Способы повышения эффективности эритроцитарных диагностикумов для оценки иммунореактивности организма в реакции пассивной гемагглютинации

Сердюк, Людмила Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Способы повышения эффективности эритроцитарных диагностикумов для оценки иммунореактивности организма в реакции пассивной гемагглютинации
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Способы повышения эффективности эритроцитарных диагностикумов для оценки иммунореактивности организма в реакции пассивной гемагглютинации"

На правах рукописи

СЕРДЮК Людмила Викторовна

4844307

СПОСОБЫ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЭРИТРОЦИТ АРНЫХ ДИАГНОСТИКУМОВ ДЛЯ ОЦЕНКИ ИММУНОРЕАКТИВНОСТИ ОРГАНИЗМА В РЕАКЦИИ ПАССИВНОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 1 ДПР 2011

Улан-Удэ-2011 г.

4844307

Работа выполнена в Институте эпидемиологии и микробиологии Государственного учреждения Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека Сибирского отделения РАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Лещук Светлана Ивановна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Шантанова Лариса Николаевна

доктор медицинских наук, профессор Бодиенкова Галина Михайловна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет»

Защита состоится « 22 » апреля 2011г. в 10 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.039.02 Восточно-Сибирского государственного технологического университета по адресу: 670013, г. Улан-Удэ, ул. Ключевская, д. 40 В.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВосточноСибирского государственного технологического университета, г. Улан-Удэ, ул. Ключевская, д. 40 В.

Автореферат разослан «_21_»_марта_2011г.

Учёный секретарь

Регионального диссертационного совета, доктор технических наук,

профессор

Хамнаева Н.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

В диагностике заболеваний инфекционной и неинфекционной патологии важное место занимают качественные диагностические системы, сочетающие в себе высокую чувствительность, специфичность и простоту выполнения исследования. Следует отметить, что эти важные свойства присущи реакции пассивной гемагглютинации (РПГА), однако данной реакции часто не хватает чувствительности. Предполагается, что невысокая чувствительность тест-систем в РПГА может быть связана либо с низкой концентрацией антигена на поверхности эритроцита-носителя, либо с неполным раскрытием антигенных структур для связи с антителами (авидностью) [Патрушев Л. И., 2004]. В связи этим, особую актуальность приобретают поиски перспективных соединений, сочетающих в себе как высокую конъюгирующую активность с антигеном, так и способность обеспечивать стабильность полученного препарата.

Другим важным компонентом при конструировании тест-систем является получение контрольных высокотитражных сывороток, производство которых также зависит от наличия высокоиммуногенных комплексов антиген-адъювант [Хаитов P.M. и др., 1996; Петров Р.В., Хаитов P.M., 2003; Tagliabue A., Rappuoli R., 2008]. Спектр имеющихся качественных адъювантов в настоящее время невелик, к тому же, они, не всегда полноценно выполняя свою главную задачу - повышать иммуногенность антигена, часто обладают рядом нежелательных характеристик: вызывают аутоиммунные осложнения, образование кист, свищевых абсцессов и гранулём [Медуницин Н.В., J 993].

Всё возрастающий интерес к адъювантам на основе полимеров был обусловлен новыми открытиями в иммунологии. Интенсивное развитие органической химии в этом направлении позволило предложить исследователям широкий спектр полимерных соединений в качестве конъюгирующих компонентов и низкотоксичных адъювантов [Петров Р.В., Хаитов P.M., Атаулла-ханов Р.И., 1993].

Комплексирование синтетических полимеров с вирусными или бактериальными антигенами позволяло существенно усилить их иммунизирующие свойства [Хаитов P.M., Зверев В.В. и др., 2005]. При конъюгировании с полимерами, выполняющими роль биологически активного иммуноадъюванта, слабо антигенные белки различного происхождения превращаются в высоко иммуногенные препараты, что позволяет резко снизить иммунизирующие дозы антигена [Krupers M.J., Van Der Gaag FJ., Feijen J., 1996]. Имеющиеся достижения в области синтеза полимерных структур [Allcock Н., 1990; Ап-nenkov V.V.et al., 2001; Анненков В.В., 2002], способных прочно связываться с белком (антигеном), весьма актуальны, поскольку они дают перспективу создания нового класса иммунодиагностикумов для РПГА, отвечающих современным требованиям.

Цель исследования:

Определение оптимальных условий и способов повышения функциональной активности эритроцитарных диагностикумов, используемых в РПГА для оценки общей иммунореактивности организма.

В соответствии с целью решались следующие задачи:

1. Подобрать эффективный метод извлечения специфических антигенов из культуральной биомассы бактерий для использования их в качестве компонентов диагностических систем;

2. Провести сравнительную оценку функциональной активности разных фракций микробных клеток бифидобактерий в технологии получения эритроцитарных диагностикумов;

3. Оценить конъюгирующие свойства «синтетических полимеров» с бактериальными антигенами при изготовлении эритроцитарных диагностикумов (ЭД) для РПГА;

4. Оценить адъювантную активность «синтетических полимеров» в сочетании с микробными антигенами;

5. С помощью разработанных ЭД исследовать иммунореактивность организма человека к симбионтной микрофлоре по уровню специфических антител в биологических субстратах организма (сыворотки крови, копрологи-ческие пробы).

Положения, выносимые на защиту

1. Конструирование эритроцитарных диагностических систем с помощью конъюгирующих компонентов (синтетических полимеров ПВИ, ПМАК и АК-ВИ) и антигенов фракции клеточных стенок бактерий позволяет улучшить качественные характеристики диагностикумов: чувствительность, специфичность, стабильность и воспроизводимость результатов;

2. Подобранные оптимальные концентрации полимеров (ПВИ, ПМАК и АК-ВИ) в комплексе с антигенами значительно повышают иммуногенную активность, что делает их перспективными в качестве адъювантов при получении высокотитражных сывороток, используемых для контроля эритроцитарных диагностикумов;

3. Высокая чувствительность и специфичность усовершенствованных эритроцитарных диагностикумов позволяет изучать особенности микробной экологии человека в современных условиях по уровню иммунореактивности макроорганизма к симбионтной микрофлоре.

Научная новизна

Осуществлена научно-методическая разработка технологии конструирования эритроцитарных диагностических систем с помощью новых конъюгирующих компонентов и высокоактивных белковых фракций, способствующих повышению их функциональной активности: чувствительности, специфичности и стабильности. Показана возможность создания узкоспецифичных (видовых) иммунодиагностикумов для оценки иммунореактивности организма к разным видам бифидобактерий. С помощью эритроцитарных диагностикумов отработан метод изучения локального иммунитета организма

человека по уровню интестинальных антител к бифидобактериям в копро-фильтратах. Показана возможность оценки специфической и неспецифической иммунорезистентности по уровню антител к симбионтной микрофлоре - нетоксигеннным коринебактериям дифтерии.

Теоретическая значимость

1. Научно обоснована и экспериментально доказана принципиальная возможность совершенствования технологии конструирования иммунодиаг-ностикумов для РПГА на основе комплексов бактериальных антигенов с водорастворимыми полимерами-конъюгатами;

2. Доказана перспектива применения водорастворимых полимеров (ПВИ, АК-ВИ, ПМАК) в качестве адъювантов в составе современных вакцинных препаратов.

Практическая значимость

1. Эритроцитарная иммунодиагностическая система для оценки специфической и неспецифической иммунорезистентности населения по уровню антибактериальных антител была апробирована в практическом здравоохранении (инновационный проект 2005-2006 «Внедрение нового иммунодиагно-стикума для оценки антибактериального противодифтерийного иммунитета с целью предупреждения заболеваний (вспышек) дифтерии у населения Иркутской области);

2. С помощью диагностических тест-систем в РПГА по концентрации антител определяется уровень реактивности организма к представителям симбионтной микрофлоры (бифидобактериям) кишечника на видовом уровне, что даёт дополнительную информацию о состоянии микроэкологического статуса организма (популяции);

3. Неинвазивный метод исследования локального иммунитета организма к симбионтной микрофлоре по уровню антител в копропробах позволяет расширить диагностику микроэкологического статуса у детей и взрослых. Оформляется медицинская технология по оценке системного и локального иммунитета к индигенной микрофлоре;

4. Материалы выполненных исследований легли в основу четырёх патентов РФ на изобретение: Патент РФ №2142807; Патент РФ №2205408(72); Патент РФ.№ 220280; Per. заявка № 2009144839(РФ);

5. Усовершенствованные эритроцитарные иммунодиагностикумы используются в практической деятельности института эпидемиологии и микробиологии и гастроэнтерологического отделения клиники НЦ ПЗСРЧ СО РАМН, материалы диссертации внедрены в учебный процесс ИГУ.

Апробация материалов диссертации

1998); На VIII Съезде Всеросс. Общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, (Москва, 2002); II научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера. Новые технологии в медицине», (Новосибирск, 2002); Международной научно-практической конференции «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования, (Москва, 2002); Российской научно-практической конференции «Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно - Сибирском регионе», (Иркутск, 2002); Международной конференции: «Пробио-тики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания», (Москва, 2004); Международных научно-практических конференциях «Актуальные проблемы права, экономики и управления в Сибирском регионе», (Иркутск, 2005, 2008); Межрегиональной научно-практической конференции «Итоги, проблемы и перспективы государственной санитарно-эпидемиологической службы Иркутской области», (Иркутск, 2007); Форуме «Роснанотех», (декабрь 2008, Москва).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 37 работ, в том числе в изданиях, рекомендованных ВАК, одиннадцать. Материалы исследований защищены четырьмя патентами.

Личный вклад автора

Автором проведен анализ научной литературы по данной проблеме, поставлена цель, сформулированы задачи исследования. Выполнены иммунологические, микробиологические, физико-химические исследования, а также все этапы конструирования эритроцитарных диагностикумов с последующим анализом материала на основе статистической обработки. Экспериментальный материал обобщен и изложен в публикациях. Осуществлено оформление диссертационной работы. Личный вклад автора составляет 80%.

Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», двух глав собственных исследований, главы «Обсуждение результатов», выводов, практических рекомендаций и списка цитированной литературы. Работа изложена на 150 страницах машинописного текста, включает 12 таблиц, 22 рисунка. Библиографический указатель включает 173 работы, из них отечественных 142 и 31 зарубежных.

Благодарность. Автор выражает искреннюю признательность за консультативную и практическую помощь в выполнении всех разделов диссертационной работы и особенно разделов, касающихся изучения популяцион-ного иммунитета населения, заведующей лабораторией микроэкологии Института эпидемиологии и микробиологии НЦ ПЗСРЧ СО РАМН, д.б.н. Софии Марковне Попковой.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объектов изучения были использованы:

Микроорганизмы. Эталонные штаммы бифидобактерий: Bifidobacterium bifidum 791, Bifidobacterium longum В 4a 200, Bifidobacterium adolescentis MC-4; 3 штамма бифидобактерий, относящиеся к двум видам: Bifidobacterium bifidum (штамм № 791 БАГ и штамм 8-3) и Bifidobacterium longum, выделенные из препарата «Бифидум № 791 БАГ» (Производитель: ДГУ ЭПП "Вектор-БиАльгам" ГНЦ ВБ "Вектор", г. Новосибирск); клеточные фракции бифидобактерий; фракция клеточных стенок нетоксигенных кори-небактерий дифтерии (вакцина Кодивак, производства МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, автор вакцины д.б.н. Е.А. Шмелева).

Адъюванты и конъюгирующие компоненты. Полный адъювант Фрейнда, гидрохинон, хром хлористый (СгС13), синтетические полимеры и полимерные комплексы. Сополимер акриловой кислоты и винилимидазола (АК - ВИ), поливинилимидазол (ПВИ), полиметакриловая кислота (ПМАК) получены в Иркутском лимнологическом институте СО РАН (ст.н.с., д.х.н., Анненков В.В.).

Эритроциты. При конструировании иммунодиагностикумов применялись формалинизированные эритроциты барана (ЭБ).

Экспериментальные животные. Беспородные кролики, были приобретены в племенном хозяйстве Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» (г.Новосибирск). В исследованиях использовались кролики-самцы (всего 25 голов весом 3 - 3,5кг.) с целью изучения адъ-ювантных свойств полимеров и получения гипериммунных сывороток, используемых в качестве контроля.

Эксперименты с мышами проводили на базе вивария НИИ Биофизики (ГОУ ВПО АГТА), имеющего в настоящее время ветеринарное удостоверение 238№ 0018304 от 07.09.2009. Мыши-самцы весом 25г (520 гол.) использовались при изучении иммуногенности клеточных фракций бифидобактерий и для получения гипериммунных сывороток.

Образцы крови людей и животных, копрологические пробы

• Сыворотки крови детей и взрослых, проживающих в гг. Ангарске (взрослые — 193 сыворотки, дети - 33), в Иркутске (взрослые - 430 сывороток, дети (от 1 года до 17 лет) - 200 сыв.), в Усолье-Сибирское (взрослые -200 сывороток, дети -150), пос. Тыреть (школьники - 182 сыворотки), обследованных в рамках основных планов НИР НЦ ПЗСРЧ;

• Сыворотки крови детей и взрослых гг.Балей (143 чел.) и Краснока-менск (78 чел.);

•Копропробы от детей и взрослых лиц - пациентов клиники НЦПЗСРЧ (200 проб);

• Сыворотки иммунизированных животных при изучении иммуноадъю-вантных свойств полимеров и иммуногенности клеточных фракций бифидобактерий, гипериммунные сыворотки для контроля диагностикумов.

Методы исследования:

В соответствии с целью и задачами работы выполнен комплекс исследований:

•физико-химических (дезинтеграция микробной массы для получения антигена, электрофоретическое разделение белков, аминокислотный анализ);

•иммунологических (РПГА, иммунизация животных, фиксация эритроцитов, постановка теста на токсичность (ЬО50);

•микробиологических (культивирование микроорганизмов, получение микробной массы);

• статистических.

Фиксация эритроцитов. Для приготовления эритроцитарных диагностических препаратов использовали эритроциты барана, формалинизирован-ные по методу \УетЬасИ К. (1959).

Конструирование эритроцитарных иммунодиагностикумов. Эритро-цитарные иммунодиагностикумы по определению антител к бифидобактери-ям и коринебактериям дифтерии готовили по оригинальной методике, использовали в качестве связующего звена (конъюгата) неприродные полимеры: поливинилимидазол (ПВИ), полиметакриловую кислоту (ПМАК) и сополимер акриловой кислоты и винилимидазола (АК - ВИ), а также гидрохинон и СгСЬ. При изготовлении иммунодиагностикумов формалинизированные и конъюгированные эритроциты барана сенсибилизировали антигенами клеточных фракций В. Ъ'фйит,, В. 1ощит, В. ас1п!ехсепИх, антигенами штаммов В. ЫАйит (№ 791 БАГ и 8-3 ) и В. 1оп£ит, выделенными из препарата «Бифи-дум № 791 БАГ», антигенами клеточных фракций нетоксигенных коринебак-терий дифтерии (вакцина «Кодивак») Всего было приготовлено и испытано 33 серии антигенных эритроцитарных диагностикумов.

Иммунологические (серологические) методы исследований. Антибактериальные антитела к бифидобактериям и нетоксигенным коринебактериям дифтерии определяли методом РПГА с помощью соответствующих антигенных эритроцитарных диагностикумов (ЭД) по стандартной схеме. Результаты реакции учитывали по 4-х плюсовой системе в зависимости от формы осадка в лунке. За титр сыворотки принимали последнее разведение сыворотки, в котором имелась положительная реакция на 2 плюса.

Микробиологические методы (посевы, культивирование микро- организмов, получение микробной массы, идентификация). Бифидобакте-рии культивировали на полужидкой питательной среде. Сухие эталонные штаммы бифидобактерий В. Ы/Ыит, В longum, В. ас1о1е.чсе>и1.ч разводили дистиллированной водой из расчета 1 доза — 1 мл, коммерческий препарат жидкий «Бифидум № 791 БАГ» использовали цельным. Посев бифидобактерий производили в полужидкую среду Блаурокка глубинно, по 1 мл бактериальной взвеси в пробирку. Культуру подращивали 48 - 72 часа при 37°С в анаэробных условиях. Микробную массу осаждали мягким центрифугированием (по 10 мин трижды, 3000 об/мин), из осадка делали взвесь по стандарту мутности до 10 кп/мл. Использовали при иммунизации животных и изготовлении тест-систем.

Иммунизация животных (получение нммунных сывороток, тест на токсичность: LD50). Для получения гипериммунных сывороток, содержащих антитела к бифидобактериям, иммунизировали кроликов по схеме: 1 раз в неделю, в течение 4-х недель, подкожно, используя для введения в качестве антигенов штаммы бифидобактерий B.bifidum, В longum, B.adolescentis и штаммы В. bifidum (№ 791 БАГ и 8-3 ) и В. longum, выделенные из препарата «Бифидум № 791 БАГ», (из расчета 109клеток/мл), а в качестве адъювантов -синтетические полимеры ПВИ, ПМАК и АК-ВИ в концентрациях от 0,02 до 0,6 мкг/мл, что в тысячи раз меньше условной токсической дозы при определении LD50. Проводя тест на мышах, мы от опыта к опыту увеличивали концентрацию полимеров, доведя её до 500 мкг/мл, когда растворенные полимеры имели гелеобразный вид и с трудом вводились шприцем. Однако и эта доза оказалась не смертельной для мышей, но была принята токсичной условно, так как растворы с большими дозами полимеров шприцем набрать было невозможно. Исходя из этого, был сделан вывод об отсутствии токсичности данных полимеров.

С целью получения гипериммунных сывороток, содержащих антитела к нетоксигенным коринебактериям дифтерии (НКД), проводили иммунизацию кроликов вакциной «Кодивак», содержащей стенки НКД, по такой же схеме, применяя в качестве адъюванта полимер ПВИ. Для испытания адъювантных свойств различных полимеров и иммуногенности клеточных фракций использовали мышей-самцов. В качестве антигенов использовали клеточные фракции штаммов В. bifidum (№ 791 БАГ и 8-3) и В. longum, вакцину «Кодивак», содержащую стенки НКД(64кД), а также клеточные фракции эталонных штаммов В. bifidum, В. longum, В. adolescentis, в качестве адъювантов применяли водорастворимые полимеры: АК-ВИ, ПВИ, ПМАК.

Статистические методы. Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ «Excel» и "Statgrafics". Выводы сделаны при вероятности безошибочного прогноза Р<0,95. Статистическую обработку данных по определению концентрации белка по Лоури в клеточных фракциях бифидобактерий проводили с использованием программы GRAPH PAD ТМ GOPYRIGHT 1995, 1997 BY H.J. MOTULSKY, RJ'AABW, коэффициент корреляции составил 0, 9921.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выбор антигена при конструировании эритроцитарных диагно-стикумов

Важное значение при конструировании ЭД имеет подбор качественного антигена. При поиске более функционально активного антигена, чем целые бактериальные клетки, в работе были испытаны две фракции клеток бифидобактерий: фракция клеточных стенок (ФКС) и цитоплазматическая фракция (ЦПФ), полученные путём двукратной дезинтеграции микробной массы на ультразвуковом дезинтеграторе UD- 20 (Польша), в течение 2 мин при 4° С. Фракции испытывались на иммуногенность при вакцинации животных и в качестве сенситинов при конструировании иммунодиагностикумов. Исследован их белковый спектр (рис.1) и аминокислотный состав.

1II ! ) 11

99Э <3 03 Я РЗ ООО ¿А -М -К

«о ^ «л ■ч- и-» -Ч" т -ч- т

Рис.1. 1)08-Ма электрофорез клеточных фракций бифидобактерий по Лэммли.

1.ФКС, 2. ЦПФ.

По результатам электрофореза, фракция клеточных стенок представлена более широким спектром белковых субъединиц с молекулярными массами от 44,2 кД до 125 кД. В белковом спектре ЦПФ отсутствовали белковые субъединицы с высокими и средними молекулярными массами, характерными для ФКС.

Изучение аминокислотного состава образцов клеточных фракций бифидобактерий позволило охарактеризовать белки и пептидосодержащие структуры клеточных фракций бифидобактерий по молярному соотношению аминокислот.

На рисунке 2. представлены сравнительные результаты испытаний бактериальных фракций в диагностикумах при выявлении специфических антител в сыворотках крови иммунизированных животных.

6 7 8 9 номера сывороток

Рис.2. Сравнительная характеристика диагностикумов на основе антигенов клеточных фракций бифидобактерий с применением сополимера АК-ВИ (0,8мкг/мл).

Иммунодиагностикум, приготовленный на основе цитоплазматической фракции бифидобактерий, продемонстрировал либо отрицательные результаты (отсутствие специфических антител), либо довольно низкие показатели (средний 1о§2 титров 2,5) Тогда как ЭД на основе антигенов ФКС зафиксировал в этих же образцах сывороток как наличие антител, так и более высокие их концентрации (средний 1о§2 титров 3,86), что характеризует его как более чувствительный. Таким образом, фракция клеточных стенок была отобрана как наиболее перспективная, что обусловлено особенностями белкового и аминокислотного состава, и использовалась в дальнейшей работе.

2. Оценка конъгогирующих свойств неприродных полимеров

Высокая специфичность реакции пассивной гемагглютинации не вызывает сомнений, является простым и дешевым методом исследования, не требующим специального оборудования. Применение синтетических полиме-ров-конъюгатов имело цель повысить чувствительность эритроцитарных ди-агностикумов в РПГА и упростить технологию их приготовления.

Отмечено, что многие синтетические полимеры при взаимодействии с биологическими объектами образуют равновесные комплексные соединения. Макромолекула за относительно короткий промежуток времени перебирает множество партнеров для взаимодействия и находит локальный энергетический минимум, что делает этот процесс менее зависимым от случайных колебаний внешних факторов. Полимеры с активными функциональными группами способны образовывать интерполимерные комплексы с белковыми макромолекулами путем множественных водородных и ионных связей. Учитывая высокую активность полимеров во взаимодействиях с белковыми объектами, была использована возможность их применения в качестве связующих агентов при конструировании эритроцитарных диагностикумов.

Предварительный анализ исследований показал, что перспективными кандидатами на роль коньюгатов могут быть синтетические водорастворимые полимеры: поливинилимидазол (ПВИ), полиметакриловая кислота (ПМАК), акриловая кислота - винилимидазол (АК-ВИ). Структура этих полимеров в той или иной степени обеспечивала необходимые свойства: способность образовывать устойчивые биокомплексы и при этом сохранять структуру антигена.

В связи с этим нами были испытаны варианты эритроцитарных диагностикумов с различными конъюгирующими полимерами данного класса. Для сравнения испытывались контрольные образцы, изготовленные на основе традиционных коньюгатов: гидрохинона в стандартной концентрации (0,43%) и СгС13 (0,3%) (табл.1).

Таблица 1

Чувствительность эритроцитарных шшунодиагностикумов на основе антигенов бифидобактерий в зависимости от вида коньюгирующего компонента

Связующий компонент Титры антибактериальных антител в РПГА

1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256

ПВИ (0,01мкг/мл) ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +/- +/-

АК-ВИ (0,8 мкг/мл) ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ -

ПМАК (0,8 мкг/мл) ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +/- -

Гидрохинон (0,43%) ++++ ++++ +/- - - - - -

СгСЬ (0,3%) ++++ ++++ ++++ ++++ - ■

Из таблицы 1 видно, что синтетические полимеры в комплексе с антигеном более активно сенсибилизируют эритроциты, чем гидрохинон и СгС13, что проявляется при испытании в РИГА более высокими титрами антител (1:64-1:128).

Результаты сравнения свидетельствуют, что выявляемость антител с помощью ЭД, приготовленных с применением слабых полимерных кислот в качестве конъюгатов, в 8-10 раз и более выше по сравнению с ЭД, приготовленными с конъюгатами СгС13 (0,3%) и гидрохинон (0,43%).

Таким образом, были отработаны характеристики всех компонентов и режимы разрабатываемых тест-систем. На рис.3 представлены фото эритроцита - носителя антигена на разных этапах конструирования диагностической системы.

А Б В

Рис.3. Этапы сенсибилизации эритроцитов барана. Микрофотографии исходного эритроцита (А), эритроцита после конъюгации с полимером (Б) и эритроцита в диагности-куме (В). Масштаб - 1 мкм (электронное микроскопирование, автор Анненков В.В.).

3. Оценка адъювантной активности неприродных полимеров

Для контроля специфичности и чувствительности ЭД важно иметь вы-сокотитражные контрольные сыворотки с антителами к изучаемым антигенам. Следует отметить, что чистый антиген не всегда бывает высокоиммуно-генен [Лещук С.И., Анненков В.В., 2002]. Способность изучаемых полимеров к стабильной коньюгации с белком может быть использована при получении таких сывороток. Были проведены серии экспериментов по отработке оптимальной схемы иммунизации мышей вакцинным штаммом НКД с разными концентрациями полимеров (ПМАК, ПВИ, АК-ВИ) в качестве адъювантов (рис.4). Вакцинировали мышей внутрибрюшинно (0,4мл) и в подушечки лап (0,1мл). Количество вводимого антигена рассчитывали соответственно массе тела животных.

Наряду с опытными группами вводились 2 контрольные группы (в каждой группе п = 10-12 гол.): 1 группа иммунизировалась антигеном с полным адъювантом Фрейнда, 2 группа — только антигеном НКД. Как видим, наиболее высокие титры антител в РГ1ГА получены в сыворотках от животных, иммунизированных антигеном в комплексе с водорастворимым полимером-адъювантом ПВИ.

70 60 SO 40 ЗО 20 10 О

... 1 -----—,-j

н 11 -Л ____ 1! 1! и

f а

csl О

АК-В И

концентрация в мкг/мл

Рис. 4. Уровень антител к КД у мышей в зависимости от выбора адъювантов и их концентрации (Kl - антиген+ адъювант Фрейнда, К2 - антиген без адьюванта).

На основании этих данных был сделан вывод о преимуществе синтетического полимера ГТВИ, по сравнению адъювантом Фрейнда. К тому же последний, как известно, имеет массу побочных эффектов (воспаление, образование олеогранулём, индукция неспецифических антител и пр.). На рис.4 представлены результаты комплексного исследования свойств полимеров, когда сравнивали не только адъювантную активность самих полимеров, но и определяли их наиболее активные концентрации.

Согласно результатам, представленным на рис.4, полимеры ПМАК и АК-ВИ проявляли наибольшую активность в концентрации 0,6 мкг/мл, а ПВИ - 0, 02 мкг/мл, причём активность последнего превышала активность двух других, а также контролей более чем в 2 раза (р<0,05).

4. Апробация эритроцитарных диагностических систем при оценке популяционной иммунореактивности населения к симбионтной микрофлоре

В экспериментальных исследованиях высокая чувствительность и специфичность эритроцитарных диагностикумов, разработанных нами, позволяла оценить иммунореактивность макроорганизма к представителям нормальной микрофлоры (нетоксигенным коринебактериям дифтерии - НКД и би-фидобактериям).

Коринебактерии, являясь древними симбионтами открытых полостей человека, выступают в роли носителей уникальных, эволюционно сбалансированных иммуногенных стимулов, поддерживающих уровень неспецифической резистентности, и способствуют формированию микроценотических сообществ человека в рамках нормального биологического и физиологического явления. По уровню естественных антибактериальных антител к нетоксигенным коринебактериям дифтерии можно судить об общем уровне иммуноре-зистентности организма. Низкий уровень антител к НКД говорит о снижении как специфического, так и неспецифического иммунитета [Гевондян B.C., Шмелева Е.А., 1987; Попкова С.М., Шмелёва Е.А.,2006].

В рамках комплексного обследования нами были проведены исследования по изучению иммунного статуса «здоровых» детей в гг. Балей и Красно-каменск (Читинская обл.), население которых длительное время подверга-

лось сочетанному воздействию химического и радиационного (от 170 до 450 мкР/ч.) факторов окружающей среды, в том числе имело место превышение родона в помещениях (более 200 Бк/м^) [Рогожников В.А. и соавт., 1995].

По данным Института педиатрии и репродукции человека ВСНЦ СО РАМН (1996 г.) среди детей было отмечено увеличение неспецифических видов заболеваний, нарушений физического и нервно-психического развития, осложнений беременности у мам, врожденных пороков, гибели плода и новорожденного, более чем в 2 раза по сравнению со средними показателями по Читинской области [Муратов В.В., 1997].

Средние показатели концентрации естественных антибактериальных антител к С.сЧрЫкег1ае у населения этих городов в сравнении с данными по Иркутску, где уровень естественного радиационного фона составлял 6-26 мкР/час (Государственный доклад "О состоянии и об охране окружающей среды Иркутской области",!994-2000), представлены на рис.5.

Рис. 5. Содержание естественных антител к коринебактериям дифтерии у жителей регионов с разным уровнем техногенной нагрузки. (Балей п=143; Краснокаменск п=78; Иркутск п=430).

Было установлено, что средний уровень нормальных антител к КД у населения обследуемых городов Читинской области значительно ниже, чем у жителей Иркутской области, что свидетельствовало об очень низком уровне общей иммунорезистентности, а значит, высокой опасности заболеваний, обусловленных снижением иммунных функций организма. Эти данные коррелировали с показателями иммунного статуса обследованных лиц: индексом иммунной недостаточности (ИИН) (рис.6).

1 оо%

80%

60% 40%

20%

Иркутск Краснокаменск Балей

Рис.6. Удельный вес лиц с высоким ИИН среди детей 5-10 лет. (Балей п=110; Краснокаменск п=78; Иркутск п=148).

ИИН отражает количество иммунологических показателей индивида, имеющих достоверное отклонение от общефизиологических стандартов [Попкова С.М., 2004]. На рис.6 видно, что доля лиц, имеющих высокий ИИН, в городах Читинской области намного выше (85% и 95%), чем в Иркутске (55%), что свидетельствует об обратной взаимосвязи данных показателей с уровнем естественных антител к НКД, являющихся «иммунологическим зеркалом» [Гевондян B.C., Шмелева Е..А.,1987] общей иммунорезистентности индивида/ популяции. Таким образом, полученная тест-система была апробирована в «полевых условиях», данный способ запатентован и может быть использован в популяционных исследованиях по оценке общей иммунорезистентности населения [Ле.щук С.И., Попкова С.М.,1999]. С помощью данной тест-системы можно одновременно оценивать как специфический антибактериальный иммунитет, так и неспецифическую иммунорезистентность.

Микрофлора желудочно-кишечного гракта организма неразрывно взаимосвязана с его иммунной системой. Поскольку бифидобактерии составляют большую (90%), а значит и наиболее значимую часть микробиоценоза кишечника, мы исследовали взаимоотношения организма именно с этой группой бактерий. Иммунологическая толерантность макроорганизма по отношению к доминанте кишечного биоценоза, бифидобактериям, - эволюционно закреплённый признак. Увеличение в популяции доли лиц с высокими титрами антител к бифидобактериям свидетельствует о «срыве» иммунологической толерантности, что для отдельных индивидуумов может быть критерием риска развития устойчивого дисбактсриоза [Попкова С.М. и др., 2004; 2008]. Для выявления в сыворотках крови антител к бифидобактериям, создавались эрмтроцитарные диагностикумы на основе уже испытанных конъю-гирующих компонентов (полимеров) с введением в структуру диагностикума антигенов бифидобактерии.

В начале работы над диагностическими системами по определению антител к интестинальной микрофлоре нами отрабатывались режимы конструирования на так называемых «общих антигенах» (смеси видов и штаммов бифидобактерий из коммерческих лечебных препаратов). С их помощью нами определялась популяционная иммунореактивность к бифидофлоре в целом (без видовой идентификации) (рис.7).

Как видно, основная часть выборки (более 80%) не имела антител к бифидобактериям или имела их в очень низкой концентрации, что можно расценивать как норму.

При анализе образцов крови людей, проживающих в гг. с разным уровнем техногенной нагрузки (Ир кутск - условно «чистый» и Усолье-Сибирское - условно «грязный»), было установлено, что в Усолье-Сибирском частота встречаемости лиц (детей и взрослых) с высокими и средним уровнем антител к бифидобактериям выше, чем в г. Иркутске (рис.8).

Рис.7. Популяционная иммунореактивностъ к бифидофлоре (взрослые — 400 сыв., дети - 200 сыв.) г. Иркутск.

Рис. 8. Частота выявление лиц с высоким и средним уровнями антител к бифидобак-териям у населения гг. Иркутска (п=600) и Усолье-Сибирское (п=350).

Это обстоятельство было расценено нами как явление нарушения имму-ногомеостаза у лиц, проживающих в условиях высокого техногенного прессинга, следствием или причиной которого может быть нарушение микроэкологического баланса интестинальной микрофлоры.

Видовой состав обитающих в кишечнике бифидобактерий не однороден и возможность выявлять антитела к разным видам бифидобактерий имеет определённые перспективы. Ещё вначале 80-х годов В.И. Вершинина утверждала что: «...в белковом комплексе бифидобактерий обнаружены антигены с узкой специфичностью, которые создают основу для типирования отдельных видов и даже штаммов».

Исходя из этого, нами были изготовлены диагностические системы, где в качестве антигенов использовались фракции клеточных стенок, доминирующих в кишечном микробиоценозе видов бифидобактерий: В.Ы/1с1ит, ВЛо^ит и В.айоЫясепИ.ч (первые опытные партии ДС были изготовлены с применением первых двух видов антигенов).

Рис. 9. Возрастная иммунореактивность к разным видам бифидобактерий.

Группа «мамы-дети», 33 пары.

В результате обследования группы «мамы-дети» г. Ангарска установлено, что в сыворотках крови мам, имеющих антитела к бифидобактериям, наблюдалась более высокая иммунореактивность к виду В.Ь'ф(1ит чем к В.1оп%ит, а у их детей определялись незначительные концентрации антител к В. Ь 'ф(1ит и чуть выше к В.1оп%шп.

В случайной выборке из 6 положительных сывороток от взрослых лиц, проживающих в г. Иркутске, определена повышенная реактивность по отношению к виду В.ЫАс1ит (рис. 10).

№ сывороток

Рис.10. Уровень иммунореактивности к бифидобактериям у взрослых г. Иркутска. Случайная выборка (п=6).

В пос. Тыреть Иркутской области обследованы 182 школьника, из которых у 145 обнаружены антитела к бифидобактериям. Анализ результатов показал, что в крови данной группы наиболее высокий уровень антител регистрировался к виду В. ЫАс1ит, чуть ниже - к В. longum и самые низкие титры антител определялись к виду В. айоЫясепйь (рис. 11).

При помощи данных тест-систем были обследованы сыворотки крови от разных возрастных категорий населения гг. Ангарска (мамы и дети) (рис.9), Иркутска (взрослые) и пос. Тыреть (школьники).

В.ЬЖсЮт

дети 5-6 лет

В.1опд ит

п.Тыреть (п-182)

Рис. 11. Средний уровень титров антител к разным видам бифидобактерий.

Подсчёт частоты встречаемости высоких и средних титров к видам бифидобактерий у школьников показал, что наименьшая часть выборки имела антитела к B.longum (12±2,4%) и В.ас1о1е$сепИх (15±2,6%), а наибольшая часть (47± 3,7%) имела антитела к В.ЫАс1ит (рис.12).

B.bifidum B.adolescentis B.longum

Рис.12. Частота встречаемости высоких и средних титров к разным видам бифидобактерий у школьников п. Тыреть (п=182).

В научной литературе имеются данные, свидетельствующие о возможности изучения локального иммунитета путём исследования копрологиче-ских проб на определение антител к вирусам гепатита В, ВИЧ и энтеробакте-риям методом ИФА [Щелкунов С.Н., Саляев Р.К., Рекославская Н.И. и др., 2005; Алешукина A.B., 2006]. Иммуиореактивность организма к кишечным микробам-симбионтам является индикатором нарушений в цепочке взаимоотношений с макроорганизмом. Так называемая мукозная иммунная система является первым барьером на пути инфекционных агентов в отличие от системного иммунитета, обеспечивающего защиту внутренних органов организма. Лимфоидная ткань, расположенная в толще слизистой кишечника, принимает участие в формировании периферической толерантности, равно как и реактивности к интестинальной микрофлоре. В результате контакта с антигеном происходит запуск механизма индукции иммунного ответа на уровне

интестинального тракта и синтез антител, которые поступают не только в кровь, но и в просвет ЖКТ. В этой связи была поставлена задача: определить в кишечнике уровень антител к бифидобактериям - доминирующей группе микроорганизмов в кишечном биоценозе методом РПГА. Отработав методику подготовки копрофильтратов для постановки их в РПГА с полученными эритроцитарными диагностикумами, мы установили: 1. тест-системы отлично улавливали наличие антител в этих образцах; 2. результаты сочетались с нашими данными по системному иммунитету.

Результаты исследования копрофильтратов пациентов гастроэнтерологического отделения клиники НЦ ПЗСРЧ СО РАМН свидетельствовали, что наименьший процент выявленных высоких титров мукозных антител в выборке (п- 200) по г. Иркутску был к виду ВЛоп^ит, доля положительных проб составляла от 2% до 8%, к В.ЫАс1ит - от 17% до 42%, к В. ас1окхсеп1м до 7-8% (рис.13). 50% 45% -40% -35% -30% -25% -20% -15% -10% -5% -0% -

к В.ЫМит А1 к В. 1опдит к В. асМеэсепйв

Рис.13. Частота встречаемости высоких титров мукозных и сывороточных антител к бифидобактериям у населения г. Иркутска (п=200).

На рис. 13 для сравнения показаны результаты исследований системного и мукозного иммунитетов, которые отражают общую закономерность формирования иммунореактивности к разным видам бифидобактерий - наиболее низкий процент сывороток с высокими титрами антител определён к ВЛоп^т (от 0 до 12%), самый высокий процент - к В.Ырйит (от 17 до 47%).

Тест-система, сконструированная нами, выявила к виду В Лощит наименьшую иммунореактивность организма среди взрослого населения в разных населённых пунктах Иркутской области с различной экологической нагрузкой. Таким образом, подтверждается популяционную закономерность: к наиболее распространённому виду - наименьшая иммунореактивность организма, что согласуется с данными молекулярно-генетических исследований по региональной видовой архитектонике бифидобактерий [Ракова Е.Б., Джиоев Ю.П., Попкова С.М. и др., 2009], которые показали наибольшую распространённость в кишечнике жителей г. Иркутска вида BJongum (67,6%) (рис.14).

- копропробы дета до года

- копропробы от года до 6 лет • копропробы от 7 до 17 лет

— копропробы от 18 и старше

— в сыворотках общий список

В.1опдит В.са1епи1а1ит B.adolescentis B.b¡fidum

Рис. 14. Региональный рейтинг видовой приоритетности бифидобактерий (г. Иркутск) (п=120).

Итак, на обследованных территориях, во всех возрастных группах наиболее часто выявлялись высокие титры антител к виду В. Ы^Ыат. Высокий уровень антител к В. Ы]Ыит объясняет минорность этого вида у жителей региона и, учитывая его меньшую по сравнению с другими видами бифидобактерий устойчивость к экзогенным воздействиям, складывается вполне логичная картина видовой региональной приоритетности, согласующейся с характеристикой популяционной иммунореактивности к разным видам бифидобактерий.

Способ определения специфических антител в копрофильтратах позволяет выявлять уровень иммунореактивности макроорганизма к интестиналь-ной микрофлоре, при этом способ получения материала для исследования является, что очень важно, неинвазивным.

Разработанные эритроцитарные диагностикумы по определению антибактериальных антител к бифидобактериям имеют большие возможности при изучении иммунологической реактивности на уровне видовой специфичности микроорганизмов естественных биотопов организма человека. Подобные достаточно чувствительные и, главное, высокоспецифичные тест-системы позволят более полно осветить недостаточно еще изученные вопросы взаимоотношений макроорганизма и его индигенной микрофлоры.

ВЫВОДЫ

1. Конструирование эритроцитарных. диагностикумов на основе конъю-гирующих компонентов (синтетических полимеров) и фракции клеточных стенок бактерий позволяет улучшить функциональные характеристики диагностических систем: чувствительность (в 10 раз выше аналогичных тест -систем с традиционными конъюгатами и антигенами), специфичность, стабильность и воспроизводимость (хранение до трёх лет и более без снижения чувствительности);

что обосновывает перспективность использования полимеров в качестве им-муноадъювантов при получении высокотитражных сывороток;

3. Специфичность, чувствительность и информативность разработанных эритроцитарных иммунодиагностикумов подтверждается лабораторными и клиническими испытаниями, определившими предельный нормальный уровень иммунореактивности к бифидобактериям от нуля до 1о£2=3-4 более чему 80% обследованных;

4. Эритроцитарные диагностикумы, изготовленные на основе антигенов нетоксигенных коринебактерий дифтерии позволяют дать скрининговую оценку популяционной реактивности организма, подтверждением чего является обоснованность критерия нормы титров нормальных антител 1:8 - 1:32 (1о§2 = 3-5) более чем у 60% населения;

5. Высокая чувствительность и специфичность полученных эритроцитарных диагностикумов позволяет дифференцировать наличие антител к бифидобактериям не только на родовом, но и на видовом уровне. Диагностическая эффективность видоспецифичных тест-систем подтверждается результатами исследований системного и мукозного иммунитетов, выявивших общую закономерность формирования иммунореактивности к разным видам бифидобактерий, заключающуюся в выявлении высоких титров антител (1о§2 = 6 и выше) к В. Ь 'фйит (от 17 до 47%) и низких к В. кпщит (от 0 до 12%).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Тест-система по определению антител к нетоксигенным коринебакте-риям дифтерии может быть использована в скрининговых исследованиях при оценке популяционной иммунорезистентности;

2. Разработанный неинвазивный способ определения специфических антибактериальных антител в копрофильтратах человека по информативности не уступает исследованиям сывороток крови и может быть использован при выявлении уровня мукозных антител для последующей адекватной коррекции дисбиозов;

3. Использование узкоспецифичных (видовых) антигенов в качестве сенситинов при изготовлении ЭД позволит оценивать иммунореактивность организма в соответствии с современными требованиями.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лещук С.И., Анненков В.В., Попкова С.М., Сердюк Л.В. Способ приготовления эритроцитарного диагностикума и способ оценки иммунорезистентности организма. Патент №2142807 РФ, 23.07.1996.

2. Оценка иммунорезистентности при массовых обследованиях населения / С.И. Лещук, С.М. Попкова, Е.Л. Кичигина, Л.В. Сердюк // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 1998. - № 2. - С. 40-43.

3. Иммунологическая оценка состояния здоровья некоторых групп населения Читинской области / С.М. Попкова, С.И. Лещук, Е.Л. Кичигина, Л.В. Сердюк // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2001. -№ 4(18). - С. 41-44.

4. Дизайн эритроцитарных диагностикумов с новыми конъюгирующими компонентами, для определения антибактериальных антител / С.И. Лещук,

B.В. Анненков, Е.И. Даниловцева, Л.В. Сердюк.// Бюл. ВСНЦ СО РАМН. -2002. Т.1, №4, - С.59-62.

5. Изучение иммуногенности некоторых клеточных фракций бифидо-бактерий / С.И. Лещук, Г.В. Юринова, С.М. Попкова, Л.В. Сердюк // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2003. - №7. - С.39-41.

6. Лещук С.И, Анненков В.В., Сердюк Л.В., Шмелева Е.А.[и др.] Иммуно-адъювантная активность поли-1-винилимидазола и способ получения антител к коринебактериям дифтерии на его основе. Патент №2205408 РФ, 27.05.2003.

7. Выделение клеточных стенок бифидобактерий / Г.В. Юринова, С.М. Попкова, С.И. Лещук, Л.В. Сердюк // Бюл. ВСНЦ СО РАМН - 2003. - №7. -

C.37-39.

8. Попкова С.М., Лещук С.И., Анненков В.В., Сердюк Л.В. Способ приготовления эритроцитарного антигенного диагностикума. Патент №2202801,20.04.2003.

9. Современные подходы к конструированию препаратов в иммунотех-нологии / С.М. Попкова, С.И. Лещук, Л.В. Сердюк, В.В. Анненков // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2004. - №9. - С.50-54.

10. Дисбактериоз, как следствие нарушения иммунологической толерантности к индигенной микрофлоре / С.М. Попкова, С.И. Лещук, Е.Л. Кичи-гина, Л.В. Сердюк // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2007. - №3(приложение). -С.57-62.

11. Внедрение нового иммунодиагностикума для оценки антибактериального противодифтерийного иммунитета с целью предупреждения заболеваний (вспышек) дифтерии у населения Иркутской области (инновационный проект 2005-2006 гг.) / С.И. Лещук, С.М. Попкова, В.В. Анненков, Л.В. Сердюк // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2007. - №2. - С.80-83.

12. Сравнительная характеристика эритроцитарных иммунодиагности-кумов по определению нормальных бактериальных антител / С.М. Попкова, С.И. Лещук, В.В. Анненков, Л.В. Сердюк // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2007. -№3. - С.43-48.

13. Современные подходы к диагностике профилактике и коррекции дисбактериозов / С.М. Попкова, С.И. Лещук, Л.В. Сердюк, Ю.П. Джиоев // Вестник Российской Военно-медицинской академии. - СПб., 2008. - № 2 (22). - С.203-204.

14. Лещук С.И., Попкова С.М, Сердюк Л.В. Способ определения специфических антител в копрофильтратах. Per. заявка № 2009144839, 2.12.09.

15. Новые технологии в создании иммунодиагностикумов для РНГА / С.И. Лещук, С.М. Попкова, Л.В. Сердюк, В.В. Анненков // Современные наукоемкие технологии. - 2010. - №7. - С. 99-101.

Список условных сокращений

АК-ВИ - акриловая кислота - винилимидазол

АСИ - ализариновый синий индикатор

БСА - бычий сывороточный альбумин

ДДС-\а - додецилсульфат натрия

ДС - диагностическая система

ЖКТ - желудочно - кишечный тракт

ИИН - индекс иммунологической недостаточности

ИК - спектроскопия (ИКС) - инфракрасная спектроскопия

ИФА - иммуноферментный анализ

кД - килодальтон

НКД - нетоксигенные коринебактерии дифтерии

НКС - нормальная кроличья сыворотка

ПААГ - полиакриламидный гель

ПАФ - полный адъювант Фрейнда

ПВИ - поливинилимидазол

ПМАК - полиметакриловая кислота

РИА - радиоиммунный анализ

РПГА - реакция пассивной гемагглютинации

ТХУ - трихлоруксусна кислота

УПМ - условно патогенная микрофлора

ФКС - фракция клеточных стенок

ЦПФ - цитоплазматическая фракция

ЭБ - эритроциты барана

ЭД - эритроцитарный диагностикум

Научное издание

СЕРДЮК Людмила Викторовна

СПОСОБЫ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЭРИТРОЦИТАРНЫХ ДИАГНОСТИКУМОВ ДЛЯ ОЦЕНКИ ИММУНОРЕАКТИВНОСТИ ОРГАНИЗМА В РЕАКЦИИ ПАССИВНОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ

Автореферат

Подписано в печать 21.03.2011. Формат 60*84 1/16. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ 32

Издательство Иркутского государственного университета 664003, Иркутск, бульвар Гагарина, 36; тел. (3952) 24-14-36

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сердюк, Людмила Викторовна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Диагностические системы в иммунологии

1.2. Адъюванты, механизм действия, применение

1.3. Современные представления об иммунореактивности организма 41 к микробам-симбионтам

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1 .Объекты исследований

2.2.Методы исследований

ГЛАВА III. КОНСТРУИРОВАНИЕ ЭРИТРОЦИТАРНЫХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ СИСТЕМ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ИММУНОРЕАКТИВНОСТИ ОРГАНИЗМА К СИМБИОНТНОЙ МИКРОФЛОРЕ В РЕАКЦИИ ПАССИВНОЙ

ГЕМАГЛ ЮТИНАЦИ И

3.1.Технология изготовления антигенных эритроцитарных 68 диагностических систем

3.2. Выделение фракций бифидобактерий и оценка их функциональной активности

3.3. Испытание конъюгирующих компонентов в технологии 35 приготовления эритроцитарных диагностических систем

3.4.Получение высокотитражных иммунных сывороток для 92 проведения контроля эритроцитарных диагностикумов

3.5.0ценка активности эритроцитарных иммунодиагностикумов для 95 РПГА на основе антигенов Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis

ГЛАВА IV. АПРОБАЦИЯ ЭРИТРОЦИТАРНЫХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ СИСТЕМ ПРИ ОЦЕНКЕ

ПОПУЛЯЦИОННОЙ ИММУНОРЕАКТИВНОСТИ

НАСЕЛЕНИЯ К СИМБИОНТНОЙ МИКРОФЛОРЕ

4.1. Изучение антибактериального популяционного иммунитета по уровню антител к нетоксигенным С.сИрЫкеНае

4.2. Изучение системного и локального иммунитета по уровню антител 104 к бифидобактериям в сыворотках крови и копрофильтратах

ГЛАВА V. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Способы повышения эффективности эритроцитарных диагностикумов для оценки иммунореактивности организма в реакции пассивной гемагглютинации"

Актуальность исследования

В диагностике заболеваний инфекционной и неинфекционной патологии особое значение придаётся наличию качественных диагностических систем, сочетающих в себе высокую чувствительность, специфичность и простоту выполнения исследования. Следует отметить, что эти качества присущи реакции пассивной гемагглютинации (РПГА), которой часто не хватает чувствительности. Предполагается, что невысокая чувствительность тест-систем в РПГА может быть связана либо с низкой концентрацией антигена на поверхности эритроцита-носителя, либо с неполным раскрытием антигенных структур для связи с антителами (авидностью) [Патрушев JL И., 2004]. В связи этим, особую актуальность приобретает проблема поиска перспективных соединений, сочетающих в себе как высокую конъюгирующую активность с антигеном, так и способность обеспечивать стабильность полученного препарата.

Другим важным компонентом при конструировании тест—систем является получение контрольных высокотитражных сывороток, производство которых также зависит от наличия высокоиммуногенных комплексов антиген-адъювант [Хаитов P.M. и др., 1996; Петров Р.В., Хаитов P.M., 2003; Tagliabue A., Rappuoli R., 2008]. Спектр имеющихся качественных адъювантов в настоящее время невелик, к тому же, они, не всегда полноценно выполняя свою главную задачу — повышать иммуногенность антигена, часто обладают рядом нежелательных характеристик: вызывают аутоиммунные осложнения, образование кист, свищевых абсцессов и гранулём [Медуницин Н. В., 1993].

Комплексирование синтетических полимеров с вирусными или бактериальными антигенами позволяло существенно усилить их иммунизирующие свойства [Хаитов P.M., Зверев В.В. и др., 2005]. При конъюгировании с полимерами, выполняющими роль биологически активного иммуноадъюванта, слабо антигенные белки различного происхождения превращаются в высоко иммуногенные препараты, что позволяет резко снизить иммунизирующие дозы антигена [Krupers M.J., Van Der Gaag F.J., Feijen J., 1996]. Имеющиеся достижения в области синтеза полимерных структур [Allcock Н., 1990; Annenkov V.V.et al., 2001; Анненков В.В., 2002], способных прочно связываться с белком (антигеном), весьма актуальны, поскольку они дают перспективу создания нового класса иммунодиагностикумов для РПГА, отвечающих современным требованиям.

Цель исследования

Определить оптимальные условия и способы повышения функциональной активности эритроцитарных диагностикумов, используемых в РПГА, для оценки общей иммунореактивности организма. В соответствии с целью решались следующие задачи:

2. Провести сравнительную оценку функциональной активности разных фракций микробных клеток бифидобактерий в технологии получения ЭД;

3. Оценить конъюгирующие свойства «синтетических полимеров» с бактериальными антигенами при изготовлении эритроцитарных диагностикумов для РПГА;

4. Оценить адъювантную активность «синтетических полимеров» в сочетании с микробными антигенами;

5. С помощью разработанных ЭД исследовать иммунореактивность организма человека, к симбионтной микрофлоре по уровню специфических: антител в биологических субстратах организма (сыворотки крови,, копрологические пробы).

Научная новизна

Осуществлена научно — методическая разработка технологии конструирования эритроцитарных диагностических систем с помощью; новых конъюгирующих компонентов и высокоактивных белковых фракций, способствующих повышению их функциональной активности: чувствительности, специфичности и стабильности. • Показана возможность ' создания узкоспецифичных (видовых) иммунодиагностикумовг для оценки иммунореактивности организма к разным, видам бифидобактерий. С помощью эритроцитарных диагностикумов отработан: метод изучения локального иммунитета организма человека по уровню интестинальных антител, к; бифидобактериям в копрофильтратах. Показана) возможность оценки; специфической и неспецифической иммунорезистентности по уровню антител к симбионтной микрофлоре - нетоксигеннным коринебактериям дифтерии.

Теоретическая значимость

1. Научно - обоснована и экспериментально доказана принципиальная. возможность совершенствования: технологии! конструирования иммунодиагностикумов для РПГА на основе комплексов бактериальных антигенов^ с водорастворимыми; полимерами-конъюгатами;

2. Доказана перспектива применения водорастворимых полимеров (ПВИ, АК-ВИ, ПМАЕ) в качестве адъювантов в; составе современных вакцинных препаратов. ,

Практическая значимость

1. Эритроцитарная иммунодиагностическая система для оценки специфической и неспецифической иммунорезистентности населения по уровню антибактериальных антител к нетоксигенным коринебактериям дифтерии была апробирована в практическом здравоохранении (инновационный проект 2005-2006 «Внедрение нового иммунодиагностикума для оценки антибактериального противодифтерийного иммунитета с целью предупреждения заболеваний (вспышек) дифтерии у населения Иркутской области);

3. Неинвазивный метод исследования локального иммунитета организма к симбиотной микрофлоре по уровню антител в копропробах позволяет расширить диагностику микроэкологического статуса у детей и взрослых. Оформляется медицинская технология по оценке системного и локального иммунитета к индигенной микрофлоре;

5. Усовершенствованные эритроцитарные иммунодйагностикумы используются в практической деятельности Института эпидемиологии и микробиологии и гастроэнтерологического отделения клиники НЦ ПЗСРЧ СО РАМН, материалы диссертации внедрены в учебный процесс ИГУ на кафедре физико-химических исследований.

Положения, выносимые на защиту

2. Подобранные оптимальные концентрации полимеров (ПВИ, ПМАК и АК-ВИ) в комплексе с антигенами значительно повышают их иммуногенную активность, что делает полимеры перспективными в качестве адъювантов при получении высокотитражных сывороток, используемых для контроля эритроцитарных диагностикумов;

Апробация материалов диссертации

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Ассамблее «Здоровье человека в Сибири», (Новосибирск, 1994); Научной конференции с международным участием: «Экология и общественное здоровье», (Новокузнецк 1994); Научно-практической конференции «Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных гепататов и инфекций управляемых специфическими средствами профилактики», (Пермь 1998); На VIII Съезде Всеросс. Общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, (Москва, 2002); II научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера. Новые технологии в медицине», (Новосибирск, 2002); Международной научно-практической конференции «Пробиотические микроорганизмы — современное состояние вопроса и перспективы использования, (Москва, 2002); Российской научно-практической конференции «Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно - Сибирском регионе», (Иркутск, 2002); Международной конференции: «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания», (Москва, 2004); Международных, научно-практических конференциях «Актуальные проблемы права, экономики и управления в Сибирском регионе», (Иркутск, 2005, 2008); Межрегиональной научно-практической конференции «Итоги, проблемы и перспективы государственной санитарно-эпидемиологической службы Иркутской области», (Иркутск, 2007); Форуме «Роснанотех», (декабрь 2008, Москва).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 37 работ, в том числе в изданиях, рекомедованных ВАК, 11. Материалы исследований защищены четырьмя патентами.

Структура и объём диссертации

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Сердюк, Людмила Викторовна

выводы

1. Конструирование эритроцитарных диагностикумов на основе конъюги-рующих компонентов (синтетических полимеров) и фракции клеточных стенок бактерий позволяет улучшить функциональные характеристики диагностических систем: чувствительность (в 10 раз выше аналогичных тест - систем с традиционными конъюгатами и антигенами), специфичность, стабильность и воспроизводимость (хранение до трёх лет и более без снижения чувствительности);

2. Эффективное комплексообразование водорастворимых синтетических полимеров с белками (антигенами) повышает иммуногенность антигенов по сравнению с классическим адъювантом Фрейнда более чем в 2 раза (р<0,05), что обосновывает перспективность использования полимеров в качестве им-муноадъювантов при получении высокотитражных сывороток;

3. Специфичность, чувствительность и информативность разработанных эритроцитарных иммунодиагностикумов подтверждается лабораторными и клиническими испытаниями, определившими предельный нормальный уровень иммунореактивности к бифидобактериям от нуля до log2=3-4 более чем у 80% обследованных;

4. Эритроцитарные диагностикумы, изготовленные на основе антигенов не-токсигенных коринебактерий дифтерии позволяют давать скрининговую оценку популяционной реактивности организма, подтверждением чего является обоснованность критерия нормы титров нормальных антител 1:8 — 1:32 (log2 = 3-5) более чем у 60% населения;

5. Высокая чувствительность и специфичность полученных эритроцитарных диагностикумов позволяет дифференцировать наличие антител к бифидобактериям не только на родовом, но и на видовом уровне. Диагностическая эффективность видоспецифичных тест-систем подтверждается результатами исследований системного и мукозного иммунитетов, выявивших общую закономерность формирования иммунореактивности к разным видам бифидобактерий, заключающуюся в выявлении высоких титров антител (1о§2 = 6 и выше) чаще к В. Ьфйит (от 17 до 47%) и реже к ВЛоп^т (от 0 до 12%).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Тест-система по определению антител к нетоксигенным коринебактериям дифтерии может быть использована в скрининговых исследованиях при оценке популяционной иммунорезистентности;

3. Использование узкоспецифичных (видовых) антигенов в качестве сенси-тинов при изготовлении ЭД позволит оценивать иммунореактивность организма в соответствии с современными требованиями.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сердюк, Людмила Викторовна, Улан-Удэ

1. Авдеева Ж.И., Акользина С.Е., Алпатова H.A. и др.// Цитокины и воспаление—2007.-Т. 6.-№ 2. -С.46-50.

2. Аковбян В.А., Дмитриев Г.А. Эволюция лабораторной диагностики сифилиса: Комментарии к Приказу Минздрава РФ № 87 от 26.03.01 г. «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса» // Здравоохранение. -2001. -№6. -С.103-106.

3. Алешукина A.B. Способ диагностики выраженности дисбактериоза кишечника // Патент № 2338197, 2006.

4. Андронова Т.А., Пинегин Б.В. Мурамилпептиды — иммунотропные лекарственные средства нового поколения //Медицинская картотека—1999.— №3.

5. Анненков В.В., Даниловцева E.H., Михалева А.И. Синтез и свойства сополимеров 1-винил-4,5,6,7-тетрагидроиндола с малеиновой кислотой // Высокомол. Соед. Сер. Б. -1998. Т.40, №2. -С.366-368.

6. Анненков В.В., Круглова В.А., Мазяр Н.Л. Применение теории «эффекта соседа» в потенциометрическом титровании полиэлектролитов // Высокомол. Соед. Сер. А. -1998. -Т.40, №3. -С.466-471.

7. Анненков В.В., Мазяр Н.Л., Круглова В.А. и др. Взаимодействие бычьего сывороточного альбумина с поли-Ы-винилазолами// Высокомол. соед. — Сер. А. -2000. -Т. 42, №11. — С. 1804-1810.

8. Барановский А.Ю., Кондрашина З.А. Дисбактериоз и дисбиоз кишечника. -С-Пб., 2000. -24 с.

9. Бароян О.В., Лепин П. А. Эпидемиологические аспекты современной иммунологии. М.: Медицина, 1972. - 265 с.

10. Басова H.H. Системы серологических реакций, основанных на феномене гемагглютинации // Матер. Всероссийской н-п конф. Пермь, 1993. -С.26-27.

11. Берестецкая Т.З. Водорастворимые полимеры и их применение. // Тезисы докл. III Всерос.конф. -Иркутск, 1987. -С.12.

12. Билибин А.Ф. Проблема дисбактериоза в клинике // Терапевтический архив. -1967. -№11- С. 21-28.

13. Большаков А.М, Осипова В.Н., Романовская Е.Ю. и др. Оценка риска влияния загрязнения атмосферного воздуха бензолом на здоровье населения // Гигиена и санитария. —2000. -№6. -С.24-28.

14. Бондаренко В.М., Петровская В.Г. Ранние этапы развития инфекционного процесса и двойственная роль нормальной микрофлоры // Вестн. РАМН. -1997.-№3.-С.7-10 .

15. Бочков И.А., Овчарова Н.М. Бактериальная колонизация и сукцессия у новорожденных детей в аспекте проблемы госпитальных инфекций // Журн. эпидемиол. -1991. -№ 8. -С. 71-75.

16. Вавилова В.П., Черных Н.С., Перевощикова Н.К. Профилактика нарушений местных факторов защиты у детей в экологически неблагоприятных условиях. Экологические и гигиенические проблемы педиатрии // Материалы III конгресса педиатров России. -М., 1998. С. 65

17. Верткий А.Л. Фармакотерапия дисбактериоза кишечника // Мед. картотека. -1998.-№ 8.-С. 26-31.

18. Вершинина В.И. Характеристика растворимых антигенов бифидобактерий // ЖМЭИ. -1981. -№2. -С.81-83.

19. Воеводин Д.А., Розанова Г.Н., Стенина М.А. и др. Роль дисбактериоза в формировании хронической неинфекционной патологии у детей // Журн. Микробиол. 2001. - № 6. - С. 88-93.

20. Воробьев A.A., Бондаренко В.М., Шендеров Б.А. и др. Дисбактериозы -актуальная проблема медицины // Вестник РАМН. — 1997. -№ 3. С. 4 - 7.

21. Гарсон Н., Гольдман М. Вакцины во всей их мощи // В мире науки. -2009. -№12. -С.45-51.

22. Гевондян B.C., Шишков В.П., Шмелева Е.А. / Способ определения иммунореактивности животных, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота: A.C. № 1320930 от 1.03.87. / (СССР).

23. Грачева Н.М. Дисбактериозы и суперинфекции, причины их возникновения, диагностика, лечение // Лечащий врач. — 1998. С. 18-21.

24. Даутов Ф.Ф., Яруллин А.Х., Гончаров А.Г. и др. Заболеваемость детей, проживающих в районах с разным уровнем загрязнения атмосферного воздуха // Гигиена и санитария. 1998. -№11. -С. 3-5.

25. Даниловцева E.H., Анненков В.В., Михалева А.И. и др. Сополимеры 1-винилимидазола и акриловой кислоты для биосепарации //Высокомолекулярные соединения. — Серия А. —2004. —Т.46, №2. С.1-6.

26. Денисова Т.Г. Эритроцитарные реагенты в иммунодиагностике сальмонеллезов: Автореф. дисс. . канд. мед. наук-Алматы, 1993. -24с.

27. Дерябин П.Н. Совершенствование иммунодиагностики гнойно-воспалительных и септических заболеваний при помощи новых эритроцитарных реагентов: Автореф. дисс. .докт. мед. наук. Алма-Ата, 1992. -42 с.

28. Додина Л.Г. К проблеме влияния атмосферного загрязнения на состояние здоровья населения // Гигиена и санитария. -1999. -№3. -С.9-13.

29. Дудникова Э.В. Современный взгляд на кишечный дисбактериоз у детей // Южно-Российский медицинский журнал. 2002. —№ 2.

30. Жуматов К.Х., Багашева С.С. Способ приготовления антительных эритроцитарных диагностикумов для индикации вирусов // Вопросы вирусологии.- 1995. №5. - С.235-237.

31. Зезин А.Б. Полиакриловая кислота // Химическая энциклопедия. — М.: «Большая российская энциклопедия», 1992. Т.З. - С.602.

32. Ипатова М.Г., Шумилов П.В., Мухина Ю.Г. и др. Дисрегуляция иммунного ответа на индигенную микрофлору у детей и подростков с воспалительными заболеваниями кишечника // Педиатрия. — 2010. -Т.89, №2. — С. 45-49.

33. Кабанов В.А. Интерполимерные комплексы нуклеиновых кислот как средство доставки генетического материала в клетку // Высокомол. Соед. Сер. А. -1994. -Т.36, №2. -С.198-211.

34. Кабанов В.А. Физико-химические основы и перспективы применения растворимых гентерополимерных комплексов // Высокомол. Соед. 1994. -Т.36, №2. - С.183-197.

35. Кабанов В.А., Петров Р.В., Хаитов Р.Н. Искусственные антигены и вакцины на основе неприродных электролитов // Итоги науки и техники. Иммунология. -М.: ВИНИТИ, 1998. -Т.13. С.6-53.

36. Казначеев В.П. Очерки теории и практики экологии человека. М., 1983. -146 с.

37. Калиакбарова Г.Т. Особенности иммунного статуса жителей отдельных естественных и техногенных биогеохимических провинций Казахстана: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Алма-Ата, 1991. -21с.

38. Каральник Б.В. Варианты реакции агглютинации: настоящее и будущее // ЖМЭИ.-1989. №8. - С.84-89.

39. Каральник Б.В. Научные основы изготовления эритроцитарных диагностикумов. // Ж.микробиол. —1977. —№4. -С.29.

40. Каральник Б.В. Эритроцитарные реагенты в клинической иммунологии // Иммунология. 1995. —№ 6. - С. 4- 6.

41. Каральник Б.В., Царевский Ю.П., Шамардин В.А. Приготовление антительных диагностикумов с помощью амидола // Эритроцитарные белковые диагностикумы. Алма-Ата, 1982. — С.82-84.

42. Кижняев В.Н. Поливинилтетразолы. Синтез и свойства: дис. .докт. хим. наук. Иркутск: ИГУ, 1997.

43. Кижняев В.Н., Круглова В.А., Анненков В.В. и др. Особенности поведения поли-с-винилтетразолов в водных средах // Высокомол. Соед. Сер. Б. -1989. Т.31, №6. - С.420-423.

44. Ковалев И.Е., Полевая О.Ю. «Биохимические основы иммунитета к низкомолекулярным химическим соединениям». М., Наука, -1985.

45. Копанев Ю.А. Значение кишечной микрофлоры для здоровья человека. Роль пробиотиков и пребиотиков для коррекции и профилактики нарушений микробиоценоза // Трудный пациент. 2008. -№11. - С.39-43.

46. Корнева Т.К. Дисбактериозы кишечника у проктологических больных: микробиологические аспекты // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. -1999. —№3. -С. 55-60.

47. Коршунов В.М., Смеянов В.В., Ефимов Б.А. Рациональные подходы к проблеме коррекции микрофлоры кишечника // Вестн. РАМН. -1996. -№2. -С.60-65.

48. Косарев В.В., Лотков B.C., Жестков A.B. Иммунологические эффекты воздействия на работающих в хлорорганическом производстве // Гигиена и санитария. 1999. - №6. - С. 31-34.

49. Костюкова H.H. Уроки дифтерии // Журн. микробиол. 1999. - № 2. -С. 92-96.

50. Крамарь JI.B. Микроэкология кишечника здоровых людей в условиях техногенного воздействия крупного промышленного города// Вестник РАМН. -2002. -№28. -С.37-40.

51. Куваева И.Б., Ладодо К.С. Микроэкологические и иммунные нарушения у детей.-М., 1991.-240 с.

52. Кутепов E.H., Вашкова В.В., Чарыква Ж.Г. Особенности воздействия факторов окружающей среды на состояние здоровья отдельных групп населения // Гигиена и санитария. -1999. -№6. -С.13-16.

53. Левин Ю.М. Эндоэкологическая реабилитация: прошлое, настоящее, будущее // Intern. J. On Immunorehabilitation. -1997. -№ 6. -P. 148-156.

54. Лещук С.И., Попкова С.М., Сердюк Л.В. и др. Новые эритроцитарные иммунодиагностикумы для метода РПГА // Материалы 11 объединенной научной сессии СО РАН и СО РАМН: Новые технологии в медицине.— Новосибирск, 18-19 июня, 2002г. С.92.

55. Лещук С.И., Попкова С.М., Сердюк Л.В. и др. Способ получения эритроцитарного антигенного диагностикума //Патент РФ № 2202801. 2003.

56. Лещук С.И., Попкова С.М., Сердюк Л.В. и др. Способ приготовления эритроцитароного иммунодиагностикума и способ оценки иммунорезистентности организма // Патент РФ №2142807.1999.

57. Лещук С.И., Анненков В.В., Юринова Г.В. и др. Дизайн эритроцитарных диагностикумов с новыми конъюгирующими компонентами, для определения антибактериальных антител // Бюллетень Сибирского отделения РАМН. 2002. -Т.1, №4. - С.59-62.

58. Литманович A.A. Композиции на основе поликомплексов: получение, модификация, взаимодействия с дисперсиями: дис. .д.х.н. -М., МГУ. -1996.

59. Литманович A.A., Сусь Т.А., Карапутадзе Т.М. и др. Комплексообразование поликарбоновых кислот с поли-Ы-винилпирролидоном различных молекулярных масс // Высокомол. Соед. Сер. Б. -1980. -Т.22, №3-С. 236-238.

60. Люберцев А.П. Воронцов-Вельяминов И.Н. Моделирование гибких полиэлектролитов методом Монте-Карло // Высокомол. Соед. Сер. А. -1990. — Т.32, №4. С.721-726.

61. Мазурова И.К. Роль противомикробных антител в пассивной защите организма от дифтерийной инфекции // Острые детские инфекции: Сб.науч.трудов М. НИИЭМ им. Г.Н.Габричевского. 1978. -T.XIX. -С.26-34.

62. Медуницин Н.В. Вакцинология. «Триада». М., 1999. - 272 с.

63. Мерингова Л.Ф., Гупалова Т.В., Суворов А.Н. и др. Влияние различных адъювантов на иммуногенность компонентов вакцины против стрептококков группы В // Медицинская иммунология. -2008. -№ 2. -С.215-222.

64. Микельсаар М.Э. Формирование и сохранение резидентной микрофлоры желудочно-кишечного тракта //Антибиотики и колонизационная резистентность. -М., 1990. 287 с.

65. Миронов А.Ю. Архитектоника микробной экологии человека в норме и при некоторых патологических состояниях: Автореф. Дисс. . .докт. мед. наук. — Москва, 2002. 44 с.

66. Митрохин С.Д. Дисбактериоз: современные представления, диагностика, возможности лечения //Антибиотики и химиотерапия-2004.-№7.-С.22-33.

67. Москаленко Е.П. О фракциях растворимого антигена возбудителя коклюша // Журн. микробиол. -1968. -№6. С.63-67.

68. Москаленко Е.П., Харсеева Г.Г., Бревдо A.M. и др. Влияние полиоксидония на адгезивные свойства CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. — 2009. —№ 2. -С. 11-15.

69. Мошиашвили И .Я., Файкин И.М. Модификация ультразвукового генератора ULA-100 ВТ для микробиологических исследований // Журн. микробиол. -1968. —№6. С.120-122.

70. Муратов В.В. Гигиенический анализ совместного действия химического и радиационного факторов окружающей среды на здоровье населения, проживающего в районе горнорудных разработок: Автореф. Дисс. .к.м.н. — Иркутск, 1997.-24с.

71. Мухина Ю.Г. Диагностика и коррекция дисбактериоза у детей // Русск. мед. журн. -1999. Т. 7, №11. - С.487-495.

72. Назарова Е. К., Гиммельфарб Е. И., Созаева JI. Г. Микробиоценоз влагалища и его нарушения. Этиология, патогенез, клиника, лабораторная диагностика // Антибиотики и химиотерапия. -2002. -Т.47. -№. 4. -С.36- 43.

73. Насыбуллина Г.М., Рябова Н.В., Ползик Е.В. и др. Роль техногенного загрязнения как фактор риска заболеваемости детей дошкольного возраста // Гигиена и санитария. -1999. -№4. -С. 35-38.

74. Нефедов Н.К. Интерполимерные комплексы на основе поли-1-винил-1,2,4-триазола и поликарбоновых кислот: Дис. . канд. хим. Наук -Иркутск, 1987. -163 с.

75. Никитина Т.Н., Авдеева Ж.И. Иммуноадъювантное действие цитокинов//Биопрепараты. -2008. -№ 1 (29). С. 16-20.

76. Остапенко В.А. Клинико-иммунологическне признаки поражения кишечника при цитостатической терапии // Иммунопрофилактика, иммунодиагностика и иммунокоррекция. Омск, 1994. - С. 54 - 56.

77. Павлова A.JL, Домнина Е.С., Скушникова А.И. и др. Кинетика сополимеризации 1-винилбензилимидазола с акриловой кислотой // Высокомол. Соед. Сер. А. -1992. Т.34, №7. -С.38-45.

78. Паранько Н.М., Рублевская Н.И. Гигиеническая характеристика загрязнения тяжелыми металлами окружающей среды промышленного региона и иммунный статус детей // Гигиена и санитария. -1999. -№2. -С. 51-55.

79. Парфенов А.И. Микробная флора кишечника и дисбактериоз // Русск. Мед. журн. -1998. -Т.6, №18. -С.1170-1173.

80. Патрушев JI. И. Искусственные генетические системы. -ИБХ РАН, 2004. -407с.

81. Певницкий Л.А., Баймуканова Г.П., Писарев В.М. и др. Экологический иммунодефицит: иммуногенетические аспекты его развития и коррекции // Вестн. РАМН. -1994. -№4. С. 20-28.

82. Перетц Л.Г. Значение нормальной микрофлоры для организма человека. — Москва, 1955.-431с.

83. Петров Р.В., Кабанов В.А., Хаитов P.M. и др. Протективная эффективность конъюгатов бактериального антигена с синтетическими полиэлектролитами // Докл. АН. СССР. -1993. Т.270, №5. - С. 1257-1259.

84. Петров Р.В., Хаитов P.M. Искусственные антигены и вакцины М.: Медицина. -1998. -289с.

85. Петров Р.В., Хаитов P.M. Коньюгированные полимер-субъединичные иммуногены и вакцины // Вестник РАМН. 2003. - №1. - С. 10-14.

86. Петров Р.В., Кабанов В.А., Хаитов P.M. и др. Модификация иммунного ответа при помощи антигена, связанного с неприродными полиэлектролитами // Журн. Микробиол. -1981. -№2. -С.58- 63.

87. Пинегин Б.В., Мальцев В.Н., Коршунов В.М. Дисбактериозы кишечника. — М., 1984. -144с.

88. Платэ H.A., Васильев А.Е. Физиологически активные полимеры // Химия. -М., 1986.-296с.

89. Подволоцкая А.Б. Функциональная характеристика аутомикрофлоры кожи детей младшего школьного возраста в условиях техногенного загрязнения среды: Автореф. дисс. . канд. биол. наук. — Владивосток, 2000. 31с.

90. Попкова С.М. Микробная экология человека в условиях техногенного прессинга промышленных городов Восточной Сибири: Дисс. . докт. биол. наук. — Иркутск, 2004. -301 с.

91. Попкова С.М., Лещук С.И., Анненков В.В. и др. Сравнительная характеристика эритроцитарных иммунодиагностикумов по определению нормальных бактериальных антител // Бюллетень ВСНЦ РАМН. -2007. -№3. -С.43-48.

92. Попкова С.М., Лещук С.И. Оценка противодифтерийного иммунитета у носителей токсигенных коритебактерий дифтерии // Метод-письмо 3.1.003.-01. -Иркутск: Цент Госсанэпиднадзора в Иркутской области. —2001. —7с.

93. Попкова С.М., Лещук С.И., Кичигина Е.Л. и др. Оценка иммунорезистентности популяции при массовых обследованиях населения // Бюллетень Сибирского отделения РАМН. -1998. -№2. -С.40-43.

94. Попкова С.М., Джиоев Ю.П., Лещук С.И. и др. Современные подходы к диагностике, профилактике и коррекции дисбактериозов // Вестник Российской Военно-медицинской академии. С-Пб., 2008. -2(22). -С.203-204.

95. Попкова С.М., Шмелёва Е.А., Макарова С.И. и др. Иммунология антропогенного ответа на антигены симбионтных нетоксигенныхкоринебактерий дифтерии // Вестник Российской Академии медицинских наук. -2006. —№1. -С.24-28.

96. Праздничная О.В., Юргенс И.Д., Кораблева C.B. и др. Трехкомпонентные интерполимерные комплексы с низкомолекулярным посредником некоторые особенности надмолекулярной структуры // Высокомолекулярные соединения. -1994. -Сер. А. Т.36, № 8. - С. 1316-1321.

97. Пшеничная Л.Н., Тукачинский С.Е. Влияние частичной модификации сывороточного альбумина на его конформацию и комплексообразующую активность // Ж.микробиол. -1977. -№3. -С.115.

98. Ракова Е.Б., Попкова С.М., Джиоев Ю.П. и др. Видовая архитектоника и плазмидный профиль бифидобактерий кишечной микробиоты у населения Иркутской области //Вестник Российской военно — медицинской Академии. -2008. -№2 (22). -С.660-661.

99. Ревич Б.А. Последствия воздействия стойких органических загрязнений на здоровье населения: Цикл лекций -М.: Джеймс, 2000. -48 с. Юб.Римарчук Г.В. Оздоровление детей в районе экологического неблагополучия // Рус. мед. журн. -1999. -№ 11. С. 500-504.

100. Румянцев В.Г. Дисбактериоз кишечника: клиническое значение и принципы лечения // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. -1999. — Т.9, №3. -С.61-63.

101. Ряпис JI.А., Беляков В.Д. Молекулярная эпидемиология дифтерии // Журн. микробиол. 1998. - № 4. - С. 101-106.

102. Сабирова З.Ф. Влияние загрязнения атмосферного воздуха в регионах нефтепереработки, нефтехимии, химии на смертность населения // Гигиена и санитария. -1999. №5. -С. 15-19.

103. Ш.Савилов Е.Д., Колесников С.И., Красовский Г.Н. Инфекция и техногенное загрязнение. Новосибирск: Наука, 1996. -190 с.

104. Скачков М.В., Смолягин А.И., Боев В.М. и др. Иммунологическая эффективность вакцинации в различных экологических ситуациях // Эпидемиология и инфекц. болезни. 2001. - № 4. - С. 47-48.

105. Скобелева В.Б., Зинченко A.B., Рогачева В.Б. и др. Взаимодействие слабосшитого полиамида с бычьим сывороточным альбумином // Вестн. Московского ун-та, сер.2. Химия. -1998. -№4. С.268-271.

106. Стенина М.А., Воеводин Д. А., Скрипник А.Ю. и др. Уровень сывороточных антител к условнопатогенной микрофлоре как маркер процесса формирования вторичного иммунодефицита у детей // Журн. микробиол. — 2001. —№5. — С.50-54.

107. Трофимов Б.А., Михалева А.И. N-винилпирролы. Новосибирск: Наука, 1984. -262 с.

108. Труфакин В.А., Трунова Л.А. Иммунологические механизмы формирования экологически обусловленной патологии // Вестн. РАМН. —1997. -№ 7. -С. 15-18.

109. Усатова Е.А. Значение микробиологических и иммунологических тестов в оценке влияния промышленных загрязнений атмосферного воздуха на детский организм (по материалам г. Ворошиловграда): Автореф. Дис. . канд. мед. наук. Москва,1988. —23 с.

110. Филиппов A.C., Савченков М.Ф., Дифенбах Т.И. и др. Состояние здоровья детей Восточной Сибири в условиях антропогенного воздействия // Экология человека и природы. — Иркутск, 1999. -С. 145-153.

111. Хавкин А.И. Микробиоценоз кишечника и иммунитет // Русский медицинский журнал. -2003. -№11 (3). -С.122-125.

112. Хаитов P.M. Вакцины нового поколения и проблемы биобезопасности //Цитокины и воспаление. -2005. -№3. -С.45-48.

113. Хаитов P.M., Зверев В.В., Семенов Б.Ф. Вакцинопрофилактика в XXI веке: настоящее и будущее // Иммунология. 2009. -№ 6. -С.324-335.

114. Хаитов P.M., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология.— М., 1995.—345 с.

115. Хаитов P.M. Физиология иммунной системы. М.: ВИНИТИ РАН, 2001.-223 с.

116. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммунная система ЖКТ: особенности строения и функционирования в норме и патологии //Иммунология. 1997. -№5. - С.4-7.

117. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Современные представления о механизмах действия полиоксидония // Иммунология. —2005. № 4. - С. 197-199.

118. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Основные принципы иммуномодулирующей терапии // Аллергия, астма и клиническая иммунология./-2000. № 1. - С. 3133.

119. Хаитов P.M., Федосеева В.Н., Некрасов A.B. и др. О сниженных анафилактогенных свойствах аллергоида, коньюгированного с синтетическим полимером // Иммунология. -1996. № 6. -С. 40-45.

120. Хергет Х.Ф., Летцель X., Петров P.O. Комплексная терапия дисбиозов // Эпидемиол. и инфекц. болезни. -1997. -№6. -С.51-55.

121. Шамардин В.А., Каральник Б.В. Способ сенсибилизации эритроцитов //АС СССР. №614377 от 22.03.76. -Б.И. №25. -19786.

122. Шендеров Б.А. Нормальная микрофлора и ее роль в поддержании здоровья человека // Рос.журн.гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. -1998. -Т.8, №1. — С.61-65.

123. Шмелёва Е.А., Злобин В.И. Популяционный уровень иммунореактивности макроорганизма к антигенам микрофлоры человека (на примере взаимоотношений с антигенами C.diphtheriae и Bifidobacterium)// Бюллетень ВСНЦ РАМН. 2003. -№ 1. -С. 164 -169.

124. Юринова Г.В. Совершенствование технологии приготовления эритроцитарных иммунодиагностикумов для РПГА на основе клеточных фракций бифидобактерий с использованием синтетических полимеров: Дис. . канд. биол. наук. Улан-Удэ, 2005. - С.65-84.

125. Ющук Н.Д., Верткин A.JI. Дисбактериоз кишечника: патогенез и фармакотерапия // Междунар. мед. журн. -1998. -№4. С.27 - 29.

126. Юрьев С.Ю., Евтушенко И.Д., Огородова JI.M. и др. Полиоксидоний и гепон в лечении хронического урогенитального хламидиоза при планировании беременности // Бюлл.СО РАМН. -2005. -№2. С. 112-116.

127. Ярилин А.А. Основы иммунологии: Учебник. М.: Медицина, 1999. -С. 608.

128. Altunkova I., Koleva М., Rangachev I. Changes in the humoral immune response in occupational exposure to metall aerosols // Probl. Khig. -1996. —№ 21.— P.122-130.

129. Allcock H. Polyphosphazenes as new biomedical and bioactive material // Marcel Dekker. -New York, 1990.

130. Annenkov V.V., Mazyar N.L., Kruglova V.A., et al. Equilibria in Solutions of Complexes of Poly(acrylic acids) and Poly(N-vinylazoles) // J. Mol. Liq. 2001. - V. 91.-P. 109-114.

131. Antoni G., et al.// J. Immunol. -1986. -V. 137. P.3201-3206.

132. Arunas Usaitis, Sirkka Liisa Maunu, Heikki Tenhu Aggregation of the interpolymer of poly (methacrylic acid) poly (vinilpyrrolidone) in aqueous solutions // Eur. Polym. J. -1997. V.33, №2. - P.219-223.

133. Arroyo P. J., Bash J. A., Wallack M. K.//Cancer Immunol. Immunother. 1993. -V. 31.-P. 305.

134. Barksolole L. Handbook on habitants isolation and indefication of bacteria. — London, 1970. V.2. - 182 p.

135. Doseva V., Shencov S., Baranovsky V.Y. Complex formation between polymethacrylic acid and copolymers of adipic acid with poly (ethylene glycol) in aqueous solution // Polymer. -1997. -V.38, №6. P. 1339-1344.

136. Eagland D., Crowther N.J., Butler С J. Complexation between polyoxyethylene and polymethacrylic acid the importance of the molar mass of polyoxyethylene // Eur. Polym. J. - 1994. - V.30, №7. -P.767-773.

137. Feliu Jordi X., Villaverde A. An optimized ultrasomcation protocol for bacterial celf disruption and recovery of ß-galactosidase fusioi // Biotechnol. Techn. -1994. -V. 8. -N 7. -C.509-514.

138. Fuller R. Probiotics 2: applications and practical aspects — London: Channan & Hall, 1997. -178 p.

139. Heath A. W., Playfair J. H. L.//Vaccine. -1992. -№10. P. 427-434.

140. Kotz J. Polyelectrolytes complexes // Polymeric Encyclopedia. Boca Raton -New-York - London - Tokyo: CRC Press Inc., 1994. - P.5762-5791.

141. Krupers M.J., Van Der Gaag F.J., Feijen J. Complexation of poly (ethylene oxide) with poly (acrylic acid-co-hydroxyethyl metecrylates) // Eur. Polym. J. 1996. - V.32, №6. — P.785-790.

142. Laemmli U.K. Cleavage of proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. -1970. -V. 227. -P. 680- 685.

143. Lowry O. H., Rosenbrough N. J., Farr A. L. Protein measurement with the Folin phenol reagent // Biol. Chem. -1951. -V.193. P.265-275.

144. Mayer L. Oral tolerance: new approaches, new problems // Clin. Immunol. -2000. -V. 94. -P. 1-8.

145. Manivel V., Rao K. V. S.//Vaccine. -1991. -V. 9. -P. 395-397. löl.Nobiron I., Thompson I., Brownlie., Collins M. E.// Microbiol. -2000. -V. 76. -№2.-P. 129-142.

146. Nürnberg J., Doule M. V, York S. M., et al. //Proc.atl. Acad. Sei. USA. 1989. -V. 86.-P. 4240-4243.

147. Perrin P., Joffret M. L, Zanetti C. et al. //Immunology. -1988. -V. 177. -P. 199-209.

148. Poxton I.K., Brown R., Sawyerr A. A. et al. Mucosaassociated bacterial flora of the human colon // J. Med. Microbiol. -1997. № 46. -P. 85-91.

149. Rajananthanan P., Attard G. S., Sheikh N. A., et al. // Vaccine. -1999. -V. 18, № 1-2.-P. 140-152.

150. Schmidt G., Zink R. Basis features of the stress response in the three species of bifidobacteria: B. longum, B. adolescentis and B. breve//International J. of Food Microbiol. -2000. V. 54. - P. 41 - 45.

151. Strauss U.P., Barbieri b.W., Wong G. Analysis of ionisation eguilibria polyacids in terms of species population distributions. Examination of "two-state" conformational transition // J.Phys. Chem. 1979. -V.83, №22. - P.2840-2843.

152. Tagliabue A., Rappuoli R. Vaccine adjuvants// Human Vaccines. -2008. —V.4, №5. -P.347-349.

153. Turner S.R. Syntethesis, charge transfer complex behavior and electronic transport properties of novel electron-acceptor polymers based on trinitrofluorenate // Macromolecules. 1980. - V.13, №4. -P. 782-726.

154. Utell M.J., Samet J.M. Particulate air pollution and health. New evidence on an old problem //Am. Rev. Respir. Dis. 1994. -V. 147, № 12. - P. 1334-1335.

155. Van der Waaij D. Colonization resistance of the digestive tract: An importance first barrier of defense to opportunistic infections in man and animals // Abstracts XII Intern. Sympos. Gnotobiology, June 23-28. Gonolulu, 1996. -P. 1243.

156. Weinbach R. Die Verwendung von formalinisierten Erythrozyten als Antigen-Träger in der indirekten Hämagglutination // Schweiz. Z allg. Path. -1959. -V.22. -P.l-8.

Информация о работе

Сердюк, Людмила Викторовна
кандидата биологических наук
Улан-Удэ, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

Способы повышения эффективности эритроцитарных диагностикумов для оценки иммунореактивности организма в реакции пассивной гемагглютинации - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы