Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сомаклональная изменчивость растений и возможности ее практического использования

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Сомаклональная изменчивость растений и возможности ее практического использования"

На правах рукописи

ДОЛГИХ ЮЛИЯ ИВАНОВНА

! !

СОМАКЛОНАЛЬНАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ РАСТЕНИЙ И ВОЗМОЖНОСТИ ЕЕ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ (НА ПРИМЕРЕ КУКУРУЗЫ)

Физиология и биохимия растений -- 03.00.12

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученей степени доктора биопогичесхих наук

Москва 2005

Работа выполнена в лаборатории генетики культивируемых клеток отдела биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН

Научный консультант:

Официальные оппоненты

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор З.Б. Шамина

доктор биологических наук, профессор Г.А. Романов

доктор биологических наук, профессор Л.А Лутова

доктор биологических наук, профессор 8 А. Высоцкий

Биологический факультет Московского государственного университета им № 3 Ломоносова

Защита диссертации состоится « 7.. июня 2005 г в 11 час на заседании Диссертационного созе~а Д.002 210 01 чри Институте физиологии растений им К.А.Тимцряззва РАН по адресу. 127276, Москва, ул Ботаническая, 35

С диссертацией можно ознакомиться з библиотеке Института физиологии растений им К.А Тимирязева РАН

Автореферат разослан ¿г . апреля 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук ___ Н В. Загоскина

Актуальность проблемы. Индуцируемая культивированием тканей in vitro и проявляющаяся у растений-регенерантов изменчивость получила определение «сомаклональной изменчивости», а измененные растения были названы сомаклонами или сомаклональными вариантами. Сомаклональная изменчивость обнаружена у регенерантов большинства исследованных видов растений. Описаны сомаклонапьные вариации по морфологическим и биохимическим признакам, физиологическим параметрам. Изменения происходят как в ядерной, так и в хлоропластной и митохондриальной ДНК, встречаются растения-регенеранты с крупными перестройками генома и с точковыми мутациями [Скаукрофт, 1990].

Индуцированная in vitro изменчивость позволяет существенно повысить генетическое разнообразие исходного материала, благодаря чему представляет большой интерес для селекции новых сортов растений. Вместе с тем, возникающие при культивировании тканей in vitro неконтролируемые мутации являются нежелательными при микроклонапьном размножении или генетической инженерии. Поэтому очень важно знать закономерности сомаклональной изменчивости и уметь ее регулировать.

В настоящее время установлено, что дедиференциация при введении тканей в культуру in vitro и редифференциации при регенерации растений, а также культивирование клеток на искусственных питательных средах оказывают существенное влияние на стабильность генома и характер экспрессии генов Накоплено много данных по вариабельности морфологических признаков, а также числа и структуры хромосом у растений-регенерантов [D'Amato, 1985; Кагр, 1995]. Высказан ряд гипотез о происхождении сомаклональных вариаций [Yeoman, 1981; Phillips et al., 1994]. В меньшей степени сомаклональная изменчивость исследована на молекулярном уровне [Goodwin et al., 1997; Гостимский и др., 1999]. Несмотря на активное исследование, открытыми остаются вопросы о влиянии условий культивирования клеток на частоту сомаклональной изменчивости, о соотношении среди сомаклональных вариаций мутаций и изменений негенетической природы, о стабильности сомаклональных вариантов, о реализации на фенотипическом уровне хромосомных аберраций или изменений ДНК. Неясно, отличается ли сомаклональная изменчивость по частоте и спектру изменений от классического мутагенеза у целых растений, какие признаки сильнее подвержены вариабельности в уел Из-за использования

БИБЛИОТЕКА

разными авторами разных видов растений и разных способов изучения трудно оценить характер сомаклональной изменчивости в целом.

Препятствием к широкому использованию культивируемых клеток в селекции являются трудности, возникающие при регенерации растений. До сих пор не выработаны общие подходы к регуляции морфогенеза in vitro, из-за чего для каждого вида и даже сорта условия регенерации растений приходится подбирать эмпирически.

Кукуруза, выбранная в качестве объекта изучения сомаклональной изменчивости, является важной сельскохозяйственной • культурой, она хорошо охарактеризована с точки зрения физиологии и генетики. Составлены подробные генетические карты хромосом кукурузы Вместе с тем, генетическое разнообразие существующих сортов этой культуры очень ограничено. Мировой банк зародышевой плазмы кукурузы представлен, главным образом, формами тропического происхождения, неадаптированными к длинному световому дню и короткому вегетационному периоду умеренных широт [Earle, Kuehnle, 1990]. Поэтому актуальным является создание новых форм растений, сочетающих высокую продуктивность с экологической пластичностью Ускорить и облегчить процесс селекции призваны новые методы создания исходного селекционного материала, в том числе, сомаклональная изменчивость и клеточная селекция

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение закономерностей сомаклональной изменчивости и оценка возможности ее использования для создания растений кукурузы, толерантных к неблагоприятным условиям окружающей среды.

В задачи исследования входили:

1) разносторонняя характеристика сомаклональной изменчивости кукурузы, включающая оценку на морфологическом, физиологическом, биохимическом, хромосомном и молекулярном уровнях;

2) исследование роли генотипа и экзогенной регуляции в обеспечении способности клеток к морфогенезу in vitro и выявление факторов, повышающих эффективность регенерации растений;

3) разработка селективной системы и отбор среди сомаклональных вариантов растений кукурузы, толерантных к абиотическим стрессам (засухе, засолению, неблагоприятным температурам).

Научная новизна результатов исследований.

В результате применения различных методических подходов для анализа одних и тех же растений-регенерантов впервые дана комплексная оценка и выявлены закономерности сомакпональной изменчивости кукурузы. Показано, что культивирование in vitro в первую очередь индуцирует многочисленные отклонения от нормального развития растений. В основе этих нарушений лежат, главным образом, ненаследуемые модификации, вызванные условиями культивирования клеток.

Среди наследуемых изменений морфологических признаков наиболее высока частота вариабельности количественных характеристик. Частота изменчивости качественных признаков близка к уровню, характерному для спонтанного мутагенеза.

Процессы дедифференциации и редифференциации при введении в культуру in vitro и последующей регенерации растений индуцируют нарушения экспрессии генов. У сомаклонов кукурузы это проявляется в виде аномалий развития растений, нарушений тканевой специфичности. Частота подобных изменений может достигать 100% Часть эпигенетических вариаций наследуется.

Культивирование тканей в стрессовых условиях повышает частоту сомакпональной изменчивости, в наибольшей степени возрастает доля летальных и полулетальных изменений.

Впервые у сомаклонов кукурузы проанализирована изменчивость RAPD- и ISSR-маркеров, и обнаружен высокий уровень полиморфизма ДНК. Клонирование и секвенирование полиморфных фрагментов выявило многочисленные мутации в виде замены нукпеотидов и делеций. Для некоторых полиморфных фрагментов показана гомология с повторяющимся последовательностями кукурузы. Обнаруженные у регенерантов изменения наследовались по доминантному и кодоминантному типам в соответствии с законами Менделя.

Появление сомаклональных вариаций в гомозиготной форме, а также нестабильное наследование измененных признаков указывает на возможную роль в становлении сомакпональной изменчивости процессов митотической и мейотической рекомбинации и активации мобильных генетических элементов

Сформулирована двухэтапность процесса морфогенеза в культуре тканей in vitro, и впервые охарактеризован тип регуляции каждого этапа. На стадии индукции эмбриогенного каллуса кукурузы преобладает влияние генотипа, а на стадии регенерации растений из соматических эмбриоидов большее значение

имеют условия культивирования и состав питательной среды Впервые показано повышение частоты регенерации растений под действием эмистима, цефотаксима и слабого постоянного электрического тока Впервые показана зависимость морфогенетического потенциала от соотношения гормонов в клетках эксплантов кукурузы.

На основании изучения характера сомаклональной изменчивости, а также реакции культивируемых клеток и растений на абиотические стрессовые факторы разработаны методы клеточной селекции толерантных к засухе, засолению и экстремальным температурам форм растений.

Научно-практическая значимость работы.

В результате проведенной работы получены и разносторонне охарактеризованы мутантные линии кукурузы, маркированные специфическими фрагментами ДНК. Эти почти изогенные линии являются незаменимым материалом для физиологических, биохимических и генетических исследований.

На основе изучения регуляции морфогенеза предложены способы повышения эффективности регенерации растений из культивируемых тканей кукурузы. Разработанные оригинальные подходы существенно расширили круг генотипов, способных к регенерации растений.

Впервые получены растения кукурузы, обладающие повышенной устойчивостью к засухе, засолению и неблагоприятным температурам Сравнение физиологических и биохимических показателей устойчивых и чувствительных клеточных линий и растений-регенерантов свидетельствует о том, что культивирование in vitro индуцировало множественные изменения метаболизма, которые в сумме обеспечили сохранение способности к росту и морфогенезу в стрессовых условиях. Показано сохранение толерантности в потомстве растений-регенерантов Таким образом, подтверждена перспективность применения культивируемых тканей для повышения устойчивости к неблагоприятным природным условиям.

Предложенная схема клеточной селекции, сочетающая непродолжительный, но жесткий отбор in vitro с сохранением регенерационного потенциала, является универсальной и может быть рекомендована для других видов растений.

Полученные данные используются при чтении лекций в рамках спецкурсов «Культура клеток растений и биотехнология» на каф физиологии растений МГУ и «Основы микробиологии и битехнологии» на каф. экологической и промышленной

биотехнологии МГУ инженерной экологии. Они включены в учебное пособие Р Г.Бутенко «Культура клеток растений in vitro и биотехнология»

Положения, выносимые на защиту

1. Культивирование тканей in vitro индуцирует множественные изменения у растений-регенерантов, среди которых есть как мутации, так и ненаследуемые изменения. Генетическая изменчивость возникает на ранних этапах культивирования, ее частота увеличивается при продолжительном выращивании клеток in vitro и под действием стрессов. Наиболее подвержены сомаклональной изменчивости признаки, связанные с программами развития

2. Способность культивируемых тканей к регенерации растений детерминирована зависящим от генотипа балансом эндогенных фитогормонов и может варьировать в определяемых генотипом пределах под воздействием внешних регуляторов.

3. При условии подбора адекватного селективного фактора культуры клеток in vitro могут быть успешно использованы для отбора растений, толерантных к засухе, засолению и экстремальным температурам.

Апробация работы

Материалы, вошедшие в диссертационную работу, были представлены на Межд. конф. «Биология культивируемых клеток и биотехнология» в Новосибирске, 1988, Алматы, 1993, Москве, 1997, Саратове, 2003; III и V Съездах ВОФР в С-Петербурге , 1993 и Пензе, 2003; III Съезде ВОГИС в Москве, 2004; VII Intern Conf. "Plant Tissue and Cell Culture", Amsterdam, 1990, 39th Ann. Europ Tissue Culture Soc. Meeting, Kracow, 1991; Intern. Symp. "Plant Biotechnology and Genetic Engineering", Kiev, 1994, Intern. Symp. "Stress and Inorganic Nitrogen Assimilation", Moscow, 1996; XVIil Intern. Conf "Maize and Sorgum Genetics and Breeding at the End of 20th Century, Belgrade, 2000; NATO-Russia Intern. Workshop "Phytohormones in Plant Biotechnology and Agriculture", Moscow, 2003; I - III Конф. «Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии, Москва, 1996, 2000, 2004; Конф по генетике соматических клеток в культуре, Звенигород, 1989, Черноголовка, 1993 и др.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 33 статьи и 26 тезисов, получен 1 патент.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, трех глав, каждая из которых включает обзор литературы, описание материала и методов исследования и изложение результатов с обсуждением, выводов и списка литературы. Работа изложена на 385" стр, включает рисунков и УЛ таблицу. Список литературы состоит из наименований.

Работа выполнена в лаборатории генетики культивируемых клеток отдела биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений им. К А.Тимирязева РАН Основные результаты получены автором лично Часть исследований выполнена совместно с сотрудниками ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии Э.Е.Хавкиным и М.В.Забродиной (анализ изоферментов эстеразы и пероксидазы), Д.М.Атаевой и Т Б.Дубровиной (хромосомный анализ),

сотрудниками ИФР РАН Т Н Пустовойтовой! и Н Е.Ждановой (определение

уровня гормонов и исследование засухоустойчивости растений). На разных этапах работы в ней принимали участие сотрудники и аспиранты лаборатории С Н.Ларина, В Г Богунова, Е.С.Осипова, Г Б Китлаев, С Диас, А Ю Степанова. Всем соавторам выражается искренняя благодарность Автор также признателен сотруднику КНИИСХ В С Щербаку за ценную консультативную помощь

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Исследования сомаклональной изменчивости проводили на инбредной линии кукурузы (Zea mays L) А188. При изучении регуляции морфогенеза были использованы генотипы американской селекции (А188, А344, 346, WD), линии, выведенные в Краснодарском НИИ сельского хозяйства (Гк26) и Днепропетровском Институте кукурузы (ДК66), линии китайского (Chinese 31) и венгерского (Паннония) происхождения, а также несколько латиноамериканских рас (Cateto Sulino Grosso, Tuxpeno Norteño и Nal-Tel) При выборе селективного фактора, моделирующего влияние засухи на растения, использовали несколько линий кукурузы с различной устойчивостью к недостатку влаги' американские генотипы' W64, В73 и линии селекции КНИИСХ: Гн118, Гк26 и Гн19 Клеточную селекцию проводили на каллусных тканях, полученных от незрелых зародышей гибридов F2 от скрещивания высокоморфогенных линий А188, Pioneer3978 и Chinese 31 с латиноамериканскими расами Catteto S G , Tuxpeno N и Tabloncillo Perla Латиноамериканские расы были выбраны как возможные доноры генов

засухоустойчивости. Семена были любезно предоставлены сотрудником отдела кукурузы КНИИСХ В.С.Щербаком.

Растения выращивали зимой в сосудах с почвой в теплице с естественным освещением при температуре 20-25°С, а летом в вегетационном домике и в поле. Опыление проводили со строгой изоляцией мужских и женских соцветий.

Морфо-физиологические признаки анализировали у растений, выращенных в полевых условиях в Подмосковье и в Краснодаре на опытном участке КНИИСХ. Анализировали не менее 20 растений из потомства каждого регенеранта в каждом поколении Морфологические признаки описывали на стадии цветения после появления початков, оценку початков делали после созревания. В качестве контроля использовали растения исходной линии А188, выращенные в тех же условиях, что и опытные растения Учитывали следующие количественные показатели: высоту растения, число листьев, длину и ширину четвертого сверху листа, высоту и число веточек метелки, число и размер початков, число рядов зерновок и число зерновок в ряду на початке, массу 100 зерновок, а также качественные признаки: окраску листьев, стебля, цветковых чешуй, зерновок и стержня початка. Для количественных признаков сравнивали средние величины со стандартной ошибкой у сомаклонов и линии А188, достоверность разницы определяли по критерию Стьюдента при Р<0,05 [Рокицкий, 1974].

Каллус получали из незрелых зародышей, изолированных на 12-14 день после опыления. Для индукции и культивирования каллуса использовали среду Мурасиге-Скуга, содержащую 30 г/л сахарозы и 1 мг/л 2,4-Д Регенерацию растений проводили на среде МС без гормонов.

Хромосомы исходной линии А188 и сомаклонов исследовали методом дифференциального окрашивания (С-сегментация) [Вайаеу, 1985] Хромосомные препараты готовили и окрашивали по общепринятой методике [Романова и др, 1990] У исходной линии было проанализировано 17 полных метафазных пластинок, полученных из 10 корешков У регенерантов было проверено по 2-4 потомка (Я^) Для каждого растения брали по три полные метафазные пластинки из меристематической зоны главного корня

Анализ изоферментов эстеразы и пероксидазы проводили по методике, разработанной ЭЕХавкиным и М В Забродиной [Хавкин, Забродина, 1994] Электрофоретические профили изоформ эстеразы и пероксидазы были получены для исходной линии А188 и ряда сомаклонов в 2-4 поколениях от самоопыления

Идентификация локусов пероксидаз и эстераз в изоферментных спектрах осуществлялась на основе сопоставления органоспецифичной экспрессии этих ферментов у различных генотипов кукурузы [Brewbaker et al, 1985; Забродина, Хавкин, 1992]. Зимографический анализ проводили в двукратной повторное™

ДНК выделяли из двухнедельных проростков методом, описанным Moller et al [1992] Амплификацию проводили в программируемом термоциклере МС2 (ЗАО «ДНК-Технология», Москва), подробная методика описана в статье Осиповой и др. [2001]. Продукты реакции разделяли электрофорезом в 2% агарозном геле с бромистым этидием в ТВЕ-буфере. Для определения длины фрагментов использовали маркеры М1 (1 kb DNA Ladder), М2 (100 bp DNA Ladder) и МЗ (123 bp DNA Ladder) "GIBCO BRL". Для количественной оценки полиморфизма ДНК и определения уровня дивергенции между сомаклонами данные были представлены в виде матрицы бинарных признаков, в которых наличие или отсутствие в RAPD- и ISSR-профилях одинаковых по размеру ампликонов соответствовало значениям 1 или 0 По матрицам расстояний были рассчитаны матрицы различий и определены генетические расстояния [Nei, Lee, 1979]. Для построения генеалогической дендрограммы по данным RAPD- и ISSR-анализа использовали компьютерную программу Treecon [Van de Peer, De Wächter, 1994] с применением 100 реплик бутстрепа. Клонирование и секвенирование полиморфных фрагментов ДНК осуществляли по стандартным методикам с использованием рекомендованных наборов реактивов [Черемис и др , 1990] Поиск гомологии специфических ампликонов с известными генами проводили по базам данных GenBank, PlantGDB, RepeatMasker и PolyPhen.

Для экстракции фитогормонов применяли методику, рекомендованную Веселовым и Кудояровой [1990]. Количественное определение концентрации гормонов проводили иммуно-ферментным методом ELISA Использовали стандартные наборы для определения гормонов (ООО "Фармхиминвест", г Уфа) Количество цитокининов оценивали по содержанию суммы зеатина и зеатинрибозида Опыты повторяли не менее двух раз, каждую пробу анализировали в пяти аналитических повторностях.

Условия электрообработки каллусов описаны в статье Китлаева и др [1994].

Для определения чувствительности к ПЭГ и NaCl каллусные инокулюмы массой 30-40 мг культивировали на средах с ПЭГ или NaCl в разных концентрациях в течение месяца, после чего определяли выживаемость как долю

эксплантов, сохранивших способность к росту, и прирост по увеличению сырой массы. Семена проращивали при 26°С в чашках Петри на фильтровальной бумаге, смоченной ПЭГ или NaCI в разных концентрациях, определяли долю проросших зерновок.

При анализе засухоустойчивости полученных после селекции регенерантов половину растений выращивали в условиях нормального полива (70% полной влагоемкости почвы - ПВП), а другую половину - в условиях засухи (30% ПВП) Для контроля в этих же условиях выращивали гибриды, от которых был получен каллус. Учитывая зависимость реакции от стадии онтогенеза, анализ устойчивости проводили трижды на протяжении жизни растений: дважды в фазе вегетативного роста и на стадии цветения метелок. Водоудерживающую способность листьев оценивали по потере ими сырой массы от исходной после инкубации в эксикаторе над серной кислотой (11) в течение 4 часов. Жароустойчивость определяли по времени появления первых признаков повреждения листьев, выдержанных в течение 10 минут в сосуде с водой, нагретой до 50°С. В потомстве каждого регенеранта анализировали не менее 20 растений.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Характеристика сомаклональной изменчивости

Особенности сомаклональной изменчивости растений были исследованы на примере растений, регенерированных из каллусных тканей инбредной линии кукурузы А188 после культивирования in vitro разной продолжительности. У растений-регенерантов и их потомства оценивали число и структуру хромосом, вариабельность ряда морфологических, физиологических и биохимических признаков, а также изменчивость молекулярно-генетических маркеров.

1.1. Изменчивость морфологических и физиологических признаков

Исследование растений, регенерированных из каллусных тканей после культивирования in vitro в течение 2-14 месяцев, показало, что большинство растений, полученных после кратковременного (2 месяца) культивирования, имело нормальную морфологию и высокую жизнеспособность. Но примерно у 25% регенерантов были отмечены различные аномалии развития: неправильное расположение первых листьев, морщинистые и деформированные листья, укороченные междоузлия, разветвление в узле кущения, развитие женских цветков на метелке.

Длительное культивирование (8-14 месяцев) сильно сказывалось на жизнеспособности и морфологии растений-регенерантов: возрастал процент гибели при пересадке в почву или на ранних этапах онтогенеза, среди выживших растений увеличивалась доля стерильных и морфологически аномальных форм, появилась хлорофиллдефектность (Табл.1).

Таблица 1. Влияние продолжительности культивирования in vitro на

жизнеспособность и морфологию растений-регенерантов кукурузы.

Продолжительность культивирования, мес Растения, укоренившие ся в почве,% Растения, достигшие зрелости, % Аномальные растения **

Укороченные междоузлия Стерильность Хлорофилл-дефектность

2 85,6±6,8 57,1+7,2 23,3±3,2 1,7±0,3 0,0

8 35,1±4,1 11,3+2,4 36,7±4,6 13,3±1,8 0,0

10 30,4±3,5 10,9+2,1 40,0±5,3 100,0 40,0+5,1

14 10,2±1,8 5,6+0,7 100,0 100,0 40,0+4,7

* - в процентах к общему числу растений-регенерантов

** - в процентах к числу растений, достигших зрелости

Аномалии развития, наблюдаемые у растений-регенерантов, не проявлялись в их потомстве от самоопыления. Скорее всего, они являются следствием нарушения регуляторных механизмов, и, прежде всего, гормонального баланса при культивировании тканей Соматические эмбриоиды, из которых развиваются растения-регенеранты, формируются ¡п ч'Лго в присутствии медленно разрушающегося регулятора роста 2,4-Д, который может накапливаться в тканях в избыточном количестве Зачатки первых пяти листьев закладываются у кукурузы при развитии зародыша, то есть также в условиях ¡п у^го Возможно, это и является причиной часто наблюдаемых отклонений от нормы по расположению и морфологии первых листьев. Соотношение гормонов имеет значение и в определении пола растений. Согласно данным М.Х.Чайлахяна и В Н.Хрянина [Чайлахян, Хрянин, 1980], цитокинины способствовали феминизации, а гиббереллин - формированию мужских цветков Еще раньше Г.Х. Молотковский обнаружил сдвиг пола в женскую сторону при обработке проростков кукурузы ауксином [Молотковский, 1957]. Основываясь на этих данных, мы предположили, что полученные из каллусных тканей растения имеют избыточное количество

ауксина и недостаток гиббереллина. Для проверки этой гипотезы регенераты на стадии 3-4 листьев были опрысканы гиббереллином Аз в концентрации 50 мг/л. Обработанные растения достигали нормальной высоты и имели на метелке только мужские цветки Эти опыты подтвердили предположение о том, что причиной многочисленных аномалий развития у растений-регенерантов является нарушение гормонального баланса.

У растений-регенерантов без дефектов развития, полученных в одном опыте после двух, а в другом - после восьми месяцев культивирования каллуса, была проанализирована изменчивость количественных и качественных морфологических признаков. По большинству количественных признаков разнообразие среди растений-регенерантов превышало пределы изменчивости контрольных растений, преимущественно за счет нижней границы значения показателя (Табл. 2). Количественные показатели выходили за пределы изменчивости исходной линии у 5-25% (в зависимости от анализируемого признака) регенерантов, полученных после двухмесячного культивирования, и у 13-63% растений, регенерированных из каллуса после 8 месяцев культивирования.

Таблица 2. Пределы изменчивости количественных признаков у растений-регенерантов, полученных после культивирования разной продолжительности

Признак Исходные растения А188 Регенераты после 2 месяцев культивирования Регенераты после 8 месяцев культивирования

Высота растения, см 100-200 60-140 85-178

Число листьев 7-12 4-14 5-11

Длина листа, см 53-80 38-69 49-85

Ширина листа, см 7-11 6-10,5 5-11

Высота метелки, см 30-40 18-40 15-54

Число веточек метелки 5-30 5-30 1-26

Число початков 1 -4 1 -4 1-3

Длина початка, см 12-20 8-17 8-19

Число рядов зерновок на початке 8, 10, 12 12, 14 8, 10, 12

Число зерновок в ряду 23-40 17-35 13-41

Рис 1 Наследуемые вариации количественных признаков у сомаклонов (незаштрихованные столбики - достоверные отличия от линии А188)

Изменения количественных признаков, в отличие от аномалий развития, наследовались в большинстве семей регенерантов. В группе растений, полученных после двухмесячного культивирования каллуса, были обнаружены статистически достоверные и стабильно наследуемые в 2-4 поколениях изменения средних значений высоты растения, размера и числа веточек метелки, числа рядов зерновок на початке (Рис.1). Во второй группе сомаклонов, регенерированных после восьми месяцев культивирования, к этим вариациям добавились наследуемые изменения числа листьев, длины листа и числа зерен в ряду У некоторых сомаклонов отмечено одновременное изменение нескольких показателей Проведенный генетический анализ показал, что измененные признаки проявлялись и наследовались независимо друг от друга, следовательно они являются результатом различных мутаций. Наибольший интерес в первой группе представлял регенерант № 27, который отличался от исходной линии по четырем морфологическим признакам, а во второй группе - регенерант № 105, имевший отличия по пяти признакам.

Сходство в наборе измененных признаков между сомакпонами внутри каждой группы, возможно, объясняется их происхождением от одного исходного каллуса. В этом случае отличия от исходной линии, обнаруженные у всех сомаклонов группы, можно рассматривать как возникшие на ранних этапах культивирования каллуса, а менее распространенные вариации - как результат мутаций, произошедших на более поздних сроках культивирования. Например, для регенерантов, полученных после восьмимесячного культивирования каллуса, по частоте встречаемости измененных признаков можно представить следующий порядок появления мутаций: увеличение числа веточек метелки -> уменьшение числа листьев -> увеличение числа зерновок в ряду -> уменьшение числа рядов зерновок на початке увеличение длины листа. Значительно труднее объяснить тот факт, что сомаклональная изменчивость затронула одни и те же признаки в двух группах независимо полученных регенерантов. К таким признакам относятся количественные характеристики метелки и початка

Сомаклональные вариации качественных признаков- альбинизм и изменения окраски зерновок, появились только в семьях регенерантов, полученных после длительного культивирования. Для большей части изменений показано менделевское расщепление в потомстве регенерантов Однако один из признаков - пурпурная окраска зерновок - наследовался нестабильно при гибридизации с исходной линией он не проявился ни в первом, ни во втором поколениях, но снова

был обнаружен в F3. Возможно, причиной появления и нестабильности этого признака является активация в культуре in vitro мобильных генетических элементов.

У некоторых сомакпонов обнаружены вариации физиологических признаков: изменения продолжительности вегетационного периода, вивипария, уменьшение морфогенетического потенциала незрелых зародышей в культуре in vitro.

Таким образом, увеличение продолжительности культивирования сопровождалось увеличением частоты сомаклональной изменчивости и расширением круга измененных признаков Это подтверждает данные, ранее полученные другими авторами. Следует отметить, что при длительном культивировании in vitro возрастала, прежде всего, доля летальных изменений и мутаций, приводящих к снижению фертильности растений.

Обращает на себя внимание высокая частота вариаций количественных признаков, которая достигает десятков процентов. Данные литературы также указывают на то, что количественные признаки наиболее подвержены вариациям условиях in vitro [Novak et al., 1986; Abdullah et al., 1989; Mohmand, Nabors, 1990; Lee et al., 1999]. Количественные показатели морфологических признаков сильно зависят от уровня эндогенных гормонов. Учитывая нарушение гормонального баланса в культуре in vitro, следует ожидать больших изменений регулируемых гормонами признаков. Но эти изменения будут, скорее, ненаследуемыми. Другой возможной причиной высокой вариабельности количественных признаков является их полигенная регуляция [Neuffer et al., 1996] Большое число ответственных за тот или иной признак генов повышает вероятность мутации по данному признаку. Поскольку отмеченные у сомаклонов кукурузы изменения количественных признаков наследовались в ряду поколений, второе объяснение представляется более вероятным

Вместе с тем, для всех сомаклонов была характерна относительная стабильность качественных признаков' немногочисленные вариации были найдены только у сомаклонов, полученных после длительного культивирования Не было выявлено изменения ни одного из десяти проанализированных маркерных признаков Вероятно, есть признаки более и менее подверженные сомаклональной изменчивости, при этом более вариабельны характеристики, связанные с программами развития, полигенные признаки, регуляторные элементы, в меньшей степени при культивировании in vitro изменяются структурные гены.

1.2. Анализ хромосомной изменчивости сомаклонов

Вариации морфологических признаков могли быть следствием хромосомных перестроек, вызваных культивированием тканей in vitro. Однако хромосомный анализ не выявил различий между сомаклонами и исходной линией ни по числу хромосом, ни по распределению гетерохроматиновых сегментов По-видимому, высокий уровень изменчивости морфологических признаков, показанный нами для сомаклонов, не обусловлен крупными хромосомными аберрациями.

1.3. Вариабельность изоформ эстеразы и пероксидазы

Для понимания природы и определения частоты сомаклональной изменчивости наиболее информативны молекулярные маркеры В качестве таких маркеров обычно используют белки, кодируемые мультигенными семействами и представленные большим количеством изоформ, а также фрагменты ДНК [Cloutier, Landry, 1994]. Исследование изоферментов как селективно нейтральных молекулярных маркеров существенно расширяет возможности выявления сомаклональной изменчивости на уровне индивидуальных локусов.

Сопоставление наборов изоформ эстеразы и пероксидазы у сомаклонов и линии А188 выявило у всех регенерантов многочисленные качественные и количественные отличия от исходных растений. Наиболее характерным было изменение тканевой специфичности экспрессии отдельных изоферментов. У сомакпональных вариантов в листьях были обнаружены новые зоны эстеразной активности, в том числе зоны, специфичные для щитка. В спектре анодных пероксидаз листьев большинства сомаклонов наблюдали усиление экспрессии изопероксидазы Рх9, характерной скорее для корней, чем для листьев. В семьях всех регенерантов в листьях была обнаружена изоформа Рх12, которая у исходной линии является строго корнеспецифичной. Внутри каждой группы сомаклонов семьи регенерантов почти не различались по спектру вариаций изоферментов. Более того, в двух группах независимо полученных сомаклонов изменчивости подверглись одни и те же изоформы ферментов.

Анализ потомков регенерантов показал, что большинство обнаруженных вариаций наследовалось во всех прослеженных поколениях потомства от самоопыления сомаклонов. При гибридизации с исходной линией А188 корнеспецифичная изоформа пероксидазы Рх12 была найдена в листьях всех

растений поколений и F2, расщепление по этому признаку отсутствовало [Zabrodina, Khavkin, 1999].

Наследование изменений электрофоретической подвижности изоформ эстеразы и пероксидазы в нашей работе свидетельствует, казалось бы, о мутационной причине данных сомаклональных вариаций. Однако, учитывая нарушение органоспецифичности, одинаковый набор измененных локусов у независимо полученных сомаклонов и отсутствие расщепления в поколении F2 после гибридизации с линией А188, логичнее предположить, что на стадии каллусообразования при дедифференциации клеток щитка происходит стабильное нарушение регуляции экспрессии органоспецифичных локусов. Вероятно, сомаклональная изменчивость затрагивает скорее регуляцию экспрессии, чем сами структурные гены, кодирующие ферментные белки.

1.4. Изменчивость ДНК-маркеров

Оценка по фенотипу не дает представления об общей изменчивости генома в условиях in vitro, так как кодирующие гены составляют лишь небольшую часть генома [Sorenson, 1984] Истинный уровень генетической изменчивости можно определить только при помощи молекулярного анализа ДНК. Поэтому в восьми семьях растений-регенерантов, независимо полученных из каллуса после двух и восьми месяцев культивирования in vitro исследовали вариабельность RAPD- и ISSR-маркеров.

12 3456 78 К-М

Рис.2. ЯДРО-спектры индивидуальных растений (1-8) линии А188 К- отрицательный контроль М-маркер молекулярного веса (1000 п.н.)

Анализ индивидуальных растений линии А188 не выявил различий в профиле амплифицируемых фрагментов Это свидетельствует о высокой степени инбредности исходной линии. (Рис.2).

При анализе сомаклонов 35 из 55 праймеров в той или иной степени выявляли полиморфизм. Растения из всех семей регенерантов отличались от исходной линии и между собой. По характеру профилей амплифицируемых фрагментов все использованные в эксперименте праймеры можно было разделить на несколько групп. Одни из них выявляли отличия каждого сомаклона от исходной линии (Рис.ЗА), другие амплифицировали специфические фрагменты, характерные для сомаклонов, полученных после двухмесячного (Рис.ЗБ) или восьмимесячного (Рис.ЗВ) культивирования, третьи обнаруживали уникальные фрагменты в отдельных семьях регенерантов.

А188 11 14 37 54 105 106 107 119 М К-

К- A18S И 14 27 54 105 106 107119 М

А188 И 14 27 54 105 106107119 М К-

^'ИИИЯ! . * Б Г*Г|—Г ^

Рис.3. RAPD-профили сомаклонов с праймерами QR-2 (А), М-10 (Б) и Q-20 (В)

Полиморфизм продуктов амплификации в семьях регенерантов прямо свидетельствует об индукции изменений в последовательности нуклеотидов ДНК, то есть мутационной изменчивости, в процессе культивирования клеток in vitro. Наличие фрагментов, характерных для нескольких сомаклонов одной группы, может быть следствием их происхождения из одного общего каллуса. Однако

17

присутствие одинакового фрагмента у сомаклонов, полученных в разных опытах, что исключает их общее происхождение, дает основание предположить, что культивирование in vitro провоцирует какие-то

специфические изменения генома. Ранее при анализе изменчивости морфологических признаков прослеживалась та же закономерность, например, в обеих группах с высокой частотой встречались вариации количественных характеристик метелки и початка. Подобные факты были описаны для сомаклонов риса [Кучеренко, 1986] и гороха [Murfet, Ezhova, 1991] В связи с этим можно говорить о существовании в геноме гипервариабильных участков Логично связать мутабильность генов с их расположением на хромосомах по отношению к гетерохроматину или сайтам рекомбинации, однако этот вопрос требует специального исследования. С другой стороны, появление одних и тех же изменений у независимо полученных сомаклонов может объясняться отбором определенных генотипов в культуре in vitro Высказано предположение, что условия культивирования (гормональный состав среды и условия освещения) способствуют ускоренному размножению клеток с мутациями, дающими им селективное преимущество [Ezhova et al, 1995] Соответственно, увеличивается и вероятность регенерации растений именно из этих клеток.

На основании сопоставления профилей амплифицированных фрагментов у линии А188 и сомаклонов были определены генетические расстояния между отдельными сомаклонами и исходной линией, и построена дендрограмма

о,/л

R54 — R14 -R27

С

Рис. 4 Дендрограмма различий для исходной линии А188 и полученных из неё сомаклонов

I и II - выявленные кластеры. Числа оценивают значение бутстрепа (%).

Степень отличия сомаклонов от исходной линии варьировала от 6,5 до 23%. Следует отметить, что сомаклоны кукурузы, полученные после длительного культивирования, сильнее отличались от исходной линии по сравнению с регенерантами первой группы При этом и разнообразие среди растений второй группы было больше, чем в первой Видимо, даже кратковременное культивирование in vitro индуцирует генетическую изменчивость, но степень генетического разнообразия между отдельными сомаклонами группы еще невысока. За время 8-месячного культивирования было накоплено больше изменений ДНК, что и проявилось в более значительном по сравнению с первой группой генетическом разнообразии растений-регенерантов. Наибольшее число полиморфных фрагментов и наибольшая удаленность от линии А188 на дендрограмме (Рис.4) соответствовало сомаклону № 105. Этот же регенерант характеризовался и наибольшей вариабельностью фенотипических показателей-он отличался от исходной линии А188 по 8 признакам.

Таким образом, иследование сомаклональной изменчивости с использованием ДНК-маркеров подтвердило динамику их появления и накопления, выявленную при анализе морфологических признаков

Наследование шести полиморфных фрагментов было проверено в потомстве каждого сомаклона, а также у гибридов регенерантов №№ 27 и 105 с линией А188 в Fi и F2. Как правило, сомаклонапьные изменения исходного генотипа происходят в одном из аллелей, то есть растения-регенеранты Ro гетерозиготны, и в потомстве от самоопыления наблюдается сегрегация. Подобные результаты получены с маркерами ОРС-09, N0-15 и Leb- в поколениях R1-R4 обнаружено расщепление по признаку наличие-отсутствие ДНК-маркера в близких к менделевским соотношениях (Табл 3) Расщепление по маркерам Q-20, М-10 и QR-2 не было выявлено ни в R,, ни в последующих поколениях. Сегрегацию признаков наблюдали только в F2, и она соответствовало доминантному характеру наследования данных ДНК-маркеров Это может быть связано с появлением у исходных регенерантов Ro мутаций в гомозиготной форме. Подобные гомозиготные сомаклональные варианты описаны у пшеницы (Larkin, 1984) и у риса (Оопо, 1985), но причина этого явления до сих пор не установлена

Полиморфные фрагменты ДНК были секвенированы По генетическим базам данных был проведен поиск генов, содержащих последовательности, гомологичные нуклеотидным последовательностям ДНК-маркеров. Наиболее интересные результаты были получены для фрагмента М-10. Одна часть

последовательности данного маркера обнаружила гомологию с ретротранспозоном Ор1е-1 5' НИ, а другая часть - с первым экзоном гена рибосомального белка кукурузы 1-26 тЯМА. Сравнение последовательностей фрагмента М-10 и участка гена, кодирующего рибосомальный белок кукурузы 1_26 тЯМА, показало наличие деструктивных изменений, которые могут быть результатом сомаклональной изменчивости.

Табл. 3. Наследование полиморфных фрагментов у исходной линии кукурузы А188 и сомаклонов.

Генотип Число растений с фрагментом . без фрагмента

Q-20 М-10 ОРС-09 NO-15 Leb QR-2

А188 0:8 0:8 8 : 0 0:8 8:0 0:8

Ri 11 0:4 4:0 0:4 0:4 2:2 4:0

R211 0:20 20:0 0:20 0:20 16:4 20:0

Ri 14 0:8 8:0 0:8 0:8 6:2 8:0

R2 14 0:12 12:0 0 : 12 0:12 0:12 12:0

R, 27 0:20 20:0 0:20 0:20 17:3 20:0

R2 27 0:21 21 :0 0:21 0:21 8 : 13 21 :0

R327 0:14 14:0 0:14 0:14 5:9 14:0

R<27 0:21 21 : 0 0:21 0:21 0:21 21 :0

F-i 27x188 0: 19 19 : 0 19 : 0 0 : 19 9 :10 2 :17

F2 27x188 0: 35 29 6 27 : 8 0 : 35 14 21 7:28

R, 54 0:4 4:0 0:4 0:4 3 :1 4:0

R2 54 0:20 20 : 0 0:20 0 : 20 0:20 20:0

R, 105 7 : 0 0 : 7 7 : 0 3:4 2:5 7 : 0

R2 105 20 0 0: 20 0 : 20 16 ■ 4 15 : 5 20 : 0

F, 105x188 4:0 0 • 4 4 : 0 4 : 0 4:0 1 : 3

F2105x188 35 0 0 : 35 29 .6 27 : 8 29:6 8 27

Ri 106 8 ■ 0 0:8 3 : 5 0 : 8 4 : 4 5 ' 3

R2 106 19:0 0 : 19 14 5 0 • 19 18 : 1 3 : 16

R3 106 20.0 0:20 9 . 11 0.20 15.5 10: 10

R4 106 20 0 0:20 16 4 0:20 18:2 6 : 14

R, 107 15.0 0 : 15 0 . 15 12 3 12 3 15 . 0

R2 107 20:0 0 : 20 0 : 20 15 ' 5 14 6 20:0

Ri 119 18.0 0 . 18 2 . 16 0 18 16 2 16.2

R2 119 21 . 0 0:21 0 • 21 0-21 7: 14 21 • 0

Большинство секвенированных фрагментов ДНК из сомаклонов кукурузы обнаружило гомологию с повторяющимися последовательностями. Однако при сравнении у линии А188 и у сомаклона № 11 последовательности нуклеотидов одного из генов, кодирующих корнеспецифичную изоформу пероксидазы ZmAP1, также было обнаружено несколько мутаций По-видимому, изменчивости in vitro подвержены как кодирующие, так и некодирующие участки генома, но высокая

частота повторяющихся последовательностей определяет и более высокую вероятность выявления мутаций именно в этих районах генома.

Проведенное изучение сомаклонов кукурузы показало многообразие природы сомаклональной изменчивости. У растений-регенерантов обнаружены: 1) ненаследуемые модификации, нормализующиеся в процессе онтогенеза, 2) изменения экспрессии генов (как наследуемые, так и ненаследуемые) и 3) истинные мутации, связанные с изменением первичной структуры ДНК. Относительная цитогенетическая стабильность регенерантов позволяет сделать заключение, что причиной значительной вариабельности морфологических и физиологических признаков не являются крупные хромосомные нарушения. Напротив, высокая частота вариабельности ДНК-маркеров, свидетельствует о наличии точковых мутаций или микрохромосомных перестроек. Появление сомаклонапьных вариаций в гомозиготной форме, нестабильность наследования отдельных признаков указывают, возможно, на участие в становлении сомаклональной изменчивости процессов митотической и мейотической рекомбинации или активации мобильных генетических элементов.

Вероятность появления различных сомаклонапьных вариаций неодинакова По-видимому, наиболее характерным типом сомаклональных изменений являются вариации, так или иначе связанные с дифференциацией и дедифференциацией. Возможно, не последнюю роль играют в этом случае изменения гормонального баланса. Процесс введения в культуру in vitro и последующая регенерация растений индуцируют множественные нарушения экспрессии генов У сомаклонов это проявляется в виде аномалий развития, нарушений тканевой специфичности Частота подобных изменений достигает у некоторых сомаклонов 100%. Высока вариабельность in vitro количественных полигенных признаков (десятки процентов), Изменчивость большинства качественных признаков, не связанных с развитием, на несколько порядков ниже.

В результате проведенной работы получены и разносторонне охарактеризованы мутантные линии кукурузы Получены молекулярные маркеры сомаклонов. Эти почти изогенные линии являются незаменимым материалом для проведения физиологических и биохимических исследований, изучения функции генов.

2. Регуляция морфогенеза в культуре тканей кукурузы

Наличие изменчивости по многим признакам, в том числе и хозяйственно ценным, предполагает возможность использования тканей in vitro для повышения генетического разнообразия культурных растений Основным препятствием к широкому использованию культур клеток в селекции является низкая регенерационная способность многих линий и сортов

Проблема регенерации растений исследовалась многими авторами, и установлено, что морфогенетический потенциал культивируемых тканей определяется генотипом, органом, из которого выделен эксплант, условиями выращивания донорных растений, условиями культивирования, составом питательной среды [Phillips et al ,1988]. Трудность состоит в том, что каждый вид и даже сорт требуют своих условий для регенерации растений, и общие закономерности до сих пор не выявлены Ведутся дискуссии, что в большей степени влияет на способность к регенерации растений- генотип или компоненты питательной среды, в первую очередь, гормоны

В связи с этим была поставлена задача оценить вклад генотипа и экзогенной физиологической регуляции в обеспечение морфогенетического потенциала культивируемых тканей кукурузы, выявить факторы, повышающие эффективность регенерации, попытаться определить причины компетентности клеток к морфогенезу.

2.1. Роль генотипа в регуляции морфогенеза

У кукурузы регенерация растений осуществляется, главным образом, через соматический эмбриогенез. Способность к морфогенезу определяется уже на стадии образования каллуса, при этом надежными эксплантами для получения эмбриогенного каллуса являются только незрелые зародыши Процесс регенерации растений из культивируемых клеток можно разделить на два этапа' 1) образование эмбриогенного каллуса, содержащего проэмбриогенные образования или соматические эмбриоиды на ранней стадии развития, 2) развитие соматических эмбриоидов вплоть до целого растения Регуляция морфогенеза на каждом этапе была исследована отдельно.

При использовании незрелых зародышей доля эксплантов, формирующих эмбриогенный каллус, значительно варьирует в зависимости от генотипа [Armstrong et al, 1985; Hodges et al, 1985] Проведенный нами анализ более 50 линий и гибридов кукурузы подтвердил это положение: доля зародышей,

формирующих эмбриогенные ткани, колебалась от 0 до 100% Эта характеристика была относительно постоянной и сохранялась из года в год, хотя и несколько зависела от условий выращивания растений, чьи незрелые зародыши вводили в культуру (Табл. 4).

Таблица. 4. Доля зародышей, сформировавших эмбриогенный каллус при разных условиях выращивания исходных растений

Линия 1986 г., поле 1987 г., поле 1987 г., теплица

А188 76,9 48,0 83,4

А344 64,5 50,0 57,4

А619 46,0 39,6 30,3

346 27,9 30,4 18,9

F2 6,9 5,1 4,9

F7 2,4 4,8 3,7

W8 2,2 0,0 1,9

Дкбб 0,0 5,6 2,9

Гк26 0,0 5,5 0,0

При гибридизации линий с разным морфогенетическим потенциалом, в зависимости от комбинации родительских пар в F( были отмечены случаи доминирования и сверхдоминирования высокой способности к образованию эмбриогенного каллуса, промежуточное наследование, когда эмбриогенный потенциал гибридов был средним между показателями родителей, а также полное подавление геномом одного из родителей способности к соматическому эмбриогенезу у гибридов (Рис.5) В большинстве случаев гибридизация приводила к повышению морфогенетического потенциала.

В некоторых комбинациях родителей гибриды от прямого и обратного скрещиваний продемонстрировали разную способность к морфогенезу Например, если Дкбб выступала в качестве материнского растения, эмбриогенный потенциал гибридов был значительно ниже, чем в случае использования этой же линии в качестве отцовского растения (Рис 5) Этот результат свидетельствует об участии в регуляции морфогенеза не только ядерных, но и пластомных генов

Материнский эффект при наследовании способности к морфогенезу уже отмечалась некоторыми авторами [Powell, Caligan, 1987; Карабаев,

Джардемалиев, 1994; Орлов и др., 1994]. Однако никем не уточнялось какие именно органеллы: хлоропласты или митохондрии, несут гены, ответственные за регенерационную способность растительных тканей.

Рис 5. Эмбриогенный потенциал гибридов Fi между линиями с разной способностью к образованию эмбриогенного каллуса

Наличие у кукурузы нескольких хорошо изученных типов цитоплазматической мужской стерильности, связанной с различными модификациями митохондриального генома, позволило исследовать вклад именно митохондриального генома в регуляцию морфогенеза in vitro. Оказалось, что все стерильные линии кукурузы обладали пониженной по сравнению с фертильной формой способностью индуцировать эмбриогенный каллус На основании этих данных представляется вероятным участие митохондриальных генов в регуляции процесса морфогенеза

Приведенные данные подтверждают большую роль генотипа в обеспечении способности к соматическому эмбриогенезу Тот факт, что в большинстве случаев в результате гибридизации с высокоморфогенными линиями удается повысить частоту образования эмбриогенного каллуса у низкоморфогенных генотипов, позволяет рекомендовать этот способ для увеличения эффективности регенерации растений.

2.2. Зависимость способности к морфогенезу от экзогенных регуляторов роста и условий культивирования

Наряду с генотипом, большое значение для образования эмбриогенного каллуса имеют компоненты питательной среды, особенно фитогормоны [Bartkowiak, 1983; Wilkinson, Thompson, 1987]. Однако для кукурузы изменение концентрации или замена 2,4-Д другими ауксинами были неэффективны. Добавление в среду цитокининов также не оказывало положительного действия на частоту образования эмбриогенного каплуса. Более перспективными оказались нетрадиционные регуляторы роста. В наших опытах было исследовано влияние на каллусогенез синтетического регулятора роста с ауксиноподобным действием дикамба, ингибитора физиологического действия этилена AgN03 и i< биостимулятора грибного происхождения эмистима. В качестве контроля

использовали стандартную среду с 2,4-Д.

Вариации состава питательной среды повлияли на долю зародышей, образующих эмбриогенный каллус (Табл.5). Повышение морфогенетического потенциала отмечено при культивировании эксплантов на среде с нитратом серебра. При замене 2,4-Д на дикамбу частота каллусогенеза у линии А344 увеличилась до уровня линии А188 Но изменения были характерны для линий с высокой и средней способностью к морфогенезу По отношению к низкоэмбриогенным линиям физиологическая регуляция не была эффективной' независимо от использованных регуляторов роста доля зародышей, образующих эмбриогенный каллус, оставалась низкой.

Проведенный дисперсионный анализ показал, что на стадии индукции эмбриогенного каллуса роль генотипа является более существенной по » сравнению с влиянием регуляторов роста, включенных в питательную среду

Эффективность второго этапа морфогенеза - регенерации растений из сформировавшихся на первом этапе эмбриоидов - не всегда коррелирует с частотой образования эмбриогенного каллуса [Rhodes et al, 1986; Novak et a!, 1988] Поэтому можно было предположить, что на каждом этапе действуют свои механизмы регуляции.

Чтобы учесть отдельно результаты второго этапа морфогенеза, оценивали число растений, регенерированных из индивидуальных эмбриогенных каллусов Применение таких регуляторов роста как AgN03 и дикамба оказалось весьма

эффективным для низкоэмбриогенной линии \ЛГО- количество полученных на этих средах из каллуса \ЛГО растений было равно или больше, чем число регенерантов

Таблица 5. Влияние регуляторов роста на частоту образования эмбриогенного каллуса.

Линия Регулятор роста % зародышей, Число регенерантов

образовавших на эмбриогенный

эмбриогенный каллус каллус

2,4-Д 60,8+5,7 1,3±0,1

А188 2,4-Д+АдГЮ3 82,6±4,4 1,1±0,1

дикамба 62,6±4,8 1,7±0,1

эмистим 33,0+3,2 3,5±0,2

2,4-Д 41,0±4,1 1,5±0,1

А344 2,4-Д+Ад1Ч03 61,8±4,2 1,3±0,1

дикамба 67,4±4,0 1,5±0,1

эмистим 47,5±3,0 4,6±0,7

2,4-Д 23,2+3,0 0,5±0,1

WD 2,4-Д+АдЫОз 26,2±5,6 1,5±0,1

дикамба 24,1±7,9 1,7±0,2

эмистим 20,3±3,4 2,6±0,3

2,4-Д 0,0 0,0

Гк26 2,4-Д+АдЫОз 1,8±1,0 0,0

дикамба 0,0 0,0

эмистим 0,0 0,0

из каллуса линий А188 и А344, которые характеризовались значительно более высокой частотой образования эмбриогенного каллуса (Табл 5) В отличие от нитрата серебра и дикамбы эмистим стимулировал регенерацию растений у всех проанализированных линий Влияние генотипа сказывалось только на степени стимуляции: у линии А188 число регенерантов увеличивалось в 2,5 раза, у линии А344 - в 3, а у У\ГО - более чем в 5 раз Интересно, что соединения, влияющие на частоту регенерации, не стимулировали индукцию эмбриогенного каллуса Полученные нами результаты дают экспериментальное подтверждение

гипотезе о разных механизмах регуляции этапа индукции эмбриогенного каллуса и дальнейшего развития эмбриоидов в растения.

Поскольку вторая стадия морфогенеза оказалась чувствительной к экзогенной регуляции, были испытаны и другие способы ее стимуляции. Увеличение количества растений-регенерантов в несколько раз было достигнуто при добавлении в питательную среду для роста каллуса антибиотика цефотаксима, обычно используемого при генетической трансформации для элиминации агробактерий. Степень стимуляции при этом зависела от генотипа использованных линий кукурузы Есть данные, что одним из продуктов разложения цефалоспориновых антибиотиков, к которым относится цефотаксим, является фенилуксусная кислота, обладающая ауксиновой активностью [Orlikowska et al ,1995] Возможно, биологическая активность антибиотика связана с образованием при его разложении стимуляторов роста и морфогенеза

Для некоторых видов растений было показано, что частота регенерации растений повышалась, если через каллусы пропускали слабый постоянный электрический ток [Goldsworthy, 1986, Rathore, Goldsworthy, 1985] Вероятно, под действием внешнего тока усиливалась поляризация культивируемых клеток [Медведев, 1996], что способствовало формированию и развитию очагов морфогенеза. В наших опытах прохождение тока через эмбриогенные каллусные инокулюмы увеличивало количество регенерированных побегов в зависимости от генотипа в 1,5-4 раза. Характер действия тока зависел от его силы и направления. Ток не индуцировал регенерационные процессы в неэмбриогенном каллусе, что является еще одним свидетельством разной регуляции стадий индукции эмбриогенного каллуса и развития соматических эмбриоидов

Таким образом, на этапе регенерации растений влияние экзогенных физиологических факторов было существенным Дисперсионный анализ показал, что вариации, обусловленные регуляторами роста, превосходят различия между генотипами в 4-5 раз Видимо, на этапе регенерации растений, в отличие от стадии индукции каллуса, определяющими являются условия культивирования Тем не менее, влияние генотипа проявлялось и на этой стадии морфогенеза

2.4. Причины компетентности клеток к морфогенезу

В каких же физиологических особенностях выражается влияние генотипа на образование эмбриогенного каллуса'' Изучению регуляции морфогенеза экзогенными факторами посвящено много работ (Phillips et al., 1988, Armstrong et

al., 1992), но молекулярные механизмы эндогенной регуляции почти не исследованы. Учитывая большое значение баланса эндогенных гормонов в определении тотипотентности [Бутенко, 1975; Лутова и др., 1994], естественно было предположить, что компетентность клеток к морфогенезу в значительной степени обусловлена количеством и соотношением эндогенных регуляторов роста. При сопоставлении уровней гормонов в морфогенных и неморфогенных тканях некоторых видов растений были обнаружены заметные различия [Ivanova et al., 1994; Копертех, Бутенко, 1995]. Но данные работы не позволяют вычленить различия, специфически связанные со способностью к морфогенезу из общего спектра вариаций, обусловленных видовой принадлежностью или условиями проведения опыта. Результаты разных авторов часто противоречат друг другу.

Нами была предпринята попытка выяснить, какие именно концентрации и соотношения гормонов характерны для компетентных к морфогенезу клеток кукурузы. При этом было использовано несколько линий кукурузы с разной способностью к образованию эмбриогенного каллуса Чтобы избежать не связанных с морфогенезом различий между линиями, были использованы также контрастные по частоте образования эмбриогенного каллуса эксппанты из разных органов одного генотипа Выбранные типы тканей существенно различались по способности образовывать эмбриогенный каллус в условиях in vitra (Табл.6).

Содержание эндогенных фитогормонов значительно варьировало в зависимости от генотипа и вида ткани. Для большинства морфогенных тканей было характерно преобладание цитокининов над ауксинами, а для всех неморфогенных - обратное отношение. В то же время, в незрелых зародышах линии R91, обладавших самой высокой способностью к образованию эмбриогенного каллуса, содержание ИУК было больше, чем уровень цитокининов. По-видимому, большое значение имеет общий гормональный баланс. Например, из таблицы видно, что экспланты, компетентные к образованию эмбриогенного каллуса, отличались относительно низким содержанием АБК. Концентрация этого гормона в способных к морфогенезу незрелых зародышах линий А188 и R91 была существенно ниже, чем в неморфогенных тканях листьев и корней А при подобных соотношениях ИУК и зеатина в незрелых и зрелых зародышах линии А188 увеличение уровня АБК в последних сопровождалось уменьшением морфогенетического потенциала. Кроме того, в незрелых зародышах двух морфогенных линий А188 и R91, в отличие ото всех остальных эксплантов, соотношение цитокининов и АБК было

примерно равным. В тканях с пониженным (зрелые зародыши А188) и низким морфогенетическим потенциалом уровень АБК существенно превосходил уровень цитокининов.

Таблица 6. Концентрации эндогенных гормонов в тканях кукурузы (нг/г сырой массы)

Генотип Вид ткани % эмбриогенного каллуса ИУК АБК ЦК ЦК/ ИУК ЦК/ АБК

А188 Незрелые зародыши 60,6±5,2 24,9±2,1 97,6+8,2 87,0+2,9 3,2 0,9

Зрелые зародыши 25,6±2,5 9,4±1,5 422±23 20,0±3,4 2,1 0,05

Листья 0 35,0±5,5 287±95 5,5±1,6 0,2 0,02

Корни 0 17,9±3,8 280±88 3,9±0,9 0,2 0,01

91 Незрелые зародыши 80,5±4,4 43,9+3,3 9,3±0,7 7,0±0,7 0,2 0,8

Листья 0 267±13 30,2±2,6 19,6±2,4 0,1 0,6

Корни 0 11,0±1,3 43,9±1,1 1,3±0,2 0,1 0,02

Гк26 Незрелые зародыши 2,2±0,3 3000+273 283±17 65,8±8,4 0,02 0,2

Паннония Незрелые зародыши 5,1±0,6 8,8+2,0 19,9±2,1 2,б±0,3 0,3 0,1

Полученные данные не дают возможности однозначно оценить, какое именно соотношение гормонов в эксплантах кукурузы является оптимальным для образования эмбриогенного каллуса. Однако выявленные различия гормонального статуса морфогенных и неморфогенных тканей свидетельствуют о большой, возможно, ключевой роли баланса эндогенных гормонов в определении способности культивируемых тканей к регенерации растений. При этом в большинстве случаев для морфогенных тканей более характерно преобладание цитокининов над ауксинами и невысокий уровень АБК, а для неморфогенных -обратное соотношение гормонов

Согласно известным данным, морфогенные и неморфогенные ткани различаются, в основном, по содержанию ауксина [Sasaki et al., 1994; Vagner et al., 1999; Jimenez, Bangerth, 2001]. Нами впервые показано существенное значение для индукции соматического эмбриогенеза у кукурузы концентраций эндогенных цитокининов и АБК. Использование генетически идентичных, но контрастных по способности к морфогенезу тканей позволило нам вычленить различия в гормональном статусе, специфически связанные с морфогенетическим потенциалом.

Для уточнения сделанных выводов экспланты с разной способностью к образованию эмбриогенного каллуса обрабатывали веществами, влияющими на концентрации эндогенных гормонов, и оценивали, как это повлияло на способность к соматическому эмбриогенезу. Одним из путей снижения концентрации ИУК является активация процесса ее окисления [Гамбург, 1976] С этой целью к среде для индукции каллуса добавляли кофакторы оксидазы ИУК п-кумаровую кислоту и 2,4-дихлорфенол.

Применение п-кумаровой кислоты и 2,4-дихлорфенола вызвало увеличение частоты образования эмбриогенного каллуса из незрелых зародышей у линий с избыточным содержанием ауксина: у линии 91 - на 15%, а у линии Гк26 - в 3-5 раз. У высокоэмбриогенной линии А188 обработка п-кумаровой кислотой вызывала, наоборот, понижение доли зародышей, образующих эмбриогенный каллус, на 30%.

Другим способом снизить внутриклеточный уровень ИУК и одновременно повысить содержание АБК является добавление последней в среду для образования или роста каллуса Экзогенная АБК десятикратно стимулировала образование эмбриогенного каллуса у линии Гк26 У линии R91 доля зародышей, образующих эмбриогенный каллус, увеличивалась на 15%, а у высокоэмбриогенного гибрида А654хМ320 снижала почти до нуля

Опыты по искусственному изменению концентрации эндогенных гормонов подтвердили связь между гормональным статусом тканей и их компетентностью к восприятию внешних индукторов Предполагаемое нами искусственное приближение соотношения эндогенных гормонов к характерному для компетентных клеток значению способствовало повышению морфогенетического потенциала.

На основании проведенного исследования регуляции морфогенеза в культуре тканей кукурузы можно сделать заключение, что способность культивируемых тканей кукурузы к регенерации растений детерминирована зависящим от генотипа балансом эндогенных фитогормонов и может варьировать в определяемых генотипом пределах под воздействием внешних регуляторов. На стадии регенерации растений норма реакции' генотипа шире, чем при индукции эмбриогенного каллуса

Исследование регуляции морфогенеза in vitro позволило нам выработать ряд рекомендаций для повышения регенерационной способности каллусных тканей. На этапе индукции эмбриогенного каллуса это применение нитрата серебра, использование соединений, влияющих на гормональный баланс в клетках эксплантов, или гибридизация с высокоморфогенными линиями. На стадии регенерации растений очень хорошие результаты дали обработка слабым постоянным электрическим током, а также добавление в среду эмистима или цефотаксима.

Разработанные подходы существенно расширили число генотипов, способных к регенерации растений Появилась возможность работать не только с модельными линиями, но и с гибридами, представляющими практическую ценность.

3. Использование сомаклональной изменчивости для получения растений, толерантных к засухе 3.1. Разработка селективной системы

Ранее уже говорилось, что при культивировании клеток повышается генетическое разнообразие по признакам, имеющим практическое значение Эффективность применения изолированных клеток возрастает, если отбор нужных мутантов проводить также на стадии in vitro Путем клеточной селекции уже получены улучшенные формы и новые сорта томатов, сахарного тростника, риса, шпината, картофеля, кормовых трав и некоторых других видов, обладающие устойчивостью к болезням и высокой продуктивностью [Сагр, 1995]

Одним из важнейших признаков в селекции кукурузы является устойчивость к засухе. Среди разнообразных механизмов засухоустойчивости присутствуют как морфофизиологические приспособления, реализуемые на уровне целых растений, так и особенности метаболизма, которые проявляются и на организменном, и на клеточном уровнях [Blum,1996; Jensen et al., 1996] Наличие

метаболической составляющей устойчивости предполагало возможность проведения отбора устойчивых генотипов в культуре изолированных тканей Однако было неясно, существует ли корреляция между чувствительностью культивируемых тканей и целых растений, и будут ли растения, регенерированные из устойчивых клеток, также устойчивы. Вопрос о применимости культивируемых клеток для тестирования устойчивости растений к стрессовым факторам до сих пор дискутируется, и данные литературы на этот счет противоречивы [Белянская и др., 1993; Duncan, Widholm, 1994, Шевякова и Др., 1998].

Для получения кукурузы, толерантной к водному дефициту, необходимо было подобрать селективный фактор, адекватно моделирующий в условиях in vitro действие засухи на целые растения, а также разработать условия клеточной селекции.

Обезвоживание клеток, сопровождающее засуху в природе, можно имитировать, применяя ионные и неионные осмотики. Мы анализировали возможность использования ионного осмотика NaCI и неионного непроникающего в клетки осмотика ПЭГ (М.в. 6000).

Работу проводили на нескольких линиях кукурузы с различной устойчивостью к засухе. Гк26, W64, В73, Гн118 и Гн19. В качестве критериев устойчивости растений нами были выбраны частота прорастания семян в растворах осмотиков, характеризующая толерантность к весенней засухе, и водоудерживающая способность листьев, отражающая поддержание водного потенциала при дефиците воды на протяжении всей жизни растений. Эти показатели сопоставляли с интенсивностью роста каллусных тканей использованных линий на средах с ПЭГ и NaCI в разных концентрациях.

Было показано, что распределение линий по чувствительность каллуса к ПЭГ полностью совпадает с их распределением по реакции на засуху (Рис 6). Чувствительность культивируемых тканей к NaCI, напротив, не коррелировала с частотой прорастания семян и водоудерживающей пособностью листьев (Рис.7). По-видимому, это вызвано тем, что при культивировании каллуса на среде с солью проявляется не только осмотическое, но и токсическое действие ионов натрия и хлора, и преимущество получают не столько осмоустойчивые, сколько солеустойчивые клетки. На основании полученных данных, в качестве селективного фактора был выбран ПЭГ в существенно ингибирующей рост клеток концентрации 25%.

□ Рост каллуса на ПЭГ ■ Прорастание семян на ПЭГ 1

Гк26

В73

№64

Рис.6. Рост каллуса и прорастание семян на среде с ПЭГ

Гк26

В73

ШЛ

Гн118

Рис 7 Рост каллуса и прорастание семян на среде с №С1

Стандартная схема, разработанная для получения мутантных клеточных линий, включает многократное пассирование клеток на селективных средах до тех пор, пока не будут отобраны стабильно растущие клоны (Шамина, 1984) При проведении отбора по такой схеме нами были выделены клоны со стабильной устойчивостью к 25% ПЭГ Но продолжительное "уп1-т"Р"Р1таР"д " '■впаитмпиыу условиях существенно снижало морфогенетическую

зз I ^"«Ит

о» т |

жизнеспособность растений-регенерантов. По-видимому, стрессовые условия способствуют более быстрому накоплению сомаклональных вариаций. Из-за трудности получения здоровых регенерантов некоторые авторы даже предлагали отказаться от использования селективных сред, и отбирать среди сомаклонов растения с нужными свойствами уже в полевых условиях [Duncan et al., 1995]. Однако при таком способе селекции теряются преимущества биотехнологического подхода, быстрота, независимость от сезона и небольшие посевные площади. Опираясь на результаты исследования сомакпональной изменчивости, мы предложили другую схему селекции. Поскольку даже непродолжительное культивирование обеспечивает повышение генетического разнообразия, а при длительном выращивании каллуса в первую очередь возрастает частота нежелательных мутаций, мы сократили длительность селекции до 4-5 месяцев. Для более полного исключения чувствительных клеток ткани культивировали в жестких селективных условиях с постоянным контролем способности к морфогенезу. Ранние стадии регенерации растений до появления первого листа, наиболее чувствительные к стрессам, проходили также в селективных условиях. Это частично компенсировало небольшую продолжительность селекции.

Такой способ клеточной селекции не обеспечивал полной элиминации чувствительных клеток, но давал возможность обогатить популяцию резистентными формами. Примером того, как изменяется реакция растений на засуху после проведения клеточной селекции по такой схеме, может быть распределение трехнедельных проростков по водоудерживающей способности листьев. После одного месяца селекции повысилась доля растений, теряющих при подсушивании меньше воды, не осталось высокочувствительных к засухе вариантов, но разнообразие внутри группы было еще велико. После двухмесячного культивирования каллуса на селективной среде была получена довольно гомогенная группа растений с устойчивостью, заметно превышающей контрольную (Рис.8). Средние значения процента потери воды в условиях засухи составили для контрольной группы 13,4%, после одного цикла селекции - 11,4%, а после двух - 9,1%.

11 12 13 14 15 16 17 18 Потеря воды при подсушивании, %

Рис 8. Распределение растений-регенерантов по водоудерживающей способности после одного и двух месяцев селекции на среде с ПЭГ

Разработанный метод клеточной селекции был использован для получения растений с повышенной устойчивостью к засухе для нескольких гибридов кукурузы. Работа проводилась, главным образом, на гибридах линий А188 и Chi31 с латиноамериканскими расами При этом линии выступали в качестве носителей высокой способности к морфогенезу, а расы были донорами генов толерантности к дефициту воды. Из клеток, устойчивых к 25% ПЭГ, было получено около 200 растений, из них Ch¡31xTuxpeno Norteño (55 регенерантов), Chi31xCatteto S G (30 регенерантов), A188xTuxpeno Norteño (58 регенерантов), A188xCatteto SG (40 регенерантов) и P3978xTabloncillo Perla (10 регенерантов)

v 3.3. Характеристика растений, полученных из устойчивых к ПЭГ клонов

Для определения степени устойчивости к засухе растений-регенерантов и исследования причин устойчивости были взяты отобранные в системе с ПЭГ гибриды Chi31xTuxpeno Norteño и Chi31xCateto SG Жизнеспособные и фертильные растения были получены из тканей, которые культивировали в селективных условиях от 1 до 4 месяцев На основе анализа водоудерживающей способности листьев трехнедельных растений для детального анализа были отобраны наиболее перспективные Учитывая, что засуха часто сопровождается высокой температурой воздуха, наряду с водоудерживающей способностью

оценивали и жаростойкость. Анализировали растения в двух семенных поколениях.

Среди регенерантов, полученных из ПЭГ-устойчивых каллусов, для анализа толерантности к обезвоживанию и перегреву были выбраны растения из семей №№ 68 и 83 (СЫ31хТихрепо 1Мог) и №N2 90, 91, 96, 118, 119 и 121 (СМ31хСа1еЮ в.в.). В качестве контроля использовали исходные гибриды, не подвергавшиеся селекции.

Жароустойчивость растений, полученных методом клеточной селекции, была выше, чем у исходных форм, как в условиях засухи, так и полива на всем протяжении онтогенеза. Время появления повреждений листа у растений в семьях 83, 91, 96, 118, 119 и 121 оказалось примерно в 2 раза больше контрольного (Рис.9).

^ Номера регенерантов

Рис.9. Жароустойчивость листьев кукурузы в фазу цветения

Засуха вызывала увеличение водоудерживающей способности как в семьях регенерантов, так и у исходных гибридов. Начиная со стадии 10 листьев, отселектированные растения стали терять меньше воды, чем контрольные, а в фазу цветения метелки, период, наиболее важный для формирования урожая, это различие усилилось (Рис.10).

Номера регенерантов

Рис.10. Водоудерживающая способность листьев кукурузы в фазу цветения

Повышение устойчивости опытных растений к обезвоживанию и перегреву, показанное с помощью физиологических методов, нашло отражение также в характере цветения тестируемых растений У контрольных растений гибрида Chi31xCateto S G засуха вызвала задержку цветения мужских цветков в среднем на 10 суток, а женских - более чем на месяц. У опытных растений из семей №№ 90, 91, 119 и 121 цветение метелок и выметывание рылец на початках происходило одновременно в условиях как полного, так и ограниченного полива, в семьях №№ 96 и 118 цветение мужских и женских цветков в условиях засухи отмечено лишь на 10 суток позднее, чем при оптимальном поливе В результате, самоопыление контрольных растений было возможно только в условиях полива до 70% ПВП, а опытные растения были успешно опылены и в условиях засухи Озерненность початков в условиях недостаточного увлажнения составляла от 70 до 100%.

Обезвоживание тканей растений в результате засухи или воздействия низких температур вызывает повышение уровня абсцизовой кислоты, которая, в свою очередь, запускает механизмы, обеспечивающие выживание клеток [Skriver, Mundy, 1990, Anderson et al, 1994]. Рядом авторов показано, что устойчивость к стресовым факторам зависит от способности быстро накапливать АБК С учетом этих данных был определен уровень эндогенной АБК в листьях исходного гибрида Chi31xCat S G и отселектированных растений в фазу цветения при нормальном и недостаточном (30% ПВП) поливе Под действием засухи концентрация

эндогенной АБК повышалась у исходного гибрида в полтора раза, а у

37

отселектированных растений в 2,5-3,5 раза. При этом степень повышения уровня АБК коррелировала с засухоустойчивостью регенерантов, определенной по водоудерживаюшей способности. Полученные результаты подтверждают выводы об увеличении засухоустойчивости растений кукурузы, отобранных в системе in vitro.

Таким образом, используя метод клеточной селекции in vitro на средах, содержащих ПЭГ, можно добиться повышения засухоустойчивости растений кукурузы. Проявление толерантности к недостатку влаги не только у растений-регенерантов, но и у их семенного потомства указывает на генетическую природу устойчивости.

В результате клеточной селекции были получены формы растений, жароустойчивость которых была повышена не только при действии засухи, но и в условиях оптимального увлажнения почвы Это может иметь большое значение при выращивании кукурузы в условиях орошения в зоне высоких температур.

Известно, что одни и те же изменения метаболизма могут вызывать повышение толерантности к нескольким стрессам одновременно Помимо засухи, обезвоживание клеток происходит при засолении и при действии низких температур [Blum, 1996]. Можно было ожидать, что растения, полученные в результате клеточной селекции на устойчивость к ПЭГ, будут менее чувствительны и к другим стрессовым факторам по сравнению с исходными гибридами.

Семена всех проверенных регенерантов продемонстрировали при неблагоприятной для кукурузы температуре 10°С более высокую всхожесть, чем исходные гибриды Часть отселектированных растений обладала также повышенной устойчивостью к действию NaCI, что проявилось в более высоком проценте прорастании зерновок на среде с 2% NaCI и более активном росте при засолении до 1,2% (Рис.11). Таким образом, проведение отбора клеток на среде с ПЭГ позволило повысить устойчивость регенерированных растений не только к засухе, но и к засолению и низкой температуре.

а Засуха

Рис 11 Реакция на различные стрессы растений, полученных после селекции на ПЭГ

В некоторых случаях высокая водоудерживающая способность и жаростойкость сопровождались и значительной солеустойчивостью (№119) У других регенерантов проявление толерантности к различным стрессовым факторам было неоднозначным Например, № 96 показал высокую устойчивость к засухе и низкой температуре, но оказался солечувствительным Растения из семьи № 121, имея умеренную толерантность к засухе и засолению, лучше всего чувствовали себя при низкой температуре По-видимому, селекция клеток на среде с ПЭГ дает возможность получить растения с различными механизмами устойчивости.

ВЫВОДЫ

1 Впервые дана разносторонняя характеристика сомаклональной изменчивости кукурузы, включающая оценку на морфологическом, физиологическом, биохимическом, хромосомном и молекулярном уровнях. Культивирование in vitro вызывает: 1) ненаследуемые модификации, нормализующиеся в процессе онтогенеза; 2) изменения экспрессии генов (как

39

наследуемые, так и ненаследуемые); 3) истинные мутации - изменения последовательности нуклеотидов ДНК;

2. Сомаклональные вариации возникают уже на ранних этапах культивирования тканей in vitro, при длительном выращивании каллусных культур, а также в стрессовых условиях увеличивается частота сомаклональной изменчивости и расширяется круг измененных признаков.

3. Процесс введения в культуру (дедифференциация) и последующая регенерация растений (редифференциация) индуцируют нарушения экспрессии генов У сомакпонов это проявляется в виде аномалий развития, нарушений тканевой специфичности. Частота подобных вариаций достигает десятков процентов.

4. Вероятность генетической изменчивости различных признаков не одинакова. Наиболее подвержены изменчивости in vitro количественные признаки. Степень изменчивости моногенных маркерных признаков, генов, контролирующих устойчивость к NaCI и ПЭГ, не превышала долей процента.

5. Впервые проанализирована изменчивость RAPD- и ISSR-маркеров у сомакпонов кукурузы. Выявлен высокий уровень полиморфизма ДНК: все проверенные растения отличались от исходной линии. Обнаруженные у регенерантов изменения наследовались по доминантному и кодоминантному типам наследования в соответствии с законами Менделя. Клонирование и секвенирование полиморфных фрагментов ДНК выявило у сомаклонов многочисленные мутации в виде замены нуклеотидов и делеций Изменчивости in vitro подвержены как кодирующие, так и некодирующие участки генома, но большинство секвенированных фрагментов ДНК из сомаклонов кукурузы обнаружило гомологию с повторяющимися последовательностями. Один из полиморфных фрагментов ДНК имел высокую степень гомологии с ретротранспозоном Opie-1 5' LTR кукурузы.

6. При изучении роли генотипа и условий культивирования в регуляции морфогенеза т vitro показано, что генотип определяет пределы изменчивости регенерационной способности. На стадии индукции эмбриогенного каллуса норма реакции генотипа является узкой и эффективность экзогенной физиологической регуляции невелика. На стадии регенерации растений из соматических эмбриоидов изменения условий культивирования существенно влияют на количество формирующихся растений.

7 Разработаны рекомендации по повышению частоты регенерации растений из культивируемых тканей кукурузы. Для усиления индукции эмбриогенного каллуса эффективны добавление в среду нитрата серебра, соединений, влияющих на эндогенный уровень гормонов, или гибридизация с высокоморфогенными линиями. Впервые показано, что количество растений-регенерантов увеличивается в несколько раз при культивировании клеток в присутствии эмистима, цефотаксима, а также при обработке каллусных инокулюмов слабым постоянным электрическим током

8 Разработаны новые методические подходы к созданию толерантных к абиотическим стрессам растений путем клеточной селекции' предложены условия и способы отбора in vitro, позволяющие в короткий срок получить жизнеспособные регенеранты с повышенной устойчивостью.

9. Впервые получены растения кукурузы, толерантные к засухе, засолению и неблагоприятным температурам. Повышенная устойчивость наследовалась в ряду поколений, что свидетельствует в пользу ее мутационной природы

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1 В.Г Чернышева, Ю И Долгих, 3 Б.Шамина, РГБутенко Влияние генетических характеристик исходных растений на морфогенный потенциал каллусных клеток кукурузы. Докл АН СССР, 1988, т 300, № 1, с 227-229

2 3 Б Шамина, Ю И Долгих. О неоднородности клеточных популяций in vitro. В сб «Физиология растений на службе продовольственной программы СССР», M ' Знание, 1988, с 32-42.

3 Z B.Shamina, V G Chernyshova, Yu I Dolgikh Genetic control of maize somatic embryogenesis. Abstr.7 Intern Congr PTCC, Amsterdam, 1990, p 214

4 Yu I Dolgikh, Yu V Bolonkina, S N Larina, Z B.Shamina. Somaclonal vanability in inbred line A 188 Maize Genetic Cooperation Newsletter 1991, v 65, p 89

5 Д M Атаева, Ю И.Долгих, Т Б Дубровина, M В Забродина, Э Е Хавкин, 3 Б Шамина. Хромосомный и изоферментный анализ сомаклональных вариантов инбредной линии кукурузы А188 Доклады ВАСХНИЛ, 1991, N 5, с.2-5.

6 Ю И Долгих, 3 Б Шамина Современные представления о причинах и механизмах сомаклональной изменчивости В сб «Молекулярные механизмы генетических процессов», M ■ Наука, 1991, с 123-127

41

7. Yu I.Dolgikh, S.N Larina, Z B.Shamina. Genetic variability on maize callus culture. Abstr, 39th Ann. ETCS Meeting, Kracow, 1991, p. 145.

8 Yu I Dolgikh, S.N.Larina, Z B.Shamina Use of tissue culture to test plant resistance to abiotic stresses Maize Genetic Newsletter Cooperation, 1992, v 66, p.82.

9. Ю.И.Долгих, С.Н.Ларина, Ю В Болонкина Анализ изменчивости регенерантов инбредной линии кукурузы А188. Генетика, 1992, т28, № 6, с.74-82.

10.Е.Е. Khavkin, M VZabrodina, Yu.I.Dolgikh, Z.B Shamina Heritable changes of anodal esterase and peroxidase patterns in A188 somaclones. Maize Genetics Cooperation Newsletter, 1993, v.67, p 84.

11 S N Larina, Yu I Dolgikh, Z.B.Shamina. Development of NaCI-resistant callus culture and régénérants. Maize Genetics Cooperation Newsletter, 1993, v67, p.84.

12. Ю.И.Долгих, С H Ларина, З.Б.Шамина. Селекция на осмоустойчивость кукурузы in vitro и характеристика растений-регенерантов. Физиология растений, 1994, т41, № 1, с.114-117.

13.Д.М.Атаева, Т Б.Дубровина, Ю.И.Долгих, З.Б.Шамина. Изменчивость гетерохроматиновых районов хромосом первого семенного поколения растений-регенерантов кукурузы. Цитология и генетика, 1994, т.28, № 1, с. 15-20.

14 С Диас, Ю И Долгих, 3 Б.Шамина, В С Шевелуха. Значение физиологических и генетических факторов в индукции эмбриогенного каллуса у различных линий кукурузы. Доклады Россельхозакадемии, 1994, № 2, с 6-8.

15ГБКитлаев, Ю И Долгих, Р Г.Бутенко Физиологическое действие электрического тока на культуру клеток кукурузы in vitro Доклады Академии Наук, 1994, т.335, № 3, с. 393-395

16 Ю И Долгих, С H Ларина, 3 Б Шамина, НЕ Жданова, Т H Пустовойтова Засухоустойчивость клеток кукурузы, полученных из устойчивых к осмотическому действию полиэтиленгликоля клеточных линий Физиология растений, 1994, т 41, № 6, с. 879-884

17 Yu I Dolgikh Establishment of callus cultures and regeneration of maize plants In "Biotechnology in Agriculture and Forestry", Springer-Verlag, 1994, p 24-36

18.S N.Larina, Yu.l.Dolgikh, Z.B Shamina. Salt resistance of plants selected in vitro. Maize Genetics Cooperation Newsletter, 1995, v.69, p. 105.

19 Yu I Dolgikh, S N Larina. Development of drought-resistant plants via tissue culture Maize Genetics Cooperation Newsletter, 1995, v 69, p. 105.

20 Yu.l Dolgikh, S N.Larina, Z В Shamina Cross-tolerance to drought, salt and low temperature of maize plants regenerated from PEG-resistant lines. Maize Genetics Cooperation Newsletter, 1996, v.70, p. 41-42

21 M VZabrodina, L A Serdobinskii, Yu.l Dolgikh, E.E Khavkin. Tissue-specific isoperoxidases in differentiated and dedifferentiated maize cells Maize Genetics Cooperation Newsletter, 1996, v.70, p 42.

22 Ю И Долгих, С H Ларина, 3 Б Шамина Толерантность отобранных in vitro растений кукурузы к засолению и низким температурам. Тез конф. «Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 1996, с. 42

23 Yu I Dolgikh, S N Larina, Z В Shamina The mutant cell lines and regenerated plants as a model to study environmental stress reactions. Abstr Intern Symp. "Stress and Inorganic Nitrogen Assimilation, 1996, Moscow, p. 23

24 Ю И Долгих, С H Ларина, 3 Б.Шамина. Использование клеточной селекции для получения растений кукурузы, толерантных к засухе, засолению и низким температурам. Сб. XVIII Мичуринских чтений, Изд-во ВНИИГСПР, 1997, с. 29-32

25 М В.Забродина, Л А.Сердобинский, Ю И Долгих, 3 Б Шамина, ЭЕХавкин. Спектры изопероксидаз в интактных и культивируемых тканях кукурузы. Тез конф "Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение растительного генофонда», Москва, 1997, с. 217

26 С Диас, Ю И Долгих Роль физиологических факторов в повышении эффективности регенерации растений из культивируемых тканей кукурузы Биотехнология, 1997, № 11-12, с 32-36

27 Ю И Долгих, Т Н Пустовойтова, Н.Е Жданова. Баланс эндогенных фитогормонов в незрелых зародышах компетентной и некомпетентной к соматическому эмбриогенезу линий кукурузы Физиология растений, 1999, т46, №6, с. 861-864

28 Yu I.Dolgikh, N Т Zhdanova, Т N Pustovoitova The content of hormones in the embryos of inbreds competent and incompetent for morphogenesis. Maize Genetics Cooperation Newsletter, 1999, Ne 73, p.71.

29.М.В.Забродина, А.С.Карягина, О.В.Сергиенко, Э Е.Хавкин, И.А.Шилов, Ю.И.Долгих. Влияние сомаклонапьной изменчивости на длину продуктов амплификации гена корнеспецифичной анодной пероксидазы кукурузы ZmAP1. Физиология растений, 1999, 46, р.639-642.

30 Yu I Dolgikh. High level of variability among the plants regenerated from callus of inbred A188. Maize Genetics Cooperation Newsletter, 1999, 73, p.70-71.

31.E.S.Osipova, Yu.l Dolgikh, Z В Shamina, S.A.Gostimskii. RAPD markers variability in maize somaclones produced from inbred A188. Maize Genetics Cooperation Newsletter, 2000, v.74, p. 52-53.

32.Yu.l.Dolgikh, Z.B.Shamina. The improvement of biotechnological production of maize plants tolerant to environmental stress Abstr XVIII Intern. Conf. "Maize and Sorgum Genetics and Breeding at the End of 20th Century, Belgrade, Yugoslavia, 2000, p. 48.

33.Е.С Осипова, З.Г.Кокаева, А.В.Троицкий, Ю.И Долгих, З.Б.Шамина, С.А.Гостимский. RAPD-анализ сомаклонов кукурузы. Генетика, 2001, т.37, № 1, с. 50-55.

34.Г.Б.Китлаев, СДиас, Т.Ю.Вера-Рамос, Ю.И.Долгих, РГБутенко. Стимуляция слабым электрическим током регенерации растений в культуре тканей кукурузы in vitro Биотехнология, 2001, № 5, с 58-63.

35 Гладков Е.А., Аксенова J1 А., Ю.И Долгих Анализ стресс-индуцируемых белков в чувствительных и устойчивых к NaCI клетках кукурузы. Труды Моек гос университета инженерной экологии, 2001, № 5, с. 16-19.

36 Yu I Dolgikh, Т N Pustovoitova, N E.Zhdanova Hormonal regulation of somatic embryogenesis on maize. In Phytohormones in Plant Biotechnology and Agnculture, Proceedings of NATO-Russia Internation Workshop, Kluwer Academic Publishers, 2003, p.243-247

37. E.C.Осипова, О В Ковеза, А В.Троицкий, Ю И.Долгих, З.Б.Шамина, С А Гостимский. Выявление специфических RAPD- и ISSR-фрагментов у сомаклонов кукурузы (Zea mays L) и создание на их основе SCAR-маркеров. Генетика, 2003, т.39, № 12, с. 1664-1672.

38. Е.С.Осипова, Ю.И.Долгих, А В. Троицкий, З.Б Шамина, С А.Гостимский. Молекулярно-генетические маркеры сомаклонов кукурузы. Тез. VIII Междунар. конф. Биология клеток растений in vitro и биотехнология, Саратов, 2003, с. 237.

39. С.А.Данилова, ЮН Долгих Способ обработки эмбриогенного каллуса кукурузы in vitro. Патент № 22007660 (РФ). Б.И. 2003. № 8.

40 С А Данилова, Ю И Долгих Стимуляция регенерации растений в культуре тканей кукурузы под действием антибиотика цефотаксима Физиология растений, 2004, т.53, № 3, с.1-5.

41 Ю И Долгих Результаты и перспективы использования клеточной селекции для создания перспективных форм растений Тез III Междунар конф «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 2004, с. 114-115.

Гарнитура Times. Формат 60V9!)/1-S, Бумага офсетная 80 г. Печать офсетная. Уч .-изд. л 1,0 Усл.печ.л 1,5. Тираж 100 экз. Отпечатано с готового Оригинал-макета в ООО "Знаменка"

* - 8 ? 8 5

РНБ Русский фонд

2006-4 5607

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Долгих, Юлия Ивановна

Введение.

Глава 1. Сомакдональная изменчивость кукурузы.

Обзор литературы.8'

Изменчивость морфологических признаков.

Изменчивость биохимических и физиологических'признаков.!

Вариации числа и структуры хромосом.

Изменения; выявляемые на уровне ДНК.,

Активация в культуре in vitro мобильных генетических элементов.Л

Вариабельность мишхондриалыюго и хлорошгастного

Геномов.

Причины и механизмы сомакяонаяьной изменчивости.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сомаклональная изменчивость растений и возможности ее практического использования"

Индуцируемая; культивированием тканей in vitro и проявляющаяся у растений-регенерантов изменчивость получила определение «сомаклональной изменчивости», а измененные растения были; названы сомаклонами или сомаклональными вариантами. Сомаклональная изменчивость обнаружена; у регенерантов большинства; исследованных видов растений!.Описаны сомаклональные вариации по морфологическим; и биохимическим признакам, физиологическим параметрам. Изменения происходят как в ядерной, так и в хлоропластной и митохондриальной ДНК, встречаются растения-регенеранты с крупными перестройками генома и с точковыми мутациями [Скаукрофт, 1990].

Индуцированная in vitro изменчивость позволяет существенно повысить генетическое разнообразие исходного материала, благодаря чему представляет большой интерес для селекции новых сортов растений. Вместе с тем, возникающие при культивировании тканей in vitro неконтролируемые мутации являются нежелательными при микроклональном размножении или генетической инженерии. Поэтому очень важно знать закономерности сомаклональной изменчивости и уметь ее регулировать.

В настоящее время установлено, что дедиференциация при введении тканей в культуру in vitro и редифференциации при регенерации растений, а также культивирование клеток на искусственных питательных средах оказывают существенное влияние на стабильность генома и характер экспрессии генов. Накоплено много данных по вариабельности морфологических признаков; а также числа и структуры хромосом у растений-регенерантов;[D'Amato,„ 1985; Кагр, 1995]. Высказан ряд гипотез о происхождении; сомаклональных вариаций [Yeoman, 1981; Phillips et al., 1994]. В меньшей степени сомаклональная изменчивость исследована на молекулярном уровне [Goodwin et al., 1997; Гостимский и др., 1999]. Несмотря па активное исследование, открытыми остаются вопросы о влиянии условий культивирования клеток на частоту сомаклональной изменчивости, о соотношении среди сомаклональных вариаций мутаций и изменений негенетической; природы, о стабильности сомаклональных вариантов, о реализации на? фенотипическом уровне хромосомных аберраций или изменений ДНК. Неясно, отличается ли сомаклональная изменчивость по частоте и спектру изменений от классического мутагенеза у целых растений, какие признаки сильнее подвержены вариабельности в условиях in vitro. Из-за использования разными авторами разных видов растений и разных способов изучения трудно оценить характер сомаклональной изменчивости в целом.

Препятствием к широкому использованию культивируемых клеток в селекции являются трудности, возникающие при регенерации растений. До сих пор не выработаны общие подходы к регуляции морфогенеза in vitro, из-за чего для каждого вида и даже сорта условия регенерации растений приходится подбирать эмпирически.

Кукуруза, выбранная в качестве объекта изучения сомаклональной изменчивости, является важной сельскохозяйственной культурой, она хорошо охарактеризована с точки: зрения физиологии и генетики. Составлены подробные генетические карты хромосом кукурузы. Вместе с тем, генетическое разнообразие существующих сортов! этой культуры очень ограничено. Мировой банк зародышевой; плазмы кукурузы представлен, главным образом, формами тропического происхождения, неадаптированными к длинному световому дню и короткому вегетационному периоду умеренных широт [Earle, Kuehnle, 1990]! Поэтому актуальным является создание новых форм растений, сочетающих высокую продуктивность с экологической пластичностью. Ускорить и облегчить процесс селекции призваны новые методы создания исходного селекционного материала, в том числе, сомаклональная изменчивость и клеточная селекция.

Целью настоящей работы являлось изучение закономерностей сомаклональной изменчивости и оценка возможности ее использования для создания растений кукурузы, толерантных к неблагоприятным условиям окружающей среды.

В задачи исследования входили: разносторонняя характеристика сомаклональной изменчивости кукурузы, включающая оценку на морфологическом, физиологическом, биохимическом, хромосомном и молекулярном уровнях;

1) исследование роли генотипа и экзогенной регуляции в обеспечении способности клеток к морфогенезу in vitro и выявление факторов, повышающих эффективность регенерации растений;

2) разработка селективной системы и отбор среди сомаклональных вариантов растений кукурузы, толерантных к абиотическим стрессам (засухе, засолению, неблагоприятным температурам).

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Долгих, Юлия Ивановна

выводы

1. Впервые дана разносторонняя характеристика сомаклональной изменчивости кукурузы, включающая оценку на морфологическом, физиологическом, биохимическом, хромосомном и молекулярном уровнях. Культивирование in vitro вызывает: 1) ненаследуемые модификации, нормализующиеся? в процессе онтогенеза; 2) изменения» экспрессии генов? (как наследуемые, так и ненаследуемые); 3) истинные мутации — изменения» последовательности нуклеотидов ДНК;

2. Сомаклональные вариации возникают уже на ранних этапах культивирования тканей in vitro, при? длительном выращивании каллусных культур, а также в стрессовых условиях увеличивается частота сомаклональной изменчивости и расширяется круг измененных признаков.

3. Процесс введения в культуру (дедифференциация) и последующая регенерация растений (редифференциация) индуцируют нарушения экспрессии генов. У сомаклонов это проявляется в виде аномалий развития, нарушений тканевой специфичности. Частота подобных вариаций; достигает десятков процентов.

4. Вероятность генетической изменчивости различных признаков не одинакова. Наиболее подвержены изменчивости in vitro количественные признаки. Степень изменчивости моногенных маркерных признаков, генов, контролирующих устойчивость к NaCl и ПЭГ, не превышала долей процента.

5. Впервые проанализирована изменчивость RAPD- и ISSR-маркеров у сомаклонов кукурузы. Выявлен высокий уровень полиморфизма ДНК: все проверенные растения, отличались от исходной? линии. Обнаруженные у регенерантов изменения наследовались по доминантному и ? кодоминантному типам наследования в соответствии? с: законами? Менделя. Клонирование и секвенирование полиморфных фрагментов ДНК выявило у сомаклонов многочисленные мутации в виде замены нуклеотидов и делений. Изменчивости? in vitro подвержены как? кодирующие, так и некодирующие участки? генома, но большинство секвенированных фрагментов ДНК из сомаклонов кукурузы обнаружило гомологию с повторяющимися последовательностями. Один из полиморфных фрагментов? ДНК имел высокую степень гомологии с ретротранспозоном Opie-1 5' LTR кукурузы.

6. При изучении; роли? генотипа и условий культивирования? в регуляции морфогенеза in vitro показано, что генотип определяет пределы изменчивости регенерационной способности; На стадии? индукции? эмбриогенного каллуса? норма реакции; генотипа; является; узкой и эффективность экзогенной ф физиологической; регуляции? невелика; На стадии; регенерации растений из соматических эмбриоидов изменения условий • культивирования существенно влияют на количество формирующихся растений.

7. Разработаны рекомендации; по повышению частоты регенерации растений из культивируемых тканей кукурузы. Для; усиления индукции эмбриогенного каллуса эффективны добавление в среду нитрата? серебра, соединений,, влияющих на эндогенный уровень, гормонов, или гибридизация с высокоморфогенными линиями. Впервые показано, что количество растений-регенерантов увеличивается в несколько раз при культивировании клеток в присутствии эмистима, цефотаксима, а также при обработке каллусных инокулюмов слабым постоянным электрическим током. т

8. Разработаны новые методические подходы к созданию толерантных к абиотическим стрессам растений путем; клеточной; селекции: предложены условия и способы отбора^ in vitro, позволяющие в короткий срок получить жизнеспособные регенеранты с повышенной устойчивостью.

9. Впервые получены растения кукурузы, толерантные к засухе, засолению и неблагоприятным температурам. Повышенная устойчивость т наследовалась в ряду поколений, что свидетельствует в пользу ее мутационной природы. т

Заключение

Дана оценка сомаклональной изменчивости кукурузы по степени чувствительности к таким абиотическим стрессам, как засоление, засуха и экстремальные температуры. Сомаклоны, полученные от линии А188, продемонстрировали? значительное разнообразие по устойчивости к пониженной температуре; По всхожести семян при 10°С часть сомаклонов превосходила исходную линию. По отношению к другому абиотическому стрессовому фактору - засолению изменчивость среди; сомаклонов была н изкой, проверенные растения уступали: исходной линии по прорастанию семян и интенсивности роста на среде с NaCl. Было высказано предположение, что это вызвано очень низкой частотой резистентных клеток в культивируемых: тканях кукурузы. В дальнейшем в процессе отбора солеустойчивых клонов на селективных средах высказанное предположение подтвердилось. Более того, было показано, что резистентные клетки не накапливаются в популяции при длительном культивировании. Для; выделения устойчивых вариантов потребовалось проведение клеточной селекции.

При выборе способа клеточной селекции нами впервые было детально исследовано негативное влияние длительного культивирования in vitro на жизнеспособность и фертильность растений-регенерантов. С учетом этого фактора и на основании анализа различных способов отбора был разработан; метод, сочетающий эффективную селекцию с сохранением

310 регенерационной способности и высокой жизнеспособности регенерантов.

Его принципиальное отличие от ранее принятого подхода состоит в том, что продолжительная: селекция in vitro» до полной; элиминации чувствительных клеток была заменена кратковременным! культивированием: в; жестких селективных условиях, проведением регенерации: растений; тоже в селективных условиях и продолжением отбора на уровне полученных растений. Этот метод позволил получить здоровые и фертильные растения кукурузы, толерантные к засухе и засолению. Разработанный!способ»клеточной? селекции был: впоследствии; успешно использован нами; для; выделения толерантных к засолению и солям тяжелых металлов газонных трав [Гладков? и др., 2003; 2004], а также устойчивых к гипоксии; вызванной корневым; затоплением, растений пшеницы [Степанова: и др.,. 2002]. Применение клеточной селекции для создания; засухоустойчивых форм было осуществлено в нашей работе впервые. Большое значение для; получения желаемого результата имел сделанный на основании; сопоставления реакций на обезвоживание растений и культивируемых: тканей выбор ПЭГ в качестве селективного фактора. Выделенные в результате клеточной; селекции на среде с NaCl растения характеризовались повышенной солеустойчивостью на всех этапах онтогенеза. В условиях засоления они превосходили исходную линию по всхожести в 2,5 раза, по выживаемости проростков - в

4-5 раз. При 0,3% засолении, летальном для: контрольных растений, полученные после клеточной; селекции регенеранты. проходили полный жизненный цикл и давали семена. Растения, полученные из устойчивых к ПЭГ клонов, развивались в условиях ограниченного полива (30% ПВП) так же, как при оптимальном увлажнении.

Наследование признаков толерантности к NaCl и засухе: было прослежено на протяжении трех поколений. Показано, что устойчивость регенерантов; не всегда; проявляется у их потомства; Вероятно, только у части полученных после селекции; растений! устойчивость обусловлена мутациями. В результате отбора, проводившегося; в каждом; поколении, была выделена группа растений, стабильно сохраняющих ценные признаки.

С целью выяснения причины солеустойчивости было проведено сравнение физиологических и биохимических показателей устойчивых и чувствительных; к; NaCl каллусных тканей. Клетки солерезистентного клона № 88 в условиях засоления характеризовались несколько более высокой скоростью накопления осмотически значимых веществ (ионов натрия, Сахаров, пролина), хотя их абсолютное количество не сильно отличалось от уровня исходной линии. Проведенный анализ не позволяет выделить какую-то одну причину устойчивости. По-видимому, культивирование in vitro индуцировало множественные изменения метаболизма, которые в сумме обеспечили сохранение способности к росту и морфогенезу в стрессовых условиях.

Полученные из устойчивых к ПЭГ клеток растения характеризовались более высокой по сравнению с исходными гибридами способностью удерживать воду при недостаточном поливе. Толерантные растения в условиях засухи накапливали больше АБК, что могло иметь значение для активации других защитных реакций. Мобилизация адаптивных изменений метаболизма у отобранных растений, наиболее выраженная на стадии цветения, позволила избежать характерного для засухи большого интервала между цветением мужских и женских соцветий, который является существенной причиной потери урожая при недостатке влаги.

В ряде случаев засухоустойчивость полученных растений сопровождалась толерантностью к высоким и низким температурам и засолению. Вероятно, это обусловлено подобием защитных механизмов, так как в основе действия всех этих стрессовых факторов лежит обезвоживание клеток. Поэтому селективная система с ПЭР, направленная на отбор клеток с повышенной способностью противостоять потере воды, может быть использована для получения растений, толерантных к нескольким абиотическим стрессам.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Долгих, Юлия Ивановна, Москва

1. Бабаева С.А., Петрова Т.Ф., Гапоненко А.К. Полиплоидия и политения культивируемых in vitro клеток злаков // Генетика, 1995, т. 31, с. 678-683.

2. Бабаева С.А., Гапоненко А.К., Петрова Т.Ф. Цитогенетический анализ IB-хромосомы сомаклона мягкой пшеницы, измененного по компонентному составу глиадинов // Докл. АН СССР, 1991, т. 320, с. 1251-1253.

3. Белянская С.Л., Шамина З.Б., Кучеренко Л.А. Морфогенез в; резистентных клонах риса // Физиология растений, 1994, т.41, с.573-577.

4. Богу нова В.Г. Физиологическая и генетическая регуляция морфогенеза и регенерации кукурузы in vitro. Диссерт. на соиск. ученой степени канд. биол. наук, Москва, 1993.

5. Бутенко Р.Г. Экспериментальный морфогенез и дифференциация в культуре клеток растений. XXXV Тимирязевские чтения, М.: Наука, 1975, с. 45-48

6. Внучкова В.А., Неттевич Э.Д., Чеботарева Т.М., Хитрова Л.М., Молчанова JI.M. Использование методов in vitro в селекции? ячменя на устойчивость к токсичности кислых почв // Доклады ВАСХНИЛ, 1989, № 7, с.2-5.

7. Внучкова В.А., Хитрова Л.М., Аш О.А., Чеботарева Т.М. j Получение растений-регенерантов зерновых культур наIселективных средах. Тезисы Междунар. конф. Биологияткультивируемых клеток и биотехнология, Новосибирск, 1988, | с. 183.

8. Гамбург К.З. Биохимия ауксина и его действие на клетки растений, Новосибирск: Наука, 1976, 278 с.

9. Гапоненко А.К., Петрова Т.Ф., Искаков А.А., Созинов А.А.j

10. Цитогенетика культивируемых in vitro соматических клеток ирастений-регенерантов злаков. Сообщение 1. Hordeum vulgare L.

11. Генетика, 1987, т. 23, с. 2036-2046. • 319т

12. Гаионенко А.К., Шаяхметов И.Ф., Бабаева С.А., Охрименко Г.П. Анализ изоферментного состава эстеразы, АДГ, ГДГ и ГОТ сомаклонов твердой и мягкой пшеницы // Генетика, 1993, т. 29, с. 323-328.

13. Гладков Е.А., Долгих Ю.И., Бирюков В.В: Отбор солеустойчивых газонных трав с помощью методов биотехнологии // Биотехнология, 2003, № 5, 380-385.

14. Гладков Е.А., Гладкова О.Н., Долгих Ю.И., Бирюков В.В. Получение газонных трав, толерантных к солям меди. Матер. Междун. конф. Стратегия адаптивной селекции полевых культур в связи с глобальным изменением климата, Саратов, 2004, с. 310314.

15. Гостимский С.А., Багрова A.M., Ежова Т.А. Обнаружение и цитогенетический анализ изменчивости, возникающей при регенерации растений из культуры тканей посевного гороха // Докл. АН СССР, 1985, т. 283, с. 1007-1011.

16. Гостимский С.А. Генетическая изменчивость клеток растений при культивировании // Успехи совр. генетики, вып. 14, М: Наука, 1987, с. 48-63.

17. Генкель П.А. Физиология жаро- и засухоустойчивости. М., Наука, 1982, 280 с.

18. Губарь Е.К., Кунах В.Л. Кариотипическая изменчивость культивируемых клеток скерды (Crepis capillaries L. Wallr) // Генетика, 1992, т.28, с. 51-61.

19. Денебаева М.Г.,, Бишимбаева Н.К. Цитоанатомическое изучениетдействия 2,4-Д на; состав клеточных популяций рыхлогоIэмбриогенного каллуса; ячменя // Биотехнология. Теория; иj практика, 2001, № 3-4, с. 54-60.

20. Денисова Э.В., Мазяркина Т.В. Изменчивость по содержанию жирных кислот и глюкозинолатов в линиях из сомаклонов? ярового рапса (Brassica napus L.). Тезисы докл. VII межд. конф.т

21. Биология клеток: растений in vitro, биотехнология; и сохранение генофонда, Москва, 1997, с. 2131

22. Долгих Ю.И., Шамина З.Б. Генетическая изменчивость в популяции клеток женьшеня // Генетика, 1986, т. 22, с. 2820-2824.

23. Дридзе И.Л., Хадеева Н.В., Майсурян А.Н. Характеристика ш регенерантов табака, устойчивых к воздействию стрессовых:факторов II Физиология растений, 1992, т. 39, с.1027-1033.

24. Ежова Т.А., Тихвинская Н.С., Багрова A.M., Васильев И.Р., Маторин Д.Н., Гостимский С.А. Получение толерантных к гербицидам форм гороха методом селекции in vitro // Доклады АН СССР, 1990, т.310, № 4, с.987-990.

25. Ежова Т.А., Багрова A.M., Хартина Г.А., Гостимский С.А.

26. Цитогенетический ? анализ длительно культивируемых каллусов и1.321тполученных нз них регенерантов гороха (Pisum sativum L.)■// Цитология и генетика, 1988, т. 22, с. 22-26.

27. Забродина М.В;, Хавкин Э.Е. Органоспецифичные спектры эстераз у проростков кукурузы // Докл. АН СССР, 1992, т. 323, с. 988-991.

28. Загорска Н.А., Шамина З.Б., Бутенко Р.Г. Изучение растений-регенерантов, полученных в культуре тканей табака // Генетика, 1971, т. 7, с. 23-35.

29. Зауралов О.А., Лукаткин А.С. Тканевые и клеточные аспекты холодоустойчивости и холодового повреждения теплолюбивых растений // Успехи современной биологии, 1996, т. 116, вып.4, с.418-431.

30. Захарин А.А. О некоторых особенностях солевого обмена гликофитов при засолении среды // Агрохимия, 1980, № 8, с. 139146.

31. Игнатова С.А., Белоусов А.А., Сидоренко Л.В. Генотипическая специфичность морфогенетических процессов в культуре соматических тканей кукурузы // Цитология и генетика, 1993, т. 27, с. 39-44.

32. Исаева Н.А., Бородько А.В. Изучение морфологической изменчивости в растениях-регенерантах ячменя // Цитология и генетика, 1988, т. 22, с. 27-31.

33. Искаков А.Р. Селекционная ценность растений ячменя, регенерированных из культуры соматических тканей; Матер. Республиканской конф; Проблемы теоретической? и прикладной генетики в Казахстане, Алма-Ата, 1990, с.111—115.

34. Карабаев М.К., Джардемалиев Ж.К. Культивируемые клетки пшеницы и кукурузы морфогенез и устойчивость // Физиологияj растений, 1994, т. 41, с. 807-814:

35. Карабаев М.К., Сидоренко О.И., Майчекина P.M., Кошанова

36. К.Ш., Ушарова Г.П. Первичные процессы фотосинтеза у сомаклональных вариантов озимой пшеницы // Изв. АН КазССР,1. Щсер. биол., 1990, № 5, с. 27-30.

37. Керимов Ф., Кузнецов? Вл.В., Шамина; З.Б. Организменный и клеточный уровни солеустойчивости? двух сортов хлопчатника // Физиология растений, 1993, т.40, с.128-132.

38. Козырева О.Г., Дунаева С.Е. Генетика регенерации в культуре in т vitro злаков // Генетика, 1994, т. 30, с. 1432-1440.

39. Козыренко М.М., Артюкова Е.В., Лауве Л.С., Журавлев Ю.Н., Реунова Г.Д. Генетическая; изменчивость каллусных линий? женьшеня Panax ginseng 11 Биотехнология, 2001, № 1, c.19-26.

40. Кокаева З.Г., Боброва B.K., Петрова Т.В., Гостимский С.А.,

41. Троицкий А.В. Генетический полиморфизм сортов, линий и мутантов гороха по данным RAPD-анализа // Генетика, 1998, т. 34, с. 771-777.j1.323

42. Кокаева З.Г., Боброва В.К., Вальехо-Роман К.М., Гостимский С.А., Троицкий А\В. RAPD-аиализ сомаклональной и межсортовой изменчивости гороха // Докл. Акад. Наук., 1997, т. 355, с. 134-136.•1

43. Константинов Ю.М., Ривкин М.И. Возможный свободнорадикальный механизм возникновения сомаклональной изменчивост у растений; Матер. VII Всес. Сими. Молекулярныеj механизмы генетических процессов, М: Наука, 1991, с. 127-130;

44. Копертех Л.Г., Бутенко P.F. Нативные фитогормоны в эксплантах пшеницы в связи соспособностью к морфогенезу in vitro // Физиология растений, 1995, т. 42, с. 555-559.

45. Костюк А.Н., Остаплюк А.Н., Левенко Б.А. Ответная реакция растений на солевой стресс // Физиология и биохимия культурных растений, 1994, т.26, с.525-544.

46. Кучеренко Л.А. Индуцированный морфогенез в культуре тканей риса и его использование для создания исходного селекционногоматериала: В кн. Культура клеток растений и биотехнология, М: Наука, 1986, с. 211-213.

47. Кучеренко JI.A. Каллусогенез, выход и характеристика регенерирующих растений риса в культуре тканей в зависимости от гормонального состава индукционной среды // Докл. РАСХН, 1993, №4, с. 3-6.

48. Лутова Л.А., Левашина Е.А., Бондаренко Л.В., Байрамова Н.Л., Андронова Е.В., Инге-Вечтомов С.Г. Мутанты высших растений по биосинтезу стеринов // Генетика, 1992, т.28, с. 129-137.

49. Лутова Л.А., Проворов Н.А., Тиходеев О.Н;, Тихонович И.А., Ходжайова Л.Т., Шишкова С.О. Генетика развития растений (ред. Инге-Вечтомов С.Г.). С.-Петербург: Наука, 2000, 539 с.

50. Марьяхина И.Я., Бутенко Р.Г. Соматическая редукция в культуре тканей капусты // Цитология и генетика, 1974, т. 8, с. 267-269.

51. Мезенцева О.Ю. Использование тканевых и клеточных культур в селекции на; устойчивость к фитопатогенам // Селекция и; семеноводство, 1990; с.59-62.

52. Михайлова-Крумова А.Б., Гаврилюк И.П., Азаркович М.И., Бутенко Р.Г. Исследование сомаклональных; вариаций белков семян гороха // Физиология растений; 1991, т. 38, с. 521-529.

53. Молотковский F.X. Явление полярности и смещения; пола у кукурузы // Докл. АН СССР, 1957, т. 114, с. 434-437.

54. Никифирова И.Д., Чернов В.А., Швидченко В.К., Бутенко Р.Г. Рост и морфогенез клеток яровых пшениц в стрессовых условиях и отбор устойчивых вариантов. Тезисы Междунар; конф. Билогия культивируемых клеток и биотехнология, Новосибирск, 1988, с.178-179.

55. Новожилов О.В., Левенко Б.А. Получение клеточных линий люцерны, устойчивых к тиазолидинкарбоновой кислоте // Цитология и генетика, 1990,1 т.24, с.28-31.

56. Орлов П.А., Маврищева Е.Б., Палилова А.Н. Взаимодействие генома и плазмона при индукции морфогенетических реакций растений пшеницы в культуре пыльников // Генетика, 1994, т. 31, с. 385-389.

57. Паназян Н.Д., Тимофеева А., Ишин А.Г. Реализация морфогенеза в культуре соматических клеток кукурузы. Тезисы III Всероссийской конф. Генная и клеточная инженерия, 1992, с. 36.

58. Подобед Н.И., Яковлева Г.А. Вариабельность сомаклонов; из культуры тканей картофеля ранней группы. Матер. II междунар. научной конф. Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии, Москва; 2000, с.26-27.

59. Полевой В.В., Саламатова T.G. Физиология роста и развития; растений. Ленинград: Изд-во Ленинградского университета, 1991, 239 с.

60. Пустовойтова Т.Н., Жданова Н.Е., Жолкевич В.Н. Повышение засухоустойчивости растений под воздействием эпибрассинолида // Доклады Акад. Наук, 2001, т.376, № 5, с.697-700.

61. Пустовойтова Т.Н., Жолкевич; В.Н; Основные направления в: изучении влияния засухи на физиологические процессы; у растений // Физиология и биохимия культ. Растений, 1992, т. 24, с. 14-26.

62. Ралдугина Г.Н., Соболькова Г.И. Генотипические различия при действии абсцизовой кислоты на каллусные культуры Brass icanapus L. II Физиология растений, 1994, т. 41, с. .702-706.

63. Сайб Л.Р., Савин В.Н., Карабаев М.К., Сейфуллин Я.Л., Юнусов HJI.-0. Влияние генотипа на; формирование морфогенного каллуса и регенерацию растений; кукурузы в; культуре in vitro // Известия АН КазССР, сер. биол., 1991, № 6, с. 33-37.

64. Сергеева Л:Е., Левенко Б.А. Солеустойчивость потомства' растений-регенерантов, полученных из солеустойчивых клеточных линий табака. Тезисы VI съезда Украинского общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова, Киев, 1992, с. 134135.

65. Соловьян В.Т., Спиридонова Е.В., Кунах В. А. Геномные перестройки в культивируемых клетках Rauvolfia serpentina. Связь с межвидовой изменчивостью // Генетика, 1994, т. 30, с. 399-404.

66. Степанова А.Ю., Полякова Л.И., Долгих Ю.И., Вартапетян Б.Б. Реакция культивируемых клеток сахарного тростника на аноксию и отбор устойчивой клеточной линии // Физиология растений, 2002, т. 49, с. 315-323.

67. Строганов Б.П. Метаболизм растений в условиях засоления. ХХХНГТимирязевские чтения. М.: Наука, 1973, 52 с.

68. Строганов Б.П., Кабанов В.В., Шевякова Н.И. и др. Структура и функция клеток растений при засолении. М.: Наука, 1970, 318 с.

69. Тухбатулина JI.K., Шамина З.Б. Получение и характеристика резистентного к pFFA клона мака. Тезисы IV Всес. конф. Культура клеток растений и биотехнология, Кишинев, 1983, с. 167.

70. Удовенко Г.В. Солеустойчивость культурных растений. Л.: «Колос», 1977, 215 с.

71. Упелниек В.П., Новосельская А.Ю., Шутка Е., Талиба Г., Метаковский Е.В. Анализ изменчивости электрофоретических спектров запасных белков зерна у регенерантов пшеницы // Генетика, 1991, т. 27, с. 1597-1604.

72. Фролова Л.В. Особенности популяций культивируемых клеток. В кн. Культура клеток растений (ред. Р.Г.Бутенко), М: Наука, 1981, с. 5-16.

73. Хавкин Э.Е., Забродина М.В. Органоспецифичные спектры пероксидаз у кукурузы // Физиология растений, 1995, т. 42, с. 281289.

74. Хавкин Э.Е., Забродина М.В. Наследуемые изменения в спектрахпероксидаз и эстераз у сомаклонов кукурузы // Физиологиярастений, 1994, т. 41, с. 859-867.w

75. Хадеева H.B., Дридзе И.Л., Майсурян А.Н. Выделение солеустойчивых форм риса путем прямой и непрямой селекции в культуре ткани // Биотехнология, 2000, № 3, с.27-37.

76. Хадеева Н.В., Майсурян А.Н., Дридзе И.Л. // Физиология растений, 1987, т.34, с. 157-162:

77. Хвырлева Ц.Д., Рыжик М.В., Ананьев Е.В., Гапоненко А.К., Искаков А.Р., Созинов А.А. Деметилирование рДНК в каллусной ткани ячменя, культивируемой in vitro // Докл. АН СССР, 1986, т. 290, с. 1249-1252:

78. Хромова Л.М. К вопросу о методологии; клеточной; селекции in vitro. В кн. Использование клеточных технологий в селекции картофеля. Научные труды НИИ картофельного хозяйства, Москва, 1987, с.40-46.

79. Чайлахян М.Х., Хрянин В.Н. Гормональная регуляция проявления пола у растений//Ботанический журнал, 1980, т. 65, с. 153-165.

80. Чернышева В.Г., Шамина З.Б. Влияние ЦМС на индукцию эмбриогенной каллусной ткани кукурузы // Генетика, 1990, т. 26, с. 1435-1439.

81. Чеченева Т.Н., Труханов В.А. Генетическая обусловленность каллусообразования и регенерационной способности у кукурузы // Цитология и генетика, 1994, т. 28, с. 46-49.

82. Шамина З.Б. Методические указания по клеточной селекции. Москва, 1984. 36 с.

83. Шамина З.Б. Стратегия получения: мутантных штаммов клеток растений-продуцентов биологически активных веществ // Физиология растений, 1994, т. 41; с. 879-884.

84. Шарова А.П., Давыдова: Ю.В., Мелик-Саркисов О.С., Аветисовт

85. В. А. Новые подходы к конструированию устойчивого к: инфекционному стрессу картофеля//Биотехнология, 1996, № 7, j с. 18-22.

86. Шаяхметов: И.Ф., Шакирова Ф.М. Формирование соматических эмбриоидов в суспензионной культуре клеток пшеницы; в присутствии АБК // Физиология растений, 1996, т. 43, с. 101-103;

87. Шевякова Н.И. Международная конференция: по полиаминам; в естественных науках// Физиология растений, 1987, т. 34, с. 543545.

88. Шевякова Н.И. Метаболизм и физиологическая роль пролина в растениях при водном и солевом стрессе // Физиология растений,1. 1983, т. 30, с. 768-779.

89. J 97. Шевякова Н.И., Кирьян И.Г. Особенности регуляции биосинтезаметионина в солеустойчивых клетках Nicotiana sylvestris L. II Физиология растений, 1995, т.42, с.94-100. s 98. Шевякова Н.И., Ракитин В.Ю., Музычко JI.M., Кузнецов Вл.В!

90. Стресс-индуцируемая аккумуляция пролина в связи с солеустойчивостью интактных растений и изолированных клеток

91. Прикладная биохимия и микробиология, 1998^ т. 34, с. 320-325.i 331

92. Хавкин Э.Е., Ко Э.Х. Организация регулирующих рост генов; у кукурузы. 2. Локусы количественных признаков // Физиология растений, 1995, т. 42, с. 629-646.

93. Abdullah R., Thompson J.A., Khush G.S., Kaushik R.P., Cocking E.C. Protoclonal; variation in; the seed progeny of plants regenerated from rice protoplasts // Plant Sci., 1989, v. 65, p. 97-101.

94. Adkins S.W., Shiraichi Т., McComb J.A., Ratanopol Ri, Kupkanchanakul Т., Armstrong L.J., Schultz A.L. Somaclonal variation in rice submergence tolerance and other agronomic characters // Physiol. Plantarum, 1990, v. 80, p. 647-654.

95. Ahoowalia B.S. Plant regeneration from meristem culture of corn, Zea mays L. Abstr.6 Intern. Congr. Plant Tissue Cell Culture, Minneapolis, 1986, p. 445.

96. Al-Zahim M.A., Ford-Lloyd B.V., Newbury H.J. Detection of somaclonal variation in garlic {Allium sativum L.) using RAPD and cytological analysis // Plant Cell Rep., 1999, v. 18, p. 473-477.

97. Anderson M.D., Prasad Т.К., Martin B.A., Stewart C.R. Differential gene expression in chilling-acclimated maize seedlings and evidencefor the involvement of abscisic acid in chilling tolerance // Plant Physiol., 1994, v. 105, p.331.

98. Armstrong C.L., Green C.E., Phillips R.L., Stucker R.E. Genetic controls of plant regeneration from maize: tissue; cultures // Maize Genet. Coop. Newslett., 1985; v. 59,- p. 92-93.

99. Armstrong C.L., Phillips R.L. Genetic and cytogenetic variation in plants regenerated from organogenic and friable embryogenic tissue cultures of maize // Crop Sci., 1988, v. 28, p. 363-369.

100. Armstrong K.C., Nakamura G., Keller W.A. Karyotype instability in tissue culture regenerants of tritical (X Triticosecale Wittmack) cv. "Welsh" from 6-month-old callus cultures // Z. Pflanzenzuchtg., 1983, v. 91, p. 233-245.

101. Arnoldt-Schmitt B. Physiological aspects of genome variability in tissue culture. II. Growth phase-dependent quantitative variability ofrepetitive Bst N1 fragments of primary cultures of Daucus carota L. II Theor. Appl. Genet, 1995, v. 91, p. 816-823.

102. Ashmore S.E., Shapcott A.S. Cytogenetic studies of Haplopappus; gracilis in both callus and suspension cell cultures // Theor. Appl.j Genet., 1989, v. 78, p. 249-259.I

103. Bajji M, Kinet J.M., Bouharmont J. Characterization of progenies issued from draught tolerant plants of durum wheat selected in vitro. Froc. Intern. Congr. Integrated Study on Drought Tolerance of Higher Plants, 1995, Montpellier, France, VII2.

104. Bao P.H., Granata S., Castiglione S. et al. Evidence for genomic•эchanges in transgenic rice (Oryza sativa L.) recovered from protoplasts 11 Transgenic Res., 1996, v. 5, p. 97-103/

105. Bartkowiak E. Tissue culture of maize. 4. Hormonal, environmental and genotypic influences on plant regenemton /7 Genet. Polon,, 1983, v.24, p. 299-304.

106. Bayliss M.W. Chromosomal variation in plant tissue culture // Int. Rev. Cytol., 1980, v. 11 A, p. 113-143.

107. Beckert M., Qing C.M. Results of a diallel trial and a breeding experiment for in vitro aptitude in maize // Theor. Appl. Genet., 1984,s v. 68, p. 247-251.

108. Benetzen J.L., Adams T.L. Selection and characterization of cadmiumresistant suspension cultures of the wild tomato Lycopersiconperuvianum // Plant Cell Rep., 1984, v. 3, p. 258-261.

109. Bennici A., Cionini P.G., D'Amato F. Callus formation from suspensor of Phaseolus coccineus in hormone-free medium: a cytological and DNA cyto-photometric study // Protoplasm, 1976, v. 89, p. 251-261.

110. Bentrup F.-W. Cellular polarity. In: Cellular Interactions (Linskens H.F., Heslop-Harrison J. eds) berlin et al., 1984, p; 473-490.

111. Benzion G., Phillips R.L. Cytogenetic stability of maize tissue culture: a cell line pedigree analysis // Genome, 1988, v. 30, p. 318-325;

112. Benzion G., Phillips R.L., Rines H.W. Case histories of genetic variability in.vitro: oats and maize. In: Cell Culture and Somatic Cell Genetics: of Plants, v.3 (Vasil I.K. ed.), Acad; Press., New York, London, 1986, p. 435-448.

113. Bertin P., Busogoro J.P., Tilquin J.P., Kinet J.M., Bouharmont J. Field-evaluation and selection of rice somaclonal variants at different altitudes // Plant Breeding, 1996, v. 115, p. 183-188.

114. Bertin P., Klnet J.M., Bouharmont J. Heritable chilling tolerance improvement in rice through somaclonal; variation and cell-line selection//Australian J. Bot., 1996, v. 44, p. 91-105.

115. Bingham E.T., Saunders J.W. Chromosome manipulation in alfalfa: scaling the cultivated tetraploid to seven ploidy levels // Crop Sci., 1974, v.14, p. 474-477.

116. Binh D.Q., Heszky L.E. NaCl stimulates and prolongs regeneration capacity of tissue and cell culture in rice (Oryza sativa L.). Abstr. VII Intern. Congr. Plant Tissue Cell Cult., Amsterdam, 1990; p. 18.

117. Blum A. Crop responses to drought and the interpretation of adaptation // Plant Growth Regulation, 1996, V. 20, c. 135-148.

118. Bobisud C.A., Martin S.P., Sekioka T.T. Field testing bacterial wilt-resistant tomato somaclones // J.Amer.Soc.Horticultural Sci., 1996, v. 121, p. 384-387.

119. Bogani P., Simoni A., Lio P., Germinario A., Buiatti M. Molecular variation in plant cell populations evolving in vitro in different physiological contexts // Genome, 2001, v. 44, p. 549-558.

120. Bogani P., Simoni A., Lio P., Scialpi A., Buiatti // Genome flux intomato cell clones cultured in vitro in different physiologicalequilibria. II. A RAPD analysis of variability // Genome, 1996, v. 39, p. 846-853.

121. Bolanos J., Edmeades G.O. Eight cycles of selection for drought tolerance in lowland tropical maize. II Responses in reproductive behaviour // Field Grop Res., 1993, v. 31, p. 253-268.

122. Bozorgipour R., Snape J.W. An assessment of somaclonal variation as a breeding tool for generating herbicide-tolerant genotypes ins wheat {Triticum aestivum L.) // Euphytica, 1997, v. 94, p. 335-340.

123. Bray E.A. Molecular responses to water deficit// Plant Physiol., 1993^ v. 103, p. 1035-1040.

124. Brears TV, Curtis G.J;, Lonsdale D.M. A specific rearrangement of mitochondrials DNA induced by tissue culture // Theor. Appl. Genet., 1989, v. 77, p. 620-624.

125. Brettel R.J.S., Thomas E., Ingram D.S. Reversion of Texas male-sterile cytoplasm of maize in culture to give fertile T-toxin-resistant plants //Theor. Appl. Genet., 1980, v. 58, p. 55-58.

126. Brettell R.I.S., Dennis E.S., Scowcroft W.R., Peacock W.J. Molecular analysis of a somaclonal mutant of maize alcohol dehydrogenase // Mol. Gen. Genet., 1986, v. 202, p. 235-239.

127. Brettell R.J.S., Pallotta M.A., Gustafson J.P., Appels R. Variation at the Nor loci in triticale derived from tissue culture I I Theor. Appl. Genet., 1986, v. 71, p. 637-643.

128. Brewbaker J.L., Nagai C.H., Liu E.H. Genetic polymorphism of 13 maize peroxidases // J: Hered., 1985, v. 76, p. 159-167.

129. Browley S.H., Wetherell D.F., Robinson K.R. Electrical polarity in embryos of wild carrot preceeds cotyledon differentiation // Proc. Natl. Acad. Sci., 1984, v. 81, p. 6064-6067.

130. Brown C., Brooks F.J., Pearson D., Mathias R.J. Conrol of embryogenesis and organogenesis in immature wheat embryo callus using increased medium osmolarity and abscisic acid // J. Plant Physiol., 1989, v. 133, p. 727-733.

131. Brown P.T.H. DNA methylation in plants and its role in tissue culture // Genome, 1989, v. 31, p. 717-729.

132. Brown P.T.Hi The spectrum of molecular changes associated with somaclonal variation // Newsletter, 1991, №. 66, p. 14-25.

133. Brown P.T.H., Gobel E., Lorz H. RFLP analysis of Zea mays callus cultures and their regenerated plants // Theor. Appl; Genet., 1991, v. 81, p. 227-232.

134. Carness M.G., Wright M.S. Endogenous hormone levels of immature corn kernels of A188, Missouri-17 and Dekalb XL-12 // Plant Sci., 1988, v. 57, p. 195-203.

135. Cassells A.C., Curry R.F. Oxidative stress and; physiological; epigenetic and5genetic variability in plant tissue culture: implications for micropropagators and genetic engineers // Plant Cell Tissue Organ Culture, 2001; v. 64, p. 145-157.

136. Cheeseman J.M. mechanisms of salinity tolerance in plants // Plant Physiol., 1988, v. 87, p.547-550.

137. Chowdari K.V., Ramakrishna W., Tamhankar S.A. et al. Identification of minor DNA variations in rice somaclonal variants // Plant Cell Rep., 1998, v. 18, p. 55-58.

138. Chowdhuri M.K.U., Schaefer G.W., Smith? R.L. et al. Molecular analysis of organelle DNA of different subspecies of rice and the genomic stability of mtDNA in tissue cultured cells of rice // Theor. Appl. Genet., 1988, v. 76, p. 533-539.

139. Chu C.C., Wang C.C., Sun C.S., Hsu C., Yin K.C., Chu C.Y., Bi F.J.

140. Establishment of an efficient medium for anther culture of rice throughcomparative experiments of the nitrogen sources // Sci. Sin., 1975, v. 18, p. 658-659.

141. Cogalniceanu G., Mihai R., Brezeanu F. Electrostimulaton of Nicotiana tabacum callus growth by very weak dynamic electric current. Abstr. VIII Int. Congr. Plant Tissue and Cell Cult., Florence, Italy, 1994, p. 22F.

142. Komamine A., Nomura K. Molecular mechanisms of somatic embryogenesis // GMJCN, 1985, v. 1, p. 56-57.

143. Cooper D.B., Sears R.G., Lookhart G.L., Jones B.L. Heritable somaclonal variation in gliadin proteins of wheat plants derived fromimmature embryo callus culture // Theor. Appl: Genet., 1986, v. 71, p. 784-790.

144. Cowen N.M., Thompson S.A., Wilkinson T.C. Culture associated variation in maize inbreds // Plant Breed., 1990, v. 104, p. 134-143.

145. Craig A., Millam S. Modification of oilseed rape to produce oils for industrial use by means of applied tissue culture methodology // Euphytica, 1995; v. 85, p. 323-327.

146. Cummings D.P., Green C.E., Stuthman D.D. Callus induction and plant regeneration in oats // Crop Sci., 1976, v. 16, p. 465-470.

147. Cuzzoni E., Ferretti L., Giordani C., Galli M.G., Raimondi E., Castiglione S., Sala F. Extrachromosomal amplification of a repeated DNA sequence in cultured rice (Oryza sativa L.) cells // G. Bot. Ital.y 1989; v. 123, № 1 -2, Suppl. 2, p. 160-161.

148. D'Amato F. Cytogenetics of plant cell and tissue cultures and their regenerates // CRC Critical Reviews in Plant Sciences, 1985, v. 3, p. 73-112.

149. Davies P.A., Palotta M.A., Ryan S.A., Scowcroft W.R., Larkin P.J. Somaclonal variation in wheat: genetic and cytogeneticcharacterization of alcohol dehydrogenase I mutants // Theor. Appl. Genet., 1986, v. 72, p. 644-653.

150. Degreef В., Jacobs Mi Evidence for ТатЗ activity in transgenic Arabidopsis thaliana // In Vitro Cell. Devel. Biol. Plant, 1996, v. 32, p. 241-248.

151. Demarly Y. Experimental and theoretical approach of in vitro variations. In: Somaclonal-Variation and Crop Improvement (Semal J. ed.), Dordrecht, Nijhoff, 1986, p. 84-99.

152. Dewey R.E., Tomothy D.H., Levings C.S. A mitochondrial protein associated with cytoplasmic male-sterility in the T cytoplasm of maize // Proc. Natl; Acad. Sci. USA, 1987, v. 84, p. 5374-5378.

153. Dewey R.E., Tomothy D.Hi, Levings C.S. Novel recombinations in the maize mitochondrial genome produce a unique transcriptional unit in the Texas male-sterile cytoplasm // Cell, 1986, v. 44, p. 439-444.

154. Diedrick T.J., Frisch D.A., Gengenbach B.G. Tissue culture isolation of a second mutant locus for increased threonine accumulation inmaize // Theor.Appl.Genet., 1990, v. 79, p. 209-215.

155. Dijak Mi, Smith D.L., Wilson T.J., Brown; D.C.W. Stimulation of direct embryogenesis from mesophy 11 protoplasts of Medicago sativa // Plant Cell-Rep., 1986, v. 5, p. 468-470.

156. Dikalova A., Kubalakova M., Dikalov S., Salganic R. Oxygen radical generation and somaclonal; variation in plant cells. Abstr. VIII Int. Congr. Plant Tissue and Cell Cult., Florence, Italy, ,1994, p. 112.

157. Dolezel J., Novak F.J. Effect of plant tissue culture media on the frequency of somatic mutations in Tradescantia? stamen hairs // Z. Pflanzenphysiol., 1984, v. 114, p. 51-58.

158. Domazlicka E., Opatrny Z. The effect of cadmium on tobacco cell culture and the selection of potentially Cd-resistant cell lines // Biol.Plant., 1989, v. 31, p. 19-27.

159. Dorffling K., Dorffling H., Lesselich G. In vitro-selection and regeneration of hydroxyproline-resistant lines of winter wheat with increased proline content and; increased frost tolerance // J. Plant Physiol., 1993, v. 142, p. 222-225.

160. Dragiiska R., Radeva V., Denchev P., Atanassov A., Djilianov D. In vitro selection for drought tolerance in alfalfa. Proc. Intern. Congr.1.tegrated Study of Drought Tolerance of Higher Plants, 1995, Montpellier, France, VIII 3 7.

161. Duncan D.R., Widholm J.M. Approaches for the development of cold tolerance in maize through regenerable callus culture. In Biotechnology in Agriculture and Forestry. V.25 Maize 9Y.P.S. Bajaj ed.). Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 1994, p. 331-343.

162. Duncan D.R., Widholm J.M. Proline accumulation and its implication in cold tolerance of regenerable maize callus // Plant Physiol., 1987, v. 83, p. 703-708.

163. Duncan D.R:, Widholm J.M. Proline is not the primary determinant of chilling tolerance induced by mannitol or abscisic acid in regenerable maize callus cultures // Plant Physiol., 1991, v. 95, p. 1284-1287.

164. Duncans D.R., Williams M.E., Zehr B.E., Widholm J.M. The production of callus capable of plant regeneration from immature embryos of numerous Zea mays genotypes // Planta, 1985, v. 165, p. 322-332.

165. Dutta R. Studies on the mechanism of electrically induces growth and differentiation in plants in vitro: the cytomorphological profile. Abstr. VIIT Intern. Congr. "Plant Tissue and Cell1 Culture", Florence, Italy, 1994, p. 49.

166. Earle E.D., Kuehnle A.R. Somaclonal variation; in maize. In: Biotechnology in Agriculture and Forestry, v. 11 Somaclonal Variation in Crop Improvement I (Y.P.S.Bajaj ed.), Springer-Verlag, Berlin Heidelberg. 1990, p.326-351.

167. Edallo S., Zucchinali C., Perenzin M., Salamini F. Chromosomal variation and frequency of spontaneous mutation associated with in vitro culture and plant regeneration in maize // Maydica, 1981, v. 26, p. 39-56.

168. Egerton-Warburton L.M., Balsamo R.A., Close T.J. Temporal accumulation and ultrastructural localization of dehydrins in Zea mays // Physiol. Plantarum, 1997, v. 101, p. 545-555.

169. Elkonin L.A., Enaleeva N.K., Tsvetova M.J., Belyaeva E.V., Ishin A. G. Partially fertile line with apospory obtained from tissue culture of male sterile plant of sorghum (iSorghum bicolor L. Miench) // Ann. Bot., 1995, v. 76, p. 359-365.

170. Escorial M.C., Sixto H., Garciabaudin J.M., Chueca M.C. In vitro culture selection increases glyphosate tolerance in barley // Plant Cell: Tissue Organ Culture, 1996, v. 46, p. 179-186.

171. Evans D.A., Sharp W.R. Application of somaclonal variation // Bio/technology, 1986, v. 4, p. 528-532.

172. Fahey J.W., Reed J.N., Readdy T.L., Pace G.M. Somatic embryogenesis from three commercially important inbreds of Zea mays II Plant Cell Rep., 1986, v. 5, p. 35-38.

173. Fauron C.M-R., Abbot A.G., Brettel R.I.S. Maize mitochondrial DNA-rearrangements between the normal type, the Texas male sterile cytoplasm and a fertile revertant cms-T-regenerated plant //Current Genet., 1987, v. 11, p. 339-346.

174. Fedak G., ArmstrongK.C., Handyside RJ. Chromosome instability in wheat plants regenerated from suspension culture // Genome, 1987, v. 29, p. 627-629.

175. Fluminhan A., Kameya T. Behavior of chromosomes in anaphase cells in embryogenic callus cultures of maize (Zea mays L.) // Theor. Appl. Genet., 1996, v. 92, p. 982-990.

176. Freeling M., Woodman J.C., Cheng D.S.К. Developmental potentials of maize tissue cultures // Maydica, 1976, v. 21, p. 97-112.

177. Gai M., Kucharska M., Maluszynski M., Polok K. Isozyme variation in callus culture of Arabidopsis thaliana (L.) Heynh; // Genetica Polonica, 1991, v. 32, p. 217-225.

178. Galiba G., Erdei L., Sarkadi L., Salgo A., Koscy G. Genotype dependent responses of wheat varieties to water and salt stresses in vitro. Abstr. VII Intern. Congr. Plant Tissue and Cell Culture, Amsterdam, 1990, p. 13;

179. Galiba G., Sutka J; Frost resistance of somaclones derived from Triticum aestivum L. winter wheat calli // Plant Breed!, 1989, v. 102, p. 101-104.

180. Galiba G., Yamada Y. A novel method for increasing the frequency of somatic embryogenesis in wheat tissue culture by NaCl and KC1 supplementation // Plant Cell Rep., 1988, v. 7, p. 55-58.

181. Gathercole P.W.E., Street H.E. A p-fluorophenylalanine-resistant cell line of sycamore with increased contents of phenilalanine, tyrosine and phenolics // Z. Pflanzenphysiol., 1978, v. 89, p. 283-287.

182. Gaut B.S., Doebley J.F. DNA sequence evidence for the segmental allotetraploid origin of maize // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, v. 94, p. 6809-6814.

183. Gengenbach; B.G., Connelly J.A., Pring D.R., Conde M.F. Mitochondrial DNA variation in maize plant regenerated during tissue culture selection // Theor. Appl. Genet., 1981, v. 59, p. 161-167.

184. Gengenbach B.G., Green C.E. Selection of T-cytopIasm maize callus; cultures resistant to Helminthosporinm maydis race T pathotoxin // Crop Sci., 1975, v. 15, p. 645-649.

185. Gengenbach B.G., Green C.E., Donovan C.M. Inheritance of selected pathotoxin resistance in maize plants regenerated from cell cultures V/ Proc. Natl; Acad; Sci., 1977, v. 74, p. 5113-5117.

186. Godwin I.D., Sangduen N., Kunanuvatchaidach R:, Piperidis G., Adkins S.W. RAPD ро1утофЫзт among variant and phenotypically normal1 rice {Oryza sativa var. indica) somaclonal? progenies II Plant Cell Rep., 1997, v. 16, p. 320-324.

187. Goldsworthy A. The electric compass of plants // New Sci., 1986, № 16 p. 22-23.

188. Goldsworthy A., Mina M.G. Electrical patterns of tobacco cells in media containing indole-3-acetic acid or 2,4-dichlorphenoxyaceticacid // Planta, 1991, v. 183, p. 368-373.

189. Golds worthy A., Rathor K.S. The electrical control of growth in plant tissue cultures: the polar transport of auxin//J. Exper. Bot., 1985, v. 36, p. 1134-1141.

190. Gonzales A.L, Pelaez M.T, Ruiz M.L. Cytogenetic variation in somatic tissue cultures: and? regenerated plants of barley {Hordeum vulgare L.) // Euphytica, 1996, v. 91, p. 37-43.

191. Graybosch R.A., Edge M.E., Delannay X. Somaclonal variation; in soybean plants regenerated from the cotyledonary node tissue culture system // Crop Sci., 1987, v. 27, p. 803-806.

192. Green; C.E., Phillips R.L. Plant regeneration from tissue culture of maize // Crop Sci., 1975, v. 15, p. 417-421.

193. Grisvard J., Sevignac M., Chateau Mi,,. Branchard Mi Changes in repetitive DNA sequence during callus: culture of Cucumis melo II Plant Sci., 1990, v. 72, p. 81-91.

194. Groose R.W., Bingham E.T. An unstable anthocyanin mutation recovered: from tissue culture of alfalfa (Medicago sativa). I. High frequency of reversion upon reculture // Plant Cell Rep., 1986, v. 5, p. 104-110:

195. Gu Mingguang. Cytogenetic stability and variability of calli and cell clones originated from maize pollen and their regenerated plants. In: Haploids of higher plants in vitro (Ни H., Yang H. eds.), Springer-Verlag, 1986, p. 79-90.

196. Gupta S.L., Nanda К. Plant regeneration from seedlings leaf tissue of Zea mays L. Abstr.6 Intern. Congr. Plant Tissue Cell Culture, Minneapolis, 1986; p. 444;

197. Hall A.J., Lemcoff J.H., Trapani N. Water stress before and during: flowering in maize and its effects on yield, its components, and their determinants // Maydica, 1981, v. 26, p. 19-38.

198. Halushkova J., Cellarova E. RFLP-analysis of Hipericum perforatum L. somaclones and their progenies // Euphytica, 1997, v. 95, p. 229235;

199. Handa A.K., Bressan R.A., Handa S., Hasegawa P.M. Clonal variation for tolerance to ? polyethylene glycol-induced; water stress in cultured tomato cells // Plant Physiol., 1983, v. 72, p. 645-653;

200. Harms C.T., Lorz H., Potrykus I. Regeneration of plants from callus cultures of Zea mays L. H Z. Pflanzenzuecht., 1976, v. 77, p. 347-351.

201. Hartmann C., Henry Y., De Buyser J. et al. Identification of new mitochondrial genome organization in; wheat plants regenerated from somatic tissue cultures // Theor. Appl. Genet., 1989, v. 77, p. 169-175.

202. Hasegawa P.M., Bressan R.A., Handa A.K. Cellular mechanisms of salinity tolerance // Hort Sci;, 1986, v. 21, p. 1317-1319.

203. Hashim Z.N., Campbell W.F., Carman J.G. Morphological analyses of spring wheat (CIMMYT cv.PCYT-10) somaclones // Plant Cell Tissue Organ Cult., 1990, v. 20, p. 95-99.

204. Heinz D.J. Sugarcane improvement through induced mutations using vegetative prorogation and cell culture techniques. In: Induce Mutations in Vegetatively Propagated Plants, Int. Atomic Energy Agency, Vienna, 1973, p. 53-59.

205. Henke R.R., Mansur M.A., Constantino M.J. Organogenesis and plantlet formation from organ and seedling-derived calli of rice (Oryza sativa) // Phusiol. Plantarum, 1978; v. 44; p. 11-14.

206. Henry I., Vain P., De Beyser J. Genetic analysis of in vitro plant tissue culture responses and regeneration capacities // Euphytica, 1994, v. 79, p. 45-58.

207. Hernandez P., Martin A., Dorado G. Development of SCARs by direct sequencing of RAPD products: a practical; tool- for the introgression and marker-assisted selection of wheat // Mol. Breeding, 1999, v. 5, p. 245-253.

208. Hibberd K.A., Walter Т., Green C.E., Gengenbach B.G. Selection and characterization of a feedback-insensitive tissue culture of maize // Planta, 1980, v. 148, p. 183-187.

209. Hirochika H. Retrotransposons of rice their regulation and use forgenome analysis // Plant Mol; Biol., 1997, v. 35, p. 231-240.

210. Hodges Т.К., Kamo К.К., Becwar M.R., Schroll S. Regeneration of maize. In: Biotechnology in Plant Science (Zaitlin M; et al! eds.), New York, Acad.Press., 1985, p. 15-33.

211. Hodges Т.К., Kamo K.K., Becwar M.R., Schroll S. Regeneration of maize. In: Biotechnology in plant science: relevance to agriculture in the eighties (Zaitlin M;, Day P., Hollaender A. eds.), Acad. Press, New York, London, Orlando, 1985, p. 15-33.

212. Hodges Т.К., Kamo K.K., Imbrie G.W., Becwar M.R: Genotype specificity of somatic embryogenesis and regeneration in maize // Bio/technology, 1986, v. 4, p. 219-223:

213. Hossain Z., Kalam A., Mandal A., Shukla R., Datta S.K. NaCl stress -its chromotoxic effects and antioxidant behavior in roots of Chrysanthemum morifolium Ramat // Plant Sci., 2004, v. 166, p. 215220.

214. Huang В., Hatch E., Goldsbrough P.B. Selection and characterization of cadmium tolerant cells in tomato // Plant Sci., 1987, v.52, p. 211221.

215. Hughes D.W., Galau G.A. Developmental and environmental induction of Lea and Lea A mRNAs and postabscission program during embryo culture // The Plant Cell, 1991, v. 3, p. 605-618.

216. Ibarra-Caballero J., Villanueva-Verduzco C., Molina-Galan J., Sanchezde-Jimenez E. Proline accumulaton as a symptom of drought stress in maize: a tissue differentiations requirement // J. Exper. Bot., 1988, v. 39, p. 889-897.

217. Irisb E.E., Nelson T.M. Development of maize plants from cultured shoot apices // Planta, 1988, v. 175, p. 9-12.

218. Ivanov P., Atanassov Z., Milkova V., Nikolova L. Culture selected somaclonal variation in 5 Triticum aestivum L. genotypes // Euphytica, 1998, v. 104, p. 167-172.

219. Ivanova A, Velcheva M., Denchev P., Atanassov A., Van Onckelen H.A. Endogenous hormone levels during somatic embryogenesis in Medicago falcata II Physiol. Plantarum , 1994, v. 92, p. 85-89.

220. Jackson P.J., Roth E.J., McClure P.R., Naranjo C.M. Selection, isolaton and characterization of cadmium-resistant Datura innoxia suspension culture // Plant Physiol., 1984, v. 75; p. 914-918.

221. Jaffe L.F. Electrophoresis along cell membranes // Nature, 1977, v. 265, p. 600-602.

222. Jaffe L.F., Nuccitelli R. Electrical control of development // Ann; Rev. Biophys. Bioeng., 1977, v. 6, p. 445-476.

223. Jaffe L.F., Robinson K.R., Nuccitelli R. Local cation entry and self-electrophoresis as an intracellular localization mechanism // Ann.N.-Y. Acad. Sci., 1974, v. 238, p. 372-389.

224. James M.G., Stadler J. Molecular characterization of Mutator systems in maize embryogenic callus cultures indicates Mu element activity in vitro //Theor. Appl: Genet., 1989, v. 77, p. 383-393.

225. Jan V.V., Demacedo C.C., Kinet J.M., Bouharmont J. Selection of Al-resistant plants from a sensitive rice cultivar using somaclonal variation, in-vitro and hydroponic cultures // Euphytica, 1997, v. 97, p. 303-310.

226. Janowiak F., Dorffling K. Effect of cool soil conditions on abscisic acid and cytokinin contents in maize seedlings // Acta Physiol. Plantarum, 1999, v. 21, p. 13.

227. Kaeppler S.M., Kaeppler H.F., Rhee Y. Epigenetic aspects of somaclonal variation in plants // Plant Mol. Biol., 2000, v. 43, p. 178188.

228. Kaeppler S.M., Phillips R.L. Tissue culture-induced DNA methylation variaton in maize // Proc. Natl. Acad. Sci: USA; 1993, v. 90, p. 87738776.

229. Kamo K.K., Becwar M.R., Hodges Т.К. Regeneration of Zea mays L. from embryogenic callus // Bot. Gaz., 1985, v. 146, p. 327-334.

230. Kang K.K., Kameya T. Selection and characterization of a 5-methyl-tryptophan resistant mutant in Zea mays L. // Euphytica, 1993, v. 69, p. 95-102.

231. Karp A. On the current understanding: of somaclonal variation // Oxford Surveys of Plant Mol. and Cell Biol., 1991, v. 7, p. 1-58.

232. Karp A. Somaclonal! variation as a tool for crop improvement // Euphytica, 1995, v. 85, p. 295-302.

233. Karp A., Bright S.W.J. On the causes and origins of somaclonal variation // Oxford Surv. Plant Mol. Cell. Biol., 1985, v. 2, p. 199-234.

234. Karp A., Maddock S.E. Chromosome variation in wheat plants regenerated! from cultured immature embryos // Theor. Appl: Genet., 1984, v. 67, p. 249-255:

235. Karp A., Steele S.H., Parmar S., Jones M.G.K., Shewry PR., Breiman A. Relative stability among barley plants regenerated from cultured immature embryos // Genome, 1987, v. 29, p. 405-412.

236. Karp A., Wu Q.S., Steel H.S., Jones M.G.K. Chromosome variation in dividing protoplasts and cell suspension of wheat // Theor. Appl.

237. Genet.,. 1987, v. 74, p. 140-146.

238. Karunaratne S., Santha S., Kovoor A. An in vitro assay for drought-tolerant coconut germplasm // Euphytica, 1991, v. 53, p. 25-30.

239. Kawahara R., Komamine A. Molecular basis of somatic embryogenesis. In Biotechnology in Agriculture and Forestry. V.30 Somatic Embryogenesis and Synthetic Seeds (Y.P.S. Bajaj ed.). Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 1995; p. 30-40.

240. Kiesselbach T.A. The: structura and reproduction of corn. Lincoln, Univ. of Nebraska Press USA, 1980,1 p.45-56.278: Kikushi K., Terauchi K., Wada M., Hirano H.-Y. The plant MITE mPing is mobilized;in anther culture // Nature, 2003, v. 421, p. 167170.

241. Kinane J.T., Jones P.W. Isolation of wheat mutants with increased resistance to powdery mildew from small induced variant populations //Euphytica, 2001, v. 117, p. 251-260.

242. Kishinami I., Widholm J.M. Selection of copper and zinc resistant Nicotiana plumbaginifolia cell suspension cultures // Plant Cell Physiol., 1986, v. 26, p. 1263-1268.

243. Kishor R., Kavi R.B., Reddy G.M. Regeneration of plants from long-term cultures of Oryza sativa L. H Plant Cell Rep., 1986, v. 5, p. 391393.

244. Kita N., Toyoda H., Shimizu K., Ouchi S. Selection of high quality strains of tomato from callus-derived regenerants and their self-polinated progenies // Plant Tissue Cult. Lett., 1987, v. 4, p. 71-74.

245. Klee H., Estelle M. Molecular genetic approaches to plant hormone biology 11 Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 1991, v. 42, p. 529-551.

246. Koinuma K., Mochizuki N., Inoue Y. Embryoid and callus induction and plant regeneration by anther culture of Japanese local varienties of maize (Zea mays L.) II Bull. Nat. Grassland Res. Inst., 1990; № 43; p. 13-22.

247. Komamine A., Nomura K. Molecular mechanisms of somatic embryogenesis // GMICN, 1985, v. 1, p. 56-57.

248. Kott L.S., Flach S., Kasha K.J. A comparative study of initiation and development of embryonic callus from haploid embryos of several barley cultivars. II. Cytophotometry of embryos and callus // Can/ J/ Bot., 1986, v. 64; p. 2107-2112.

249. Koyro H.-W., Stelzer R. Ion concentration in the cytoplasm and vacuoles of rhisodermis cells from NaCl treated Sorghum, Spartina and Puccinellia plants // J. Plant Physiol., 1988, v. 133, p. 441-443.

250. Krishnamurthi M., Tlaskal J. Fiji disease resistant Saccharum officinarum var.Pindar subclones from tissue cultures // Proc. Int.Soc.Sugar Cane Technol., 1974, v. 15, p. 130-137.

251. Kuehnle A.R., Earle E.D. In vitro selection for methomyl resistance in cms- T maize // Theor. Appl. Genet., 1989, v. 78, p. 672-682.

252. Kumar V., Sharma D.R. Isolation and characterization of sodium chloride resistant callus culture of Vigna radiata (L.) Wilczek var. radiata II J. Exper. Bot., 1989, v. 40, p; 143-147.

253. Kumar V., Sharma D.R. Selection and characterization of an L-thiazolidine-4-carboxylic acid resistant callus culture of Vigna radiata (L.) Wilczek var. radiata И Plant Cell Rep., 1989, v. 7, p. 648-651.

254. Kwok S., Kellog D.E., McKinney N., Spasic D., Goda L., Levenson C., Sninsky J.J; Effects of primer-template mismatches on the polimerase chain reaction: Human immunodeficiency virus type 1 model studies.// Nucl; Acids Res., 1990, v.18; p. 999-1005.

255. La Rue C.D. Growth and regeneration of the endosperm of maize in culture // Amer. J. Botany, 1949, v. 34, p. 585-586.

256. Landi P., Tuberosa R., Lucchese C., Frascaroli E. Direct and: correlated responses to recurrent selection for regeneration capacity in maize callus cultures. Abstr. VIII Int. Congr. Plant Tissue and Cell Culture, Florence, Italy, 1994, p. 19.

257. Landsmann J., Uhrig H. Somaclonal variation in Solanum tuberosum detected at the molecular level // Theor. Appl; Genet., 1985, v. 71, p. 500-505.

258. Lapitan N.L.V., Sears R.G., Gill B.S. Amplification of repeated DNA sequences in wheat x rye hybrids regenerated from tissue culture // Theor. Appl. Genet., 1988, v. 75, p. 381-388.

259. Larkin PJ., Ryan S.A., Brettell RT.S., Scowcroft W.R. Heritable somaclonal variation in wheat // Theor. Appl. Genet., 1984, v. 67, p. 443-455.

260. Larkin P.J., Scowcroft W.R. Somaclonal; variation a novel source of variability from cell cultures for plant improvement // Theor. Appl. Genet., 1981, v. 60, p. 197-214.

261. Larque-Saavedra A., Wain R.Z. Abscisic acid levels in relation to drought tolerance in varieties of Zea mays L. I I Nature, 1974, v. 251, p. 716-717.

262. Leal M.R., Maribona R.H., Ruiz A., Korneva SM Canales E., Dinkova T.D., Izquierdo F., Coto O., Rizo D. Somaclonal variation as a source of resistance to eyespot disease of sugarcane // Plant Breed., 1996, v. 115, p. 37-42.

263. Lebreton C., Lazic-Jancic V., Steed A., Pekis S., Quarrie S.A. Identification of QTL for drought responses in maize and their use in testing causal relationships between traits // J. Exper. Bot., 1995, v. 46, p. 853-865.

264. Lee M., Phillips R.L. Genetic variants in progeny of regenerated maize plants // Genome, 1987, v. 29, p. 834-838.

265. Lee M., Phillips R.L. The chromosomal basis of somaclonal variation // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 1988, v.39, p. 413-437.

266. Lee S.H., Shon Y.G., Kim C.Y., Chun H.J., Cheong Y.H., Kim Z.H.,

267. Lee T.M., Lur H.S., Chu C. Role of abscisic acid in chilling tolerance of rice (Oryza sativa L.) seedlings. I Endogenous abscisic acid levels // Plant Cell Environment, 1993, v. 16, p. 481-490.

268. Levenko B.A., Pasternak E.Yu., Sidorova; N.V. Selection for resistance to water and salt stress in wheat. Abstr. VII Intern. Congr. Plant Tissue and Cell Culture, Amsterdam, 1990, p.37.

269. Lewis J., Bird A. DNA methylation and chromatin structure // FEBS Letters, 1991, v. 285, p. 155-159.

270. Lima-De-Faria A. DNA replication and gene: amplification in: heterochromatin. In: Handbook of Molec.Cytol. (Lima-de-Faria A. ed.), Amsterdam/London: North Holland, 1969, p. 234-282.

271. Ling D., Chen W., Chen M., Ma Z. Chromosome variation in plants regenerated 5 from cultured somatic cells of rice indica // Acta Genet. Sin., 1987, v. 14, p. 247-254.

272. Liu C.-M., Hu Z.-H., Chua N.-H. Auxin polar transport is essential for the establishment of bilateral symmetry during early plant embryogenesis // The Plant Cell, 1993, v. 5, p. 621-630.

273. Lo Schiavo F., Pitto L., Giuliano G., Torti G., Nuta-Ronchi V.,

274. Marazziti D., Vergara R., Orselli S., Terzi M. DNA methylation ofembryogenic carrot cell- cultures and its variation as caused: bymutation, differentiation, hormones and hypomethylating drugs I I Theor. Appl. Genet., 1989, v. 77, p. 325-331.

275. Lo Shiavo F. Early events in embryogenesis. In: Biotechnology in Agriculture and Forestry, v. 30 Somatic Embryogenesis and Synthetic Seeds (Bajaj Y.P.S. ed.), Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 1995, p. 20-29.

276. Locy R.D., Chang Ch.-Ch., Nielsen B.L., Singh N.K. Photosynthesis in salt-adapted heterotrophic tobacco cells and regenerated plants // Plant Physiol., 1996, v. 110, p. 312-328.

277. Lowe K., Barnes T.D., Ryan P., Paterson K.E. Plant regeneration via organogenesis and embryogenesis in the maize inbred line B73 // Plant Sci., 1985, v. 41, p. 125-132.

278. Lu C., Vasil I.K., Ozias-Akins P. Somatic embryogenesis in Zea mays //Theor. Appl. Genet., 1982, v. 62, p. 109-112.

279. Lu C., Vasil V., Vasil I.K. Improved efficiency of somatic embryogenesis and plant regeneration in tissue culture of maize (Zea mays) II Theor. Appl. Genet., 1983, v. 66, p. 285-289.

280. Lupotto E. In vitro culture of isolated somatic embryos of maize {Zea mays L.)//Maydica, 1986, v. 31, p. 193-201.

281. Lupotto E., Locatelli F., Lusardi M.C. In vitro selection for salt tolerance in maize. In Biotechnology in Agriculture and Forestry, v. 25 Maize (Bajaj Y.P.S. ed.), Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 1994, p. 314-330.

282. Ma Hi, Gu M., Liang G.H. Plant regeneration from cultured immature embryos of Sorghum bicolor (L.) Moench. //Theor. Appl. Genet., 1987, v. 73, p. 389-394.

283. Mandal A.B., Pramanic S.C., Chowdhury В., Bandyopadhyay А.К. Salt tolerant Pokkali somaclones performance under normal and saline soils in Bay Islands // Field Crops Research, 1999, v. 61, p. 1321.

284. Maralappanavar M.S., Kuruvinashetti M.S., Harti C.C. Regeneration, establishment and evaluation of somaclones in Sorghum bicolor (L.) Moench; II Euphytica, 2000, v. 115, p. 173-180.

285. Mascarenhas A.F., Sayagaver B.M., Jagannathan V. Studies on the growth of callus culture: of Zea mays L. In: Tissue Culture (Ramakrishna С/V/ ed.). Junk, The Hague, 1965, p. 283-291.

286. Matzke M.A., Matzke A.J.M. Differential inactivation and methylation of transgene in plants by two suppressor loci containing homologous sequences // Plant Mol. BioL, 1991, v. 16, p. 821-830.

287. McCaig T.N., Romagosa I. Water status measurements of excised wheat leaves: position and age effects // Crop Sci., 1991, v. 31, p. 1583-1588.

288. McCain J.W., Hodges Т.К. Anatomy of somatic embryos from maize embryo cultures // Bot. Gaz., 1986, v. 147, p. 453-460.

289. McCain J. W., Kamo K.K., Hodges Т.К. Characterization of somatic; embryo development and plant regeneration from friable maize callus cultures // Bot. Gaz., 1988, v. 149, p. 16-20.

290. McCoy T.J. Characterization of alfalfa (Medicago sativa L.) plants regenerated from selected NaCl tolerant cell; lines // Plant Cell Rep., 1987, v. 6, p.417-422.

291. McCoy T.J., Phillips R.L., Rines H. W. Cytogenetic analysis of plants regenerated^from oat {Avena sativa) tissue cultures; high frequency of partial chromosome loss I I Can. J. Genet. Cytol., 1982, v. 24, p. 37-50.

292. Messenguer R., Ganal M.W., Steffens J.C., Tanksley S.D. Characterization of the level; target sites and; inheritance of cytosine methylation in tomato nuclear DNA// Plant Mol. Biol., 1991; v. 16, p. 753-770;

293. Miao S., Duncan D.R., Widholm J. Selection of regenerable maize callus cultures resistant to 5-methyl-DL-tryptophan, S-2-aminoethyl-L-cysteine and high levels of L-lysine plus L-threonine // Plant Cell: Tissue Organ Culture, 1988, v. 14, p. 3-14.

294. Miller S.A., Williams G.R., Medina-Filho H.P., Evans D.A. A somaclonal variant of tomato resistant to race 2 of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici II Phytopathol., 1985, v.75, p. 1354.

295. Mishiba K.-I., Okamoto Т., Mii M. Increased ploidy level in cell suspension cultures of Doritaenopsis by exogenous application of 2,4364dichlorophenoxyacetic acid // Physiol. Plantarum, 2001, v. 112, p. 142-148.

296. Mohmand A.S., Nabors M.W. Somaclonal variant plants of wheat derived from mature embryo explants of three genotypes // Plant Cell Rep., 1990, v. 8, p. 558-560;

297. Molnar S.JJ, Gordon P.N;, Rice T.B. Initiation of totipotent corn tissue cultures from undeveloped axillary and» secondary ears // Can. J. Genet. Cytol., 1980, v. 22, p. 671672.

298. Morocz S., Donn G., Nemeth J., Dudits D. An improved system to obtain fertile regenerants via maize protoplasts isolated from a highly embryogenic suspension culture // Theor. AppL Genet., 1990, v.80, p. 721-726.

299. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plantarum, 1962, v.15, p. 473-497.

300. Murata M. Effect of auxin and cytokinin on induction of sister chromatid exchanges in cultured cells of wheat {Triticum aestivum L.) II Theor. Appl: Genet., 1989, v. 78, p. 521-524.

301. Murata M., Orton T.J, Chromosome structural changes in cultured celery cells // In Vitro, 1983, v. 19, p. 83-89.

302. Nabors M.W., Daniels A., Nadolny L., Brown C. Sodium chloride tolerant lines of tobacco cells // Plant Sci.Lett., 1975, v.4, p. 155-159.

303. Nagarajan P., Walton P.D. Evaluation of R| alfalfa somaclones for herbage yield and morphological characteristics I I Plant Breed., 1989, v. 102, p. 333-337.

304. Narasimhulu S.B., Chopra V.L., Prakash S. The influence of cytoplasmic differences on shoot morphogenesis in Brassica carinata A.Br. // Euphytica, 1989, v. 40, p. 241-243.

305. Nishibayashi S., Hayashi Y., Kyozuka J., Shimamoto K. Chromosome variations in protoplast-derived calli and in plants regenerated from calli of cultivated rice //Jap. J. Genet., 1989, v. 64, p. 355-361.

306. Novak F.J. The changes of caryotypes in callus cultures of Allium sativa L. // Caryology, 1974, v. 27, p. 45-54.

307. Novak F.J:,. Doleselova M., Nesticky M., Piovarci A. Somatic embryogenesis and plant regeneration in Zea mays L. // Maydica, 1983, v. 28, p. 381-390.

308. Novak F.J., Hermelin Т., Daskalov S., Nesticky M. In vitro mutagenesis in vaize. In: Genetic Manipulation in Plant Breeding (Horn W., Jensen C.J., Odenbach W., Schieder O. eds.), DeGruyter, Berlin, New York, 1986, p.563-576.

309. Novak F.J., Opatrny Z., Rovenska В., Nesticky M. Studies on the morphogenetic response of maize tissue cultures of different origin // Biol. Plantarum, 1979, v.21, p. 418-426.

310. Oono K. Putative homozygous mutations in regenerated plants of rice // Мок Gen. Genet., 1985, v. 198, p. 377-384.355; Orton T.J. Chromosomal variability in tissue culture and regenerated plants inHordeum//Theor. Appl; Genet., 1980, v. 56, p. 101-112.

311. Orton T.J. Comparision of salt tolerance between Hordeum vulgare and H. jubatum in whole plants and callus; cultures // Z. Pflanzenphysiol., 1980; v.98, p. 105-118.

312. Ostry M.E., Ward? K.T. Field; performance of Populus expressing somaclonal variation; in resistance to Septoria musiva II Plant Sci., 2003, v. 164, p. 1-8.

313. Palit R., Reddy G.M. Selection of callus resistant to Pyricularia oryzae and regeneration of plants in rice (Oryza sativa L.) // Indian J. Exp. Biol., 1990, v. 28, p. 928-931.

314. Palmer J.D., Shields C.R. Tripartite structure of the Brassica campestris mitochondrial genome //Nature, 1984, v. 307, p. 437-440.

315. Paran I., Michelmore R.W. Development of reliable PCR-based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce. Theor. Appl. Genet., 1993, v. 85, p. 985-993.

316. Pareddy D.R., Petolino J.F. Somatic embryogenesis and plant regeneration from immature inflorescences of several elite inbreds of maize // Plant Sci., 1990, v. 67, p. 211-219.

317. Parker W.B., Somers D.A., Wyse D.L., Keith; R.A., Burton J.D., Gronwald J.W., Gengenbach B.G. Selection and; characterization of sethoxydim-tolerant maize tissue cultures // Plant: Physiol., 1990, v. 92, p. 1220-1225.

318. Parrot W.A., Вouton J.H. Aluminum toIerance in alfalfa as expressed: in tissue culture // Crop Sci., 1990, v.30, p. 387-389!

319. Peschke V.M., Phillips: R.L., Gengenbach; B.G. Discovery of transposable element activity among progeny of tissue culture-derived maize plants // Science, 1987, v. 238, p. 804-807.

320. Phillips R;L., Peschke V.M. Discovery of Ac activity among progeny of tissue culture-derived maize plants. In: Proc. Int. Symp. Plant Transposable Elem., Madison, Wise., New York, London, 1988, p. 305-315.

321. Phillips R.L., Somers D.A., Hiberd K.A. Cell/tissue culture and invitro manipulation. In: Corn and Corn Improvement Agronomy

322. Monograph 18; (Sprague G.F., Duddley J.W. eds) Am. Soc. Of Agronomy, Madison, WI, 1988, p. 345-387.

323. Pickering R.A. Plant regeneration and variants from calli derived from immature embryos of diploid barley {Hordeum vulgare L.) and H. vulgare L. x H. bulbosum L. crosses // Theor. Appl; Genet., 1989, v. 78, p. 105-112.

324. PlanckaertF., Walbot V. Molecular and genetic characterization ofMu transposable elements in Zea mays: behavior in callus culture and regenerated plants // Genetics, 1989, v. 123, p. 567-578.

325. Pluhar S.A., Erickson L., Pauls K.P. Effects of tissue culture on a highly repetitive DNA sequence (E180 satellite) in Medicago sativa II Plant Cell Tissue Organ Cult., 2001, v. 67, p. 195-199.

326. Powell W., Caligari P.D.S. The in vitro genetics of barley {Hordeum vulgare L.); detection and analysis of reciprocal differences for cultureresponse to 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 11 Heredity, 1987, v. 59, p. 293-299.

327. Pua E.-C., Thorpe Т.А. Differential Na2S04 tolerance in tobacco plants regenerated? from Na2S04-grown; callus // Plant Cell; Environ., 1986, v. 9, p. 9-16.

328. Quatrano R.S. Development of cell polarity // Ann. Rev. Plant Physiol., 1978, v. 29, p. 487-510.

329. Rahman M.M., Kaul K. Differentiation of sodium chloride tolerant cell lines of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.): cv. Jet Star // J. Plant Physiol., 1989, v. 133, p.710-712.

330. Raman K., Walden D.B., Greyson R.I. Propagation of Zea mays L. by shoot tip culture: a feasibility study // Ann. Bot., 1980, v. 45, p. 183189.

331. Rapela M.A. Organogenesis and somatic embryogenesis in tissue culture of Argentine maize (Zea mays Al.) 11 J.Plant Physiol., 1985, v. 121; p. 119-122.

332. Rathor K.S., Hodges Т.К., Robinson K.P. A refined technique to apply electric currents to callus cultures // Plant Physiol., 1988, v. 88; p. 515517.

333. Rathore K.S., Goldsworthy A. Electrical control of shoot regeneration in plant tissue culture // Bio/technology, 1985, v. 3, p. 1107-1109.

334. Rhoades M.M., Dempsey E. On the mechanism of chromatin loss induced by the В chromosome of maize // Genetics, 1971, v. 71, p. 7396.

335. Rice T.B. Tissue culture induced genetic variation in regenerated maize inbreds. In: Proc. 37th Annu. Corn and Sorghum Res. Conf., Chicago, 1982, p. 148-162:

336. Ristic Z., Cass D.D. Dehydration avoidance and damage to the plasma and thylakoid membranes in lines of maize differing in endogenous levels of abscisic acid//J. Plant Physiol., 1993, v. 142, p. 759-764.

337. Rowland. G.G., McHughen A., Gusta L.V., Bhatty R.S., MacKenzie S.L., Taylor D.C. The application of chemical mutagenesis and biotechnology to the modification of linseed (Linum usitatissimum L.) // Euphytica, 1995, v.85, p. 317-321.

338. Ryan S.A., Scowcroft W.R. A somaclonal variant of wheat with additional 13-amilase isozymes // Theor. Appl. Genet., 1987, v. 73, p. 459-464.

339. Sachs M.M., Tuan-Hua, Ho D. Alteration of gene expression during environmental stress in plants // Annu. Rev. Plant Physiol;, 1986, v. 37, p. 363-376.

340. Sacristan M.D. Karyotypic changes in callus culture from haploid and diploid plants of Crepis capillaries L. // Chromosoma, 1971, v. 33, p. 273-283.

341. Sacristan M.D., Wendt-Gallitelli M.F. Transformation to auxin-autotrophy and its reversibility in a mutant line of Crepis capillaris callus culture // Mol. Gen. Genet., 1971, v. 110, p. 355-360.

342. Saitou N, Nei M. The neibor-joining method: a new method; for reconstructing phylogenetic trees // Mol. Biol. Evol., 1987 v. 4, p. 406-425;

343. Saleh N.M., Gupta H.S., Finch R.P. Stability of mitochondrial DNA in tissue-cultured cells of rice//Theor. AppK Genet., 1990, v. 79, p. 342346.

344. Salvi N.D., George L., Eapen S. Plant regeneration from leaf base callus of turmeric and random amplified polymorphic DNA analysis of regenerated plants // Plant Gell Tissue Organ Cult., 2001, v. 66, p. 113119.

345. Saneoka H., Nagasaka C., Hahn D.T., Yang W.-J., Premachandra G.S., Joly R.J., Rhodes D. Salt tolerance of glycine-betaine-deficient and containing maize lines // Plant Physiol., 1995, v. 107, p. 631-638.

346. Sasaki K., Schimomura K., Kamada H., Harada H. IAA metabolism in embryogenic and non-embryogenic carrot cells // Plant and Gell Physiol., 1994, v. 35, p. 1159-1165.

347. Schmidt M., Walz C., Hesemann C.U. Somaclonal variation of the mitochondrial ATPase subunit-6 gene region in regenerated triticale shoots and full-grown plants // Theor. Appl. Genet., 1996, v. 93, p. 355-360.

348. Scowcroft W.R., Larkin P.J., Brettel R.I.S. Genetic variation! from tissue culture. In: Use of Tissue Culture and Protoplasts in Plant Pathology, Acad. Press, Australia, 1983, p. 121-133.

349. Sebestiani L., Lenzi A., Pugliesi C., Fambrino M. Somaclonal variation for resistance to Verticillum danliae in potato (Solanum tuberosum L.) plants regenerated from callus // Euphytica, 1994, v. 80, p. 513-515.

350. Semal J., Lepoivre P. Application of tissue culture variability to crop improvement. In Plant Tissue Culture: Applications and Limitations. (Bhojwani S.S. ed.), 1990, Amsterdam et al., p; 301-315.

351. Shepard J.F., Bidney D., Shalin E. potato Protoplasts in crop improvement//Science, 1980; v. 208; p. 17-24.

352. Sheridan W.E., Clark J.K. Maize embryogeny: a promising experimental system//Trends Genet., 1987, v. 3, p. 3-6.

353. Shi Y., Liu J. Establishment of somatic embryoid-clone and plant regeneration of forage maize // GMICN, 1986, v. 2, p. 8-12.

354. Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. Molecular responses to drought stress. Abstr. Intern. Workshop "Molecular Biology of Drought Tolerance in Crop Plants", Varna, Bulgaria, 1998, p. 5-6.

355. Shirzadegan M., Christey M., Earl E.D. et al. Rearrangement, amplification and assortment of mitochondrial DNA molecules in cultured cells of Brassica campestris U Theor. Appl. Genet., 1989, v. 77, p: 17-25.

356. Smith M.K., McComb J.A. Selection for NaCl-tolerance ins cell? cultures of Medicago sativa and recovery of plants from a NaCl-tolerant cell line // Plant Cell Rep., 1983, v. 2, p. 126-128.

357. Smith R.H., Bhashkaran S., Miller F.R. Screening for drought tolerance in sorghum using cell culture // In Vitro Cell and Dev. Biol., 1985, v. 21, p.541-543.

358. Smulders M.J.M., Rus-Kortekaas W., Vosman B. Tissue culture-induces DNA methylation? polymorphisms in repetitive DNA of tomato calli and regenerated plants // Theor. Appl. Genet., 1995, v. 91, p. 1257-1264.

359. Somers D.A., Anderson P.C. In vitro selection for herbicide tolerance in maize. In Biotechnology in Agriculture and Forestry, v. 25 Maize (Bajaj Y.P.S. ed.), Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 1994, p. 293313.

360. Songstad D.D., Duncan D.R., Widholm J.M. Effect of 1-aminocyclopropane-l-carboxylic acid, silver nitrate and norbornadiene on plant regeneration from maize callus cultures // Plant Cell Rep., 1988, v. 7, p. 262-265.

361. Songstad D.D., Duncan D.R., Widholm J.M; Proline and polyamine involvement in chilling tolerance of maize suspension cultures // J. Exper. Bot., 1990, v.41, p.289-294.

362. Songstad D.D., Petersen W.G., Armstrong C.G. Establishment of friable embryogenic (type II) callus from immature tassels of Zea mays (Poacea) // Amer. J. Bot., 1992, v. 79, p. 761-764.

363. Sorenson J.C. The structure and expression of nuclear genes in higher plants // Adv. Genet., 1984, v. 22, p. 109-144.

364. Springer W.D., Green C.E., Kohn K.A. A histological examination of tissue culture initiation from immature embryos of maize // Protoplasma, 1979, v. 101, p. 269-281.

365. Srivastava D.K., Gupta V.K., Sharma D.R. Regeneration in water stress tolerant callus cultures of tomato (Lycopersicon esculentum L. cv. Solan Gold). Abstr. VIII Intern. Congr. "Plant Tissue and Cell Culture", Florence, Italy, 1994, p. 124.

366. Sun Z.X., Zhao C.Z., Zheng K.L., Qi X.F., Fu Y.P. Somaclonal genetics of rice Oryza sativa L. // Theor. Appl. Genet., 1983, v. 67, p. 67-73.

367. Sung Z.R., Smith I., Signer E.R. Quantitative mutagenesis in soybean suspension culture. In: Genetic Manipulation with Plant Material, 1975, p. 53-58.

368. Suprasanna P., Kao K.V., Reddy G.M. Plantlet regeneration from glume calli of maize (Zea mays L.) 11 Theor. Appl. Genet., 1986, v. 72, p. 120-122.

369. Swanson E.B., Herrgesell M.J., Arnoldo M;, Sippell D.W., Wong R.S.C. Microspore mutagenesis and selection: Canola plants with field tolerance to imidazolinones // Theor. Appl. Genet., 1989, v. 78, p. 525530.

370. Swedlund Bi, Vasil Т.К. Cytogenetic characterization of embryogenic callus and regenerated plants of Pennisetum americanum (L.) K. Schun. // Theor. Appl; Genet., 1985, v. 69, p. 575-581.

371. Tantau H., Dorffling К. In vitro-selection of hydrozyproline-resistant cell: lines, of wheat (Triticum aestivum): accumulation: of proline, decrease in osmotic potential, and increase in frost tolerance // Physiol.Plant., 1991, v. 82, p. 243-248.

372. Taylor C.B. knox-on effects on leaf development // The Plant ^ Cell,1997, v. 9, p. 2101-2105.

373. Taylor P.W.J., Fraser T.A., Ко H.-L., Henry R.J. RAPD analysis of sugarcane during tissue culture. In: Current Issue in Plant Molec. and Cell Biol (Terzi M., Cella R., Falavigna A. eds.), Kluwer Acad. Publ.,

374. Dirdrecht et al., 1995, p. 241-246.

375. Teichmann Т., Guan C., Kristoffersen P., Muster G., Tietz O., Palme K. Cloning and biochemical characterization of an anionic peroxidasefrom Zea Mays // Eur. J. Biochem., 1997, v. 247, p. 826-832.

376. Thamitong P., Furusawa I., Yamamoto M. Resistant tobacco plants from protoplast-derived calluses selected for their resistance to Pseudomonas and Alternaria toxins // Theor. Appli Genet., 1983, v. 66, p. 209-215.

377. Thompson A.J., Gunn RJE., Jellis G.I., Boulton RJE., Lacey С .NT). The evaluation of potato somaclones. In: "Somaclonal Variations and Crop Improvement" (Semal J. ed.), Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht et al., 1986, p. 236-243.

378. Todd J., Cooke R., Racusen H., Cohen J.D. The role of auxin in plant embryu&eiiesis H The Plant Cell; 1993, v. 5, p. 1494-1495.

379. Todorovska H., Trifonova A., Petrova M. et al. Agronomic performance and molecular assessment of tissue culture-derived barley lines // Plant Breed;, 1997, v. 116, p. 511-517.

380. Tomes D.T., Smith O.S. The effect of parental genotype on initiation of embryogenie callus from elite maize {Zea mays L.) germplasm // Theor. Appl. Genet., 1985, v. 70, p. 505-509;

381. Tome J.M., Santos M.A., Pons A., Blanco M. Regeneration of plants from mesocotyl tissue cultures of immature embryos of Zea mays L. // Plant Sci., 1980, v. 17, p. 339-344.

382. Tuberosa R., Lucchese C. Long-term totipotent callus cultures in the maize inbred B79 // Agr. Med., 1989, v. 119, p. 412-416.

383. Tuberosa R., Sanguineti M.C., Landi P., Salvi S., Maccaferri M.,

384. Umbeck P.F., Gengenbach B.G. Reversion of male-sterile T-cytoplasm maize to male fertility in tissue culture // Crop Science, 1983, v.23, p.584-588.

385. Vain P., Flament P., Soudain P. Role of ethylene in embryogenic callus initiation and regeneration in Zea L. // J. Plant Physiol., 1990, v. 135, p. 537-540.

386. Vain P., Yean H., Flament P. Enhancement of production and regeneration of embryogenic type II callus m Zea mays L. by AgNC>3 // Plant Cell Tissue Organ Cult., 1989, v. 18, p. 143-151.

387. Van der Bulk R.W. Application of cell and tissue culture and in vitro selection for disease resistance breeding a review // Euphytica, 1991, v. 56, p. 269-285.1. T>

388. Vasil V., Chin Yu.L., Vasil Т.К. Histology of somatic embryogenesis in cultured immature embryos of maize (Zea mays L.) // Protoplasma, 1985, v. 127, p. 1-8.

389. Vasil V., Vasil I.K., Lu C. Somatic embryogenesis in long-term calluscultures of Zea mays L. (Gramineae) // Amer. J. Bot., 1984, v. 71, p. 158-161.

390. Vyskot В;, Gardova В., Siroky J. Methylation pattern of two repetitive DNA sequences in tobacco tissue culture and their regenerants // Biol. Plantarum, 1993, v. 35, p. 321-327.

391. Wang W.C., Marshall D; Genomic rearrangement in long-term shoot competent cell cultures, of hexaploid wheat // In Vitro Cell. Devel. Biol. Plant, 1996, v. 32, p. 18-25.

392. Wang X., Wang Q., Song M., Zheng E. Effect stimulation with weak electric currents on in vitro culture of cabbage // Acta Bot. Sinica, 1993, v. 35, Suppl., p. 66-70.

393. Watmough S.A., Dickinson N.M. Multiple metal resistance and Co-resistance in Acer pseudoplatanus L. (Sycamore) callus cultures I I Ann. Botany, 1995, v. 76, p. 465-473.

394. Weigel R., Wolf M., Hesemann C.U. Mitochondrial DNA variation in plants regenerated from embryogenic callus cultures of cms triticale // Theor. Appl. Genet., 1995, v. 91, p. 1237-1241.

395. Weisenseel M.H., Dorn A., JafFe L.F. Natural H+ currents traverse growing roots and root hairs of barley (Hordeum vulgare L.) // Plant Physiol., 1979, v. 64, p. 512-518.

396. Wersuhn G. Obtaining mutants from cell cultures I I Plant Breed., 1989, v. 102, p. 1-9.

397. West M.A.L., Harada J.J. Embryogenesis in the higher plants: an overview//The Plant Cell, 1993, v. 5, p. 1361-1369.

398. Widholm J.M. Cultured; carrot cell mutants: 5-methyltryptophan-resistance trait carried from cell; to plant and- back // Plant Sci. Lett., 1974, v. 3, p. 323-330;

399. Widholm J.M. Selection and characterization of Daucus carota L. cell line resistant to four amino acid analogues// Ji Exper. Bot., 1978, v. 29, p. 1111-1116.

400. Wilkinson T.C., Thompson S.A. Genotype, medium; and genotypexmedium effects on the establishment of regenerable maize callus // Maydica, 1987, v. 32, p. 89-105.

401. Willman M.R., Schroll S.M., Hodges Т.К. Inheritance of somatic embryogenesis and plantlet regeneration from primary (type I) callus in maize // In vitro Cell and Dev. Biol., 1989, v. 25, p. 95-100.

402. Winicov I. Characterization of salt tolerant alfalfa (Medicago sativa L.) plants regenerated from salt tolerant cell lines // Plant Cell Rep., 1991, v. 10, p. 561-564.

403. Woodward B.R., Furze M.J., Cresswell C.F. Callus initiation and somatic embryogenesis in root cultures of the maize inbred line 21A-6 // S. Afr. J. Bot., 1990, v. 56, p. 695-699.

404. Wright J., Reilley A., Labriola J., Kut S., Orton T. Petaloid male-sterile plants from carrot cell cultures // Hortscience, 1996, v. 31, p. 421-425.

405. Wright T.R., Penner D. Cell selection and inheritance of imidazolinone resistance in sugarbeet {Beta vulgaris) II Theor. Appl. Genet., 1998, v. 96, p. 612-620.

406. Xie: Q.J., Rush M.C., Linscombe S.D. Inheritance of homozygous somaclonal variation in rice // Crop Sci., 1996, v. 36, p. 1491-1495.

407. Yang H., Tabei Y., Kamada H;, Kayano Т., Takaiwa F. Detection of somaclonal variation in cultured rice cells using digoxigenin-based random amplified ро1утофЫс DNA // Plant Cell Rep., 1999, v. 18, p. 520-526.

408. Yang H., Tabei Y., Kamada H., Kayrano Т., Takaiwa F. Detection of somaclonal variation in cultured rice cells using digoxigenin-based random amplified polymorphic DNA // Plant Cell Rep.,1999, v. 18, p. 520-526.

409. Ye J.M;, Kao K.N., Harvey B.L., Rossnagel B.G. Screening salt-tolerant barley genotypes via F(-anther culture in salt stress media // Theor. Appl. Genet., 1987, v. 74, p. 426-429.

410. Yeo A. Molecular biology of salt tolerance in the context of whole-plant physiology// J. Exper. Bot., 1998, v. 49, p. 915-929.

411. Yeoman M.M. The mitotic cycle in higher plants. In: The Gell Cycle (Japess P.C.L. ed.), Cambridge: Cambridge Univ. Press, 1981, p. 161184.

412. Zabrodina M.V., Karyagina A.S., Khavkin E.E., Shilov I.A. A188 inbred and its somaclones do not differ in lengths of amplified fragments of the anionic peroxidase gene ZmAP 1 // Maize Genet. Coop. Newslett., 1999, № 73, p. 69-70.

413. Zaghmout O.M.-F., Oliver M.J. Differential modulation; of root formation in wheat embryogenic callus culture; by indoleacetic acid-degrading compounds //J. Exper. Bot., 1995, v.46, p. 155-159.

414. Zagorska N.A., Shamina Z.B., Butenko R.G. The relationship of morphogenetic potency of tobacco tissue culture and its cytogenetic features // Biol. Plantarum, 1974, v. 16, p. 262-274.

415. Zehr B.E., Williams M.E., Duncan D.R., Widholm J.M. Somaclonal variation in the progeny of plants regenerated from callus cultures of seven inbred lines of maize // Can.J.Botany, 1987, v.65, p.491-499.

416. Ziauddin A., Kasha K.J. Long-term callus cultures of diploid barley (Hordeum vulgare). II. Effect of auxins on chromosomal status of cultures and regeneration of plants // Euphytica, 1990, v. 48, p. 279286.

417. Zorinyants S.E., Nosov A.V., Badaeva E.D., Smolenskaya I.N., Badaev N.N. Cytogenetic analysis of a long-term Triticumtomopheevii (Zhuk.) Zhuk. Cell suspension culture // Plant Breed, 1995, v. 114, p. 219-225.