Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Совершенствование методов лабораторной диагностики герпесвирусных инфекций

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование методов лабораторной диагностики герпесвирусных инфекций"

На правах рукописи

РГБ ОД 1 4 1ААР 2011

Порываева Антонина Павловна

Совершенствование методов лабораторной диагностики герпесвирусных инфекций

03.00.06-вирусология

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2000 г.

Работа выполнена в Екатеринбургском научно-исследовательском институте вирусных инфекций МЗ РФ.

Научный руководитель -доктор медицинских наук, профессор,

заслуженный деятель науки РФ Н.П. Глинских.

Научный консультант - доктор медицинских наук Н.В. Шалунова.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН Ф.И. Ершов, доктор биологических наук, профессор Г.А. Галегов.

Ведущее учреждение:

Институт вирусных препаратов им. академика О.Г. Анджапаридзе РАМН. Защита диссертации состоится в диссертационном совете Д.001.20.02 НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН в 12 часов " з " СЬ-ОЛ-Сс с-с £ 2000 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН

Ученый секретарь специализированного совета

Автореферат разослан ^ £ ^сб-р СиСЛ ^СРР

доктор медицинских наук

Н.П. Косякова

Общая характеристика работы

ктуальносгь проблемы. По данным Всемирной организации здравоохране-1Я заболеванш, обусловленные вирусами герпеса, как причина смертности : вирусных инфекций занимают второе место после гриппа. От генерализо-ишой герпетической или вдггомегаловирусной инфекции погибает до 30% ЙЧ - инфицированных больных. Нередки случаи развития герпесвирусной гфекцип на фоне как вирусного, так и бактериального или паразитарного болепания. В настоящее время доказана этиологическая роль вируса юстого герпеса и цитомегаловируса в развитии ряда онкологических болеваний, таких как рак шейки ма гки, миелосаркома спинного мозга, яутриутробная инфекция плода герпесвирусами приводит к самопронз-)льным абортам, мертворождешпо, а также к грубым нарушениям развития гибели новорожденных в первые дни жизни.

Герпесвирусная инфекция как системное заболевание сопровождается зражением центральной нервной системы (энцефалиты, миелиты, щефаломнелиты), глаз (кератиты, кератоувеиты, иридоциклиты), печени епатиты новорожденных и взрослых), слизистых оболочек и кожных жровов. Тяжесть и острога процесса этих заболеваний определяется эфекционной активностью герпесвируса.

Способность вирусов герпеса сохраняться в популяции хозяина обеспечи-1ет существование стертых и атипичных клинических форм инфекции, »тентное носительство. Кроме того, герпесв1фусы обладают уникальной юсобностью к пожизненно!! персистенции в организме хозяина и могут эеспечивать заболевание в ассоциации с другими возбудителями, что значи-;льно затрудняетих диагностику.

Поэтому в создавшейся ситуации заметно повышается интерес к методам 1бораторной диагностики, которые позволяют выявлять вирусный антиген ^посредственно в материалах от больных и определять инфекционную гшвность вирусных агентов в наиболее короткие сроки. Как показали многие исследователи (В.К.Сганиславская 1984, И.Ф. аринский 1991, Ь. КоНшег 1992) метод иммунофлюоресценции может с :пехом применяться в практике клинических лабораторий, что позволяет пределять тактику лечения и осуществлять контроль за качеством проводных терапевтических мероприятий. Но чувствительность и специфичность анного метода во многом зависят от активности и специфичности люмине-дирующих иммуноглобулинов, которые, в свою очередь, определяются зчеством биологического сырья.

Выделение парусных агентов из материалов от больных также имеет звестные сложности - это подбор чувствительной клеточной культуры, и идовая ограниченность некоторых вирусов и время получения результатов. Перечисленные обстоятельства вызвали поиск новых путей, позволяющих овыситъ уровень чувствительносш клеточных культур к вирусам герпеса, [меется опыт применения био-и химеопрепарагов повышающих чувстви-

тельность клеточных культур к вирусам (Л.С. Сандахчнев 1989, Р.Я. Подчерняева 1993, О. НоГшапп 1994). Но в опюшеннн гсрпссвирусов таких работнамнв доступнойлнтсратуре обнаружено не было.

Поиск подходов к совершенствованию методов лабораторной диагностики является оправданным и актуальным, что отражено в планах НИР ЕНИИВИ и Отраслевых программах.

Цель и задачи. Целью настоящей работы являлась совершенствование технологического процесса получения люминесцирующих иммуноглобулинов для выявлений вируса простого герпеса и цитомегаловируса в пораженных клетках человека, а также расширение спектра клеточных культур для выделения герпесвирусов и использование их в диагностической практике. В связи с этим, задачи диссертационной работы определялись следующим образом:

•изучение возможность использования бно- и химиопрепаратов для повышения чувствительно сти клеточных культур к ВПГ-1 и 2 типа, ЦМВ;

•разработка оптимальных условий получения флюоресцирующих им муноглобулинов к вирусу простого герпеса;

•разработка метода получения иммунных асцитических жидкостей крыс к цитомегаловирусу и приготовления из них флюоресцирующих иммуноглобулинов;

•оценка диагностической ценность полу ченных коныогатов в эксперименте и на материалах от больных.

Научная новизна работы. Впервые разработаны комплексные методы повышения чувствительности клеточных культур к вирусу простого герпеса 1, 2 шпов и цитомегаловирусу за счет применения био- и химиопрепаратов, что позволило расширить спектр чувствительных к герпесвирусам клеточных линий и штаммов. Показана возможность использования клеточных куш.тур животного происхождения для выделения цитомегаловируса из материалов от больных. Для выделения вирусов из материалов от больных предложено использовать оригинальные диплоидные культуры клеток из тканей и органов эмбриона кролика КЭК (кишечник эмбриона кролика), ПЭК (почки эмбриона кролика), ЛЭК (легкое эмбриона кролика).

Впервые в качестве неспецнфнческого иммуностимулятора в схемах иммунизации кроликов был использован фитопрепарат "Эраконд", что позволило получить высокоактивные сыворотки для производства диагно-стт1ческихлюм1шесцирующнхтшуиоглобушшов к ВПГ.

Впервые разработаны условия получения иммунных асцитических жидкостей крыс для приготовления люминесцирующих препаратов для диаг-

стики ЦМВ, -значительно снижающие эффект неспецифической фшоорес-

1Щ1Ш.

фактическая ценность работы. По результатам проведенных исследований юрмлено информационное письмо "Использование клеточных культур для русологических исследований ВПГи ЦМВ".

Апробация и внедрение полученных шоминесцнрутощих препаратов уществлены на базе Областного кожно-венерологического диспансера и тонального герпетического центра при проведении лечебно-профилакти-скихмероприятийи диспансеризации герпетических больных.

Основные положсшш, выносимые на защиту

Клеточные культуры животного происхождения КЭК (кшпечшпс эмбри-ia кролика), ПЭК (почки эмбриона кролика) и ЛЭК (легкое эмбриона олика) могут быть использованы в лабораторной практике для выделения 1Г 1 и 2 типа и ЦМВ из материалов от больных. Повышение чувствитель-1сти клеточных культур за счет использования оригинальных методик (зволяет сократить временной интервал для получения результатов русовыделения до 48-96 часов.

Для приготовления люминесцирукшщх иммуноглобулинов к ВПГ отра-ааны схемы иммунизации с применением неспецифического иммуноспшу-тора эраконд, что позволяет получать высокоактивные и специфичный шунные сыворотки кроликов при одновременном снижении антигенной 1грузки на животных.

Использование лабораторных белых крыс в качестве продуцентов им-,ноглобулинов к цитомегаловирусу человека дает возможность получить 1сокоспецифичные люминесцнрующие препараты, применение которых ютоверно снижает эффект неспецифической флюоресценшш и позволяет ювесш дифференциальную диагностику по этиологическому агенту.

1робация. Диссертация апробирована на заседашш Ученого Совета гШИВИв 1998г.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Ученого эвета и научных конференциях ЕНИИВИ в 1995 1996 1997 1998 гг., на шференции молодых ученых УГМА в 1996, 1997 годах, на конференции ак, СПИД и сопутствующие 1шфекщш"С-Петербургв 1997 году.

f

ублнкащш. Основное содержание исследования отражено и 24 печатай«.

IOOT®.

фуктура и объем диссертации. Диссертащюнная работа изложена на 110 рашщах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, главы Материалы и методы", трех глав собственных исследований, обсуждения, шодов, указателя литературы. Работа иллюстрирована 7 рисунками и 27

таблицами. Библиографический указатель литературы содержит Ш® источников отечественных и зарубежных авторов.

Содержание работы

Материалы н методы исследования.

В работе использовали эталонные штаммы вирусов простого герпеса ВПГ-1 типа (штамм JIJ и 2 типа (штамм ВН), цитомегаловирус человека (штамм АД|69), полученные из Государственной коллекции вирусов на базе Института вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН.

Клеточные культуры.

В ходе выполнения исследований были использованы клеточные культуры, различные по своему видовому и тканевому происхождению: ФЭЧ, диплоидные клеточные штаммы легкого эмбриона человека - ЛЭЧ-81, штаммы клеток почечной ткани эмбриона человека - ПЭЧ, легкого эмбриона кролика - ЛЭК, почечной ткани эмбриона кролика - ПЭК, сердечной мышцы эмбриона кролика - СЭК, штаммы полуперевнваемых клеток эмбриона овцы ПЭО-83, почечной тканиноворожденного кролика - ПНК-86. В опытах использовали также стабильные линии перевиваемых клеток: Vero - клетки почечной ткани африканской зеленой мартышки, RD - клетки рабдосаркомы таза, RH -клетки почки эмбриона человека, Таурус-1 - штамм гетероплондныхклеток почки теленка.

Бно-н химионренараты, использованные для обработки клеточных культур в процессе вирусовыдслешш.

Коллаза - ферментативный препарат, разработанный НПО "Вектор" в качестве заменителя трипсина.

Инсулин - гормон поджелудочной железы свиньи применяли в качестве частичного заменителя натнвной сыворотки крупного рогатого скота. Фитопрепарат "Эраконд" (экстракт растительный конденсированный) получен из люцерны по оригинальной технологии . Применялся как ростстимулирующая добавка к среде р оста.

Днметнлсульфокснд (ДМСО) - химическое вещество класса полярных растворителей.

Животные.

Для получения диагностических шоминесцирующих препаратов в качестве продуцентов иммунного сырья было использовано 64 беспородных белых

(ысы и 76 кроликов породы "шиншилла".

Крыс иммунизировали цитомегаловирусной суспензией. Для наведения цита использовали клетки асцитической перевиваемой опухоли яичника 1ысы (штамм ОЯ), полученной в 1972 году в Институте экспериментальной и инической онкологии АМН СССР.

Кроликов иммунизировали введением герпесвирусной суспензии. После :ончания цикла иммунизации животных обескровливали методом взятия ювииз сердца.

Титр антител к ВПГ в сыворотке крови кроликов и к ЦМВ в ИАЖ крыс гределяли в реакции нейтрализации на клеточной культуре ЛЭЧ-81 по »щепринятойметодике.

Выделение иммуноглобулиновых фракций из сыворотки кровикроликов и АЖ крыс проводили методом осаждения сернокислым аммонием с после-тощим освобождением иммуноглобулинов от сернокислого аммония на льфилырационных колонках с сефадексом G-50. Контроль чистоты шуноглобулиновой фракции проводили методом электрофореза в аровом геле по Kochejn.

Полученную иммуноглобулиновую фракцию конъюгировали с флюро-[еинизотиоционатом по методу Кунса. Несвязавшийся краситель удаляли ль-фильтрацией на сефадексе G-25. Контроль на полноту очистки от несвя-вшегося красителя проводили методом восходящей хроматографии на ware.

Впериодс 1995-1998 гг. было обследовано 1500 пациентов в возрасте от 1,5 :дель до 60 лет с подозрением на герпесвирусную инфекцию. Сбор »териалов от больных осуществляли сотрудники Областного герпетическо-| центраподруководством к.м.н., врача-дерматолога Некрасовой T.C. Авторское участие заключалось в проведении вирусологических и сероло [ческихисследований.

Вирусологические исследования включали в себя выделение вирусных ентов на клеточныхкультурахиз материалов от больных. Выявление вирусных агентов проводилось методом иммунофлюоресцен-ш с применением люминесцирующих диагностикумов полученных по соб-венным методикам.

При анализе результатов исследования использовались статистические :тоды: критерий Сгьюдента, критерий вероятности, воспроизводимость меда по Парсу. Расчеты производились на персональном компьютере IBM PC микрокалькуляторе "Электроника" БЗ-64.

Результаты исследований и их обсуждение.

На первом этапе исследования был определен спектр клеточных культур из 1нка-музея ЕНИИВИ наиболее чувствительных к лабораторным штаммам ИГ-1 типа (штамм Л,); ВПГ-2 типа (штамм ВН) и ЦМВ (штамм АДш). Следует отметить, что для ВПГ-1 типа этот спектр достаточно широк и

включает в себя как первнчно-трипинизированные, так и диплоидные и перевиваемые клеточные линии из органов и тканей человека и животных. Наиболее чувствительными, то есть клетками, в которых репродуктивный цикл вируса составлял 24-36 часов и сопровождался полным разрушением монослоя, явились ПЭЧ (почки эмбриона человека) время наступления полной деградации монослоя 24 часа; ПЭК (почкиэмбриона кролика) 20-24часа; ФЛЭЧ (фибробласгы легкого эмбриона человека) 24-36 часов; Vero (почки зеленой мартышки) 24-36 часов.

Для ВПГ-2 типа чувствительными оказались в основном первично-трипсинизированные клетки почек, легких и фибробластов эмбрионов человека. Время наступления полной деградации монослоя в этих культурах составляла 24-36 часов. Но кроме этого ВПГ-2 типа размножался ив диплонд-ныхклеточных линиях, таких как ПЭК, КЭК, СЭК (почки, кишечник и сердце эмбриона кролика), цитопатические изменения, в которых наступали через 36-48 часов, что позволило использовать эти более стабильные линии в дальнейшей работе. Цитомегаловирус человека, имеющий видовую специфичность, обладал самым узким спектром чувствительных клеточных культур в который входили в основном клеточные линии из органов и тканей человека (ФЭЧ, ЛЭЧ, ФЛЭЧ, RD) время появления ЦПЭ 24-48 часов. Но в то же время удалось адаптировать лабораторный штамм АД,„, и к диплоидным клеточным культурам животного происхождения (ПЭК, ЛЭК, КЭК, ПЭО-83 и Таурус-1) время появления ЦПЭ 48-96 часов.

Таким образом, проведенные исследования позволили выявить насколько диплоидных линии клеток из органов кролика .которые могут быть использованы для выделения как ВПГ- 1 и 2 типов, так и для ЦМВ из материалов от больных. То есть устраняется необходимость использование двух-трех клеточных культур для вирусовьщеления, потому что, как правило, при первичном выделении ВПГ применяются ФЭК (фибробласгы эмбриона курицы), ЛЭЧ, ФЭЧ или Vero, а для ЦМВ только линии клеток человеческого происхождения.

Существенным недостатком метода выделения вирусов в клеточных культурах является длительность получения результатов. Результаты этих исследований могут быть получены в среднем через 48-96 часов. Поэтому следующим этапом работы явилось изучение влияния био- и химиопрепара-тов на чувствительность клеточных культур к вирусам герпеса в условиях эксперимента.

Вещества, относящиеся к биопрепаратам, были отобраны на основании предыдущих экспериментов, которые показали, что коллаза, эраконд и инсулин нетоксичны и не влияют на цитоморфолошческие характеристики клеток. Диметилсульфоксид (ДМСО), который успешно применяется в малых концентрациях (0,025-1,0%) в криобиологии для консервации и хранения клеточных линий так же был нетоксичен и не влиял на цитоморфо-логическую характеристику клеток.

Проведенные исследования показали, что применение коллазы в концен-

ации 0,25%, обладающей свойствами протеолитических ферментов; 0,5%-о раствора ДМСО, увеличивающего прошщаемость клеточной стенки; менителн сыворотки крупного рогатого скота 0,5%1-ый раствор эраконда и гсулин в дозе 0,2 ЕД/мл, которые позволяют снизить содержание сыворотки РС в среде роста в 1,52 раза позволяет значительно сократить время (апташш лабораторных штаммов ВПГ-1, ВПГ-2 и ЦМВ. Изучение шамики выявления вирусов герпеса в обработанных (Vero для ВПГ-1 и ЭК для ВПГ-2 и ЦМВ) вышеуказанными препаратами клеточных 'льтурах позволило установить, что ВПГ-1 и ВПГ-2 шпов вызывали |рактерные изменения в клеточном монослое через 12-18 часов после ражения (вакуолизация цитоплазмы, образование синцитий и снмпластов). Ф-методом вирусные антигены ВПГ-1 и ВПГ-2 в зараженной культуре шаруживались уже через 6 часов в виде отчетливых зернистых флюоресин-тощих включений вядрах клеток. Для цитомегаловируса отчетливое изме-:нне клеток с формированием цитомегалов в виде "совиного глаза" наблю-1Лось через 24 часа после заражения, а антиген ЦМВ обнаруживался ИФ-;годом через 12-18 часов как отчетливое внутриядерное свечение зернистого ш диффузного характера. В необработанных же культурах щггопатические (менения клеток характерные для ВПГ-1 и 2 типов насту пали только через 24 ica и 48 часов для ЦМВ. ИФ-мегодом антигены герпесвирусов в необра> тайных культурах выявлялись через 12-18 часов для ВПГ-1 и 2 типов и через >-24 часа для ЦМВ.

Полученные в ходе экспериментов данные позволили применять эти пре-фаты и в практических исследованиях материалов от больных людей на эедмет выявления инфекционно активных вхфусных агентов группы герпе-I. Было проведено вирусовыделение из 110 материалов от больных с подо-lemieM на герпесв1ф\ сную инфекцию (54матернала на ВПГи 46 на ЦМВ). В 1честве материалов для вирусовыделения использовались: моча, слюна, )овь, соскобы со слизистой уретры, вагины и цервикального канала. В1фу-»выделение проводилось на клеточных культурах ПЭК, КЭК, Vero 1работанных 0,25% коллазой, 0,5%-ым раствором ДМСО, 0,5%-ым 1створом эраконда, и ннсу-лином в дозе 0,2 ЕД/мл. Обработанные культуры 1еток за счет повышенной чувствительности позволили выявить в!фусы рпеса и цитомегалии в более короткие сроки, то есть цнтопатический [)фект наблюдался через 20-36 часов после заражения, а наличие антигенов, го так же является характеристикой активного размножения вирусного ента в клетке, обнаруживалось через 6-18 часов.

Возможность определять наличие агентов герпесвирусов в зараженных .■льтурах уже через 6-18 часов после внесешы материалов является достаточ-з существенной, поскольку указывает на активное размножение вкусного ента в клеточном монослое. В случаях, когда необходимо проведение сстренного антивирусного лечения использование обработанных клеточ-:>ix культур может быть весьма ценно, гак как это дает возможность оцени-ш» качество лекарственной тер агат каждые 6-18 часов и вносить необ.ходи-

мыс коррективы в лечебный процесс.

Таким образом, обработка клеточных культур коллазой, ДМСО, эракон-дом, инсулином позволяет использовать в практике вирусовыделения более стабильные линии дишюидных и перевиваемых клеточных линий животного происхождения, не искажая результатов, и дает возможность провести иссле-дованиев более сжатые сроки.

Как говорилось ранее, одним из методов, позволяющих определить наличие антигена непосредственно в материале от больных, является метод имму-нофшооресценцин (ИФ). Специфичность и чувствительность этого метода определяется качеством биологического сырья. Одним из основных показателей качества биологического сырья считается титр антител к определенному агенту. Задачи этого исследования входила разработка схем иммунизации животных с целью получения максимального титра антител у большинства продуцентов.

Действующий в настоящее время регламент на производство иммуноглобулинов люминесщфующих диагностических к вирусу простого герпеса кроличьих сухих рекомендует две схемы иммунизации, которые позволяют получить иммунные сыворотки крови с титром 1:320 приблизительно у 40% продуцен тов и с титром 1:80 - 1:160 у ¿0-55%, при этом количество сывороток с титром 1:640 и выше не превышает 10-12%. Следует так же отметить, что в течение цикла иммунизации возможна гибель животных-продуцентов вследствие развития герпетической инфекции, отход составляет от 20 до 40% кроликов.

Была изучена возможность применения неспецифического иммуностимулятора растительного происхождения "эраконд" в различных схемах иммунизации. Его влияние на а! ш пело образование у кроликов к вирусу простого герпеса сравнивалась с традиционно применяемым для этих целей адьюван-том Фрейнда. Изучение динамики антигелообразования показало, что титр антител в сыворотке крови в схемах, где предварительно вводился эраконд, заметно отличался от такового в сывороткахкрови, полненных по аналогичным схемам иммунизации, но с применением адьюванта Фрейнда. Эти различия становились особенно заметными на 14 сутки от начала иммунизации, что прослеживалось в течение всего времени до 28 суток.

Наиболее эффективной оказалась схема трехкратной иммунизации с применением эраконда и чередованием двух внутривенных введений антигена и аппликаций на скарифицированную роговицу глаза. Предложенная схема позволяет получить иммунные сыворотки крови кроликов к ВПГ с титром антител 1:160 и выше у 60% продуцентов и с титром не ниже чем 1:320 у 25%. Применение в качестве стимулятора иммуногенеза адьюванта Фрейнда в этой схеме дает возможность получить иммунные сыворотки с титром антител к ВПГ не ниже чем 1:640 только у 35-48% кроликов и с титром 1:320 у 15-20%, при этом подавляющее большинство сывороток имеет титр антител к ВПГ 1:160. Следует еще отметить, что введение адьюванта Фрейнда не устраняет отход животных, которые погибают в ходе иммунизации от развития

грпетического энцефалита, что составляет приблизительно 15-20% от обще-о числа кроликов. При использовании в качестве стимулятора иммуногенеза раконда удается сохранить всех животных-продуцентов до окончания цикла ммунизации, что является существенным преимуществом, так как колнчест-о получаемого качественного биологического сырья увеличивается. Одним з преимуществ применения эраконда в цикле иммунпзацнн можно считать и о, что клинические проявления на введение ВПГ, такие как: развитие керати-ов, стоматитов, повышение температуры у этой группы животных протека-г более сглажено пли незначительно выражено, а это в известной мере блегчает уход и снижает затраты трудового времени. Существенным являет-я и то, что значительно снижается объем вводимого антигена, всего 2,0 мл, то в 12,5 раз меньше чем предложенныйв официальном регламенте на произ-одство люминесцирутощих иммуноглобулинов диагностических к ВПГ роличьих сухих, и весь цикл иммунизации составляет всего 14 дней, в два аза короче, чем по регламенту.

Продуцентами биологического сырья для приготовления люминесцирую-цIX иммуноглобулинов диагностических к ЦМВ человека тоже являются ролики.

При использовашш кроликов в качестве продуцентов имеет место высокая нтипенная нагрузка, то есть объем вирусного материала, вводимого живот-ому за одну инъекцшо, составляет 5,0 мл, количество введений от 5 и более, [итомегаловирус человека не патогенен для кроликов, но такое массирован-ое введение чужеродного белка может вызывать необратимые патологнчес-ие изменения в организме животного по типу аллергических заболеваний и риводит к гибели продуцентов. Иммунизация кроликов по предложешюй в егламент на производство иммуноглобулинов люминесцирующих диагно-шческихк ЦМВ человека вызывает гибель от 15 до 20% животных.

Качественно новое биологическое сырье может быть получено при исполь-звании иммунных асшгшческих жидкостей (ИАЖ). Учитывая видовую спе-ифичностъ ЦМВ и количество антигенной нагрузки в течение всего цикла ммунизации, выбор был остановлен на самках белых беспородных лабо-аторныхкрыс. Эти животные неприхотливы, удобны в содержании и хоро-ю переносят достаточно большие антигенные нагрузки.

Изучение динамики антителообразования у крыс по четырем схемам имму-нзации позволило выбрать две наиболее оптимальные:

Одна из них предусматривала двукратное введение антигена с ннфекцион-он активностью 5,0 ^ ТЦД!0/мл по 0,015 мл на 1 г массы животного, нутрибрюшшшо, с интервалом в 14 дней.

Другая отличалась кратностью введения (3 внугрибрюшинные инъекции нтигена) и интервалом в 7 дней. Титр антител к ЦМВ в ИАЖ крыс, получен-ых по этим схемам иммунизации, был достаточно высок от 1:160 до 1:640.

Эта схемы в дальнейшем применялись в ходе исследований по усилению иммунного ответа под действием стимуляторов иммуногенеза.

Изучалось действие адыованта Фрейнда, который вводили по обычной схеме и фитопрепарата эраконд. Эраконд вводили трехкратно по 0,0025 мл 10% суспензии на 1 г массы животного за сутки до введения антигена. Было изучено 4 схемы иммунизации. Наиболее эффективной оказалась схема трехкратного введения антигена с инфекционной активностью 5,5 lg ТЦД50/мл по 0,015 мл на 1 г массы животного, внутрибрюшннно, с интервалом в 7 дней и предвари-тельным трехкратным внутримышечным введением эраконда. Эта схема позволила получить ИАЖ с титром антител к ЦМВ 1:1280 у 42,5% крыс и с титром не ниже 1:320 у 57,5% продуцентов. Из иммунных асцитическнх жидкостей с высоким титром антител приготовлены люминесцирующие иммуноглобулины в количестве 50 образцов с красящей активностью 1:32 1:128. С помощью люминесцирующих иммуноглобулинов из ИАЖ крыс было исследовано 68 материалов от 30 пациентов с подозрением на цитоме-галовирусную инфекцию. Вирусный антиген был выявлен в 48,7% случаев. При параллельном исследовании материалов от больных с применением люминесцирующих иммуноглобулинов кроличьих сухих процентсовпадешш был высок (97,2% - положительных и 94,9% - отрицательных). Все это указывает на высокую активность и специфичность люминесцирующего конъюгата из ИАЖ крыс и возможность его применения в иммунофшоорес-центной диагностики цитомегаловнрусной инфекции. Возможность применения и диагностическая ценность модифицированных методов диагностики былаизученана 1500 больных.

Роль герпесвирусов при поражении кожи учитывается мало, в основном это традиционные проявлеши: поражения кожи носогубного треугольника, области верхних и нижних век, реже ушныхраковин и волосистой часта головы. Кожные же поражения, располагающиеся на межреберном пространстве, по ходу седалищного нерва, как правило, приписывается вирусу опоясывающего лишая. Поэтому результаты лечения без учета этнологического фактора носят характер временного успеха.

Исследования материалов от 364 пациентов, страдающих различными пор ажашями кожи, показало, что у 152 больных наличествовал аншген ВПГ (см. табл. 1). При этом антиген ВПГ у 85 человек был выявлен при поражениях кожи, клинический диагноз которых предполагает наличие ВПГ как этиологического агента эрозии, изъязвления кожи, высыпания везикулярного характера на кожи лица. Кроме этого удалось показать самостоятельную роль герпесвируса при поражениях кожи, которые считаются классическими бактериальными, например фурункулез. Антиген ВПГ был выявлен у 14,7% пациентов из этой группы обследованных. Значителен процент выявления антигена ВПГ и при аллергических дерматитах, особенно у взрослых (до 65,5% случаев). Это указывает на то, что роль герпесвируса при смешанных вирус - бактериальных инфекциях требует более пристального внимания и изучения. При этом важное место должна занимать лабораторная диапюсти-

по выявлению антигенов герпесвирусов.

Многочисленными работами, как отечественными, так и зарубежными следователями доказана роль герпесвирусных инфекций в патологии плода новорожденных детей. С целью выявления наличия антигена ВПГ была ¡следована группа из 79 женщин на разных сроках беременности (см. табл. . Эта же группа обследовалась и на наличие антигена ЦМВ, так как казана возможность активации родственных герпесвирусов на фоне рпетическон инфекции. То есть существует вероятность смешанной вирус-грусной инфекции.

В обследованной группе беременных смешанная ВПГ-ЦМВ-инфекцня [блюдалась у 5,2% женнцш. Процент выявления этой смешанной вирус -[русной инфекции составляет приблизительно 10% и в другой группе лшшн, которые страдают расстройствами функции деторождения, олученные результаты позволяют рекомендовать обследование пациенток I наличие антигена как ВПГ, так и ЦМВ, что будет способствовать более 1чественному проведению лечебныхмероприятнй.

Осуществление лабораторного контроля за проводимым антивирусным чением у 743 пациентов с диагнозом герпесвирусная инфекция показало, о применение ИФ-метода позволяет не только провести первичное тавление антигенов ВПГ и ЦМВ в клиническом материале, но может быта ¡пользован в качестве экспресс-теста для оценки качества проводимого ¡чения. Проведете вирусовыделения имеет значение не только для тактики :чения, но может также носить прогностический характер относительно ¡жести заболевания.

Результатом выполненной работы явилось разработка НТД на экспери-гнтально-пронзводственный выпуск иммуноглобулинов люмшксцирую-их диагостическихкщггомегаловирусу человека кроличьих сухих.

Составлены методические рекомендации по использованию клеточных /льтур для выделения вирусов из материалов от больных.

Изданы с разрешения ГС-ЭН РФ методические рекомендации "Использова-1е клеточных культур, применяемых в практике вирусологических :следований при герпетической инфекции". Свердловск, 1995; "Применение оминесцирующих иммуноглобулинов к вирусам герпсса в клинической тактике" Свердловск, 1995.

Усовершенствованные методы лабораторной диагностики герпесвнрус-лх инфекции внедрены в работу клинических лабораторий и центров ральского решонаинекоторых других территорий России.

Основные результаты выполненной работы представлены в выводах.

Таблица 1

Уровень выявления антигена ВПГ методом ИФ у больных с различными поражениями кожи и слизистых оболочек

Клинический диагноз обследованных пациентов Общее кол-во больных Дети (до 16 лет) Взрослые (от 16 и старше)

кол-во обследованных выявление антигена кол-во обследованных выявление антигена

абс. число %% абс. число %%

Эрозии, изъязвления 109 31 10 32,2 78 34 43,5

Высыпания неясной этиологии 85 27 5 18,5 58 36 62,0

Нейродермит 41 24 9 37,5 17 4 23,5

Аллергический дерматит 47 18 7 38,0 29 19 65,5

Фурункулез 34 15 3 20,0 19 2 10,5

Афтозный стоматит 42 24 18 75,0 18 8 44,0

Гнойный стоматит 47 33 16 48,4 14 2 14,2

Итого: 405 172 68 39,53 233 105 45,06

Таблица 2

Выявление антигенов ВПГ и ЦМВ ИФ-методом в мазках-отпечатках пациенток

Группа обследуемых кол-во обследованных Выявление антигена (%%)

ВПГ ЦМВ ВПГ+ЦМВ

ОАА 257 27,6 8,17 10,1

Беременные 79 24,9 15,0 5,2

Итого: 336 52,5 23,3 15,3

выводы

Проведенные исследования позволили дать комплексную оценку методов бораторной диагностики герпесвирусных инфекций и наметить пути ее вершенствования за счет расширения спектра клеточных культур, исполь-;мых для вирусовыделения, и применения разработанных высокоактивных шинесциругощих диагностик-умов.

Впервые показано, что метод получения диагностических препаратов для шинесцентной микроскопии герпесвирусов из иммунных сывороток кро-ков-продуцентов с применением неспецифического растительного [муностимулятора эраконд позволяет получить высокоспецифнчное олошческое сырье для производства люминесцирулощихдиагностикумов.

Впервые показана возможность получения и использования крысиных \Ж для приготовления шоминесцирующих диагностикумов к цитомегало-русу человека, что значительно расширяет круг животных-продуцентов, еличиваег объемы получаемого биологического сырья и повышает чество диагностического препарата.

Применение био - и химиопрепаратов (эраконда, инсулина, коллазы и VICO) повышающих чувствительность клеточных культур к вирусам эпеса, позволило расширить спектр используемых клеточных линии живот-го происхождения для культивирования цнтомегаловируса человека и ачительно ускорить процесс адаптации к ним как лабораторных штаммов 1Ги ЦМВ, такиштаммов, выделяемых от больных.

Использование модифицированных методов лабораторной диагностики эпесвирусных инфекшш позволило сократить время выделения вирусных гнтов из материалов от больных на 24-48 часов и выявлять вирусные анти-яы методом иммуиофлюоресценции, значительно снизив процент ложно-рицательных и ложноположительных результатов.

Внедрение разработанных методов диагностики герпесвирусных инфекций работу Герпетического центра позволите уточнить диагноз у 364 следованных, показав роль вируса простого герпеса в заболеваниях кожи в ,7% случаев.

Показана необходимость проведения дифференциальной диагностики по [явлешпо вирусов группы герпеса для женщин на разных сроках беремен-сти и осуществления контроля за качеством проводимого антивирусного ченияу пациентов с диагнозом герпесвирусная инфекция.

Считаю своим приятным долгом выразить огромную благодарность моему научному руководителю - директору Екатеринбургского института вирусных инфекций, доктору медицинских наук, профессору Н.П. Гшшских за постоянное внимание, всесторошпою помощь и полученные знания.

Выражаю признательность старшему научному сотруднику, кандидату медицинских наук В.К. Слободешок за оказанную помощь в написании диссертации.

Выражаю огромную благодарность заведующему кафедрой эпидемиологии Уральской Медицинской Академии, доктору медицинских наук, профессору В.А. Слободенюку за предоставленную возможность заниматься научной работой, постоянную поддержку и помощь в организации проведения научных исследований неспецифических иммуномодуляторов.

Выражаю признательность младшему научному сотруднику лаборатории клеточных культур H.A. Шмелевой, младшему научному сотруднику лаборатории гриппа и ОРВИ Ю.В. Григорьевой за оказанную мне помощь в выполнешш работы, постоянное внимание и поддержку.

Глубокую признательность выражаю ученому секретарю НИИ вирусологии РАМН доктору медицинских наук Н.П. Косяковой и В.П. Лапшиной за вниманиеипомощьвоформлешшработы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. "Клеточные культуры в диагностике вирусных инфекций, вызываемых вирусами группы герпеса" //Метод, рекомендации - Свердловск 1995 г. (соавт. Г.Г. Колесникова, В.К. Савушкнна, В.П. Устьянцев, A.A. Бахарсв, H.A. Шмелева.)

2. "Применение люминесцирутощих иммуноглобулинов к вирусам герпеса в клинической практике" //Метод, рекомендации - Свердловск 1995 г. (соавт. В.К. Савушкина, O.A. Нефедова, С.П. Астапенков.)

3. "Экспресс - диагностика цитомегаловирусной и герпетической инфекций методом иммунофлюоресценции." //Сборник научных трудов "Актуальные проблемы современной вирусолопш". - Екатеринбург 1995 г. - стр. 24-29. (соавт. В.К. Савушкина, O.A. Нефедова, С.П. Астапенков.)

4. "Действие диметилсульфоксида на чувствительность культур клеток к вирусам группы герпеса" //Сборник научных трудов "Актуальные проблемы современной вирусологии". - Екатеринбург 1995 г. - стр. 53-57. (соавт. С.П. Астапенков A.A. Бахарев.)

научных трудов «Клинико-эпидемиологические аспекты вирусных инфекций». -Екатеринбург 1999 г. - стр.11-15 (соавт. Т.С.Некрасова, Н.Н.Дашевская, Н.П.Глинских).

16. «Диагностика герпесвирусных заболеваний у женщин с нарушениями функций деторождения и беременнных» // Сборник научных трудов «Клинико-эпидемиологические аспекты вирусных инфекций». - Екатеринбург 1999 г. -стр. 138-141 (соавт. Ю.В.Григорьева, Н.Ю.Пономаренко).

17. «Применение фитопрепарата эраконд при экспериментальной герпетической инфекции» // Сборник научных трудов «Клинико-эпидемиологические аспекты вирусных инфекций». — Екатеринбург 1999 г. - стр.146-149 (соавт, Ю.В.Григорьева).

18. «Влияние фитопрепарата эраконд на репродукцию вирусов простого герпеса и II типов в клеточной культуре» // Сборник научных трудов «Клиник эпидемиологические аспекты вирусных инфекций». - Екатеринбург 1999 стр.149-152 (соавт. Ю.В.Григорьева).

19. «Применение фитопрепарата эраконд для кратковременного культивирг клеток макрофагально-лимфоцитарной системы мыши» // Сборник научш дов «Клинико-эпидемиологические аспекты вирусных инфекций». - Екате 1999 г. - стр.152-155 (соавт. Ю.В.Григорьева).

20. «Получение высокоактивных иммуноглобулинов для индикации в' стого герпеса» II Сборник научных трудов «Клиника-эпидемиологичес вирусных инфекций». - Екатеринбург 1999 г. - стр.157-161 (соавт. Н А.В.Слободенюк, Ю.В.Григорьева).

21. «Применение иммуномодулирующих препаратов при герпесвир циях» // Метод, рекомендации в сборнике «Клинико-эпидемиологи> вирусных инфекций». - Екатеринбург 1999 г. - стр.183-198 (соавт. Т.С.Некюасова. Н.Н.Алексашгоова. Н.Н.Дашевская. П.Б.Нехамкин.

13. "Повышение чувствительности клеточных культур для вирусологической диагностики вирусов группы герпеса" // Материалы V международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы". - С-Петербург 19-23 мая 1997 г. том II-стр. 129 (соавт. Н.Л. Оленева, Т.С. Некрасова).

14. "Примените реальдерона в терапии тяжелых форм генитального герпеса" // Материалы V международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы". - С-Петербург 19-23 мая 1997 г. том II - стр. 140 (соавт. Т.С. Некрасова, Л.Н. Александрова).

Подписано в печать 25.01.2000 г. Формат 60X84 1/16. Бумага "Гознак". Отпечатано на ризографе. Объём 1.0 печ. л. Тираж 70 экз.

Свердловский областной центр .медицинской профилактики. 620075, г. Екатеринбург, ул. Карла Либкнехта, 8, тел. (3432) 51 28 68

"Вопросы диагностики внутриутробных вирусных инфекций и их влияние патологию плода" //Сборник научных трудов "Актуальные проблемы временной вирусологии". - Екатеринбург 1995 г. - стр. 124-128. (соавт. И.А. альчиков, Н.П. Глинских. A.B. Слободенкж, О.Ю. Гоголева.)

"Изучение токсичности некоторых химнопрепаратов в эксперименте на еточных культурах" //Материалы международной научной конференции бщая эпизоотология: иммунологические, экологические и методологичес-е проблемы". - Харьков 1995 г. - стр. 465-466. (соавт. В.К. Савушкина, С.П. ¡тапенков.)

"Значение оценки инфекционной активности вирусов при герпетических Золеваниях" // Тез. науч. практических работ "Актуальные вопросы [штарно-эпидемиологического благополучия населения г. Екатеринбурга современном этапе." - Екатеринбург 1997 г. - стр. 133 (соавт. Н.П. зшских, H.H. Александрова Т.С. Некрасова).

"Использованиеклеточныхкультур в диагностике герпетическихннфекцнй ¡ольныхс отягченным акушерским анамнезом" II Тез. научно- практических бот "Актуальные вопросы санитарно-эпидемиологического благополучия селения г. Екатеринбурга на современном этапе." - Екатеринбург 1997 г. -р. 134 (соавт. Т.С. Некрасова A.A. Бахарев).

"Повышение чувствительности клеточных культур, используемых в [агностике герпетических инфекций" II Материалы VII съезда российского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. -осква 28-31 января 1997 г., том I. - стр. 93 (соавт. Г.Г. Колесникова, В.К. шушкина).

. "Совершенствование лабораторной диагностики герпесвирусных инфек-й". // Вестник УГМА - Екатеринбург 1997 г. выпуск 4 - стр. 78-79 (соавт. А. Бахарев, Ю.В. Григорьева).

. "Поиск перспективных фитопрепаратов для неспецифической защиты при русных инфекциях". И Вестник УГМА - Екатеринбург 1997 г. выпуск 4 - стр. -87 (соавт. Ю.В. Григорьева, A.B. Слободенкж).

. "Актуально«!, оценки инфекционной активности и патогенностн при рпетических заболеваниях". II Тез. Российской научно-практической нференщш дерматовенерологов "Иммунопатология и иммунореабили-ция в дерматовенерологии" Екатеринбург 1997 г., том I - стр. 77-78 (соавт. П. Глинских, H.JI. Оленева, H.H. Александрова).