Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сопутствующая микрофлора в процессе инкубации стальноголового лосося (ONCORHYNCHUS MYKISS WALBAUM) в рециркуляционной системе водоснабжения при разной температуре

ВАК РФ 03.00.10, Ихтиология

Автореферат диссертации по теме "Сопутствующая микрофлора в процессе инкубации стальноголового лосося (ONCORHYNCHUS MYKISS WALBAUM) в рециркуляционной системе водоснабжения при разной температуре"

КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПО РЫбОПОВСТВУ КСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО- ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ? Г Б О Л РЫБНОГО ХОЗЯЙСТВА И ОКЕАНОГРАФИИ

( ВНИРО)

па правах рукописи

УДК: 576. 8: 639. 371. 1: 639. 3. 034

АсореИ Риаль Хосе Антонио

СОПУТСТВУЮЩАЯ МИКРОФЛОРА В ПРОЦЕССЕ ИНКУбАЦИИ ПАЛЬНОГОЛОВОГО ЛОСОСЯ (ОНСОННУЯСНиБ МУК1БЗ идьвАии) РЕЦИРКУЛЯЦИОННОЙ СИСТЕМЕ ВОДОСНАбЖЕНИЯ ПРИ РАЗНОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ.

Специальность 03. 00. 10- Ихтиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1994

1'нбота выполнена во Всероссийском научно- исследовательском интитуте рыбного хозяйства и океанографии

!1;.учный руководитель- доктор биологичесних наук

проф. П. А. Душкина Научный нонсупьтант- Т. В. Беагачина

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных иаун проф. Ю. А. Привеэенцев локтор биологических наук, проф. Ю. Г. Симаков

Ведущее учереждение:

ЖгероссийсниИ научно- исследовательский ичститут прудового рыбного хозяйства • (ВНИИПРХ)

Защита диссертации состоится «>25 » XI 1994 г.

м « » часов на заседании специализированного совета

Л 117.01.02. при Всероссийсном "научно - исследовательском институте рыбного хозяйства и океанографии (ВНИРО),

ул. В. Красносельская, д. 17а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИРО Автореферат разослан » XI 1994г.

Ученый секретарь специализированного совета ВНИРО,

кандидат биологических наук ( )/ X) Астафьева А. В.

ср>.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Внращивание лососевых по товарного состояния ведётся в России преимущественно в Европейской части страны ( Нарпевич и яр.1991; 1'изЬк1па, 1994). Так, в частности, стальноголовый лосось (ОпсогЬупсЬиз тук1зз Walbau.ni) в течение нескольких последних лет выращивается в экспериментальных и полупромышленных масштабах на научной базе Б. Утриша (Анапсний район, Краснодарский край). В комплексе исследований этого вида большой удельный вес занимает проблема инкубации икры в замкнутой системе водоснабжения, где сорийные инкубационные установим находятся в условиях разной температуры воды под наблюдением сотрудника ВНИРО к. б. н. В. С. Агапова, изучающего влияние этого фактора на выживание и чимп развития инры и личинок.

Вполне очевидно, что в замннутой системе будет находиться сопутствующая минрофлора, изученная крайне мало. Следует полагать, что её влияние на выживание икры должно играть большую роль.

О присутствии патогенной и условно патогенной микрофлоры у взрослых рыб при искусственном выращивании нескольких видов из семейства лососевых, свидетельствуют многие исследования, ноторые подчёркивают значение минрофлоры для рыбы и человека.

Отмечается, что качественный состав сапрофитной микрофлоры

форели в естественных водоемах во многом идентичен микрофлоре при иыращиванйи взрослых рыб в замкнутой системе аквакультуры ( Васюков, Авдеева, 1984 ).

Возможность передачи патогенных микроограниэмов и вирусов через инкубируемые икринки на последующие этапы выращивания отмечена для лососевых р. Он :ог!1упс1и1а, в частности О. шук18з(Ка1Ь. и для форели, __

Однако полного анализа минрофлоры во всей цепи инкубационного процесса в рециркуляционных системах, которые будут иметь большое знамение на фоне усиливающегося загрязнения естественных водоемов, проводилось крайне мало, а на российских наводах не проводилось, по- видимому, вообще. Данная работа нризвана восполнить этот пробел.

ЦЕПЬ РАбОТЫ

- определение общего видового состава минрофлоры стальноголового лосося в раннем онтогенезе в условиях рециркуляционной системы водоснабжения в северо- восточной части Черного моря;

оценка влияния температуры воды (5, 8,11, 14, 17°С) в инкубационных аппаратах на видовой состав и общую обсеменённость микрофлоры,

- изучение динамики общей обсеменённости и видового состава во ноем цинле инкубационного процесса: вода инкубаторов и источников иодоснабжения, половые продукты самой и самцов, полостная жидность самок, икра в процессе развития, и, отчасти, оценка их нлияния на выживаемость икринок и предпичинок.

«

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

1Чбота посвящена малоизученному вопросу состава минрофлоры при разведении стальноголового лосося в пресноводный период жизни, а также микрофлоре этого вида в раннем онтогенезе при разной температуре инкубации. В результате исследований осуществлено 195 выделений, в которых встречены 38 разных видов Оактерий, дрожжей и грибнов, 8 видов встречены впервые в России в условиях северо-восточной части Чёрного моря, и, ноннретно при нырзщивании стальноголового лосося.

С помощью оригинальных инкубационных установок В. С. Агапова, па которых была проведена наша работа, впервые рассматривается линамина численности и видового разнообразия микрофлоры при разной температуре иннубации инры, показано, что при выращивании стальноголового лосося существует цепь, создаваемая мевду разными .чиеньями, для передачи микроогранизмов на дальнейшие этапы развития.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

I

При иннубации икринок стальноголового лосося получены данные, позволяющие сделать вывод о том, что температура воды и санитарное состояние источника водоснабжения оказывают существенное влияние на количественный и качественный состав микрофлоры в инкубаторах. Выявлен характер аакономерностей пинамики численности микрофлоры воды и икры в инкубаторах в условиях разной температуры. Дается оценна возможного влияния

микрофлоры на выживаемость икринок. Задачи данной работы направлены на уменьшение понаэателеИ низкой выживаемости икры путём постоянного санитарного контроля общей обсеменённости и нидового состава икры на ранних этапах развития стальногопового лосося. Поставлен вопрос о необходимости организовать санитарный контроль всей цепи процесса инкубации икры и выращивания личинок.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные результаты работы были обсуждены на коллоквиумах лабораторий марикультуры и научной диагностической лаборатории болезней рыб и других гидробионотов и на Учёном совете ВНИРО; на коллоквиумах : декабрь 1991г. , ноябрь 1992г., октябрь 1993г., октябрь 1994г;

на Учёном совете : декабрь 1992 г.;

на Пятом Всероссийском совещании по систематике, биологии и биотехнике разведения лососевых рыб, С.-Петербург, 1994.

ПУБЛИКАЦИИ

Опубпинованы 2 работы, одна сдана в печать.

СТРУКТУРА РАБОТЫ

Лиссертация изложена на 150 страницах машинописного тенета, ннлючает 10 таблиц, 3 рисунка, состоит из Введения, 6 [■лав, включая «Материал и методина», Заключения и Выводов. Список yi• пользованной литературы включает 151 источнин, из них 102 ннрубежных авторов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Работа проводилась в 1992-1994 гг. на Черном море (Б. Утриш

Анапского района), на указанных установках В.С.Агапова и при рырзщивании личинок стзльноголового лосося ( О^согЬупсЬиэ туказз) и пяти инкубаторах. Каждый из них имеет локальную систему подачи 1>оды с разной температурой (5, 8, 11, 14, 17°С) и шесть рамок для с-цлодотворенной икры. До поступления в инкубаторы вода иыдерживается в течение двух недель в системе биофильтров, сходящихся внутри каждого инкубатора. Смена 1/10 части объема циркулирующей воды производится каждые 5- 7 дней. Продолжительность эмбриогенеза стальноголового лосося в этих условиях длится от двух недель (14,17°С) до трех месяцев (5°С).

и.чя оценки общей обсеменённости воды была использована среда МПА - мясо- пептонный агар. Подсчёт осуществлялся по прямому к.году всех выросших на агаре колоний на 1 мл воды.

Л-ч/1 выделения и определения микроорганизмов в воде инкубаторов, бака водоснабжения и бассейнов производителей у ..юльаовались следующие среды и методы: МПА (ТЗА), среда ДДА, среды для диплобактерий и фпексибактерий, среды АН для аэромонад, «Кинг-Б» для псевдомонад, «Клиглер» для Грам(-) палочек и ЭНДО лля энтеробактерий (колиформы) - кишечные палочки, бактоагар сухой Плоскирева для салмонеллы. Для общей обсеменённости икринок 11 (^оплодотворенных и оплодотворенных), преппичинок, спермы и полостной жидкости использовали МПА.

К-14 элективные жидкие среды для выделения и определения микроорганизмов в полостной жидности зрелых самок, в половых продуктах (неопподотворенные инринки и сперма), и в

оплодотворенных икринках в инкубации, а также в предличиннах, использовали: ДДА, среды для диплобактерий и фпексибактерий, среды АН для аэромонад и «Кинг- Б» для псевдомонад, среда «Нлигер» и среда ЭНДО для энтеробактерий, бактоагар сухой Плоскирева, тест онсидазы, определение присутствия грибнов рода Saprolegnda методом «приманки».

ВИДОВОЙ СОСТАВ МИКРОФЛОРЫ СТАЛЬНОГОЛОВОГО ЛОСОСЯ НА РАННИХ ЭТАПАХ ВЫРАЩИВАНИЯ И ЕГО ЗНАЧИМОСТЬ I! полостной жидкости самок, половых продуктах производителей, содержащихся в заводских условиях и инкубируемых в замннутой системе водоснабжения, икринках стальноголового лосося присутствуют разнообразные представители микрофлоры. Сапрофитная микрофлора, которая является симбионтом (например, villus ), условно патогенная психрофильная микрофлора лишенной группы {>;3cherichia coli и др. ) . По нашим данным и предыдущим работам ни Б. Утрише, многие из этих видов встречаются на дальнейших этапах выращивания данного анадромного вида.

Среди встреченных микроорганизмов, патогенных для рыб и опасных для человека и других животных, например, Vibrio ci lginolyticus, Аегошопаз hydrophi la, Pseudomonas spp, Kdwardsiella tarda.

Jinn определения всех видов использовался справочник "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology" (1984,9 вып. !.

Для оценки состава микрофлоры в опытах осуществлено 195 ныделений, в которых встречены 38 разных видов бантерий, дрожжей

и грибнов ( в скобках указана их встречаемость): ]. 1АКТЕРИИ

Vibrio anguillarum (9)

Vibrio alginolyticus (1)

Vibrio spp (7)

Aeromonas hydrophila (9)

Salmonella anatum (2)

1'roteus vulgaris (4)

Mwardsiel la tarda (6) +

K-,cherichia coli (13)

Yersinia ruckeri (4)

Yersinia enterocolitica серотип 03 +

I'seudomonas aeruginosa (2)

I'seudomonas testoalcaligenes (8) +

I'seudomonas spp (5)

Staphylococus aureus

Staphylococcus saprophytics (8)

Staphylococcus haemolyticu3 (17)

Staphylococcus epidermidis (2)

Sarcina maxima (1)

Sarcina spp (2)

Eriterococcus faecal is (4)

Enterococcus spp (l)

Диплобактерии (17)

Lactobacillus spp (1) +

Nocardia asteroides (2)

Mocardia farcinica (2)

Nocardia rubra (1)

Nocardia spp (1)

Bacillus subtilis (2)

Bacillus cereus (3)

Euactinomycetes (Streptomycetes)

Streptomyces albus (10)

Streptomyces spp (2) +

J'lexibacter columnaris (13)

Flexibacter (Chondrococcus) spp (14)

Cytophaga crocatus (5) +

ДРОЖЖИ

Candida albicans (2) Candida kefyr-2 (1)+ 3 ГРИБКИ

Saprolegnia spp (2) Aspergillus negros (1) + л : встречены впервые в России в условиях с. - восточной части бассейна Черного моря при выращивании стальноголового лосося.

МИКРОФЛОРА ВОДЫ В РЕЦИРКУЛЯЦИОННОЙ СИСТЕМЕ, БАКЕ ГОДОСНАБЖЕНИЯ И БАССЕЙНАХ ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ О' >цая обсеменённость воды существенно изменяется в процессе со прохождения через инкубационные установки и в зависимости от 1омпературы. Отмечены виды с различной адаптацией к температуре :

меэофильные или теплолюбивые и психрофипьные или холодолюбивые.

Число мезофильных микроорганизмов (бангерии, дрожжи, грибки) увеличивается с температурой в интервале от 5 до 17°С, число психрофильных микроорганизмов, наоборот, уменьшается. Наблюдается некоторое вертикальное увеличение в каждом иннубаторе для входа и пчхода . Танже увеличивается общая обсеменность при ниэних 'i рмпературах 5 и 8°С.

Чмким образом существенное влияние на количественный состав микрофлоры оказывают температура воды в иннубаторе, присутствие икры на инкубационных рамках и санитарное состояние источнина нодоснабжения, приводящее в течение процесса иннубации н интенсивному микробиологическому накоплению. Источниками кикрофлоры в воде являются также : бак водоснабжения, оболочни самих икринок с сопутствующими микроорганизмами и, в меньшей степени, сопутствующий хендлинг человека.

Общая обсеменённость в воде бассейна , где с о держатся производители, показывает значительные результаты: 231. ООО кол. /мл в ) 993 г. и 351.000 кол./мл в 1994 г. в среднем.

И.-j таблицы 1 видно, что при каждой температуре в воде развиваются определенные виды микроорганизмов.

Н составе микрофлоры в воде встречаются виды, которые были иыделены также в других средах (полостная жидность, половые продукты, икринки). Встречены виды, могущие стать патогенными для ркры - в основном, грибок Saprolegnia spp, и для молоди лосося -бактерии Edwardsiel la -tarda, Flexibacter columnaris, Vibrio

ШЛИЦА 1

ОШАЯ ОБСШЕНЁННОСТЬ И ВИДОВОЙ СОСТАВ МИКРООРГАНИЗМОВ В ВОДЕ ИНКУБАТОРОВ ПРИ РАЗНЫХ ТЕМПЕРАТУРАХ В РЕЦИРКУЛЯЦИОННОЙ СИСТЕМЕ ВОДОСНАБЖЕНИЯ

ОБЩАЯ ОБСЕЫЕНЁННОС: Ь (71 колоний/ил )

1 ТЕМПЕРАТУРА (•С) МЕЗОШЬНЫЕ ПСИХРОШЬНЫЕ СРЕДИ ПРИСУТСТВИЕ И РОСТ САПРОЛЕГНИИ

ВХОД выход ВХОД ВЫХОД МПА КЛИГЛЕР ТЕСТ ОКСИДАСА

5 870 1000 760 1100 Вк^лососсиА ¿лсагиЪ. АняифЯсШ. - - УГ-

8 640 1100 700 820 £-и1ша>сш1 ¿ишСуТТаМ. - - ЗарпАуши чг-

II 770 2000 350 530 кегМасСъ - - -

К ггоо 3200 110 120 ¿арЬубуйт ТЕсо&юшИз. Уш-ыма. мтсй'/ссл ■ИыНу. оз. - -

17 - 3500 4 0 а&сиитга'х. ВЛотгиЬх/Ь. '¿¡злсбь. £5сАи(£сша. + -

auguil larum. И воде бассейнов, где содержатся производители, микрофлора была представлена следующими формами (таблица 2), которые совпадают в ряде случаев с той микрофлорой, ноторая была обнаружена в воде инкубаторов при разной температуре.

Оитеробантерии встречаются в воде (бак водоснабжения, инкубаторы, бассейны производителей), в половых продуктах и в икринках. Их число патогенно для стальноголового лосося (Kdwardsiella tarda, Yersinia ruckeri, Proteus vulgaris) (Toranzo, Barja,1985).

МИКРОФЛОРА В ИНКУБАЦИОННОМ ЦИКЛЕ

Если в инкубаторах общая обсеменённость воды, подготовленной с помощью биофильтров, относительно невелика, то вода в бассейнах, где содержатся производители, характеризуется весьма высокой обсеменённостью (таблица 2).

II полостной жидкости самки, взятой в этот же день из того же бассейна, общая обсеменённость составила 100. 500 кол. /мл и были обнаружены микроорганизмы, уназанные в таблице 3.

Совпадение значений общей обсеменённости и видового состава в обеих средах в одно и то же время анализа говорит о том, что вода в бассейнах может стать источником микрофлоры для производителей. Из таблицы 3 видно, что микрофлора в полостной жидности самок количественно и качественно обильна.

Микрофлора достаточно обильна и в самих половых продуктах самой и самцов. Определение этой микрофлоры в поповых продуктах, т. е. в сперме и неопподотворенных икринках (9 самок и 8 самцов; 51

ТАБЛИЦА 2

ОБЩАЯ ОБСЕМЕНШНОСТЬ И ВИДОВОЙ СОСТАВ МИКРООРГАНИЗМОВ В.. ВОДЕ БАССЕЙНА ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ

ДАТА

ОБЩАЯ,-ОБО.(71 кол/мл) ВИДОВОЙ СОСТАВ

5/5/1993 231.000 БЦоЯу&свссМ КаетоСуиш 7шг£си/еп.. себитпамз.

6/2/1994 351.000 SaJtu.no. 3/>А Ц-6г£о (тя&гсгаЛ-ып. £с£тиц&СеШ £аяс£а..

го

ОБЩАЯ ОБСЕМЕНЁННОСТЬ И ВИДОВОЙ СОСТАВ МИКРООРГАНИЗМОВ ' В ПОЛОСТНОЙ ЖИДКОСТИ САМОК

ТАБЛИЦА 3

• ДАТА САМКА ОБЩАЯ ОБСЕЙ."11^ ВИДОВОЙ СОС. СРЕДЫ

МПА. ш ФЛЕКСИБЙС. ДЙПЛОБАК» КИНГ АН

5/5/199 52 100.500 56у>1ш/освамЛ аастпа.Ш. Аагтоб/Тиш. ^аесй&э. З^/зАр&сассШ Аа&кофЯ&М. йеютоуш

7/2/199' 3' 280.500 St АиитйЬйсШ. ш> „ агииигтМ-т. - - - - -

II Л 158.500 /2е1лтопаЛ - - - — -

И 5 178.500 (игжобиЯоцд ап^и£саЛит. - - - — -

проба) показало следующий состав микроорганизмов ( таблица 4). Таким образом, четыре вида, которые были обнаружены в полостной жидкости исследуемых самок ( таблица 3) найдены также и в поповых продуктах ( таблица 4).

В неопподотворенных икринках были обнаружены 10 микроорганизмов, среди которых фигурируют и грибки: Streptomyces filbus (и 3 случаях), Proteus vulgaris (3), Salmonella anatum, Staphylococcus 3aprophyticus (2), Staphylococcus aureus, Nocardia rubra, Nocardia spp, Aspergillus negros, Edwardsiella tarda (2), I'3eudomonas testoalcal igenes, при этом отмечаются значительные уровни общей обсеменённости.

Неноторые бантерии (Staphylococcus saprophyticus,

Staphylococcus aureus, Edwardsiella tarda, Pseudoraonas testoalcaligenes) встречаются затем и в оплодотворенных икриннах п процессе иннубации.

Неоплодотворенные икринки могут также получить микрофлору, передающуюся при нонтакте со спермой и остатками метаболизма (которые выделяются иногда с поповыми продуктами).

Путь передачи микрофлоры имеет место в основном до (в полостной жидности) и при оплодотворении, а затем оболочки и биофильтры действуют антибактериальными средствами.

В сперме встречены 8 видов разных микроорганизмов (таблица 4). Этот видовой состав был обнаружен при значительных уровнях общей обсеменённости для такой среды - от нескольких сотен до Л. ООО коп. /мл спермы. Часть обнаруженных в сперме микроорганизмов

ТАБЛИЦА 4

ОБЩАЯ ОБСЕМЕНЁЕШОСТЬ И ВВДОВОЙ СОСТАВ МИКРООРГАНИЗМОВ В ПОЛОВЫХ ПРОДУКТАХ ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ! ВЗЯТЫ ВЫБОРОЧНО)

__срвд_

ДЙгл 1РОИЭВО-] ДИТЕЛИ ЮЛОВЫВ ТРОДШЫ ЬЩАЯ 1и№: ¡лки^ц) НИИ . ш АГАР' ДЛЯ ФШСИШ- , ТЕР-Щ АГАР ДЛЯ ШЛОБДКТЕ-ИШ- ■КИНГ" для ПСЕВДОМОНА-ДОВ "АН" ДЛЯ АЭРО-■. МОНАДОВ

П/2/199 5 5« 9 икра нвоплод 2400 - - ' - -

(Г- спорна 450 - - ¿ШЯйы. ¿и&Ябг. + Уп£Ии\ тЬгя -

)/2/1991 5«! 8. икра нзоплод 900' ' - - -

п опэрма 330 - - + - + -

С1/2/195 3 ре 10 икра не оплод 640 - - гШйоб ЪтЪаашрис^Ясь /¡/осал^ив-ФГ.

м (Г» .сперма гэо - -

7/2/199' дь з икра расплод. 150.'5 Об \SfABbytacoeCu4 - - - - ■

и С" сперма 4000 * Яш:(£ил - - - - ■

и (№ 4 икра -наоплод, 16.000 - - - - -

и сперма 850 ■ШЫНуиЫ. - . - - - '

и ри 5 икра нвоплод, 3900 ' яиииЛ. - - - : - •

Оыпи выделены и из неоплодотворенных инринон ( Salmonella ana-turn, Proteus vulgaris. Staphylococcus 3aprophyticus, Streptomyces albus).

Следует отметить, что в поповых продуктах встречаются некоторые виды микроорганизмов (таблица 4), ноторые могут стать патогенными для лососевых: Edwardsiella tarda, ProteU3 vulgaris, Streptomyces spp и экземпляры из родов Pseudomonas, Nocardia и 5;taphylococcus (Toranzo et al.,1985). Эта минрофлора встречается не только в процессе иннубации, но и на дальнейших этапах иыращивания стальноголового лосося. Таким образом, половые продукты можно рассматривать как «переносчики» микрофлоры, могущие сформировать её на последующих этапах в цепи развития икринок. Маркирующим показателем этой роли «переносчика» может являться присутствие бактерий рода Streptomyces в половых продуктах обоих производителей, а также в икринках в течение инкубации. Любопытно, что представители этих микроорганизмов не встречаются ни в воде инкубаторов, бака, бассейнов, ни в полостной жидкости. В половых продуктах встречаются также представители группы энтеробактерий (таблица 4 ).

МИКРОФЛОРА ИКРИНОК СТАЛЬНОГОЛОВОГО ЛОСОСЯ Н РАННЕМ ОНТОГЕНЕЗЕ ПРИ РАЗНОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ

)!:1ятие проб проводилась после закладки оплодотворенных икринок в иннубаторы и до момента вылупления. Микрофлора инкубируемых инринок очень обильна при разной температуре и стдиях развития, как по общей обсемеиённости, так и по видовому

составу.

)! икринках при инкубации был обнаружен 21 вид бантерий при 77 ныделениях, среди которых: }'Jexibacter columnaris (8 случаев), Clytophaga crocatus (5), Staphylococcus haemolyticus (5), Staphylococcus aureus (6), Staphylococcus epidermidis (2), Staphylococcus saprophyticus (4),Pseudomonas testoalca1igenes (7), l'seudomonas aeruginosa (2), Pseudomonas spp (4), Lactobacillus i.pp, Enterococcus faecalis (2), Aeromonas hydrophila (4), Vibrio anguillarum (6), Vibrio alginolyticus, Escherichia coli (9),Yersinia ruckeri (3), Edwardsiella tarda (2), Nocardia farcinica, Bacillus cereus (3), Sarcina spp, Streptomyces spp.

;>уот видовой состав инринок нолеблетсп в широном диапазоне от одного инкубатора к другому при разных температурах : от 5 до 17°С и, соответственно, при различных стадиях развития от первых клеточных делений через стадию «глазка» до момента вылупления личинок.

I! опытах в каждом из инкубаторов при разной температуре и стадии развития икринок встречен разный состав микрофлоры. При более ниэних температурах встречаются психрофильные бактерии, такие как Oytophaga crocatus, при более высоних температурах теплолюбивые (меэофильные), такие как Flexibacter columnaris и пнтеробактерии, однако в инкубируемых икринках не наблюдается такого четкого веления между обеими группами в зависимости от •гомпературы кан в случае воды инкубаторов. У инкубируемых икринок наблюдается самая обильная (таблица 5) разнообразная микрофлора.

J-XUJMJJril-in. V/

ОБЩАЯ ОБСЕМЕНЁННОСТЬ И ВИДОВОЙ СОСТАВ {МИКРООРГАНИЗМОВ В ИКРИНКАХ В ПРОЦЕССЕ ИНКУБАЦИИ ( ВЗЯТЫ ВЫБОРОЧНО )

1 дни Ьоетв рпло- ЁОТВО-3?ЕНИЯ КОЛИЧЕСТВО ГРАДУС. ДЩЙ САМКА (?) ГЕМПЕ-РАТШ ('С ) ■CTALT: . дш РАЗВИ тияЛ рБЩАЯ ЭБСЕМ.. СРЕДЬ!

('пш ДДА АГАР для флекоиб^к АГАР ДЛЯ диплобак- "КИНГ"ДЛЯ поавдоио- flUIKffl- "АН" ДЛЯ аэромона-

9/4/92 : 24 120 ■ 9 Е7 5 /гсшниЛ inS/щеинс; 9100 L + +

и п 192 и 8 . Siuymt- Ш1£. 12000 - +. , t - -

•I II 254. II ¡нижние- ЧШ. 16000 - + + - -

п и 336 II 14 tUjftue. HU£. 16000' + • + + ; - -

2/3/93 19 95 * 2 №9 5 ШШНий ' WJpiuutuej 8500 +• Cyliphaaa. спеаылЛ, - +S. ititMelyltaii Тзьщ&моп&А iff. tM JfiffiSaUutixfy

и h 152 и 8 йвмнии mijuuUKtj 9400 + С. oucaXai. s A. Jvjcbephil*. + + P. avtu^irusa, S. xfufytuv i* enccafZa

п и 209 п II, ЪЩХв.. 12000 + S. Mfufylfiui ■, FT ciCuMntxis. - +S. аилам. Iff, St&tfUCUii JZtfCA

п и 266 п 14 Uaqka.. 12000' i-y/dtio ап}Ы4аХФ,_ ffatfacfet сс&т- пали. oiutuufJiLs - + Нсш&мш T. cc&imкали.. £nCuiceau4 £ЛШИ ■f S. tfiCc&njrudCs,

и II ; 323 и 17. ¿(■¿умение. 89000 _ + СуТорйДул. tnccafhi + fJoauuUa-^алсШел. + 1? etiuAittisti S. сЛ. + 1силщашЦ

2/3/9: 22 220 2 №8 10 Wfycu.. 34500 ** Шио inpuL&vtum. +'ymCuitL . личные + 1-Xvtsini'a. XiLCKVtC, tiKciibvHiuai.

и 19 190 '9 №10 10 шдкл. 14000 rKcx. ceCumiwiis, uit&UUun.. пил kmc. ' + +S. аилии. ЪсшЬясшм s/f с. ate. + CgfopiiaaiL. Uwcatui.

течение всего процесса инкубации в икринках часто нстречаются микроограниэмы, которые были обнаружены также в пидовом составе микрофлоры предыдущих этапов: в воде бака нодоснабжения, инкубаторов и бассейнов, в полостной жидкости самок, в половых продуктах, в неоплодотворенных икринках. Это говорит о том, что существуют пути в одной и той же цепи, связанные с передачей микрофлоры через инкубационный процесс от самих производитепей и условий их среды содержания до момента пылупления из инринон. Поэтому непосредственно после вынлева предличинок, при 16°С встречаются представители микрофлоры, обнаруженной и при инкубации (таблица 6). Это подтверждает роль «переносчинов», которую осуществляют икринни во всей цепи развития от неоплодотворенной икры до предличинни при вылуплении через инкубируемую икру, при разных температурах и стадиях эмбриогенеза. Лругим маркирующим показателем этого является присутствие бактерии К'Ьгер^тусез в сперме, неоплодотворенной и инкубируемой икре, которая не встречается в других средах, таких, кан вода и полостная жидкость.

Указанный видовой состав в икринках был обнаружен при весьма значительных показателях общей обсеменённости для 1 мл суспензии содержимого инринон от нескольких десятнов нолоний до ста и более (таблица 5),в отличие от проб,полученных из воды или из полостной жидкости. Тем более, если учесть маленькие размеры икринок (оноло 40 мг веса и 4 мм диаметра), и,, что, хотя мы говорим о сопутствующей микрофлоре, она в основном является внутренней.

ТАБЛИЦА 6

МИКРОФЛОРА ПРЕДЛИЧИНОК НЕПОСРЕДСТВЕННО ПОСЛЕ ШЛУПЛЕНИЯ 9?

Трс) ИНКУБ, (раньше) тм в БАССЕЙ НАХ ОБЩАЯ ОБСЕМ. (71 КОЛ/ЫЛ) срЕда

ДДА СРЕДА ДЛЯ ФЛЕКСИБАКТЕРИЙ СРЕДА ДНЯ ДИШГОБАКТЕРИЙ

5 16 3600. — Уаи'т'а. 1иск?и. + Ззлипа. т<гх!та.. йикЬ/а. ке/рИ-

8 16 19000 — Скитапт Л(оса&ска. алШшсШ.

II 16 23500 — + + /\fccaKcfax,

14 16. 30000 — ^.¿шухенл! ¿гусби/ЛиА

Общая численность микрофлоры в иннубируемых икринках меняется с температурой в каждом инкубаторе от 5° до 17°. В анспериментальных иннубаторах увеличение происходит не только на переходе от неоплодотворенной икры к инкубируемой, но и закономерно и постепенно с изменением температуры у икры всех исследуемых самок (6).

Широкий диапазон микрофлоры,. который встречается у инкубируемых икринок при значительных уровнях общей численности на 1 мл содержимого суспензии, становится более значимым, имея в виду частое выделение у икринок опасных патогенных для лососевых на разных этапах развития, среди них: Flexibacter columnaris (8), C.'ytophaga crocatus (5), Pseudomonas aeruginosa (2), Lactobacillus i.pp, Aeromonas hydrophila (4), Vibrio anguillarum (6), Vibrio alginolyticus. Yersinia ruckeri (3), Edwardsiella . tarda(2) . Дти потенциально опасные патогенные микроограниэмы могут, по данным опытов, передаваться через икринни на последующие ^тапы. Встречаются и бактерии из группы энтеробантерий: Edwardsiel la tarda (2), Escherichia coli (9), Yersinia ruckeri (3).

)! проведенных опытах выживаемость икринок определялась по отношению к числу первоначально заложенных в инкубаторы икринок (по данным B.C. Агапова). Выживание, в этом случае , означает число икринок, которые вылупились н нонцу инкубации. В экспериментальных иннубаторах было использовано 8 самок, причем самые высокие показатели выживания икринок после вылупления были обнаружены в основном в диапазоне температуры от 8 до 11°.

Оптимальной температурой для развития инринон стальноголового лосося, по данным шестилетнего (1989-19Э4гг) исследования )!. С. Агапова на Б. Утрише, оказалась - 11°С.

Хотя при 5 и встречаится в икриннах типичные патогенные холодолюбивые, тание нан Vibrio anguillarum и Cytophaga crocatus, трудно обнаружить какие-либо закономерности, могущие связать присутствие микроорганизмов в икре с их выживанием.

Наиболее интересные результаты обнаружены при высоких температурах инкубации: 14 и 17°С. В этих опытах отмечены (В.С.Агапов) самые низкие проценты выживания икринок, доходящие до нулевых значений: 17° является фактически летальной температурой для икры. В указанных опытах микрофлора в икриннах при обеих температурах оказывается количественно и качественно обильна.

В случае с икринками речь идет о миллилитре суспензии содержимого самой икры - в основном, периветиллиновой жидкости. Таким образом, пределы ста и более коп. /мл в икринках, вероятно, являются значительными. Настоящая работа решает этот вопрос впервые.

Данные наблюдения показывают, что между общей обсеменённостью микрофлоры и % выживания икры не существует прямой корреляции. Однако, общая обсеменённость микрофлоры в инриннах несомненно свидетельствует о потенциальной возможности действия определенной массы микроорганизмов на разные этапы онтогенеза стальноголового лосося, как, вероятно, и любой другой рыбы. Эта возможность лействия на метаболизм рыбы и, соответственно, влияния на

ныживаемость, увеличивается с повышением числа микроорганизмов в инриннах. Тем более, что среди всех минроорганизмов присутствуют типичные патогенные или условно- патогенные для стальноголового лосося, которые при 14 и 17° встречаются в инриннах: Edwardsiella tarda, Escherichia coli, Flexibacter columnaris, Vibrio anguillarum, Aeromonas hydrophila, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas spp. Эти бантерии , обнаруженные в икринках, могут илиять на их метаболизм и, соответственно, на выживание. Кроме того, они могут передаваться через сами инкубируемые икринки в последующие этапы развития рыбы, где, в зависимости от состояния рыбы и условий выращивания, могут влиять на выживание. Температуры 14 и 17° являются оптимальными для роста большого диапазона иышеупомянутых патогенных микроорганизмов, а также для действия их Ферментов. Некоторые из этих микроорганизмов, в основном, бактерии (I'aeudomonas, Vibrio, E.coli и т.д.) выделяют вредные ферменты (токсины, споры и т. д. ) в организме, где находят благоприятные для роста условия. Их патогенность зависит от выделения ферментов ( Stanier et.al.,1985) .

ПУТИ ПЕРЕДАЧИ МИКРООРГАНИЗМОВ В ХОДЕ ИНКУбАЦИИ ИКРЫ СТАЛЬНОГОЛОВОГО ЛОСОСЯ Сопутствующая минрофлора в ходе инкубации икры в тех средах, которые внлючаются в течение этого процесса, оказывается в основном достаточно обильной по общей численности и видовому составу.

Рид представителей этой микрофлоры выделяется в нескольких

средах подряд: в воде бассейна, инкубаторов, в полостной жидности сямон, в поповых продунтах, в икринках, в личинках. Среди этих микрооорганиэмов часто встречаются патогенные и условно патогенные микроорганизмы, а также микроорганизмы фекального загрязнения. В основном встречаются бактерии, но также обнаружены дрожжи и грибки. По отношению н температуре обнаружены мезофильные (теплолюбивые) и псих рофильные (холодолюбивые) микроорганизмы. МаИдены не тольно представители пресной воды, но и морской из-за своеобразия источника водоснабжения (4%о).

Самые высоние показатели общей обсеменённости встречаются в иоде бассейна для производителей (коп. /мл воды) и в полостной жидкости самой (кол. /мл суспензии жидности),а затем в инринках в ¡намкнутой системе инкубаторов при разной температуре и?в.

последнюю очередь^ в предличиннах. Наименьшие показатели общей численности микроорганизмов встречаются в поповых продуктах, а. затем - в воде инкубаторов и источнине водоснабжения (бан).

Интересно отметить сходные пределы обсеменённости между некоторыми средами этой цепи: вода бассейна для производителей и полостная жидкость самок (1), вода инкубаторов и бак (2), икринки мри инкубации и личинки (3). В случае 1, вероятно, можно говорить о том, что условия содержания производителей в бассейнах могут стать источником передачи микрофлоры в самок. В случае 2 это естественно, так как бак является источником снабжения инкубаторов. Здесь расхождения зависят от самого процесса иннубации в воде инкубаторов при разных температурах. В последнем,

ом случае, это, по всей вероятности, связано с тем, что икринки н основном переносят ту минрофлору ( главным образом внутреннюю), которая и встречается непосредственно после вылупления у предличинок до перехода на экзогенное питание (где микрофлора может быть и внешней).

Но видовому составу микрофлора оказывается в основном достаточно обильной во всех средах цепи развития икры. Качественная картина микроорганизмов является разнообразной, с широким диапазоном видов, некоторые из них показывают большую встречаемость (около 10 раз).

Колыпинство микроорганизмов встречается в нескольких средах цепи инкубации этого лосося, что свидетельствует о существовании путей передачи этой микрофлоры от первоначальных моментов 1 вода в бассейнах для производителей и баке водоснабжения) до вылупления и непосредственно после него. Эти пути взаимосвязаны. Таким образом, мы считаем, что современные методы санитарного контроля пыращивания стальноголового лосося и других видов рыб должны учитывать эти пути возможной передачи микрофлоры с первоначальных этапов во всем процессе культивирования. Микробиологический контроль должен быть более предупредительным, . чем, нак это сложилось традиционно, лечебным путем при состоявшихся уже признаках заражения.

Основными путями передачи минрофлоры могут быть следующие (таблица 7). Сначала источниками передачи микроорганизмов являются бак водоснабжения для воды инкубаторов и бассейны, где содержатся

ЗлДОЗОЙ СОСТАВ МИКРОФЛОРЫ В ЦЕ1П1 ¿ШШГБА1Ш ЛСРЙЙОК. СТАЛЬНОГОЛОйОГО ЛОСОСЯ

ВОДА. БАССЕЙНА ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ водл- • • ■ ИНКУБАТОРОВ ПОЛОСТНАЯ 2ИД. ПОЛОВЫЕ ПРОД. ИКРИНКИ ПРЕДЛИЧШИ

£иЧйиишМ /ислйЩ

£<ь?еисбсси4 У/>. г

ВГ.'китс^АиЦ (5), $/:Аииш>1у1?1иА Сг). $/: МяшхАуКии(5')_

г/: (г). & (ч).

(/бемс/йь /иипил. /Ли*ШМА*. МсилМ'л. /¡мШел. А/осапЖл-

Т&И&Яп а&ягит: (3). айиииаи! Т&С&Лх ?)

¿"хЛиисЬ'ъ ик. ЫамЖм1 (9). ЕиАш'с1л'а- (г).

УШ/гил 7сд зеит/'.оз. УШма. юаалССз). Уеги'шл шспиС.

{¿¡Шлчк'яНа. . Ес/ош(й1Ша ТШй.0,

виитохМ АубЬсркк ¿¡¡мнпиц СЬишШ ¿р/пуМс^

5Тарку/£>исш4 аалес/х ЗТШлишии аилилш Vг/МатОИзт.

СакскЖх 4.

ЪшШ лМг&Сг). %а.аеш ачац(ъ).

ДлртуШМ шуиЛ.

¡/¡¿ги> ш^шИляшл. МЫс амушМмдм (¿) //¡¿¡¿а а*$ш£1АЛит(5)

а/4

ЗЯцрЯйиуи! sff^. ЗЬир/отусс* ¡рр.

Золена* УлохСгла..

СуТорЬ&^А. сИиХи4(5,

ТЬщ&мсхМ пц Иш/яжМ тЫшЬ/шш^

ЪшЪняна 'гг(ч)

производители. Тольно при определенных условиях инкубации представители микрофлоры воды иннубаторов могут стать угрозой для инкубируемых икринок, например, грибок Saprolegnia и условно патогенные бактерии: Staphylococcus spp, Б. coli, которые нстречаются и в икринках. Скорее всего условия содержания производителей в бассейнах определяют их микрофлору, например, у самок в полостной жидности, где встречаются бактерии, выделенные из воды самого бассейна (Мaphylococcus haemolyticus, Flexibacter columnaris, Vibrio angui1larum) .

Затем, нак уже было сказано выше, сами неоплодотворенные инринки, находясь в полостной жидкости самки с открытыми микропиле, при созревании могут принимать часть присутствующей микрофлоры в этой среде. Икра становится носителем микрофлоры в течение процесса инкубации от оплодотворения до вылупления. Полостная жидкость и неоплодотворенные икринки показывают плотный нароет микроорганизмов в тех же самых средах для флексибактерий, диплобактерий и псевдомонад. Неоплодотворенные икринки могут также получить микрофлору, передаваемую при нонтакте со спермой (встречаются одновременно в половых продуктах обоих производителей: Streptomyces albas, Salmonella anatum, Proteus vulgaris, Staphylococcus saprophytious и др. ), они могут поступать танже с остатками метаболизма.

Половина микроорганизмов, которые были обнаружены в сперме, ныдепилась и из неоплодотворенных икринок. По всей видимости, спорма является источником микрофлоры для икры при контакте с

пеоплодотворенной икрой. Эти микроорганизмы встречаются затем в инкубируемых икринках в ходе их развития: видовой состав микрофлоры поповых продуктов и икринок является очень близким и часто совпадает (таблица 7).

МОсле оплодотворения и при разных температурах эта минрофлора развивается в иннубируемых икринках. Так же кан в полостной жидкости и половых продуктах, в икриннах встречается самая обильная и разнообразная минрофлора. Температура играет здесь, по данным опытов, значительную роль.

В течение всего процесса инкубации в икринках часто пстречаются микроорганизмы, обнаруженные на предыдущих этапах ( в иоде бана водоснабжения, инкубаторов и бассейнов, в полостной жидкости самок, в поповых продуктах,в неопподотворенных икринках) (таблица 7). Это свидетельствует о том, что существуют пути передачи микрофлоры во время инкубационного процесса от самих производителей и условий их содержания до вылупления икринок. Кроме этого, непосредственно после выклева у предличинон пстречаются представители минрофлоры, обнаруженной при инкубации инры : E.coli, Yersinia ruckeri, Aeromonas hydrophila,

Staphylococcus aureus, представители родов Nocardia и Sarcina.

Приведенные примеры позволяют утверждать, что икринни играют роль «переносчиков» во всей цепи развития от неоплодотворенной инры до стадии предличинни при выпуппении через инкубируемую инру при разных температурах и стадиях эмбриогенеза.

Опираясь на сочетание всех показателей ( значительные уровни

( ' щей численности и присутствие патогенных и условно патогенных 1 икроорганиэмов, среди которых находятся и энтеробантерии!, I.иможно в определенной мере объяснить те низкие проценты I-.живания инринок ( по данным В. С. Агапова) вплоть до нулевых значений, особенно при более благоприятных для роста микроорганизмов температурных режимах (14 и 17°).

П >лученные при выращивании стальноголового лосося на Б. Утрише результаты могут быть использованы для других анадромных видов )'Ыб, культивируемых на побережье моря в искусственных условиях, несмотря на тание специальные условия инкубации, как разные •I омпературы, замкнутая система водоснабжения, а также на )' нальную особенность ( пресная вода с примесью в виде соленой поды).

ВЫВОДЫ

1. При изучении сопутствующей минрофлоры в процессе инкубации стальноголового лосося в замкнутой системе водоснабжения "существлено 195 выделений микроорганизмов, среди которых встречены 38 разных видов бактерий (в основном), дрожжей и 1 рибков. В данной работе 3 видов были выделены впервые в условиях '■ассейна северо-восточной части Черного моря при выращивании этого объекта. Выявлению большого разнообразия микрофлоры несомненно способствовало использование широкого диапазона питательных сред.

В процессе эмбриогенеза стальноголового лосося в инкубационной замкнутой системе установлено изменение видового

разнообразия, а также общей численности микроорганизмов, сопутствующих икре при разной теимпературе. В пределах 5 и 8° обнаружены холодолюбивьге или психрофильные формы, а при И, 14 и 17°- тепгоюбивые или мезофильные.

П В воде инкубаторов в течение иннубации наблюдается увеличение числа кишечных палочен, особенно при 17°, ухудшающее качество воды. Обсеменённость рыбы энтеробантериями важна в отношении санитарной оценни товарного материала.

4 . В процессе получения икры и её иннубирования создается микробиологическая цепь, включающая такие звенья, кан вода С>иссеИна, где содержатся производители, полостная жидкость самок, половые продукты (сперма и неоплодотворенная икра), инкубируемые инринни, вода инкубаторов и бака их водоснабжения, а также иредличинки.

Оплодотворенные инринки, у которых наблюдается количественно и качественно обильный состав . микрофлоры, играют роль «переносчинов» микрофлоры, начиная с полостной жидности самок и кончая предличиннами непосредственно после вылуппения.

5 Развивающаяся в процессе инкубации микрофлора влияет, пероятно, на выживаемость икринок, особенно при более высоких температурах инкубации (14 и 17°), приводя иногда н нулевым значениям. При этом в икринках встречаются значительные показатели эбщей обсеменённости и выделяются патогенные микроорганизмы, /словно патогенные микроорганизмы, а танже энтеробантерии.

Ъ При микробиологической оценке процесса выращивания

стальноголового лосося необходимы два поназателя: общая обсеменённость и видовой состав микрофлоры во всех звеньях развития икринон от полостной жидности самон до вылупления.

7 При санитарном контроле микрофлоры водыtпроизводителей, половых продуктов, инкубируемой икры и её выживания несомненно должны применяться разнообразные меры предотвращения высокой численности микроорганизмов, нак с использованием методов ихтиопаталогии, тан и путем совершенствования таних установон, кан биофильтры и ультрафиолетовое облучение на разных этапах иннубационного процесса. Это позволит получить продукцию

имсоного качества и повысить экономические показатели

лососевых рыбохозяйств.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. АсореИ Риапь X. А. Минрофлора стальноголового лосося

(0ncorhynchu3 mykiss) в процессе инкубации икры в замкнутой системе водоснабжения. Систематика, биология и биотехнина разведения лососёвых рыб. 5-ое Всероссийское совещание ГосНИОРХ. С.-Петербург. 19Э4. с. 13-14.

2. АсореИ Риаль X. А. Сопутствующая минрофлора в процессе инкубации стальноголового лосося (Oncorhynchus mykiss) при разных температурах в рециркуляционной системе. Систематика, биология и биотехника разведения лососевых рыб. 5- ое Всероссийское совещание ГосНИОРХ. С.-Петербург. 1994. с. 15-16.

3. Асорей Риаль X. A. Microflora asociada al proceso de incubación del salmón cabeza de acero (Oncorhynchus mykiss) en.