Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Совершенствование метода культуры пыльников для получения регенерантов риса с использованием крезацина

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование метода культуры пыльников для получения регенерантов риса с использованием крезацина"

Р Г Б О А

') о (\'л г.гп всероссийский - 1 нЯучно-исследовлтельскии институт риса

На правах рукописи

КОНДОРИ МАМАНИ ХЕСУАЛЬДО

УДК 631.527.8:633.18

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА КУЛЬТУРЫ ПЫЛЬНИКОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕГЕНЕРАНТОВ РИСА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КРЕЗАЦННА

Специальность 00.01.05 — селекция и семеноводство

автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

всероссийский научно-исследовательский институт риса

На правах рукописи

КОНДОРИ МАМАНИ ХЕСУАЛЬДО

УДК 631.527.8:633.18

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА КУЛЬТУРЫ ПЫЛЬНИКОВ Щ ПОЛУЧЕНИЯ РЕГЕНЕРАНТОВ РНСА О ИСПСЛШШЕМ КРЕЗАЦИНА

Специальность 06.01.05 — селекция и семеноводство

автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Диссертационная работа выполнена во Всероссийское научно-исследовательском институте риса.

Научный руководитель — академик АЛЕШИН Н. Е

Официальные оппоненты — доктор биологических на ук ВОРОБЬЕВ Н. В., кандидат сельскохозяйственны) наук, доцент БАРЧУКОВА А. Я.

Ведущее предприятие — Краснодарский сельскохо зяйственный биотехнологический центр.

Защита диссертации состоится «. ¿У» фШ^

1995 г. в —{Л_ час. на заседании диссертационногс

совета К 020.66.01 при Всероссийском научно-исследова тельском институте риса.

Адрес: 353204, г. Краснодар, п/о Белозерное, ВНИ!' риса.

С диссертацией можно ознакомиться в научной биб лиотеке ВНИИ риса.

Автореферат разослан «_»__ 1995 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат -г, ^ </ ,

биологических наук С 0> СОРОЧИНСКАЯ Е. М

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Биотехнология в области сельского хозяйства предоставляет возможность заниматься во-фосами культуры тканей. Актуальность и научная новизна работы с пыльниками представляют особый интерес 1,ля зерновых культур, использование пыльников как туть для получения гаплоидных организмов активно н впрямую решают генотип и наследственность будущего растения. Совершенствование этого метода важно боль-не всего потому, что дает возможность сократить селекционный цикл: гаплоидность — гомознготность — гетеро-!ИГотность таким образом для создания новых сортов с эпределенными к определенным условиям требованиям (С01АК 93—94).

В связи с важностью проводимой работы, отметим, ■1ТО методами традиционной селекции, обогащенными отбытиями в области генетики и физиологии растений, юздано немало выдающихся по урожайности и другим качествам сортов и гибридов интенсивного типа. Значе-1ие современной, особенно начала 60-х годов селекции 5 борьбе с голодом, новые высокоурожайные культуры тшеницы и риса стали основным источником пищи во многих странах третьего мира. Биотехнология на нынеш-1ем этапе своего развития существенно облегчила и ускорила селекционный процесс, дала селекционерам возмож-юсть из большого числа вариантов выбрать генотипы с оптимальным сочетанием нужных признаков (Чернин П. С., 1990). Первые гаплоиды, спонтанно возникающие з популяциях, были выделены в 1932 г. в Японии, первые ¡еленые растения из пыльников риса получены в 1963 г., сейчас таким образом выведено около 100 сортов. Гап-юидию широко применяют в селекции риса, ее рассматривают как новую форму аналитической селекции (Не--рука В. И., 1989, Коновалова 10. Б., 1990). Культуры <леток растений используются не только для генетических

манипуляций с растениями, но и в качестве источников ферментов и продуктов вторичного метаболизма, а также как модельные системы для изучения дифференциальной экспрессии генов. У определенных видов растений, в частности, у многих злаков, микроспора представляет собой единственную легко доступную индивидуальную то-типотентную клетку. Эта гаплоидная клетка дает уникальные преимущества при изучении деления и дифференци-ровки клеток (Deaton W. R., Collins G< В., 1982).

Основным ограничением метода культуры пыльникоз in vitro является пониженная регенерационная способность каллусных тканей генеративного происхождения и особенно высокая доля альбиносов. Широкому использованию данного метода препятствует также отсутствие надежных биохимических маркеров для оценки морфогене-тического потенциала культуры пыльников риса и идентификации дигаплондных линий, несущих селекционно-ценные изменения (Кучеренко Л. А., 1991, Красникова О. В., 1994).

Так как во всех растениях содержатся необходимые для их роста и развития фитогормоны, такие как гибберелли-ны, ауксины и цитокинины, то влияние различных биостимуляторов роста на питательную среду для культур in vitro еще на сегодняшний день остается как бы открытым важным вопросом. Из множества существующих биостимуляторов, созданных искусственно, крезацнн успешно проходил государственные испытания в 1986 г. и рекомендован Госкомиссией СССР для применения в сельском хозяйстве (ИркИОХ- СО АН СССР, 1986). С целью изучения влияния гормонального состава индукционно!"] среды на каллусогснез и регенерацию проростков, разные исследования проводились, применяя кинетин; 2,4-Д. ИУК, НУК в дозах от минимальных до максимальных. Некоторые результаты свидетельствуют о том, что у всех генотипов индукция и репродукция успешно произошли (Биотехпологическая Академия, 11 —12, 1993).

В России, являющейся самой северной зоной рисосеяния, основным направлением считается создание раннеспелых, высокопродуктивных сортов, устойчивых к засолению, к пониженным температурам в период прорастание — всходы. Широкий спектр изменчивости, наблюдаемой в культуре тканей, открывает большие возможности в создании сортов с желаемыми признаками. Таким об-

разом, всеобщее значение в селекции растении приобретают различные методы биотехнологии. Проблема изолированной культуры тканей всегда привлекала внимание исследователей с момента се возникновения, в начале нашего века, когда Г. Габерландт впервые предложил культуру растительных клеток в качестве метода для доказательства их тотипотеиции, т. е. наличие у них полного потенциала развития будущего организма, каким обладает оплодотворенная яйцеклетка (Коренев Г. В. и др., 1990).

Цель и задачи исследований. Целью наших исследований является совершенствование метода культуры пыльников для получения регеперантов риса с использованием крезацина.

В задачи исследовании выполняемой работы входило:

1. Изучение объектов исследований и понимание био-технологнческих процессов в селекции.

2. Проведение лабораторных экспериментов.

3. Изучить влияние крезацина на каллусогенез и регенерацию.

4. Выявление влияния питательной среды на физноло-го-морфологнческое состояние тканей риса.

5. Разработать и дать необходимые рекомендации для практического применения.

Научная новизна — это то, что впервые изучалось, отбор различных районированных сортов и влияние биостимулятора крезацина на тотипотентность их пыльников в различных условиях.

Согласно патентным работам индукционные питательные среды были оптимальными для каждого генотипа, одновременно также в водной культуре семян с целью выяснения реакции растений на биостимулятор.

Практическая значимость работы заключается в продолжении работы по культуре пыльников и исследований, проведенных в течение нескольких лет для получения гомозиготных линий, которые передаются в коллекцию ВНИИ риса, учитывая применение нового биостимулятора крезацина.

Апробация работы. Результаты исследований и зпачи мость работы докладывались и экспонировались на краевых и международных конференциях молодых ученых (г. Краснодар), организованных Комитетом по высшему

образованию и министерствами сельского хозяйства и и гидрометеорологии (1994—1995).

Публикации. По теме исследований и специальности опубликованы 2 печатные работы. По другим темам 3 печатные работы.

Структура и объем диссертации. Настоящая работа состоит из введения, трех глав, выводов и списка использованной литературы из, 126 источников, из них 61 зарубежный автор.

Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста, содержит 24 таблицы и 13 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы проведения исследований

Исследования проводились в лабораториях по биотехнологии Краснодарского сельскохозяйственного Биотехнологического Центра с 1993 по 1995 год. Рис, как объект наших исследований, широко распространен на Северном Кавказе; сорта, которые мы изучали, находятся в распоряжении ВНИИ риса. Они служат донорами различных по генотипу эксплантов, в зависимости от происхождения и биологических особенностей: Краснодарский 424 (а. с. № 843), Жемчужный (а. с. Л° 3900), Старт (а. с. № 2789), Спальчик (а. с. № 2788), Кулон (а. с. № 4361), мутант Алексеенко, мутант Шиловского, 450 В, К-41-146-1 Gilanica, Jtalpatna. Эти растения являются частью рабочей коллекциии ВНИИ риса и их жизнеспособность держится в специальных камерах искусственного климата или в условиях in vivo.

Так как цель наших исследований — выявление влияния крезацина, то согласно патенту SU 1678256 Al формула, которая была использована нами для приготовления питательных сред, описывается в таблице 1 (Харчен-ко Н. П., Алешин Н. Е., Авакян Э. Р., Алешин Е. П., Воронков М. Г.).

Основой культивирования пыльников была методика, описанная Бутенко Р. Г., 1964, Харченко П. Н., 1986 и Кучеренко Л. А., 1991. Растения-доноры были выращены в камерах искусственного климата, в теплицах и на веге-

тационной лизиметровой площадке. Для взятия эксплан-тов из материала стадию развития оптимальных растений определяли по морфологическим признакам. Отобранные метелки риса подвергают воздействию пониженной температуры 4° С не более 10 дней, затем перед культивированием материал стерилизуют 0,01% раствором сулемы — 15 минут.

Основное условие для работы с пыльниками во время посадки в сосуды — соблюдение чистоты и стерилизация рабочего места вместе с инструментами. Пробирки с культивированными пыльниками на твердой среде Блей-ца, содержащей крезацин, помещают в термостат при температуре 25—26° до появления каллусов.

После образования каллусов, хотя процент их выживания не всегда приближается к оптимальному, переносят или субкультивируют на твердую среду Мурасиге и Скуга, содержащей крезацин. На этот раз пробирки помещают в камеры искусственного климата до появления регенерантов.

Таблица 1

Компоненты Количество компонентов, мае. %

минимальное оптимальное максимальное

Ca(N03)2-4H20 0,7659 0,8499 0,9741

KN03 2,1047 2,4594 3,0287

MrS0.,-7H20 0,0829 0,0857 0,1001

NH1NO3 2,1434 2,4493 2,6594

КН0РО4 0,7226 0,7348 0,8324

KCl 0,1490 0,1592 0,1698

ZnS0<-7H20 0,0036 0,0039 0,0049

H3BO3 0,0028 0,0039 0,0047

MnS04-4H20 0,0001 0,0108 0,0120

KI 0,0013 0,0019 0,0022

Na2 ЭДТА 0,0920 0,0936 0,1110

FeS04-7H20 0,0651 0,0681 0,0707

Тиамин 0,00005 0,0002 0,0006

Пиридоксин 0,0003 0,0002 0,0005

Никотиновая кислота 0,0010 0,0012 0,0018

Глицин 0,0039 0,0049 0,0057

Сахароза 72,9353 73,4797 74,1995

Агар-агар 18,4938 19,5928 20,2431

Деднфференциаторы: 0,0006

крезацин 0,0002 0,0004

2,4-Д 0,00005 0,0001 0,0002

дистиллированная вода остальное 7

Одновременно, согласно авторскому свидетельству № 152002, 1983 (Авакян Э. Р., Алешин Н. Е., Алешин Е. П.) на водной среде были посажены семена риса. Целью эксперимента являлось повышение механической прочности тканей риса с присутствием и без присутствия крезацина. Предварительно в питательные растворы вводят кремнийсодержащее вещество — метаксиликат натрия, концентрацией 0,19—0,32 мм, семена растений риса, близких между собой по интенсивности, раскладывают на марлевых сеточках, закрепленных на фарфоровые стаканы, заполненные питательным раствором. Затем стаканы помещают в термостат на 72 часа и поддерживают температуру 36° С. Затем стаканы выставляют на свет и вы-" ращивают растения риса при 25° С.

Для выявления состояния растений и их реакции на экзогенные факторы в ходе лабораторных работ были определены следующие физиолого-биохимические показатели проростков и регенерантов.

Содержание белка в листьях и корнях по методу Лоу-ри. Метод основан на образовании окрашенных продуктов ароматических аминокислот с реактивом фолина в сочетании с бнуретовой реакцией на пептидные связи.

Содержание хлорофиллов и каротиноидов в экстрактах зеленых листьев по методу Шлыка. Метод основан на извлечении пигментов из ткани с последующим определением спектрофотометрическим анализом. Особенности спектров поглощения хлорофиллов а и в и каротиноидоз — это то, что позволяет определить их количество в экстракте без предварительного разделения.

Содержание крахмала по йодной пробе определяют по величине окрашенной части проростка в синий цвет, после залива их 1% спиртовым раствором йода.

Угол подъема проростка определяют путем прикалывания проростков к картону, покрытому фильтровальной бумагой, затем у основания стебля заливают водой, через сутки измеряют угол по тангенсу.

Определение абсолютно сухого вещества, всхожести, энергии прорастания и биометрические измерения осуществляют по общепринятым методикам для исследований. Статистическую обработку данных экспериментов за каждый год проводили по Б. А. Доспехову.

Совершенствование метода культуры пыльников

Как известно, метод получения гаплоидных растений через культуру пыльников, является актуальным вопросом, общая схема этого процесса изображена на рис. 1. Выбор оптимальных растений-доноров позволяет иметь хорошие пригодные эксплапты (пыльники) для их культивирования in vitro с последующим получением каллусов и регенерангов. Полученные зеленые регенеранты

/

Регеперапт Л

Диплоидное растение — исходным материал для селекции рисл.

Ka.i.'ivc

Исходное растенне

Рис. № 1. Схема нслучсчшя исходного материала для селекшш риса через культуру пылышкоп.

являются перспективным материалом для селекционной работы.

Использование крезацина, как способ совершенствования культуры пыльников, говорит о биостимулируюшем действии этого препарата на индукцию пыльцевых зерен. Крезацин по механизму действия имитирует природные ауксины, обладая, однако, гораздо более высокой активностью (описание изобретения к патенту, 1991).

Влияние крезацина на каллусогенез

Согласно описанию изобретения к патенту: питательная среда для культивирования пыльников риса (П. Н. Харченко, Н. Е. Алешин, Э. Р. Авакян, Е. П. Алешин и М. Г. Воронков, 1991) и учитывая рекомендации (Huang et. al., 1986; Rout Sarma, 1991) были приготовлены 6сред, различающихся по составу и концентрации компонентов, в том числе крезацина. Подсчет каллусогенеза и регенерации в % сделан в расчете на 100 высаженных пыльников. Результаты по влиянию индукционной питательной среды, содержащей крезацин на каллусогенез, как видно в таблице 2, дали следующее:

Таблица 2

Влияние крезацина на каллусогенез из пыльников изучаемых сортов риса, %

с Содержание крезацина в среде, мг/л

с £ Сорт 0 1 2

1. Краснодарский 424 10,0 14,7 13,3

2. Старт 3,3 5,1 5,4

3. Кулон 15,0 — 18,5

4. Мутант Алексеспко 12,6 17,7 19,3

5. К-41-146-1 Gilanica 9,5 8,5 ■ 10,5

В заранее предлагаемой среде без крезацина наблюдался довольно общий не пониженный каллусогенез. Сорта Кулон — 15,0%, мутант Алексеенко — 12,6% и т. д. вероятно, помимо крезацина, в поддержании условий для индукции клеток сыграли роль витамины и другие органические вещества (глицин, 2,4-Д). В среде, где присутствие крезацина было в количестве 1 мг/л, наблюдалось

отсутствие каллусогенеза для сорта Кулон, но для сортов Краснодарский 424 и мутант Алексеенко особенно заметно повышение этого показателя—14,1% и 17,7% соответственно.

В следующей среде, содержащей крезацин 2 мг/л, наблюдалось восстановление каллусогенеза для всех сортов. Каллусогенез, как считают некоторые авторы (О. В. Красникова, 1994), как начальная фаза индукции пыльцевых регенераптов, играет решающую роль, поэтому обеспечение питательной среды оптимальными компонентами способствует получению ожидаемых высоких результатов.

Таблица 3

Влияние крезацина на каллусогенез из пыльников изучаемых сортов риса, %

с Содержание крезацина в среде, мг/'т

с Сорт

% 4 6 8

1. Краснодарский 424 11,4 6,4 —

2. Старт 6,0 5,7 4,7

3. Кулон 20,0 13,8 10,0

4. Мутант Алексеенко 21,1 20,0 18,5

5. К-41-146-1 СПатса 10,6 1,9 11,2 Ff 7> Го/

В таблице 3 продолжается анализ полученных данных в среде, содержащей крезацин 4 мг/л. Образование каллусов у низкорослых и карликовых сортов, как мутант Алексеенко, достигло 21,1%. Затем идет Кулон — 20,0% и Краснодарский 424 —■ 11,4%. По рекомендации из патента эта среда самая оптимальная, о чем свидетельствуют результаты по сравнению с данными, полученными в предыдущей таблице.

Взаимное влияние компонентов, витаминов и крезацина оказывает положительное действие на каллусогенез. По литературным данным предполагаем, что возможно комбинация с глицином от общей массы — 0,0049% п дихлорфеноксиуксусной кислоты — 0,00001% крезацин стимулировал индукцию, препятствуя при этом инфекции, т. к. пыльники, которые были культивированы в среде с крезацином 4 мг/л, дали наибольший каллусогенез. Как следует из экспериментальных данных, использование оптимального варианта питательной смеси обеспечивает

увеличение каллусогенеза относительно известного способа на 67,5% (описание изобретения, 1991). Последнее очень важно, так как количество пыльников отдельны:; гибридов и других форм, получаемых в единичных экземплярах, достаточно. Кроме того, повышение частоты каллусогенеза позволяет уменьшить объем приготовления среды, количества повторностей, лабораторной техники и рабочего времени.

Привлекает внимание исследование (Кучеренко Л. А., 1991) о том, что светлые каллусы самые пригодные для регенерации проростков, также исследования (Тарусов, 1968, Тур и др., 1983) об интенсивности проявления фер мента алкогольдегидрогенеза А. Д. Г. в каллусных образованиях, что могло бы способствовать регенерации в зависимости от генотипа и ткани.

Влияние крезацина на регенерационную способность каллусных тканей

Использованию метода пыльников мешает преимущественная регенерация альбиносных растений (Кучеренко, Харченко, СЬаПе!, 1980). Имея в виду такие особенности, данные в следующей таблице 4, показывают результаты и процентах в расчете на 100 высаженных пыльников: Сорт мутант Алексеенко достиг в предлагаемой среде 6,5% регенерации, в среде с содержанием крезацина 1 мг/л и 2 мг/л — 8,8 и 9,6% соответственно. Наблюдается самый высокий показатель регенерации у сорта Кулон в среде с крезацином 2 мг/л — 10,0%.

Т а б л и и а 4

Влияние крезацина на регенерацию каллусов изучаемых сортов риса, %

Л. п. Сорт Содержание крезацина в среде, мг/л

0 1 2

I. Краснодарский 424 1,0 — 3,5

2. Старт — 2.3 2,5

3. Кулон 3,6 — 10,0

4 Мутант Алексеснко 6,5 8,8 9,6

5. К-41-146-1 ОИатса — 4.6 4,3

12

Видно, что сорт Краснодарский 424 не имеет регене-рантоп в среде с крезацнном 1 мг/л, сорт Кулон в той же среде, сорт Старт в первой предлагаемой среде и сорт К-41-146-1 (лПагпса также в первой. Возникает вероятность предположить, что под действием крезашша в питательной среде мутант Ллексеенко систематически регенерирует, так как в каждой среде появились растения. Ноли для культивирования пылышкоп использовали среду Блейца, то для переноса каллусов была использована среда Мурасиге и Скуга и содержание ее более специально и оптимально п дополнительных органических веществах и стимуляторах роста, как со — НУК и 2,4-Д, совместное действие с крезацнном сказывается на поддержании физиологической тотипотентности каллусов.

Если анализировать данные таблицы 5, где содержание крезацина по-разному влияло на разные среды в зависимости от генотипа, сорт Краснодарский 424 достиг 3,9% регенерации в среде с крезацнном 4 мг/л и 3,1% в среде с крезацнном 6 мг/л, заметна некоторая систематичность для сорта Старт, который имел 3,0% регенерации в среде с крезацнном ■)( мг/л и 2,8% в среде с крезацнном 6 мг/л и 0,2% в среде с крезацнном 8 мг/л. Возможно предположить в этом случае об ингибировании питательной среды.

Т а б л и ц а 5 Влияние крезацина на регенерацию каллусов

№

Сорт

Содержание крезацина в среде, мг/л

1

1. Краснодарский 42-) 3,9 3,1 —

2. Старт 3.0 2,8 0,2

3. Кулон 12,4 — 2,0

1. Мутант Ллексеенко 10,0 10,0 9,2

5. К-*! 1-116-1 аПаш'са 3,6 — 4,3

Многие авторы относят частоту регенерации растений из пылышкоп к морфологическим особенностям генотипов растении, но возможная взаимосвязь гормонального состава питательной среды с концентрацией ионов и катионов разных элементов (Кио е(. а!., 1978) также дает основание изучить влияние молекулярной структуры крезацина, которая в значительной степени благоприятствует

развитию и дифференциации каллусов (Франк-Каменец-кий В. А., 1981; Voegele Л. С., 1974).

Возникает предположение о том, что возможная повышенная регенерационная способность мутанта Алек-сеенко, как видно в таблице, связана не только с генотипом, но и отношением между концентрацией крезацина и самой питательной средой, в результате которого повышается эффективность этого метода.

В случае сорта К-41-146-1 О, результаты регенераци-онной способности его каллусов показывают нам некоторую аналогичность с сортом Старт. Несмотря на пониженную процентную регенерацию появляется перспективность использования этого сорта. Во время появления регенерантов наблюдаются некроз и инфекция каллусных тканей, одновременно развиваются альбиносные и зеленые растения. На рисунке 2 видны разные стадии развития регенерантов изучаемых сортов.

Влияние крезацина на выход зеленых регенерантов

Повышение выхода хлорофильных пыльцевых регенерантов риса возможно на основе биохимических изменений среды, либо при использовании особых генетических форм. Однако серьезной проблемой при этом являются низкий выход зеленых растений и образование подавляющего количества (90% и более) альбиносов (Харченко П. Н., Шиловский В. Н., 1982). Предпринят ряд попыток решения этой проблемы манипуляциями составом культурных сред. Другим путем решения задач может быть использование особых форм риса с заведомо известными генетически детерминированными изменениями метаболизма.

Т а б л п ц а . 6

Влияние крезацина на выход зеленых проростков изучаемых сортов риса, % от общего числа регенерантов

¿V» п. п. Сорт 1 Содержание крезацина в среде, мг/д

1 1 0 1 2

1. Краснодарский 424 14,3 _ _

2. Старт — — 19,4

3. Кулон 33,3 — —

4. Мутант Алекссснко — 25,0 30,0

5. К-41-146-1 СНашса — 30,0 —

14

Р и с. № 2. Развитие регенератов риса в разных стадиях.

Если анализировать результаты таблицы 6, выход зеленых регенерантов для сорта Краснодарский 424 в известной предлагаемой среде составляет 14,3%, несмотря на то, что не содержался крезацин. Возможно, эго явление регенерации растений в названной среде связано с другими факторами, не имеющими отношения к стимуляторам роста, в частности, к крезацину. Аналогичный случай наблюдается у сорта Кулон. Выход зеленых регецерантоз в среде без крезацина составил 33,3%, сорт Старт имел зеленые регенеранты в среде, содержащей крезацин в количестве 2 мг/л, выход которых составил 19,4%.

У мутанта Алексеенко наблюдается систематический выход регенерантов не только в средах с содержанием крезацина 1 и 2 мг/л, но и по возрастанию процентного выхода, который составил 25,0 и 30,0% соответственно. В случае сорта К-41-146-1 G, в ереде с крезацином 1 мг'л выход хлорофильных регенерантов был 30%. Перспективные сорта имеют более активный синтез пигментов, в частности, хлорофилла. Они обладают более высокими потенциальными возможностями в условиях in vitro, чем традиционные высокорослые, это подтверждается многолетними исследованиями, которые проводились во ВНИИ риса. Следовательно, возникло предположение о том, что доноров интенсивности для селекционной работы ищут среди карликовых и полукарликовых форм риса с низким содержанием эндогенных гиббереллинов (Kobayashi

et. al., 1989).

Таблица 7 Влияние крезацина на выход зеленых проростков изучаемых сортов риса, % от общего числа регенерантов

Содержание крезацииа в среде, мг/л

6

8

1. Краснодарский 424 20,7 — —

2 Старт — 20,0 —

3. Кулон 15,0 — 20,0

4. Мутант Алексеенко 35,0 14,2 —

5. К-41-146-1 СПатса 12,5 — —

Данные таблицы 7 олицетворяют уникальность карликовых сортов, особый случай представляет сорт мутант Алексеенко, у которого в оптимальной среде с крезацином 4 мг/л был высокий процентный выход зеленых регенерантов — 35,0%.

Влияние крезацина равномерно сказывается на все генотипы, способствуя регенерации. Сорт Кулон единственный, который имел зеленые регенеранты а среде с крезацином — 8 мг/л. Оптимальность питательной среды, содержащей крезацин 4 мг/л, подтверждается не только патентом изобретения, но и проводимыми исследованиями. Как видно из таблицы 7, на этой среде произошел выход зеленых регенерантов почти всех изучаемых сортов, за исключением сорта Старт. С другой стороны, сорт Крас-

выход зеленых регенератов

--------мутант Алексеенко

--—--Краснодарский 424

Р н с. № 3. График выхода зеленых регенерантов в %, в зависимости от содержания крезашша в питательной среде.

нодарский 424 и К-41-146-1 ОПатса имели регенеранты только и оптимальной среде, во всех остальных средах регенерантов их не наблюдается.

На основе разработанного во ВНИИ риса метод! отобрана такая форма — мутант Алексеенко, он характеризуется пониженным биосинтезом эндогенных гиббе-реллинов (Авакян Э. Р., и др., 1984). Причем подобные изменения метаболизма генетически детерминированы. Этот мутант отличается повышенной кремниефилыюстыо, уникальным распределением белковых структур в эндосперме, а также повышенным содержанием хлорофилла. Последнее дает основание предположить, что такая форма может отличаться и повышенным выходом пыльцевых зеленых регенерантов. Пример мутанта Алексеенко свидетельствует, что источником форм риса с генетически повышенным выходом зеленых регенерантов являются

короткостебельные формы, синтезирующие пониженное количество гиббереллинов. Для лучшего представления выхода зеленых регенерантов из культуры пыльников в зависимости от крезацина на рисунке 3 графически изображается пример двух сортов — мутант Ллексеенко и Краснодарский 424.

Изучение влияния водной культуры, содержащей крезацин, на выход проростков

Водная культура главным образом используется для выявления механической прочности растений (Авакян Э. Р., 1983), согласно авторскому свидетельству. В ходе проводимых исследований были определены: длина стеблей проростков, длина корней и длина влагалища первого настоящего листа. Были приготовлены 2 среды, одна без крезацина и другая с крезацином в количестве 10 мг/л. Изучалось 9 форм риса,

Как видно из таблицы 8, быстрый рост зерен изучаемых сортов за 14 дней (срок для эксперимента) не был таким, как в среде без крезацина, но рост и развитие влагалища первого листа, от которого зависит будущая урожайная способность растений, был не так сдержан крезацином, что указывает на возможное положительное влияние этого биостимулятора.

По сравнению с первой средой произошло также сокращение длин корней. Для сорта Ла1ра1:па в первой сре-

Таблица 8

Биометрические показатели изучаемых сортов риса, питательная среда с крезацином 10 мг.'л

с с

л

Вариант

О ГР со

га

к о К с;

к » к а „

«=( = и сп

<3 =3

си в; а. X 2

и ^ и Ч Ч

1. Краснодарский 424 33,2 3,7 23,2 51,1

2. Спальчик 29,0 2,8 20,8 38,5

3. Старт 30,0 3,4 20,8 37,3

4 Жемчужный 39,0 2,7 23,8 42,3

5. Кулон 38,6 3,4 23,8 41,3

6. Мутант Шмловского 48,2 3,8 27,6 48,9

7. 450 В 42,8 3,6 29,0 46,2

8. К-41-146-1 СПашса 44,2 3,2 28,0 42,9

9. Л{а1ра1па 30,2 1,5 19,6 36,3

де длина корней была 92 мм, во второй — 1,5 мм. Главное также процентное соотношение средней длины влагалища первого листа сортов во второй среде с крезацином к сортам в первой среде без крезацина, так как рост этого органа не был сокращен сильно. Как видно из таблицы, разница составляет от 36,3% — сорт Ла1ра1;па до 51,1% — сорт Краснодарский 424. В целом биостимулятор креза-цин способствует формированию и развитию органов растений, несущих ответственность за конечный зерновой урожай, что подтверждают исследования, проводимые в ИркИОХ, 1981. Для сравнения было указано, что в полную спелость в соломе мутанта Алексеенко содержится более 20% кремнезема, а в соломе Краснодарского 424 — 6—7% (Авакян Э. Р., Алешин Н. Е., Алексеенко Е. В., Алешин Е. П. , 1984). На рисунке 4 графически изображена' зависимость длин органов проростков от содержания крезацина.

50

чс

зо

70

10

3

п

— длина 1 проростка,

— длина корня,

длина влагалища 1-го листа

Р и с. № 4. График биометрических изменений растении риса в водной среде (крезацин 10 мг/л)

Физнолого-биохимнческие характеристики регенерантов и проростков

Фотосинтез — процесс усвоения растениями световой энергии и использование се для образования органических веществ из диоксида углерода и воды. В ходе процесса в атмосферу выделяется кислород. Фотосинтез осуществляется при участии многих ферментов и кофакторов, условно в нем выделяют две стадии: световую и темную. Рис относится к С3 — группе растений (Алешин Е. П.', Алешин Н. Е„ 1991).

Для осуществления анализов в первую очередь было определено содержание пигментов в листьях зеленых регенерантов сортов Краснодарский 424 и мутант Алексеен-ко, как это видно в таблице 9.

Таблица 9 Содержание пигмеи гоо в листьях зеленых регенерантов (мг/г сырой массы)

iN» п. п.

Биостимулятор

Ca, Св, Ск.

мг/г мг/г мг/г

Са+Св, мг/г

Сорт Краснодарский 424

1. Крезацин, 0 1,87 0,39 0,49 2,25

2. Крезацин, 4 мг/л 1,09 0,48 0,55 2,17

Сорт мутант Алексеенко

1 Крезацин, 1 мг/л 2,23 0,71 1,64 2,95

2. Крезацин, 2 мг/л 1,87 0,40 0,49 2,27

3. Крезацин, 4 мг/л 2.30 0,80 0,50 3,10

4. Крезацин, 6 мг/л 1,95 0,06 1,41 2,61

F^f > Pol

Анализ результатов для сорта Краснодарский 424, который только в 2-х средах имел зеленые регенеранты, показывает, что в среде, содержащей крезацин 4 мг/л, содержание пигментов в однородном порядке несколько выше, чем в известной среде, за исключением хлорофилла а, содержание которого для известной среды без креза-цина было 1,87 мг/г, что сказывалось на суммарном содержании хлорофиллов. В случае мутанта Алексеенко, анализ данных показывает, что содержание пигментов в листьях выше, чем в листьях сорта Краснодарский 424. Как известно, одним из источников генов карликовости является мутант Алексеенко, полученный методом химического мутагенеза из сорта Краснодарский 424 (Алексеенко, 1989).

' Более активный синтез пигментов мутанта Алексеенко по сравнению с районированными сортами дал основание предположить, что такая форма может отличаться н повышенным выходом хлорофилльных пыльцевых реге-нерантов. Это значит— карликовые генотипы могут быть источниками выхода зеленых регенерантов (Зеленский, 1989).

В след. таблице 10 определение пигментов в проростках в водной среде карликовые формы риса обладают повышенной эффективностью фотосинтеза. По всей вероятности мутант Шиловского обладает наиболее активным синтезом пигментов среди всех изученных сортов. Об этом свидетельствуют данные в таблице 10, где питательная среда с крезацином также содержала микроэлементы (0,5 п. с. + микроэлементы по 1озЫ(1а). Нужно отметить, что суммарное содержание хлорофилла у всех низкорослых сортов риса соответствует показателям, определенным для районированных интенсивных сортов риса в Краснодарском крае, например, Спальчик, но значительно превосходит их в сравнении с традиционным высокорослым сортом Краснодарский 424. Это соответствует ге-нетико-физиологической детерминации степени интенсивности формы, предложенной Алешиным Е. П. п Алешиным Н. Е. (1993). Известно также, что плотность мезо-фильных тканей, содержащих хлоропласты, возрастает у риса в эволюционном ряду; сорта индийского подвида — традиционные сорта японского подвида — современные сорта японского подвида.

Таблица 10

Содержание пнгментоз с листьпх проростков изучаемых сортов риса, питательная среда с крезацином, 10 мг'л

,N'0 п. .1.

Вариант

Са, Св, Ск,

мг/г мг/г мг/г

Са+С.в, МГ/'л

1. Краснодарский 424 0,470

2. Спальчик 0,390

3. Сгарт 0,410

4. Жемчужный 0,480

5. Кулон 0,510

6. 150 В 0,42

7 Мутант Алексеенко 0,60

8. К- И-146-1 ОПашса 0,26

9. Ла1ра1па 0,40

РфУ Ро,

0,140 0,210 0,610

0,1 10 0,210 0,500

0,09 0,220 0,500

0,12 0,330 0,600

0,12 0,24 0,630

0,09 0,20 0,510

0,12 0,24 0,72

0,08 0,15 0,34

0,12 0,21 0,52

21

Белки — высокомолекулярные биополимеры, структурными элементами которых являются а-аминокислоты. Молекулярный вес белков варьирует в очень широких пределах от 10 000 до нескольких сотен тысяч и более. В ходе исследований и проводимых работ так же было определено содержание белка в листьях и корнях на примере сорта Краснодарский 424, в возрасте 13 дней, как это видно в таблице 11.

Таблица 11 Содержание белка в тканях риса. Сорт Краснодарский 424

№ п. п.

Вариант

Орган растения

% белка

1. Контроль лист 4,17

корень 3,91

2. Крезацин 10 мг/л лист 7,67

корень 9,44

3. Крезацин 1 мг/л лист 13,43

корень 4,55

4. Крезацин 0,1 мг/л лист 5,22

Крезацин 0,01 мг/л корень 4,52

5. лист 4,63

р<р > Ро | корень 4,07

Содержание крезацина разное по всем вариантам. По сравнению с контролем все остальные варианты имели повышенное процентное содержание белка в листьях и корнях, что говорит о положительном действии крезацина. Но во втором и третьем вариантах, где крезацин 10 мг/л, наблюдались в ходе эксперимента некоторое за-торможение роста и слабость проростков, из-за того только появился первый лист и длина корней не превысила 2—3 мм. Варианты с крезацином 0,1 мг/л и 0,01 мг/л имели более здоровые проростки с образованием даже развернутой листовой пластинки второго листа, с другой стороны, содержание белка снизилось. По всей вероятности, учитывая все параметры, наиболее оптимальный вариант, где не препятствуется развитию растений испособ-ствуется содержанию белков, находится в интервальном количественном содержании крезацна 0,1 мг/л — 1,0 мг/л.

В ходе проводимых исследований определялось также наличие крахмала, абсолютно сухое вещество и угол подъема проростков, результаты которых описываются в выводах.

Выводы

1. Установлено, что синтетический регулятор роста — крезацин в значительной мере повышает эффективность культуры пыльников риса.

2. Использование крезацина в культуре пыльников риса in vitro способствует ускорению традиционного селекционного процесса, повышая частоту каллусообразо-вания изолированных пыльников и обеспечивая преимущественную регенерацию зеленых регенерантов.

3. Повышение эффективности метода культуры изолированных пыльников при использовании крезацина обеспечивается в значительной степени за счет оптимизации первой стадии культивирования.

4. Предложены модификации питательных сред по составу и соотношению регуляторов роста, оптимальные для районированных российских сортов с целыо выявления потенциальных возможностей изученных генотипов в условиях in vitro.

5. Установлено, что частота регенерации зеленых пыльцевых проростков при использовании крезацина у сортов интенсивного типа варьировала от 14,2 до 35,0%, а у высокорослых от 12,5 до 20,0%.

6. Изучено влияние концентраций крезацина в водной питательной среде. При оптимальном содержании этого стимулятора роста содержание пигментов в проростках достигло 0,72 мг/г; белков — 6,80%; крахмала—15,3% и абсолютно сухого вещества — 15,9% в стеблях, 11,7% — в корнях.

7. Для биотехнологов и селекционеров рекомендуется использовать крезацин в культуре пыльников.

8. Для применения в биохимии, биотехнологии и селекции рекомендуется использовать крезацин в водной культуре растений.

По материалам диссертации опубликованы работы:

1. К о н д о р и М. X. Биотехнология как способ борьбы с загрязнением окружающей среды: например, рис //Тез. докл. конф. молодых ученых.— Краснодар, 1994.— С. 13—15.

2. Сельское хозяйство и биотехнология: перуанский подарок — картофель. Статья в газете КГАУ.— Январь, 1994.

По другим темам:

1. Escolar Puneno...? Ministerio de la Presidencia — concytec. Lima—Perú, 1988.

2. Я живу в другой стране. Краснодар, 1994.— 20 с.

3. Демократия и социальные отношения: например, Россия (в печати).— 1995.

Подписано к печати 15.10.95 г. Объем 1 п. л. Заказ 3167. Тираж 100.

Типография издательства «Советская Кубань» 350680, ГСП, г. Краснодар, ул. им. Шаумяна, 106