Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сохранение редких и исчезающих видов растений в культуре in vitro и оценка уровня их внутривидового полиморфизма

ВАК РФ 03.02.01, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Сохранение редких и исчезающих видов растений в культуре in vitro и оценка уровня их внутривидового полиморфизма"

На правах рукописи

ЖОЛОБОВА Ольга Олеговна

СОХРАНЕНИЕ РЕДКИХ И ИСЧЕЗАЮЩИХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO И ОЦЕНКА УРОВНЯ ИХ ВНУТРИВИДОВОГО ПОЛИМОРФИЗМА

03.02.01 - ботаника

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

005019499

1 9 ДПР 2012

Белгород - 2012

005019499

Работа выполнена в ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» и ГБУ ВО «Волгоградский региональный ботанический сад»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Сорокопудова Ольга Анатольевна

Официальные Баранова Ольга Германовна

оппоненты: доктор биологических наук, профессор

ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет», заведующая кафедрой ботаники и экологии растений

Молканова Ольга Ивановна

кандидат сельскохозяйственных наук Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН, заведующая лабораторией биотехнологии растений

Ведущая организация Ботанический сад Ботанического института

им. В. Л. Комарова РАН

Защита диссертации состоится «24» апреля 2012 г. в 15-00 на заседании диссертационного совета Д 212.015.12 при ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет». Адрес: 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет».

Автореферат разослан «23» марта 2012 г. Автореферат размещен на сайте http://www.bsu.edu.ru

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент

Н.Г. Габрук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время происходит стремительное сокращение ареалов и полное исчезновение многих видов растений. Биологическое разнообразие является основой для поддержания экологических условий существования и экономического развития человеческого общества, генетические ресурсы являются основным источником селекционно-важных признаков. В связи с этим актуальна проблема сохранения и воспроизводства редких и исчезающих видов растений как in situ, так и ex situ.

Использование системы in vitro по сравнению с традиционными методами поддержания коллекций растений имеет ряд преимуществ: высокие коэффициенты размножения; миниатюризация процесса, приводящая к экономии площадей, занятых маточными и размножаемыми растениями; оздоровление посадочного материала от нематод, грибов и бактерий, вызывающих болезни растений; возможность длительного депонирования образцов с меньшими затратами на хранение. В условиях in vitro удается размножить и укоренить те растения, которые трудно размножаются традиционным способом.

В коллекциях in vitro необходимо сохранять уникальные ассоциации генов, то есть генотипы различных популяций. Поэтому отбор образцов для сохранения ex situ следует проводить с использованием современных методов молекулярной биологии для анализа генетического полиморфизма.

При подборе оптимальных режимов сохранения редких и исчезающих видов растений необходимо, чтобы образцы находились в жизнеспособном состоянии и генетической подлинности. Молекулярно-генетическое исследование при работе с редкими и исчезающими видами растений позволяет провести генетическую идентификацию и паспортизацию, как исходных растений, так и регенеран-тов, сохраняющихся в коллекциях in vitro.

Разработка эффективных методов микроклонального размножения является основой работ по созданию генетических банков in vitro редких и исчезающих видов растений, а так же одним из перспективных направлений сохранения биоразнообразия в целом.

Цель и задачи исследований. Цель исследований - усовершенствование основ сохранения редких и исчезающих видов растений с использованием метода микроклонального размножения.

Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:

1. Создать наиболее репрезентативную коллекцию редких и исчезающих видов растений в культуре in vitro.

2. Оптимизировать методику введения в культуру in vitro редких и исчезающих видов растений.

3. Усовершенствовать методики клонального микроразмножения редких видов и оценить возможность их унификации.

4. Оценить уровень внутривидового полиморфизма редких и исчезающих видов растений, используя методы молекулярно-генетического анализа.

5. Оценить экономическую эффективность хранения редких и исчезающих видов растений в культуре in vitro.

Научная новизна. Впервые на территории России создана крупнейшая коллекция in vitro редких и исчезающих видов растений, содержащая 72 вида из 25 семейств. Выявлены общие закономерности и специфические особенности культивирования in vitro различных видов растений, занесенных в Красную книгу РФ и Красные книги субъектов Федерации.

Впервые в России создан банк ДНК редких и исчезающих видов растений. Проведены RAPD- и AFLP-анализ редких видов, которые можно использовать в качестве методов для выявления генетического полиморфизма, что крайне актуально для малоизученных таксономических групп растений.

Практическая значимость. Созданная коллекция in vitro редких и исчезающих видов растений позволяет не только решить проблемы сохранения биоразнообразия, но и при необходимости получать достаточное количество материала для создания искусственных популяций и выполнения работ по реинтро-дукции редких видов. Модифицированные методики микроклонального размножения редких видов с ценными хозяйственными и декоративными признаками могут быть использованы в промышленном производстве данных растений. Технология апробирована на базе тепличного хозяйства в г. Волжский и отмечена серебряной медалью «За научные инновации года» на Международной выставке «Цветы 2008».

В дальнейшем молекулярно-генетические методы оценки внутривидового полиморфизма могут быть использованы для проведения генетического мониторинга, проверки генетической стабильности образцов, хранящихся в культуре in vitro, для исследования сомаклональной изменчивости, а также паспортизации образцов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Усовершенствованные методики клонального микроразмножения некоторых редких видов позволяют сохранить их генофонд и обеспечить устойчивое содержание этих растений в культуре in vitro.

2. При разработке стратегии сохранения редких видов ex situ отбор образцов и их количество целесообразно проводить с учетом данных об уровне и характере генетического разнообразия вида в целом, полученных с использованием молеку-лярно-генетических методов.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на IV Международной конференции «Биологическое разнообразие. Интродукция растений» (Санкт-Петербург 2007), II Семинаре по реинтродукции растений (Волгоград 2007), II Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (Волгоград 2008), I Всероссийской научно-практической конференции «Ведение региональных Красных книг: достижения, проблемы и перспективы» (Волгоград 2011). Научные разработки экспонировались на различных выставках, в том числе отмечены наградами на Международной выставке «Зеленая неделя» в Германии (почетным дипломом и серебряной медалью), Международной выставке «Цветы 2007» и «Цветы 2008» (серебряные медали), выставке «Агропромышленный комплекс 2007» в Волгограде (золотая медаль).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 работ, 4 из которых в изданиях, рекомендуемых перечнем ВАК РФ.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов с их обсуждением и выводов. Работа изложена на 154 страницах компьютерного текста, содержит 21 таблицу, 24 рисунка. Список используемой литературы включает 239 авторов, из них 72 - на иностранных языках.

Глава 1. НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ СОХРАНЕНИЯ РЕДКИХ И ИСЧЕЗАЮЩИХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ

На основе литературных данных рассмотрены два методических подхода к сохранению биоразнообразия растений: сохранение дикорастущих видов в естественных условиях (in situ) и искусственных (ex situ). Проанализирована возможность использования биотехнологических методов для сохранения и воспроизводства редких и исчезающих видов растений.

Рассмотрены теоретические основы культуры изолированных тканей, необходимые условия и возможные трудности на всех этапах клонального микроразмножения. Изучены факторы, влияющие на микроклональное размножение редких и исчезающих видов растений в культуре in vitro: генотипические особенности, физиологические факторы, состав питательной среды и условия культивирования.

Описаны наиболее представительные коллекции меристем редких и исчезающих видов растений in vitro. Проанализированы способы повышения эффективности содержания регенерантов в культуре in vitro на каждом этапе клонального микроразмножения.

Рассмотрена возможность и эффективность использования молекулярно-генетических маркеров для определения уровня генетического полиморфизма редких и исчезающих видов растений.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии и молекулярной биологии Государственного бюджетного учреждения Волгоградской области «Волгоградский региональный ботанический сад» (ГБУ ВО «ВРБС») в 2005-2011 гг.

Исследования проведены на основе коллекции in vitro редких и исчезающих видов растений, в состав которой входят 72 вида, относящихся к 25 семействам.

В работе придерживались принятых на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии РГАУ - МСХА методик приготовления и стерилизации питательных сред, инструментов и оборудования, изложенных в практикуме «Лабораторно-практические занятия по сельскохозяйственной биотехнологии» (2004).

Модельными объектами при оптимизации методик введения в культуру in vitro служили: Lepidium meyeri Claus., Matthiola fragrans Bunge., Silene cretáceo Fish, ex Spreng., Hedysarum razoumovianum Fish, et Helm, (в качестве первичного экспланта использовали семена); Hedysarum cretaceum Fish., Н. grandiflorum Pall.,

Clematis integrifolia L„ C. orientalis L., C. recta L. (апикальные меристемы и пазушные почки побегов); Bulbocodium versicolor (Ker-Gawl.) Spreng, (сегменты луковиц), Gladiolus tenuis Bieb., Iris tenuifolia Pall, (изолированные зародыши). На этапе введения в культуру отрабатывали различные приемы стерилизации. В ходе эксперимента изучали способность эксплантов к регенерации в зависимости от типа экспланта и сроков их изоляции.

На стадии пролиферации использовали минеральную основу питательной среды MS (Murashige, Skoog, 1962) в сочетании с агаром и сахарозой. В качестве регуляторов роста в питательную среду добавляли: кинетин 0,5; 1,0; 2,0; 5,0 мг/л; 6-Бензиламинопурин (6-БАП) 0,1-1,0; 2,5; 5,0 мг/л, тидиазурон (TDZ) 0,2 мг/л, зеатин 0,1; 0,5; 1,0 мг/л, 6-БАП рибозид 0,5 мг/л, 2-изопентениладенин (2ip) 1,0 мг/л и комбинации этих препаратов с 3-индолилуксусной кислотой (ИУК). Контролем являлась питательная среда MS без добавления гормонов. На стадии размножения учитывали следующие показатели: коэффициент размножения, процент верифицированных растений. Изучали влияние видовых особенностей и продолжительности пассажа на коэффициент размножения.

На стадии укоренения в качестве фитогормонов использовали: ß-индолил-З-масляную кислоту (ИМК) 0,5; 1,0; 2,0; 2,5; 3,0; 5,0 мг/л и 3-индолилуксусную кислоту (ИУК) в концентрациях 0,1-1,0; 2,0; 3,0 мг/л. Учитывали процент укореняе-мости, количество и длину корней.

Модельными объектами на стадиях пролиферации и укоренения служили: Lepidium meyeri, Matthiola fragrans (представители семейства Brassicaceaé), Silene cretáceo (Caryophyllaceae), Hedysarum cretaceum, H. grandiflorum, Calophaca wolgarica (L. fil.) Fisch, ex DC. (представители семейства Fabaceaé), Clematis integrifolia, С. orientalis, С. recta (представители семейства Ranunculaceaé).

Адаптация регенерантов проводилась с применением пищевой полиэтиленовой пленки, с постепенным ее перфорированием.

Математическую обработку данных проводили стандартными методами (Доспехов, 1985) с использованием пакета программ Microsoft Office.

Молекулярно-генетический анализ генотипов редких и исчезающих видов растений проводили в Институте Общей генетики им. Н.И. Вавилова на базе лаборатории генетики растений. Выделение суммарной ДНК производили из индивидуальных растений с помощью СТАВ-метода с небольшими изменениями (Torres et al., 1993). Для полимеразной цепной реакции использовали наборы реактивов производства "Диалат-ЛТД" (Москва). Для проведения RAPD анализа генома использовались произвольные 10-членные RAPD-праймеры. PCR реакцию проводили в термоциклере РСТ-150™ (MJResearch 1пс,США). Продукты реакции амплификации разделяли электрофорезом в 1,7% агарозном геле в IxTBE буфере, окрашивали бромистым этидием и фотодокументировали.

AFLP-анализ проводился с небольшими модификациями (Arens et al., 1995, Smulders et al,, 2000). Рестрикция ДНК (400 нг) проводилась с использованием EcoRI и Msel с последующим лигированием адаптеров. Электрофорез продуктов амплификации проводился в 6% полиакриламидном геле в IxTBE буфере на камере SequiGen 38x50 см (BioRad) с последующим окрашиванием серебром (Bassam, Gresshoff, 2007).

Матрицы данных, полученные в результате RAPD- и AFLP-анализа, были использованы для проведения кластерного анализа методом UPGMA и анализа методом неметрического многомерного шкалирования (программа PAST 1.67b) (Hammer, 2001).

Глава 3. ФОРМИРОВАНИЕ КОЛЛЕКЦИИ РЕДКИХ И ИСЧЕЗАЮЩИХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ IN VITRO

Одним из перспективных направлений, наряду с традиционными способами сохранения растений ex situ, является создание коллекции in vitro редких и исчезающих видов растений.

В настоящее время коллекционный фонд in vitro ГБУ ВО «ВРБС» насчитывает 72 редких вида, принадлежащих к 25 семействам (рис. 1).

«Iiidaceae

■ Fabaceae « Asteraceae я Liliaceae

» Brassicaceae ш Caryophyllaceae «Paeoniaeeae

■ Papaveraeeae ш Alliaceae

в Aristolochiaceae ш Asclepiadaceae ш Asphodelaceae ш Capnfoliaceae » Cistaceae ш Crassulaceae ш Dipsacaceae ^ Dioscoieaceae

.....Hyacinthaceae

.....IIy'[x'iicaccac

ш Lamiaceae

Mehmthiaceae ш Orchidaceae Polygonaceae Scrophulariaceae Vitaceae

Рис. 1. Структура коллекции in vitro редких и исчезающих видов растений (по принадлежности к семействам)

Максимально представлены в коллекции семейства: Iridaceae Juss. - 20,8%, включающее 15 представителей; Fabaceae Lindl. - 16,7% (12 видов); Asteraceae Dumort. - 15,3% (11 видов); Liliaceae Juss - 6,9% (5 видов); Brassicaceae Burnett -5,6% (4 вида); Caryophyllaceae Juss. - 5,6% (4 вида); Paeoniaceae Rudolphi - 2,8% (2 вида); Papaveraeeae Adans. - 2,8% (2 вида). Остальные семейства представлены в коллекции менее 2% и насчитывают только по одному представителю.

В коллекции in vitro представлены виды разных семейств и жизненных форм: прямостоячие кустарники (Calophaca wolgarica, Genista tanaitica Bieb.), полукустарнички (Lepidium meyeri, Silene cretacea, Hedysarum cretaceum), стержнекорне-вые травянистые поликарпики (Matthiola fragrans, Hedysarum grandiflorum, Astragalus dasyanthus Pall.), короткокорневищные травянистые поликарпики (предста-

5,6» о

Liliaceae 6.9» о

вители рода Iris L.), луковичные и клубнелуковичные поликарпики (Bellevalia sarmatica (Georgi) Woronow, Allium regelianum A. Beck., Tulipa gesneriana L.).

По эколого-фитоценотическим группам: лугово-степные (Iris aphylla L.), степные (Bellevalia sarmatica, Calophaca wolgarica, Astragalus dasyanthus, Iris pu-mila L.), галофитно-лугово-степные (Allium regelianum), петрофильно-степные (стенотопные виды — кальцефиты: Hedysarum cretaceum, Lepidium meyeri, Matthi-ola fragrans, Silene cretáceo).

Основная часть коллекции (44 вида) занесена в Красную книгу Российской Федерации. В Красную книгу Волгоградской области занесены 42 вида коллекции in vitro. Это составляет 28,5 % от общего количества высших цветковых растений Красной книги Волгоградской области.

В наших исследованиях представлены виды разных категорий редкости (рис. 2). Категория 0 (по-видимому, исчезнувшие виды) составляет 2,3% и представлена 1 видом - Gladiolus palustris Gaudin. Категория 1 (таксоны, численность особей которых уменьшилась до критического уровня) включает 8 видов - Aristo-lochia manshuriensis Korn., Serratida tanaitica P.Smirn., Dioscorea caucasica Lipsky, Belamcanda chinensis (L.) DC., Iris acutiloba C. A. Mey., Orchis palustris Jacq., Papaver bracteatum Lindl., Parthenocissus tricuspidata (Siebold, et Zucc.) Planch., что составляет 18,2%.

Рис. 2. Структура коллекции in vitro редких видов, занесенных в Красную книгу Российской Федерации (по категориям редкости)

Уязвимые виды (2 категория): таксоны, которым, по-видимому, в ближайшем будущем грозит перемещение в категорию находящихся под угрозой исчезновения, если факторы, вызвавшие сокращение их численности, будут продолжать действовать. К этой категории относятся 17 редких и исчезающих видов растений (38,6%).

Наибольшее число видов (18) включает в себя 3 категория (редкие виды: таксоны, представленные небольшими популяциями, которые в настоящее время не находятся под угрозой исчезновения и не являются уязвимыми, но рискуют оказаться таковыми), что составляет 41%.

Таким образом, коллекционный фонд редких и исчезающих видов в культуре in vitro широко представлен видами различных категорий редкости, относящихся к 25 семействам и разным эколого-фитоценотическим группам. Репрезентативность коллекции дает возможность производить отбор наиболее типичных модельных объектов для проведения экспериментов по подбору оптимальных условий культивирования in vitro.

Глава 4. УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДИК КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ РЕДКИХ И ИСЧЕЗАЮЩИХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ

В ходе экспериментов были выявлены факторы, влияющие на эффективность регенерации редких и исчезающих видов растений в культуре in vitro. Реализация морфогенетического потенциала культивируемых растений обусловлена видовыми особенностями, типом и сроками изоляции экспланта, составом питательной среды и условиями культивирования.

Изолирование и стерилизация первичных эксплантов. Для введения в культуру редких и исчезающих видов растений использовали различные типы эксплантов. В качестве модельного объекта для введения в культуру in vitro семенного материала был выбран вид Matthiola fragrans. В ходе эксперимента был подобран оптимальный режим стерилизации семян (табл. 1).

Таблица 1

Влияние различных режимов стерилизации на получение стерильных эксплантов Matthiola fragrans

Стерилизующий агент Концентрация стерилизующего агента, % Количество стерильных эксплантов, %

Временная экспозиция

7 минут 10 минут

«Лизоформин 3000» 3 33,3±2,4 43,3±9,6

5 83,3±2,4 86,6±2,4

Гипохлорид натрия в составе белизны 30 16,7±2,4 30±4,8

«Хлорамин Б» 10 20±4,8 63,3±7,3

Исследованы всхожесть и динамика прорастания семян Hedysarum razoumo-vianum в зависимости от состава питательной среды. Семена прорастали на 9 день после введения в культуру in vitro. В качестве стерилизующего агента использовали Лизоформин 5% с экспозицией 10 минут. Наибольшее количество проросших семян (13) отмечали на безгормональной питательной среде без добавления агара. Культивирование семян на питательной среде, содержащей гормоны, оказывало угнетающее влияние на развитие проростков (появление аномально утолщенных проростков), в то время как на безгормональной среде формировались проростки без морфологических отклонений.

На этапе введения в культуру представителей рода Clematis L. (С. integrifolia, С. orientalis, С. recta) в качестве первичных эксплантов использо-

вали непосредственно конус нарастания (апекс) с листовыми примордиями и латеральные почки вегетирующих побегов. В результате полученных экспериментальных данных, оптимальным стерилизующим агентом для введения в культуру in vitro эксплантов С. integrifolia является 1%-ный раствор лизоформина при экспозиции 5 мин, максимальная жизнеспособность эксплантов составляла при таком режиме стерилизации 90% (рис. 3).

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

123456789 10 Белизна "ХлорампнБ" "ЛгпоформпнЗООО"

Рис. 3. Жизнеспособность эксплантов Clematis integrifolia в зависимости от режима стерилизации

Условные обозначения: 1 - Белизна 30%, 5 минут; 2 - Белизна 30%, 10 минут; 3 - Белизна 50%, 3 минуты; 4 - Белизна 50%, 5 минут; 5 - Хлорамин 5%, 7 минут; 6 - Хлорамин 7%, 5 минут; 7 - Хлорамин 7%, 7 минут; 8 - Лизоформин 0,5 %, 10 минут; 9-Лизоформин 1%, 5 минут; 10-Лизоформин 1%, 10 минут.

Установлена общая закономерность для всех видов, используемых в экспериментах по введению в культуру in vitro. На этапе подбора оптимальной концентрации стерилизующего агента и временной экспозиции отмечали следующее: при увеличении временной экспозиции или концентрации стерилизатора процент стерильных эксплантов увеличивался, но при этом наблюдали снижение процента жизнеспособных эксплантов, увеличивались сроки прорастания, активность ростовых процессов значительно снижалась. Такой эффект, скорее всего, связан с инги-бирующими свойствами стерилизующего агента. Оптимальный временной режим стерилизации для разных редких и исчезающих видов находится в разных пределах, его подбор осуществлялся индивидуально. При использовании в качестве первичных эксплантов семян пределы временной экспозиции составили от 5 до 20 минут. Для апикальных и латеральных меристем оптимальное время стерилизации составило от 3 до 7 минут.

В ходе экспериментов были изучены особенности формирования проростков Iris tenuifolia в зависимости от типа первичного экспланта (табл. 2). Массовое прорастание изолированных зародышей отмечали на 15 день культивирования, процент жизнеспособных проростков составил 80,19%. В случае проращивания зрелых

II

семян in vitro наличие проростков отмечено в значительно более поздние сроки -55 день культивирования, процент жизнеспособных проростков составил 59,54%. Таким образом, преимущество культуры изолированных зародышей позволяет получить высокий процент жизнеспособных проростков за короткие сроки.

Таблица 2

Жизнеспособность проростков Iris tenuifolia в зависимости от типа экспланта

Тип экспланта Сроки прорастания, ДНИ Процент жизнеспособных проростков, %

Зрелые семена 55 59,54±2,7

Изолированные зародыши 5 80,19±0,8

В ходе работы выявлено влияние срока изоляции эксплантов представителей рода Clematis на их способность к размножению в культуре in vitro. Приживаемость эксплантов зимнего срока изоляции составила не более 60%, во время массового цветения (июнь-июль) еще ниже - 40%, что свидетельствует о низкой активности ростовых процессов. Наибольшую приживаемость наблюдали у эксплантов весеннего срока изоляции, которая у некоторых видов достигала 85-90%. Таким образом, наиболее благоприятными сроками для введения в культуру in vitro растительных тканей редких видов рода Clematis является начальная стадия вегетации.

В результате проведенных экспериментов на этапе введения в культуру in vitro был подобран оптимальный режим стерилизации некоторых редких и исчезающих видов растений. Впервые в качестве стерилизующего агента для введения в культуру редких видов растений был использован хлорсодержащий препарат «Лизоформин 3000», при использовании которого наблюдалось максимальное количество стерильных эксплантов. У Lepidium meyeri, представителя семейства Brassicaceae, максимальный процент проросших семян составил 42% при использовании 5%-го лизоформина в течение 10 минут. Такой же режим стерилизации использовали при введении в культуру in vitro семян Matthiola fragrans того же семейства, при этом процент стерильных семян составил 86,6%, из которых только 50% способны к регенерации, семена прорастали на 17 день.

Для семейства Caryophyllaceae оптимальной концентрацией лизоформина является 3%. При временной экспозиции 7 минут процент стерильных семян Silene cretáceo составил 83,3%, при этом жизнеспособными оказалось 73,3% эксплантов.

Лизоформин 5% в течение 10 минут использовали для введения в культуру in vitro сегментов луковиц и семян Bulbocodium versicolor (Melanthiaceae Batsch). В результате экспериментов было получено 90% стерильных луковиц и 85% стерильных семян.

При работе с представителями семейства Iridaceae (Gladiolus tenuis, Iris tenuifolia) семена стерилизовали в 7%-ном растворе лизоформина в течение 10 минут.

При использовании вышеперечисленных режимов стерилизации был получен максимальный выход стерильных и жизнеспособных эксплантов редких и исчезающих видов растений.

Оптимизация состава питательных сред и условий культивирования редких видов на этапе микроклонального размножения. В ряде исследований, посвященных изучению проблем регенерации культивируемых вегетативных тканей, указывается на то, что для стимулирования регенерационных процессов целесообразно использовать цитокинины и ауксины совместно (Sahoo, 1998; Wang, Debata, 1999; Rani et al., 2000). На предварительном этапе работы, с целью подбора оптимального сочетания гормонов, было использовано 39 вариантов питательной среды с различными комбинациями 6-БАП и ИУК.

Изучено влияние цитокинина и ауксина в среде на регенерационные процессы в культуре in vitro Lepidium meyeri (табл. 3).

Таблица 3

Влияние концентрации 6-БАП и ИУК на коэффициент размножения

Lepidium meyeri

6-БАП Концентрация ИУК (мг/л)

(мг/л) 0 0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 1,0

0 1,1 ±0,1 1,1 ±0,1 1,1 ±0,1 1,1 ±0,1 1,1 ±0,1 1,1 ±0,1 1,1 ±0,1

0,1 5,4 ± 0,3 4 ±0,3 4 ±0,3 7,6 ± 0,5 5,4 ± 0,3 3,2 ± 0,3 4,6 ± 0,3

0,5 8,4 ± 0,6 12 ±0,3 6,8 ± 0,7 43,2±1,9 12,4±0,5 5 ±0,4 9,2 ± 0,4

1,0 17,4 ±0,9 12,4 ±0,6 19,6±0,8 19,4±0,8 29,4±1,1 4,6 ±0,3 32,4±0,4

2,5 35 ± 1,0 14,4 ± 0,8 2,8 ± 0,2 31,8±0,9 16,4±0,5 11,8±1,2 19,8±0,6

5,0 7,8 ± 0,5 34,8 ± 1,3 - 22,6±1,0 - - 33,8±0,6

Полученные данные, подтвердили наличие положительного эффекта при совместном использовании 6-БАП и ИУК. При культивировании растений-регенерантов L. meyeri на питательной среде, содержащей 0,5 мг/л 6-БАП и 0,5 мг/л ИУК, был получен максимальный коэффициент размножения, который составил 43,2. Независимо от соотношения цитокинина с ауксином высокие концентрации 6-БАП (2,5 и 5,0 мг/л) оказались неприемлемыми для размножения, так как процент витрифицированных растений составил более 50%.

Таким образом, при культивировании на питательных средах с низкой концентрацией 6-БАП (0,1-0,5 мг/л) у 90-100% растений-регенерантов отсутствовали аномальные побеги, и происходила активация пазушных меристем.

Темпы развития эксплантов при культивировании разных видов существенно отличаются. Так, если для L. meyeri и М. fragrans (представителей семейства Brassicaceae) максимальные значения коэффициента размножения (12;10,5) были зафиксированы при первых субкультивированиях, то для представителей семейства Fabaceae (Hedysarum grandiflorum, Н. cretaceum, Astragalus dasyanthus) характерна другая закономерность. Максимальный коэффициент размножения 4,8 приходился на 4-5 пассаж (рис. 4).

Количество субкультивирований

- 3— Lepidium meyeri И ■ Hedysarum cretaceum

Рис. 4. Сравнение темпов развития Lepidium meyeri и Hedysarum cretaceum в зависимости от количества субкультивирований

Многими исследователями показано определяющее влияние физиологически активных веществ на морфогенез in vitro (Высоцкий, 1998; Игнатова, 2004; Долгих, 2005). Для увеличения коэффициента размножения и получения выровненных микропобегов, способных к ризогенезу, было проведено исследование по подбору оптимальных концентраций регуляторов роста для представителя семейства Fabaceae — Calophaca wolgarica, который отличается низкой семенной продуктивностью, немногочисленным самосевом и медленным развитием (рис. 5).

Рис. 5. Влияние различных цитокининов на коэффициент размножения

Са1оркаса \volgarica Условные обозначения: 1 - Кинетин 1,0 мг/л; 2 - Кинетин 2,0 мг/л; 3 - Кинетин 5,0 мг/л; 4 - Зеатин 0,1 мг/л; 5 - Зеатин 0,5 мг/л; 6 - Зеатин 1,0 мг/л; 7 - 6-БАП 0,1 мг/л; 8 - 6-БАП 0,5 мг/л; 9 - 6-БАП 1,0 мг/л.

Сравнительный анализ влияния различных регуляторов роста на коэффициент размножения С. wolgarica показал нецелесообразность использования зеатина, так как индуцировать регенерацию побегов удалось у небольшого количества эксплантов, стебли растений были очень тонкие, уменьшались размеры листьев. Максимальный коэффициент размножения составил 1,4 на среде, содержащей 0,5 мг/л зеатина.

Из всех цитокининов наибольший коэффициент размножения 4,0 отмечен при использовании в качестве гормона 6-БАП в концентрации 0,5 мг/л. Однако при этом происходили изменения в морфологии побегов: междоузлия побегов сократились, уменьшились размеры листьев, изменилась их форма. Кроме того, у половины регенерантов при концентрации 1,0 мг/л 6-БАП наблюдалась витрифи-кация побегов.

Кинетин оказывал стимулирующее действие на регенерационные процессы в широком диапазоне концентраций (от 1,0 до 5,0 мг/л). Коэффициент размножения составил от 1,6 до 2,5. У растений-регенерантов не наблюдали морфологических изменений. Таким образом, оптимальной питательной средой для культивирования С. wolgarica является среда с добавлением кинетина в концентрации 2,0 мг/л.

В процессе наших исследований определены коэффициенты размножения у разных видов рода Hedysarum L. (табл.4). На начальных этапах культивирования на стандартной среде Мурасиге и Скуга коэффициенты размножения изученных видов отличались в 3 раза (от 4,2 до 12,0). Практически на всех средах у представителей рода Hedysarum наблюдалась витрификация побегов. Для Н. grandiflorum оптимальной питательной средой для культивирования является среда с добавлением 0,5 мг/л 6-БАП, коэффициент размножения составил 3,8, в то время как у Н. cretaceum на данной среде коэффициент размножения составил 2,0, и наблюдалась значительная витрификация побегов — 80%.

Таблица 4

Влияние видовых особенностей на коэффициент размножения Hedysarum grandiflorum и Hedysarum cretaceum in vitro

Цитокинины Концентрация, мг/л Коэффициент размножения Нитрифицированные реге-неранты,% Коэффициент размножения Витрифици-рованные ре-генеранты, %

Hedysarum cretaceum Hedysarum grandiflorum

6-БАП 0,5 2,0±0,3 80 3,8±0,5 10

6-БАП рибозид 0,5 4,6±0,8 - 2,2±0,3 30

Зеатин 1,0 2,5±0,4 20 1,2±0,2 -

TDZ 0,2 12±1,3 20 4,2±1,1 90

2ip 1,0 2,2±0,4 10 2,8±0,4 10

Кинетин 0,5 2,0±0,2 - 2,2±0,3 -

Кинетин 1,0 1,8±0,2 10 2,5±0,4 -

Для Н. cretaceum лучше подошла среда с добавлением 0,5 мг/л 6-БАП рибо-зид (коэффициент размножения 4,6). Культивирование на среде с 0,5 мг/л кинети-на коэффициент размножения у видов составил 2,0 и 2,2, растения не имели морфологических отклонений. Коэффициент размножения на среде с TDZ 0,2 мг/л различался в 3 раза. Если у Н. cretaceum наблюдалось разрастание тканей побега и образование большого числа адвентивных почек, то у Н. grandiflorum почти у всех регенерантов побеги были витрифицированные. Таким образом, регенераци-онная способность в культуре in vitro обусловлена видовыми особенностями, и даже в пределах одного рода носит индивидуальный характер.

Отчетливо проявлялись видовые особенности и у представителей разных семейств, что выражалось в различном количестве дополнительно заложенных почек и развивающихся из них побегов. Коэффициенты размножения изучаемых видов представлены на рисунке 6.

Наибольшей способностью к регенерации характеризовался представитель семейства Caryophyllaceae (Silene cretáceo) - 13,5. Самая низкая регенерационная способность наблюдалась у представителя семейства Fabaceae (Hedysarum cretaceum)■. коэффициент размножения (Кр) - 2,0.

По интенсивности пролиферации изученные виды были условно разделены нами на три группы: первая группа включает представителей семейства Caryophyllaceae (Silene cretáceo) и семейства Brassicaceae (Lepidium meyeri, Matthiola fragrans), Kp > 7,0; вторая группа включает виды семейства Ranunculaceae Juss (Clematis recta, С. orientalis, С. integrifolia) - 4,0 < Kp < 7,0; к третьей группе с самой низкой регенерационной способностью относятся виды семейства Fabaceae (Calophaca wolgarica, Hedysarum grandiflorum, H. cretaceum).

Silemcretacea Lepidium meyeri Matthiolafingraus Clematis redo Clematis orientalis Clematis integrifolia Calophaca wolgarica Hedysort imgrandiflon im Hedysarum cretaceum

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 U 12 13 14 15 16

Ko )(]>(|)iiniieiiT pa tMiiovKtmiii

Рис. 6. Коэффициент размножения редких и исчезающих видов растений на среде с добавлением 0,5 мг/л 6-БАП

Сравнительный анализ влияния видовых особенностей на коэффициент размножения редких и исчезающих видов растений показал различия как между близкородственными видами (представители рода Hedysarum), так и между вида-

;...................; ------------- 1.1.5 ..... Г,1 " ! i

--.-- 4.« i--

6,9 I—f . j ,..[—X-- 4.2 i- ь 1—

4 1-

3,8 i-

а——н |

ми, относящихся к разным семействам. При этом значения коэффициента размножения между близкородственными видами, в пределах одного семейства, отличались незначительно. Анализ полученных данных по интенсивности пролиферации между редкими видами различных семейств показал значительные отличия (коэффициент размножения между семействами Caryophyllaceae и Fabaceae отличался более чем в 6 раз - от 2,0 до 13,5). Такие различия позволили провести градацию между семействами по регенерационной активности в культуре in vitro.

Особенности укоренения модельных видов в условиях in vitro. Важным этапом при получении растений-регенерантов является укоренение микропобегов. Проведенные эксперименты по подбору сред на этапе укоренения показывают значительные отличия скорости укоренения в зависимости, как от видовых особенностей редких и исчезающих видов, так и от концентрации ауксинов, применяемых для индукции ризогенеза.

Модельными объектами для укоренения были выбраны представители семейств Ranunculaceae (Clematis integrifolia, С. recta, С. orientalis) и Brassicaceae (Lepidium meyeri). В ходе работы изучали влияние различных концентраций ИУК и ИМК на процесс ризогенеза. Укореняемые побеги L. meyeri высаживали на питательные среды, минеральную основу которых составляла полная и разбавленная вдвое модифицированная среда Мурасиге и Скуга с добавлением 20 г/л сахарозы, 6,5 г/л агара и набора витаминов как в основной среде.

Через двадцать дней после помещения побегов на питательную среду наибольший процент корнеобразования (80%) наблюдался на среде с полной минеральной основой среды МС и концентрацией ИУК 1,0 мг/л. На разбавленной среде количество растений с корнями было меньше. Впоследствии происходил процесс сглаживания как по количеству растений с корнями, так и по характеру корнеобразования (количество, длина корней, количество растений с корнями второго порядка).

Для Clematis integrifolia и С. recta оптимальной оказалась питательная среда, содержащая ИУК в концентрации 0,5 мг/л, при этом процент укорененных растений составил 90 и 80% соответственно (рис. 7). Для С. orientalis лучшие показатели отмечены на среде, содержащей ИМК в концентрации 1 мг/л. При этом процент укорененных растений составил 90%. Увеличение концентрации ауксинов до 3 мг/л приводило к образованию каллуса, при этом побеги были нитевидные, верифицированные, листья бледные, мелкие.

Наиболее ответственным моментом при клональном микроразмножении любой культуры является перенос растений в нестерильные условия, т.е. высадка их в почвенный субстрат. Именно на данном этапе отмечается наибольший процент гибели пробирочных растений.

Адаптацию растений-регенерантов проводили при t=25°C, освещенности 3 клк, влажности воздуха 70%. В качестве субстрата использовали смесь: торф; песок; дерновая земля (1:1:2). Растения высаживали в контейнеры емкостью 0,2 л. Для регуляции влажности использовали пищевую пленку с постепенным ее перфорированием. Выход адаптированных растений составлял 70-90%. Затем адаптированные растения переносили в теплицу для доращивания.

100%

ИУК 11УК ИУК 11УК IIMK ИМК 1ШК имк 0.? 1.0 2.0 3.0 0.5 1.0 2.0 3.0 Концентрация ауксинов. мг'л ■ С. integrifolia ■ С. recta я с", orientalis

Рис. 7. Влияние ауксинов на индукцию ризогенеза микрочеренков представителей рода Clematis L

В результате исследований было установлено, что реализация морфогенети-ческого потенциала у редких и исчезающих видов растений определяется видовыми особенностями исходных растений, типом экспланта, его физиологическим состоянием, составом питательных сред и условиями культивирования.

Глава 5. ИЗУЧЕНИЕ УРОВНЯ ВНУТРИВИДОВОГО ПОЛИМОРФИЗМА

РЕДКИХ И ИСЧЕЗАЮЩИХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ ПРИ ПОМОЩИ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ

Одним из наиболее рациональных подходов к описанию внутривидового разнообразия, является использование молекулярно-генетических маркеров, которые позволяют легко идентифицировать отдельные генотипы, оценивать степень генетического полиморфизма внутри отдельных популяций и вида в целом.

Поскольку большинство редких видов растений относятся к числу малоизученных в генетическом плане объектов, то для них возможно использование маркеров универсальных для всех видов растений и животных: RAPD и AFLP, ISSR и некоторых других.

Выполненная работа направлена на изучение и описание генетического разнообразия редких и исчезающих видов родов Iris, Matthiola, Hedysariim, Lepidium, Cou-sinia и др., произрастающих на территории Волгоградской области.

Первым этапом работы при использовании молекулярных методов исследования, является получение очищенной геномной ДНК из растительных тканей. Несмотря на существование ряда опубликованных протоколов по выделению тотальной ДНК растений, при работе с некоторыми видами редких и исчезающих растений, необходима модификация этих методик. Это связано с наличием в клетках этих растений большого количества вторичных метаболитов, в том числе эндогенных полисахаридов и фенольных соединений. Модификация протокола с помощью СТАВ-буфера позволила получить качественную тотальную ДНК.

Следующий этап работы состоял в оптимизации RAPD-метода и идентификации праймеров, которые обнаруживают полиморфизм применительно к отобранным видам растений. В ходе работы были использованы произвольные деся-тичленные праймеры, различающиеся по нуклеотидной последовательности и GC составу. Проведенное электрофоретическое фракционирование продуктов поли-меразной цепной реакции препаратов ДНК с этими произвольными десятичлен-ными праймерами (RAPD) позволило выявить широкий спектр полиморфизма.

Анализ внутри и межвидового разнообразия в популяциях видов рода Iris с использованием RAPD маркеров (рис.8) показал, что данный род характеризуется высоким уровнем внутри и межвидового генетического разнообразия. При использовании праймера АК1 электрофореграмма показала только наличие межвидового полиморфизма, RAPD-спектры Iris pumila, относящихся к разным популяциям были идентичны. В то время как, праймер (DPD03 выявил наличие, как межвидового полиморфизма, так и внутривидового межпопуляционного полиморфизма.

Результаты генетического анализа также свидетельствуют о наличии межпопуляционного полиморфизма вида Hedysarum cretaceum Fisch, и являются примером внутрипопуляционного полиморфизма для вида Lepidium meyeri Claus, (рис. 8).

12 34 М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

А Б

Рис. 8. RAPD-спектры: А - с праймером OPD03, Б - с праймером АК1

Условные обозначения: Рис. A.:l — Iris pumila L., популяция Природного парка Цимлянские пески; 2 - Iris pumila L., популяция Калач на Дону; 3 - Iris pumila L., Москва, ГБС РАН; 4 - Iris scariosa L.

Рис. Б.: М - маркер молекулярной массы DNA ladder; 1 - Iris pumila, популяция - природный парк Цимлянские пески; 2 - Iris pumila, популяция - Калач на Дону; 3 - Iris pumila, Москва, ГБС РАН; 4 - Iris scariosa', 5 - Hedysarum cretaceum, популяция - Средний Дон; 6 — Hedysarum cretaceum, популяция — окрестности хутора Кондраши; 7, 8 — Lepidium Meyeri, интродукционный участок ГБУ ВО «ВРБС»; 9 — Artemisia hololeuca', 10 — Artemisia salsoloides; 11 - Colchicum laetum; 12 - Allium regelianum; 13 - Genista tanaitica\ 14 - Silene hellmannii.

Работы по оценке уровня генетического разнообразия и анализу относительных генетических расстояний в популяции Cousinia astracanica (Spreng.) Та-mamsch с использованием RAPD и AFLP маркирования показали, что данный вид характеризуется высокой степенью генетического разнообразия. Например, анализ RAPD спектров образцов Eremurus spectabilis позволяет сделать вывод о высоком внутрипопуляционном разнообразии (рис. 9), несмотря на ее малую численность. Отобраны праймеры, позволяющие детектировать высокий уровень меж- и внутривидового полиморфизма.

Рис. 9. Дендрограмма образцов Eremurus spectabilis Bieb., построенная на основе проведенного RAPD-анализа

Для проведения RAPD-анализа генома Matthiola fragrans было использовано 11 десятичленных праймеров, ранее успешно применяемых для маркирования генома пасленовых, злаков и представителей родов Stachys, Syringa и др. (Кочие-ва и др., 1999; 2004; 2006). Всего проанализировано 40 образцов ДНК из шести популяций М. fragrans и два образца ДНК растений, сохраняемых в культуре in vitro. Большинство используемых праймеров выявляли полиморфизм образцов ДНК М. fragrans. С учетом образцов из культуры in vitro всего было получено 442 полиморфных фрагмента, средний процент полиморфных локусов составил 55,3%. Были выявлены как различия между популяциями, так и внутрипопуляци-онный полиморфизм. При этом популяции различались между собой по уровню выявляемого полиморфизма.

С помощью AFLP-анализа также были выявлены различия между популяциями и внутрипопуляционный полиморфизм М. fragrans. AFLP-анализ также выявил уникальные для каждой популяции амплифицируемые фрагменты ДНК. В RAPD-спектрах выявлено 22 мономорфных фрагмента, в AFLP-спектрах - 28. Ряд общих фрагментов, по-видимому, можно считать маркерами вида.

Сходство результатов, полученных при использовании двух различных методов, говорит о правомерности использования каждого из них по отдельности. В то же время более простая методика проведения RAPD-анализа, большее количество уникальных фрагментов, выявляемых в каждой популяции по сравнению с

AFLP-анализом, а также хорошее разделение популяций при статистической обработке результатов RAPD-анализа позволяет сделать вывод о правомерности использования RAPD-метода (несмотря на то, что в последнее время многими исследователями этот метод рассматривается, как "морально устаревший") при генетическом мониторинге популяций М. fragrans. С другой стороны, объединение RAPD- и AFLP-методов позволяет более точно оценить генетическое разнообразие и генетические особенности популяций, поскольку характеризует более обширные области генома изучаемого растения.

Проведенная работа дает возможность перевести исследования редких и исчезающих видов растений на качественно новый уровень. Полученные в работе результаты показывают высокую внутривидовую генетическую дифференциацию с использованием ДНК-маркеров, что, в свою очередь, позволяет говорить о возможности проведения полномасштабного генетического мониторинга.

Исходя из полученных данных, очевидно, что при разработке стратегии сохранения редких видов ex situ отбор и количество образцов целесообразно проводить, опираясь на данные об уровне и характере генетического разнообразия вида в целом, а мероприятия по сохранению отдельных популяций in situ организовывать, проводя предварительный генетический мониторинг с учетом географической межпопуляционной и локальной внутрипопуляционной изменчивости.

Экономические аспекты использования метода клонального микроразмножения редких и исчезающих видов растений. В данной работе рассчитана стоимость технологии воспроизводства редких видов растений в культуре in vitro. Для этого были произведены расчеты затрат на осуществление полного цикла выращивания редких видов методом микроклонального размножения, начиная от введения в культуру in vitro, этапа микроразмножения, индукции ризогенеза и адаптации регенерантов к нестерильным условиям (in vivo). А также затраты на непрерывное поддержание коллекции редких видов, используя метод клонального микроразмножения.

При расчете затрат учитывали: уровень мировых цен на аналогичную продукцию, стоимость материальных затрат, фонд оплаты труда и начисления на заработную плату, стоимость коммунальных платежей, стоимость амортизационных отчислений на оборудование.

Коллекция редких и исчезающих видов в культуре in vitro ГБУ ВО «ВРБС» насчитывает 72 вида. Для возможности стабильного поддержания коллекции in vitro все виды представлены 20 экземплярами. В среднем продолжительность пассажа на среде, содержащей небольшое количество гормонов, необходимых для поддержания развития растений нормальной морфологии, у большинства видов составляет 50-60 дней. Исходя из этого, в течение года необходимо шесть раз производить пересадку регенерантов на свежую питательную среду. Годовой нормой пересадки экземпляров редких видов в культуре in vitro является 8640 регенерантов. Учитывая все годовые затраты, для сохранения одного вида в коллекции in vitro в течение года потребуется 6 144 рубля.

При необходимости массового размножения редких видов (восстановление исчезнувших популяций, редкие лекарственные растения, производство редких видов в качестве источников сырья для получения биологически активных веществ) оснащение лаборатории позволяет ежемесячно производить 7000 расте-

ний, что за год составит 84 ООО растений. С учетом среднего коэффициента укоренения 50%, выход адаптированных растений за год составит 42 ООО растений. В данном случае стоимость производства одного растения составит 19,99 рублей.

На основании произведенных расчетов был проведен анализ возможных путей снижения стоимости данной технологии. Это возможно, благодаря усовершенствованию имеющихся собственных разработок и использованию зарубежного опыта. Замена дорогостоящих компонентов среды на более дешевые, снижение затрат на расходные материалы, а также повышение квалификации обслуживающего персонала для снижения трудозатрат позволят значительно снизить затраты на готовую продукцию.

Значительный экономический эффект дает также прием хранения коллекции in vitro редких видов растений в условиях замедленного роста. Данные расчетов позволяют сделать вывод о том, что создание лабораторий по клональному микроразмножению актуально и экономически выгодно как для решения производственных задач, так и для сохранения биоразнообразия.

ВЫВОДЫ

1. Создана крупнейшая коллекция редких и исчезающих видов растений в культуре in vitro, включающая 72 вида, принадлежащих к 25 семействам.

2. Модифицированы методики введения в культуру in vitro редких видов растений с использованием препарата Лизоформин - оптимального стерилизующего агента, при использовании которого был получен максимальный процент стерильных эксплантов.

3. Усовершенствованы методики клонального микроразмножения некоторых редких видов растений. Впервые в культуру in vitro введены редкие виды флоры Волгоградской области {Allium regelianum, Lepidium meyeri, Matthiola fra-grans, Hedysarum cretaceum, Silene cretacea и другие).

4. Установлено, что реализация органогенного потенциала у редких и исчезающих видов растений определяется видовыми особенностями исходных растений, типом экспланта, его физиологическим состоянием, составом питательных сред и условиями культивирования.

5. Проведенный RAPD-анализ редких и исчезающих видов растений показал возможность использования данного метода для выявления как их межвидового, так и внутривидового полиморфизма.

6. Полученные в работе результаты RAPD- и AFLP-анализа показывают высокую генетическую дифференциацию популяций Matthiola fragrans, что позволяет использовать эти методы для проведения полномасштабного генетического мониторинга редких видов растений.

7. При разработке стратегии сохранения редких видов ex situ отбор образцов и их количество целесообразно проводить с учетом данных об уровне и характере генетического разнообразия вида в целом, полученных с использованием молекулярно-генетических методов.

8. Данные расчетов стоимости затрат на содержание в культуре in vitro редких видов растений позволяют сделать вывод о том, что создание лабораторий по клональному микроразмножению актуально и экономически выгодно как для решения производственных задач, так и для сохранения биоразнообразия.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При разработке стратегии сохранения редких видов ex situ отбор образцов целесообразно проводить, опираясь на данные об уровне и характере генетического разнообразия вида в целом. Мероприятия по сохранению отдельных популяций in situ следует организовывать, проводя предварительный генетический мониторинг с учетом географической межпопуляционной и локальной внутрипо-пуляционной изменчивости.

2. При использовании метода in vitro для размножения и сохранения редких и исчезающих видов растений необходимо учитывать генетические особенности каждого вида, типы эксплантов, и их физиологическое состояние. Наиболее благоприятными сроками для изоляции растительных эксплантов является начало вегетации. Оптимальной питательной средой для размножения редких видов является среда, содержащая 6-БАП в концентрации 0,5-1,0 мг/л, для укоренения - среда с добавлением 0,4-1,0 мг/л ПУК.

3. Адаптацию укорененных растений необходимо проводить с применением пищевой полиэтиленовой пленки, с постепенным ее перфорированием, создавая эффект «влажной камеры».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

*- публикации в печатных изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК

1. Короткой, О.И. Формирование и изучение крупнейшей в России коллекции клемати-сов ГУ «Волгоградский региональный ботанический сад» / О.И. Коротков, О.О. Короткова, Ю.Б. Утц // Материалы V Междунар. науч. конф. «Цветоводство без границ» (15-19 июля 2006 г.) - Харьков, 2006. - С. 46-48.

2. *Малаева, Е.В. Генетический банк редких и ценных видов растений Волгоградского регионального ботанического сада / Е.В. Малаева, H.A. Супрун, О.И. Коротков, О.О. Короткова // Вестник Волгоградского государственного университета. Серия 3. Экономика. Экология. -Волгоград, 2008. - С.241-245.

3. Короткова, О.О. Создание генетического банка in vitro коллекции клематисов ГУ «Волгоградский региональный ботанический сад» / О.О. Короткова // Сборник тезисов докладов участников XXIII Всероссийской конференции обучающихся «Национальное достояние России». - Минобрнауки РФ, Рособразование, РОСКОСМОС, РАО, НС «ИНТЕГРАЦИЯ», 2008.-С. 186-187.

4. Короткова, О.О. Особенности культивирования редких и исчезающих видов растений in vitro / О.О. Короткова, О.И. Коротков // Молодежные ботанические чтения: Материалы региональной научно-практической конференции - Волгоград, 2009. - С. 251-253.

5. Короткова, О.О. Актуальность создания генетического банка редких и исчезающих видов растений в культуре in vitro / О.О. Короткова // Молодежные ботанические чтения: Материалы региональной научно-практической конференции. - Волгоград, 2009. - С. 178-180.

6. Короткова, О.О. Описание генетического разнообразия редких и исчезающих видов растений на основе использования генетических маркеров / О.О. Короткова, О.И. Коротков // Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии: материалы VIII Международной научно-практической конференции - Барнаул, 2009. - С. 348-350.

7. Короткова, О.О. Сохранение коллекции клематисов (Clematis L.) ГУ «Волгоградский региональный ботанический сад» в культуре in vitro / О.О. Короткова, О.И. Коротков // Сборник статей по материалам III Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира». - Волгоград, 4-6 августа 2010 - Волгоград: Изд-во AVATARS, 2010. - С. 145-153.

8. Агеева, С.Е. Сохранение редких и исчезающих видов растений в генетическом банке Волгоградского регионального ботанического сада / С.Е. Агеева, О.И. Короткое, О.О. Коротко-ва, Т.Н. Мельникова, Е.В. Малаева // Международная научная конференция: «Актуальные проблемы ботанического ресурсоведения». - Алматы, 2010. - С. 28-31.

9. Круглова, JI.H. Особенности развития инорайонных редких растений России при культивировании в Волгоградском региональном ботаническом саду / Л.Н. Круглова, О.И. Короткое, О.О. Жолобова и др. // Ботанические сады и устойчивое развитие северных регионов: Материалы докладов Всероссийской научной конференции с международным участием, посвященной 80-летнему юбилею ПАБСИ КНЦ РАН - Апатиты, 2011. - С. 121-126.

10. Круглова, Л.Н. Интродукция редких и исчезающих видов растений на базе Волгоградского регионального ботанического сада / Л.Н. Круглова, С.Е. Агеева, О.О. Жолобова и др. // Роль ботанических садов и охраняемых природных территорий в изучении и сохранении разнообразия растений и грибов: Материалы Всероссийской научной конференции с международным участием - Ярославль: Изд-во ЯГПУ, 2011. - С. 71-74.

11. Жолобова, О.О. Биотехнологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения редкого вида Matthiola fragrans Bunge / О.О. Жолобова, О.И. Короткое, A.M. Кудрявцев // Сборник статей по материалам I Всероссийской научно-практической конференции «Ведение региональных Красных книг: достижения, проблемы и перспективы» - Волгоград, 2011. -С. 242-246.

12. Сафронова, Г.Н. Особенности культивирования in vitro Gladiolus tenuis Bieb. / Г.Н. Сафронова, О.О. Жолобова, О.И. Короткое и др. // Сборник статей по материалам I Всероссийской научно-практической конференции «Ведение региональных Красных книг: достижения, проблемы и перспективы» - Волгоград, 2011. - С. 239-242.

13. Жолобова, О.О. Сохранение биологического разнообразия редких и исчезающих видов растений методами биотехнологии в Волгоградском региональном ботаническом саду / О.О. Жолобова, A.B. Буганова, О.И. Короткое и др. // Сборник статей по материалам I Всероссийской научно-практической конференции «Ведение региональных Красных книг: достижения, проблемы и перспективы» - Волгоград, 2011. - С. 231-234.

14. Жолобова, О.О. Особенности сохранения редкого вида Sedum subulatum (С.А. Меу.) Boiss. в культуре in vitro / О.О. Жолобова, A.B. Буганова, О.И. Коротков и др. // Сборник статей по материалам I Всероссийской научно-практической конференции «Ведение региональных Красных книг: достижения, проблемы и перспективы» - Волгоград, 2011. - С. 228-231.

15. *Хадеева, Н.В. Генетический мониторинг популяций левкоя душистого (Matthiola fragrans Bunge) с помощью RAPD- и AFLP-анализа / Н.В. Хадеева, A.M. Кудрявцев, О.О. Жолобова и др. // Известия РАН. Серия биологическая - 2011. - Вып.4. - С. 389-396.

16. Круглова, Л.Н. Интродукция некоторых редких и исчезающих кальцефитных видов растений в Волгоградском региональном ботаническом саду / Л.Н. Круглова, С.Е. Агеева, A.B. Буганова, О.О. Жолобова // Биологическое разнообразие. Интродукция растений - Санкт-Петербург, 2011. - С. 245-247.

17. *Сафронова, Г.Н. Распространение Iris tenuifolia Pall, на территории Волгоградской области и меры по его сохранению / Г.Н. Сафронова, О.О. Жолобова и др. // Вестник Удмуртского университета. Биология. Науки о земле. - 2011. - Вып.4. - С. 152-155.

18. *Жолобова, О.О. Сохранение редких и исчезающих видов растений при помощи методов биотехнологии / О.О. Жолобова, О.И. Коротков, Г.Н. Сафронова, A.B. Буганова, O.A. Со-рокопудова // Современные проблемы науки и образования. - 2012. - № 1; URL: http://www.science-education.ru/101-5341 (дата обращения: 25.01.2012).

Подписано в печать 21.03.2012. Гарнитура Times New Roman. Формат 60x84/16. Усл. п. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 72. Оригинал-макет подготовлен и тиражирован в ИПК НИУ «БелГУ» 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Жолобова, Ольга Олеговна, Белгород

61 12-3/1250

На правах рукописи УДК 602.7: 635.9:577.21

Жолобова Ольга Олеговна

К

СОХРАНЕНИЕ РЕДКИХ И ИСЧЕЗАЮЩИХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO И ОЦЕНКА УРОВНЯ ИХ ВНУТРИВИДОВОГО

ПОЛИМОРФИЗМА

Специальность 03.02.01 - ботаника

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Белгород, 2012

СОДЕРЖАНИЕ

Список использованных сокращений.......................................................4

Введение..........................................................................................5

Глава 1. НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ СОХРАНЕНИЯ РЕДКИХ И ИСЧЕЗАЮЩИХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ.........................................................................11

1.1. Способы сохранения редких и исчезающих видов растений...................11

1.1.1. Сохранение редких и исчезающих видов растений в условиях in situ......12

1.1.2. Сохранение редких и исчезающих видов растений в условиях ex situ.....15

1.2. Клональное микроразмножение как метод сохранения биоразнообразия...20 1.2.1 Клональное микроразмножение: достоинства, этапы, необходимые условия............:.............................................................................20

1.2.2.Факторы, влияющие на микроразмножение растений.........................24

1.2.3. Трудности, возникающие при клональном микроразмножении растений.........................................................................................28

1.3. Особенности клонального микроразмножения редких и исчезающих видов растений.........................................................................................31

1.3.1. Этап введения в культуру in vitro.....................................................33

1.3.2. Этап микроразмножения редких и исчезающих видов..........................39

1.3.3. Этап индукции ризогенеза редких видов в культуре in vitro..................41

1.3.4. Возможности длительного депонирования редких видов в культуре in vitro...............................................................................................43

1.4. Редкие виды как ценное сырье для получения биологически активных веществ..........................................................................................44

1.5. Использование молекулярно-генетических методов для оценки

биоразнообразия..............................................................................46

1.5.1. Методы выявления полиморфизма ДНК редких и исчезающих видов растений.......................................................................................49

1.5.2. Особенности использования ДНК-маркеров в изучении генетического

разнообразия редких и исчезающих видов растений.................................57

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ...........................64

Глава 3. ФОРМИРОВАНИЕ КОЛЛЕКЦИИ IN VITRO РЕДКИХ И

ИСЧЕЗАЮЩИХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ ГБУ ВО «ВРБС»............................68

Глава 4. УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДИК КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ РЕДКИХ И ИСЧЕЗАЮЩИХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ.............................................................................:......75

4.1. Изолирование и стерилизация первичных эксплантов..........................75

4.2. Оптимизация состава питательных сред и условий культивирования редких и исчезающих видов растений на этапе микроклонального размножения.......82

4.3. Укоренение in vitro я адаптация регенерантов редких видов к условиям in vivo...............................................................................................95

4.3.1. Укоренение-редких видов в условиях культуры in vitro......................95

4.3.2. Адаптация укорененных микропобегов к нестерильной среде..............99

Глава 5. ОПИСАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ РЕДКИХ И ИСЧЕЗАЮЩИХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ НА ОСНОВЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ..........................................................101

5.1. Генетический мониторинг популяций Matthiola fragrans Bunge с помощью RAPD- и AFLP-анализа....................................................................106

5.1.1. RAPD анализ генома Matthiola fragrans........................................108

5.1.2. Изучение генетического полиморфизма Matthiola fragrans при помощи AFLP-анализа.................................................................................111

5.1.3. Сравнение методов RAPD- и AFLP-анализа Matthiola fragrans............112

Глава 6. ЭКОНОМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ РЕДКИХ И ИСЧЕЗАЮЩИХ

ВИДОВ........................................................................................117

ВЫВОДЫ.....................................................................................123

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................125

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

6-БАП - 6-бензиламинопурин

6-БАПр - 6-бензиламинопурин рибозид

2,4-Д - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота

2 ip - 2-изопентениладенин

АК - аскорбиновая кислота

Z - зеатин

Zp - зеатин рибозид

Tdz - тидиазурон

К - кинетин

ИУК - 3-индолилуксусная кислота

НУ К - нафтилуксусная кислота

ИМК - /2-индолил-З -масляная кислота

AFLP - Amplified Fragment Length Polymorphism; полиморфизм длин амплифицированных фрагментов

CAPS - Cleaved Amplified Polymorphic Sequences; расщепленные амплифицированные полиморфные последовательности ISSR - Inter Simple Sequence Repeat; межмикросателлитные фрагменты ПЦР - Polymerase Chain Reaction; полимеразная цепная реакция RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA; произвольно амплифицируемая полиморфная ДНК

SCAR - Sequence Characterized Amplified Region; амплифицированный район с известной последовательностью

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В последние десятилетия все большее понимание находит тот факт, что биологическое разнообразие является основой для поддержания экологических условий существования и экономического развития человеческого общества, следовательно, оно является всемирным достоянием. Угроза сохранению отдельных видов и экосистем еще никогда не была так велика, как сегодня, когда рост населения и последствия хозяйственной деятельности приводят к необратимым изменениям природы нашей планеты. На XVI Международном ботаническом конгрессе, проходившем в августе 1999 г. в США подчеркивалось, что если не принять в ближайшее время действенные меры по сохранению видового разнообразия растений, то к середине XXI века могут быть потеряны от 1/3 до 2/3 из 300 ООО видов растений, обитающих в настоящее время на Земле (Ревин, 2000). Отсюда очевидна необходимость разработки и реализации эффективных мероприятий по сохранению мирового растительного биоразнообразия. Важнейшим шагом в этом направлении послужило принятие мировым сообществом в 1993 г. Международной Конвенции о биологическом разнообразии (КБР).

Генетические ресурсы растений рассматриваются во всем мире как основной источник улучшения сельскохозяйственных культур на ближайшие десятилетия. Создание источников и доноров селекционно-важных признаков, т.е. организация предселекционной работы, в большинстве случаев базируется на мировых генетических ресурсах или коллекциях культивируемых растений и их диких сородичей. Раскрытие потенциала генетических ресурсов по основным биологическим и селекционным признакам обеспечивает генетическую базу для реализации селекционных программ различных направлений. В целом же предселекционная работа включает все этапы работы с генофондом от сбора, поддержания и изучения до правовых аспектов авторства на доноры и источники ценных признаков.

Эффективность сохранения генофонда растений ex situ может быть резко повышена путем создания генетических банков растений. По классификации Международного центра генетических ресурсов различают следующие виды генетических банков: 1) генные банки семян; 2) полевые генные банки (специальные, обычно клоновые посадки ценных древесных и многолетних травянистых растений); 3) банки меристем - хранение растительного материала in vitro (культур меристем, тканей и сеянцев в условиях замедленного роста) (Андреев, Горбунов, 2000).

По данным Совета ботанических садов России в коллекциях ботанических садов и дендрариев из 461 вида покрытосемянных, голосемянных и папоротниковидных растений, включенных в Красную книгу РФ (2008), 252 вида (55%) выращиваются в российских интродукционных центрах. В культуре in vitro содержится не более 20% редких и исчезающих видов растений. Наиболее представительными являются коллекции ГБС РАН (70 видов) и ГБУ ВО «ВРБС» (72 вида).

При создании банков in vitro особо актуальна проблема сохранения генетической стабильности хранящихся образцов. Открытие методов, позволяющих выявить генетические различия между объектами, дало большой скачок в картировании геномов растений. ДНК-маркеры обладают существенными преимуществами по сравнению, с морфологическими и другими маркерами: они позволяют выявлять полиморфизм в любом участке генома, дают возможность вести анализ по неограниченному числу локусов. (Малышев, Картель, 1997; Saliba-Colombani et al., 2000). Чтобы служить эффективной базой для улучшения культур, генетическое разнообразие должно быть тщательно й всесторонне ' изучено. Сами коллекции должны быть рационально организованы как на этапе отбора образцов, так и на этапе их сохранения. Каждый образец коллекции должен быть идентифицирован и паспортизирован.

Сохранение редких и исчезающих видов растений в условиях in vitro

связано с определенными проблемами. Первая - небольшой объем растительного материала, находящийся в распоряжении экспериментатора. Вторая - как максимально, без потерь использовать материал, так как значительная его часть теряется на начальных этапах культивирования in vitro. Возникает еще ряд вопросов, решение которых становится актуальным при работе с редкими видами, относящимися к категориям редкости I и II по критериям МСОП: из каких ценопопуляций изолировать материал (учитывая состояние ценопопуляций и сохраняя их ■ целостность); какой растительный материал использовать в качестве экспланта (учитывая генетическое и фенотипическое разнообразие размножаемого вида, возрастной и половой составы, способы размножения (семенной и/или вегетативный)); как скажется гетерокарпия и гетероспермия на росте и развитии нового поколения и т.д.

Как показывает опыт, влияние генотипа на условия культивирования эксплантов актуально не только на этапе введения в культуру, но и на этапах микроразмножения и адаптации, а также при длительном депонировании образцов. Кроме этого необходимо учитывать не только эндогенные, но и экзогенные факторы.

Разработка эффективных- методов микроклонального размножения является основой работ по созданию генетических банков in vitro редких и исчезающих видов растений, а так же одним из перспективных направлений сохранения биоразнообразия в целом.

Цель исследования - Создание коллекции редких и исчезающих растений в культуре in vitro для сохранения их биоразнообразия и усовершенствование методик их клонального микроразмножения.

Задачи.

1. Оптимизировать методику введения в культуру in vitro редких и исчезающих видов растений.

2. Усовершенствовать методики клонального микроразмножения редких видов и оценить возможность их унификации.

3 . Оценить уровень внутривидового полиморфизма редких и исчезающих видов растений, используя методы молекулярно-генетического анализа.

4. Оценить экономическую эффективность хранения редких и исчезающих видов растений в культуре in vitro.

Научная новизна. Впервые на территории России создана крупнейшая коллекция in vitro редких и исчезающих видов растений, содержащая 72 вида из 25 семейств. Выявлены общие закономерности и специфические особенности культивирования in vitro различных видов растений, занесенных в Красную книгу РФ и Красные книги субъектов Федерации.

Впервые в России создан банк ДНК редких и исчезающих видов растений. Проведены RAPD- • и AFLP-анализ редких видов, которые можно использовать в качестве методов для выявления генетического полиморфизма, что крайне актуально для малоизученных таксономических групп.

Практическая значимость работы. Созданная коллекция in vitro редких и исчезающих видов растений позволяет не только решить проблемы сохранения биоразнообразия, но и при необходимости получать достаточное количество материала для создания искусственных популяций и выполнения работ по реинтродукции редких видов. Модифицированные методики микроклонального размножения редких видов с ценными хозяйственными и декоративными признаками могут быть использованы в промышленном производстве данных растений. Технология апробирована на базе тепличного хозяйства в г. Волжский и отмечена серебряной медалью «За научные инновации года» на Международной выставке «Цветы 2008».

В дальнейшем молекулярно-генетические методы оценки внутривидового полиморфизма могут быть использованы для проведения генетического мониторинга, проверки генетической стабильности образцов, хранящихся в культуре in vitro, для исследования сомаклональной изменчивости, а также паспортизации образцов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Усовершенствованные методики клонального микроразмножения некоторых редких видов позволяют сохранить их генофонд и обеспечить устойчивое содержание этих растений в культуре in vitro.

2. При разработке стратегии сохранения редких видов ex situ отбор образцов и их количество целесообразно проводить с учетом данных об уровне и характере генетического разнообразия вида в целом, полученных с использованием молекулярно-генетических методов.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на Всероссийской конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия» (Волгоград 2008), IV Международной конференции «Биологическое разнообразие. Интродукция растений» (Санкт-Петербург

2007), II Семинаре по реинтродукции растений (Волгоград 2007), II Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (Волгоград

2008), I Всероссийской научно-практической конференции «Ведение региональных Красных книг: достижения, проблемы и перспективы» (Волгоград, 2011). Научные разработки экспонировались на различных выставках, в том числе отмечены наградами на Международной выставке «Зеленая неделя» в Германии (почетным дипломом и серебряной медалью), Международной выставке «Цветы 2007» и «Цветы 2008» (серебряные медали), выставке «Агропромышленный комплекс 2007» в Волгограде (золотая медаль).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 работ, 4 из которых в изданиях, рекомендуемых перечнем ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, выводов, списка литературы, приложения. Основной объем работы составляет 155 страниц компьютерного текста, содержит 21 таблицу, 24 рисунка, ... приложений. Список литературы включает 239 источников, из них 72 - на иностранных языках.

Работа по молекулярно-генетическому анализу генома редких видов растений частично поддерживалась Программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Биологическое разнообразие» Раздел 2. Инвентаризация разнообразия растительного мира России.

ГЛАВА 1. НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ СОХРАНЕНИЯ РЕДКИХ И ИСЧЕЗАЮЩИХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ

1.1. Способы сохранения редких и исчезающих видов растений

Согласно данным "Национальной стратегии сохранения биоразнообразия России" (2001), наша страна играет ключевую роль в сохранении глобального биоразнообразия и поддержании биосферных функций, так как на ее территории сохраняется крупнейший массив природных экосистем и представлена значительная часть мирового видового разнообразия. Несмотря на относительное благополучие общего состояния биоразнообразия России, ряд типов экосистем и видов живых организмов находятся на грани исчезновения. Около 15% российской - -территории, = -на - которой -проживает 2/3 населения страны, оцениваются как экологически неблагополучные, со значительной степенью разрушения естественных экосистем и деградации почв. Большое число видов являются редкими и находящимися под угрозой исчезновения и требуют особого внимания.

Редкие и находящиеся под угрозой исчезновения виды растений, их популяции характеризуются различной структурой, экологическими нишами, циклами развития и функционирования. Для создания эффективных программ по сохранению отдельных видов и биоразнообразия в целом, необходимо определить принципы, то есть частные методологические подходы, и основные задачи, решение которых позволит определить стратегию сохранения объектов природы. На основании принципов определяются способы сохранения -совокупность основных методов и приемов по сохранению редких и находящихся под угрозой исчезновения видов, а на их основе - конкретные организационные и технические средства их реализации.

Как известно, существует два методических подхода к сохранению биоразнообразия растений: сохранение дикорастущих видов в естественных условиях (in situ) и искусственных (ex situ).

1.1.1. Сохранение редких и исчезающих видов растений в условиях in situ

Сохранение популяций редких и находящихся под угрозой исчезновения видов и контроль их состояния ставит определенные задачи.

Основными задачами в этой области являются поддержание численности популяций и видов, сохранение внутрипопуляционной структуры и поддержание популяционной структуры вида. Для этого необходимы: борьба с нелегальной эксплуатацией природных популяций редких видов; нормирование их использования в различных целях (рекреационных, научных, культурных и др.); проведение экологической экспертизы хозяйственных проектов, затрагивающих местообитания видов и влияющих на их численность.

Задачи по охране популяций редких и находящихся под угрозой исчезновения видов животного и р