Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Совершенствование технологии ускоренного размножения винограда методом in vitro и применение регуляторов роста в условиях in vitro и in vivo
ВАК РФ 06.01.08, Виноградарство
Автореферат диссертации по теме "Совершенствование технологии ускоренного размножения винограда методом in vitro и применение регуляторов роста в условиях in vitro и in vivo"
$-35302
ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВИНОГРАДАРСТВА И ВИНОДЕЛИЯ нменк Я, И. ПОТАПЕНКО
На правах рукописи БАТУКАЕВ Абдулмалик Абдулхамндовнч
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ УСКОРЕННОГО РАЗМНОЖЕНИЯ ВИНОГРАДА МЕТОДОМ IN VITRO И ПРИМЕНЕНИЕ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА В УСЛОВИЯХ IN VITRO и IN VIVO
Специальность: 06.01.08 — виноградарство
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук
МОСКВА 1999
Работа выполнена tía кафедре виноградарства Московской сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева н в отделе виноградарства Чеченского ii ta у чно-исследователь-ского института сельского хозяйства.
Научный консультант—доктор сельскохозяйственных наук,
профессор К. В. Смирнов.
Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных
наук, академик РАСХН профессор В. С. Шсвелуха; доктор биологических наук, академик РАЕН, профессор Л. П. Трошин;
доктор сельскохозяйственных ¡наук, Г. П. Малых.
Ведущая организация: НПО «Сады Кубани».
Защита состоится «2Л» . . 1999 г. в час.
на заседании диссертационного совета Д.020.78,01 во Всероссийском научно-исследовательском институте виноградарства н виноделия имени Я. И. Потапенко по адресу: 346421, Ростовская область, г. Новочеркасск, проспект Баклаковскнп, 1G8.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИВцВ имени Я. И. Потапенко.
Автореферат разослан . , . . 1999 г.
Отзывы из автореферат в двух экземплярах, заверенные и скрепленные гербовой печатью, просим направлять Ученому секретарю совета.
Ученый ССК|_ диссертационного cóSSTJT кандидат сельскохозяйствен! наук
В. С, Петров.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Акту»лы10стъ темы исследования. Виноград — одна га самых распространенных сельскохозяйственных культур, играющая существенную роль в мировой экономике.
Как свидетельствует мировой опыт, главная стратегия научно-технического прогресса заключается в решении проблем и вопросов, кмеюших базисное основополагающее значение, приводящее о конечном итоге и к большому экономического эффекту, В этом аспекте пути и методы БИОТЕХНОЛОГИИ — науки, возникающей на стыке нескольких биологических дисциплин: генетики, вирусологии, микробиологии и растениеводства занимают исключительно важное значение.
Стало очевидным, что выход из кризиса, обеспечение эффективности производства, повышение финансовой устойчивости и конкурентоспособности продукции невозможны без перехода к новым технологиям и быстрого высокоэффективного технико-экономического освоения новых мощностей, создаваемых на основе базисных нововведений. В этом смысле особого внимания заслуживают проблемы организационно-экономического развития и освоения биотехнологии.
Ускоренное расширение площадей под новыми перспективными ценными сортами возможно только за счет разработок и совершенствования технологий, обеспечивающих ускоренное размножение перспективных сортов нового поколения, "сочетающих в себе повышение их урожайности и качество продукции с повышенной устойчивостью к неблагоприятным биотическим и абиотическим факторам.
С учетом этого, во многих странах мира большое значение в настоящее время придается внедрению в производство интенсивных методов производства высококачественного посадочного материала винограда и разработке новых высокоэффективных способов ззхлалхи виноградников. Одновременно с этим актуальной проблемой настоящего времени является
ЦИБ МСХА фоцд научной литературы
резкое сокращение или полное исключение использования химических веществ, загрязняющих экологию зон подделывай«* винограда в борьбе с болезнями, вредителями и сорной растительностью, внедрение сортов, устойчивых к болезням и вредителям, не требующих химических средств борьбы. Поэтому особый интерес представляют сорта технического и столового направления, отличающиеся повышенной устойчивостью к болезням (мкльдью, оидиум, серая гииль, актрокноз и др.) и морозам. И это понятно. Ведь возделывание винограда комплексно-устойчивых сортов выгодно как экономически (меньше затрат труда и средств), так и экологически (продукция без остаточного количества ядохимикатов).
За последние десятилетни благодаря активной работе селекционеров виноградарей Российской федерации и ряда зарубежных стран получено и передается ' производству большой набор новых сортов, отвечающих современным требованиям.
Однако одним из существующих препятствий на пути внедрения нового сорта а практику является низкий коэффициент их размножения обычными методами, не позволяющий получать в течение одного сезона большое количество посадочного материала. Это препятствие может быть устранено за счет использования достижений биотехнологии, которая предлагает селекционерам эффективный м быстрый метод микрораэмножения растений. Очень важно и то, что посадочный материал, получаемый этим путем, генетически идентичен давшему ему начало материнскому растению.
Кроме того, клональмое микрораэмиожение винограда имеет р*д преимуществ и особенностей, а именно:
проводится в' лабораторных условиях, что исключает влияние различных негативных факторов окружающей среды;
обеспечивает высокий коэффициент размножения; позволяет производить посадочный материал оздоровленный от вирусов и бактериального рака ; ■■
- проводить размножение растений круглогодично н на потоке. Таким образом, появляется возможность размножать сорта, которые плохо укореняются обычным способом и получать с единицы плошали максимальное количество растений. При использовании этой технологии размножения исключается возможность перезаражения растений во время интродукции, а также устраняется вероятность завоза и распространения карантинных объектов, что имеет также немаловажное значение для обеспечения длительного хранения растений, находящихся в пробирках с целью сохранения генофонда. При использовании згой технологии значительно ускоряется процесс передачи Новых сортов и клонов в ГСУ и создаются за более короткий период мнкроматочники интенсивного типа в производственных условиях.
Цель и задачи исследований. Целью наших исследований являлось изучение особенностей регенерации растений и разработка рациональных згро приемов при клонапьном микроразмножения посадочного материала винограда, использование этих приемов в системе оздоровления и размножения посадочного материала, а также усовершенствование способов адаптации растений винограда, размноженных методом in vitro, для увеличения приживаемости в условиях in vivo и обеспечивающих повышение выхода и качества посадочного материала винограда, а также установление принципиальной . возможности использования гиббереллнна на семенных «ортах винограда н разработка рациональных способов обработки виноградных насаждений механизированным способом пут£м сплошного опрыскивания.
В *той слязи нами применимо к культуре винограда решались следующие задачи: ' .
1. изучал* н оптимизировать факторы, влияющие на регенерацию эксплантами вегетативных органов;
-2/. оптимизировать состав питательных сред на всех этапах культивирования эксплантов;
3. выявить оптимальные концентрации регуляторов роста и других мшест» при /тигельном культивировании и хранении пробирочных растений;
4. исследовать возможность освобождения от вирусов получаемых растений метолом культуры изолированных алексо» {получение беэвирусних клонов с целью производства здорового посадочного материала винограда);
5. изучить и разработать эффективные способы переноса пробирочных растений in vitro в нестерильные условия in vivo;
6. определить оптимальные условия выращивания при адаптации растений, полученных in vitra и на основ« их использования разработать технологические приемы;
7. определить экспериментальным путем оптимальный субстрат для выращивания растений, полученных к условиях in vitro;
8. изучить возможность повышения коэффициента размножения;
9. изучить эффективность действия стимуляторов росте при адаптации и выгонке, растений, полученных in vitro и рекомендовать наиболее перспективные нз них для практического использования; ,f-
10. выявить видовой состав нематод на участках, предназначенных под закладку микроматочников оздоровленным посадочным материалом винограда;
11. изучить аяпяиие гибберелпина на рост и развитие вегетативных н генеративных органов виноградного растения;
12. изучить влияние гиббереплина на качество и продуктивность насаждений семенных сортов винограда; - '.;':.
13. щучить влияние тмбберешшна на физиологические и биохимические показатели сортов винограда разлитых эколого-географнчеси« групп;'
14. разработать регламенты . ' механизированной S обработки гибберелянном насаждений семенных сортов винограда (сроки обработки^ концентрации раствора и др.),. : ■"■.,}'-J.'" ;: !-ví
В работе изучен, обобщен н использован опыт работы ведущих стран мира по производству и переработке еиж»раяа, та101Х11^ Фраииия, И1алия,'
Испания, США, Австралия - и др.(всего 16 стран) в период прохождения стажировки по линии МОВВ (1993... 1996 гг.). Во Франции основные исследования по in vitro винограда проводится в лабораториях тканевой культуры Национального иаучно-иссждоватеяьского института в Монпелье под руководством профессора Boubals D. и на Национальной (Государственной) опытной станции по оздоровлению, расположенной на tor« Франции на. прибрежных песках Средиземного Моря, под руководством профессора Grcnan S. Основные направления научных работ: оздоровление и размножение методом in vitro посадочного материала винограда; координация всех маучно-исследомтельских работ в стране по санитарной и клеточной селекцнн; прививка винограда в условиях in vitro и изучение совместимости различных, привоев с подвоем; создание базовых маточников, размножение н распространение оздоровленного посадочного материала винограда по всей стране. В Испании. а Научно-исследовательском институте Агробиологии исследователями Martinez M.C.R. и Mantilla J.L.G. проводятся исследования по вопросам сохранения генотнпнческой стабильности у растений, размноженных в культуре изолированной ткани н устранения характера ювсннльностн. В Португалии, Аргентине и Венгрии занимаются изучением общих вопросов оздоровления. посадочного - материала , винограда и созданием базовых маточников. В США irna руководством профессоров Wokcr R. н Meridit К. в условиях in vttro исследуют проблемы, связанные с генетической инженерией н клеточной селекыней многрша..
Научим ноимэнж. Впервые в условиях Чеченской Республики проведено оздоровление я размножение посадочного материала винограда методом in vitro. Предложены более совершенные методы мнкрокл овального размножения винограда; при введении экепдантов винограда в культуру in vitro и их развитие на этапе мккроразы ножен ил установлены оптимальные концентрации распоров регуляторов роста, кх влияние на развитие жеплантоа в условиях in vitro, а также на укоренение, рост и разлитие растений, в период их дотации и
выгонки в условиях in vivo; впервые для адагггации и выгонки пробирочных растений изучены и рекомендованы субстраты из цеолитов Тедзаминсхого месторождения, определен их оптимальный гранулометрический состав фракций и его влияние на укоренение, рост и развитие растений винограда » условиях in vitro и in vivo; изучено влияние водного режима и физических свойств кеолитовых субстратов на рост растений винограда; впервые изучен и рекомендован метод адаптации в широких пробирках, который позволяет в весенний период высаживать растения in vitro непосредственно в теплицу, минуя промежуточный этап адатацни в сосуд-пакетах; на этапе дополнительного повышения коэффициента размножения в условиях in vivo (в сосуд-пакетах) изучено и рекомендовано использовать, перлит двухразового обжига; впервые проведены широкомасштабные исследования наличия ъирусоносителей на участках планируемых под закладку маточников оздоровленным посадочным материалом винограда и установлено, что из трех выбранных для закладки в них маточников в госхозе «Гребеиской* имеются вирусоноситедн Xiphinema index и Longidorus elongatus. Проведенный нами анализ на наличие вирусов в растениях, полученных методом in vitro по методу Elisa teste показал, что в растениях, оздоровленных в условиях in vitro, вирус отсутствует. На основе всестороннего анализа и обобщения, а также многолетней экспериментальной проверки вначале в лабораторных, а затем и в производственных условиях усовершенствована технология микроклоналыгого размножения винограда. Впервые проведено агробиологическое, цнтоэмбрнологическое и хозяйственно-технологическое изучение влияния гнббереллина на семенных сортах винограда при сплошном их опрыскивании и ' установлена биологическая возможность и экономическая целесообразность применения приема механизированной обработан сортов винограда, имеющих функционалыю-женский тип цветка, который обеспечивает увеличение рентабельности используемого приема на 27,4%, В результате многолетних испытаний установлено, что характер и эффективность действия препарата на
виноградное растение в значительной степени зависят от принадлежности сортов к различным эколого-геогрзфнчеекмм группам, их биологических особенностей, концентрации раствора препарата и срока обработки, «первые проведено испытание действия препарата дроп на семенные сорта винограда.
Практическая значимость и реализация результате») исследований. Практическая значимость состоит а том, что предлагаемая технологи» клонального микроразмножения винограда позволяет производить оздоровленный от вирусов и патогенных микроорганизмов посадочный материал винограда круглогодично к на потоке, имея при этом высокий
коэффициент размножения.
На основании проведенных исследований и опытов по элементам более совершенной технологии in vitro из оздоровленного посадочного материала винограда созданы микроматочники в виноградарских хозяйствах Чеченской Республики (госхозы «Восточный», «Авангард», «Советская Россия», ОПХ «Ги каловское»), Республике Дагестан (госхоз «АксаЙ») и Ростовской области (госхоз «Краснодонский») на площади более 10 га.
. Предложенная технология по механизированному опрыскиванию семенных сортов винограда, имеющих функционально-женский тип цветка позволяет повысить урожайность. и качество семенных сортов винограда, имеющих функционалыю-жеяскнй тип цветка Нимранг и Кзттакургам при незначительных затратах труда.
Положенно, выносимые на защиту. Совершенствование сортамента винограда с учетом современных требований была, есть, будет н в перспективе одной из ведущих актуальных проблем. Эффективность ее решения тесно связана соовсхамл и разработкой прогрессивных технологий ускоренного Размножения н ~ внедрения новых сортов вянограда, обеспечивающих повышение коэффициента их размножения и получение оздоровленного сертифицированного посадочного материала.
Одним из путей и методов ей решения является технология микроклоиалСного размножения винограда, которая представляет собой систему приемов и методов, органически связанных между собой. Каждое та звеньев этой технологии находится, в свою очередь, в процессе бесконечного совершенствования и модификации. Изложенная в диссертации технология представляет собой усовершенствованную модель, основанную на обобщении экспериментально разработанных нами звеньев и широком использовании: передового зарубежного опыта. Многолетняя проверка жизненности и эффективности использования этой технологии в производственных условиях показала еС состоятельность и эффективность, доказательством чему является получение высококачественного оздоровленного посадочного материала винограда, которым заложено более 10 га маточников новых сортов а б виноградарских хозяйствах.
На защиту выносятся усовершенствованные звенья этой технологии к числу которых, главным образом относятся: эффективность использования 2%-го гинохлорита Ыа при экспозиции 10 мнн; модифицированная питательная среда Мураснге и Скуга по сравнению со средами Готре, Уайта и Хеллера; . лучшая регенерация изолированных меристем винограда при использовании 6-БАП в концентрации 0,5-1,0 мг/л, а при массовом размножении одноглазковыми эксплаитами в концентрации 2 мг/л, также при этом выявлена эффективность действия 2-»Р (нэопенгалаленнн); преимущества ПС в концентрации 1,0 мг/л в сочетании с 6-БАП в концентраций 0,5 мг/л; повышение активности и общей результативности укоренения микропобегов на питательной среде, содержащей ИМ К в концентрации 2 мг/л; испольк>ваняе -различных субстратов ■ (песок, перлит, иеолит) в сосуд-пакетах из полизтилеиовой пленки при переносе растений, находящихся в пробирках в нестерильные условия; преимущества использовали* субстрата перлита 2-разового обжига, обеспечивающего приживаемость растений и собственно размножения в сосуд-пакетах; оптимизация срока пересадки растений
винограда после адаптации » условия защищенного грунта (месяцы: март, апрель); оптимизация по механическому составу твердой, жидкой м газообразной фаз цеолигового субстрата с пористостью 50% н НВ-50%; сокращение периода укоренения растений винограда в условиях tn vivo на цеолиювом субстрате; а также ряд других звеньев обшей технологии микроклонального размножения и оздоровления посадочного материала винограда.
Все вышеизложенные закономерности получены на основе методически выдержанных многолетних экспериментов, анализа и обобщения опыта зарубежных стран.
В число традиционных методов, способствующих повышению урожайности виноградм н ко в (удобрения,' орошение,, фнготехннка и др.) в последние десятилетня воцкл эффективный прием обработки виноградных насаждений регуляторами роста, среди которых наиболее широкое распространение получил гиббереллин. На основании результатов многолетних экспериментальных'' исследований, проведенных на многих сортах, относящихся к различный эколого-геотрафнческнм группам, выявлены ооределенные закономерности в реакции сортов на обработку их гиббереллнном. Это позволяет научно-обоснованно подбирать сортимент, п^югиозяровать уровснь эффеимвностн'и бапее целенаправленно решать задачи по использованию этого приема.
Ллробаиии работ. Результат исследований докладывались на международных, республикадекях конференциях, а также на различных совещаниях, посвященных производству посадочного материала винограда: Всероссийский ННИВиВ имЛ.Н,Потапенко (Новочеркасск, 1993, 1996, 1998); ТСХА (Москва, 1985, 1986. 1997, 1998); ВНИИВиВ «Магарач» (Ялта,1988); Дагестанский КИИВиВ (Мамедкала, 1988, 1990), ИФР (Москва, 1997); ЧТУ (Грозный,1998). .
По материалам диссертации опубликовано 14 работ, а том числе две монографии, общим объемом 25,8 печатни* листов и оформлено одно изобретение. Основные научные разработки и нх усовершенствования вошли а программу теоретических курсов и лаборагторно-лрактических занятий дисциплин «Сельскохозяйственная биотехнология» и « Виноградарство» для студентов Аграрного факультета ЧТУ и других сельскохозяйственных высших учебных заведений.
МЕТОДИКА И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ Исследования и обобщение материала проводили в 1983... 1993 гг. на кафедре виноградарства ТСХА и а отделе виноградарства ЧНИИСХ.
Одним из основных условий успешного культивирования ■ изолированных органов растений является соблюдение строгой стерильности Необходимость соблюдения тщательной стерилизации обусловлена тем, что на искусственных питательных средах, предназначенных для культивирования изолированных органов растений, одновременно хорошо развиваются - и патогенные микроорганизмы, «агоры« создают двойку» опасность для культивируемых тканей.
Пвд|«1вма и скрнтмш! ма»япг> материала. 8 мгиетм исходного материала • культуре ю лп&о использовали иитюпао ркгуоке зеленые побил винограда »готовленные с ■сгсгарующих куспм мтограда • мае...июне и из выведенной т состояния покоя ш^сшмЛ лозы • огаме-зимний период. В последнем. случае, »«зревшую лозу . иарезат на ' шух...трехгяазкоаь*е черенки длиной 8...13 а* и сгоним на (дошатямис при температуре воздуха 25..Л)
Через 25 ..10 «уток, в зависимости от сорта и стспеми покоя лозы, на черенках появлялись зеленые побеги.
Из доставленных в лабораторию зеленых побегов растений, произрастающих в попе или заготовленных из выведенной из состояния покоя вызревшей лозы, отчленяли верхушки побегов размером 2...3 см. Верхушки побегов, помещенные в марлевые мешочки стерилизовали в 70 %-м этиловом спирте 30...40 сек. Затем мешочки помещали в гнпохлорит натрия. Время стерилизации в ги по хлорите натрия 8... 10 мин. После мешочки перемешали в стерильную воду для промывки от дезинфицирующих веществ.
Работы по высадке исходных эксплантатов, а также расчленение и посадку проводили в ламинарном боксе. После посадки пробирку с одноглазковым эксплакгом переносили в культуральную комнату с температурой 23...28 "С и освещением 3...5 тыс люкс.
Приготовление питательных сред. Питательные среды готовили на бндистнлнрованной воде. Навеску агара переносили в колбу, заливали половинным количеством (от объема среды) воды н выдерживали на водяной бане до полного растворения агара. Параллельно готовили раствор минеральных солей, сахарозу и регуляторы роста. После некоторого охлаждения агара его сливали с раствором составных компонентов питательной среды. Соли железа, сахарозу и другие добавки готовили в день их использования. Растворы минеральных солей и витаминов готовили заранее в укупоренных стеклянная я хранили при температуре 3...5 "С.
г|{ питательной среды определяли рН - метром (нонометром) перед автоклавироваяием. Для установления нужного значения рН использовали однонормалыше растворы ЫаОН н НС1. Питательную среду разливали в предварительно простерилиэованные сухим жаром пробирки н устанавливали в бюхеы н стерилизовали в автоклаве при давлении 0,8 атмосфер я течение 20 ;мин.
Рябот» н стерняьаои боксе. Все процессы изоляции, посадки, пересадки эксплантоь проводили в пылезащитных камерах. Такие лаыинар-боксы обеспечивают высокую степень стерильности. Они были установлены »
специальной комнате, предварительно простерилизованной
ультрафиолетовыми лампами в течение . I часа. Для обеспечения дополнительной стерильности в рабочей зоне пылезащитны* камер дополнительно устанавливали бактериальную лампу типа БУВ - 15. .Под ее действием проходило облучение инструментов и других материалов перед началом работы и, кроме того, снижался риск заноса микроорганизмов при манипуляциях, связанных с необходимостью вносить предметы н материал при отключенном двигателе пылезащитной камеры.
Перед началом работы поверхность рабочей зоны пылезащитной камеры обрабатывали ватным тампоном, смоченным 96 %-ыы этиловым спиртом. В самой камере постоянно находились бинокулярная лупа, спиртовая горелка н инструменты для изоляции регенератов и пересадок, чашки Пегрн для хранения ватных тампонов. Инструменты в процессе работы держали в стакане, а перед операцией вычленения верхушек, обновления среза, черенкования побегов обжигали над пламенем спиртовки до испарения спирта.
Все процессы вычленения, черенкования побегов н другие манипуляции проводили на стерильных, увлажненных - фильтрах, помешенных в чашки Петри. Такие комплексы стерилизовали завернутыми в специальную бумагу в автоклаве в течение 1 часа ори давлении 2 атм Увлажненные фильтры предохраняли эмеллаеты от высыхания, которое могло возникнуть в условиях пылезащитных камер при постоянном движении воздуха.
Условия кулиммр«в1им. Экскяакту культивировались вЧкцнальиоЯ свет оком кате при верхнем освещении и освещении между рядами (добмрок. Источник освещения ЛДЦ • 80., Постоянная температура сохранялась при ' помощи бытовых кондиционеров БК • 2500. Культивирование вем при часовом световом дмеу ос*ешенностъю 3,0...5,-0 тыс люкс и температуре 24.„26 X. .
Элементы учетов и метвды обработки ««лученмм ж данных. При
проведении опытов по кяональиому микроразмножению регистрировали
следующие показатели: инфицирован« ость эксплантов, %; количество погибших культур, */< увеличение размера экспланта, мм; среднее количество междоузлий с листом на побег, шт; формирование побега, см; образование корней, их количество, шт., длина, мм, сырой вес. г; выход растений, пригодных к пересадке в нестерильные условия, %; приживаемость растений а нестерильных условиях, %.
Повторность опытов. была 10.„20 - кратная (в зависимости от типа опыта), неизолированная, в делянке един эксплант.
Математическую обработку проводили методом дисперсионного анализа но Доспехову В. А. (1985).
Изучение реакции семенных сортов винограда различных )колиг«-геырафнчесхнх групп на применение гиббереллнна.' С учетом стоящей задачи установления различий реакции семенных сортов, относящихся к различным эколого-гео графическим группам, подбор изучаемых сортов проводился под - этим углом зрения. В их число вошли следующие сортообраэлы: а) обоеполый тип пасла - Джзнджал кара, Хусайне, Тайфи розовый, Сурхак китайский, Халили черный. Баян ширей, Юмалак и б) фун кцнонлл ьно-женский тал цветка - Каттакурган, Ним ранг, относящиеся к восточной экалого-геогрзфнческой группе (Сопузг опепЫ)? №£ги1). Также в опыт были включены обоеполые сорта западно-европейской группы (Сопуаг осЫаМа1)(№(П||) Рислинг и Мускат венгерский Из сортов группы бассейна черного моря (Сооуаг ропй'са Ке£ги1) сорт Ркацители.
Обработка препаратами гиббереллня и дроп проводилась методом сплошного опрыскивания кустов винограда с помощью ручного ранцевого опрыскивателя в конце цветения. Расход рабочей жидкости один литр на один куст. Каждый вариант опыта включал а себя однорядную делян су по 40 кустов, 10 вз которых являлись учетными (куст - поаторность). Таксация и Отбор
-О-
однородны* учетных кустов проводились на основании результатов предварительного проведения агробиологических учетов.
Агробиологические учйты н наблюдения проводились по общепринятым методикам (Ампелография СССР, т.), 1946) и включали в себя изучение роста побегов* показателей плодоносности, величины и структуры урожая. Динамика роста ягод изучалась с применением специально разработанной методики, позволяющей формировать изменения объемов ягод без их отрыва от гроздей. Динамика роста и развития листовой поверхности определялась методом Мельника и ЩегловскоЙ (Агротехнические исследования по созданию интенсивных виноградных насаждении на промышленной основе, 1978). Определение содержания хлорофилла в листьях . проводилось пут£м исследования спиртовой вытяжки пигментов на ФЭКе (Практикум по физиологии растений, 1972). Определение продуктивности фотосинтеза проводилось по методике Амирджанова (Сборник методик по фиэиолого-бнохимнческнм исследованиям в виноградарстве, 1967). Определение накопления'Сахаров проводилось в период достижения технической зрелости ягод с помощью лабораторного рефрактометра. Микроскопический анализ степени развития эмбрионального побега н его плодоносность проводили С помощью микроскопа МБС-9. Экономическая эффективность применения гжббереллина на семенных сортах винограда механизированным способом подсчитывала» по Никифорову (1976). Математическая обработка полученных данных проводилась методом дисперсионного анализа по Доспехову Б. А. (1976),
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
1 Раздел. Совершенствован не технологии ускоренного размножения
винограда методом in vitro Введение в культуру in vitro. Одним из начальных этапов, предшествующих введению эксплантов в стерильную культуру, является стерилизация растительного материала. Эффективность стерилизующего агента оценивается по степени освобождения от инфекции н по характеру действия на экспланты. Предпочтение должно отдаваться тем стерилизующим растворам, которые наиболее полно освобождают растительный материал от инфекционного начала, обеспечивают высокую приживаемость и не ингибируют последующее развитие эксплантов на питательной среде.
Как отмечает Бутенко Р.Г. (1964). стерилизующее вещество должно обеспечивать более полное освобождение от инфекции при незначительном повреждении тканей.
На первом этапе микроразмножения отборе эксплантов н введении их в культуру - необходимо обратить внимание на их дезинфекционную обработку, поскольку питательные среды являются отличным субстратом для развития бактериальной н грибной микрофлоры. Дезинфекция тканей требуется для удаления микроорганизмов, находящихся на поверхности растений (Дорошенко Н.П., 1996).
Таким образом, большое значение на этапе введения в стерильную культуру имеет правильное выполнение приемов стерилизации растительного материала, от которой зависит инфицироваяность эксплантов, их состояние н степень развит*. *
Стерялнзашио растительных тканей а асептической культуре проводят различными веществами, такими как соединения ртути и других тяжелых металлов -. сулемы, дноцнда; соединения, растворы которых содержат активный хлор - пшохлорнш кальция и натрия, хлорамины, хлорная нзаестъ.
I. Инфицированное!» и приживаемость эксплантое винограда (%) в зависимости от применения стерилизующих веществ (1987,. Л 989 гг.) *
Стерилизующее вещество
Сорт и сулема диоцид гнпожлорит НСР« I
показатель N.
0.1 *А 0.1% 2%
,, Восторг11
инфицирован ность 0 0 0
приживаемость 85,0 90,0 80.0 4.08
гибель 15,0 10.0 20.0
Кодрянка"
инфицирован ность 0 0 0
приживаемость 70.0 65.0 75,0 3,25
гибель 30.0 35.0 25,0
,Л»ию мезеш41
инфицирован ность 15.0 15,0 30,0
приживаемость 70.0 60.0 65.0 3,04
гибель 15.0 25,0 5,0
Подарок Магяряча"
и нфниирован ность 10.0 0 20,0
приживаемость 75,0 85,0 70.0 2.87
гибель 15,0 15,0 10.0
„Ркацители"
инфицирован ность 15,0 10,0 25.0
приживаемость 80.0 70,0 70,0 3,18
гибель 5,0 20,0 5.0
При выборе стерилизующего вещества й его концентрации (табл. 1) мы руководствовались соображениями его .эффективного воздействия на . сапрофитную микрофлору, присутствующую на изучаемом объекте, и . минимальным отрицательным ■■■ влиянием на сам объект, то есть на меристематжческне верхушки и одноглазковые экспланты.
Исследования показали, что эффективность стерилизации зависит а первую очередь от вида стерилизующего раствора, а также от таких факторов, как сортовые особенности, сроки изоляции, тип и размер эксплантов.
Стерилизация эксплантов винограда в 0,1 %-и растворе сулемы в течение 10 минут обеспечивала относительно наибольшую их приживаемость, однако дальнейшие наблюдения показали, что он сдерживает развитие эксплантов как на этапе введения,- так и в первом пассаже культивирования. Вероятно, это свидетельствует о более длительном остаточном последействии сулемы на растительные ткани, чем других стерилизующих веществ. При этом сулема оказывала тормозящее действие не только на вегетативное развитое эксплантов винограда, но и на рост недифференцированных тканей.
Обработка данных эксперимента не показала существенных различий в приживаемости эксплантов винограда при обработке их стерилизующими веществами: сулемой - 0,1 %, дмоцидом - 0,1 % и пою хлоритом натрия -2,0 %. Диоцкд, а отличие от сулемы, сдерживает развитие эксплантов винограда лишь па начальном этапе культивирования, а в дальнейшем обеспечивает их хорошее развитее. Результаты проведенного опыта лают возможность сделать вывод о более мягком действии стерилизующего раствора гнгю хлорита натрия на растительную ткань, что обеспечивало более успешную регенерацию побегов.
. Практически любой стерилизующий раствор токсичен для растительных тканей и » той шп той степени угнетает рост эксплантоа. Д ействие этого фактора имеет несомненное значение на первом этапе мшерорюмможеим. Тем не менее мы можем сделать вывод, что ю трех включенных в эксперимент стерилизующих веществ по комплексной оценке показателей: инфицированное», приживаемость и регенерация побегов, следует выделить гнлохлорит натрия - 2 % при экспозиции 10 мин.
-О-
Регенерация растений н| апикальной меристемы. От результатов опытов, проведенных на этапе регенерации побегов, существенно зависит ход дальнейших экспериментов. Именно на этом Э1<те необходимо получить культуру, свободную' от инфекции, добиться выживания ее на питательной среде и обеспечить быстрый рост эксплаитов. В связи с этим изучались оптимальные варианты тех факторов, которые могли бы повлиять на регенерацию побегов из изолированных апексов.
Совместно с институтом физиологии растений им. К.А. Тимирязева (Бургутин А.Б.) были начаты работы по получению клонов винограда методом культуры изолированных меристем, которые используются для получения свободного от вирусов посадочного . материала и для дальнейшего микроклопального размножения.
X. Приживаемость апикальных меристем на этапе введения в культуру in vitro (1988,. 1990 гг.)
Сорт Количество высаженных меристем, шт. Инфицировано, шт. Инфиннро- ванность, % ■ Погибло шт. Приживаемость
шт. %
в Восторг" 40 4 10,0 6 30 75,0
„Агат шетй* 40 5 12,5 4 31 77,5
„ Лакхеди иеиш " 40 4 10,0 7 29 72,5
( Ркацители" 40 14 35,0 4 22 ■ 55,0
Меристемы вычленяли из интенсивно растущих зеленых побегов по вышеуказанной методике. Сорта „ Восторг" „Агат донской" и .Лакхеди мезеш" испильзовалн из тепличного накопителя, а материал сорта иРкацители" брали с интенсивно растущих побегов производственных насаждений. Степень
приживаемости апикальных' меристем на этапе введения в культуру in vitro у группы сорго» (^Восторг,"„Агат донской" и .Лакхедн мезеш") (табл.2) не имели существенных различий. Однако в опыте с сортом „Ркацители* был отмечен высокий процент инфицированное?* апикальных меристем, вызванной заражением сапрофитной микрофлорой. Как было отмечено выше, апикальную меристему сорта „ Ркацители" вычленяли из . материала, взятого с производственных насаждений, то есть из открытого грунта, что даже после соответствующей стерилизации процент инфицированное!» остается сравнительно высоким, чем у других сортов, взятых из тепличного наколнтел». Мы наблюдали гибель апикальных меристем в процессе культивирования. В этом случае, по-видимому, гибель наступает за счет повреждены» апикальных структур в процессе нх вычленения. Существенное различие в количестве прижившихся апикальных меристем между группой сортов „Восторгг .Агат донской* ^Лагаеди мезеш" и „Рхацктели^' по-видимому связано с особенностями исходного материала, вводимого в культуру in vitro.
Прижившиеся. апикальные меристемы, через месяц после посадки, развились а кгастерчюбеги размерами 2...3 мы, которые были пересажаны на питательную срещу с содержанием тех же компонентов. Пересадку производили в биологические пробирки размером 40 х 120 мм.
11а этапе псрссадгн кластер-побегов прижиьоемость их достаточно высокая, почта у всех сортов она находилась а пределах 90 % (тэбл.3). Очень низок процемт инфицированных побегов. По-видимому, здесь повлиял фактор стерилизация апикальных меристем при »велении в культуру in vitro, а также • процесс пересадки растений я стерильных условиях (даминар-боксах).
В течение 55 .60 дней образовались регенераты растений размерами 6..Л0 ш. Да^' мы пр»сту11иди их микроклоналыюму размножению. Растеяня-^ снеранш разрезали на фрагменты, включавшие узел с листом и оочк^ (ннжмя чаеть междоуалня длиннее верхней на 1. 2 см). Полученные v' мюфочеренкм высаживала в биологические пробирки на агаровую среду так.
3. Приживаемость кластер-побегов и образование регенератов растений (1988... 1990 гг.).
Сорт Количество высаженных кластер-побегов, шт. Ияфнциро-вано, шт. Погибло, шт. Приживае- -мость.
ШТ. ' %
вВвсгорг" 30 0 3 27 90,0 .
^ Агат донской " 31 0 1 30 96,8
„Лмпем мпеш" 29 1 2 26 89,6
(Гк1штлмп 22 2 0 20 90.9
•ггобн нижняя часть междоузлия была погружена в агар. Пробири закрывали фольгой и помешали их в кулыуральную комнату с сооттспующта методике условиями.
Резюмируя полученные результаты, следует отметить, что высокая приживаемость апикальных меристем дает. возможность дальнейшего их культивированиями размножения, прн кшором возможно получекве беэвмрусного посадочного материала. Дальнейшие исследования вами били проведены с эксплантатами, полученными из (полированных апикальных меристем.
Влмвнме мммеральиФГ» емгява лмтательдой среды па развитие * жппига ■шппмм >■"'* !
Для успешной регенерации растений важное значение имеет подбор питательной среды.: С целью -подбора • питательной среды, имеющей оптимальный набор минеральных компонентов для размножения эксплантов винограда, были испытаны среды Готре, Уайта. Хелпера. Мурасиге-Скуга. Эти среды, отличаясь между собой по минеральному составу, имеям одинаковый/ набор органических добавок и физиологически активных веществ. -1- . У :
-¿о- - ■.
4. Влияний минерального состава питательной среды -на развитее мнхропобегов винограда i* vitr* (1987...1990 гг.)
Среда . .Восторг" .Кад-рянкя" ■Ледарок Магарача" „Ркацители" НСРм
Готре Комо межвоузд, с листом, цгт Длина побега, см Кол-во корней, шт.
3.« 3.2 3,9 4,0
4.0 3,6 3,9 4,8 0,81
3,4 3.1 4,0 3.6
Уайта Кол-«о межлоузл. с листом, urr Длина побега, см Кол-во корней, шт.
4.0 3.8 3,6 3.9
3.9 3,4 3.0 4,2 0,64
4,2 4,1 3.8 4,0
Хедяера
Кол-во междоузл. с листом, шг Длина побега, см Кол-во корней, шт.. 2,7 3,4 2,0 3,4
2,6 3,7 2,2 3.9 0,42
3.0 за 2.6 2.8
Модифицированная среда МурясмгеОсуга Кол-во межлоузл. с листом, шт Длим побега, см Коя^о корней, шт. .
9.6 10,2 8,8 8,4
9.8 10.8 9,2 9,0 0,57
4,8 5,2 4.6 4.8
. Минеральный состяа вышеуказанных сред по-разному шиш на регенерацжжную способность эктлакгоа аинограда.
Как показали результаты жлцтюшя, лучшее развитее эксплаитоа винограда было отмечено на модифицированной среде Мураскге-Скуп, на шпорой мнхроообеги били более развиты (табл. 4),
Обтаятсядсшша, которую нам удалое» мишпъ. — зависимость развития . эксппантов винограда от суммар»юй яоаоентрацхи минеральных солей. Различия »минеральном составе тяжтелишх сред ажшшсь не только на кшшчесгоеын^'ю^ш^ Так, эксоланга на
относительно бедных средах (Гетре. Уайта, Хеллера) были слабее развиты, наблюдалась некоторая хдоротичность листьев, что говорит о явном недостатке в культуральной среде, прежде всего, содержащих азот солей (табл.4). В отличие от эксплактов, развивающихся на этих средах, у эксплантов, помещенных на среду Мураснге-Скуга, проходил более интенсивный рост побегов и корней, особенно на модифицированной среде Мурасиге-Скуга (с уменьшенным содержанием макросолей).
Существенные различия по количеству междоузлий с листом, длине побега и по количеству корней у эксплантов винограда сортов „Восторг," it Кодряниа? ^Подарок Мага^ча" и ^Лсашпели14 на средах Готре, Уайта, Хеллера не обнаружены. Только на модифицированной среде Мураснге - Скуга эксолаты различных сортов виносрада проявили способность к образованию более развитых побегов н корней.
При строгом соблюдении режима выращивания пробирочных растений через 8.¡.12 дней микрочеренки укореняются, а через 12...15 дней у них развиваютск первые 2..Л листа и 1...J корня, и еще через месяц они мыеют обянстаенный побег, состоящий из 8... 10 междоузлий, корневая, система занимает »се дно пробирки. Такие растеньица можно пересаживать в сосуд -пакеты или расчеренковать.
Влияние регуляторов роста на развитие жшштв винограда ш усмяяях i« vitr*
Одним из важнейших и неотъемлемых компонентов питательной среды являются регуляторы роста. Их тщательный подбор н выявление оптимальных концентраций позволяют повысить эффективность метода клональносо ' микроразмножения винограда in vitro.
Проведенные эксперименты показали, что регенерация побегов из ■полированных апексов происходила при всех концентрациях б-БАП. кроме как при добавке препарата а количестве 5,0 мг/д, когда верхушки сразу начинали чернеть и гибли. Верхушки, выращиваемые на среде с концентрацией 0,01...0,1
мг/л 6-БАП развивались очень медленно. Вероятно, это связано с тем, что такие низкие концентрации препарата слабо стимулируют процессы органогенеза растений.
Самые лучшие результаты были достигнуты на среде с концентрацией 1,0...2,0 мг/л. Реакция меркетемэтических верхушек на такие концентрации проявилась в образовании четко выраженного бурого пробитое идного каллуса у основания верхушек. В дальнейшем наблюдалось разлитие листьев, конус нарастания у верхушек вытягивался.
Таким образом, оптимальная. концентрация 6-БАП для развития верхушечных меристем винограда равна 1,0...2,0 мг/л. Однако последующи« исследования по изучению влияния 6-БАП на развитие одноглаэковых эксплантов винограда, на этапе собственно размножения оптимальные дозы концентрации сдвигаются в меньшую сторону (табл. 5).
5. Влияние 6-БАП на развитие одноглазковых черенков винограда в
условиях!« иГго(см), (1989,,. 1991 гг.).
Концентрация, мг/л
Сорт 0.1 0,5 1.0 2,0 5,0 ПСР«
^ Восторг" 5,0 9,9 10,6 IX 0.0 1.М
„Кодрянка" 5,1 П.5 11,9 7,9 0.0 2,06
,Лшш мезеш" 4,3 7.4 10,5 ' 4,8 0,0 1.67
„Подарок Магарача*' 4,4 7,0 9,2 5,0 0,0 1.56
„Виорнка" : 4,6 8,2 И.5 5,8 0.0 2,18
„Рхииши" 4,9 9.1 11,8 0,0 2.35
Наиболее эффективное влияние 6-БАП оказал в диапазоне концентрация 0,5...1,0 мг/л. Тем не* менее^Гследует отметить наибольший прирост мнкропобегоа, который бил зафиксирован в варианте с концентрацией 1,0 мг/л. Минимальная длина мяхролобега наблюдалась в вариантах с концентрациями
0,1 мг/л. а при концентрации 5,0 мг/л вообще подавляется раз»нгие побега, это говорит о том, что в первом случае данная концентрация недостаточна для максимального удовлетворения возможностей эндогенного цкгокниина для роста и развития ыикрОиобега, а во втором случае наоборот - высокая концентрация препарата ингибнрует развитие микропобегов (табл.5).
Другим веществом, обладающим цитокн ни новой активностью, явился препарат цитокнкиного характера действия ДРОП. Действие препарата, оказываемое мм на развитие экспланта - мнкропобегов различных сортов виноград», оценивал» по развитию длины побега и количеству междоузлий, так как чем больше междоузлий с листом, тем больше н коэффициент размножения.
& Развитие микропобегов винограда на среде, содержащей ДРОП (1990...1992 гг.).
• Концентрация, мг/л г
Сорт <м 1,0 | 2,0 5,0 НСР*
„ Восторг"
Кол-во междоузл. с листом, шт. 5,6 7,7 6.0 - -
Длина побега, см 7.2 9.8 7.1 - - ' ив
„Квдракка^
Кол-во междоузл. с листом, шт. • 4 Л 6,0 5,4 ■ - -
Длина побега, см 5,4 &л 6.» - - 1,20
„Лякхедн метет" ■ " •
Кол-во междоузл. с листом, шт. 7,0 „6-4 * Тл 3,5 -
Длина побега, си . 7.5 9.0 4,4 - . 1,48
. ,11«прок Магарача"
Кол-во междоузл. с листом, шт. 5,6 7.1 •5.0 2,3 - ■
Длина побег а, см ' ? Л 9,4 6,7 3,8 -
„Виорнка" Кол-во междоузл. с листом, шт. Длина побега, см
5.9 8,2 7.1 - -
8,0 9,2 8.4 - - 1.02
, Ркацители" ■ Кол-во междоузл. с листом, шт. Длина побега, см
6,8 9,3 8,2 -
8.1 10,6 9,8 4,8 - 1,64
Наиболее существенные различия в степени развития микропобегое винограда in vitro были обнаружены в варианте, содержащем ДРОП в концентрации 0,5 мг/л (табл. 6).
Число междоузлий с листом, развивающихся на микропобегах in vitro, помещенных на среды с рхзными концентрациями ДРОП, не имело существенных различий, кроме варианта, где уровень концентрации ДРОП был равен 0,1 мг/л. В этом случае отмечено максимальное число междоузлий с листом. В варианте опыта с высокой концентрацией ДРОП 2,0 и 5,0 мг/л было отмечено аномальное развитие ынкролобегов.
Также было установлено, что максимум стимулирующей активности у ДРОПа на этапе регенерации верхушечных меристем приходился на значительно ' более низкие концентрации (0,1. 0,5 мг/л). При таких концентрациях отмечен более интенсивный рост побегов.
Дальнейшее повышение концентрации до 2,0...5,0 мг/л вызывало не только подавление регенерацжпшых процессов, но и гибель культивируемых верхушек меристем, особенно в варианте при концентрации 5,0 мг/л, в котором верхушки после помещения на такую среду гибли через 6...S дней
7. Развитие микропобегов винограда на среае Мв. содержащей 2-кзопентладснин (2-»р) (1990-1993 г.)
Сорт Концентрация мг/л НСР«
0.1 | 0,5 | 1,0 | 2,0 | 5,0
„Восторг" Кол-во междоузл. с листом, шт. Длина побега, до
4,4 7,7 5.2 -
5,6 10,5 6,0 - 1.84
„Кодрянка" Кол-во междоузл. с листом, шт. Длина побега, см
4.8 8,1 8,2 4.6 -
6.0 9,8 10,9 5.1 - 1,57
„ Подярок Магарячя" Кол-во междоузл. с листом, шт. Длина побега, см
3,7 6,2 6.1 4,0 -
5,8 8,4 8.0 5,2 - 1,32
„ Виорнкя" Кол-во междоузл. с листом, шт. Длина побега, см
5,1 8,9 6,2 5.4 -
6.4 10,8 7,3 6Д - 1.68
При добавлении в питательную среду 2-изопелтладеиина (2чр) -цитокиимного характера действия отмечаются сушественные различи*'в росте побега и количестве междоузлий в вариантах с концентрацией 0,5 мг/л и 1,0 мг/л, особенно следует выделять концентрацию 0,5 мг/л (табл. 7).
Ф«м удлинении побегов. Длительное выращивание эксплантов винограда на средах с повышенной концентрацией цнтокииинов вызывало торможение роста побегов. Побеги (кластер-побеги), пересаженные на среду укоренения, очень часто не образовывали корней и гибли. Поэтому перед этапом укоренения целесообразно мести фазу удлинения побегов.
Как показали эксперименты, для доведения побегов до длины, пригодной для укоренения (более 10 мм), достаточно было осуществить пересадку иа среду с содержанием 6-БАП 0,$...0,1 мг/л. Применение такой концентрации 6-бензиламинопурина позволило уменьшить ингибнрующее
Динамика развит« побеге» винограда на средах, содержащих 6-БАЛ и его сочетаний с ПС
сорт Подарок Нагарача
сроки, сут
сорт Коярянкз
сроки, сут.
1. - 0,5 мг/л 6-БАП + 1.0 иг/л ГК 2* -0,5 мг/я б-БАП
3, - 0,5 мг/л 6-БАП + 2,0 мг/л ГК
4. -0,5 мг/л 6-БАП+ 5,0 мг/л ГК
-ЗА,
«и*.
Рисунок I
-2 У-
действие цигокннннов. что привело к росту побегов. На такой среде побега активно росли и через 14.,.1$ дней достигали длины до 20 мм (рнс.1).
Дм ускорена» процесса удлинения побегов параллельно проводили изучение действия гиббереяловой кислоты а различных концентрациях в сочетании 6-БАП. Как показал опит, при сочетании ОД мг/л 6-БАЛ + 1,0 мг/л ГК был достигнут наилучший результат. Такое сочетание препаратов ускоряло вытягивание стеблей у растений; и через две недели размер побегов достигал 25,.26 мм.
Таким образом, проведенные нами эксперименты показали эффективное действие ГК и пониженной концентрации 6-БАП для удлинения побегов перед этапом укоренения.
Адаптация растений винограда 1я vitra при пересадке в нестерильные условия in vivo
Растения, выращенные методом in vitro должны пройти адаптацию к внешним условиям io vivo (климатической камеры, оранжереи, теплицы) после извлечения их из куяьтуральных пробирок.
В наших исследованиях была поставлена задача найти более совершенный метод адаптации, позволяющий избежать существенные трудности. Адаптацию к условиям in vivo растения безболезненно проходят в пробирках. Для этого достаточно снять с пробирок алюминиевую фольгу, которой закрываются пробирки размером: диаметр - 40 и высота - 120 мм. В отличие от стандартных биологических пробирок в предложенных нами пробирках с большим диаметром лист винограда может полностью развернутся 'и начать функционировать. Есть и отрицательная сторона - слишком большой диаметр пробирки, при полном ее открытии (снятии фольги) листья растений винограда завядают. 1 ■■
В наших исследованиях по адаптации пробирочных растений, после посадки эксплантов на агармэованную питательную среду, пробирки -закрывали алюминиевой фольгой марки А-5.
Через 35...4Ü дней культивирования, когда образовались 4...5 листов, в зависимости от варианта (табл. 9) пробирки с растениями открывали полностью (100 %), наполовину (50 %), на одну треть (30 %) и оставляли их » таком состоянии 10... 14 дней. В течение этого времени сформировавшиеся листья проходят адаптацию к внешним условиям. D дальнейшем а период роста побега образовываются новые листья, которые автоматически, с момента образования проходят адаптацию к условиям in vivo.
8. Адаптация растений винограда в условиях in vitra (1991...1993гг.)
№ Сорт Открытие пробирок
100% J 50% J 30%
Выход лробнрочных растений
шт. % шт. % шт. %
1 „Востерг" 2 Í.0 24 60.0 36 90.0
2 „Квдрш»'1 4 10,0 21 52.5 38 95,0
3 (1Лакхши мезеш" 0 0,0 18 45,0 35 87,5
4 .Подарок Мягарячя" 2 5,0 20 50,0 36 90,0
5 „Гкшигош" 0 0,0 16 40,0 34 «5.0
Растеши in vitro, прн полном открытии пробирок (табл. 8), около 95 % погибли, нежные тхаки пробирочного растения винограда завяла m некротнзнроаались. В варианте с открытием пробирок на 50 % выход растений а зависимости от сорта был * пределах 40...60 Выделялся вариант при открытии пробирок для прохождения адаптации растений на одну треть (30 %). В этом случае газообмен » условиях in vitro я in vivo протекает более плавно,
-гд-
нежные ткани листьев винограда адаптируются постепенно и выход растений винограда составил 85.,.90 *Л. .
Чтобы предотвратить образование плесеней на агаризов&нной среде, достаточно 4...S раз за этот период полить растения водой - увлажнить поверхность агара и лишнюю волу слить, перевернув пробирки.
Таким образом, в конце указанного периода (т.е. через 10:.. 14 дней после открытии пробирок) верхушка растения винограда с одним - двумя развитыми листочками готова к пересадке в почву. Необходимо заглублять побег в почвенный субстрат так, чтобы над поверхностью оставалась верхушка с одним • двумя развитыми листочками. Туманообразующая установка или влажная камера при этом не требуется. Чтобы защитить растение от патогенов, следует применять стерильный почвенный субстрат нля песок, свободный от нематод.
Этап перевода пробирочных растений in vitro в нестерильные условия in vivo является весьма ответственным. Для прохождения первого этапа адаптации растений в условиях in vivo мы использовали полиэтиленовые сосуд-пакеты (размер пакета высота -25 см, диаметр—6 см). Однако для успешного развития растений недостаточно создание микроклимата в сосуд-пакетах, максимально приближенного к условиям пробирки, важное значение имеет н тип субстрата, используемого для адаптации и развитая корней и в целом роста растения. -
После проведения определенных рекогносцировочных опытов в качестве субстрата для укоренения пробирочных растений in vitro в условиях in vivo нами был использован песок, завезенной с Терско-Кумсхого массива (Шелковской район Чеченской республики).
'Известно, что для возделывания культуры винограда предпочтительны легкие почаы, в том числе супесчаные. Дополнительным . аргументом использования леска в качестве субстрата при прохождении адаптации в сосуд-пакетах «вилось то, что почвенный субстрат тепличного комплекса и
виноградного питомника, где проводилось дорашнвание посадочного материала, состоит из того же песка.
Эксперимент состоял из следующих вариантов: в качестве контроля был взят песок в естественном виде, далее песок, стерилизованный в термостате; песок, промытый простой водопроводной водой; песок, промытый . ыарганиовхой; песок, промытый мар! лповкой и раствором Чеснокова.
Экспериментальные данные показывают (табл. 9), что процент приживаемости и развитие побега намного ниже в контрольном варианте почти у всех исследуемых сорго» винограда. Это говорит о том, что гнилостные бактерии, находящиеся в леске, подавляют нормальное развитие нежной корневой системы растений, только вышедших из стерильных условий in vitro, и способствуют их загниванию и подавлению роста побегов.
Иначе ведут себя растения, высаженные на стерилизованный в ' . термос, лте субстрат (песок). Приживаемость здесь в зависимости от сорта находилась в пределах 95... 100 %. В варианте с песком, промытым простой водопроводной водой в целом растения развиваются слабо, хотя по сравнению с контролем процент приживаемости в нем несколько выше. Это говорит о том, •по под воздействием гнилостных бактерий корневая система работает слабо, что отражается на росте н развитии побегов
Лучшие результаты были получены нами в Варианте опыта при стерилизации песчаного субстрата марганцовокислым калием. Приживаемость растений была в зависимости от сорта в предела* 95...10Cf
Из всех включенных в эксперимент вариантов следует выделить вариант: песок, стерилизованный марганцовокислым калием и раствором Чеснокова. В нем наблюдалась хорошая приживаемость, рост н развитие растений. . Это объясняется следующими факторами: первое - наличие . стерилизованного субстрата; второе - применяя раствор Чеснокова, мы вносим в зону действия корневой системы доступные усвоению минеральные вещества. • ;
9. Влияние песчаного субстрата на степень приживаемости, роста в развития растений в
сосуд-пакетах (период культивирования 40 дней) (п * 40)
№ Вариант Сорт Год Приживаемость Длина побега Количество междоузлий с листом
шг. % см ort.
.Колрякк»" 1988 21 52,5 8,2 7,0
1 Песок - .Восторг" 1989 26 65,0 7.4 6,8
контроль .Подарок Магарача'' 1989 19 47,5 8,8 7,2
Песок • . Кодрянка" 1988 40 100,0 12,5 * 10,4
2 стерилизов. .Восторг" 1989 38 95,0 11,0 10,1
в термостате „Подарок Магарача* 1989 38 95,0 11,8 9,8
Песок - „Кодрянка" 1988 27 67,5 10,7 9.4
3 промытый .Восторг" 1989 29 72,5 9,8 8,6
водой .Подарок Магарача" 1989 24 60,0 12,4 10,9
Песок• „Кодринка" 1988 37 92,5 12,8 11,3
4 промытый .Восторг*4 1989 40 ' 100,0 11.5 10,2
КМпО< .Подарок Магарача" 1989 40 100,0 13.4 11,8
Песок- „Кодрянка" 1988 38 95,0 15,6 13,2
5 КМп04+ .Восторг" 1989 38 95,0 16,7 14,4
раствор | Чеснокова .Подарок Магарача" 1989 40 100,0 16,5. 15,1
„Кодрянка" 1988 2,87
НСРи |Восторг" 1989 3,12
Подарок Магарача" 1989 3,46
Следовательно, при переходе на промышленную основу производства оздоровленного посадочного материала in vitro, нами использовался и бия предложен в разрабатываемую техно, огню на этапе перехода растений in vitro в условия in vivo в качестве субстрата - песок, стерилизованный марганцовокислым калием и распором Чесиокова.
Черенкование растении винограда из сосуд-пакетов дает возможность увеличить коэффициент размножения оздоровленных растений in vitro. Этим методом, не занимая большую площадь в зимиий период, можно увеличить производство посадочного материала. Нами изучались различные способы улучшения ускоренного размножения винограда, укоренения, роста и развития в условиях сосуд-пакетов,
В эксперимент по определению оптимального субстрата при черенковании растений винограда из сосуд-пакетов были включены перлит молотый (без обжига), перлит (одноразовый обжиг), перлит-вспученныЯ (2-разовый обжиг) и в качестве контроля использовали песок, промытый марганцовокислым калием.
Во всех вариантах с перлитовым субстратом процент приживаемости одноглазковых черенков с листом был выше, чем с контрольным вариантом на песке. Хотя при использовании обожженного перлита во всех вариантах процент приживаемости (табл. 10) находился на одинаковом уровне (95...100 %). Однако наилучшим ростом и развитием выделялся вариант при использовании перлита вспученного 2*-разового обжига.
Таким' образом. После того как растения в сосуд-пакетах достигали размера 12...15 см в высоту, после черенкования на одиоглазковые экспланты повторяли посадку ка субстрат в сосуд-пакеты, тем самым значительно повышая ' коэффициент размножения. Преимущество такого способа размножения вим, что в зимних условиях, не занимая больших площадей, мы имеем возможность постоянно увеличивать количество размноженных растений, вплоть до весны. А в начале апреля высадить всю эту массу растений
10. Влияние мрамтмого субстрата на степень приживаемости, роста и развития растений t
сосуд-пакетах (черенкование) (период культивирования 40 дней (п=40)
№ Вариант. Сорт Год Приживаемость Длина побега Количество междоузлий Длина корней,
* шт. % см un. см
.Восторг" 1989 32 80.0 12,2 10,8 -
1 Песок» 1Кодрянка" 1989 34 85,0 М,4 10,5 -
КОМрОЛЬ ^Педярок Магар«ча" 1990 37 92,5 12,5 1U 22,9
Перлит .Восторг" 1989 36 90,0 13.9 11.2 -
2, (без обжига) ^Кодрякка" 1989 38 95,0 14,2 12,0
< Под» рок Магарача" 1990 38 95,0 14,5 12,3 24,2
Перлит г Восторг" 1989 39 97,5 15,5 12.1
3 (одноразовый .Кодряика" 1989 40 100,0 15,8 11,8 .
: обжяг) • .Подарок Магарачя" 1990 40 100,0 16,4 13,0 26,9
Перянт , Восторг" 1989 40 100,0 16,6 12,4 •
4 . ссцучегашй : ^Кодаяккя" 1989 40 100,0 17,9 12,7
(2* раз. обжиг) .Подарок Мягарача" 1990 40 100,0 18,2 14,2 44,1
.X Перлит* - ^Врсторг* 1989 40 100,0 14,4 11,5 -
5 иелка» фрахшм .К«дрянкап 1989 40 100,0 15,7 12,4
(2х раз. обжиг) .Подарок Магярачя" 1990 38 95,0 16,4 12,9 40,8
.Восторг" 1989 2,34
НСР» . .Кешишка'* 1989 2,02
и Подарок Ma га раня" 1990 1,86
в весеннюю теплицу (покрытую стеклом или пленкой). При этом нет необходимости нести расходы на отопление теплицы в зимний период.
Дальнейшие наши исследования показали, что растения, высаженные таким образом в апреле даже в иеобогреваемую теплицу, к концу вегетации достигают стандартных размеров.
После того как растения винограда проходили адаптацию в сосуд* пакетах, они поступали в тепличный накопитель. Здесь проводилась работа, характерная дня ухода за растениями а условиях теплицы.
Посадку пакетных растений винограда производили после подрезания дна пакета вместе с песчаным субстратом в фунт теплицы, верхний слой которого перемещали с песком на глубину 20 см. Летом, при сильной солнечной инсоляции, молодые растения необходимо притенять. Пакеты с растениями размещали сплошными рядками с расстоянием 20 см, при расстоянии между растениями 10 см в ряду.
На начальном этапе наших исследований посадку растений в теплицу производили постоянно и на потоке, по мере завершения адаптивного процесса рас.ений из сосуд-пакетов в культуральной комнате. Однако при этом мы столкнулись С определенными трудностями. Во-первых, у . растений, высаженных в тепличный накопитель в зимний период, приживаемость, рост и развитие задерживались и проходили слабо нз-за проблем, возникающих с отоплением больших теплиц и недостаточным освещением.
В связи с этим мы пошли по менее дорогостоящему направлению, о чСм свидетельствуют экспериментальные данные, полученные в течение нескольких последующих лет.
Проводя массовое черенкование в осенне-зимний период как Пробирочных растений, так и растений в сосуд-пакетах, переводили растения, прошедшие адаптацию, в специальную комнату с температурой 10...12 0 С. В таком состоянии растения, как правило, замедляют свой рост и развитие. Таким образом, мы создали накопитель с десятками тысяч растений.
В конце марта — начале апреля эту большую партию растений высаживали из сосуд-пакетов'в теплицу (можно н в пленочную), и к концу вегетации (осенью) эти растения доходили до стандартной величины. Растения, которые поступили в теплицу в мае - юоне, хорошо приживаются, растут, но не успевают достигнуть размера стандартных саженцев, в связи с чем их приходятся оставлять на второй год.
Растения винограда из сосуд-пакетов поступали в тепличный накопитель как с песчаным, так и с перлитовым субстратом. Ранее мы отмечали, что укоренение, рост и развитие растений ш vitro с перлитовым субстратом в сосуд-пакетах выше по сравнению с песчаным субстратом. Однако при высадке в грунт растения с песчаным субстратом проходили адаптацию к условиям быстрее, чем с перлитовым, также и процент приживаемости был выше.
В результате мы пришли к выводу, что лучше использовать цеолнтовый субстрат в сосуд-пакетах на этапе увеличения коэффициента размножения (методом черенкования), а для растений, которые, по нашим расчетам, после адаптивного процесса будут высажены в теплицу, необходимо использовать песчаный субстрат, при котором мы отмечали более высокую приживаемость и лучшее прохождение адаптивного процесса.
Нммуноферментный анализ ня содержание вирусов в растениях винограда размноженных метолом in vitro, н определение внругоносителей на участках, планируемых под микромяточнюсн новых сортов винограда.
Высокая вредоносность вирусных н мнко плазменных заболеваний заставила виноградарей многих стран перейти на производство безвирусиого посадочного материала.
Небольшой размер эксплата, применяемого для клонального михроразмножения, поверхностная стерилизация его, асептический перепое па питательную среду в субкультнвироваяие в условиях, исключающих
инфицирование, приводят к оздоровлению полученных растений от нематод, грибных и бактериальных патогенов. Именно вирусные болезни — причина потерь от 10 до 50 % урожая сельскохозяйственных культур, размножаемых вегетативно (Муромцев, Бутенко и др., 1990).
По данным Cramer (1967), вирусные болезни снижают урожай винограда во всем мире на 10 %, Таг, в ФРГ потери урожая винограда от вируса коротютучлня составляют 16..% (BrucVbawer, 1963), а вирус инфекционного хлороза во Франции вызывает снижение урожая до 70 % (Vutttenez, 1970). На зараженных маточниках подвоев уменьшается выход лозы. При использовании яозы с больных насаждений ухудшается укоренение черенков и приживаемость Прививок,
Сведения о вирусных болезнях винограда в бывшем СССР появились а 1946 году, когда было описано корогкоузлие и болезнь знаний в Крыму 'Рыжков В.А.. 1946) н коропгхоузлие в Молдавии (Вердеревский Д.Д., 1946). Затем об инфекционном хлорозе винограда в Грузин сообщили Канчавели JI.A. И Эрнста»н Е..М. (1949). Однако систематическое изучение вирусных болезней вин-лралз а бывшем СССР началось лишь в 1964 году в Молдавии (Вердеревский Д.Д., Звягина Е.А., 1964) и в 1965 году в Украине (Мялкус Б.Н., ' 1968; Штеренберг П.М. всоавт., 1968)
т1 ■ ■ ...
В задачу наших исследований входило изучение способов выявления и степени зараженности вирусными болезнями "Мозаики резух»" методом нымунофсрмЬгтного анализа, то есть Elisa test - метод (по непрямому типу). Исследования проводились на сортах винограда Восторг, Агат донской, Кодрянка, Подарок Магарача, размноженных методом in vitro. Elisa test— это высокочувствительный тест, позволяющий определить белки, содержащиеся а тканях растений в количестве нескольких нанограммов в 1 мл.
Показания анализа обследования растений на присутствие вируса . «мозаики резухи» свидетельствуют о том, что вирусы на растениях винограда, размноженных меристемой методом in vitro, не обнаружены. Средний
показатель на аппарате Elisa на сорте „Восторг* составляет 0,015, на сорте Агат донской'он равен О,ОМ, в то время как контроль положительный (+) с вирусом «мозанкн резухи» - 0,034, а контроль отрицательный (-) без вируса - 0,012 (табл. И).
11. Показатели анализа обследования растений на вирус _"Мозаика резухи" (1990... 1991 гт.)._i_
№Ns лунок на Повтор- Показания
№ Сорт мнкроплате ностн на аппа-
рате
1 Восторг 2-В I 0,017
2-С 2 0,013
X 0,015
2 Восторг 2-Д I 0,014
2-Е 2 0,015
X 0,0145
3 Восторг 2-, 1 0,015
2-, 2 0,017 ^
X 0,016
4 Апгг донской 3-В 1 0,017
з-с 2 0,012
X 0,014
5 Агат донской З.д 1 0,016
3-Е 2 0,014
X 0,015
6 Агат донской 3-. 1 0.012
3-. 2 0,014
X 0,013
Контроль, Вирус "мозаика п-в 1 0,033
(+)положит резухи" п-с 2 0,034
X 0,0335
Контроль, Безвирусный н-д 1 0,013
(-)отрнцат 11-Е 2 0,011
X 0,012
Следует отметить, «по анализу на содержание вируса «мозаики резухи»
подвергались растения, находящиеся в сосуд-пакетах, поэтому можно только
констатировать данные, полученные на аппарате ELISA, что вирус «мозаики резухи» на этом этапе не обнаружен (табл.П)
-J t- -
Влияние цеолита и« укоренение« рост и развитее растений в условиях ¡n
vitro н in vivo
Органы растений, ткани и клетки в большинстве случаев способны расти на среде, содержащей лишь основные вещества, поставленные сосудистой системой. Такие, как соли азота и другие необходимые элементы: сахароза, некоторые амнноки "лоты, витамины и другие факторы, влияющие на
12. Использование цеолита в условиях in vitro сорт^Подарок Магарача"(1 990.,.) 991 тт.).
N* Варианты При жм ваемость растений, Высота растений, см Число междоузлий С листом, urr.
шт. %
1. Мурасиге-Скуга -(контроль) 9 90,0 9,8 8,2
2. Цеолит < 1мм + НгООшетнл.) 0 0,0 0.0 0,0
3. Цеолит 1..J мм + HjO (дистнл.) 8 80,0 8,3 7.6
■ Цеолит < 1мм (50%) +1...Э мм (5(3%) 4 40,0 7.2 6.5
5. Мураскге-Скуга+цео-литОД.Л мм (без агара) 2 20г0 * 4.6 3.0
V Мурасиге-Скугз+цео-лит 1...3 мм (без агара) 10 100,0 10,5 8.6
7. Мураснге-Скуга+цео-лнт6,5...1мм (50%) +1...3мм (50%) (без агара) 5 50,0 4.8 3.1
HCPoí 2.18
рост н развитие растения. Однако точный состав питательной среды должен
быть подобран в зависимости от потребностей разных групп растений, в . конкретной случае • винограда.
Нами была поставлена цель изучить возможность замени дорогостоящих искусственных питательных сред на среду с цеолитовым субстратом при размножении винограда методом in vitro. Посадку одноглаз ко вмх эксплантов винограда проводили на просгерилизоваиный субстрат цеолита согласно общей методике производства посадочного материала в условиях in vitro.
В качестве контроля использовали модифицированную среду Мурасиге-Скуга. Экспериментальным путем, изучая действие цеолита в разных качествах, как с различными фракциями, так и совместно с модифицированной средой MypacHic-Oeyra. следует выделить варианты с цеолитом фракцией 1...3 мм, как в чистом виде, так и со средой Мураснге-Скуга. В этих вариантах наблюдается высокая приживаемость н рост растений (табл. )2).
Процесс микроразмножения растений состоит из ряда последовательных операций, каждая из которых имеет свою специфику: отбор эксплантов0 н введение их в культуру, собственно мтфоразмноженне, ■ укоренение -размноженных побегов и адаптация растений к нестерильным условиям ю viva Последний этап процесса микроразмножения • самый ответственный и может свести на нет всю предыдущую работу из-за некачественного его проведения.
На этом этапе большое значение имеет подбор оптимального субстрата, требующий специальной доработки. В предлагаемом нами способе адаптации растений винограда последний проводится в культуральных комнатах. Полиэтиленовые сосуд-пакеты размерам 6 см в диаметре и 25 г.м в высоту наполняли цеолитовым субстратом и производили посадку в них пробирочных растений in vitro. В эксперимент были включены цеолиты различных фракций (табл.13). Результаты эксперимента при изучении влияния исолитового субстрата различных фракций на приживаемость и развитие виноградных растений, выращиваемых в сосуд-пакетах а период адаптации, показывают, что приживаемость растений при использовании цеолита фракцией I...3 мм составляет 90 %. Такой же процент приживаемости и у контрольного вариант:
13. Использование цеолита при доращивалии растений винограда в сосуд-пакетах (1991... 1993 гг.)
н. Вариант При живаемость растений, Высота растений. Число междоузлий с . листом,
игг. % см шт.
1. Песо* - контроль 18 90,0 16,3 9.5
2. Цеолит O.S... 1 мм 0 0,0 0.0 0.0
3. Цеолит 1 „3 мм 18 90.0 18,7 9.8
4. Цеолит 3...5 мм 12 60,0 14,4 8,7
5. Цеолит S...10 мм 0 0,0 0.0 0.0
6. Цеолит 0,5... 1 мм <50%>И...Э мм(50%) 10 50.0 13.2 8.4
7. Цеолит ОЛ..1мм(33.3%) + I.Jmm(333%) + 3.„5ш*(33,3%) 16 80.0 16,4 9,2
НСР« 3,82
Однако показатель интенсивности роста растений с цеолитом выше (табл. 13). Варианты, когда субстрат имеет фракции цеолита менее 1 мм и 5... 10 мм, дат отрицательные результаты. То есть с одной стороны, из-за плотности субстрата корня не могут развиваться, с другой стороны, слишком большая фракция также пагубно действует на развитие нежных корней растений винограда, которые погибают так и не приспособившись н не адаптировавшись.
Таким образом, цсолитовый субстрат фракцией I...3 мм при выращивании виноградных растений в период адаптации в сосуд-пакетах in . : vivo является - наиболее оптимальным, при котором обеспечивается формирование хорошей корневой системы и надземной части растений.
Оздоровленные пробирочные растения винограда проходят адаптацию к нестерильным условиям в сосул-пакетах с субстратом нз песка н различных фракций цеолита. При появлении настоящего листа, что указывает на хорошую приживаемость и окончание процесса адаптации растения, их можно высаживать в теплицы (пленочные или стеклянные).
Однако, по нашим наблюдениям, приживаемость этих растений недостаточно высока, особенно при отсутствии возможности полива. Лучше приживаются растения с 7...$ настоящими листьями высотой 20.„25 см через 30..,40 дней после адаптации.
Важно также определить оптимальные сроки высадки растений в теплицы.
На основании полученных нами данных оптимальные сроки посадкн -в апреле, тем не менее допустим и срок посадки а мае. Из растений винограда, высаженных в эти сроки, к концу вегетации, осенью можно получить оздоровленные стандартные саженцы.
Для производства качественного оздоровленного посадочного материала винограда мы изучали влияние цеолита на укоренение, рост и развитие растений винограда в условиях защищенного грунта.
Благодаря удлиненному периоду вегетации виноградных растений в теплицах, оптимальному температурному режиму и значительно более устойчивой влажности воздуха н почвы, растения винограда имели более высокие показатели роста и развития, чем саженцы в открытом грутче. .
По нашему мнению, весьма перспективным является использование цеолита в качестве почвенного субстрата цри выращивании посадочного материала винограда в теплицах.
Исходя нз того, что дня растений винограда структура и фракционный состав цеолигового субстрата имеет важное значенне, если не решающее, потребовалось изучение фракционного соотношения цеатитового субстрата на > развитие, рост, продуктивность посадочного материала винограда. Наблюдения;
14. Использование цеолита в условиях защищенного грунта (1992... 1994 гг.)
№ Варианты Прижи* вае- мс.-ть, % Вызревание побегов, см Кол-во междоузлий с листом, нгт. Диаметр побегов мм
Сорт ^К'одрин ка "
I. Песок ■ контроль 80,0 68,0 16,2 4,8 4,0
2. Цеолит 0,5... 1 мм 40,0 54,6 13.7 3.6 М
3, Цеолит I ...3 мм 90,0 72,7 17.9 5.0 _4.8
4. Цеолит 3...5 мм 90,0 84,8 17,6 5.2 4,9
5. Цеолит5...)0мм 70,0 68,4 16,1 4.1 3,9
6. Цеолит 1...3 мм (50%)+3...5 мм(50 %) 100,0 93,4 18,2 5.3 V
7. Цеолит 1..,3мм(33,3%) + 3...5 мм (33,3%) + 5...10 мм (33.3%) 100,0 88,1 17,8 5.1 5,0
НСГ«1 12,36
Сорт „Пода рок Магарача"
1. Песок - контроль 90,0 76,4 15,9 « 5,4 * 5,2
2. Цеолит 0,5... 1 мм 50,0 57,3 12,4 4,1 4,0
3. Цеолит 1...3 мм 100,0 83,6 16,8 5.6 5,2
4. Цеолит 3...5 мм 90,0 85,1 »6.5 5.1 4,8
5. Цеолит 5...10 мм 70,0 74,4 16,0 4,7 4,4
• 6. Цеолит 1 ...3 мм (50%>+3,,,5 мм(50 %) 100,0 102,6 17,4 5.2 4,9
7. ' Цеолит 1 ...3мм(33,3%) + 3...5 мм ^33,3%) + 5...10мм (33,34) 90,0 94,5 17,1 5.6 5,0
НСРо( 10г18
за ростом и развитием растений винограда показали определенную связь между высотой растений, количеством листьев и междоузлий, диаметром побегов и соотношением фракционного субстрата цеолита (табл. 14).
Результаты исследований показывают, что фракционный состав цеолнтового субстрата зависит от свойства агрегатов. Вызревание побегов растений винограда в вариантах 1, 2 было наименьшим (табл. 14). Во всех остальных вариантах опыта использования цеолита наблюдалась тенденция к повышению процента приживаемости растений, вызревания побегов и увеличения количества междоузлий с листом. Тем не менее, следует особо отметить вариант 6, где все показатели (приживаемость, вызревание побегов, количество междоузлий с листом и диаметр побегов) были выше, чем в других вариантах опыта, хотя и в варианте 7 получены неплохие результаты.
II Раздел. Рмпвм семейных с«рт винограда различных зтмг»- ° пмряфнчмхт групп на применение гмббереллиия
Влияние гиб&ереляина на '■ рост легетамимих органа* м эмбриональную закладку соцветии • зимующем глюк*
В смэн с принципиально новым в технологическом отношении подходом обработки насаждений семенных сортов винограда гнббереллином изучению этих »опросов быж> уделено особое внимание.
Результаты исследований позволили установить следующие основные закономерности. Препарат пра сплошной обработке им растений вызывает определенную стимуляцию роста побегов, степень которой зависит от принадлежности сорта к эколо го-географической труппе, пола цветка' я концентрации раствора. Снльне* на действие гиббереллнна реагируют сорта запад»ю-европейской группы. Внутри восточной группы сорта, имеющие функционально-женский тип цветка, менее отзывчивы на применение препарата. Степень реакции сортов всех трупп прямо пропорциональна
величине концентрации распора. Наименьшая прибавка длины побегов »од действием препарата зафиксирована у сортовиКаттакурган"н ^Ниыраиг."
Цитоэмбриологические исследования таких показателей как величина . форма зимующего глазка в различных* зонах побега, диаметр центральной почки, длина эмбрионального побега, количество соцветий в центральной почке, диаметр и длина соцье ий, а также срок распускания глазков и процент развившихся из них побегов подвержены определенным изменениям под влиянием гнббереллинз. Причем степень нх изменчивости тахже зависит от принадлежности сорта к эколого-географи ческой группе, пола цветка, концентрации раствора и срока обработки. Как правило, повышенная концентрация гнббереллнна (50 и 100 мг/л) вызывает уменьшение величины глазка, которое по зонам побега соотвегствеино составляет у сорта ^Рислинг*1 на 6,9% и 16-2%. у сорта „Баян ширей" 7-21% и 20-28%. При этом зимующий •лаэок вместо широко конической формы приобретал коническую, и верхняя его часть становилась более заостренной. При повышенной концентрации (100% мг/л) у сортов „Рислинг** и „Баян ширей "подушечка глазка разрасталась, при этом глазок уменьшается в размерах н выносится на вершину подушечки. Такие глазки на «торой год вегетации, как правило, не развивались.
Учеты плодоношения н перезимовки показали, что реакция семенных сортов винограда на действие препарата различна. Применение препарата в конце цветения у всех изучаемых сортов, кроме „Кагтакургана" и „НимрангзС вызывало задержку распускания почек на 4- 5 дней. Повышенная концентрация (50 ыг/п) при сроке обработай растений в конце цветения у сорта „Рислинг1" ■ вызвала снижение процента распускания глазков, в то же время каких либо изменений данного показателя в этом варианте опыта у сорта „Ркацители** не зафиксировано. Повышенную реакцию на гнббереллин (обработка в конце цветения раствором препарата в концентрации 50 мг/л проявил сорт„Баян • ширей." - ,
■ . -«.f-
Следует отметить , что у всех изучаемых сортов такие показатели, как процогт распускания глазков, коэффициент плодоношения и коэффициент плодоносности побегов при обработке препаратом в срок через 10 дней после цветения в концентрациях 25 и 50 мг/л были на уровне контроля, хотя именно в этих вариантах наблюдается увеличение урожайности. У сортов с функционально-женским типом цветка (1 Нимранг1' и чКатгакурган" существенных изменений агробиологических показателей во всех вариантах опыта обработки гнббереллнном не наблюдалось. Физиологические м биохимические показатели
Чистая продукяимноетъ фотосинтеза. Чистую продуктивность фотосинтеза изучали на трех семенных сортах винограда — „КагтакурганГ ^Хусайне' н „Баян ширей*'при ограниченной листовой поверхности. Степень и
направленность действия препарата у всех трех сортов были различными
о
(рис.3) У сорта с функционально-женским типом цветка „ Каттакургап" наблюдалось значительное и закономерное увеличение чистой продуктивности фотосинтеза по мере повышения концентрации раствора.
У обоеполого сорта „Хусайне^нзменения практически отсутствовали, а у другого обоеполого сорта „Баян ширей" напротив, отмечено снижение чистой продуктивности фотосинтеза в вариантах с обработкой гнббереллнном.
В связи с тем, что у этих сортов указанные изменения совпадают с изменением массы грозди под действием гиббереллина, можно сделать вывод, что основным лимитирующим фактором продуктивности фотосинтеза в данном случае является не площадь-листовой поверхности, а потребности самой грозди, т.е. влияние препарата на - чистую продуктивность фотосинтеза опосредовано через его действие на саму гроздь.
Содержимые хлорофилла « листьях винограда. В нашем опыте содержание хлорофилла определяли на 4 сортах : „Баян ширей* и „Рислинг* (обоеполый тип цветка), „Каттакурган* и ,)1нмракг* (функционально-женский тип цветка). Данные табл.17 показывают, что разница а содержании
-кб-
хлорофилла между вариантами опыта была несущественной. Исключением был вариант с концентрацией препарата 50 мг/л на соргс^Баян ширей" Уменьшение содержания хлорофилла в листьях отмечено в зоне побега с интенсивным ростом листьев. Поскольку в этом варианте отмечено также усиление интенсивности роста листовых пластинок, то в данном случае правомерно высказывание Гамбурга К.3.('964) об отставании синтеза пигмента от роста листовых пластинок.
Накопление сахара* « ягодах винограда. Из всех органических соединений, входящих в химический состав ягод, наиболее существенное значение, определящее качество плодов, имеют сахара. В целом но нх содержанию в значительной степени судят о качестве винограда. Практически у всех исследуемых сортов винограда (табл.18) обработка гиббереллином вызвала повышение сахаронакоплення, что соответствует биологии гриба "usrium moniti forme, который значительно лучше растет в условиях преобладания углеродных источников питания над азотным (Гамбург КЛ. 1964). Эта биологическая особенность гриба Fusarium monili forme позволяет предположить, что, поселяясь на растениях, он выделяет в ткань гиббереллин, в результат« чего повышается содержание углеводов.
Анализ опубликованных данных и результаты наших исследований показали, что влияние гиббереллина на содержание Сахаров зависит от биологических особенностей сорта, применяемых концентраций и сроков обработки. Повышение сахаронакоплення в опыте отмечалось в основном при обработке гиббереллином я конце цветения.
У семенных сортов винограда под действием гиббереллина наблюдается тенденция к повышению сахаристости сока ягод, у бессемянных же сортов отмечается обратная закономерность (Мананков М.К. 1981), т.е. реакция семенных сортов винограда значительно отличается от реакции бессемянных.
Взаимосвязь чистой продуктивности фотасйнтвэа с массой грозди при применении гкйвереллина (1966 г.)
Рис. й
5 20 х
у
§ 15
&
£ 10 §
в
Ь и
Катхахурган - Хус&№е
800
600
3
с
3- 400
I :
200
Ваян ширей
КЛ
- контроль
223 " 25 мр/л ^ 50 кг/л
Каттакурган
Г
А
Хусайне
С
ж
ш
Ваян ииреО
17. Влияние сплошной обработки куста гиббсреляином на содержание хлорофилла к листьях винограда
• Содержание хлорофилла
№ Вариант I зона (новообразовавшиеся листья ) II зона (листья интенсивного роста) III зона (сформированные листья)
% на кассу листьев %к контролю % н» массу листдеа КОИГ- ролю Ч ня мессу листьев %« контролю
1 2 3 4 5 « 7 *
сорт.,Баян ширей"
1, Контроль 0.078 100,0 0,099 100,0 0,103 100,0
2. 25 мг/л (конец цветения) 0.081 103 0,098 98,9 0,102 99.0
3. 50 мг/л (конец цветения) 0.073 93,6 0.077 77,2 0,101 98,0
НСР« 0.015 — 0,020 — 0,002 ■ —
.сорт Рислинг"
1. Контроль 0,116 100,0 0.123 100,0 0Л129 100,0
2. 25 мг/г (конец цветения) 0,116 100.0 0,121 98,0 0.121 93.2
3. 50 мг/л (конец цветения) 0,111 95,6 0,10^ 87,0 0,131 101,6
НСРМ 0,009 — 0,0)8 — 0,020 —
сорт.,К»тта курган"
1. Контроль 0,122 100,0 0.143 100,0 0,148 100,0
2. 25 мг/я (конец цветения) . 0.120 98,3 0,145 101,4 0,146 98,6
3. 30 мг/л (конец цветения) 0,124 101,6 0,140 97,9 0,144 973
НСР<« 0,006 — 0.006 — 0.008 —
сорт Лнмрянг «
Контроль 0,135 100,0 0,148 100,0 0.154 100.0
' 2. 25 мг/л (конец цветения) ^ 0,137 101,5 0,151 102,0 0.156 1013
з. 50 мг/л (конец ■..''■ цветения) ■ 0,13 103,0 0,156 105,4 0,145 94.2
НСР»5 0,004 — 0,016 — 0,015 —
-ЧЬ '
18. Влияние гиббереллина на сахаристость сока ягод, % ___ (1983... 1986 гг.)__
Сорт Контроль Обработка в конце цветения, мг/л Обработка через Юдней после цветения, мг/л Обработка в конце цветения + через 10 дней, мг/л
25 | 50 25 1 50 25
Сорта с обоеполым типом цветка
1, Convar occidental is Nepnil
„Рислинг" 20,5 22,0 22,4 20,8 21,1 21,9
„ Мускат венгерский *1 20,9 23.4 23,5 21,8 22,0 22J
11. Convar pantika Negrul
..Ркацители" | 20,9 22.2 22,5 22,0 22,1 22,7
Ш. Convar oriental's Neural
„ Баян ширей " 17,8 21,7 21,8 18,9 19,4 о 20,2
„Юмапак" 18,5 21,8 21,7 20,3 19,8 20,8
„Сурхак кнтабский " 13.3 15,2 15,8 15,2 15,0 15,8
„ Хал или черный." 12,4 14г8 15,3 13,4 13,2 15.2
и Джанджяя кара" 18.4 19,9 20,4 19,1 19,3 19,7
„ Хусайне" 17.1 18,3 18,9 17,9 18,1 19,2
„Тайфи розовый" 17,3 1У> 9,1 18,8 19,0 19.6
Сорта с функционально-женским типом цветка
u Катга-курган" 1«,9 19,3 19,6 17,9 18^ 19,8
„Ннмранг" 18,6 19.7 19,9 19,1 19.3 19,8
Бессемянный сорт
„ Кишмиш черный " 23.0 - ■ 22,4 22,0 22,4 23,3 22.9
■-so-
Влияние гнбберелиня на продуктивность виноградных растений.
Тенденция к уменьшению массы грозди при обрабопсе гиббереплнном в конце цветения в обоих концентрациях наблюдается у обоеполых сортов Сопуаг осск!епЫ|$ Ые£ги1 „Рислинг,*4 ^Мускат венгерский" и Сопуаг опеМаЪз и Баян ширей" Причиной этому явилось ингибирующее действие препарата на развитие семян 1 ягодах, в результате чего в грозди образуется значительное количество бессемянных порошащихся ягод, имеющих более мелкие размеры. У сорта „Баян ширей" доля бессемянных ягод достигла 75% . Существенное увеличение массы грозди при обработке гнббереллнном через 10 дней отмечено у обоеполых сортов Сопчаг огкп(аН$ Ые^ги! нЮмалак7 „Сурхак кнтабскнй" „Халнли чбрный" ^ Джанджал кара',' Дайфи розовый." У сортов с функционально-женским типом цветка „Катта курган" н ^Нимранг" увеличение массы грозди было отмечено при обработке в период как через 10 дней после чветения, так и в конце цветения. Применение гнббереллнпа повысило урожайность сортов экопого-географической группы Сопуаг оссИспЫЬ Ыевт! „РнслннгГ „М/скагг венгерский" группы Сопуаг опели!¡5 Недги! „ Юмалак" при обр лботке через 10 дней после цветения в концентрации 50 мг/л. (табл. 19). При применен им препарата через 10 дней после цветения как в концентрации 50 мг/л. .так и в концентрации у сортов Сопуаг опеШа^ Не£ги1 „Баян ширей," „ХусаЙнеГ .Тайфи розовый," „Сурхак кнтабский" „Халнли черный" урожайность увеличилась. Из всех изучаемых сортов наиболее высокой положительной отзавчивостью выделились сорта, имеющие функционально-женский тип цветка, ^Кагтахурган" н чНимранг/ у которых урожайность повысилась во всех вариантах обработки. Причем наибольшая прибавка урожая получена а варианте опыта при обработке насаждений раствором гиббереллина в концентрации 50 мг/л в конце цветения.
19. Влияние гиббереллнка на урожайность, ц/га (1983...1986 гт.)
Сорт Контроль Обработка в конце „ цветения, мг/л Обработка через 10 дней после цветения, мг/л Обработка в конце цветения + через 10 дней, мг/л
25 |50 25 I 50 25
Сорта с обоеполым типом цветка 1. Convar occidental ¡s Negral
яРислинг" 138,3 133,8 129,9 149,1 157,1 132,9
„ Мускат венгерский" 183,8 155,3 . 141,8 199,0 205,2 162,4
11 Convar pontica Negrul
я Ркацители " 307,9 284,2 272,2 315,9 327,5 333,8
til. Convar oríentalís Negrul o
чБаян ширей* 398,4 377,9 311,2 441,3 458.3 428,2
„Юмалак" 134,2 134,9 127,8 139,9 154,9 139,2
„Сурхак китайский" 170,4 170,5 166,0 183,8 207,9 190,1
„ Хал или черный" 227,6 235,6 220,4 255,2 268,6 238,3
„ Джанджал кара" 305,5 340,9 316^5 311,7 306,9 343,6 I
„Хусайне" 225,6 229.5 251,8 266.1 277,5 233,7
„ТаЙфн розовый" 371,7 357,4 336,1 404,1 414,5 357,9
Сорта с ( >уикцнонально женским типом цветка
„Капакургая" 211,1 258,1 288,9 243,2 248,9 278,5 .
„Ннмранг" 246,2 293,7 319,0 276,6 287,3 331,6
Бесссмяний сорт -
„ Кишмиш черный " 356.1 380,6 391,0 361,8 374,1 .... 406,4
Внедрение н экономическая эффективность мшнширфванюг« способа обработки гиббереллином сорта нКа1та курс«»" с функционально-женским типом »»я к"а.
В 1986 году было проведено внедрение результатов исследований и определена экономическая эффективность механизированного способа обработки гиббереллином сорта винограда „Каттакурган" с функционально-женским типом цветка в совхозе им. Мичурина Узбекистана на плошали пять гектаров.
Результаты внедрения свидетельствуют о том, что механизированный способ обработки гиббереллином обеспечивает достаточно высокую эффективность действия препарата на повышение продуктивности насаждений сорта винограда Каттакурган с функционал ьно-жснскнм типом цветка.
Ввиду постоянно обостряющегося дефицита рабочей силы в сельском "озяйстве из способов обработки нами был выбран именно механизированный способ обработки гиббереллином виноградных насаждений, разработанный кафедрой виноградарства ТСХА и НПО им.Р.Р, Шредера.
Исследования, проведенные Саленковым (1981), показывают, что при ручной обработке раствором гиббереллина затраты труда на гектар составляют 5 чел.-дн., при механизированной обработке 0,3 чел.-днУга, то есть затраты труда снижаются почти в 80 раз, что свидетельствует о хороших перспективах данного способа обработки в условиях дефицита рабочей склы.
При обработке гиббереллином сорта винограда ^Каттакурган'с помощью •факторного 'опрыскивателя урожайность увеличилась на 23,6 ц/га, что позволило получить годовой экономический эффект в размере 794 рубля дополнительного чистого дохода с каждого гектара и составляет на весь объем внедрения (пять гектаров) 3970 руб. (в ценах 1986 года).
выводы
1. Проведенные исследования показали возможность успешного размножения винограда методом культуры изолированных тканей н органов in vitro, что объясняется высокой потенциальной способностью винограда к вегетативному размножению вообще и к микроклопальному в частности.
2. Раствор 2%-го гилохлорита натрия при экспозиции 10 мин. оказался более эффективным при стерилизации эксплантов винограда, что позволяло существенно снизить их зараженность. Ртутьсодержащие препараты (диоцид, сулема) на начальных этапах культивирования оказывают ингибнруюшее действие на развитие эксплантов.
3. Питательная среда на основе прописи Мураснге-Скуга является
оптимальной для развития микропобегов винограда по сравнению со средами
о
Гогре, Уайта и Хеллера.
4. Из испытанных регуляторов роста наиболее результативно регенерация побегов из изолированных апексов проходила при концентрации . 6-БАП 0,5... 1,0 мг/л. При массовом размножении побегов оптимальной оказалась концентрация 6-БАП 2 мг/л.
Стимулирующее действие ДРОПа оказалось эффективным в низкой концентрации, однако эффект вызываемый им, был ниже, чем 6-БАП.
Действие ПС в концентрации 1,0 мг/л в сочетании с 6-БАП 0,5 мг/л, показало лучшие результаты. Такое сочетание препаратов ускоряет вытягивание стеблей у растений (кластер-побегов).
При испытании ауксинов (ИМК. ИУК), введенных в среду на этапе укоренения побегов, самый высокий процент укоренения бш. отмечен на среде, содержащей ИМК в концентрации 2 мг/л, который является лучшим стимулятором рнзогенеза.
5, Растения, полученные с использованием метода in vitro, не отличаются от исходных форм. Иногда наблюдаемые у пробирочных растений морфгаы
-S4- '
зависят от условий культивирования н исчезают после высадки в нестерильные условия.
6. Использование сосуд-пакетов т полиэтиленовой пленки спосооствует успешному переносу пробирочных растений винограда в нестерильную среду в результате создания в них благоприятных условий микроклимата.
7. Установлено, что адаптация растений непосредственно в пробирках проходит плавно и с меньшими потерями при открытии пробирок на одну треть (33%), при котором нежные ткани листьев растений винограда адаптируются постепенно и повышается выход растений винограда до 53-90 %.
8. Черенкование растений винограда из сосуд-пакетов дает возможность значительно увеличить коэффициент размножения оздоровленных растений in vitro. В этих целях эффективно использовать субстрат мелкой фракции (двухразовый обжиг) перлита, при котором наилучшие показатели приживаемости растений а условиях in vivo (сосуд — пакет).
9. Наиболее благоприятным сроком пересадки растений вннорада, прошедших адаптацию, в условия защищенного грунта является март— апрель— май. .
10. Путем изучения фауны нематод, впервые проведенными нами на виноградниках Чеченской Республики, были обнаружены представители различных экологических трупп. Нематоды родов XtpMnema и Longidonts, представлены видами Xiphinema index, Longidorus elongatos- Оба эти вида обнаружены в госхозе «Гребенской» на песчаных типах почв. Обнаруженная плотность популяции нематод «ирусоноснтелей на 100 г почвы 2,,.4 шт. достаточна для заражения.
11. Проведенный иммуноферментный анализ (Elisa test) на содержание вируса «мозаики резухи» на растениях винограда, полученных через меристему в условиях in vitro, свидетельствует, что вирус не обнаружен,
-S5-
12. Состав агрегатов размерами 1-Змм и 3*5 мм позволило создать оптимальное соотношение твердой, жидкой и газообразной фаз цеолитового субстрата с норна остью 50% н наибольшей алагоемкостью 50%. Прочность и водопрочность псолитояого субстрата могут обеспечить долговременное его использование.
13. Установлено сокращение периода укоренения растений винограда в условиях in vivo (сосуд-пакет) на цеолитовом субстрате по сравнению с контролем. Приживаемость растений составляла 95%. Отмечена интенсивность ростовых процессов растений винограда на цеолитовом субстрате, которая увеличилась на 12,4%.
14. В результате изучения действия различных фракций цеолита на рост и развитие растений винограда в условиях защищенного грунта установлою, что цеолит способствовал хорошему росту, высокому вызреванию побегов и 100% приживаемости. °
15. Путем сравнения поливных режимов различных субстратов выявлена закономерность: оросительная норма цеолитовых субстратов гораздо ниже, чем торфяных и песчаных.
16. В результате испытания гнббереялнна на семенных сортах вино1рада было установлено, что действие препарата на виноградное растение зависит от биологических особенностей сорта, концентрации раствора препарата и срока обработки.
17. При обработке насаждений винограда гибберелляном у обоеполых сортов Convar orieiHalis Negro! .Юмалак,' „Сурхак китабскиЙ." ^>£алкли черный," Джаиджал кара? Тайфи розовый" через 10 дней после цветения увеличивается -масса грозди. У сортов, имеющих функционально женский тип цветка, Каттакурган" и чНимранг"увеличенне массы грозди отмечается как .через 10 дней после цветения, так и в конце цветения.
|g. Дня повышения урожайности для всех представителей трех эколого-гсо графических трупп сортов является срок обработки через 10 дней после
цветения. Для сортов Сопуаг осск)епЫ|$ №{ти1 „Рислинг;' Мускат венгерский*1 — обработка гиббереллииом в концентрации 50 мг/д, а для сортов Сопчаг опсШаНз Ыейто! — в обеих концентрациях 25 мг/л и 50 мг/л, У сортов с функционально женским типом цветка наибольшая прибавка урожая получена в варианте при обработке я конце цветения к концентрации 50 мг/л.
19. Влияние гиббереялина на содержание сахара в ягодах винограда зависит от биологических особенностей сорта, развития семян в ягоде. У семенных сортов в том случае, когда гиббереллин вызывает увеличение в грозди числа бессемянных ягод, он способствует повышению сахаристости, ускорению сроков созревания, что я&ляется важным фактором особенно тля сортов раннего периода созревания.
20, Среди семенных сортов винограда наиболее отзывчивы на обработку гиббереллииом сорта с функционально женским типом цветка. Под действием препарата увеличиваются размеры ягод и повышается их зааязываемость, что приводит к увеличению массы грозди и урожая. Эффективны концентрации от 25 до 50 мг/л. Обработку можно производить с конца цветения и в течение 10 дней после него. Лучшие результаты дает однократная обработка в конце цветения раствором в концентрации 50 мг/л. В связи с тем, что препарат у этих сортов не вызывает избыточного роста побегов и снижения плодоносности кустов, обработку можно проводить методом сплошного опрыскивания.
Рекомендации производству
. Для размножения винограда методом клонального микроразмножения в \ качестве источника эксплантов использовать меристематнческие верхушки размером 200.. 300 м км и одноглазковые экспланты винограда. Стерилизацию ; растительного материала нужно проводить 2% раствором гил о хлорита натрия ' экспозицией 10 мин. ■■
Интенсивности развития* эксплантов винограда добиваться на питательной среде, составленной на основе минеральных солей рецептов Мураснге-Скуга с добавлением тиамина —1мг/л, лирндоксина — 1мг/л, никотиновой кислоты - 1мг/л, патентоката кальция- 1 мг/л, мезоинознта -100 мг/л. Среда должна автоклавироваться под давлением 0,S атм. в течение 20 минут. Экспланты следует культивировать на 16 часовом режиме дня при температуре 24.,.26*С и освещенностью 3-5 тысяч люкс.
Для ускорения процесса роста побегов в условиях in vitro применять в сочетании стимуляторы роста ГК 1,0 мг/л i- 6-БАП 0,5 мг/л.
Обработка ГК 25мг/л в адаптационный период в условиях in vivo будет способствовать выгонке и хорошему развитию наземной части растений. .
В качестве субстрата для сосуд-пакетов рекомендуется цеолит фракцией I...3 мм и песок (стерилизованный марганцовокислым калием + раствор Чеснокова). В условиях защищенного грунта использовать соотношение фракций цеолита 1 -3 мм (50%) + 3-5 мм (50%).
При подготовке, участков под микроматочникн оздоровленного посадочного материала винограда в борьбе с нематодами-переносчиками вирусов Xiphinema index н Longidorus elongatua необходима обязательная фумигация почвы. *
Разработанная система мнкроклонального размножения винограда может быть использована для оздоровления н массового размножения безвирусных клонов в системе производства здорового посадочного материала, а также для размножения ценных перспективных форм и новых комплексно-устойчивых сортов винограда.
Обработку сортов винограда с функционально женсхнм типом цветка гиббереллином можно проводить с помощью тракторного опрыскивателя. Для этой цели используют опрыскиватель ОУМ-4. Однако, можно использовать серийный опрыскиватель ОН-400-5 со специально установленными.: вертикальными штангами. При опрыскивании, дня получения хорошего
качества обработки, необходимо применять совмещенный принцип: штанговое опрыскивание с вентилятором (с целью обнажения со«пегий под действием воздушного потока).
' Для получения высоких прибавок урожая от применения гиббереллина следует перед механизированной обработкой тщательно провести выломку н подвязку зеленых побегов с целью качественного покрытия соцветий раствором препарата.
СПИСОК* опубликованных работ и изобретений
1. Совершенствование технологии ускоренного размножения и оздоровлен №. посадочного материала винограда методом in vitro. - М, - 1998. -Монография. - С.223.
2. Реакция семенных сортов винограда различных эколого-географмческих групп на применение гиббереллина,- Монография.- М,- 1996. - С. 138.
3. Программа н методические указания по курсу «(Сельскохозяйственная биотехнология» для студентов Аграрного факультета ЧГУ.- М. - 1998. - С.24.
4. Перспективы использования гиббереллина на семенных сортах винограда а Узбекской ССР. И Виноделие и виноградарство СССР. - 1987,- № 4.- С. 25-27.
5. Влияние сплошной обработки раствором гиббереллина семенных сортов винограда в условиях Узбекской ССР на рост, плодоношение и качество винограда. ТСХА ГОСАГРОПРОМ,- М, - 1987..-20. (Рукопись доп. во
: ВНИИТЭИСХ, № 347 ВС-87 Деп ).
6. Авторское свидетельство № 1323073 на изобретение: "Способ выращивания ягодных культур". - 1987.
7. Влияние сплошной обработки раствором гиббереллнна на семенные copia винограда в условиях Узбекской ССР. И Новое в технологии возделывания винограда; сб. науч. трудов. - М.: Изд-во ТСХА. - 1988,
8. Наука производству: Ускоренное размножение винограда метолом in vitro. Заочный институт е.- х, знаний, // Голос Чечено-Ингушетии, - № 87. -1991.
9. Влияние гиббереллнна на физиологические и биохимические показатели семенных сортов вино1рада. // Доклады ТСХА. - 1998. - № 1. -С. 148-155,
10. Ускоренное размножение новых комплексно-устойчивых сортов винограда. // Биология клеток растений in vitro. Биотехнология и сохранение генофонда: Тезисы докл. VII Междун. Конф. - М. - 1997. - С.395-396.
11. Адаптация оздоровленных in vitro растений винограда на цеолитовых субстратах, / Биология клеток растений ш vitro. Биотехнология н сохранение генофонда: Тезисы докл. VII Междун. Конф. — М. - 1997.— С.397-398.
12. Введение экеллактов винограда в культуру in vitro н их развянтне на этапе микроразмножения. - Сб. трудов ЧТУ. - Грозный, - 1998. - С,134.
13. ^генерация растений винограда из апикальной меристемы.* Сб. трудов ЧГУ. - Грозный. - 1998. - С.133.
14. Последействие гиббереллнна на основные агробиологические показатели семенных сортов винограда ft Садоводство и виноградарство - 1999. -№2.
Объем 3% п. л.
Заказ 337.
Тира-ж 100
Типография Издательства МСХА 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 14
Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, доктора сельскохозяйственных наук, Батукаев, Абдулмалик Абдулхамидович, Москва
/О
V J 1 i . ^
\ : ' ... ' у
МОСКОВСКАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ИМЕНИ К.А. ТИМИРЯЗЕВА
На правах рукописи
БАТУКАЕВ Абдулмалик Абдулхамидович
Совершенствование технологии ускоренного размножения винограда методом in vitro и применение регуляторов роста в
условиях in vitro и in vivo
Специальность 06.01.08. - виноградарство
Диссертация на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук
Научный консультант -доктор сельскохозяйственных наук, профессор К.В. СМИРНОВ
Москва -1999
СОДЕРЖАНИЕ
ЧАСТЬ ПЕРВАЯ
Совершенствование технологии ускоренного размножения винограда
методом in vitro
Введение....................................................................................10
Глава 1. Культура изолированных тканей и органов растений in vitro (обзор литературы).............................................................17
1.1. История развития метода in vitro и области его применения.......17
1.2. Основные методы клонального микроразмножения растений (in vitro).............................................................................................20
1.2.1. Индукция пролиферации пазушных меристем .................25
1.2.2. Развитие адвентивных побегов из ткани экспланта...............27
1.2.3. Регенерация растений из каллуса...................................29
1.3. Основные этапы клонального микроразмножения растений in vitro............................................................................................31
1.3.1. Регенерация растений из апикальной меристемы...........39
1.3.2. Укоренение микропобегов...............................................43
1.4. Освобождение растений от вирусных заболеваний...........46
1.5. Факторы, влияющие на процесс регенерации и клональное микроразмножение in vitro................................................................ 49
1.6. Адаптация растений при пересадке в нестерильные условия 54
1.7. Хранение пробирочных растений.................................. 60
Глава 2. Цель, задачи, объект, методика и условия проведения
исследований...................................................................................64
2.1. Цель и задачи исследований................... ..........................64
2. 2. Объект исследований.......................................................66
2. 3. Организация и методика проведения работы..:.....................71
2.3.1. Подготовка и стерилизация исходного материала............ 72
2.3.2. Приготовление питательных сред..................................73
2.3.3. Работа в стерильном боксе............................................75
2.3.4. Условия культивирования...............................................76
2.4. Элементы учетов и методы обработки полученных данных........76
Глава 3. Введение эксплантов винограда в культуру in vitro и их развитие на этапе микроразмножения..............................................78
3.1. Введение в культуру in vitro............................................78
3.2. Регенерация растений из апикальной меристемы..............81
3.3. Влияние минерального состава питательной среды на развитие эксплантов винограда.........................................................................86
3.4. Влияние регуляторов роста на развитие эксплантов винограда в условиях in vitro...............................................................................89
3.4.1. Фаза удлинения побегов..............................................93
3.4.2. Этапы укоренения побегов винограда in vitro ..................95
Резюме.................................... ................................................96
Глава 4. Адаптация растений винограда in vitro при пересадке в
нестерильные условия in vivo...........................................................98
4.1. Адаптация растений винограда в условиях in vitro..................99
4.2. Адаптация растений винограда в условиях in vivo...............101
4.2.1. Перевод пробирочных растений в нестерильные условия ..102
4.2.2. Влияние температуры, света и влажности воздуха при адаптации растений полученных in vitro.................................105
4.2.3. Изучение возможности значительного повышения коэффициента размножение винограда.............................................107
4.2.4. Применение регуляторов роста в период адаптации растений винограда в условиях in vitro (сосуд-пакетах)..............................................109
4.3. Доведение растений винограда, размноженных методом in vitro, до стандартных саженцев в условиях теплицы...................................................ИЗ
Резюме.....................................................................................115
Глава 5. Иммуноферментный анализ на содержание вирусов в растениях винограда, размноженных методом in vitro, и определение вирусоносителей на участках, планируемых под микроматочники новых сортов винограда......................................................................... 117
5..1. Тестирование посадочного материала винограда полученного методом in vitro на наличие вирусных заболеваний..................................117
5.2. Определение вирусоносителей на участках, планируемых под микроматочники новых сортов винограда.........................................121
5.2.1. Методика отбора средней пробы почвы для выявления почвенных нематод......................................................................123
5.2.2. Методика приготовления препаратов.......................125
Резюме.....................................................................................128
Глава 6. Воздействие цеолитовых субстратов на укоренение, рост и
развитие растений винограда при микроклональном размножении ... 129
6.1. Применение природных цеолитов в сельском хозяйстве ...... 129
6.2. Цель и задачи, материал и методика проведения исследований.................................................................................... 143
6.3. Определение оптимального гранулометрического состава фракций цеолитового субстрата...................................................... 145
6.4. Влияние цеолита на укоренение, рост и развитие растений в условиях in vitro.............................................................................148
6.5. Влияние цеолита на укоренение, рост и развитие растений винограда в условиях выращивания сосуд-пакетах ................................ 150
6.6. Применение цеолита при доращивании растений in vitro в условиях защищенного грунта ......................................................................152
6.7. Изучение водного режима, физических свойств субстратов и
водообеспечение растений винограда..............................................155
Резюме.....................................................................................159
Глава 7. Переход на промышленную основу производства посадочного материала винограда методом in vitro......................... 161
7.1. Производство посадочного материала винограда в лаборатории in vitro........................................................................................... 161
7.2. Адаптация посадочного материала винограда в условиях in vivo............................................................................................. 168
7.3. Закладка микроматочников новыми перспективными, оздоровленными сортами винограда..................................................179
Глава 8. Обсуждение результатов исследований.................. 181
Выводы................................................................................. 195
Рекомендации производству................................................. 198
ЧАСТЬ ВТОРАЯ Реакция семенных сортов винограда различных эколого-географических групп на применение гиббереллина
Введение........................................................................................................201
Глава 1. Роль гиббереллинов в регуляции роста и плодоношения виноградного растения и перспективы его использования в производстве (обзор литературы)......................................................................................203
1.1. Гиббереллины, их роль и место в гормональном комплексе виноградного растени.................................................................................................203
1.2. Отзывчивость различных сортов винограда на обработку гиббереллином...........................................................................208
1.3. Практическое использование гиббереллина в технологическом
комплексе возделывания виноград ...............................................................212
Глава 2. Цель, задачи и методика проведения исследований..............218
2.1. Место проведения опытов, цель и задачи..............................218
2.2. Объект исследований и схема опытов..................................219
2.3. Элементы учета и наблюдений...........................................223
Глава 3. Влияние гиббереллина на продуктивность, качество и вегетативные органы семенных сортов винограда...................................227
3.1. Структура урожая винограда.......................................................227
3.2. Влияние гиббереллина на рост и развитие ягод и семян винограда .................................................................................239
3.3. Физиологические и биохимические показатели...........................255
3.4. Динамика роста побегов различных сортов винограда при обработке их гиббереллином и его влияние на конечный прирост и вызревание лозы..........................................................................263
3.5. Влияние гиббереллина на динамику роста листьев.....................283
3.6. Особенности анатомического строения семенных сортов винограда, обработанных гиббереллином.........................................................287
3.7. Показатели характера перезимовки и плодоносности кустов
винограда семенных сортов при применении гиббереллина...................292
Заключение...................................................................................................302
Глава 4. Влияние регуляторов роста на семенные сорта и перспективные селекционные формы винограда в условиях Молдавии ........................305
4.1. Влияние совместного применения гиббереллина с препаратом дропп на величину грозди и ее структур.....................................................305
4.2. Влияние регуляторов роста на сахаронакопление и содержание семян в ягодах винограда.............................::..............................................311
Резюме..........................................................................................................315
Внедрение и экономическая эффективность механизированного способа обработки гиббереллином сорта винограда с функционально женским
типом цветка Каттакурган ..........................................................316
Выводы.....................................................................................................318
Рекомендации производству........................................................320
Список литературы........................................................................321
Приложения......................................................................................378
ЧАСТЬ ПЕРВАЯ
Совершенствование технологии ускоренного размножения винограда методом in vitro
ВВЕДЕНИЕ
Виноград — одна из самых распространенных сельскохозяйственных культур, играющая существенную роль в мировой экономике.
Как свидетельствует мировой опыт, основной тезис научно-технического прогресса заключается в том, что только решение вопросов, имеющих большое научное значение, приводит в конечном итоге и к большому экономическому эффекту. В этом аспекте наиболее перспективными являются пути и методы БИОТЕХНОЛОГИИ — науки, возникающей на стыке нескольких биологических дисциплин: генетики, вирусологии, микробиологии и растениеводства.
Увеличение производства винограда требует не только расширения площадей, но и разработка и совершенствование технологий, обеспечивающих ускоренное размножение перспективных сортов, повышение урожайности виноградных насаждений.
Во многих странах мира большое значение в настоящее время придается внедрению в производство интенсивных методов производства высококачественного посадочного материала винограда и разработке новых высокоэффективных способов закладки виноградников.
Рост и урожайность винограда, срок вступления в плодоношение во многом зависят от качества посадочного материала.
В настоящее время биотехнология стремительно выдвигается на передний край научно-технического прогресса. Этому способствуют два обстоятельства. С одной стороны, бурное развитие современной молекулярной биологии и генетики, опирающихся на достижения химии, физики, что позволило использовать потенциал живых организмов в интересах хозяйственной деятельности человека. С другой стороны, острая
практическая потребность в новых технологиях, призванных ликвидировать нехватку продовольствия, энергии, минеральных ресурсов.
Как наука биотехнология молода, развитие ее стремительно. Поток информации иногда противоречив или доступен лишь узким специалистам.
За последние двадцать лет значительно расширились и углубились исследования по проблеме культуре тканей многих сельскохозяйственных растений, в том числе и винограда. Их направленность преследует разные цели:
— вскрытие потенциальных особенностей тех или иных тканей к регенерации;
— поиск путей индуцирования морфо- и органогенеза в каллусе;
— попытка получения гаплоидных растений из меристемного апекса или верхушек побегов после фитосанитарной термотерапии;
— микроклонирование (микроразмножение) как способ исключительно быстрого и весьма эффективного вегетативного размножения в асептических условиях. В последнем случае микроразмножение служит сокращению длительности селекционного процесса и ускорению внедрения новых сортов в производство.
Из-за недостаточной производительности существующих методов размножения посадочного материала продвижение в производство новых сортов затягивается на десятилетия. С учетом этого назрела необходимость разработки и внедрения новых методов размножения сортов винограда. Одним из эффективных способов решения проблемы является технология клонального микроразмножения винограда.
Актуальной проблемой настоящего времени является сокращение или прекращение использования химических веществ в борьбе с болезнями, вредителями и сорной растительностью с целью охраны окружающей среды от загрязнения за счет использования биологических и агротехнических
методов борьбы, внедрения сортов, устойчивых к болезням и вредителям, не требующих химических средств борьбы. Поэтому особый интерес представляют сорта технического и столового направления, отличающиеся повышенной устойчивостью к болезням (мильдью, оидиум, серая гниль, антрокноз и др.) и морозам. И это понятно. Ведь возделывание винограда комплексно-устойчивых сортов выгодно как экономически (меньше затрат труда и средств), так и экологически (продукция без ядохимикатов).
Однако отсутствие посадочного материала накладывает свой отпечаток на глобальное решение вышеуказанных проблемных вопросов, то есть обычная технология размножения винограда не отвечает требованиям времени, не может в короткие сроки обеспечить виноградарские хозяйства комплексно-устойчивыми и хозяйственно ценными сортами винограда.
Одно из существующих препятствий на пути внедрения нового сорта в практику — невозможность получения в течение одного сезона большого количества посадочного материала для вегетативного размножения. Это препятствие может быть устранено за счет использования достижений биотехнологии, которая предлагает селекционерам эффективный и быстрый метод микроразмножения растений. Очень важно и то, что псадочный материал, получаемый этим путем, генетически идентичен давшему ему начало материнскому растению.
В виноградарстве клональное размножение — получение ряда следующих друг за другом поколений генетически однородных организмов в результате вегетативного размножения от одного общего материнского организма — является традиционным. При клональном микроразмножении указанная традиция сохраняется, но значительно повышается коэффициент вегетативного размножения за единицу времени, при одновременном сокращении занимаемой площади питомников.
Клональное микроразмножение имеет ряд и других преимуществ и особенностей, а именно:
— проводится в лабораторных условиях, что исключает влияние различных факторов окружающей среды;
— имеет высокий коэффициент размножения;
— позволяет производить оздоровленный от вирусов и бактериального рака посадочный материал;
— позволяет производить размножение растений круглогодично и на потоке;
— появляется возможность размножать сорта, которые плохо укореняются обычным способом;
— получать с единицы площади максимальное количество растений;
— при размножении исключается возможность перезаражения растений;
— при интродукции растений устраняется вероятность завоза и распространения карантинных объектов;
— позволяет длительно хранить растения, находящиеся в пробирках, при соответствующих условиях;
— дает возможность селекционерам сохранить требуемый генофонд;
— ускоренно размножать новые сорта и клоны для передачи их в ГСУ и создавать в хозяйствах микроматочники интенсивного типа;
— имеет большое природоохранное и ресурсосберегающее значение.
Наиболее существенные результаты диссертации, их новизна
выражаются в следующем: установлены оптимальные концентрации растворов регуляторов роста (ИМК, 6-БАП, ПС, 2-iP, ДРОП), их влияние на развитие эксплантов в условиях in vitro, а также на укоренение, рост и развитие растении, в период их адаптации и выгонки в условиях in vivo; впервые для адаптации и выгонки пробирочных растений изучены и
рекомендованы субстраты из цеолитов Тедзаминского месторождения; впервые изучен и рекомендован метод адаптации в широких пробирках, который позволяет в весенний период высаживать растения in vitro непосредственно в теплицу, минуя промежуточный этап адаптации в сосуд пакетах; на этапе дополнительного повышения коэффициента размножения в условиях in vivo (в сосуд-пакетах) изучено и рекомендовано использовать перлит двухразового обжига; впервые проведены широкомасштабные исследования на наличие вирусоносителей на участках планируемых под закладку маточников оздоровленным посадочным материалом винограда и установлено, что из трех выбранных для закладки в них маточников, в госхозе «Гребенской» имеются вирусоносители Xiphinema index и Longidorus elongatus; проведенный нами анализ на наличие вирусов в растения полученных методом in vitro по методу Elisa teste показал, что в растени
-
Батукаев, Абдулмалик Абдулхамидович
-
доктора сельскохозяйственных наук
-
Москва, 1999
-
ВАК 06.01.08
- Совершенствование технологии ускоренного размножения интродуцированных сортов винограда в условиях Нижнего Придонья
- Система производства посадочного материала винограда высших категорий качества
- Адаптация растений винограда in vitro к условиям нестерильной среды
- Обоснование приемов световой биотехнологии при клональном микроразмножении винограда
- Оптимизация этапов клонального микроразмножения гибридов вишни на основе применения новых биологически активных веществ
