Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Совершенствование иммунодиагностикума для определения HB3Ag методом реакции обратной пассивной гемагглютинации и его клинико-эпидемиологическре испытание в Восточной Сибири

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование иммунодиагностикума для определения HB3Ag методом реакции обратной пассивной гемагглютинации и его клинико-эпидемиологическре испытание в Восточной Сибири"

СССР

КОРПОРАЦИЯ "ФАРЙВДУСТШГ Концерн Имыуноген*

ТсшскиА ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский институт вакцин и сывороток

■ На правах рукописи

Л ЕЩ У К . Светлана Ивановна

СОЕЕНПШЯВОЙДШЕ ШНУНОДЯШОСТИШВ. ДНЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТОДОЙ. РЕАКЦИИ

СБРАШОЯ ПАССИВНОЙ ГЕМАГПШ1ШЩИ И ЕГО ШПШШЮ^етЩЕНИОЛОПШЖОШ ЙСШГАШЕ В ВОСТОЧНОЙ СИБЙРЙ

03.09.06 - вирусологи»

Автореферат диссертации1 не соискание ученой степени кандидата биологических наук

Томе* - 1991

Рабога выполнена в егетатзгте впядаззЕсдегш

щ мааробиологши ЕОЭ СО ДМН СССР !

Научный рукеведзтаь: до8?у>р кедш^нскях неук,

крсф5сеор В.А.Диань®в

Офацааяътш спашениз: доггер ©Зд5цшекнг исув,

црюфаееер В.Д.Педоплёкш

К®ЗДЩгЯ бамогз^зскшЕ надга Г.Н.Ует®р

Ввдущэе ^юхдйш© : Ресудг^етазшый шушо-асеяедог&тагьсшШ ннотату» ставдартазацва в кстрохя вэдщек€шех бяелогшчоеказг препаратов Мгн8етеро¥ва здравеэзфаншшя СССР.

Задета ссе*он?ся " * ¿СЫ^-Я 199£.. в /Стасов на заседания спецяаяязнроваюшго соаота К. 098Л 1.01 по щжеувде-нкэ учакой Степана шадвщата науа пра Тоаскш ордена Трудового Красного 2нвизт нгучио-Есследог&'гельскои цкстктуто ваяцкн в сывороток (634050, г.Тшск, пр.Ленша,32).

С днсоэртацдай мс но ознаЕоаштъся в библиотека Томского

иаучно-нсслэдовагвльехоге агетагдта эаяцда т выворотов.

Автореферат разослан "{Ч 1991г.

Увдный секретарь спацяаяизированиого совета наидздат бяологачзскжх наук

Л.Н.Полв15уЕ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. ВирускнЯ гепатит В (ВГВ) широко распространенное габолевгшно: по дгшнь*? экспертов ВОЗ ososo 3% наезде кия зеиного шара поражены вирусов гепатита В, в СССР даовень носитаяьствп КЗа-елтигена - маркера вируса.гепатита В в срвдаем составляет 6%.

Степень распространения HB"V~ в человеческой популяции„особенно в форнз б ts е с ггш т о • с i о г о вируеоносительетва.в гзядом ел ущьэ обусловливает слогиввзеся неблагополучие эпидемиологической ситуации.

В PÜ8CP наиболее неблагополучном ¡j этом отношении являзтся регион Восточной Сибири,где имеет место повышенное,по сравнзнкв с Европейской частью страны,носительство НБ^-аитигека, Тывинская АССР - 12-14$, Бурятская АССР - II,(по РОЛГА) (3.А.Горкина с соавт.,1982) (45),

Вирусный гепатит В наносит большой ущерб состоянию здоровья населения и экономике государства.Временная нетрудоспособность при этом заболевании продолжается более месяца.Нередко гепатит В приникает хроническое течение,которое может осложниться развитием церроза.а в некоторых случаях и первичного рака печени {3'xlttce ei.al. , 1980;Ыатбеку U. аЛ.\ 1982).

В большинстве случаев заражение вирусом ГВ обусловлено проведением различных лечебных диагностических манипуляций,геыо-транефузий,различного. рода инъекций, хирургических и других парен -тералышх вмешательств.Поэтому профилактика гепатита В должна проводиться путем принятия мер,предотвращающих парентеральную передачу вируса: это тщательная стерилизация шприцев и игл,переход на шприцы я иглы однократного пользования,стерилизация хирургического,диагностического, зубоврачебного инструментария п т.п. Эти меры долети быть дополнена выявлением носителей HBj-антигена вируса гепатита В чувствительными методами (РОПГЛ, РИЛ, ИФА).Современные методы позволяет1 выявлять несколько антигенов, которыа являются специфическими «аркарами инфекции: HBjA^ , HBeAg .антитела к этим антигена«, антитела к сердцевинное сити-гену (анти-НВс) и дольта вирусной пнфзкцки (Ананьев В.А.,1983; . Вязов С.0.,1986; Ворозгбиева Т„Е„ е соавт.,1982 к др.).

Интенсивно седется работа по созданию исунодкагмостипулоз и вакцкн для профилактики НВУ"-янфокцяп,оягеа.ко они до еж пор

не внедрятся повсенастно в практику здравоохранения аэ-ва отсутствия их е доегато«з$оы количества'.

Дяя прахтичзекнх оргеяоа здравоохранения наибол®® достойным для определения Ш-?Ао является иатод РОЯГА. Наряда' с высокой чувствительностью он щюст в вшюяиекшз, не требует социального оборудования м кошт использоваться для акспресс-дкаг-ностшш (учет реакций производится »зарез 30 минут).Этот метод отвечает многим требованиям практического здравоохранения.

Существующие щщунодаагноетихумы на НВа-йшиген как кошгэр-часкив.так и экспериментальные во иного« разднчавтся мазду собой. Эти различия касаэтся ввдовой пркнадяеяностн эритроцитов (барана, кур, индеек) .способов их фиксации к сенсибилизация (глютаровыЯ альдегид,хлорид хрома,амидол).раздетгных источников иммунной сыворотки и способов ввдедення НВ^-аятнтел.

_ Следует отмэтнть.что пассивная геиагглютинащяя как никакая другая реакция таит в себе возмояность неспецифячаских реакций.

В связи с вшеизложенным,в настоящее время актуальными являются исследования,направленные на совершенствование технологии изготовления юофнодиагностнкуыов на НВз-антиген и внедрение в практику здравоохранения высокочувствительного метода РОПГА. В этом направлении и проведена настоящая работа.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилась отработка и дальнейшее совершенствований методов приготовления антительного эрктроцитарного диагностикума для индикаций НВз-антигена и внедрение РОПГА в клинико-эпвдемиологическую {фактику.В соответствии с поставленной целью определены следующие задачи:

2. Отработать методы сенсибилизации различных эритроцитов.

2. Получить высокоактивные иммунные сыворотки для приготовления антительньк диагноегикумов.

3. Устранить неспецифические реакции,наблюдающиеся в РОПГА.

4. Апробировать новые варианты шцунодиагностикумов на НВ¿-антиген в практической здравоохранении.

5. Выявить и изучить распространенность ШЛГ вирусной инфекции в Восточной Сибири.

Научная новизна работы. Впервые для получения эритроцитар-ного икыуиодиагиостихума дяя индикации НВ^-антигена в качестве кояьвгирувдего агента применен амидол (2,4-диаминфенолхпоргид-рат) дая сшивки НВ^-антител с поверхностью эритроцитов.Предложены

рагщояаяькш кет оды етабияязацип я еенсжбаяизации эритроцитов, позволяющие подучить высокочувстгительтгй ищукодаагкеетикум па НВ^-аятаген.

Впервые в качестве адъшвелта для иммунизация животных аргшэ-«еио иовое соединение из основе еиитетичоехжз иоянаняонов (еопо-яшер 5-изопроп©нилтетразола к^вииияпирролидона) .епоеобкое проявлять кмцуноадызвантнда свойства в свесе с НВа-антигеном.

Препарат защищен авторским сввдетельствоа 9 1578143.

Впервые показана принципиальная возможность получения гамма-фракции кз ящ кнчунизированных птиц к приготовление диагностн-чзсгсого препарата иа их основе для ицдгтацдаг НВувнтигеяа.

Изучдяа природа неспецифичзских реакций,набл®даэдихся в РШР&, связанная с использованием глвтаровог© альдегида и недостаточно очищенных НВ4-антитея,Для устранения ивспецифических реакций, г давяда образом,показана необходимость проводить очистку специфических иммуноглобулинов от белковой принеси.

Ложнополозитедыше реакции, связанные с присутствием в исследуемых сыворотках гетерогемагглюгининов и ревматоидного фактора, должны контролироваться на специфичность реакцией нейтрализации НВэ-аятнгена.

Отмечен высокий процент- НВ^-аятягенокосительства среди здорового населения Восточной Сябирз, в среднем по Тывинской ССР -125?, Бурятской ССР - 10,2%, в Иркутской области - 6,6%.

Практическая ценность работы. Модифицирован способ получения эрзтроцэтЕрмого тифнодвагаостедгна на НВ3-антиген,что позволило сократить расход сэнсяткна в 2,5 раза (по существующей методике I иг/т, в предложенном варианта 0,4 иг/кл).

Внедреяио высокочувствительного икмунодиагностшдгсга в лечеб-но-профилактнчеекке учрввдения Востовдой Сибири дало возможность улучшить лабораторную диагностику гепатита В.

По результата?; проведенной работы подготовлено информационное письмо по "Сравнительной характеристике катодов лабораторной диагностики'РОПГА и ВИЭЗГ (для инфекционистов,эпидемиологов,главных врачей ЦРБ, СПН Иркутской области),гтрксаз' 780 от 24.12,87г. по отделу здравоохранения Иркугского облисполкома, инфоркацкоиноэ пвсыю используется 2 угебг-х-:; процессе к научной работе кафедры' госф-нологка и аллэргохсгггз ИЛИ с 1587 года.

На защиту выносятся следующие основные подокення..

1. Иммунодиагиостпкумы на HBj-ангпгоя'для РОПГА во каогом отличаются между собой.Этн отличия кйсевтся звдовой привдяодиосты эритроцитов,способов фиксации и сенсибинзацян, различных нсточяи-ков специфической сыворотки к способов гцдеяення ттштвй,

2. Подтверждается необходимость контроля полонлтедьяызе результатов реакцией нейтрализации.

3. Получение гиперкыыунных сывороток на основа новых синтетшгэс-л'иа адыозантов.

4. Расшифрована вероятная природа неспецифэтеских результатов, наблюдавшихся в РОПГА. ■

Í5. Регион Восточной Сибири эндемичный по вирусному гепатиту В. Носительство НВА-антигена (по РОПГА) иа изучаемой территории среди здорового населения составляет в среднем 9,6*,

Апробация работы. Результаты работы доложены и обсуждены на конференции молодых ученых Института эпидемиологии а микробиологии совместно с медицинским институтом (Иркутск,1932),на обществе эпидемиологов и микробиологов (Иркутск,I9S4), на 1У Всесоюзной конференции "Человек и природа на БАМа" (Новосибирск,1934), на научно-практической конференции "Здоровье населения Иркутской области" (Ангарск,1988),на IX Всесоюзном симпозиуме по целенаправленному изысканию лекарственных веществ (Рига,1991).

В завершенном виде диссертационная работа апробирована 13 декабря 1990г. на заседании Ученого Совета института эпидемиологии и микробиологии ВСФ СО АМН СССР г.Иркутска и II июня 1991г. на заседании межлабораторного совета Томского ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского института вакцин и сывороток Министерства медицинской промышленности СССР.

Публикация результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения,обаopa литературы,четырех глав собственных исследований, обсуждения получениях результатов,выводов и указателя литературы (70 отечественных и 1И иностранных автора).Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста,иллюстрирована 22 таблицами и 4 рисунками.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1'атеркалн и гэтоды. При конструировании эритроцптарннх диаг-ностикуиоп на HBj-антиген использовали эритроцита барана,кур,индеек,человека 0(1) Ph(-). КВ4-антиген выделяли из антигонсодер-лнцей крови доноров.полученной со станции переливания крови г.Иркутска и ТувинскоЯ АССР. Очистку НВ^-антигена осуществляли по технологии,включающей: осалдзняо полиэтиленглюколеч,обработку пзпсинок.Ультрацентрифугирование сьторотки проводили в линзйном градиенте плотности сахарозы от 15% до ЗСй концентрации в 0,9% раствора натрия хлорида.

Специфические кицуноглобулкны получали из сывороток крови Егиунизкрованних яивотных и птиц (козы,кролики,куры,индейки), а такге из яиц ¡:г?.$унизироваяных птиц (куры,индейки) .Иммунизацию проводили с::асыо очищенного На¿-ант и гена с равным объемом полного адъюванта ФрзКнда (QaÍ¿¿c-¿/Le,-n- США).В другом варианте использовали принципиально новый способ получония иммунных сывороток с помощьэ спнтеткчзского адъюванта сополимера 5-изопропенилтет-разола и //-вшилшфролидона.Инмунизацию животных и птиц прово. дкли по катода:,? В.А.Ананьева с соавт. (1980,1983) и С.О.Вязова (1982). Обработку эритроцитов формальдегидов проводили по методу А.М.Олейникова (1953),глютлровн! альдегидом по катоду Ы.Г.Гориной и А.Ц.Оловникова (1974).Сенсибилизация эритроцитов иммуноглобулинами проводили в присутствия шшзГЕрувцих агентов глютаро-зого альдегвда (С^Н^О^) btti'ü, ; хлорвда хрома (CgCIgGHgO) л екццола (2,4-дисжнофзнолхлоргадрат).В качество сонскткна попользовали и сг.оцяфачзсккэ кг^чуноглобултзщ коз я индеок класса Iq D с тптрси НВь-антитзл X: 128 - 1:256, сыворотки доноров с КВ$-анта-телг-.и 1:2 - 1:4.

Эффзктгаэносгь л диагностическая знач:":ость разных способов приготовления гся^нодтгностпкуков изучалась в сравнительных опытах с сущестпусл^щ ко1г*зрчзскге.7! дяагностккумаия.

На зсох этапах работы содеряенкэ НВ$-антнгена я НВь-аитптвя определял» с пс-„:оцьп преципитат-хин их г<этодоэ: тхзтод двойной ™л- • гунодкффузин а агаровой голо на горизонтальной поверхности по Оухтерлони: мэтод встречного ггдг.иоэлоктрофорэза (ВИЗ®) ,разработанный ft í en.cLox-f-est ti. G¿{ 1970) .роанцгпз обратной пассивной " ' гсг-гагглстинацки я кшуноферуентныЯ анализ (ИМ).Всо пологятель-нцо на НВ$-знткген результаты подтзоргдалп реакцией иойтрализа гря.Очястку HBj- ентнгена проводили катодом, продяояегашм В.А'.Анаиь-oc:rj с соглт. (1978) заявка Г-> 2654785, псслодрванпя волпсь на

базе лаборатории этиологии вирусных гепатитов института вирусологии иы.Д.Ч.Ивановского (руководитель лаборатории доктор медицинских наук,профессор В.А.Ананьев).

Исследования по циркуляции НВ§-анткгена проводили ка территории Иркутской области,1увинской и Бурятской АССР. Изучали распространенность гепатита В и-носительство НВ^-антигена у здоровых лиц,больных вирусными гепатитами,другими инфекционные а септическими заболеваниями.Возраст обследованных лиц от 0 до 70 лет включительно.

При анализе заболеваемости использовали материалы Иркутской городской и областной СЭС, республиканских СЭС Тувинской и Бурятской АССР (ф.85).годовые,месячные журналы регистрация инфекционных болезней (ф.60) с 1978 по 1990 годы.

Статистический анализ информации по отдельным эпидемиологическим параметрам проводился с использованием критериев Стакдента.

Количество проанализированных при выполнении настоящего исследования различных материалов представлено в таблица I.

Таблица I

Объем изученных материалов № : Наименование документов: Количество

I. Проанализировано:

- годовых отчетов различных санэпидстанций

Иркутска,Тувинской и Бурятской АССР 60

- индивидуальных карт доноров II772

- индивидуальных карт развития ребенка 4729

- обменных карт по беременности и родам 1708

П. Изучено:

- историй болезни больных вирусными гепатитами 3651

- историй болезнг больных соматических стацион. 1450

- карт эпидобследования очагов ВГВ G69

На наличие НВу антигена обследовано более 20 тысяч сывороток от 11771 доноров, 4729 детей дошкольного и школьного возраста, 1450 больных соматических стационаров, 2188 здоровых взрослых, 1708 беременных женщин.-

Наблюдение за донорами проводили в динамике.Носительство НВ$А^ у доноров изучали в зависимости от возраста и пола.Анализ

цатвриада по носвтвдьству НВ^Ай з заяксЕиосто от групповой пра-надлэкностй сыворотки проводили у 5911 донсроа»

НВ^-аи?ЕГвне!®а изучали у 3651 больного репэп5тса1»госпиталя-зпрованных § городскув ш детекуэ инфекционные бояы-шш.Это были больнш е ДЕИгнозами: ганата*? А, гепатит В л энрусныЯ гепатит кэясноЗ этиояоггш.

Результата п обсуждение. Конструпровсякэ а еоперпанетвованка ■ эрптроцктарнкх дкагноетга^ыов на НВ^-акткген,, В неззй стране предяокзко несколько иэтодоз получения эрстро-цатарннх двагностпкумов для квдизацни КВ^-антигена кэтодоц РОПГА, но оно р2злпч20тся по чувствительности к специфичности.Поэтоцу это? вопрос продолжает кзучаться.Проблемы я обучения эритроцнтар-нее ДЕЗгкостсхуиов возкЕЕспт яз-за различна способов иагрузж: зрггерогрпгос гсмосэнсягинягя.о? прггрода: сенситша п коньзпгруз-цзго аграта. '

Цаль пгстоп^эго раздала работы - совершенствование дпагнсс-тйчзского прзпарата на ГЮзАо для РОПГА»

На мл были спр&дадеин оятжпяьныз условия стабилизации и свн-еябплпзацги эрэтррцгзгоззбцз проведен подбор еексит:ша :: еоньэге-доарго агента.Ваявганн законеегэрносгп»оцределяпцга осношшэ ха-рзеторпстгаш РОПГА: еэ «^оствстольность»специфичность,воспрокз-водг^'.ость.

При Езго*озлгня2 вксперпкзнтальных длсгност^улоп пспольао залн эритроциты б5.ргка,еур,евдезк,1гзяобэка 0(1) Рп(-). В качеств*? сзнсптшщ цргзгзнязз гежзглобудкны пнмунизпрованншс коз,пкдс-с-1:,

кроликов, РЕКйЗГД0буЛ1ШМ,ВВД9ЛеИНЫЭ КЗ ЯЕЦ ПНДОЗЕ.Нур, 0. тшаг.о

снзоротгя доноров е НВа-шпгпгелека и оль^укка чзлоеэчзссзй кор-

сальный.

Получзнсэ сортных сывороток с использование;* спягепгеесетго гдъзванта сопоапмзра (5-язопропэнплтетразола я //-вптлпстрэгп-дона).С цэльа полония кгс.-унной сызоротп: кпвотншс к пткц ишу-нпзпрошзди смэсьэ НВ&-антигена к полного одьвзвнта Срэйнда. Адьвзант ^рзйнда - кятортный гтспара? а достаточно дорогой н.гто огргнгчзгьэт ого игроков приязненно для вшеуказангоя целей.Нами Сила црадпрсаота попытка провостп паунвзацва спвотшяс с зазлзноЯ едьоэснта Орэйнда сополимером 5-пзопропенплтетразола а /^"-вгнил-гкяродэдона.Цропсрат готовили а Иркутску государственном уншзер-сзтотэ на кафадра высокомолекулярных соединений.Прп государственной рзгтгетркрд ецу присвоен нс!*зр 7538386. КолбОлоо' блг.зп™гп по4

структуре й свойствам к данному сополкиэру являются еОподккеры акриловой кислоты к V-вянгмпЕрроявдоня, применяемые в качзства адъювантов в сочетании е антигенами гекагглютинина вируса гриппа, холерного энтеротокскна. 0-полкеахарида {ЗвЛтсп&и ^ркутихш-т.), однако об их использовании для стимуляции антител гепатита В не сообщалось. \

Сополимер Ь-изопропенллтетразол в л^-вттлпирраяидон представляет собой порошок белого цвета,растворимый в диметилформа-ывде,диметидсульфоксиде,физиологическом растворе.Благодаря налн-щ' звеньев 5-нзопропениятетразола сополимер обладает свойствами слабой М-Н полнкнслоты (рНо = 5,0),чем кислотность поликислоты вьгше,тем она слабее.В воде при низких степенях ионизации он существует в компактной конформации,стабилизированной водородными связями и гидрофобными взаимодействиями с участием метильныу групп 5-кзопропендлтетразола и метиленовых групп У-винилпирро-лвдона.При ионизации макромолекулы претерпевают конфораационный переход к развернутой структуре.

Токсичность сополимера 5-изопропенидтетраэола я /V-винилпир-ролидона определена на белых беспородных мышах методом йербера. Дпя наиболее активного сополимера ДЦзд 1340 мг/кг, а выбранная нами доза 0,6 мг/мл, то есть он практически не токсичен.При изучении адъювантной активности синтезированного полимера использовали его водный раствор с рН=5.

Сополимер 5-изопропенил.тетразол и л'-винилпирролидон проявляет адьювантные свойства при иммунизации животных в смеси с НВ¿-антигеном.На кроликах породы "шинхила" провели полный цикл иммунизации смесью НВ^-антигена и сополимера.

Инъекции проводили подкожно в несколько точек пятикратно с интервалом в семь дней.В каздую из инъекций животным вводили смесь,содержало«) 60 мсг НВ^-антигена и 0,6 мг сополимера в I мл. В контрольной группе кроликов иммунизировали смесью НВу-антигена И полного ад-ыоэгнта Фрейнда (табл.2) .После полного цикла иммунизации была получена гипериммунная сыворотка с содержанием НЗь-ан-тител в титре 1:64 - 1:128.

Очистку гипериммунной сыворотки от сывороточных белков проводили методом иммуносорбентнрй хроматографии на Ш1С-800В. Метод включал адсорбцию НВз-антигена на сорбенте »пептический гидролизат антисыворотки.делипвдизацию гидролизата,хроматографию гидролиэата, элюцию НВа-антител,концентрацию антиНЗ^ и диализ.

Такта образом,сопояияер (&-83одропзншзтетразола и //-вгаял-кзрролвдона) коне? приаонп?ься для Епдгнвзацт! животных в качестве адьювента,позвол1ШциЯ в сиеся с НВ^А^ получать ГЕпзркм^шыз сизорокш.

Табдкца 2

Результаты кзученая к^уноадьтантной актЕвшсгя (сополншэра 5-пзопропенкятатразояа и //-вгожяпкрро-лвдона) по БИЭ$

Исследуемоэ вещество

1:2 |1:4 :1:8 :1:16 :1г32 »1:64 :1:128|1:255

Смэеь Ш$Ад с полти адьЕвантоа ФрэКада

Сцзсь НВаА§ с сопо-лигаром 5-нзопропекнл-тетразола ж л'-виннл-пирролидона (0, Оиг/ш)

Сиэсь ИВ{А§ с сополимером 5-взопропэнкг-тетразояа в /у-вянел-шгрролвдона(0,16мг/и2) -

Саась НВ&&9 е сопо-ДШврОМ 5-ИЗОДРОП2ЯЕЗ-тетраэола я л'-ветш!-Шфролвдона(5кг/|гя) -н-+

Раздельное ввэдаякэ сополЕмвра а '

•н+ +++

ПршйУчанЕз:

- погод агтяотннацяй в "ч—* - тактичная аггявтиигцжя -отезгтсташ агглвтаяецян

Для изготовления даагноствшсЕкя препарате» кспользупт различные гокъюгяругщиа агенты,кгогунноэ сцрьэ,поз?оцу и споообн юс гфнготовления различны,от этого зависит специфичность в чувствительность ЕШ!унодка^шосткяу{1а.Н2г01 быля апробированы различные в^рианты сенсибилизации зря громов птиц и человека 0(1) РМ-), ¡твьюгирующие агенты: глвтаровыЯ альдегид,хлорид хрома в аывдол Ввделение гашга-фракцин из яиц иммунизированных птнц. Была предпринята попытка в качестве иммунного сырья использовать г агама-фракцию,вьделеннуп из яиц тшцунязированных птиц.С этой целью от кур и индеек, тщунизярованных НВ^-ангягенои,собирала

Ю- .

яйца к из них ввделяли /"-фр&хцят.Я работу брал« по 10 яяц от каждой пти^й.Желток отделяли от бэлйа в добавляли фосфатный буфер (0,01 М, рН=7,5),буфер готовила на 0,1 М.растворе хлорида натрия.Смешивала желтки и белки отдельно с двумя объемами буфера ж добавляли полнэтиленгликоль (ГОГ-бООР производства '"Setvö" 3,5^* конечная концентрация в растворе,смесь выдерживала 45 минут при комнатной температуре.Затем центрифугировали при 15000-20000^ в течение 15 минут.Фильтровали надосадочную жидкость через шестислойную марлевую салфетку и добавлял; ПЭГ, вцдер-живали 45 минут и снова центрифугировали 10 минут при 15000 -200000.осадок суспендировали в буфере и добаьдяли ПЭГ до 12%, выдерживали 45 минут,снова центр«фугировали в том же режиме.

Надосадочную жидкость удаляли,в осадок добавляла фосфатный буфер.Смесь вьщерживалп 12 часов в холодильнике при температуре +4°С, после чего добавляли несколько капель хлороформ.Пробу с хлороформом тщательно встряхивали и выдерживали при комнатной температуре 15 минут для осаждения хлороформа.В надосадочной жидкости определяли гамма-фракцию яиц методом (ИД) по Грабарю с антиптичьей сывороткой,специфические HBs-антитела методом РПГА с антигенным диагностикумом. Результаты представлены в таблице 3. Как видно из таблицы,титр НВ^-антител намного выше был определен в желтках яиц индеек 1:2000 в желтках кур 1:256» В белках яиц индеек титр HBs-антител был 1:64, в белках яиц кур ниже 1:16„ . Таким образом,максимальное количество специфических антител находится в желтках яиц иммунизированных птиц. Это иммунное сырье использовали для приготовления диагностического препарата«

В одном из вариантов для сенсибилизации использовали глюта-рированные эритроциты.Смесь,состоящую из 5 объемов 8£ взвеси отмытых эритроцитов,5 объемов сыворотки донора с НВ#-антител-ши0 I объема 2,555 раствора глютарового альдегида,выдерживали 90 минут при температуре 56°С в водяной баке (периодически встряхивая взвесь).После чего охлаждали 30 минут при комнатной температур« и отмывал;. 4 раза забуференным физиологическим раствором pHV7,2 с 0,4$ содержанием бычьего сывороточного альбумина (БСА). Иммунодиагностику« готовили в виде 1% взвеси сенсибилизированных глютарированных эритроцитов на забуференноь физиологическом растворе с 0,456 содержанием БСА с добавлением консерванта.

В другой варианте использовал* формалин из ированные эрнтро- . цкш. Сенсибилизацию эритроцитов проводили в присутствии хлорвда

s

м ç-»

ч о и

QDO>:I

оооги

*•*-«

"520151

гк*т

1

»1 1 »» «« *» «•

s

14 s; « eo e«*«

3 mn

¡Q* «A «t t* •»

I Biî

00 oo oo oo

Z

I Î

i » «

i i i

9 I I

< -H I

Î Î î î

+ î

t '

î • $ '

î t

î i

> 00 00 4000 09

в

» « % •

w л îo л

о • о •

о м о ai

at» и и og

w se

H so

jUg l?25

'OSO -о я с

о о о -

Ч «tí 4«

■И I

+ I

4- I

î X

ama t

n a ¡o л O O Sí

S3

<яв« оч дч

¡s |>§

идо,

3

H CT

sad

О Q, ~ О

Р

С. ä

S

я tj

д в

i § 5

s & 1

i S i

О а» в

t

• * *

п О +

• • т

о set +

+1 н

S О

S I к s t.'

+

хроыа ((М^з'бН^О) шЕ^ногиобугшаш (1дС!),ввдаяеяншн из юе^н-ной ешоротхи кквохнызс ы птиц, а такка гвшга-фраЕцизй,вцдавенной кз аиц гйзщгнизировшньас птиц (кндэйки, куры).Пэрзд свнскбоввзациай эритроциты ресуепендироаали в 20-кратном объекз 0,9$ раствора у/еС1 и цантри||угировали в течение 20 ищут при 15000 ¿? .Эту про-цздуру повторяли ецэ 2 раза,затем готовили 502 взьзсь клеток ш зтоёз ео раствора.При постоянной пере^ешванааз к 8 объеыам дистиллированной воды последовательно добавляли I объш 50? взвоси отьш-тых на 0,9% раствора у/аС1 и I ебъода раствора кга^уноглобулкна и I объем 0,2% раствора хлорного хрома (ОгС^-б^О), Сыэсь оставляли на 10-20 шшут при кошатной текдаратуре,затек прибавляли равный объем 0,9й раствора Л/&С1 е 0,4% содэрашгазы БСА (бычьего сывороточного аяьбуикна) и отмывали от несвязанного белка 4 раза при 20000 д. .

Сенсибилизированные эритроциты готовили в ввде взвеси. Отработаны условия сенсибилизации форналшшзировшшых эритроцитов с штцью аквдояа (2,4-дианинофенолхлорпадрат).К двум объешш 20$ взсаеи эритроцитов,отштгх от формалина, добааякям один объем ста-цЕфячзсЕИх шууногяобулкнов с содержанкам белка 0,4 иг/ил т одш обьвк 0,43% сгзгаприготовленного раствора еывдола.Процентное содержание ашздояа в растворе готовили по катоду Б.В.Каральника (1982) .Сыэсь встряхивали и ввдерживаяи 30 минут в водяной бана прк теказратура 5б°С, шркодкческн перемешивая.Отмывание сенсиб&вкзв-ровашшх оритроцптов проводили физиологическим раствором рН»?,0 с 0,4£ еодзрганЕзм сывороточного бычьего альбушша.три раза при 20000 § в течзнкз 5 икнут.Готовили 0,555 взвесь сенсибилизированных еритроцитоз на физиологической растворе с добавлением консерванта (азид натрия) ,ггцучивахи и подвергала контроле на стшцкфнч-иость в активность.

Активность приготовленного шмунодаагностикума характеризовал» поваз&тея©м титра НВ&-анткгена, который давал хорошо ввдвдув агглютинация сенснбаяизировадашс эритроцитов.Приготовленный ныцу-яодиагноствкум сравнивала с кошгарчэскюги препаратам производства Горьковского НИИ епндзкиологин и ыикробвэяопш,провэводства Тизеснтсйого НИИ вшсцкн в сывороток и Иркутского предприятия по производству бактерийных препаратов.Во всех опытах чугстантогь-ность експерЕШЯтадьвоге Ейэгунодвггаостихуиа была мва. Сршнатавь-нш дциин» цредставявкн в табяюэ

Таблица 4

Сопоставление активности окспэргагентального НВа-дкагностяяука с когязарггзекгагя препаратам

Диагностические препараты

НВ&-позитиЕная сыворотка

^ ^ со'-ос^с^ Р 8 3 8

N ^ 05 м со 3! й $ $ 2 м $ 8 &

Эксперим.диагн. + + + + -

Горьковск.НИИЭЙ

серия Р6(1987г) +

Ташкентск.НИИВС

серия £бЗ(1987г) + + + +

Предприятие по производству бак.

препаратов + ----- - -

г.Иркутска

серия ®37( 1987г)

Примечание: " + " - агглютинация

" - " - отсутствие агглотинации 1:16000 - конечное раззедение сыворотки

Показано,что с помощью амидола возможна эффективная сенсибилизация эритроцитов НВ»,-антнтеламй.

Таким образом,эффективность сенсибилизации зависала от свойств коныогирущего агента и сенситина.Результаты сенсибилизации эритроцитов иммуноглобулинами от разных животных демонстрирует таблица

Как видно из таблицы во всех случаях при применении хлорзда хрома отмечалась высокая эффективность препаратов,титры НВа-анги-гена в РОПГА колебались в пределах 1:1024 до 1:24000. В то время как при применении глвтарового альдегида и иммуноглобулинов не обеспечивает высокой активности диагностических препаратов,титры в РОПГА не превышали 1:8. Отмечено,что специфичность эритроцнтар-ных диагностикумов зависит от способа фиксации эритроцитов.Проведенный анализ швдунодиагностикума яа основе «итерированных эритроцитов показал неспецифические реакции в РОПГА, положительный результат в группе лиц с диагнозом гепатит В был выявлен в 40$ случаев,а в группе с диагнозом гепатит А агглютинация отмечена во всех случаях.Иммунодиагностикумы на основе формалинизированных эритроцитов в отличии от глютарированных исключают возможность

Таблица 5

Чувствительность экспзрклзнтальння диагностически:.

пропсрстов 2 зввксейосте от бц5& Еойгьвгерувзого Егенга и сзнсктгаа

Иыцуярдкагяостигдшы гКоньаги- ; ' Тктт) РОПГА

на оековз эритроцк- :рувщий

тов птиц сенсиокли- : агент

зированкых Ig <3 eeí- :

цукной сызороткц :

пкаоткнх :

Iod КЗ сызоротЕй СгС13 1:400 1:1024 1:2563

1:4 1:1280 1:2 1:1260

1:4 1:32 1:4

»озасзвоБЗная Hscnoqs&rsscsffic рзапцхй в РОПГА, кспояьзовагша с ез,-lacree сеясэткза катагяой cssojkwk: биго но еффаетнгно.

Следуем огх;тсть,ч?о логкопояоактссьиыо результат в Р0ЯГА «гут сйзть е.: зет о при налички б исследует« сыворотка rsTspor-еи-егггзтшетов к рзк^атоццного фатгора.В связи с 8т:сл,полояктальныЯ результат геизггшгккацш долкзн подвергаться контроля на es спэ-цг4::чность с по^оцьэ реакции нейтрализация.

Е результате проведенных исследований показано,тао сауноди-елюгтиука.прнготозланжэ на. основа фор^алкнязпрованных ерктро-цэтов,ссядабкявзЕрован1й£Е епзцпф'^30®-^ сафноглобулвнгап (%<3 ) в прасутсувЕз коргдо ярое- и стодола,обяедеда высокой «^гветвк-тель::остьэ к сЕцк:ргс:остьо.

Очкцзнньгй НЗаА§

-"5Q яаа

:позитивная АГ - для:сыворотка

виза : ^о.

:(1:16 по : ВХЭЗ)

е**-**^ * *<• «J »» WU» i»' КОЗ * WtúJil^yWLICUl альдегид охр. 1:4

Ig <3 из сисороткн ОгЫ3 1:6400 ьзооо

ка^НЕзкоовешшх Ендеок глзтаропый аздзгэд отр. 1:8

IgÓ ES CUEOpOTUH СгС13 1:24000 1:2000

козленка,рсдпБизгоск ОТ СДфТШЗИрОБ&ННОи ЕОЗН гхетароЕий альдгггд «игр. 1:4

из CtCIo 1:80 1:16

ЕОЛТКОВ ЯКЦ глатарог^'; сльдзгэд отр. 1:2

' " 15

Испытание сконструированного гашунодкагностикума з лечебно-профилактических учреждениях Восточно-' Сибирского рэгшэна. Изучение НВ &-ан т иг анемии у больных.

№.!мунодиагностикум для индикация НВь-антягена прошел широкую апробации на станциях и пунктах переливания крови, в ннфек-ционных больницах и отделениях городов ИркутскаДеолья-Скбиреного, Усть-Кута,Тайшета,Зимы» Бурятской и Тувинской АССР. На наличке НВя-аитигена было исследовано 16820 сывороток от 3651 больного гепатитом, эти больные приходили з диагнозами: гепатит А,гепатит 3 и вирусный гопатет неясной этпояогии.У больных с диагнозом гепатит А- НВ¿-антиген обнаружен у 13 Д?; с диагнозом гепатит В -у Щ?; с кедиагносцировакннм гепатитом В - у 18,6%. У ззроелнх. и детеЯ (0-14 лот)- с клиническим диагнозом гепатит В НВй-аити-ген обнаруживался практически с одинаковой частотой: ззроелыо -73,7*,, дота - 71,ОХ. Достоверных различий в частота обнаружения КВ^-антигена у больных с клиническим диагнозом гепатит В в зависимости от возраста обнаружить ко удалось,но отмечена тенденция к более частому обнаружению НВ^-антнгена у яиц в возрасте от 14 до 40 лет, а у больных с клиническим диагнозом гепатит А от 21 до 40 лет.Следует отметить,что ередн больных гепатитом В НЗз-антп-гея несколько чаще обнаруживался у мужчзш (75%),чем у женщин (70,955). У лиц с диагнозом гепатит А процент положительных находок был практически одинаковым: иенщщэд 19,1%, мужчины 17„3%. Обследование больных с диагнозом "вирусный гепатит" и другими заболеваниями печени дала результаты близкие к результатам,полученным у больных с диагнозом "гепатит А" (от 8,2% до 18,3%). НВ^-анти-ген чаще выявлялся у больных с тяжелым (100£} м среднетяжелым (93,3%) течением заболевания, у больных с легким течением (84%). Период антигенемии варьировал от I недели до 2 месяцев,но у большинства больных она была транзитерной и заканчивалась х моменту выписки из стационара.Пра затяжном течении болезни наблюдалась длительная антигенемия а у 20,4% больных гепатитом В, при последнем исследовании обнаруживался НВ^-антиген.Интересно,что у больных с клиническим диагнозом "гепатит А этот показатель при последующем анализе был равен 4,9%, при диагнозе вирусный гепатит - 10,®, то есть приближались н показателям,характерным для здорового носа-тельства.что косвенным образом свидетельствует в пользу того,что в группе с клиническим диагнозом гепатит А и вирусный гепатит били

больны; с гс-патптом В,либо кнфокцпошшй процесс протекал на фоне антигононосительства.

Йзучэнкс носптельетва НВБ-анткгена у здорового

населения Восточной Скбкри.

Нзлши:о НВз-йнУкгсна определяли в сьгаорогко гсровк здоровьдс л»'Ц (е то;: числе доноров).больных шфзкцконных и соматических стационаров, бсромйшшх езшдкн,детей дошкольного и школьного возраста. Результату обследования представлены на рисунке I.

■ Наиболее высокие пока&а^еян НВ^-анткгона во всех обследован-ник: группах был к отмзчоны у тателей ТувшспоГ; АССР (у здоровых взрогяых - 11,9%, у здоровых детей - 10,62, у доноров - 9,7%, у больны:: салаткчэских стационаров - 15,02, у беременных кенщ«н -12,6%). При сравнении оыявляоиости НВз-антигена у коренного к лркглого населения Двинской АССР, более высокий процент отмэчзн у тувкнц-зв е средней (15,39£ - тувинцы, 1,1% - прочие).По Бурятской АССР среди здоровш: лкц - 9,6$, дети - 9,7$, доноры -6,9%, больные согллт.чзсккх стационаров - 12,1%, беременные кенздлны -12,22. Более незккэ показатели НВ^-анткгена характерны для Иркутской облает;:: здоровыэ взрослыз - 4,05, донора - 5,1$, здоро-х;ш дата - 6,12, больные соматических стационаров - 10.6Й, беременные еен^пны - 6,5/а. Срада всех обследованных контингентов икни-

уровень носительсгва НВ&- енткгена наблюдался в группа гдоровах взрослых,хотя разница иевду здоровьыи взрослыми и донорам; б!у;а носуцостоскной.Высокая частота положительных результатов на НВ^-снтигон Е^ясдсна среди больных сокаткчзсквх. стационаров - б сроднен 12,бй.

Носктелгаи НВ &~£нтг:гона среди дотей к подростков в Тувинской и Бурятской АССР чагдз били дата дошкольного возраста (16,5 к 13,4^ соответствошю).окольнккк - 10,6 и 8,3^. В Иркутской области но-с~?сяьство среди дошкольников было с сродней так5Ы ко,как и среди скйльтгков - 4,6% в 4,9^ .соответственно,Анткгеноносктольство одного ¡; .того со возраста неодинаково сродз: организованных к неорганизованных дотей.Нэоргенизованикз дети допкольного возраста реже оказывались иосцтеляик НВ «¡-антигена, чей организованные дети того ео созраста.Среди организованных детой кладиай возрастной группы (0-3 года) гпкеклальноз колнчзство носителей НВа-антигена било сштзсяо с саггр^тш: дзтсккх коллективах (8,53$) ,шатгапьноо в яездышх группах детских комбинатов (2%).

Срадз пдерозш: сгросгнз нос столки: НВд-аиуигена чазз были

=fc

S ^«С? ^ i

-1-1—I-!-г—I—3-1-I—-т-' • »г"

^ S? ^ § о, tua 1ч и

лица от 21 до 30 лет,а среди доноров от 17 до 20 лет.Достоверных различий уровня носительства в зависимости от возраста наин выявлено не было.Основываясь на проведенных исследованиях по полу доноров „носйтельство НВ4-антигвна в большинстве случаев было отмечено среди яенщнн.В то же время титры НВ¿-антигена у мужчин чае-то бывают вьппе.чем у женщин.Так высокие титры НВ^-антигена от 1:640 к выше у лиц мужского пола встречаются в 29,7%, у кекщнн только в 18,8%.

Анализ проведенный у 5911 доноров в связи с группой крсвге в резус принадлежностью был практически одинаков как среди резус-положительных (4„2&)стак к среди резус-отрицательных (4,1?) лиц, а по группам крови Н%-антиген относительно чаще встречался у людей В(Ш) группы - 5,6?«, 0(1) - 3,63, А(Щ - 4,3%, АВ(1У) - 3.0Й. Вахнш представляется факт преобладания низких титров НВ^-анти-гена у хенщнч,по сравнекав с мужчинами.

Такта образок,проведенные исследования выяввая высокую частоту носительства НВ^-антигена в регионе Восточной Сибири.

Рбзиве,

В результате проведенных исследований был разработан экспериментальный высокочувствительный эритроцятарный ккмунодкагностЕ-кук на НВ^-анткген для РОПГА.

Предложены рациональные методы сенсибилизации эритроцитов. Во всех вариантах лучшим стабилизатором эритроцитов является фор-ыальдегкд.Наши исследования подтверждают дачные литературы о той, что сенсибилизация эритроцитов наиболее эффективно осуществляется при использован ел хлорида хрома.Примененный наша для этих целей анвдол и» уступает хлориду хрома,а в ряде случаев с его по-иоцьв удалось получить экспериментальные препараты с более высокой чувствстельностью.Нроые того, спользование амидола в качестве конъвгсруюцэго агенте сокращает расход сенситкна,® связи с чеы можно снггаать себестоимость препарата.

Показана пргнципкальи&я возможность получения относительно активной гакаа-фракцка- из яиц пьшункзкро ванннх птиц.

При ЕСПОЛЬЗОВОЛЕЗ нэдостаточно ОЧКЦвННЫХ Ш£.дгНОГЛОбуЛ1ШОЕ д^е сс;;ес(5Елпзйцпн эрктроцптов возникает неепэцнфкчесЕИо реакцкз ч з-гбс^егдазея в РОПГА.Било показано,что по своей эффективности в сг«стез суззйгсра ка^шого отвата пра получения НВ^-антитех, соасггхзр 5-агоцрс1г2Ь1гзУотрзаол в «дДвшишаррозгадон из уступает едкжзпг? саась вз обледазт вяагостья е легко

вводятся парзнтерально подопытика жяотти. Данный сопоятакзр коне т вслользоваться при иммунизация ннвотных с цзльа получения специфических антатзд.

Логнополотательннв результаты а РСПГА,связанные о наличием в исследуемых сыворотках готерогеаагглатингиов или ревматоидного фактора,должны подвергаться контролю на её специфичность с поморья реакции нейтрализация НВз-антигена.Сыворотки с бактериальным загрязненазм исследовать нельзя.Использование РОПГА е высокочувствительным юаауяодиагностикумом позволило установить высокую частоту нослтвльства НВа-антигена в Восточной Сибзри.

ДРШИЧЕСШШ РЕКШЕНДАЦИИ

Результата,полученные в настоящей работа,могут быть использованы в иаушо-ясследовательекях учрввденплх,практическом здравоохранении,на предприятиях по производству иммунопрепаратов, занимающихся вопросами дкалюетпки,профялаэтптга ВГВ, а тайка . разработкой диагностических препаратов.

ВЫВОДЫ

¡.Предложен новый метод сенсибилизации эритроцитов с пошщью амидола при изготовлении кммунодиагностнкуиа на НВ&-антиген.Преимущество этого гяетода определяется высокой чувствительность® и экономичностью.

2.Впервые для гоазунизацки животных применен препарат сополимер 5-изопропекилтвтразол а-Д^-винилпирролвдон,способный проявлять имк^ноадъввамтяые свойства в смеси с НВ^-антигоном.Сополимер легко растворим в воде.Полученная масса не обладает вязкостью и легко вводится парентерально подопытный животным.

3.Показана принципиальная возможность получения специфических антител я ЛВа-антигену из яиц иммунизированных птиц.

4„йзучена природа неспецифичесяих реакций наблздающихса в РСПГА, связанных с присутствием в исследуемых сыворотках гетерогеиаг-глютининов а ревматоидного фактора.Разработан контроль яа её специфичность с помощьв реакции нейтрализации НВ¿-антигена. С целью устранения неспецифичоских реакций рекомендовано при производства препарата давать экспериментальную оценку способу фиксации эритроцитов.проводить очистку специфических иммуноглобулинов от белковой принеси.

5. Метод РОПГА для тгпрвделения АВ^-антигена - -наркэра гепатита В - внедрен в Восточной Сибири, при этом установлена высокая частота

носитальства Н%-акт11гена,тщ: в сродней: по Тувснской АССР - I2&, по Бурятской АССР -• 10,по Иркутской области - 6,6% на протяженна 8-10 лет.

6.Откачана высокая частота штигенвшж у детей на территории Тувинской в Бурятской АССР (13,5% н 10,соответственно), по Иркутской области - 4,8%, что соотвэтствует общим високкл показателям ноектельства на этюс территориях.

7.Использоваииэ катода РОПГА в лочвбно-профалактическвг учревде-киях позволило улучзать диагностику гепатита В в регионе Восточной Сибири.

СЖСОК РАБОТ, опубликовании* по тела диссертации:

1.Лещук С.И. Сравнительная характеристика эрытроцитарных днаг-ностгшуиов для индикации НЗ ^-ан к г е н аУ У До с т ке е н к к иммунологии 12 илгробнологип в яечебио-профсдактичзскую практику здравоохранения: Тезисы докд.облает.науч.практкч.конф.-Новокузнецк,-1981.-С.149-150.

2.Носктельство НВ§-антцгена на территории Восточной Спбирц/ З.А.Горхааш.Б.В.Городиский,С.И.Лещун,И.А.Королева к др.// Ьплдо-к20л0гвя,клшш:а, диагностика к профилактика антропонозних к зоо-нознше инфекций: Материалы конференции.-Астрахань.-1982.-С.33-35.

3.Лаппн H.H., Лещук С.И. Охрана материнства к детства в связи с проблемой вирусного гепатита на Западном участке БАМ// Человек

и природа на BAUo; Маторзаш 1У Всесоюзной конф.,T.I,-Новосибирск, 1934.1сЛ02-103.

4.Носцтсльство HBg-аитигена у детой// И.А.Королева, С. К.Лецук, 0.Т.Козлова,Л.0.Полякова к др.//Респуб.сб.науч.трудов,-Свердловск, НИК вирусках ЕИфокц2й,-1935,-С.104-107.

5.Антитела а дэльта-анткгену у "бессггяггоыных" носителей HBgAo /С.О.Вссов,С.Л.Чзрновзцгий,6.Г.Вазихова,С.К.Лоцук с др.// Бкрусные гепатиты: Сб.нау^.трудов кн-та Вирусологии га.Д.И.Ивановсиого,-1.1.,1935.-С.00-93.

6.Лщук С.И. Сравнительная характвркстпза »лзтодоз лабораторной дпхгносткгл (ВИЗ® s РОПГА) при гопаткте В //Здоровье населения Иргутсггой области: Тез.докя.иауч.практ.конф.-Иркутск, 1988.-СЛ66-157.

С.И. Иаутаивз природы иокоторьк кеспощфгсвсквх реакций nps соиструтзровгнга ератроцотарньк днагностккуыов для "определился НЗд-слтпгснг/УЕлзк.Вопросы вкрусолоп:я.-1938. —1.--6.-С.722-725.

8.Игядуностялудлруп5И9 я пммуноадъювантные свойства сополимеров 5-нзопропэннлтвтраэола п ^-вшилпирролидона/В.В.Ашзнков, Н.М.БоЯко,С.Й.Лещук,В.А.Круглова и др.У/IX Всесоюзный спшгозяуы по целенаправленному изыскании лекарственных веществ; Тез.докладов/22-24 января 1991,Рига.-1991.-С.50.

Отпечатано э Глазковской типография. Тирад..;;.......Ьаказ 3.."-IV......