Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ спонтанной и индуцированной изменчивости компонентного состава запасных белков яровой мягкой пшеницы

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Анализ спонтанной и индуцированной изменчивости компонентного состава запасных белков яровой мягкой пшеницы"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ им. Н.И. Вавилова

ОЛ

На правах рукописи

" 5 С£» вд

УПЕЛНИЕК ВЛАДИМИР ПЕТРОВИЧ

удк 633.112.1:575.17:575.22

АНАЛИЗ СПОНТАННОЙ И ИНДУЦИРОВАННОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ КОМПОНЕНТНОГО СОСТАВА ЗАПАСНЫХ БЕЛКОВ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена в лаборатории генетики растений Института общей генети им. Н.И.Вавилова РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Е.В. Метаковский

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Ю.Ф. Богданов кандидат биологических наук И.Д. Никифорова

Ведущее учреждение: Главный Ботанический Сад РАН

Защита диссертации состоится " V " ¿¿{//^¡УяпЛ 1994года /Э часов ¿Финну] на заседании специализированного Ученого уЬвета Д 002.49.01 при Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: 117809, Москва, В-333, ул. Губкина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетик им. Н.И. Вавилова.

Автореферат разослан «¿Г» ¿Х^и/Л^и— 1994г.

Ученый секретарь специализированного Совета

кандидат биологических наук Г.Н. Полухина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В настоящее время новым источником генетической изменчивости может по праву считаться сомаклональная вариация, или наследственная гетерогенность фз нотипических характеристик регенерантов, возникащая в процессе культивирования тканей растений in vitro (Larkin, scowcroft 1981). В перспективе сомаклональная изменчивость может быть использована в биотехнологии и селекции для создания новых сортов сельскохозяйственных и декоративных

КУЛЬТУР (Larkin, Scowcroft 1981, 1983).

Среди различных видов растений пшеница считается одним из наиболее удобных генетических объектов (мае кеу i960). Кроме того пшеница является одной из основных продовольственных культур, и любые данные, полученные в ходе экспериментов с этой культурой, могут, несомненно, иметь как теоретическое, так и прикладное значение.

Для того, чтобы оценить перспективы практического использования сомаклональной изменчивости в селекции пшеницы, необходимо определить частоту ее встречаемости и механизмы возникновения, понять отличие от других источников индуцированной изменчивости. Изучение сомаклональной вариации у пшеницы, однако, до сих пор основывалось в основном на анализе сложных количественных признаков, что затрудняло получение однозначно интерпретируемых результатов. Следовательно, нужны надежные признаки (генетические маркеры), с помощью которых можно точно идентифицировать генотип исходной формы и выявлять изменения, возникающие у регенерантов по этим признакам.

у пшеницы высокополиморфные запасные белки зерна -глиадины и высокомолекулярные глютенины (ВМГ) - имеют ряд существенных преимуществ в качестве модели для анализа генетической изменчивости. Во-первых, генетика этих белков детально изучена (Payne et ai 1982, 1984). С помощью анализа электрофоретического спектра глиадина можно (теоретически) идентифицировать десятки миллионов генотипов, мутационные изменения, различного рода примеси и т.д. (MetaJcovsky, sozinov 1987). Во-вторых, учитывая огромный полиморфизм запасных белков, можно предположить, что давление естественного отбора на гены, контролирующие синтез этих белков, невелико. Если во

1 1

время культивирования тканей действительно происходят мутационные изменения генов, то практически все мутации, возникающие в генах запасных белков и приводящие к потере их экспрессии, изменению заряда или молекулярной массы контролируемых ими полипептидов, можно будет идентифицировать с помощью анализа электрофоретических спектров.

В ряде работ была обнаружена сомаклональная изменчивость

ПО Генам, КОНТРОЛИРУЮЩИМ СИНТеЗ ГЛИаДИНа ПШеНИЦЫ ( Larkin et al 1984, Maddock et al 1985, Cooper et al 1986). Однако авторы этих исследований относили к сомаклональной изменчивости любые различия в электрофоретических спектрах между регенерантами и исходными формами,' не учитывая данные о генетическом контроле компонентов глиадина. Как показано в работе (Metakovsky et ai 1987), подобный подход может привести к ошибочной интерпретации полученных результатов.

Дели и задачи работы.

Основная цель работы состояла в изучении спонтанной и индуцированной изменчивости компонентного состава запасных белков зерна у яровой мягкой пшеницы.

Были поставлены и решены следущие задачи:

1. Выявлены изменения в электрофоретических спектрах запасных белков зерна, вызываемые культивированием тканей in vitro и химическим супермутагеном нитрозоэтилмочевиной (НЭМ). Проанализирован характер наследования этих изменений.

2. Определена частота сомаклональной изменчивости по генам запасных белков пшеницы.

3. Проведено сравнение частоты и характера спонтанной и

ДВУХ ТИПОВ ИНДУЦИрОВаННОЙ ИЗМеНЧИВОСТИ ЛОКУСОВ Gli И Glu-l.

Научная новизна работы состоит в том, что впервые определена частота изменчивости генов запасных белков (локусов Gli-i, Gii-2 и Giu-i), индуцированная культивированием тканей in vitro и химическим мутагеном НЭМ. Описаны типы мутаций и характер их наследования. Проведено сравнение характера и частоты спонтанного и индуцированного мутагенеза.

Практическая ценность. Показана возможность использования генов запасных белков (глиадинов и ВМГ) в качестве удобных генетических маркеров для выявления сомаклональной изменчивости, химического и спонтанного мутагенеза. На основании этого подхода определена большая мутагенная эффективность НЭМ по сравнению с методом культивирования

тканей in vitro, в ходе исследований создана коллекция редких мутантов с идентифицированным генотипом, что несомненно имеет как теоретическое, так и прикладное значение.

Апробация работы. Результаты исследования докладывались на конференциях молодых ученых Института общей генетики в 1988 и 1989 годах, на III международном совещании "Gluten Proteins" (Будапешт, 1987), на Всесоюзной конференции по биотехнологии злаковых культур (Алма-Ата, 1988 г.), на vil Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1990), на iv Международном совещании "Gluten proteins" (Канада, 1990 г.), на семинаре "Генетика и селекция ПШеНИЦЫ" (S.Angelo Lodigiano, ИТЭЛИЯ, 1993 Г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано четыре статьи и двое тезисов, список которых приведен в конце автореферата.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, шести глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение), выводов и списка литературы. Объем работы -/УСтраниц машинописного текста, включая 13 таблиц и 16 рисунков. Список цитируемой литературы состоит из 178 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Растительный материал. В работе использовано 468 регенерантов (Rj), 115 растений Mj (растений, выращенных из зерен, обработанных НЭМ) и 260 растений контроля яровой мягкой пшеницы сорта Chinese spring. Этот материал любезно предоставлен Сельскохозяйственным институтом Академии наук Венгрии (г. Мартонвашар).

Регенеранты были получены из десятидневных эмбрионов по стандартной методике (Mureshige, Skoog 1962, Galiba et al 1985). Донорами эмбрионов служили 16 линейных растений сорта Chinese Spring. От КЭВДОГО КЭЛЛУСа бЫЛО ПОЛуЧвНО ОТ I ДО 5

регенерантов.

Растения Mj были выращены из зерен, обработанных 0,01 % раствором НЭМ в течение 18 часов, после чего промытых в проточной воде, высушенных и высеянных в открытый грунт.

Кафедра биотехнологии Тимирязевской сельскохозяйственной Академии предоставила 113 линий регенерантов сорта яровой мягкой пшеницы Целинная Юбилейная из них 17 растений -регенеранты rj, 30 линий rg, 33 линии r4 и 33 линии r5, а

з

также один контрольный образец (232 зерна), этого сорта.

В период полевого сезона 1991 года получено десять мутантных растений второго поколения. Растения выращены из мутантных половинок зерен в вегетационных сосудах в открытом грунте. В период цветения каждый колос изолировали бумажными изоляторами.

Создана гибридная комбинация: растения Mj N143 х Кзыл-Бас. Растения Fj были выращены и любезно предоставлены нам сотрудниками СИБНИИСХоза. ¡

Лабораторные методы

Глиадин экстрагировали из размолотых половинок зерен 70% этанолом при 40°С в течение 40 мин. После центрифугирования (15 мин при 4000-5000 об/мин) в супернатант добавляли лактатный буфер (рН 3,1), содержащий краситель метиленовый зеленый И 80% сахарозу (Metakovsky, Novoselskaya 1991).

Одномерный электрофорез глиадана в полиакриламидном геле (ПААГ) проводили согласно принятой методике (Bushuk, Zillman 1978) С модификациями (Metakovsky, Novoselskaya 1991) ДЛЯ вертикальных пластин (1,8мм х 140мм х 150мм). Раствор геля содержал 8,3% акриламвда, 0,4% метиленбисакриламида, 0,1% аскорбиновой кислоты. Полимеризацию осуществляли с помощью системы катализаторов Fe2(so4)3-H2o2. Электрофорез проводили в течении 3 часов в 0.005М лактатном буфере (рН 3,1) при постоянном напряжении 550v.

Белок для электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия (sds-электрофорез) экстрагировали из остатков муки, оставшихся после однократной экстракции глиадина, в течение двух часов при комнатной температуре 0,076М трис-буфером (рН 6,8), содержащим 2% sds, 3% меркаптоэтанола, 10% глицерина, а также краситель бромфеноловый синий. Пробы центрифугировали (4000-5000 об/мин) в течение 10 мин, после чего супернатант прогревали 3-5 мин. при t°80-90°C. sds-электрофорез проводили на камере фирмы "bio-rad" по стандартной методике (laemaii 1970). Разделящий гель (10%) готовили на 0.375М трис hci (рН 8,8) содержащем 0,1% sds. Полимеризацию геля инициировали добавлением 0,04% ТТЗЩ и 0,08% персульфата аммония (ПА). Концентрирущий гель (4,5%) готовили на 0,125М трис hci (рН 6,8), содержащем 0,1% sds, а полимеризацию геля инициировали добавлением 0,15% ТЕЪВД и 0,04% ПА. Электрофорез в 0.025М трис-0,192М глициновом буфере, содержащим 0,1% sds, проводили

14-20 часов (в соответствии с движением маркера бромфенолового синего) при постоянном напряжении 80v. Гели после электрофореза фиксировали в ТХУ и окрашивали Кумасси r-250.

АНАЛИЗ ХАРАКТЕРА И ЧАСТОТЫ НАСЛЕДСТВЕННОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ КОМПОНЕНТНОГО СОСТАВА ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОГО СПЕКТРА ГЛИАДИНА И ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ГЛПГЕНИНА У РЕГЕНЕРАНТОВ И КОНТРОЛЬНЫХ РАСТЕНИИ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ СОРТА CHÍNESE SPRING.

Имея детальную информацию о генетическом контроле всех компонентов глиадина (Метаковский с соавт. 1986, Ахмедов, Метаковский 1987) И ВМГ (Payne et al 1983) Сорта Chinese spring, можно выяснить вероятные причины возникновения любых изменений в электрофоретических спектрах. Генетический подход к анализу электрофоретических спектров состоял в следующем.

Очевидно, что отличие спектров глиадина или ВМГ исследуемого образца от контроля может быть вызвано различными причинами. Во-первых, исследуемый образец (или зерно) могут являться продуктом случайной перёкрестной гибридизации. В этом случае в первом поколении гибрида спектр запасного белка представляет собой сумму компонентов электрофоретических спектров обоих родителей (Созинов 1985). В последующих поколениях будет происходить генетическое расщепление по аллельным вариантам локусов gií и/или Glu, т.е. в спектре конкретного анализируемого образца (зерна) может наблюдаться как гетерозиготное состояние по какому-то из этих локусов, так и замена вариантов блоков компонентов исходного генотипа на блоки компонентов глиадина другого родителя.

Зерно, отличающееся от контроля, может быть также примесью, т.е. зерном другого сорта или его биотипа, случайно попавшего в анализируемый образец. Используя огромный полиморфизм запасных белков зерна, примесь легко отличить по присутсвию в ее электрофоретических спектра? аллельных вариантов блоков компонентов, не характерных для исследуемого образца (Созинов и соавт. 1986). В то же время спонтанные и индуцированные мутации в гомозиготном состоянии будут проявляться в исчезновении (а в гетерозиготном - в ослаблении окрашивания) одного компонента электрофоретического спектра (рис. 16), целого блока (рис. 1а) или в изменении подвижности одного компонента (рис. 1в) и наследоваться без изменений

(Metakovsky et al 1994). ЕСЛИ ПрвДПОЛОЖИТЬ, ЧТО ВОЗНИКаЩЭЯ

Рис. I. Три типа изменений в электрофоретических спектрах глиадина, обнаруженные в индивидуальных зернах растений rj и Mj сорта яровой мягкой пшеницы Chinese Spring: I - контроль, 2 - измененные спектры; а - первый тип, отсутствие всех компонентов, контролируемых одним локусом (на рисунке - потеря всех компонентов, контролируемых Gii-BIa); б - второй тип, потеря одного компонента; в - третий тип, изменение электрофоретической подвижности одного компонента (на рисунке это один из комопнентов, контролируемых Gii-A2a).

Представлены изменения в спектрах, обнаруживаемые у гомозигот по мутации.

б

спонтанная или индуцированная мутация затрагивает один ген (аллель), то среди зерен с самоопылившихся растений первого поколения, наряду с гетерозиготами по этой мутации, могут обнаруживаться и гомозиготы, поскольку данные зерна фактически являются потомками f2. Мы исходили из предположения, что во всех случаях мутации возникают только в гетерозиготном состоянии, а гомозиготы появляются в результате расщепления этих гетерозигот.

Электрофоретические спектры глиадина и ВМГ большинства проанализированных зерен соответствовали известным спектрам

сорта Chinese Spring ПО КОЛИЧвСТВу КОМПОНеНТОВ, ИХ

электрофоретической подвижности и интенсивности окрашивания. Среди контрольных растений обнаружено два случая изменений электрофоретических спектров, которые могли быть вызваны спонтанными мутациями. У одного из этих растений спектр глиадина одного из десяти зерен отличался от нормального спектра сорта значительным ослаблением интенсивности окрашивания одного из компонентов, контролируемого локусом Gii-Bi. При этом интенсивность других компонентов, контролируемых тем же локусом, осталась без изменений. У этого же зерна был ослаблен также один из компонентов sDs-электрофоретического спектра. Очевидно, данный компонент и указанный компонент глиадина представляют один и тот же полипептид. Относительное ослабление его интенсивности могло быть вызвано спонтанной мутацией второго типа (аналогично рис. 16) по соответствующему глиадинкодирущему гену, находящейся в гетерозиготном состоянии.

У другого растения в sds-Электрофоретическом спектре одного из семи зерен обнаружено значительное ослабление интенсивности окрашивания субъединиц 2 и 12, наследующихся сцепленно и контролируемых локусом giu-di.

Электрофоретический спектр глиадина этого зерна.соответствовал контролю. Следовательно, данное изменение не' может быть объяснено моносомией и, вероятно, связано с делецией участка длинного плеча хромосомы id (мутация первого типа).

Таким образом, среди контрольных растений сорта Chinese spring, было обнаружено две мутации в гетерозиготном состоянии. Поскольку каждая из них встретилась лишь в одном зерне, очевидно, что в обоих случаях изменения в электрофоре тических спектрах были вызваны мутациями,

возникшими в последнем поколении. Расчитанная из этих данных частота возникновения спонтанных мутаций по локусам запасных белков зерна составила 9,6 х Ю-4 на локус, на поколение.

Для того, чтобы определить частоту изменений в локусах запасных белков у регенерантов, необходимо быть уверенным в том, что все одинаковые мутации, обнаруженные у разных растений, возникли самостоятельно, т.е. не являлись результатом одного мутационного события. В данном эксперименте независимо возникшими считались те мутации, которые выявлены у регенерантов, выращенных из разных каллусов. Например, при расчете частоты возникновения мутаций регенеранты N147 и N313, полученные из одного каллуса N9, рассматривались как один мутант (табл. I). В другом; случае регенеранты NI5I и N314 также были получены из одного каллуса, однако изменения в спектрах этих растений были разными и, следовательно, независимо возникшей считалась каждая из них. С учетом этих соображений, в исследованном материале регенерантов сорта Chinese spring было зафиксировано по одному изменению по электрофоре гиче ским компонентам глиадина, контролируемым локусами Gli-Ai и Gii-Di и одиннадцать случаев изменений по компонентам, контролируемым gií-bi (табл. I). Все обнаруженные изменения были либо первого, либо второго типа. Данные по частотам изменчивости отдельно для каждого из локусов gií-i представлены в таблице 2.

Использование F-критерия (Плохинский 1969) позволило показать, что частота изменчивости локуса gií-bi в данном эксперименте была достоверно выше, чем гомеологичных ему Gli-Al и Gli-Di (f=I0,76 при Fgt3,64-6,63). В целом частота появления растений, несущих мутации по локусам gü-i, составила 0,93# или Э.ЗхЮ-3 на локус, на поколение.

В локусах Gii-2 обнаружены мутации только первого типа, (табл.3 и 4). Превышение частоты изменчивости локуса gií-b2 по сравнению с локусом gií-A2 оказалось статистически достоверным (f=8,I9 при fBt-3,64-6,63), а различив между локусами gií-B2 и g11-d2 - недостоверным (f=3,I8). В целом частота изменчивости по локусам Gii-2 составила 9,3 х Ю-3 на локус, на поколение.

В локусах Giu-i было зафиксировано пять случаев мутаций, причем только первого типа (табл.5). Рассчитанная по этим данным частота сомаклональной изменчивости составила 5,3 х Ю-3 на локус, на поколение.

Таблица I. Изменения в глиадинкодирувдих локусах хромосом первой гомеологической группы, выявленные при изучении спектров глиадина у регенерантов сорта Chinese spring

N Растения Локус Число мутан-тных зерен Тип мутации * ** Число нормальных зерен Всего зерен

24 Gli-Bl i i 2 2 гет гомо 3 5

52 Gli-Bl 4 1 гет 16 20

73 Gli-Al 1 1 1 1 гет гомо 18 20

Gli-Bl 3 1 гет 17 20

Gli-Dl 4 1 гет 16 20

77 Gli-Bl 2 2° гет 9 10

121 Gli-Bl 1 1 1 гет гомо 3 5

143 Gli-Bl 1 1 23 гет гомо 5 7

147 Gli-Bl 2 I 1 гет гомо 7 10

151 Gli-Bl 2 1 гет 8 10

220 Gli-Bl 1 1 гет б 7

272 Gli-Bl 2 1 гет 8 10

313 Gli-Bl 2 1 гет 12 14

314 Gli-Bl 2 1 2 2 гет гомо 3 ' 6

Пояснения к таблице I !

* - типы мутаций: [

1 - отсутствие всех учитываемых компонентов блока

глиадинов, контролируемых одним локусом; I 2_ - отсутствие компонента 3, контролируемого вн-вг; - отсутсвие компонента 5, контролируемого в11-в1;

2 - отсутствие компонента 10, контролируемого си-в1.

** - гет - мутация обнаружена в гетерозиготном состоянии; гомо - мутация обнаружена в гомозиготном состоянии.

Таблица 2. Частота изменчивости локусов Gii-i у регенеранто! сорта Chinese Spring

Локус Число мутантных локусов Число исследованных локусов Частота изменчивости % Доверительный интервал Р=0,95

Gli-Al 1 468 0,21 0,01-1,23

Gli-Bl 11 468 2,35 1,18-4,32

Gli-Dl 1 468 0,21 0,01-1,23

Таблица 3. Мутации локусов Gii-2, обнаруженные при изученш спектра глиадина у регенерантов сорта Chinese spring

N растения Локус Число мутантных зерен Тип мутации * ** Число нормальных зерен Всего зерен

25 Gli-B2 1 1 гет 4 5

29 Gli-B2 Gli-B2 4 1 1 1 гет гомо 10 15

32 Gli-B2 2 1 гет 18 20

48 Gli-B2 1 1 гет 14 15

59 Gli-B2 3 1 гет 12 15

84 G11-B2 1 1 гет 9 10

88 Gli-B2 1 1 гет 4 5

109 Gli-B2 2 1 гет 8 10

199 G11-B2 2 1 гет 8 10

37 Gli-D2 3 1 гет 2 5

52 Gli—D2 4 1 гет 15 19

106 Gli-D2 1 1 гет 12 13

232 Gli—A2 Gli-A2 1 1 1 1 гомо гет 8 10

* - 1 - отсутствие всех компонентов блока глиадинов

контролируемых одним локусом; ** - гомо - мутация обнаружена в гомозиготном состоянии;

гет - мутация обнаружена в гетерозиготном состоянии.

Таблица 4. Частота изменчивости локусов Gii-2 у регенерантов сорта Chinese Spring

Локус Число му- тантных локусов Число исследованных локусов Частота изменчивости % Доверительный интервал Р=0,95

Gli—А2 1 468 0,21 0,01-1,23

Gli-B2 9 468 1,92 0,88-3,61

Gli-D2 3 468 0,64 0,13-1,86

Таблица 5. Мутации, обнаруженные при изучении электрофоре ти-ских спектров высокомолекулярных глютенинов у регенерантов

сорта Chinese Spring

Число Число

N Локус мутант- Тип ** нормаль- Всего

растения TTWY мутации ных зерен

зерен зерен

214 Glu-Dl 3 1 гет 7 10

219 Glu-Bl l 1 гет 4 5

272 Glu-Bl 2 1 гет . 5 7

302 Glu-Bl 2 1 гет 8 10

3 27 Glu-Bl 1 1 гет 4 5

I - отсутствие всех компонентов контролируемых одним локусом

** - гет - мутация обнаружена в гетерозиготном состоянии.

Среди всех исследованных регенерантов только растение n272 оказалось мутантным одновременно по двум локусам, си-в1 и С1и-В1, локализованным в разных плечах хромосомы 1В. Очевидно, данный регенерант являлся моносомиком по хромосоме 1В, поскольку одновременное возникновение двух делеций по локусам, расположенным в разных плечах одной хромосомы весьма маловероятно.

ЧАСТОТА И СПЕКТР МУТАЦИИ ГЛИАДИНКОДИРУПЦИХ ЛОКУСОВ У РЕГЕНЕРАНТОВ СОРТА ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ ЦЕЛИННАЯ ЮБИЛЕЙНАЯ

При анализе электрофоретических спектров 232 контрольных зерен исследованного образца сорта Целинная Юбилейная, обнаружено четыре биотипа (генотипа по глиадину, или глиатипа). Все четыре глиатипа имеют одинаковые аллели по локусам Gii-Ai, Gii-Bi, Gii—А2 и Gii-D2 (соответственно f, е, q, е). Глиатипы I и 2 имели аллель Gii-Dia, а 3 и 4 - аллель Gli-Dif; глиатипы I и 3 имели аллель Gii-B2m, а 2 и 4 - аллель Gii-B2d. Содержание глиатипов в исследованном образце составило, соответственно, 10,3%, 37,1%, 18,1%, 30,2%. Десять зерен, отличавшихся от любого из глиатипов по двум или более аллелям глиадинкодирунцих локусов, были признаны примесями и исключены из анализа.

В спектре глиадина одного из 222 зерен, не являвшихся примесью, обнаружена мутация первого типа. Таким образом, если ' учитывать каждое исследуемое зерно как отдельное растение (образец взят из большой партии зерна), то частота спонтанной изменчивости локусов Gii сорта Целинная Юбилейная составит примерно 7,5x10 на локус, на поколение, что соответствует данным, полученным ДЛЯ сорта Chinese Spring. I

Зерна II из НО линий регенерантов разных поколений сорта Целинная Юбилейная имели изменения первого и второго типов по компонентам глиадина, контролируемым локусом gii-bi. Из этих II случаев только шесть оказались независимо возникшими, тогда I как пять регенерантов с одинаковыми изменениями были получены из одного каллуса. Частоту сомаклональной изменчивости расчитывали так же, как и в предыдущих главах, принимая, что мутации обнаруженные в разных поколениях, были индуцированы в rt поколении. В результате для регенерантов сорта Целинная

1 о

Юбилейная эта частота составила 9,1x10 на локус, на поколение, что также соответствует данным, полученным для сорта Chinese spring. Частота изменчивости локуса Gii-Bi и здесь оказалась выше по сравнению с другими исследованными локусами.

В целом, полученные результаты свидетельствуют о том, что в основе сомаклональной вариации, по крайней мере по изученным генам запасных белков зерна пшеницы, лежит мутационная изменчивость. Выявленная частота мутаций, вызываемых культивированием тканей in vitro, втрое превышает известную

частоту спонтанного мутагенеза у пшеницы (Metakovsky et al 1993). При этом в нашей работе у регенерантов были обнаружены мутации только первого и второго типов, связанные с хромосомными аберрациями и/или с частичной потерей генетического материала (Metakovsky et al 1993) и поэтому менее интересны в практическом отношении.

АНАЛИЗ ХАРАКТЕРА И ЧАСТОТЫ ИЗМЕНЧИВОСТИ, ВЫЗВАННОЙ ВОЗДЕЙСТВИЕМ НИТР030ЭТИЛМ0ЧЕВИНЫ, У ЛОКУСОВ, КОНТРОЛИРУЮЩИХ СИНТЕЗ ГЛИАДИНА И ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ГЛЮТЕНИНА СОРТА CHINESE SPRING.

В ходе анализа электрофоретических спектров запасных белков зерна растений, обработанных ЮМ, было обнаружено три типа (рис. I) изменений (табл. 6). Следовательно, спектр мутаций, вызываемых НЭМ, оказался шире, чем индуцированных культивированием тканей in vitro: НЭМ, в отличие от культивирования in vitro, индуцировала также и изменения третьего типа (рис. 1в), которые являются следствием мутаций индивидуальных генов в локусах запасных белков, приводящих к появлению новых полипептидов. Как видно из таблицы 7, среди локусов Gii-i наиболее изменчивым под действием использованного мутагена оказался Gii-Bi. Среди Gii-2 также выделился локус, расположенный в хромосоме генома В. Однако превышение его частоты изменчивости по сравнению с локусами Gii-A2 и Gii-D2 оказалось статистически недостоверным (для Gli—А2 F=3,I6, ПРИ Fst=3,89-6,76).

В целом частота изменчивости локусов Gii, индуцированная НЭМ, составила 3,3 х Ю-2 на локус, на поколение, что по крайней мере втрое превышает частоту сомаклональной вариации, выявленную В ТОМ Же эксперименте На сорте Chinese Spring. Для локусов Giu—1 эта величина составила лишь 4,4хЮ~3 на локус, на поколение и практически не отличалась от сомаклональной изменчивости по этим локусам.

НАСЛЕДОВАНИЕ ИЗМЕНЕНИИ ЭЛЕКТРОФОРЕГИЧЕСКИХ СПЕКТРОВ ГЛИАДИНА, ВОЗНИКАЩИХ В ПРОЦЕССЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ IN VITRO И ХИМИЧЕСКОМ МУТАГЕНЕЗЕ.

Наследование изменений, обнаруженных в спектрах запасных белков изучалось на растениях, выращенных из половинок мутантных зерен.

Растения rj nI2I и nI47, имевшие гомозиготную мутацию по потере всех компонентов глиадина, контролируемых локусом Gii-Bi, а также растение n143, имевшее гомозиготную мутацию, но по потере одного компонента блока, контролируемого тем же

Таблица 6. Мутации по локусам, Gii-i и giu-i, выявленные при изучении электрофоретических спектров глиадина и ВМГ у растений Mj сорта Chinese Spring

N растения Локус Число мутан тных зерен Тип мутации * ** Число нормальных зерен Всего зерен

5 Gli-Bl Gli-Bl i i 1 1 гет гомо 8 10

10 Gli-Bl i 1 гет 9 10

15 Glu-Bl 2 1 гет 8 10

27 Gli-B2 2 2 гет 13 15

40 Gli-Bl 2 3 гет 8 10

51 Gli-Bl 2 1 гет 8 10

54 GH-D2 2 2Г гет 18 20

69 Gli-Bl 2 за гомо 8 10

70 Gli—B2 6 1 гет 9 15

74 Gli-D2 3 2Д гет 17 20

79 Gli—B2 Gli—B2 7 1 1 1 гет гомо 12 20

85 Gli-Bl 1 1 гет ' 9 10

89 Gli-Bl Gli—B2 2 1 1 гет гет 14 15

90 Gli-Bl Gli-B2 2 1 1 гет гет 9 10

Gli-B2 2 1 гет 8 10

93 Gli-Bl Gli-Bl 1 1 1 1 гет гомо 8 10

Gli—B2 4 1 гет 6 10

продолжение таблицы 6

94 С11-А2 2 2 гет гомо 16 20

98 СИ-А2 2 1 3$ гет гомо 17 20

101 С11-В2 2 1 гет 8 10

104 С11-В1 1 1 гет 9 10

107 СИ-02 1 1 гет 9 10

109 С11-В1 1 1 гет • 9 10

* 1 - отсутствие всех кошонентов контролируемых одним локусом

2в - отсутствие компонента 22, контролируемого локусом

С11-А2

2г - отсуствие компонента 17, контролируемого локусом

С11-02

2д - отсутствие компонента 25, контролируемого локусом

СИ-02

з - изменение подвижности компонента 5, контролируемого

ЛОКУСОМ СИ-В1

за - изменение подвижности компонента 4, контролируемого локусом С11-В1

з° - изменение подвижности компонента. 26, контролируемого локусом СИ-А2

локусом, в спектрах всех исследованных зерен потомков имели такие же изменения, как и в предыдущем поколении.

Анализ зерен потомков регенерантов NN59-, 77, 88, 199, 220, которые несли мутации в гетерозиготном состоянии, показал наследуемость изменений, обнаруженных у регенерантов. При этом должно было обнаруживаться генетическое расщепление в виде трех фенотипических классов: гетерозигот и двух типов гомозигот в соотношении 2:1:1, соответственно. Однако как видно из табл.8, расщепление соответствовало теоретически ожидаемому только у регенеранта 220. В остальных случаях гомозиготы по мутации либо отсутствовали, либо их количество

Таблица 7. Частота мутационных изменений в локусах, контролирующих синтез запасных белков зерна у растений, подвергнутых воздействию нитрозоэтилмочевины

Локус Число исследованных локусов Число мутантных локусов Частота изменчивости % Доверительный интервал Р=0,95

С11-А1 115 0 0,00 -

С11-В1 115 11 9,57 4,83-17,40

115 0 0,00 -

С11-А2 115 2 1,73 0,21- 6,20

вп-вг 115 7 6,08 2,47-12,20

011-02 115 3 2,60 0,54- 4,86

С1и-В1 113 1 0,88 0,00- 4,87

С1и-01 113 0 0,00 -

Таблица 8. Распределение зерен регенерантов 1*2, мутантных по глиадинкодирупцим локусам

NN растений Число проанализированных зерен Генетическое расщепление X2 Вероятность Р

Фактическое ожидаемое

59 44 20:24: о 11:22:11 18,5 <0,001

77 57 31:22: 4 14:28:14 28,9 <0,001

88 40 26:14: 0 10:20:10 37,4 <0,001

199 48 29:19: 0 12:24:12 37,1 <0,001

220 40 11:19:10 10:20:10 0,2 >0,90

было сильно уменьшено, что свидетельствует о неблагоприятном воздействии исследованных мутаций первого и второго типов на выживаемость растений.

Определенный интерес представляет тот факт, что отсутствие гомозигот по мутации наблюдалось только у мутантов с изменениями по Gii-вг, тогда как гомозиготы по исследованной мутации такого же типа (потеря всех компонентов) по gií-bi присутствовали, и, более того, расщепление соответствовало соотношению 1:2:1.

Представляло интерес выяснить, как наследуются мутации третьего типа, проявляющиеся в изменении подвижности одного из компонентов глиадина. С этой целью изучено 120 зерен f2 полученных от скрещивания мутантного растения mj n143 и сорта Кзыл-Бас. Показано, что число зерен в фенотипических классах (27:61:32) соответствует теоретически ожидаемому при расщеплении 1:2:1 (х2=0,45; р>0,80). Следовательно, ген, контролирующий синтез "мутантного" компонента, находится в составе основного локуса gií-bi. (не рекомбинирует с ним) и аллелен гену, контролирующему синтез исходного "немутантного" компонента. Этот результат подтверждает предположение о мутационном характере возниковения семейств аллелей глиадинкодирующих локусов.

Общие выводы работы I. В результате анализа электрофоретических спектров глиадина и ВМГ обнаружена генетическая изменчивость по локусам запасных белков пшеницы (gü-i, gü-2 и giu-i), индуцированная культивированием тканей in vitro и химическим мутагеном нитрозоэтилмочевиной (НЭМ). У регенерантов обнаружено два, а у растений, подвергнутых воздействию НЭМ (растения Mj) три типа изменений в электрофоретических спектрах глиадина. Частота отсутствия всех компонентов глиадина, контролируемых одним локусом (первый тип мутаций), у регенерантов сорта chineas spring составила 0,78%, а у сорта Целинная Юбилейная 0,45% на локус, на поколение. Для растений Mj сорта Chinese spring эта величина составила 2,17%. Изменения второго типа, отсутствие одного компонента глиадина, возникли у регенерантов каждого из этих сортов с частотой 0,14% и 0,45%. Частота изменений второго типа, индуцированных с помощью НЭМ, составляла 0,43%. Третий тип, изменение подвижности одного компонента (появление

нового полипептида), встречался (0,43% на локус, на поколение) только у растений Мр что указывает на большее разнообразие мутаций, вызываемых НЭМ, по сравнению с сомаклональной изменчивостью.

2. Частота сомаклональной изменчивости по локусам gií для исследованных сортов в среднем составляла 9,2хЮ"3 на локус, на поколение, тогда как НЭМ индуцировала у сорта chínese spring мутации этих локусов с частотой 3,3х10~2 на локус, на поколение. Следовательно, частота изменчивости, индуцируемой НЭМ в gií локусах, существенно выше, чем частота сомаклональной изменчивости. Однако частота изменчивости (первый тип мутаций) по локусам giu-i у растений Rj и Mj оказалась статистически неразличимой и составила 0,53% и 0,44% на локус, на поколение. Частота спонтанной изменчивости по локусам gií для сорта Chinese spring составляла 6,4xI0-4, а для сорта Целинная Юбилейная 7,5хЮ-4 на локус, на поколение.

3 Установлено, что частота возникновения мутаций по локусам Gii-i и Gii-2 примерно одинакова у регенерантов и растений, обработанных НЭМ. Наиболее изменчивыми являются локусы Gii-bi и gií-b2. Предполагается, что большинство мутаций первого типа по данным локусам было вызвано потерей саттелитов хромосом IB и 6В, в которых расположены эти локусы.

4. С помощью анализа электрофоретических спектров глиадина растений ^ и установлено наследование мутаций первого и второго типов, выявленных в первом поколении. Генетическое расщепление гетерозигот по мутации соответствовало соотношению 2:1:1 среди зерен одного растения (Rg' n220, первый тип мутации). В остальных случаях количество гомозигот по мутациям первого и второго типов было сильно уменьшенным, либо они отсутствовали. Это свидетельствует о негативном влиянии данных мутаций на выживаемость растений.

5. Анализ потомства f2 показал, что мутантный ген, контролирующий синтез компонента с измененной электрофоретической подвижностью, находится в составе основного локуса gií-bi. В результате такой мутации появляется новый, ранее не идентифицированный блок компонентов глиадина, что подтверждает предположение о мутационном характере возникновения семейств аллелей глиадинкодирущих локусов.

Материалы диссертации опубликованы в работах

1. Novoselskaya A.Yu., Upelniek V.P., Sutka J., Galiba G. , Metakovsky E.V. & Sozinov A.A. Studying somaclonal variation in wheat with the help of biochemical markers // In.Proc.3rd In.Workshop on Gluten Proteins, Budapest, 1987, World Scientific, Singapore-New Jersey-Hong Kong, p.57-70.

2. Новосельская A.D., Упелниек В.П., Метаковский Е.В. Сомаклональная вариация по запасным белкам у пшеницы // Тезисы докладов v съезда Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова, Москва, 1987, т.4, ч.4, с.106-107.

3. Новосельская A.D., Упелниек В.П., Метаковский Е.В. Идентификация генотипа регенерантных растений, полученных из каллусной культуры пшеницы // Тезисы докладов Всесоюзной конференции по биотехнологии злаковых культур, Алма-ата, 1988, с.76.

4. Упелниек В.П., Новосельская A.D., Шутка Е., Талиба Г., Метаковский Е.В. Анализ изменчивости электрофоретических спектров запасных белков зерна у регенерантов пшеницы // Генетика, 1991, т.27, n9, с.1597-1604.

5. Metakovsky E.V., Davidov S.D., Chemakov V.M., Upelniek V.P. Gliadin allele identification in common wheat: III. Frequency of occurrence and appearance of spontaneous mutations at the gliadin-coding loci // J. Genet, said Breed. 1993, V. 47, p. 221-236.

6. Upelniek V.P., Novoselskaya A.Yu., Sutka J., Galiba G, Metakovsky E.V. Genetic variation at storage protein coding loci of common wheat (cv Chinese Spring) induced by nitrosoethylurea and by cultivation of immature embryos in vitro // Theor. Appl. Genet. 1994.(accepted).