Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Совершенствование методов изучения микоплазмозов растений

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование методов изучения микоплазмозов растений"

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИИ

На правах рукописи

САКАЛИЕВА ДИМИТРИИКА

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ИЗУЧЕНИЯ МИКОПЛАЗМОЗОВ РАСТЕНИЙ

(Диагностика, оценка на устойчивость)

Специальность: 06.01.11 — Защита растений от вредителей и болезней

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1992

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте защиты растений и Ленинградском Государственном Аграрном Университете и период прохождения аспирантской подготовки.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Ю. И. Власов; доктор биологических наук, профессор А. Я. Лескова.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Н. Н. Гусева; кандидат биологических наук В. В. Фарбер.

Ведущее учреждение: Ростовский Государственный Университет.

Защита состоится 45 февраля 1992 года в 10 часов на заседании

Специализированного совета, шифр Д.020.01.11 при Всесоюзном научно-исследовательском институте защиты растений по адресу: 189620, г. Санкт-Петербург—Пушкин, шоссе Подбельского, д. 3, ВИЗР.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЗР.

Автореферат разослан 43 января 1992 г.

Учений секретарь Специализированного совета ВИЗР

Г. А. Наседкина

,,-j ВВЕДЕНИЕ

* i

-»'гуяльность тс-Mli. Микоплазмн - это г/ельча^кте прокариоты, ли-"*шшПше' клеточной стенки, что ябллстся их основным отличительным свойством; клетки микоплазм ограничены липгь плазматической мембраной, этим и определяется пластичность микоплазм, непостоянство и многообразие очертаний клеток, их неустойчивость - быстрый лизис при осмотическом шоке, действии детергентов, этанола и других факторов. Многие вопросы, касающиеся изучения микоплазм и вызываемых шли болезней, разработаны еще недостаточно из-за серьезных методических трудностей, возникающих при работе с этой группой патогенов.

Так, для доказательства этиологии микоплазмоподобных болезней еще далеко не в полной мере применяются новые, современные методы диагностики этих микроорганизмов. Вместе с тем нельзя игнорировать и простые приемы, которые могут дать предварительную ориентировку относительно природы болезни.

Не разработаны в методическом плане вопросы оценки сельскохозяйственных" культур на устойчивость к микоплазменным болезням. Между тем это направление представляется исключительно перспективным.

В связи с изложенным тему исследований мн рассматриваем как безусловно актуальную.

Цель и задачи исследования. Целью нашего исследования являлось:

1. Усовершенствование методов диагностики микоплазменной инфекции.

2. Разработка методики оценки растений на устойчивость к микоплаз-мозам.

Для достижения этой цели планировалось решить следующие конкретные задачи:

- усовершенствовать методы экспресс-диагностики микоплазм в тканях растений;

- разработать методику очистки микоплазм из тканей растения барвинка /cathoranthua roseus /L./ G.Don. ' /;

-.получить диагностикум к Acholeplasna ар. - возбудителю кругло-лис-тности картофеля /КЖ/;

- разработать методику оценки томатов на полевую устойчивость к столбуру;

- выявить сортообразцы томатов, устойчивые в полевых условиях к столбуру.'

Научная новизна. Впервые получен диагностикум к Acholeplasna

вр . Предложена методика приготовления антигена из растений бар-

ВИНКа - Cbtharantliua ro^euo /L./ G.Don.

Разработана и предложена методика оценки томатов на полевую устойчивость к столбуру,

Практическая ценность работ». Предложены дополнительные методы экспресс-диагностики микоплазма-инфекции. Выявлены сортообразцы TQ' матов с высокой полевой устойчивостью к столбуру.

Апробация -работы и публикации. Основные положения работы доложены на методической комиссии ВИЗР по фитопатологии и на кафедре фитопатологии ЛГАУ и отражены в 2-х публикациях.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав, выводов, рекомендаций и приложения. Работа иллюстрирована ло таб' лицами, 5 схемами и 47 рисунками, Список литературы содержит . 236 работ, из них 467 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Показана актуальность проблемы и ее научная новизна: Обоснованы цель и задачи исследований.

Глава 1. Обзор литературы Дан обзор литературных данных советских.и зарубежных авторов по следуицим разделам: 1. Общие сведения о микоплазмах. 2. Локализация в растениях. 3. Систематика микоплазм. 4. Методы диагностики микоплазм.

Глава 2. Материал и методы исследований . Объектом исследования служили ¡возбудители микоплазмозов томатов, картофеля, цитрусовых и цветочных культур.

Основные исследования.проведены с возбудителями стцлбура томатов и круглолистности картофеля. Для получения очищенного.антигена были использованы растения барвинка / Catharanthua roseua /L./ G.Don. /.

Эспериментальные исследования по теме диссертационной работы проводили в лаборатории вирусных, микоплазменннх и нематодных бо-■ лезней ВИЗР в 1989-1991 гг. При исследованиях, связанных с получением диагностикума к Acholepl&ama ар. - возбудителю круглолистности картофеля, нам была оказана помочь и содействие предприятием меристемных культур в г.Сочи /руководитель предприятия - кандидат биологических наук А.Е.Рыбалко/. Изучение типов поражения томатов столбуром и оценка на устойчивость к столбуру проведена на коллэк-

нш Крымской опытно-селекционной станции ВИР /КОСО ВИР/, которая находится в западной части предгорной зоны Краснодарского края.

Образцы цитрусовых, пораженных различными заболевания!®, были любезно предоставлены нам НПО по чага и субтропическим культурам' /Озургети-Анасеули/. Образцы цветочных культур получили из Ботанического сада АН Молдовы.

Электрснномикроскопические исследования проводились в межинститутской лаборатории электронной микроскопии БНИИСХМ и ВИЗР и в лаборатории электронной микроскопии Главного Ботанического Сада АН СНГ , Москва.

В своих исследованиях мы пользовались как общепринятыми методиками, так и заново разрабатывали некоторые методические вопросы.

Наши оригинальные методические подходы подробно освещены в экспериментальной части'диссертации.

ЭКСПЕШШТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. Цитологический метод экспресс-диагностики микоплазма-инфёкции

Использованный цитологический метод основан на специфическом окрашивании в синий цвет клеток флоэмы у растений, инфицированных микоплазмой. Дот этих целей применяют краситель, предложенный Dieses /1948/, и световой микроскоп.

В СНГ цитологический метод экспресс-диагностики был уже испытан на отдельных объектах /столбур томатов и ведьмина метла люцерны/ с положительным результатом /Расулова, 1991; Файзиева, 1991/, однако, мы решили исследовать более широкий круг объектов.

Вэзультаты наших исследований представлены в таблице 1.

Следует иметь в виду, что при определенных концентрациях красителя могут быть окрашенными как больные, так и здоровые ткани флбэин. Поэтому для получения объективных результатов нами отработаны параметры применения метода, которых надо придерживаться, исходя из помещенных в таблице данных. Полученные материалы расширяют . зпектр применения.метода дла выявления миноплазменного поражения растений.• " '

Таблица I.

Результаты применения цитологического метода экспресс-диагностики . микоплазма-пнфекции

Вид растения Анализируемый орган Концент-. рация красителя /%/ Зкспо--зиция /мин./ Симптомы проявления болезни Возбудитель Синее окрашивание флоэмы

I 2 3 . 4 - 5 6 7

стебель . 0,1 ■ 5 карликовость ШЮ +

) стебель " ' 0,1 5 здрровый контроль . - ' -

черешок . 0,05' . 10- позеленение цветков,- Ш10 +'

. измельчение листьев

черешок: • . 0,05 10 здоровый контроль' -

цветоножка " 0,05 10 "хлороз,измельчение . ШЮ ' +

листьев-

•черешок 0,05.' . 10 позеленение цветков' ШЮ +

цветоножка- '0,05 10 здоровый контроль

черешок ■ 0,05 10 здоровый контроль - . - .

цветоножка- 0,1 10. ' здоровый контроль - - -

цветойожка . 0,2 5 здоровый контроль

черешок \ ■ , 0,1 5 • измельчение листьев МП0 .+

черешок 0,1 . 5 здоровый контроль

черешок 0,1 5 псорозис ' . вирус-

Люцерна -.

(Medieago sativa Ь,

Барвинок- ■ ( Catharairthu» ■ roseua /Ь«/ G.Don.)

Георгины. (Dahlia Сачг.)

■Мандарин

(Citrus reticulata)

I 2 3 4

Апельсин черешок и,2 5

(Citrus slaeaala) черешок и,1 5

■ плодоножка 0,1 10

черешок 0,05 10

оредняя жидка" 0,1 5

листа

черешок 0,05 20

- ■ • черешок 0,1 10

черешок 0,2 5

черешок 0,1 5

0,2 5

Барвинок '' черешок .0,1 5

(Catharanthu»• черешок 0,1 5

roseu» /Ъ./ G.Don) черешок U,05 10

Картофель . . черешок 0,05 10

(Solanum черешок 0,05 ' 10

tuberosum L.)

Табак черешок 0,1 Ю

. (Hicotiana черешок 0,2 10

glauca) черешок U,05 . 30

5

6

отасоорн ЛДи +

стабоорн мпи +

стаоборн uno +

стабборн uno- +

стабборн uno +

псорозис вирус -

псорозио вирус -

псорозис вирус -

здоровый контроль - -

здоровый контроль — —

иаоборн ЫПО +

здоровый контроль - -

здоровый контроль — —

ведышна иетла ano +

здоровый контроль - -

Крымский изолят сголбура т +

мпи +

• ano +

I 2 3 4 5 6 7

черешок 0,1 10 здоровый контроль -

черешок . 0,2 10 здоровый контроль -

• черешок ■ 0,05 10/ здоровый контроль - -

Тонаты • • черешок 0,2 5 крутлолисгность картофеля дшо' +

Ьусорегв1соп /КЛК/

• евси1еп-Ьша 11111. черешок 0,1 10 здоровый контроль

0,2 . 5 здоровый контроль

Глава 4. Методика оценки сортообразцов томатов на полевую устойчивость к столбуру

4.1. Степень изученности Еолроса

. В теоретическом плане вопрос об устойчивости томатов к мико-плазме, вызнващей столбур, по существу не разработан. Известно /в отношении грибов, вирусов/, что устойчивость к патогену может быть расоспецифической и нерасоспецифической. Первый тип устойчивости /по Вандерпланку, 1983/ - вертикальная устойчивость и второй тип - горизонтальная устойчивость. Наряду с термином "горизонтальная устойчивость" фитопатологи применяют как близкие понятия - "полевая устойчивость" и "относительная устойчивость". Отметим, что горизонтальная /нерасоспецифическая/ устойчивость к патогену прак-тическивсегда имеет место, тогда как расоспецифическая /вертикальная/ устойчивость утрачивается с появлением новых рас возбудителя.

В фитомикоплазмологии почти не разработаны критерии понятий "раса" или "штамм" у микоплазм, хотя внутривидовая дифференциация у этих патогенов, безусловно, имеется /например, у Spiropiaama citri выявлен ряд серотипов/. В связи с таким положением у исследователя нет возможности целенаправленно проводить оценку томатов на расоспецифическую /вертикальну к/ устойчивость к столбуру. Поэтому та оценка, которая проводится в полевых условиях на естественном инфекционном фоне, будет в любом случае характеризовать горизонтальную устойчивость томатов к столбуру. Хотя, скорее всего, в природе имеет место сочетание двух вышеназванных типов устойчивости.

Томаты могут быть также толерантными к столбуру. Термин "толерантность" определяется по-разному, но обычно имеется в виду, что это - достаточно высокая продуктивность растения в условиях системного инфицирования патогеном. Предлагаемая методика может быть использована и при оценке томатов на показатель толерантности к стол-буру, если эта оценка будет сопровождаться данными по урожайности.

Основное же назначение методики,- суммарная оценка устойчивости томатов к столбуру в полевых условиях.

4.2. О диагностике столбура

В данном разделе подробно .проанализированы особенности диагностики столбура.'

Визуальные анализы и учеты в поле могут при необходимости подкрепляться более точными лабораторными исследованиями.

К числу лабораторных анализов относится прежде всего электронная микроскопия и прижизненное изучение патогена, выделенного на искусственную питательную среду.

В нашей работе на электронных микрофотографиях /при просмотре ультратонких срезов из тканей растений, пораженных столбуром/ зафиксированы типичные для шкоплазмоподобных организмов /МПО/ структуры, характерные для класса Uollicutea . В отдельных случаях мы обнаружили смешанную инфекцию ВТО и микоплазмы столбура, что отражает ситуацию, часто складывающуюся в природе.

Для микробиологического изучения патогена нами применялась методика выделения микоплазмы столбура на искусственные питательные среды, а дифференциация МПО осуществлялась с помощью светового микроскопа.

В методическом плане просмотр препаратов в темном поле.универ-' сального биологического микроскопа МБИ-6 позволяет четко отдифференцировать спиралевидные структуры /род Splropiasma / от кокко-. образных микоплазменных структур, которые обычно характерны для рода Acholeplaama. •

В нашем материале спиралевидные структуры отсутствовали. ■

При диагностике столбура можно также применять индикаторный метод, используя передачу микоплазмы на высокочувствительные сорта томатов, табака, а также на общепринятый в фитомикоплазмологии индикатор - барвинок / Catharanthuo roseue /ь./ G.Don. /. Применяя метод прививки, нами изучена реакция,растений-индикаторов на стол-бур» В диссертации представлены данные по реакции /характерные симптомы проявления МПО/ томатов и барвинка на различные изоляты мико- . плазмы столбура, которые имелись в коллекции ВИЗР.

В условиях Краснодарского края, являющегося одним из регионов, • благоприятных для развития столбура, мы описали разные типы внешнего проявления этой болезни.

Несмотря на определенные сортовые отличия,, в основном наблюдалось 2 типа проявления, столбура: 1 тип - большой бутон и П тиц -.измельчение листьев.

' При 1 типе поражения наблюдается краевой хлороз молодых листьев. и краевой антоциан более старых листьев, удлинение черешков, разрастание чашелистиков, слияние их с образованием большого "бутона". ■ Пестик сильно удлинен, шестидольный, плоды .или не образуются вовсе, или сильно деформированы. Зачастую происходит растрескивание плодов

й выход семян наружу.

II тип симптомов характеризуется прежде всего сильным измельчением и хлорозом листьев, редукцией долек листа. Стебель и черешки листьев утолщаются, становятся ребристыми. Элементы цветков превращаются в листочки. Больные кусты тлеют готический габитус, они обычно не полегают и поэтому легко заметны среди здоровых растений.

4.3. Создание инфекционного фона

При создании инфекционного фона следует учитывать биологию возбудителя и прежде всего резервацию инфекции в сорняках и передачу микоплазмы с сорных растений на томаты посредством переносчика.

Участок для посадки томатов выбирается с учетом наличия вокруг него множества растений-резерваторов столбура, прежде всего - вьюнка полевого. Это создает вероятность' высокого инфицирования на них цикадок и последующего распространения патогена на томатах.

Одним из важных условий для создания инфекционного фона явля- ■ ется использование высоковосприимчиЕых сортов. Он считается достаточно высоким и выдержанным, если стандарт поражается не ниже 50 %.

В качестве восприимчивого стандарта необходимо использовать длительно вегетиругацие средне-поздние или поздние сорта.

4.4. Учет пораженности растений столбуром

Для определения поражения растений томатов столбуром чаще всего могут быть использованы визуальный, серологический анализы; а также анализ с помощью препаратов, окрашенных красителем шепев при просмотре.в световой микроскоп.

Визуальный анализ наиболее приемлем'для массовых обследований растений и основан на внешнем осмотре томатов и определении болезни по специфическим симптомам /см. шкалу/.

Шкалы поражения и устойчивости томатов, характеризующие число больных растений в процентах, и шкала степени устойчивости томатов к столбуру приводятся по данным методических указаний, разработанных с нашим участием /Власов, Самсонова, Беседина, Макарова, Сака-лиева, Медведская, 1990/. ' ,.

Шкала поражения /%/ 1 - очень слабое /до 10,0/ 3 - слабое /10,1 - 35,0/

5 - среднее , /35,1 - 60,0/ 7 - сильное /60,1 - 85,0/

9 - очень сильное /свыше 85,0/

Шкала устойчивости /%/ . очень слабая /поражение 85 % и выше/ /60,1 - 85,0/ /35,1 - 60,0/ /10,1 - 35,0/ /до 10,0/

Шкала степени устойчивости томатов к столбуру

1 -

3 - слабая 5 - средняя 7 - высокая 9 - очень высокая

Степень устойчивости

Степень поражения" различных органов растений

стебель

цветки

плоды

листья

1-очень Укорочение Чашелистики в 3-4 Отсутствуют Хлороз,силь-

слабая междоузлий, 'раза длиннее нор-. . ная редукция

карлико- мы,узкие,иногда . листьев не-

вость, расширенные к се- скольких яру-

обильное • редине,свободные ' сов

образование или сросшиеся; • пазушных позелзнение ле- " побегов пестков,венчика;

редукция тычинок; прорастание завязи в вегетативный побег

2-слабая Укорочение Чашелистики гипер-Отсутствуют междоузлий, трофируются;вен- или,если об-отставание чик редуцируется разуются,то в росте или зеленеет, мелкие,имеют

цветки могут быть белые бугрис-стерильными . тые участки ткани,белую полосчатость

3-средняя Незначитель-Частично гипертро-Мелкие,имеют ное отстава-ффованы.в отдель-бугристость

. ние в росте ных случаях сте- и полосча- • рильны тость

5-средняя Нормальный Частично деформи- Зугристые рованы

7-Высокая Нормальный .Нормальные Нормальные

Хлороз,редукция листьев, преимущественно верхних

9-очень Нормальный Нормальные высокая

Нормальные

Хлороз,анто-цИан,слабая • редукция листьев

Хлороз,анто-циан

Легкий хлороз верхних листьев

Здоровые

4.5. Итога оценки томатов на устойчивость к столбуру

• Подробные результаты оценки томатов на полевую устойчивость к столбуру в 1990-1991 гг. приведены в приложении диссертации. В этом разделе отмечена группа сортообразцов, показавших высокую устойчивость к заболеванию /7-й и 9-й балл устойчивости/.

Таблица 2.

Сортообразцы томатов с высокой полевой устойчивостью к столбуру

№№ Наименование сортообразца Кат. пп ВИР Происхождение Балл устойчивости

1 Каштан 4620 КОСО 9

2 Ont 814 5212 Канада 9

3 Ранний Узбекистан 4750 Узб. НШ10Б 9

4 Факел 3900 - 7

5 Р2 гибрид МТМ-3 13289 Индия 7

6 Нарвик 13835 Югославия 7

7 Титан КОСО 7

8 Maja 5182 ' ' ФЕТ 9

9 Моряна 13381 ВНИИОБ 7

10 Вр. 13439 • Венесуэла 9

Глава 5. Получение диагностического набора

к возбудителю микоплазменного заболе-вания-круглолистность' картофеля /КДК/. Иммуноферментный анализ /ИФА/. Использование ИФА. для диагностики фитомико-плазмозов.

5.1. Получение микоплазменных антигенов из индикаторного растения барвинка catha-ranthus 'гоаечз /1./ G.Don.

Процесс очистки микопдазмоподобных организмов /МПО/ из сока больного растения сложен, поскольку. МПО концентрируются только . во флоэмной ткани, занимающей незначительную часть от общей массы растения. Выделение МПО поэтому сопряжено .с определенными методическими трудностями." Успешное получение очищенных препаратов

'зависит от правильного выбора подходящих растений-накопителей.

Важно отметить, что при перенесении инфекции на некоторые индикаторные растения, например, барвинок / Catharanthus говеиа /ь./ G.Don./, удавалось освободиться от сопутствующих вирусов картофеля /Власов, Самсонова, 1980/. В нашей работе именно барвинок служил накопителем микоплазмы, возбудителя круглолистности картофеля /КЛК/. .

В процессе получения микоплазменного антигена из растений нами было апробировано несколько методик /lully et al. , 1973$ Sinha, 1974, 1979," 1983, 1987; Aadrea da Hocha et al. , 1986/.

По нашему мнению, наиболее приемлема уетодика T. Ishizaka /1980/.

Очистку антигена проводили |ю следующей схеме:

Листья барвинка, зараженного КЖ /28 г/

0,1 М фосфатный буфер рН 6,8 /84 мд/.

4000 об/мин - 30 мин. .

Насыщенный "раствор сульфата ^ммони^ П\/2 504> рН 7,0

5000 об/мин - 30 мин. ■ Бидистиллированная вода /2,5 мд/ • Дистиллированная вода /3 л/ 5°С - 72-х часов

0,1 М фосфатный буфер /14 мл/

гомогенизация

фильтрование гомогената. центрифугирование фильтрата

высаливание супернатанта

центрифугирование разведение осадка диализ

разведение диализата

5.2. Схема иммунизации кроликов

Для иммунизации использовали кроликов породы Белый великан массой около 2500 г. Антиген вводили внутримышечно по. следующей схеме: первая инъекция в объеме 2 мл антигена и 2 мл полного адъю-ванта врейнда; повторную инъекцию провели через пять дней в том же объеме; еще через пять дней сделали последнюю инъекцию в первоначальном объеме. Через 14 дней после последней инъекции у кроликов брали кровь для определения титра полученной антиснворотки. Титр определили реакцией двойной диффузии в 1 %-ном агаровом геле • /1:64/. .

5.3. Получение диагностического набора

Так как известно, что вццеление иммуноглобулиновой фракции позволяет использовать антисыворотки в низких титрах, ми решили получить эту фракцию. Это позволило использовать опытную антисывррот-ку для проведения твердофазного иммуноферментного анализа.

5.3.1. Выделение иммуноглобулиновой фракции 1б0

Иммуноглобулиновая фракция ¡¿С. получена нами по следующей' схеме:

10 мл антисыворотки + 10 мл насыщенного раствора сульфата аммо-- ния /рН 7,0/ ^

'.. Центрифугирование при 15000 об/мин - 30 мин.

Ресуспендирование осадка в следующем растворе: насыщенный раствор сульфата аммония + забуференный физиологический раствор /3$Р/ в соотношении 1:1 ^

Центрифугирование - 3 раза при 15000 об/мин -'30 мин.

Ресуспендирование осадка в дистиллированной воде

Диализ против ЗФР в течение 9 ч!сов при 4°С \

Концентрацию иммуноглобулина определили спектрофотометрически при длине волн 280 нм. Она оказалась равной 14,8 мг/мл.

5.3.2. Получение пер'оксидазного конъюгата методом периодатноГо окисления /маркирование х^о пероксидазой из хрена/

' Приведем методику получения конъюгата:

1. Диализ 1 мл 1ва против 0,01 М натриево-карбонатного буфера рН 9,4-9,6 при 4°С в течение 9 часов

2. 5.мг пероксидазой из.хрена + 1 мл дистиллированной воды

3. К полученному раствору добавляется по каплям раствор периодата . натрия

4. Диализ против 0,001 М натриево-ацетатного'буфера рН 4,4—4,5 ' при 4°С в течение '9 часов

5. К полученному диализату /4/ добавляется диализат да /1/ и .' 125 мкл раствора.бората натрия

6. Инкубирование смеси' при 4°С в течение 2-х часов

7. Диализ против забуференного физиологического раствора /ЗФР/ в течение ночи

8. К полученному раствору конъюгата добавляется равный объем насыщенного раствора сульфата аммония

9. Центрифугирование при 15000 об/мин - 30 мин.

10."Диализ против ЗФР при 4°С в течение 9 часов.

5.4. Иммуноферментный анализ /ИФА/

' Иммуноферментный анализ /ИФА/ является высокочувствительным тестом, который за рубежом применяется не только в вирусологии, но и в фитомикоплазмологии. В СНГ разработка ИФА для целей фитомико-плазмологии не проводилась. . I

В наших исследованиях использован сэндвич-вариант ИФА. . Количественные результаты иммуноферментного анализа в оптических единицах считывали с помощью вертикального автоматического регистрирующего фотометра ЫН -700 /фирма БШАТЕСН , Швейцария-ФРГ/ при длине волны 490 нм. •

. 5.5. Интерпретация результатов ИФА

Данные ИФА обычно интерпретируют по результатам тестирования отрицательных контролей.

Основываясь на этих данных, вычисляли среднее значение оптической плотности и величину стандартного отклонения по следующей фор-

„. \1

СО - стандартное отклонение,

п - число измерений, •

Х1 -' величина сигнала для данного 'измерения, ш - среднее арифметическое от х1

Порог положительных результатов определяли по следующей формуле:

Р = I + ЗЕ

Р - порог достоверности положительных результатов, Т - среднее значение оптической плотности А^^ в здоровом контроле, Е - стандартное отклонение от среднего значения в здоровом контроле.

Анализ данных показывает, что полученный нами диагностический набор к возбудителю микоплазменного заболевания КЛК, принадлежащему

К классу Мо1Нс1^ез сем. АсЬо1ер1а8ц^аовав » МОЯНО ИСПОЛЬЭО-вать для практических исследований.

С помощью ИФА провели обследование коллекционного материала томатов на КОСС ВИР.

Положительный результат был также получен при обследовании люцерны, зараженной "ведьминой метлой" /Волгоградский изолят/.

По результатам проведенных нами реакций можно судкгь о наличии серологического родства между микоплазмами, возбудителями кругло-листности картофеля, столбура томатоЕ и ведьминой метлы люцерны, т.е. на основании полученных данных нами подтверждена их принадлежность К семейству АсЬо1ср1аоиагасеае.

Результаты применения ИФА для диагностики микоплазменных заболеваний растений обобщены в таблицах 3, 4, 5, 6.

Таблица 3.

Результаты применения ИФА для диагностики круглолист-ности картофеля /КЛК/ на барвинке

' 1бО СО

мкг/мл мкг/мл

Показатели ИФА /в оптических единицах/ Р = X + ЗЕ

т к

490

20 6 0,394 ; 0,285

30 6 0,531 0,280 '

50 14 0,788 ' 0,429

* ^490 ~ средняя величина оптической плотности из 96 проб.

Таблица 4.

.Результаты' применения ИФА для диагностики ведьминой ■ метлы люцерны /Волгоградский изолят/

'

мкг/мл

10 40

СО мкг/мл

10 14

Показатели ИФА /в оптических единицах/*

490

0,13 0,52

Р = X + ЗЕ

0,08 0,16

» субстрат - ортофенилендиамин

Таблица 5.

Результаты применения ИФА для диагностики 'столбура на томатах

мкг/мл

СО мкг/мл

Показатели ИФА /в оптических единицах/

490

Р = X + ЗЕ

10 6 0,544 0,311 •

10 10 • 0,924 ' 0,360

20 6 0,550 0,211

20 10 0,813 | 0,233

30 6 0,568 0,211

30 10 0^8 0,233

50 14 0,641 0,364

• '60 14 0,679 0^428

50 18 . 1,011 0,428

60 18 1,063 0,420

70 14 0,683 0,428

70 18 1,039 0,428

Таблица 6.

Оптимальные соотношения ингредиентов реакции ИФА

№№ Вид растения СО пп_;___мкг/мл_ мкг/мл

1' Барвинок 30 6

2- Томаты 50 14

3 Люцерна 40 14

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В фитомикоплазмолопш остаются недостаточно или слабо разработанными многие вопросы методического характера. К их числу относятся: 1/ методы диагностики патогенов; 2/ методы оценки сельскохозяйственных культур на устойчивость к микоплазменннм болезням. Одна из причин пробелов в указанных направлениях заключается в том, что микоплазмы как патогены растений были открыты лишь 25 лет назад. Вторая причина определяется спецификой самих микоплазм как объектов исследований. Это лабильные, нестойкие во внешней

.:среде патогены, что затрудняет их изучение и идентификацию.

Учитывая, что в растительных тканях микоплазмн обычно локализуются ро флоэме, нами широко апробирован метод окрашивания клеток

. флоэмы по Bienes . Ранее были установлены отличия в окрашивании тканей флоэмы больных и здоровых растений на примере столбура томатов /Расулова, 1991/. Пораженные микоплазмой клетки флоэмы окрашивались в синий цвет. Нами показаны возможности использования этого метода на разных культурах, пораженных микоплазмами, определены параметры его применения.

В итоге выполнения диссертационной темы получены оригинальные -данные о возможностях получения диагностикума к микоплазме-возбу-дителю круглолистности картофеля /сем. Acholeplasmataceae /. Особенность нашего подхода заключалась в том, что исходным материалом для получения антигена служила не чистая культура микоплазм, а сок больных растений.

Отдельный вопрос, имеющий большое принципиальное значение, ко-' торый исследовался нами - разработка методики оценки томатов на 'полевую устойчивость к столбуру. Для' создания такой методики необходимо было пройти несколько этапов. Один из них заключался в опп-

• сании типов внешнего проявления столбура, что требовалось учитн-

. вать при визуальных полевых учетах и наблюдениях. Далее осуществля-.лась разработка принципов создания инфекционного фона, исходя из особенностей биологии возбудителя и цикадки-переносчика микоплазмн. И, наконец, потребовалось создание нескольких шкал для оценки ус-

• тойчивости томатов к столбуру. ,

. Непосредственная оценка сортообразцов томатов на полевую ус-

■ тойчивость.к столбуру проведена на Крымской опытно-селекционной станции ВИР в Краснодарском крае, и в итоге выявлены образцы, высокоустойчивые к заболеванию /7-й и 9-й баллы устойчивости по 9-ти балльной шкале/. -

■ . Во Всесоюзном институте защиты растений аналогичная методика разработана для оценки люцерны на полевую устойчивость к микоплаз-

■ менному .заболеванию - ведьмина метла. В итоге при нашем участии созданы'научно-методические подходы, которые надо учитывать при аналогичных исследованиях с другими микоплазменными болезнями.

ВЫВОДЫ •

1. Расширены границы применения экспресс-метода диагностики мико-

плазменной инфекции путем окрашивания тканей флоэмы по .Dienea. Метод показал положительные результаты при исследовании различных культур, пораженных микоплазмами /люцерна, картофель, барвинок, георгины, цитрусовые/. Определены параметры его применения на каждой культуре.

2. Разработана методика очистки МПО для получения антигена из сока больных растений. С использованием очищенного антигена получен диагностикум к микоплазме-возбудителга круглолистности картофеля /сем. Xcholeplaemataceae /. Осуществлена постановка ИФА для диагностики и установления серологического родства между возбудителями фитомикоплазмозов.

3. Определены типы поражения томатов столбуром, которые необходимо учитывать при оценке коллекционного материала на устойчивость к заболеванию.. '

4. Обоснованы методы создания инфекционного фона для оценки томатов на полевую устойчивость к столбуру.'

При создании инфекционного фона следует предусмотреть: а/ наличие вокруг участка растений-резерваторов столбура; ' б/ создание искусственных условий для повышенной миграции ци-

кадок с сорных растений на томаты; в/ использование в качестве стандарта высоковосприимчивых сортов.

5. Разработаны шкалн устойчивости томатов к столбуру.

6. Выделены сорта томатов, высокоустойчивые к столбуру - Капитан, Ont 814, Вр. 13439, Ранний Узбекистан, Факел, Нарвик, Титан,

Maja » Моряна, Fg гибрид МТМ-3.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Экспресс-метод диагностики микоплазма-инфекции путем окрашивания тканей флоэмы по Dieneà необходимо применять в научно-исследовательских и опытных учреждениях как дополнительный метод при установлении природы болезни.

2. Методика оценки томатов на полевую устойчивость' к столбуру рекомендуется к применению в селекционных учреждениях.

3. Сорта томатов с высокой устойчивостью к столбуру целесообраз-. но использовать в зонах эпифитотий этого заболевания /Северный Кавказ и -др./.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Власов Ю.И., Самсонова Л.П., Ееседина В.А., Макарова 0.0., Са~ калиева Д.Н., Медведская И.Г. Методические указания по оценке .томатов на устойчивость к столбуру. Ленинград, 1990.

2. Власов Ю.И., Самсонова Л.Н., Богоутдинов Д.З., Сак'алиева Д.Н., Ееседина В.А. и др. Методические указания по комплексному изучению микоплазмозов растений /на примере столбура томатов/. Л., 1991. . ' '