Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Совместное регулирование ранних стадий развития Т-лимфоцитов транскрипционными факторами Egr1 и NFATc1

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Совместное регулирование ранних стадий развития Т-лимфоцитов транскрипционными факторами Egr1 и NFATc1"

На правах рукописи

КОЛЬЦОВА Екатерина Константиновна Совместное регулирование ранних стадий развития Т-лимфоцитов транскрипционными факторами Egrl и NFATcl

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□□ЗОБ172и

Москва - 2007

003061720

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава» на кафедре биохимии совместно с Онкологическим центром Фокс Чейз (г. Филадельфия, США)

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор Вавилова Татьяна Павловна Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, Казанский Дмитрий Борисович Доктор биологических наук, профессор Медведев Алексей Евгеньевич

Ведущая организация:

Институт молекулярной генетики РАН

Защита состоится 21 сентября 2007 года в 14 часов

на заседании диссертационного совета Д.212.203.13 при ГОУ ВПО «Российский Университет Дружбы народов» по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.8, Медицинский факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Университета Дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.б

Автореферат разослан _2007_года

диссертационного совета д.б.н., профессор Е.В. Лукашева

Ученый секретарь

Список сокращений

TCR (Т cell receptor) - Т-клеточный рецептор; Pre-TCR (pre Т cell receptor) - пре-Т-клеточный рецептор; DN (Double Negative) - двойные негативные; DP (Double Positive) - двойные позитивные; SP (Single Positive) - одиночные позитивные; Egr (Early growth response) - белки раннего ответа;

NFAT (Nuclear Factor of Activated T cells) - ядерный фактор активированных T-лимфоцитов;

YFP (Yellow Fluorescence Protein) - желтый флуоресцентный белок; GFP (Green Fluorescence Protein) - зеленый флуоресцентный белок;

КО (Knock-Out) - мыши с "генетическим" нокаутом гена, полученные при инактивации соответствующего гена в эмбриональных стволовых клетках; Tg (Transgene) - трансген;

FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter) - проточная цитофлуоримегрия; ПЦР - полимеразная цепная реакция;

RAG (Recombinase Activation Gene) - ген, активирующий рекомбиназу.

Актуальность проблемы.

Одновременное и координированное действие различных транскрипционных факторов, а также взаимодействие между ними, играет важную роль в регуляции экспрессии генов. Изучение транскрипционной регуляции развития Т-лимфоцитов чрезвычайно важно для понимания механизмов клеточной дифференцировки, как в норме, так и в патологии. В частности, детальное изучение механизмов развития Т-лимфоцитов может привести к разработке новых подходов при лечении заболеваний крови, таких как лейкозы и лимфомы, так как эти виды новообразований развиваются главным образом из незрелых лимфоцитов, нормальное развитие и дифференцировка которых нарушена.

Развитие Т-лимфоцитов представляет собой непрерывный процесс в иммунной системе позвоночных животных. Выделяют три ключевых точки, прохождение которых необходимо для эффективного развития Т-лимфоцитов: ß-селекция, негативная селекция и позитивная селекция (von Boehmer et al, 2004). Прохождение каждой из этих стадий, по-видимому, регулируется работой сигнальных каскадов, активирующих большое разнообразие транскрипционных факторов (Anderson et al, 2002). В то же время, биохимические осноеы регуляции развития Т-клегок к настоящему времени недостаточно изучены.

Настоящая работа посвящена изучению регуляции ß-селеквдш Т-лимфоцитов. Ключевая роль в контроле ß-селекщш принадлежит сигналам от пре-Т-клеточного рецептора (pre-TCR) (von Boehmer and Fehling 1997). Сигналы, передаваемые через pre-TCR, регулируют программу дифференцировки путем активации разнообразных транскрипционных факторов, таких как Egr, NFAT, ß-catenin/TCF-1, Myb, NF-кВ и GATA-3 (Anderson et al, 2006; Aifantis et al, 2001; Barndt et al, 1999; Verbeek et al, 1995; Okamura et al, 1998; Bender et al, 2004; Pearson et al, 2000).

Белки Egr экспрессируются многими типами клеток и регулируют разнообразные клеточные функции. Было показано, что белки Egr активируются в ответ на сигнал от pre-TCR и играют важную роль в процессе регуляции случайной перестройки а-цепи гена TCR (Xi et al, 2004; Bettini et al, 2002; Miyazaki et al, 1998). Тем не менее, остается неясным, каким образом белки Egr взаимодействуют с другими регуляторами экспрессии генов. Следовательно, внутриклеточная роль и молекулярный механизм действия белков Egr в Т-лимфоцитах требуют дальнейшего изучения.

Белки семейства NFAT также являются транскрипционными факторами, которые активируются в ответ на сигналы от pre-TCR и необходимы для прохождения ß-селекции (Aifantis et al, 2001; Xanthoudakis et al, 1996; Ranger et al, 1998). В частности, было показано, что

белку NFATcl принадлежит важнейшая роль в регуляции развития Т-лимфоцитов при переходе от стадии двойных негативных (DN) клеток к двойным позитивным (DP) клеткам (Yoshida et al, 1998). Egrl- и NFAT-белки могут совместно регулировать экспрессию различных генов, таких как: 1L-2, TNF, CD154 и Fcis-лиганд (Decker et al, 2003 ;Rengarajan et al, 2000; Dzialo-Hatton et al, 2001;Cron et al, 2006).

В настоящий момент в литературе нет данных о возможном взаимодействии и совместном действии транскрипционных факторов Egrl и NFATcl в процессе регулирования ранних этапов дифференцировки Т-лимфоцитов. Поэтому данное исследование является актуальным и необходимым для понимания молекулярных механизмов, контролирующих развитие Т-лимфоцитов. В свою очередь, знание молекулярных механизмов действия этих транскрипционных факторов может найти практическое применение при разработке профилактических или терапевтических подходов к лечению различных злокачественных заболеваний крови, аутоиммунных заболеваний и иммунодефицитов.

Цели II задачи исследования:

Целью данной работы является изучение роли транскрипционных факторов Egrl и NFATcl в контроле развития Т-лимфоцитов на стадии р-селекции.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Определить, ингибирование каких внутриклеточных путей передачи сигнала приводит к нарушению дифференцировки Т-лимфоцитов, но не влияет на экспрессию белков семейства Egr.

2. Исследовать, какие белковые молекулы действуют совместно с Egr и насколько их присутствие важно для прохождения Р-селекции, опосредованного Egrl.

3. Исследовать эффект взаимодействия транскрипционных факторов Egrl и NFAT на р-селекцию ш vitro и in vivo.

4. Выявить гены-мишени, изменение экспрессии которых происходит благодаря совместному действию транскрипционных факторов Egrl и NFATcl.

Научная повизпа

В настоящей работе впервые показано, что транскрипционные факторы Egrl и NFATcl совместно регулируют ранние этапы дифференцировки Т-лимфоцитов, в частности, р-селекцию. Подобная совместная регуляция наблюдается как в системах in vitro на клеточных линиях, так и

в системе in vivo. Мы изучили биохимическую основу этого эффекта и выявили гены, экспрессия которых совместно регулируется транскрипционными факторами Egrl и NFATcl.

Практическая значимость

Результаты, полученные в данной работе, представляют интерес не только для фундаментальной науки о развитии Т-лимфоцитов, но и для практического применения. В качестве практических рекомендаций результаты проведенного исследования в перспективе могут быть использованы в разработке новых терапевтических подходов к лечению онкологических заболеваний крови и некоторых форм иммунодефицитов. Потенциально, низкомолекулярные ингибиторы Egrl и NFATcl также метут найти применение для профилактики возникновения или ремиссии Т-клеточных лимфом.

' Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на нескольких международных и отечественных симпозиумах и конференциях, в том числе: на конференции «Fox Chase Cancer Center Conference», Филадельфия, США, 2005; на конференции «Современные аспекты гистогенеза и вопросы преподавания гистологии в вузе», Москва, Россия, 2007; на III Российском симпозиуме «Белки и пептиды», Пущино, Россия, 2007

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Структура п объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных результатов, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на /ЗсРстраницах машинописного текста и включают Ä6 рисунков, ¿1/ таблиц и список литературы из источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для выяснения роли отдельных сигнальных путей в дифференцировке Т-лимфоцитов стимулированные культуры инкубировали в присутствии растворителя DMSO (контроль) или в присутствии одного из следующих ингибиторов: 1) циклоспорина A (CsA), ингибитора функциональной активности белка калыщнейрина (конечная концентрация 2 мкМ); 2) РР2,

4

ингибитора протеинкиназы Src (1 мкМ); 3) U0126, ингибитора протеинкиназы МЕК (MEK-Erk сигнального пути) (5 мкМ); 4) SB203580, ингибитора протеинкиназы р38 (25 мкМ); 5) JNKII, ингибитора протеинкиназы INK (1 мкМ). Наиболее эффективные, но при этом наименее токсичные для клеток концентрации каждого ингибитора были установлены путем его титрования. Клетки культивировали в течение 24 часов и после измерения уровня экспрессии поверхностного маркера CD25 с помощью проточной цитофлуориметрии оценивали эффективность их дифференцировки.

Чтобы определить, как ингибирование различных сигнальных путей влияет на экспрессию генов Egr и TCR-a на уровне л<РНК, стимулированные клетки обрабатывали специфическими ингибиторами (циклоспорином А, РР2, U0126, SB203580, JNKII), как описало выше. Клетки после 24 часов культивирования подвергали лизису, выделяли суммарную клеточную РНК, при помощи реакции обратной транскрипции синтезировали кДНК и измеряли экспрессию генов с помощью ПЦР в реальном времени. Уровень экспрессии каждого из генов был нормализован относительно уровня экспрессии актина.

Для определения совместного влияния транскрипционных факторов Egrl и NFATcl на развития Т-лимфомы in vitro, а так же изменение экспрессии совместно регулируемых генов, клетки Scid.adh в концентрации 106клеток/мл инфицировали ретровирусиым супернатантом с добавлением полибрена (8 мкг/мл) с помощью центрифугирования в течение 45 мин при 30°С. Через 30 часов после инфекции клетки анализировали и сортировали с помощью проточной цитофлуориметрии, исследуя экспрессию поверхностного белка-маркера CD25 на GFP-положительных (GFP+), YFP-положительных (YFP+) и GFP/YFP-положительных клеточных популяциях, экспрессирующих NFAT, Egrl и NFAT/Egrl, соответственно. Измерение уровня экспрессии генов проводили в сортированных клетках с помощью ОТ-ПЦР или ПЦР в режиме реального времени, используя для нормирования экспрессию актина.

Для изучения совместного влияния транскрипционных факторов Egrl и NFATcl на развитие Т-лимфоцитов in vivo использовали систему культивирования Т-лимфоцитов в культуре клеток ОР-9. Для этого гематопоэтические клетки-предшественники выделяли из эмбриональной печени мышей на 12,5 день эмбрионального развития. Клетки эмбриональной печени наслаивали на раствор Lympholite-M (используется для градиентного выделения отдельных клеточных популяций) и центрифугировали при 2800 об/мин в течение 15 мин при ЗО'С. Далее клетки-предшественники в количестве 5х104 клеток были помещены для последующего культивирования в клеточный планшет, содержащий монослой клеток OP9-DL1.

На 4-ый день культивирования клетки были инфицированы ретровирусами, экспрессирующими Egr или NFAT, и на 16-ый день были проанализированы с помощью проточной цитометрии.

Формирование белкового комплекса между Egrl и NFATcl оценивали с помощью иммунопреципитации Egrl из клеточных лизатов с NFATcl-GST химерным белком, а так же с NFATcl из лизатов клеток Jurkat, стимулированных форболовым эфиром и кальциевым ионофором иономицином. После иммунопреципитации белковые препараты анализировали с помощью денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле и присутствие NFATcl и Egrl определяли с помощью вестерн-блоттинга.

Для выяснения роли Egrl в развитии пре-ТСЛ-дефицитных Т-лимфоцитов скрещивали трансгенных мышей EgrlTg и нокаутных мышей Rag2KO. Затем полученных мышей EgrlTg/Rag2KO скрещивали с нокаутными мышами ШКО, чтобы подтвердить гипотезу, согласно которой Egrl активирует экспрессию ИЗ. Развитие Т-лимфоцитов в клетках, выделенных из тимуса двухнедельных мышей следующих генотипов: Rag2KO, EgrlTg/Rag2KO, EgrlTg/Id3KO/Rag2KO, оценивали по экспрессии маркеров CD4, CD8, CD25 и CD44 с помощью проточной цитофлуориметрии. В мышах с генетической инактивацией гена Rag2 (Rag2KO) развитие Т-лимфоцитов останавливается на стадии DNIII, При усиленной экспрессии трансгена Egrl у мышей с нокаутом гена Rag2 (EgrlTg/Rag2KO) развитие Т-лимфоцитов восстанавливается пратически до нормального уровня. Нокаут гена Id3 не приводит к драматическим нарушениям развития Т-лимфоцитов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Ингибирование капьцинейринового сигнального пути полностью блокирует дифференцироеку Т-кпеток, но практически не влияет на экспрессию Egrl

Белки Egr являются важнейшим компонентом в пути передачи сигнала от pre-TCR при ß-селекции (Carleton et al, 2002 ; Miyazaki et al, 1997). Тем не менее, сигнальные пути, а так же другие транскрипционные факторы, которые могут совместно с Egr-белками контролировать развитие Т-лимфоцитов, до сих пор мало изучены. Для того чтобы исследовать этот вопрос, мы использовали клеточную линию Seid, adh, представляющую собой удобную модель дифференцировки Т-клеток in vitro (Carleton et al, 1999). Эта клеточная линия стабильно трансфицирована химерным рецептором ТАС, состоящим из внеклеточного домена рецептора IL-2-oc человека и цитоплазматического участка СОЗ-рецептора, который является компонентом

сигнального комплекса ICR. Стимуляция Seid, adh клеток через химерный рецептор имитярует сигнал от pre-TCR, что приводит к изменению экспрессия генов и. в частности, к снижению поверхностной экспрессии CD25 (маркера развития Т-лимфоцитов) (von Boehmer et al ¡999). Основной интерес для нас представляли ингибиторы сигнальных путей, которые нарушают дифференцировку Т-лимфоцитов, но не влияют на экспрессию генов Ear в отве: на активацию pre-TCR. Такие сигнальные пути потенциально могут кооперировать с Egr-белками в регуляции развития Т-лимфоцитов. В то же время пути, одновременно подавляющие и днфференцировку Т-лимфоцит ет, и активацию зкспрессви Egi. располагаются выше, чем Hgr в иерархии передачи сигнала.

l're-TCR активирует многие сигнальные кути, среди которых основными явпяитя протеищеиназные сигнальные каскады МАР2К, MliK/Erk, ЙЗКУАКТ, а также пути с участием фосфолипазы С и протеинкиназы С.

Оказалось, что ингибнроваяие ферментативной активности протеинкияйз Src и Елк, а также фосфатазы кальцйЯейрина приводило к остановке развитая Т-лимфоцитов на стадии DNJÜ щ следовательно, блокировало р-селекцию (Рис. 1). С другой стороны, ингибированис протеинкиназы р38 и JNK (Рис.1)> а также протешЕкиназы С, PI3K, ttiTOR И фосфолипазы Су1 (данные fie приведены) не оказывало влияния на днфференпировху Т-лнмфонитов в нашей модели. Из наших данных можно сделать вывод, что сигналы, передаваемые через кальцннейрнн, Src и MEK-Erk необходимы для регуляции ß-Селекции in vitro.

CsA U0126 РР2 SB JNKII

zmkm

■ ; 0,2 нкМ

CD25

Anti-TAC:>JVT стимуляция Кё<ггимулированные клетю Artti-TAC:r;AT стимуляция *

Рис.1. Влияние ингибиторов на яифферепцнровку Т-лимфоцитов.

Ингибированис дифференцировки Т-лимфоцитов оценивали по уровню экспрессии СВД5, В норме при р>-селекции происходит уменьшение экспрессии СШ5 (серая линия). Неййфференцированяые клетки экспрессируют высокий уровень СЕ>25 {пунктирная линия, закрашено серым цветом). Влияние ингибиторов на дифференцировху, а значит на экспрессию СШ5, доказано черной линией.

Чтобы выяснять, как ингибирозание сигнальных путей влияет на экспрессию генов, необходимых для прохождения [1-селекции, мы стимулировали клетки Seid, adh антителами к химерному рецептору ТЛС и инкубировали с одним из вышеперечисленных ингибиторов. Изменение в экспрессии генов семейства Sgr: Egrl Egr2, Egr3, а также гена и-цепи Т-клеточного рецептора (TCR-a) анализировали на уровне мРНК с помощью количественной ПЦР в режиме реального времени.

Важно отметить, что среди ингибиторов, нарушающих дифференцировку, только циклоспорин А (CsA). ингибитор активности кзльцикейриггя, лить частично подавлял экспрессию одного из генов белков раннего ответа - Egrl, в то время как ÜÜ126 (МЕК/ЕА-сигналыщИ пугь) н РР2 (ингибитор протеи яюшазы Src) ждав ляли как дальнейшую дифференцировку Т-лимфоцитов, гак и экспрессию всех генов семейства Egr и TCR-a (Рис. 2). В то же время иншбирование активности протеинкиназы JNK не влияло на экспрессию генов семейства Egr и TCR-a,

120 -,

CHIP Р2 ■В CsA ffifö uoi 26

^EJMK ЕЕИ контроль

ЕдИ

TCR-л

Едг2 ЕдгЗ

Рис. 2. Влнянне ингнбпрнвания различных сигнальных путей на транскрипцию генов ИМ ей елна Egr» TCR-a.

Поскольку ингибиронание кальцинейрин-МЕАТ-сигн^й-ного ттути приводит к полному блокированию дифференцировки Т-клеток, но при этом лишь частично ингибирует экспрессию гена Egrl, можно предположить, что Е^гI не является геном-мишенью для этого сигнального пути. Это означает, что сигнальные пути МГ'АГ н Ер! не иерархичпы и, возможно, что Eg совместно с КРАТ может регулировать ранние стадии развития Т-лимфоцитов.

Egrl и NFAT совместно регулируют прохождение ß-селекции Каяьцинейрин ферментатйвна регулирует активность транскрипционных факторов NFAT, которые, как было погано, играют важную роль в развития Г-лимфояитов. Однако непонятно, какие представители семейства NF AT потенциально могу; быть принимать участие в подобной ре!уляшш. Мы решили выяснить, какие из членов семейства NFAT эхспрессируются в клеточной, линии Seid, adh., С помощью GT-ПЦР мы показали, что неточная линия Seid, adh экспрессирует NF ATI, NFAT2 и NF А14 (Рис. 3), но не NFAT3,

ß-акгин NFAT 1 NFAT 2 NFAT 3 —*

NFAT 4 —;

Рис. 3. Экспрессия транскршшнониых факторов семей с i в а INFAT в клеточной линии Sciii.n Jh. YpoSHb эхйтрессии м?ИК белков семейства NFAT измеряли с помощью ОТ-ГОДР.

По данным Voshidii eV al. [Yoshid/i ei ol, 1998) известно, что среди факторов семейства NFAT, только NFATcl принимает участие в регуляции диффереицировки Т-лимфоиктов из двойных псташвньте (DN) лимфодапов ъ двойные позитивные (DP) лимфоциты, В связи с этим, мы решили выяснить, может ли Egrl кооперировать именно с NFATc 1. Для этого мы совместно эхспрессировали EgT 1 и NFATc S в клеточкой лищт Seid, adh с ксаолъзовзнием ретровирусвъм векторов с различными флуоресцентными маркерами (YFP и GFP), удобными для идентификаций траясфищ^кшшнь'д клеток.

Согласно полученным данным совместная экспрессия двух транскрипционных факторов приватна к значительно более пораженному уменьшению экспрессии CD25, чем в случае, когда факторы экс пресс про вались по отдельности (Рис, 4). Следовательно, транскрипционные

факторы и ТчФАТс 1 совместно регулируют прохождение р-селекиии Т-лимфоцитами, по крайней мере, в использованной нами модели клеток ранней Т-клеточчой лимфомы.

Рис 4. Совместная экспрессии Egrl н NFATci вызывает дифференцировку клеточной ЛИНИИ Scid.adl). Л - экспрессия NFAT, меченного UFP (GFГ'-клетки): Б - совместен экспрессия NFAT, печенного GFP, и Egr, меченного YFP (GFР7YFP'-клетки); В - экспрессия F.gr, меченного YFP (У FP"-клетки). Измерение экспрессии СШ5 в Т-лимфоцитах проводили с помощью цитофлуориметрии. Уровень экспрессии CD25 в нетрап еду циро кап пых клетках (контроль) - пунктирная линия, закрашено серым цветом; уровень экспрессии CD25 в транедупиронаиных клетках - черная линия

Недавние исследования показали, что генетический нокаут гена NFATci приводит к нарушению развития Т-лимфоцитов при перекоде от стадии DNIti к стадии DNIVOWjií/í/ е! al, 1998). Более того, исследования в других модельных системах показал«, что NFATci и Egrl совместно регулируют экспрессию таких нммуно логически важных генов, как IL-2, TNF-a, CDIS4 у. ген матриксной металлопротсинази MTl-MMP (Decaer el a!, 2003; Cron el al, 2006;Macian el al 2000; Alfonso-Jaume et al. 2004). Важно отметить, что настоящая работа впервые описывает взаимодействие Egrl-NFATcl в контексте развития лимфоцитов, вызванного активацией через pre-TCR

Следует отметить, что при совместной экспрессии NFATci с Egr 2 или Egr3 кооперативного аффекта не наблюдалось ("Рис. 5). Однако суперэкспрессия Egr2 или Egr3 в данной клеточной линии -сама по себе вызывала дифференцировку Т-лимфоцитов в значительно большей степени, чем суперэкспрессия Egrl (Рис. 5).

Экспрессия CD25

Рис. 5. NFAT совместно с Egrl, но пе с Egr2 или Egr3 вызывает днфферепцировку клеточной липни Scid.adh. Уровень экспрессии CD25 в нетрансдуцированных клетках (контроль) -пунктирная линия, закрашено серым цветом; уровень экспрессии CD25 в трансдуцированных клетках -черная линия

Egrl и NFA Т2 совместно регулируют развитие Т-лимфоцитое in vivo Мы решили выяснить, могут ли Egrl и NFAT совместно регулировать развитие pre-TCR-дефицитных тимоцитов и вызывать р-селекцию. Для этого мы использовали мышей EgrlTg/Rag2KO, у которых трансген Egrl, экспрессируемый только в Т-лимфошггах, вызывает дальнейшее развитие DN-тимоцнтов, дефицитных по pre-TCR, в DP-стадию. В то же время Т-лимфоциты у мышей Rag2KO сами по себе не способны к развитию в DP-тимоциты, так как у них отсутсвует важный компонент рекомбинации и перестройки генов TCR, что необходимо для Р-селекции. На 12,5 день эмбрионального развития мыши мы выделили клетки-предшественники из печени эмбрионов и культивировали их на монослое клеток OP-9-DL1, которые производят различные белковые факторы дифференцировки и обеспечивают нормальное развитие Т-лимфоцитов. Через 4 дня мы трансдуцировали данные клетки ретровирусным вектором, кодирующим NFATcl, или контрольным вектором, и через 12 дней

после доставки NFATcl анализировали экспрессию маркеров диффсреннировки с помощью проточной цитометрия. На рисунке 6 показано относительное число CD8- и DP-клеток в образцах мышей Rag2KO и EgrlTg/Rag2KO. Кроме того, приведены данные абсолютного количества клеток в данных популяциях.

Мм наблюдали значительное усиление развития тимоцитов, дефицитных но prc-TCR (Rag2KO), в ответ на совместную экспрессию Eyrí и Nf'ATcI. Интересно, что введение в систему только Egrl или только NFAT не вызывало дальнейшего развития Rag2-дефинитных тимоцитов, что указывает на важность кооперации между этими транскрипционными факторами. Таким образом, мы показали, что Egrl и NFATcl совместно регулирую! р-сслекцию тимоцитов in vivo.

MFAT

□ Rag2KO

m- — —

Рис 6. Транскрипционные факторы Egrl и NFATcl совместно регулируют развитие Т-линфмшто» ¿я vivo.

Чтобы убедиться в том, что NFATcl не просто активирует пролиферацию Т-лимфоцитов, а влияет именно на дифференциронку, мы сортировали DNIII-тиисшиты из тимуса двухнедельной мыши и культивировали их на монослое клеток ОР-О. DNIIl-клетки были транедуцировань! NFATcl и Ras (RasVI2), в качестве контроля.

Действительно, и в этом случае развитие Т-лимфоцитов шло более интенсивно в присутстаки обоих транскрипционных факторов Egrl и NFATcl. При этом экспрессия одного NFATcl приводила к образованию похожего количества зрелых клеток, что и экспрессия Ras, несмотря на то, что Ras располагается практически на вершине многих сигнальных каскадов (Рис. 7А). Активация пролиферации вектором KasVL2 была сравнима с таковой в клетках, экспрсссируюших одновременно и Egrl, и NFATc!. При этом экспрессия одного VFATc! не вызывала выраженной активации пролиферации (Рис. 7Б). Таким образом, мы показали, что NFATct с о вместо с Egrl регулируют не только пролиферацию Т-лимфоцитов, но я их дифференцировку.

Транскрипционные факторы Egrl uNFATcJ при ß-селекции формируют комплекс Данные нашей рвбогы свидетельствуют о том, что транскрипционные фйКгоры Egrl и NFATcl совместно регулируют ß-селекцию. Мы решили выяснить, происходит ли формирование комплекса между ними на этой стадии развития Г-лимфодатов. Для этого мьг использовали химерный белок, где методами генной инженерии щмкоразмерный NFATc] был "слит" с глутатионтрансфераэоЙ (OST). Данный ПОДХОД позволяет удобно детектировать азаимодейсгвие мкаду Травъхршщионными факторами.

А 1-ын день 7-ой l r Li /:.| L> Б

BthTrofi

Raj2KD

HFAT

h3sv12 ragíko

Рис 7. Транскрипционные факторы Egrl и NFATcl совместно регулирую! развитие Т лимфоцитов ¡Я vivo. Экс применю маркеров CD4/CDS в клетках, транедуцнрованных контрольным вектором, NFATcl и Ras (А) и анализ пролиферации клеток, транйдуциро ванных теми же векторами (Б) проводили на СКТН-тимонитах, выращенных в культуре клеток ОР-9

NFAT

ЕвПГвИедКО

Дни

HagZKO жктчр -в- R.1í>;'№NFAT

Risiko ras EsrtTalRUiStfÖMK-rap Egrl N FAT

Действительно, мы смогли обнаружить физическое взаимодействие Е^г] и йиРАТс! после то] й. как инкубировали лиззт из стимулированных клеток линии .Тигкаг со слитым белком ¡Ч!ЕАТс1-ОЗТ, который был иммобилизован на СЙТ-сефарозных шариках (Рис. 8 А). В случае, если Епг1 я МГДТе 1 взаимодействуют между собой, то то клеточного лидата должен образовывать комплекс с КГАТ-ОБТ и физически прикрепля ться к шарикам. Действительно, после промывки шариков и окрашивания антителами к Egr¡ мы обнаружили, что Едг! находится я комплексе с ЫРАТ (Рис 8А), Затем мы решили определить, существует лн такое взаимодействие т г&да, Иммунолрецшгитация с антителами к ЫРАТе) и последующее окрашивание антителами к Egr¡

13

покачало, что Egr I связывается с Nr АТс i в длзагзх. tipwro тон ленных' из клеточной лтиш Jurkat (Рис. 8% Наше наблюдение позволяет сделать вывод, что транскрипционные факторы NFATcl и Egrl формируют Комплекс как in vitro (при использовании GST-NFATcl-коньюгнрованного беяка). гак и in vivo с иапользоашяклеточных лизатов).

А 2 g Б ? о 2 =

cd u

■к -к

Si

S

I

<

ш.

Z

'Л s

a

m а

<

S Q.

г

0-

o

s-

5

3 s

Cl

ESr1

Щ l i

migG

Рис 8. Траискршншониые факторы Egr1 и NFAT образуют комплекс при прохождении р-селсктш. А. Им м у но преципитация Egrl с NFATcl-GST слитым белком: бкрашиаание антителами к Egrl. Б. Ймму но преципитация Egrl с NFATei hi ливта клеток Jurkat, стимулированных фороолайЬ1м эфиром Ц аоиоашиинси (PMAIhohoY, окрашивании антнтелами к Egrl и антителами к мышиным IgG (migG).

Для кооперативного «зпнмодейептия с ¡\'РАТс) 1 необходимы актитционный и ДИК-

Связывающий домены Е^г

Для того чтобы определить, какой из доменов Е§г1 необходим для эффективного взаимодействия с \;РАТс1. мы сконструировали несколько делеиионных мутантов Сит) (Рис У):

Актива ционный домен

PMPDY

■МГШШ- ' сГ

По пн о р азмерны й Едг1

DED

Л112

5. Г

ЕРШШ

Рис 9. Схема конструкций делеиионных мутантов Egrl. I. Il одноразмерный Egri; 2. DED -мутант с аминокислотной Заменой H4I7L и ДНЩеадЗЪ]ваюше м домене, которая приводит к отсутствий» еннтьаааппя с Д i :' К АР - -.'.y ган г с далс.и".''/ конссркзтнвнаго PM1PD У mothus; 4. 32 - '>■: ' с делением проксимального участка актинац но иного домена, рис положенно го на N-копце молекулы: 5 ДМ - мутант с делеци¿Г] пес-го активацийиного домена, расположенного иа N-конце молекулы.

Дли того, чтобы исследовать эффект этих мутаций на активацию дифференцировав, ретровйрусдне конструкдта с делеционнъши мутантами смеете с NFATei были экспресеированы в клетках Seid, adh (Рис. 10).

NFAT

Еэг1

Полно размерная конструкция

согз

l'iic 10. Эффект направленного мутагенеза белка Kgrl на дифферевцнроаку Т-клеточной лнмфомы Seid,adh in vitro ггри совместной транедукннн e NFATct. Уровень экспрессии CD25 в нетранс ду ни р о ванн ы х метках (контроль) - пунктирная линии, закрашено серым цветом: уровень ¡репрессии CD25 в транс дуй Прова иных клетках - черная линия

Было показано, что делеция белкового мотива PM1PDY", консервативного у всех белков семейства Egt. нарушает способность Egrt стимулировать дифференциропку Т-клеточной лимфомы Seid, adh in viirc При этом незначительно уменьшается и способность Egrl функционально взаимодействовать С NFATei, Делении проксимального участка или всего N-концевого актив анионного домена приводят к более значительным нарушениям в активации дифферегщироеки Н кооперации с NFATei, при этом эффект тем выражение«, чем протяженнее

деления. Блокирование связывания Egrl с ДНК (деления ДНК-с вызывающего домена) также й&руше?дифференцкроаку, опосредованную совместной работой tgrj и NFAT.

Таким образом, можно сделать вывод, что активадионный и ДНК-сназывающий домены Egrl необходимы для кооперативного взаимодействия с NFAT и стимуляции дифференцировки Клеточной линии Seid. adh. Кроме того, можно предположить, что для Т-клегочного развития Может быть нужна как активаыионная, так и ДНК-связывающая активность Egrl.

Необходимо ли присутствие NFA Т для стимуляций развития Т-лимфоцитов, опосредованного Egrl?

Мы показали, что Egrl способен взаимодействовать с NFATcl в процессе диффйренцнровки Ti клеточной ли.чфомйг. При этом оставалось невыясненным, на сколько присутствие функционально активного эндогенного Ts]FAT необходимо для совместной активации дифференцпровки Г-лимфоцитов. Действительно, клеточная линия Seid. adh, транедуцировананная Egrl, сама экспресеирует значительное количество эндогенного NFATcl. что может быть достаточным для взаимодействия с Egrl. К сожалению, Т-Лимфоциты, нокаутные по трем генам семейства NFAT (NFATl. NFAT2 и NFAT4), в настоящее время недоступны. Поэтому исследовать функцию Egrl в полном отсутствии NFAT не представляется возможным. Поэтому мы решили использовать ингибиторы активности всех белков семейства NFAT. Клетки Seid, adh, транедуцированные Egrl, обрабатывали циклоспорином А (CsA) и ингибитором протеиншпазы p3S (SB), чтобы определить блокирует ли илгибироеание активности NFAT дифференцировку, опосредованную Egrl.

А Б

ад - ¿0

i нн ?

Г: Я Г

- ■! J: ^

EgrKDMSO Esrl'SB EgM/CsA Контроль PyrklA

+ Ед И

Рис 11. Йнгибироваяне активности NFATcl частично подавляет дифферей д провесу клеток Scid.adh. Измерение экспрессии CD25 с помощью цитофяуориметрин в метках, трап еду цирован НЫх Egrl и обработанных ингибиторами SB или CsA (А) или транедуиированньих OYKA'iafS).

Контроль Oyrk* ► Egrl

Действительно, в присутствии циклоспорина А, но не ингибитора протеинкиназы р38 (SB203580), мы наблюдали частичное ингибирование дифференцировки лимфомы Scid. adh, опосредованной Egrl (Рис. 1IA).

Для того, чтобы окончательно показать, насколько присутствие функционально активного NFATcl необходимо для Egrl-опосредованного прохождения Р-селекции, мы клонировали и экспрессировали совместно с Egrl эндогенный ингибитор активности белков NFAT, DYRKla. Измерение уровня CD25 в клетках, трансдуцированных Egrl совместно с DYRKla, показало, что суперэкспрессия DYRKla приводит к снижению эффективности прохождения Р-селекции по сравнению с одиночной экспрессией Egrl (Рис. 11Б).

Таким образом, дифференцировка pre-TCR-дгфицитных тимоцитов, опосредованная транскрипционным фактором Egrl, частично блокируется ингибитором кальцинейрина, а так же суперэкспрессией эндогенного внутриклеточного ингибитора активности NFAT, DYRKla. Это, безусловно, свидетельствует о том, что Egrl-опосредованное созревание тимоцитов, по крайней мере, частично, зависит от присутствия функционального NFAT.

NFATcl и Egrl совместно регулируют экспрессию генов

Для того чтобы понять молекулярный механизм совместного действия транскрипционных факторов Egrl и NFATcl, мы решили идентифицировать гены-мишени, экспрессия которых совместно регулируется данными транскрипционными факторами. Наше внимание было направлено прежде всего на гены, экспрессия которых, как было показано, изменяется во время прохождения р-селекции и функция которых важна для прохождения этой точки развития. Интересно, что среди анализируемых генов, мы обнаружили гены Rag2 и ld3. Rag2 является ферментом, катализирующим рекомбинацию генов а- и Р-цепи Т-клеточного рецептора (Mombaerts et al, 1992). Регуляторный фактор Id3, в свою очередь, подавляет активность Е-белков, что является необходимым для прохождения р-селекции (Norton et al, 1998). Таким образом, функция этих двух генов чрезвычайно важна для регуляции перехода от стадии DNIII к стадии DNIV. Мы показали, что экспрессия Rag2 уменьшалась гораздо более значительно в присутствии и Egrl, и NFATcl, чем в присутствии каждого фактора по отдельности. В то же время, в присутствии обоих факторов ген Id3 экспрессировался на более высоком уровне (Рис. 12А).

1С0

а!

«да

5-

X

V

I

С

Л 20

Г МЗ

35 т

1

1

3 » .

1

к- го

I « 1

а

1 « 41 1 5 »0 1

■ ЕдгЮТР Э КРАТЕР 3 Едг^РДТГГРР-СРР

е- 300 £

X 250 X

200

а

Едг1 4

ар 3

и 1

д Ш ? 1

1 0

Рис 12. Совместная регуляння экспрессии гснок транскрипционными факторами Е§г! и >'ЕАТ. Изменение уровня мШК генов и Ш(Л) я генов семействаЕ^г (Е) согласно данным ПЦР в реальном времени.

Интересным наблюдением была активация экспрессии гена Е%г1 в присутствии совместно суиерэхспрессированых Е^г1 и №АТ (Рис. 12Б). Это может объясняться су шествованием так называемой петли обратного положительного регулирования. Возможно, комплекс, состоящий из Н§г1 и ^ЛТ2, к значительной степени активирует экспрессию и самого гена Этот вопрос требует дальнейших экспериментальны к исследований. При этом значимых изменений в экспрессии генов Е%г2 и Е%гЗ в ответ на совместную экспрессию Е§г1 и ЖАТ2 не наблюдалось (Рис, 12 Б).

№, экспрессия которого зависим от Е°г1, являете» ключевой молекулой в стимуляции

развития Т-клеток

ИЗ является белком, который подавляет активность так называемых Е-белков. Подавление функций Е-белков, как следует из экспериментов с мышиными нокаут шиш моделями, играет важную роль при р-селекиии. Для того чтобы определить является ли 1(33 необходимый элементом для совместной индукции Т-клсточного развития транскрипционными факторами Ер1 и №АГс1. мы скрестили мышей, трансгснных по Еег1 в Т-клетках (мышей ! с мышами Кл"2КО {для предотвращения экспрессии эндогенного ргс-ТСК), и затем с

мышами ШКО. Как было сказано выше, Egr I Tg способен промотирсшать развитие рге-ТСВ-дефкцитаых твдоцита*, но нейзвестно, требуется лй для этого активность или присутствие Id3.

При измерении экспрессии основных маркеров дифференцировки CD4/CD& (Рис. J ЗА) и CD44/CD25 (Рис. ] ЗБ) было показано, что у мышей с нокаутом гена Rag2 развитие Т-лимфоцитов останавливалось на стадии DNIII. С другой стороны, экспрессия EgrlTg у мышей EgrITg/Rag2KO приводила к восстановлению развития практически до нормального уровня и образованию большого количества CDS- и DP-тиыопитов (Рис. 13А). При этом наши данные показывают, что этот эффект полностью исчезает в отсутствие гена ИЗ, так как у мышей EgrlTg/ Id3KO/Rag2K.O развитие клеток при переходе от стадии DN1II к стадии DÍNTV полностью блокировано, так же как и при нокауте гена Д(У£<?(Рис.13 А. В). Таким образом, ¡загни данные показывают. что Id} является геном-мишенью тракскршдно иных факторов Egrl В NFATél и что подобная Egrl-опосредованная индукция гена Id3 чрезвычайно важна для прохождения ¡i-селекции.

А

Rag2KO EgríTg/Ran2KQ £gr1Tg/l33KC/Rag2KO число клеток CDS + DP (х10"4)

IftM

i

KtM

-0,Sü

CD4 ■

Яиагко Ез г i Tqí Egriv

RacC К О 1ЙШ

Клдгхо

Б

КадЗКО

1'ИС. 13. Геи ДО являете« мишенью Ецг!. Анализ экспрессии поверхностных маркеров СЦ4/СИ8 (А) и С1Ж'СП25 (Б) в Т-л им {¡шиитах, выделенных га три труп мышей. На графиках справа показано общее число зрслых(С08^0Р) клеток(А) и число ОМГУ клеток (К).

Суперэкелрессия Е£г1Т£ практически восстанавливает развитие Т-лимфоцптов у мышей Я;|«2КОп в то время как нокаут гена Ш полностью предо гврашает этот эффект-

Egr1Tg/Rag2KO EgrtTgíld3KC/Rag2KO ...... ,

-—-, Число плеток DNIV (х1СП)

Rag КО EgrfTgi egrtTs'

ñogCKO УЗК»

Таким образом, в данной работе мы показали, что эффект двух транскрипционных факторов Egrl и NFATcl реализуется благодаря тому, что они совместно регулируют экспрессию генов, продукты которых играют критическую роль в регуляции ß-селекшш. Этими генами оказались ИЗ и Rag2. Активация генов Rag необходима для перестройки генов а- и ß-цепей Т-клеточного рецептора. После удачного завершения перестройки генов TCR экспрессия генов Rag резко снижается. С другой стороны, Id3 и связанные с ним продукты играют важную роль в регуляции ранних этапов дифференцировки Т-клеток. Удивительными оказались данные, свидетельствующие о том, что ИЗКО практически не нарушает нормальное развитие Т-лимфоцитов. Отсутствие эффекта Id3KO на прохождение ß-селекции, индуцированного pre-TCR, может объясняться компенсаторным эффектом других представителей семейства Id, таких как Idl и Id2. В самом деле, было показано, что Idl является мишенью белка с-шус, который также активируется сигналом от pre-TCR. То, что ИЗ играет важную роль в развитии тимоцитов в использованной нами системе Egrl Tg, вероятно, отражает упрощенную экспериментальную систему, где Egrl активирует только стимулы развития. Это позволяет сделать вывод о том, что функция Id3 критична для Egrl-опосредованного прохождения ß-селекции. В соответствии с этим, мы предположили модель, в которой Egrl кооперативно с NFATcl индуцирует экспрессию ИЗ, что в свою очередь, стимулирует ß-селекцию вследствие подавления активности Е-белков. Безусловно, наша модель представляет собой упрощенную версию нормального процесса дифференцировки, индуцированной pre-TCR, и, вероятно, также существуют и другие гены-мишени, кооперативно регулируемые Egrl и NFATcl. Ответ на этот вопрос требует дальнейших исследований.

выводы

1. Кальцинейриновый, Src- и MEK-Erk сигнальные пути вовлечены в регуляцию перехода клеток из стадии DNIII в стадию DNIV, а ингибирование этих путей нарушает экспрессию генов Egrl, Egr2, Egr3 и TCR-a.

2. NFATcl является одним из партнеров Egrl в регуляции дифференцировки Т-лимфоцитов.

3. Взаимодействие Egrl и NFATcl оказывает значительное влияние на прохождение (3-селекции как in vitro, так и in vivo.

4. Молекулярными мишенями транскрипционных факторов Egrl и NFATcl, являются гены Id3 и Rag2

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Koltsova Е. and Wiest D. L. Basis for Egr-mediated promotion of thymocyte development beyond the ¡5-selection checkpoint. // Fox Chase Cancer Center Conference, Philadelphia, U. S. A. (2005), p. 18. (Доля авторского участия - 80%).

2. Koltsova E., Ciofani M., Benezra R., Miyazaki Т., Clipstone N., Zuniga-PfKicker J. C., and Wiest D. L. Egrl and NFATcl act in concert to promote thymocyte development beyond the (3-selection checkpoint. IIJ Immunol. (2007) in press. (Доля авторского участия - 80%).

3. E. К. Кольцова, O.JI. Евстафьева, Т. П. Вавилова. Роль транскрипционных факторов Egrl и NFAT в развитии Т лимфоцитов. // Морфология (2007) 131., №3, 75-76. (Доля авторского участия - 90%).

4. Е. К. Кольцова, Д. Л. Вист, Т. П. Вавилова. Транскрипционные факторы NFAT2 и Egrl совместно регулируют созревание Т-лимфомы in vitro. Н Биохимия (2007) 72, № 9, с. 1172-1181 (Доля авторского участия - 90%).

5. Е. К. Кольцова, О.Л. Евстафьева, Т. П. Вавилова. Транскрипционные факторы NFATcl и Egrl совместно регулируют р-селекцшо Т-лимфоцитов. ///// Российский симпозиум «Белки и пептиды», Пущино, Россия (2007). (Доля авторского участия - 90%).

«Совместное регулирование ранних стадий развития Т-лимфоцптов транскрипционными

факторами Egrl и NFATel»

КОЛЬЦОВА Екатерина Константиновна.

Прохождение Р-селекции, первой ключевой точки развития Т-лимфоцитов, регулируется через пре-Т-клеточный рецепторный комплекс (pre-TCR). Pre-TCR регулирует программу дифференцировки путем активации большого разнообразия транскрипционных факторов, в том числе белков семейств Egr и NFAT. В данной работе показано, что Egrl и NFATel могут совместно регулировать развитие Т-лимфоцитов до CD8+ одиночных позитивных и CD4+CD8+ двойных позитивных стадий. Отмечено, что Egrl и NFAT2 контролируют экспрессию генов регуляторного фактора Id3 и рекомбиназы Rag2, функции которых чрезвычайно важны для развития Т-лимфоцитов. Показано, что нокаут гена Id3 полностью нарушает способность суперэкспрессированного Egrl регулировать ¡3-селекцию. Таким образом, регуляторный фактор ИЗ, экспрессия которого совместно регулируется транскрипционными факторами Egrl и NFATel, играет важную роль при Egrl-опосредованной Р-селекции. Кроме того, наши результаты показывают, что кооперативное взаимодействие NFATel и Egrl во время прохождения fi-селекции приводит к интеграции информации от кальцинейринового и Erk-сигнальных путей соответственно.

«Transcriptional factors Egrl and NFATel cooperatively regulate early thymocyte

development»

KOLTSOVA Ekaterina Konstantinovna

Development of immature T cell precursors beyond the P-selection checkpoint is regulated by signals transduced by the pre-T cell receptor (pre-TCR) complex. The pre-TCR induced differentiation program is ■ orchestrated by a network of transcription factors that serve to integrate this signaling information. Among these transcription factors are those of the early growth response and NFAT families. Here we demonstrate that Egrl and NFATel act together to promote development of T cell precursors beyond the p-selection checkpoint to the CD8 single positive and CD4+CD8+ double positive stages. Moreover, we find that Egrl and NFAT cooperatively induce the expression of Rag2 and Id3, which play an important role in control of thymocytes development. Importantly, we show here that Id3-'deficiency abrogates the ability of ectopically-expressed Egrl to promote traversal of the P-selection checkpoint. Taken together, these data demonstrate that Id3 is a cooperatively-induced target that is important for Egr-mediated promotion of development beyond the P-selection checkpoint. Moreover, these data indicate that the Erk and calcium signaling pathways may converge during P-selection through the concerted action of Egrl and NFATel, respectively.

Заказ № 344. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кольцова, Екатерина Константиновна

СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОIJ30P ЛИТЕРАТУРЫ.

Этапы развития Т-лимфоцитов. ар и уб Т-лимфоциты. пре-т-клет0ч11ый рецептор (pre-tcr) и его роль в регуляции р-селекции. р'селекция.

Т-клеточ11ЫЙ peiieiitop (TCR).

Транскрипционная регуляция развития Т-лимфоцитов.

GATA-3.

NF-kB.

PU-1.

SPIB.

Семейство ры уляторных белков HLH (Е-белки, Id-шжи).

Семейство Есж-пелков.

Роль Egr в развитии Т-.тмфогцтюв.

Egrl.

Семейство NFAT-белков.

NFATcl (NFAT2).

Семейство белков DYRK.

Кооператив! 1ая рег уляция экспрессии генов несколькими транскрипционными факторами.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Клеточные культуры. жив0 г11ые модели (мыши). i'EI IE iическое типир0ва11ие мышей.

Методы молекулярного клонирования.

Плазмиды.

Продукция и трансдукция ретровирусов.

Проточная цитофлуриметрия (FACS).

Выделении РНК и измерение экспрессии генов. п11р в риалы юм времени. выдели! 1ие эмы'ионалыюй печени.

Выделение гематопоэтических клеток-предшественников (HSC) и выращивание зрелых Тлимфоцитов в культуре клеток OP9-DL1.

Приготовление ядерных и цитоплазматических экстрактов.

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ПО Лэммли В ДЕНАТУРИРУЮЩИХ УСЛОВИЯХ И ВЕСТЕРН-ВЛОТТИИГ.

Преципитация с использованием белка NFATcl, слитого с GST.

Стимуляция клеточной линии .Шикатфорболовым эфиром и иопомицином. Приготовление клеточных лизатов и имму11011реципитация.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. ингппнровлпие кальцинейрипового сигнального пути полностью блокирует дифферкнцировку т

КЛЕ'ГОК, НО ПРАКТИЧЕСКИ НЕ ВЛИЯЕТ НА ЭКСПРЕССИЮ EGRl.

Е(ж1 и NFAT совместно регулируют дифференцировку SCID.adii тимомы IN VITRO.

ECK I и NFATcl совместно регулируют развитие первичных Т-лимфоцитов.

ТРАНСКРИПЦИОПНЫЕФАКТОРЫ EGRl И NFATcl ФОРМИРУЮТ КОМПЛЕКС ПРИ ß-СЕЛЕКЦИИ.

Для кооператив! юго взаимодействия с NFATCI необходимы активационный и ДНК-связывающий

ДОМЕНЫ EGR.

НЕОБХОДИМО ЛИ ПРИСУТСТВИЕ NFAT ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РАЗВИТИЯ Т-ЛИМФОЦИТОВ, ОПОСРЕДОВАН! 1010 EGRl?

NFATcl и EGRl совместно регулируют экспрессию генов.

ГЕ11 Iü3 НЕОБХОДИМ ДЛЯ EGRl -ОПОСРЕДОВАННОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ Т-ЛИМФОЦИТОВ.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кольцова, Екатерина Константиновна

выводы

1. Калыдииейриновый, Src- и MEK-Erk сигнальные пути вовлечены в регуляцию перехода клеток из стадии DNIII в стадию DNIV, а ингибирование этих путей нарушает экспрессию генов Egrl, Egr2, Egr3 и TCR-a.

2. NFATcl является одним из партнеров Egrl в регуляции дифференцировки Т-лимфоцитов.

3. Взаимодействие Egrl и NFATcl оказывает значительное влияние на прохождение Р-селекции как in vitro, так и in vivo.

4. Молекулярными мишенями транскрипционных факторов Egrl и NFATcl, являются гены ЫЗ и Rag2.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе мы показали, что совместный эффект двух транскрипционных факторов Ейг1 и ЫРАТс1 реализуется благодаря тому, что они одновременно регулируют экспрессию генов, продукты которых играют критическую роль в регуляции р-селекции. Этими генами являются ЫЗ и Rag2. Более того, функция ИЗ необходима для Е£г1-ЫРАТс1-опосредованного прохождения [}-селекции.

Безусловно, полноценное развитие Т-лимфоцитов в организме является значительно более сложным процессом, чем описанная в данной диссертационной работе модель. Вероятно, Е£г1 и КРАТс1 могут совместно регулировать экспрессию и других генов, однако без данных анализа глобальных изменений в экспрессии генов (анализа тотальной мРНК на микрочипах) это определить пока не представляется возможным.

Кроме того, по-прежнему остается открытым вопрос о том, каким именно образом комплекс, состоящий из Egrl и ЫРАТс1, регулирует транскрипционную активность гена ЫЗ. Мы провели компьютерный анализ последовательности промотора гена ЫЗ, основываясь на результатах исследования регуляции этого промотора в миобластах. С помощью программы «гХ^а» для анализа последовательностей промоторов генов мы не обнаружили композитных сайтов связывания Egrl и ЫРАТс1 или независимых сайтов связывания ЫБАТ в промоторе гена ЫЗ. Тем не менее, промотор содержал консервативные Е£г1 -сайты, что делает предположение о кооперативной активации экспресии ЫЗ путем связывания Е§г1 и ЫГАТЫ с композиционными или близко расположенными сайтами менее вероятным. Однако мы считаем, что полностью отвергать возможность прямой активации промотора гена ЫЗ транскрипционными факторами Е£г1 и №АТс1 нельзя, так как компьютерные программы все время совершенствуются и возможно в ближайшем будущем можно будет получить новые данные о расположении сайтов связывания транскрипционных факторов на промоторе того или иного гена. Кроме того, возможно, что существует уникальный сайт связывания для комплекса Egrl-ЫРАТс 1.

11е исключено, что регуляция экспрессии ЫЗ в тимоцитах осуществляется при участии еще не идентифицированного компонента, который активируется в условиях совместной экспрессии транскрипционных факторов Е£г1 и ^АТс1. Ответ на этот вопрос требует дальнейших экспериментальных исследований.

Полученные в диссертационной работе результаты о совместной роли Е§г1 и ЫРАТс1 в пролиферации и Р-селекции Т-лимфоцитов являются не только исключительно важными для понимания базовых процессов развития лимфоцитов, по и потенциально могут повлиять на разработку нового поколения лекарств для Т-лимфом, направленных на модулирование активности транскрипционных факторов иЫЕАТс!.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кольцова, Екатерина Константиновна, Москва

1. von Boehmer H. Selection of the T-cell repertoire: receptor-controlled checkpoints in T-cell development//Adv. Immunol.-2004-№84, P.201-238.

2. Anderson M.K., Hernandez-Hoyos G., Dionne C.J, Arias A.M., Chen D., Rothenberg E.V. Definition of regulatory network elements for T cell development by perturbation analysis with PU. 1 and GATA-3 // Dev. Biol.- 2002-№246, P. 103-121.

3. Fehling H.J., von Boehmer H. Early alpha beta T cell development in the thymus of normal and genetically altered mice // Curr. Opin. Immunol. -1997-№9. P. 263-275.

4. Anderson M.K. At the crossroads: diverse roles of early thymocyte transcriptional regulators // Immunol. Rev.- 2006-№209. P. 191-211.

5. Aifantis I., Gounari F., Scorrano L., Borowski C., von Boehmer II. Constitutive pre-TCR signaling promotes differentiation through Ca2+ mobilization and activation of NF-kappaB and NFAT // Nat. Immunol.- 2001-№2. P. 403-409.

6. Barndt R., Dai M.F., Zhuang Y. A novel role for IIEB downstream or parallel to the pre-TCR signaling pathway during alpha beta thymopoiesis // J. Immunol.- 1999-№163. P. 3331-3343.

7. Verbeek S., Izon D., Hoiliuis F., Robanus-Maandag E., te Riele II., van de Wetering M., Oosterwegel M., Wilson A., MacDonald H.R., Clevers H. An HMG-box-containing T-cell factor required for thymocyte differentiation // Nature-1995-№374. P. 70-74.

8. Okamura R.M., Sigvardsson M., Galceran J., Verbeek S., Clevers II., Grosschedl R. Redundant regulation of T cell differentiation and TCRalpha gene expression by the transcription factors LEF-1 and TCF-1 // Immunity-1998-№8. P. 11-20.

9. Xu Y., Banerjee D., Huelsken J., Birchmeier W., Sen J.M. Deletion of beta-catenin impairs T cell development//Nat. Immunol.-2003-№4. P.l 177-1182.

10. Bender T.P., Kremer C.S., Kraus M., Buch T., Rajewsky K. Critical functions for c-Myb at three checkpoints during thymocyte development // Nat. Immunol. -2004-№5. P. 721-729.

11. Pearson R., Weston K. c-Myb regulates the proliferation of immature thymocytes following beta-selection // EMBO J. -2000-№19. P. 6112-6120.

12. Pai S.Y., Truitt M.L., Ting C.N., Leiden J.M., Glimcher L.H., Ho I.C. Critical roles for transcription factor GATA-3 in thymocyte development // Immunity-2003-№19.P. 863-875.

13. Xi H., Kersh G.J. Early growth response gene 3 regulates thymocyte proliferation during the transition from CD4-CD8- to CD4+CD8+ // J. Immunol. -2004- №172. P.964-971.

14. Bettini M., Xi II., Milbrandt J., Kersh G.J. Thymocyte development in early growth response gene 1-deficient mice//J. Immunol. -2002-№169. P.l 713-1720.

15. Miyazaki T., Lemonnier F.A. Modulation of thymic selection by expression of an immediate-early gene, early growth response 1 (Egr-1) // J. Exp. Med. -1998-№188. P.715-723.

16. Xanthoudakis S., Viola J.P., Shaw K.T., Luo C., Wallace J.D., Bozza P.T., Luk D.C., Curran T., Rao A. An enhanced immune response in mice lacking the transcription factor NFAT1 // Science-1996-№272. P. 892-895.

17. Ranger A.M., Oukka M., Rengarajan J., Glimcher L.I I. Inhibitory function of two NFAT family members in lymphoid homeostasis and Th2 development // Immunity-1998-№9. P. 627-635.

18. Rengarajan J., Mittelstadt P.R., Mages H.W., Gerth A.J., Kroczek R.A., Ashwell J.D., Glimcher L.II. Sequential involvement of NFAT and Egr transcription factors in FasL regulation // Immunity- 2000-№12. P.293-300.

19. Dzialo-Hatton R., Milbrandt J., Hockett R.D., Jr., Weaver C.T. Differential expression of Fas ligand in Thl and Th2 cells is regulated by early growth response gene and NFAT family members // J. Immunol. -2001-№166. P.4534-4542.

20. Cron R.Q., Bandyopadhyay R., Genin A., Brunner M., Kersh G.J., Yin J., Finkel T.H., Crow M.K. Early growth response-1 is required for CD154 transcription // J. Immunol.- 2006-№176. P.811-818.

21. Balciunaite G., Ceredig R., Fehling H.J., Zuniga-Pflucker J.C., Rolink A.G. The role of Notch and IL-7 signaling in early thymocyte proliferation and differentiation // Eur. J. Immunol.- 2005-№35. P.1292-1300.

22. Schmitt T.M., Ciofani M., Petrie H.T., Zuniga-Pflucker J.C. Maintenance of T cell specification and differentiation requires recurrent notch receptor-ligand interactions // J. Exp. Med.- 2004-№200. P.469-479.

23. Shortman K., Vremec D., Corcoran L.M., Georgopoulos K., Lucas K., Wu L. The linkage between T-cell and dendritic cell development in the mouse thymus // Immunol. Rev.- 1998-№165. P.39-46.

24. Rothenberg E.V., Telfer J.C., Anderson M.K. Transcriptional regulation of lymphocyte lineage commitment //Bioassays- 1999-№21. P.726-742.

25. Aruffo A., Stamenkovic I., Melnick M., Underhill C.B., Seed B. CD44 is the principal cell surface receptor for hyaluronate//Cell -1990-№61. P.1303-1313.

26. Zuniga-Pflucker J.C., Lenardo M.J. Regulation of thymocyte development from immature progenitors // Curr. Opin. Immunol. -1996-№8. P.215-224.

27. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. Москва. Медицина. 2002.

28. Kisielow P., Teh I I.S, Bluthmann Н., von Boehmer Н. Positive selection of antigen-specific T cells in thymus by restricting MHC molecules // Nature- 1988-№335.1. P.730-733.

29. Sha W.C., Nelson C.A., Newberry R.D., Kranz D.M., Russell J.I I., Loh D. Y. Positive and negative selection of an antigen receptor on T cells in transgenic mice // Nature-1988-№336. P.73-76.

30. MacDonald H.R., Hengartner H., Pedrazzini T. Intrathymic deletion of self-reactive cells prevented by neonatal anti-CD4 antibody treatment // Nature- 1988-№335.1. P. 174-176.

31. Pardoll D.M., Fowlkes B.J., Bluestone J.A., Kruisbeek A., Maloy W.L., Coligan J.E., Schwartz R.H. Differential expression of two distinct T-cell receptors during thymocyte development//Nature- 1987-№326. P.79-81.

32. Janeway, Charles A.; Travers, Paul; Walport, Mark; Shlomchik, Mark. Immunobiology. New York and London: Garland Science; 2005 .

33. Ярилин A.A. Основы Иммунологии. 1999.

34. Галактионов В.Г. Иммунология. Academia, 2004.

35. Fontenot J.D., Gavin М.А., Rudensky A.Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells // Nat. Immunol. -2003- №4. P.330-336.

36. Hayday A.C. Gamma.[delta] cells: a right time and a right place for a conserved third way of protection // Annu. Rev. Immunol.-2000-№18. P.975-1026.

37. Carding S.R., Egan P.J. Gammadelta T cells: functional plasticity and heterogeneity // Nat. Rev. Immunol. -2002-№2. P.336-345.

38. Shin S, El-Diwany R., Schaflert S., Adams E.J., Garcia K.C., Pereira P., Chien Y.I I. Antigen recognition determinants of gammadelta T cell receptors // Scicnce- 2005-№308. P.252-255.

39. Salerno A., Dieli F. Role of gamma delta T lymphocytes in immune response in humans and mice // Crit. Rev. Immunol. -1998-№18. P.327-357.

40. Adams E.J., Chicn Y.H., Garcia K.C. Structure of a gammadelta T cell receptor in complex with the nonclassical MHC T22 // Science- 2005-№308. P.227-231.

41. Lauritsen J.P., Haks M.C., Lefebvre J.M., Kappes D.J., Wiest D.L. Recent insights into the signals that control alphabeta/gammadelta-lineage fate // Immunol. Rev.-2006-№209. P. 176-190.

42. Petrie H.T., Scollay R., Shortman K. Commitment to the T cell receptor-alpha beta or -gamma delta lineages can occur just prior to the onset of CD4 and CD8 expression among immature thymocytes // Eur. J. Immunol. -1992-№22. P.2185-2188.

43. Bringman T.S., Aggarwal B.B. Monoclonal antibodies to human tumor necrosis factors alpha and beta: application for affinity purification, immunoassays, and as structural probes // IIybridoma-1987-№6. P.489-507.

44. Irving B.A., Alt F.W., Killeen N. Thymocyte development in the abscnce of pre-T cell receptor extracellular immunoglobulin domains // Science -1998-№280. P.905-908.

45. DeJarnette J.B., Sommers C.L., Huang K., Woodside K.J., Emmons R., Katz K., Shores E.W., Love P.E. Specific requirement for CD3epsilon in T cell development // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.- 1998-№95. P. 14909-14914.

46. Fehling II.J., Krotkova A., Saint-Ruf C., von Boehmer II. Crucial role of the pre-T-cell receptor alpha gene in development of alpha beta but not gamma delta T cells // Nature -1995-№375. P.795-798.

47. Haks M.C., Krimpenfort P., Borst J., Kruisbeek A.M. The CD3gamma chain is essential for development of both the TCRalphabeta and TCRgammadelta lineages // EMBO J.- 1998-№17. P.1871-1882.

48. Love P.E., Shores E.W., Johnson M.D., Tremblay M.L., Lee E.J., Grinberg A., Huang S.P., Singer A., Westphal H. T cell development in mice that lack the zeta chain of the T cell antigen receptor complex // Science -1993-№261. P.918-921.

49. Malissen M., Gillet A., Ardouin L., Bouvier G., Trucy J., Ferrier P., Vivier E., Malissen B. Altered T cell development in mice with a targeted mutation of the CD3-epsilon gene // EMBO J. -1995-№14. P.4641-4653.

50. Aifantis I., Azogui 0., Feinberg J., Saint-Ruf C., Buer .J, von Boehmer H. On the role of the pre-T cell receptor in alphabeta versus gammadelta T lineage commitment // Immunity -1998-№9. P.649-655.

51. Aifantis I., Buer J., von Boehmer H., Azogui 0. Essential role of the pre-T cell receptor in allelic exclusion of the T cell receptor beta locus // Immunity- 1997-№7. P.601-607.

52. Mombaerts P., Iacomini J., Johnson R.S., Herrup K., Tonegawa S., Papaioannou V.E. RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes // Cell -1992-№68.1. P.869-877.

53. Dudley E.C., Petrie H.T., Shah L.M., Owen M.J., Hayday A.C. T cell receptor beta chain gene rearrangement and selection during thymocyte development in adult mice //Immunity- 1994-№1. P.83-93.

54. Fehling 11. J., von Boehmer H. Early alpha beta T cell development in the thymus of normal and genetically altered mice // Curr. Opin. Immunol.-1997-№9. P.263-275.

55. Zinkernagel R.M., Doherty P.C. Restriction of in vitro T cell-mediated cytotoxicity in lymphocytic choriomeningitis within a syngeneic or semiallogeneic system // Nature-1974-№248. P.701-702.

56. Yachi P.P., Ampudia J., Zal T., Gascoigne N.R. Altered peptide ligands induce delayed CD8-T cell receptor interaction--a role for CD8 in distinguishing antigen quality // Immunity- 2006-№25. P.203-211.

57. Kjer-Nielsen L., Clements C.S., Purcell A.W., Brooks A.G., Whisstock J.C., Burrows S.R., McCluskey J., Rossjohn J. A structural basis for the selection of dominant alphabeta T cell receptors in antiviral immunity// Immunity -2003-№18. P.53-64.

58. Ho I.C., Vorhees P., Marin N. Oakley B.K., Tsai S.F., Orkin S.H., Leiden J.M.Human GATA-3: a lineage-restricted transcription factor that regulates the expression of the T cell receptor alpha gene // EMBO J. -1991-№10. P. 1187-1192.

59. Yamamoto M., Ko L.J., Leonard M.W., Beug II., Orkin S.H., Engel J.D. Activity and tissue-specific expression of the transcription factor NF-E1 multigene family // Genes Dev.-1990-№4. P. 1650-1662.

60. George K.M., Leonard M.W., Roth M.E., Lieuw K.H., Kioussis D., Grosveld F., Engel J.D.Embryonic expression and cloning of the murine GATA-3 gene // Development- 1994-№120. P.2673-2686.

61. Oosterwegel M., Timmerman J., Leiden J., Clevers II. Expression of GATA-3 during lymphocyte differentiation and mouse embryogenesis // Dev. Immunol.- 1992-№3. P. 1-11.

62. Manaia A., Lemarchandel V., Klaine M., Max-Audit I., Romeo P., Dieterlen-Lièvre F., Godin I.Lmo2 and GATA-3 associated expression in intraembryonic hemogenic site // Development -2000-№127. P.643-653.

63. Ghosh S., May M.J., Kopp E.B. NF-kappa B and Rel proteins: evolutionary conserved mediators of immune responses // Annu. Rev. Immunol. -1998-№60. P.225-260.

64. Franzoso G., Carlson .L, Xing L., Poljak L., Shores E.W., Brown K.D., Leonardi A., Tran T., Boyce B.F., Siebenlist U. Requirement for NF-kappaB in osteoclast and B-cell development // Genes Dev. -1997-№11. P.3482-3496.

65. Voll R.E., Jimi E., Phillips R.J., Barber D.F., Rincon M., Hayday A.C., Flavell R.A., Ghosh S.NF-kappa B activation by the pre-T cell receptor serves as a selective survival signal in T lymphocyte development // Immunity- 2000-№13. P.677-689.

66. Ghosh S., Karin M. Missing pieces in the NF-kappaB puzzle // Cell- 2002-№l 09 Suppl:S81-S96.

67. Barkett M., Gilmore T.D. Control of apoptosis by Rel/NF-kappaB transcription factors. Oncogene- 1999-№18. P.6910-6924.

68. Oh I.H., Reddy E.P. The myb gene family in cell growth, differentiation and apoptosis // Oncogene -1999-№ 18. P.3017-3033.

69. Akashi K., Traver D., Miyamoto T., Weissman I.L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages // Nature -2000-№404. PI93-197.

70. Westin E.H., Gallo R.C., Arya S.K., Eva A., Souza L.M., Baluda M.A., Aaronson S.A., Wong-Staal F. Differential expression of the amv gene in human hematopoietic cells // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. -1982-№79. P.2194-2198.

71. Mucenski M.L., McLain K., Kier A.B., Swerdlow S.U., Schreiner C.M., Miller T.A., Pietryga D.W., Scott W.J. Jr, Potter S.S.A functional c-myb gene is required for normal murine fetal hepatic hematopoiesis // Cell-1991-№65. P.677-689.

72. Emambokus N., Vegiopoulos A., Harman B., Jenkinson E., Anderson G., Frampton J. Progression through key stages of haemopoiesis is dependent on distinct threshold levels of c-Myb // EMBO J. -2003-№22. P.4478-4488.

73. Ess K.C., Witte D.P., Bascomb C.P., Aronow B.J. Diverse developing mouse lineages exhibit high-level c-Myb expression in immature cells and loss of expression upon differentiation//Oncogene- 1999-№18. P.l 103-1 111.

74. Stern J.B., Smith K.A. Interleukin-2 induction of T-cell Gl progression and c-myb expression // Science -1986-№233. P.203-206.

75. Chang H.C., Zhang S., Thieu V.T., Slee R.B., Bruns H.A., Laribee R.N., Klemsz M.J., Kaplan M.H.PU.l expression delineates heterogeneity in primary Th2 cells // Immunity -2005-№22. P.693-703.

76. Anderson M.K., Weiss A.H., Hernandez-Hoyos G., Dionne C.J., Rothenberg E.V. Constitutive expression of PU.l in fetal hematopoietic progenitors blocks T cell development at the pro-T cell stage // Immunity -2002-№16. P.285-296.

77. Anderson M.K., Hernandez-Hoyos G., Dionne C.J., Arias A.M., Chen D., Rothenberg E.V. Definition of regulatory network elements for T cell development by perturbation analysis with PU.l and GATA-3 //Dev. Biol. -2002-№246. P. 103-121.

78. Dionne C.J., Tse K.Y., Weiss A.H., Franco C.B., Wiest D.L., Anderson M.K., Rothenberg E.V.Subversion ofT lineage commitment by PU.l in a clonal cell line system // Dev. Biol.- 2005-№280. P.448-466.

79. Spain L.M., Guerriero A., Kunjibettu S., Scott E.W. T cell development in PU.l-deficicnt mice//J. Immunol. -1999-№163. P.681-687.

80. Scott E.W., Simon M.C., Anastasi .J, Singh I I. Requirement of transcription factor PU.l in the development of multiple hematopoietic lineages // Science- 1994-№265. P.1573-1577.

81. Linderson Y., French N.S., Neurath M.F., Pettersson S. Context-dependent Pax-5 repression of a PU.l/NF-kappaB regulated reporter gene in B lineage cells // Gene-2001-№262. P. 107-114.

82. Rekhtman N., Radparvar F., Evans T., Skoultchi A.I. Direct interaction of hematopoietic transcription factors PU.l and GATA-1: functional antagonism in erythroid cells // Genes Dev. -1999-№13. P.1398-1411.

83. Rekhtman N., Choe K.S., Matushansky I., Murray S., Stopka T., Skoultchi A.I. PU. 1 and pRB interact and cooperate to repress GATA-1 and block erythroid differentiation // Mol. Cell. Biol.-2003-№23. P.7460-7474.

84. Zhang P., Zhang X., Iwama A., Yu C., Smith K.A., Mueller B.U., Narravula S., Iorbett B.E., Orkin S.I I., Tenen D.G.PU.1 inhibits GATA-1 function and erythroid differentiation by blocking GATA-1 DNA binding // Blood -2000-№96. P.2641-2648.

85. Lefebvre J.M., Haks M.C., Carleton M.O., Rhodes M., Sinnathamby G., Simon M.C., Eisenlohr L.C., Garrett-Sinha L.A., Wiest D.L. Enforced expression of Spi-B reverses T lineage commitment and blocks beta-selection //J. Immunol. -2005-№174. P.6184-6194.

86. Murre C., Bain G., van Dijk M.A., Engel I., Furnari B.A., Massari M.E., Matthews J.R., Quong M.W., Rivera R.R., Stuiver M.H. Structure and function of helix-loop-helix proteins // Biochim. Biophys. Acta -1994-№l218. P. 129-135.

87. Engel 1., Murre C. The function of E- and Id proteins in lymphocyte development // Nature Rev. Immunol. -2001-№1. P.193-199.

88. Yan W., Young A.Z., Soares V.C., Kelley R., Benezra R., Zhuang Y. High incidence of T-cell tumors in E2A-null mice and E2A/Idl double-knockout mice // Mol. Cell. Biol.-1997-№17. P.7317-7327.

89. Engel I., Murre C. Ectopic expression of E47 or El2 promotes the death of E2A-deficient lymphomas // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.- 1999-№96. P. 996-1001.

90. Park S.T., Nolan G.P., Sun X.H. Growth inhibition and apoptosis due to restoration of E2A activity in T cell acute lymphoblastic leukemia cells // J. Exp. Med. -1999-№189. P.501-508.

91. Zhuang Y., Soriano P., Weintraub H. The helix-loop-helix gene E2A is required for B cell formation//Cell- 1994-№79. P.875-884.

92. Zhuang Y., Cheng P., Weintraub H. B-lymphocyte development is regulated by the combined dosage of three basic helix-loop-helix genes, E2A, E2-2, and HEB // Mol. Cell. Biol. -1996-№16. P.2898-2905.

93. Bain G., Quong M.W., Soloff R.S., Hedrick S.M., Murre C. Thymocyte maturation is regulated by the activity of the helix-loop-helix protein, E47 // J. Exp. Med. -1999-№190. P. 1605-1616.

94. Norton J.D., Deed R.W., Craggs G., Sablitzky F. Id helix-loop-helix proteins in cell growth and differentiation //. -1998-№8. P.58-65.

95. Pan L., Sato S., Frederick J.P., Sun X.H., Zhuang Y. Impaired immune responses and B-cell proliferation in mice lacking the Id3 gene// Mol. Cell. Biol. -1999-№19.1. P.5969-5980.

96. Yokota Y., Mansouri A., Mori S., Sugawara S., Adachi S., Nishikawa S., Gruss P. Development of peripheral lymphoid organs and natural killer cells depends on the helix-loop-helix inhibitor Id2//Nature- 1999-№397. P.702-706.

97. Rivera R.R., Johns C.P., Quan J., Johnson R.S., Murre C. Thymocyte selection is regulated by the helix-loop-helix inhibitor protein, Id3 // Immunity -2000-№12. P.17-26.

98. Miyazaki T. Two distinct steps during thymocyte maturation from CD4-CD8- to CD4+CD8+ distinguished in the early growth response (Egr)-l transgenic mice with a recombinase-activating gene-deficient background // J. Exp. Med. -1997-№186.1. P.877-885.

99. Marada T., Morooka T., Ogawa S., Nishida E. ERK induces p35, a neuron-specific activator of Cdk5, through induction of Egrl //. -2001-№3. P.453-459.

100. Khachigian L.M., Lindner V., Williams A.J., Collins T. Egr-l-induced endothelial gene expression: a common theme in vascular injury // Science -1996-№271. P. 14271431.

101. Lee S.L., Sadovsky Y., Swirnoff A.H., Polish J.A., Goda P., Gavrilina G., Milbrandt J. Luteinizing hormone deficiency and female infertility in mice lacking the transcription factor NGFI-A (Egr-1) // Science- 1996-№273. P. 1219-1221.

102. Gashler A., Sukhatme V.P. Early growth response protein 1 (Egr-1): prototype of a zinc-finger family of transcription factors // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol.- 1995-№50.P.191-224.

103. Kaufinann K., Thiel G. Epidermal growth factor and thrombin induced proliferation of immortalized human keratinocytes is coupled to the synthesis of Egr-1, a zinc finger transcriptional regulator//J. Cell Biochem. -2002-№85. P.:381-391.

104. Kaufniann K., Thiel G. Epidermal growth factor and platelet-derived growth factor induce expression of Egr-1, a zinc finger transcription factor, in human malignant glioma cells //J. Neurol. Sci. -2001-№189. P.83-91.

105. Perez-Castillo A., Pipaon C., Garcia I., Alemany S. NGFI-A gene expression is necessary for T lymphocyte proliferation//J. Biol. Chem. -1993-№268. P. 1944519450.

106. Biesiada E., Razandi M., Levin E.R. Egr-1 activates basic fibroblast growth factor transcription. Mechanistic implications for astrocyte proliferation // J. Biol. Chem. -1996-№271. P. 18576-18581.

107. Hofer G., Grimmer C., Sukhatme V.P., Sterzel R.B., Rupprecht H.D. Transcription factor Egr-1 regulates glomerular mesangial cell proliferation // J. Biol. Chem.- 1996-№271. P.28306-28310.

108. Kaufmann K., Bach K., Thiel G. The extracellular signal-regulated protein kinases Erkl/Erk2 stimulate expression and biological activity of the transcriptional regulator Egr-1 // Biol. Chem. -2001-№382. P. 1077-1081.

109. Bid M.A., Kumar M.V., Iczkowski K.A., Bostwick D.G., Tindall D.J. Expression of early growth response genes in human prostate cancer // Cancer Res. -1998-№58. P.2461-2468.

110. Riggs P.K., Rho 0., DiGiovanni J. Alteration of Egr-1 mRNA during multistage carcinogenesis in mouse skin // Mol. Carcinog. -2000-№27. P.247-251.

111. Khachigian L.M., Williams A.J, Collins T. Interplay ofSpl and Egr-1 in the proximal platelet-derived growth factor A-chain promoter in cultured vascular endothelial cells //J. Biol. Chem.-1995-№270. P.27679-27686.

112. Svaren J., Ehrig T., Abdulkadir S.A., Ehrengruber M.U., Watson M.A., Milbrandt J. EGR1 target genes in prostate carcinoma cells identified by microarray analysis // J. Biol. Chem.- 2000-№275. P.38524-38531.

113. Nair P., Muthukkumar S., Sells S.F., Han S.S., Sukhatme V.P., Rangnekar V.M. Early growth response-1-dependent apoptosis is mediated by p53 // J. Biol. Chem. -1997-№272. P.20131-20138.

114. Ham J, Eilers A., Whitfield J., Neame S.J., Shah B. c-Jun and the transcriptional control of neuronal apoptosis//Biochem. Pharmacol.-2000-№60. P. 1015-1021.

115. Virolle T., Adamson E.D., Baron V., Birle D., Mercola D., Mustelin T., de Belle I. The Egr-1 transcription factor directly activates PTEN during irradiation-induced signaling//Nat. Cell Biol. -2001-№3. P.l 124-1128.

116. Swiatek P.J., Gridley T. Perinatal lethality and defects in hindbrain development in mice homozygous for a targeted mutation of the zinc finger gene Krox20 // Genes Dev. -1993-№7.P.2071-2084.

117. Shao II., Kono D.H., Chen L.Y., Rubin E.M., Kaye J. Induction of the early growth response (Egr) family of transcription factors during thymic selection // J. Exp. Med. -1997-№185. P.731-744.

118. Shaw J.P., Utz P.J., Durand D.B., Toole J.J., Emmel E.A., Crabtree G.R. Identification of a putative regulator of early T cell activation genes // Science -1988-№241. P.202-205.

119. Rao A., Luo C., I logan P.G. Transcription factors of the NFAT family: regulation and function // Annu. Rev. Immunol. -1997-№15. P.707-747.

120. Graef I.A., Chen F., Crabtree G.R. NFAT signaling in vertebrate development // Curr. Opin. Genet. Dev. -2001-№11. P.505-512.

121. Crabtree G.R., Olson E.N. NFAT signaling: choreographing the social lives of cells // Cell 2002; 109 Suppl:S67-79.:S67-S79.

122. Ilogan P.G., Chen L., Nardone J., Rao A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT // Genes Dev. -2003-№17. P.2205-2232.

123. Lopez-Rodriguez C., Aramburu J., Jin L., Rakeman A.S., Michino M., Rao A. Bridging the nfat and nf-kappab families. nfat5 dimerization regulates cytokine gene transcription in response to osmotic stress // Immunity -2001-№15. P.47-58.

124. Park J., Takeuchi A., Sharma S. Characterization of a new isoform of the NFAT (nuclcar factor of activated T cells) gene family member NFATc // J. Biol. Chem. -1996-№271.P.20914-20921.

125. Chen L., Glover J.N., Hogan P.G., Rao A., Harrison S.C. Structure of the DNA-binding domains from NFAT, Fos and Jun bound specifically to DNA // Nature -1998-№392. P.42-48.

126. Rengarajan J., Tang B., Glimcher L.H. NFATc2 and NFATc3 regulate T(H)2 differentiation and modulate TCR-responsiveness of naive T(H)cells // Nat. Immunol. -2002-№3. P.48-54.

127. Peng S.L., Gerth A.J., Ranger A.M., Glimcher L.II. NFATc 1 and NFATc2 together control both T and B cell activation and differentiation // Immunity- 2001-№14. P.13-20.

128. Kiani A., Viola J.P., Lichtman A.H., Rao A. Down-regulation of IL-4 gene transcription and control of Th2 cell differentiation by a mechanism involving NFAT I //Immunity- 1997-№7. P.849-860.

129. Porter C.M., Clipstone N.A. Sustained NFAT signaling promotes a Th 1 -like pattern of gene expression in primary murine CD4+ T cells // J. Immunol. -2002-№168. P.4936-4945.

130. Avni 0., Lee D., Macian F., Szabo S.J., Glimcher L.H., Rao A. T(I I) cell differentiation is accompanied by dynamic changes in histone acetylation of cytokine genes//Nat. Immunol. -2002-№3. P.643-651.

131. Gwack Y., Sharma S., Nardone J., Tanasa B., Iuga A., Srikanth S., Okamura H., Bolton D., Feske S., Hogan P.G., Rao A. A genome-wide Drosophila RNAi screen identifies DYRK-family kinases as regulators of NFAT // Nature -2006-№441. P.646-650.

132. Alberts, Bruce; Johnson, Alexander; Lewis, Julian; Raff, Martin; Roberts, Keith; Walter, Peter. Molecular biology of the cell // New York and London: Garland -Science-2002.

133. Li-Weber M., Laur 0., Krammer P.H. Novel Egr/NF-AT composite sites mediate activation of the CD95 (APO-l/Fas) ligand promoter in response to T cell stimulation // Eur. J. Immunol. -1999-№29. P.3017-3027.

134. Carleton M., RuetschN.R., BergerM.A., Rhodes M., Kaptik S., Wiest D.L. Signals transduced by CD3epsilon, but not by surface pre-TCR complexes, are able to induce maturation of an early thymic lymphoma in vitro // J. Immunol. -1999-№163. P.2576-2585.

135. Beals C.R., Clipstone N.A., Ho S.N., Crabtree GR. Nuclear localization of NF-ATc by a calcineurin-dependent, cyclosporin-sensitive intramolecular interaction // Genes Dev.- 1997-№11. P.824-834.

136. Fagerholm S., Hilden T.J., Gahmberg C.G. Lck tyrosine kinase is important for activation of the CD 1 la/CD 18-integrins in human T lymphocytes // Eur. J. Immunol.-2002-№32. P. 1670-1678.

137. DeSilva D.R., Jones E.A., Favata M.F., Jaffee B.D., Magolda R.L., Trzaskos J.M., Scherle P.A. Inhibition of mitogen-activated protein kinase kinase blocks T cell proliferation but does not induce or prevent anergy//J. Immunol.- 1998-№160. P.4175-4181.

138. Han Z., Boyle D.L., Chang L., Bennett B., Karin M., Yang L., Manning A.M., Firestein G.S. c-Jun N-terminal kinase is required for metalloproteinase expression and joint destruction in inflammatory arthritis //J. Clin. Invest.- 2001-№108. P.73-81.

139. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning // A Laboratory Manual, 2 Edn. Plainview, NY: Cold Spring Harbor Lab. Press-1989.

140. Neal J.W., Clipstone N.A. Glycogen synthase kinase-3 inhibits the DNA binding activity ofNFATc//J. Biol. Chem. -2001-№276. P.3666-3673.

141. Haks M.C., Belkowski S.M., Ciofani M., Rhodes M, Lefebvre J.M., Trop S., Hugo P., Zuniga-Pflucker J.C., Wiest D.L. Low activation threshold as a mechanism for ligand-independent signaling in pre-T cells // J. Immunol.- 2003-№l 70. P.2853-2861.

142. Coelen R.J., Jose D.G., May J.T. The effect of hexadimethrine bromide (polybrene) on the infection of the primate retroviruses SSV 1/SSAV 1 and BaEV // Arch. Virol. -1983-№75. P.307-311.

143. Schmitt T.M., Zuniga-Pilucker J.C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro // Immunity- 2002-№17. P.749-756.

144. Schreiber E., Matthias P., Muller M.M., Schaffner W. Rapid detection of octamer binding proteins with mini- extracts, prepared from a small number of cells // Nucleic Acids Res.-1989-№17. P.6419.

145. Macian F. NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function // Nat.

146. Rev. Immunol.- 2005-№5. P.472-484.

147. Macian F., Garcia-Rodriguez C., Rao A. Gene expression elicited by NFAT in the presence or absence of cooperative recruitment of Fos and Jun // EMBO J. -2000-№19. P.4783-4795.

148. Gounari F., Aifantis I., Khazaie K., Iloeflinger S., Harada N., Taketo M.M., von Boehmer II. Somatic activation of beta-catenin bypasses pre-TCR signaling and TCR selection in thymocyte development//Nat. Immunol. -2001-№2. P.863-869.

149. Engel I., Murre C. The function of E- and Id proteins in lymphocyte development // Nat. Rev. Immunol.-2001-№1. P. 193-199.

150. Engel I., Johns C., Bain G., Rivera R.R., Murre C. Early thymocyte development is regulated by modulation of E2A protein activity // J. Exp. Med.-2001-№194. P.733-745.

151. Rivera R., Murre C. The regulation and function of the Id proteins in lymphocyte development // Oncogene- 2001-№20. P.8308-8316.1. БЛАГОДАРНОСТИ

152. Кроме того, я хочу выразить благодарность всем сотрудникам кафедры биохимии МГМСУ за поддержку, помощь и ценные обсуждения результатов данной диссертационной работы.