Молекулярно-генетический анализ генофондов редких и исчезающих видов растений Пермского края

Боронникова, Светлана Витальевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетический анализ генофондов редких и исчезающих видов растений Пермского края
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ генофондов редких и исчезающих видов растений Пермского края"

00347308В На правах рукописи

БОРОННИКОВА СВЕТЛАНА ВИТАЛЬЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГЕНОФОНДОВ РЕДКИХ И ИСЧЕЗАЮЩИХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ ПЕРМСКОГО КРАЯ

Специальность 03.00.15 - генетика

- 8 ОКГ 2009

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Уфа - 2009

003479086

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Пермском государственном университете

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, академик РАСХН, профессор Драгавцев Виктор Александрович

Агрофизический научно-исследовательский институт РАСХН

доктор биологических наук, профессор Янбаев Юлай Аглямович

Башкирский государственный аграрный университет

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Путенихин Валерий Петрович

Учреждение Российской академии наук Ботанический сад-институт Уфимского научного центра РАН

Ведущее учреждение:

Институт общей генетики имени Н.И. Вавилова РАН

Защита состоится « ¿0 » HA&lWv, 200 9 г. в «J¿_» часов на заседании Диссертационного совета ДМ 002.133.01 по адресу: г.Уфа, 450054, пр. Октября, 71

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН и на сайтах ВАК РФ и ИБГ УНЦ РАН ibg.anrb.ru/dissov.html, e-mail: molgen@anrb.ru

Автореферат разослан « $.% » г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

С. М. Бикбулатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Сохранение биологического разнообразия занимает особое место среди глобальных проблем современности (Вахрамеева, 1988; Конвенция о биологическом разнообразии..., 1992; Алтухов, 1995; Динамика популяционных генофондов..., 2004). Основой биологического разнообразия является его генетическая компонента. Сокращение видового и генетического разнообразия представляет реальную угрозу для биосферы, поскольку устойчивость воспроизводства природных экосистем и агроэкосистем непосредственно связана с их генетически обусловленным потенциалом к адаптациям к меняющимся условиям окружающей среды (Мэгарран,1992; Глазко, 1998; Лебедева и др., 1999, Жученко, 2001, Динамика ..., 2004). К середине текущего столетия прогнозируется увеличение числа видов растений, находящихся под угрозой исчезновения, с 7 до 60 тысяч (Frankel, 1995; Стратегия сохранения ..., 2004).

одновременного молекулярного маркирования многих геномных участков, которые могли бы позволить создавать «геномный портрет» каждого отдельного индивидуума и, таким образом, наиболее объективно оценивать своеобразие генофондов популяций. Особую важность разработка таких методов имеет для решения главной проблемы в поддержании биоразнообразия - отбора наиболее типичных представителей популяций и создания генетически обоснованных программ по их сохранению. К настоящему времени у редких эндемичных видов растений Урала изучен ряд характеристик внутривидовой изменчивости (Кучеров, Щелокова, 1987; Кучеров и др., 1993; Янбаее и др., 2000; Янбаев и др., 2007), но практически не исследована генетическая изменчивость травянистых реликтовых редких видов растений, в том числе и в Пермском крае.

Актуальность диссертационной работы обусловлена:

а) недостаточной теоретической разработанностью молекулярно-генетических подходов к изучению геномов дикорастущих редких видов растений, представленных популяциями с низкой численностью;

б) важностью определения молекулярно-генетических основ генетического разнообразия редких видов растений на популяционном уровне;

в) отсутствием экспериментальных методов молекулярного маркирования многих участков геномов редких видов растений, пригодных для массового анализа;

г) недостатком методов для оптимизации сохранения генофондов редких и исчезающих видов растений.

Цель и задачи исследования

Цель работы - разработать принципы множественного молекулярно-генетического геномного маркирования и технологию идентификации и паспортизации генофондов редких реликтовых видов растений Пермского края в качестве модельной системы оптимизации сохранения генофондов редких и исчезающих видов растений.

Для достижения цели были поставлены следующие основные задачи:

1. Подобрать наиболее полиморфные стабильные ДНК-маркеры и разработать методы оценки мультилокусного полиморфизма ДНК с целью оптимизации исследования генофондов популяций редких и исчезающих видов растений.

2. Исследовать генетическое разнообразие популяций некоторых редких реликтовых видов растений, распространенных на территории Пермского края.

3. Определить общую и эффективную численность популяций, способ размножения и семенную продуктивность некоторых редких реликтовых видов растений.

4. Установить популяции с типичными и специфическими характеристиками генофондов.

5. Разработать методику и провести молекулярно-генетическую паспортизацию (ключевого звена технологии идентификации генофондов редких и исчезающих видов растений), на модельных редких реликтовых видах растений Пермского края.

Положения, выносимые на защиту

1. Наиболее эффективным для оценки генетического разнообразия популяций редких и исчезающих видов растений является использование ДНК-фингерпринтинга (анализа полилокусных спектров) высоко полиморфных и стабильных ISSR- и IRAP-маркеров.

2. Оптимизация сохранения генофондов редких и исчезающих видов растений возможна с учетом показателей генетического разнообразия, установленных по результатам молекулярного маркирования множественных геномных участков, а также с обязательным учетом уровней внутри- и межпопуляционного разнообразия.

3. Для сохранения генофондов редких и исчезающих видов растений рекомендуются отбор в природных условиях популяций и их групп как с наиболее типичными, так и со специфичными характеристиками генофондов.

4. Для оптимизации сохранения генетического разнообразия на популяционном уровне необходима молекулярно-генетическая идентификация и паспортизация генофондов редких и исчезающих видов растений, позволяющая на основании оценок полилокусного сочетания моно- и полиморфных участков ДНК составить молекулярно-генетическую формулу, иггрих-код популяций и обобщить данные в виде генетического паспорта.

Научная новизна полученных результатов

сибирского Adonis sibirica Patrin ex Ledeb., бубенчика лилиелистного Adenophora lilifolia (L.) A.DC., пиона уклоняющегося Paeonia anómala L., наперстянки крупноцветковой Digitalis grandiflora Mill. Впервые оценена эффективность в исследованиях генофондов редких видов растений IRAP-метода, основанного на использовании в полимеразной цепной реакции (ПЦР) в качестве праймеров терминальных последовательностей ретротранспозонов. С целью анализа геномов редких реликтовых видов растений были клонированы и секвенированы последовательности ДНК пяти редких видов растений Пермского края. Нуклеотидные последовательности LTR-ретротранспозонов некоторых редких видов растений были включены в мировую базу генетических данных GenBank NCBI под номерами: EF191000-EF191012 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

С целью изучения взаимосвязи генетического разнообразия с показателями численности выявлены общая и эффективная численность популяций и изучены биологические особенности модельных реликтовых редких видов растений, такие как преимущественный способ опыления, способ и эффективность размножения. Даны характеристики изученных популяций с определением степени антропогенного воздействия в соответствии с рекомендациями, разработанными автором диссертационной работы. С целью оптимизации сохранения генофондов редких и нуждающихся в охране видов растений разработана методика молекулярно-генетической паспортизации на популяционном уровне, которая включает в себя анализ полиморфизма стабильных ISSR- и IRAP-маркеров, выявление идентификационных мономорфных (родовых и видовых) и полиморфных фрагментов ДНК, составление молекулярно-генетической формулы, штрих-кода и генетического паспорта. Анализ генетического разнообразия редких видов растений на основании оценки полиморфизма ISSR- IRAP-маркеров предложен в качестве критерия оценки состояния их генофондов. На основании полученных данных рекомендованы научно обоснованные меры сохранения генофондов изученных редких реликтовых видов растений и разработаны подходы оптимизации сохранения генофондов редких и нуждающихся в охране видов растений.

Практическая значимость и реализация результатов исследований

Поддержание исторически сложившегося уровня генетического разнообразия популяций как основы сохранения их адаптационного потенциала в естественно колеблющейся и антропогенно трансформированной среде является необходимым условием их существования и развития. Изучение генетической изменчивости природных популяций, оценка их состояния позволяют рекомендовать научно обоснованные меры сохранения популяций редких видов растений.

Разработанная технология идентификации генофондов и ее ключевое звено (методика молекулярно-генетической паспортизации) позволяют оптимизировать сохранение генофондов растений, включая редкие и исчезающие виды растений. Научные выводы работы и рекомендации непосредственно используются при проведения мониторинга популяционного разнообразия редких и нуждающихся в охране видов растений Пермского края, так как автор диссертационной работы является куратором пяти редких реликтовых видов растений от Управления по охране окружающей среды Пермского края. На основании анализа динамики показателей численности и генетического разнообразия бубенчик лилиелистный (АЛепорИога ИП/оНа (Ь.)А.ОС.) внесен в Красную книгу Пермского края (2008). Результаты и выводы исследований могут быть использованы для сохранения генофондов редких и нуждающихся в охране видов растений и оптимизации сохранения генетического разнообразия на популяционном уровне и в других регионах страны.

Теоретические и практические результаты исследований используются при преподавании учебных дисциплин и специальных курсов студентам Новосибирского, Уральского, Челябинского и Пермского государственных университетов, а также Калининградского технического университета, что подтверждено справкой и актами внедрения результатов исследований в учебный процесс.

Связь работы с научными программами

Диссертационная работа выполнялась в ходе подготовки и реализации ПГУ приоритетного инновационного национального проекта «Образование» в части «Молекулярная генетика». Популяционно-генетические исследования были частично связаны с последовательным циклом программ Управления по охране окружающей среды Пермской области (2006 г): гос. контракты № 6/2006 от 03.04.2006, № 90203 от 10.04.2006, № 90202 от 01.06.2006, № 90211 от 01.06.2006; а также Министерства градостроительства и развития инфраструктуры Пермского

края: гос. контракты № 65-0 от 20.06.2007, № 56/1-0 от 13.06.2007, № 11-0 от 18.02.2008, № 43-0 от 17.03.2008.

Часть исследований проводились в связи с тематикой гранта РФФИр_урал_а № 07-04-96032 «Динамика генетического разнообразия и структуры популяционных систем ресурсных растений Пермского края при антропогенных воздействиях» (2006-2009 гг.), гранта РФФИр_урал_а №07-04-96016 «Влияние нефтяных загрязнений почв на популяции микроорганизмов и растений Пермского края» (2006-2009 гг.), гранта РФФИ АНФ_з №08-04-92673 «Участие в российско-австрийском семинаре «Молекулярно-генетические маркеры, филогеография и популяционная генетика для устойчивого лесного хозяйства: Евроазиатская перспектива» (2008-2009 гг.).

Личный вклад автора

Разработка подходов и программы молекулярно-генетических исследований; выбор типов молекулярных маркеров и объектов исследований; планирование, организация и проведение полевых и лабораторных исследований; обработка, обобщение и интерпретация представленных в диссертационной работе результатов, их сопоставление с литературными сведениями, разработка теоретических положений; подготовка практических рекомендаций и публикаций, написание и оформление текста диссертации проведены лично автором работы. Идея создания концепции идентификации генофондов, разработка методики молекулярно-генетической паспортизации, выявление мономорфных и полиморфных идентификационных фрагментов ДНК, а также составление молекулярно-генетической формулы и молекулярно-генетического паспорта единолично принадлежат автору диссертационной работы. Для гетерогенных природных популяций растений диссертантом предложена запись молекулярно-генетической формулы в виде штрих-кода. Автор диссертационной работы является инициатором и одним из соавторов обоснования внесения Ас1епорЬога 1Ш/оНа (Ь.) А.ОС. в Красную книгу Пермского края (2008) с категорией угрожаемого состояния 3 (Я) - редкий вид. Результаты части исследований, проведенных совместно с соискателями и аспирантами диссертанта, опубликованы; ссылки на них приведены в соответствующих разделах работы.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены и доложены на Втором республиканском совещании семинаре «Содержание и формы экологического образования в педвузе» (Пермь, 1990), IX Всесоюзном совещании по 8

семеноведению интродуцентов «Репродуктивная биология интродуцированных растений» (Умань, 1991), межвузовской научной конференции «Охраняемые природные территории. Проблемы выявления, исследования, организации систем» (Пермь, 1994), 2-й Международной научно-практической конференции «Экология и охрана окружающей среды» (Пермь, 1995), симпозиуме «Проблемы репродуктивной биологии растений» (Пермь, 1996),V научной конференции памяти проф. A.A. Уранова «Популяции и сообщества растений: экология, биоразнообразие, мониторинг» (Кострома, 1996), популяционном семинаре «Жизнь популяций в гетерогенной» (Йошкар-Ола, 1998), XI съезде Русского ботанического общества «Ботанические исследования в азиатской России» (Барнаул, 2003), Proceedings of the IV Balkan Botanical Congress (Sofia, 2006), VII Международном симпозиуме «Нетрадиционные и редкие растения, природные соединения и перспективы их использования» (Белгород, 2006), Всероссийской научной конференции «Ботанические исследования в Поволжье и на Урале» (Саратов, 2006), Международной конференции «Генетика в России и мире», посвященная 40-летию Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН (Москва, 2006), Международной научно-практической конференции «Антропогенная динамика природной среды» (Пермь, 2006), IV Международной научной конференции «Биотехнология - охране окружающей среды» (Москва, 2006), Четвертом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007), Всероссийской конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века» (Петрозаводск, 2008), Международной научно-практической конференции «Нанобиотехнологии в сельском хозяйстве» (Москва, 2008), Пятом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009), Съезде генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина, Пятом Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009).

Публикации

Диссертантом по теме диссертации опубликовано 64 научные работы, в их числе 12 статей в ведущих рецензируемых журналах из перечня ВАК, 10 статей в других журналах, 29 статей в материалах конференций, 1 учебно-методическое пособие и 2 монографии, в одной из которых диссертант является соавтором.

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, семи глав — обзор проблемы, объекты и методы исследований, 5 глав результатов и их обсуждения, выводов. Список литературы включает 306 источников, в том числе 196 отечественных и 110 иностранных. Диссертационная работа изложена на 356 машинописных страницах, содержит 66 таблиц, 51 рисунок и приложения.

Благодарности

Автор выражает искреннюю признательность за помощь при обучении, повышении квалификации, освоении современных методов молекулярно-генетического анализа, подготовке диссертационной работы и консультации с.н.с. лаборатории гетерозиса растений ИЦиГ СО РАН В.И. Коваленко и зав. лабораторией академику РАН В.К. Шумному, академику РАЕН, РАСХН (иностранный член) В.И. Глазко и проф. Т.Т. Глазко; проф. каф. ботаники и генетики растений ПГУ В.А. Верещагиной, Н.В. Москвиной, зав. кафедрой ботаники и генетики растений ПГУ проф. С.А. Овеснову; сотрудникам группы проф. С.А. Гостимского (особенно с.н.с. З.Г. Кокаевой) и всей кафедре генетики Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова; зав. лабораторией растительной геномики Института биотехнологии университета Хельсинки (Финляндия) проф. А.Х. Шульману и доц. Р.Н. Календарю; зав. лабораторией популяционной генетики ИОГен имени Н.И. Вавилова РАН д.б.н. Д.В. Политову. Выражается искренняя благодарность соавторам по публикациям, а также всем, кто поддерживал и поддерживает развитие молекулярно-генетических исследований в ПГУ.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследований

В качестве основных объектов исследований избраны пять реликтовых редких видов растений, распространенных в Пермском крае: адонис весенний Adonis vernalis L. и адонис сибирский Adonis sibirica Patrin ex Ledeb. из семейства Ranunculaceae, наперстянка крупноцветковая Digitalis grandiflora Mill, из семейства Scrophulariaceae, пион уклоняющийся Paeonia anómala L. из семейства Paeoniaceae, бубенчик лилиелистный Adenophora lilifolia (L.) A.DC. из семейства Campanulaceae с категорией угрожаемого состояния 3 (R) (Горчаковский и др., 1982; Красная книга Среднего Урала, 1996; Красная книга Пермского края, 2008).

Эти виды являются реликтами (Белковская и др., 1988; Камелин и др., 1999). Проведены комплексные исследования 27-ми природных популяций (82 выборки) редких видов растений. Для изучения генетического разнообразия A. vernalis из разных частей Кунгурской островной лесостепи избраны 10 популяций, в том числе самая северная популяция Av2, расположенная на Спасской горе в Кунгурском районе. На территории Ординского района находятся 4 популяции: Avl, Av3, Av4 и AvlO, в Уинском районе - одна (Av7). Южная группа представлена популяциями Октябрьского района: Av5, Av6, Av8 и Av9. Для анализа генетического разнообразия A. sibirica избраны 3 популяции из разных частей Пермского края: As J из центральной (Добрянский район), As2 - из юго-западной (Кишертский район), a As3 - из северной части (Ильинский район). Первая популяция Ad. liilifolia (Ad.lil.l) приурочена к северному участку островной Кунгурской лесостепи; вторая (Ad.lil.2) и третья (Ad.lil.3) популяции находятся в юго-западной, а четвертая (Ad.lil.4) - в северной части края. Для изучения динамики численности и генетического разнообразия D. grandiflora были избраны 5 популяций в разных районах Пермского края: первая (Dgl) расположена в Кишертском районе, вторая (Dg2) - на Спасской горе Кунгурского района, 3 популяции (Dg3, Dg4, Dg5) - в Октябрьском районе. Популяции P. anomala находятся в центральной части Пермского края: Pal в Чусовском, Ра2 в Добрянском, а РаЗ в Губахинском районах. Для апробации ISSR- и IRAP-методов анализа полиморфизма ДНК помимо редких видов растений были использованы некоторые широко распространенные травянистые виды растений и один широко распространенный древесный вид Populus tremula L.

Разработка методики молекулярно-генетической паспортизации редких видов растений с целью оптимизации сохранения их генофондов проведена на примере двух видов рода Adonis (A. vernalis, A. sibirica) (Боронникова, 2008), а ее апробация - на примере как редких, так и широко распространенных видов растений рода Adenophora (бубенчик лилиелистный Adenophora lilifolia (L.) A.DC., бубенчик трехлистный Adenophora triphylla A.DC.), рода Digitalis (наперстянка крупноцветковая Digitalis grandiflora Mill., наперстянка пурпуровая Digitalis purpurea L., наперстянка ресничатая Digitalis ciliata Trautv., наперстянка шерстистая Digitalis lanata Ehrh., наперстянка желтая Digitalis lutea L.).

Полевые исследования проводились с использованием традиционных методов, применяемых в ботанике, молекулярной и популяционной генетике. С 1988 по 2005 гг. проведены исследования биологических особенностей редких

видов растений, определение их семенной продуктивности (Работнов, 1960; Вайнагий, 1973), возрастного состава эффективного размера популяций (Хедрик, 2003), а также подсчет общей (N) (Голубев и др., 1978; Денисова и др., 1986) и эффективной (Ne) численности популяций (Вахрамеева, 1981; Алтухов, 2004); а с 1994 по 2009 гг. - анализ генофондов (Lewontin, 1972; Nevo, 1987; Chalmers, 1992; Алтухов, 1995, 2003; Хедрик, 2003; Артюкова и др., 2004; Динамика..., 2004). Определение степени антропогенного воздействия на изученные популяции редких видов растений проведено по разработанным автором рекомендациям (Боронникова, 2008).

Для анализа молекулярно-генетического полиморфизма ДНК были собраны листья с 30-ти случайно выбранных растений в каждой популяции на расстоянии от 30-ти до 50-ти м друг от друга. Для выделения ДНК использовали методику A.M. Торрес (Torres et al., 1993) с незначительными модификациями. С целью молекулярно-генетического анализа ДНК выделена из более 1520 образцов листьев редких видов растений, а так же с целью молекулярно-генетической паспортизации дополнительно из 1240 образцов проростков, почек возобновления и листьев.

Анализ молекулярно-генетического полиморфизма ДНК, включая основные его стадии, проведен в молекулярно-генетической лаборатории кафедры ботаники и генетики растений ПГУ с использованием ISSR- (Inter Simple Sequence Repeats, Zietkiewicz et al., 1994) и IRAP- (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism, Kalendar et al., 1999) методов с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР). С целью разработки праймеров для IRAP-анализа полиморфизма ДНК в лаборатории растительной геномики Института биотехнологии университета Хельсинки (Финляндия) проведены клонирование и секвенирование последовательностей ДНК пяти редких видов растений. Клонирование последовательностей ретротранспозонов осуществляли с помощью нового универсального метода (Kalendar et al., 2008), основанного на использовании ПЦР с праймерами из консервативного участка связывания tRNA (PBS, Primer Binding Site), непосредственно прилегающего к левому прямому повтору LTR (Long Terminal Repeats) в центральной части ретротранспозона.

Продукты амплификации с универсальными PBS-праймерами были клонированы в pGEM-T («Promega», USA) плазмидный Т-вектор после очистки в QIAGEN («MinElute PCR Purification Kit»), Цитирование проводили при 16°С в

течение 12 часов. Трансформацию плазмидной ДНК со вставками осуществляли с использованием компетентных клеток E.coli штамма JM109 («Promega», USA). Клетки, несущие плазмиду со вставкой фрагмента чужеродной ДНК, были выявлены путем бело-синей селекции на среде с ампициллином в конечной концентрации 100мкг/мл, X-Gal (20мг/мл) и IPTG (200мг/мл). Проверка pGEM вектора на наличие клонированных ПЦР-продуктов проведена с помощью ПЦР с универсальными праймерами (М13 universal и reverse).

Секвенирование последовательностей ДНК проведено с использованием капиллярного секвенатора ABI3700 («Biosystems», USA). В соответствии с консервативными участками LTR-ретротранспозонов в различных ориентациях были разработаны праймеры с использованием программы FastPCR (Календарь, Боронникова, 2007). Для IRAP-анализа пяти редких видов синтезированы 70 праймеров в «MWG Biotech AG» (Germany).

С целью разработки первого варианта IRAP-метода проанализирован полиморфизм геномных участков пяти редких видов растений с использованием 70 IRAP-праймеров. Эффективность выявления полиморфизма IRAP-праймерами рассчитана для A. vernalis, A. sibirica, Ad. lilifolia, D. grandiflora, P. anómala в соответствии с предложенной нами (Календарь, Боронникова, 2007) шкалой (1-5): от низкой (1) до высокой (5). Амплификация ДНК IRAP- и ISSR-методами была выполнена в термоциклерах MJ Mini-Cycler («Bio-Rad», USA) и Терцик («ДНК-Технология», Москва) по типичным для IRAP- и ISSR-методов программам (Молекулярная генетика, 2007). Для проверки достоверности полученных спектров ДНК опыт повторяли не менее четырех раз. Амплифицированные продукты были подвергнуты электрофорезу в 1.7-2% агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Гели были отсканированы в системе гель-документации Gel-Doc XR («Bio-Rad», USA). Для определения длины фрагментов ДНК использовали маркер молекулярной массы 100 bp +1.5 + 3 Kb DNA Ladder («ООО-СибЭнзим-М», Москва) и программу Quantity One («Bio-Rad», USA). У четырех редких реликтовых видов растений проведен анализ полиморфизма 350 ISSR- и 450 IRAP-маркеров, том числе 219 IRAP-маркеров у двух видов рода Adonis.

Для количественной оценки степени полиморфизма и определения уровня дивергенции между изученными популяциями, полученные данные были представлены в виде матрицы бинарных признаков, в которой наличие или отсутствие в ISSR- и IRAP-спектрах одинаковых по размеру фрагментов

рассматривалось, соответственно, как состояние 1 или 0. При этом учитывали только воспроизводимые в повторных экспериментах фрагменты, изменчивость по интенсивности не брали в расчет. Компьютерный анализ молекулярно-генетического полиморфизма ДНК проведен с помощью программы POPGENE 1.31 (Yeh et al., 1999) и специализированного макроса GenAlExô (Peakall, Smouse, 2006) для MS-Excel с определением: доли полиморфных локусов (Williams et al., 1990) при Р„, общего числа аллелей («,), эффективного числа аллелей (пе) (Kimura et al., 1964), ожидаемой гетерозиготности (Я£) (Nei, 1987).

Уровень внутрипопуляционного разнообразия оценен через показатели среднее число морф (ц) и доля редких морф (А) (Животовский, 1980). Объемы использованных выборок в среднем составляли 30 особей. Оценку отклонения наблюдаемых распределений генотипов от ожидаемых при равновесии Харди-Вайнберга проводили с использованием теста хг ■ Оценка генетического разнообразия внутри и между популяциями редких видов растений проведена с использованием информационной мера Шеннона (Schennon, 1949; Lewontin, 1972; Chalmers, 1992), которая не предусматривает существование в популяциях равновесия Харди-Вайнберга и традиционно применяется (Артюкова и др., 2004) при молекулярно-генетическом анализе редких видов растений. Индекс разнообразия Шеннона рассчитывали для каждой популяции (Я ), среднее значение для популяций (Ни) и для суммарной выборки (Н!р), на основе этих значений определяли долю внутри- и межпопуляционного разнообразия. Для описания генетической структуры подразделенной популяции были использованы следующие параметры: ожидаемая доля гетерозиготных генотипов (Нт) во всей популяции, как мера общего генного разнообразия; ожидаемая доля гетерозиготных генотипов (I/s ) в субпопуляции, как мера ее внутрипопуляционного разнообразия; доля межпопуляционного генетического разнообразия в общем разнообразии или показатель подразделенное™ популяций (GST) (Nei, 1975). Генетическое расстояние между популяциями (£>) определяли по формулам М. Нея (Nei, 1978; Nei, Li, 1979). На основе матриц бинарных признаков были рассчитаны матрицы генетических различий (Nei, 1972), на основании полученной матрицы невзвешенным парно-групповым методом (UPGMA - unweighed pair-grup method using arithmetic average) были построены дендрограммы, отражающие степень родства исследуемых популяций по ISSR- и

IRAP-спектрам при помощи компьютерных программ Treecon 1.3Ь и POPGENE 1.31. Молекулярно-генетичеекая паспортизация проведена по разработанной автором методике (Боронникова, 2008). Проверка всех выявленных идентификационных молекулярных маркеров у исследованных видов проведена не менее 5-ти раз. Статистические анализы выполнены при помощи программ STATISTICA 6.0 (версия 6.0.) и MS EXCEL. Статистическая обработка данных молекулярно-генетического анализа проведена с использованием стандартных для популяционно-генетических исследований методов (Животовский, 1983, 1990; Лакин, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Биологические особенности редких реликтовых видов растений и характеристика избранных для изучения популяций

1.1. Adonis vernalis L.

В Пермском крае отмечено 19 местонахождений A. vernalis. За последние 15 лет общая численность этого вида сократилась на 20-25% (Боронникова, 2008). Вид в природных условиях размножается только семенным путем. Показано, что основной вклад в семенное размножение A. vernalis вносят средневозрастные генеративные особи (g2), составляющие эффективную численность популяций. Установлено, что к популяциям с низкой общей численностью относятся Av3, Av6, Av7, Av8, AvlO (от 39 в Av7 до 184 особей в Av6), а к популяциям с высокой общей численностью - Avl, Av2, Av4, Av5, Av9 (от 248 в Av2 до 562 особей в Avl). Показано, что в изученных популяциях A. vernalis с низкой общей численностью эффективная численность варьировала от 8 (Av7) до 65 особей (Av8), а в популяциях с высокой общей численностью эффективная численность изменялась от 67 (Av2) до 194 (Av9) особей. Популяции Av3 , Av6, Av7 и AvlO находятся под антропогенным воздействием сильной степени, популяции Av, Av2, Av5 и Av8 -средней, a Av4 и Av9 - слабой степени.

1.2. Adonis sibirica Patrin ex Ledeb.

В Пермском крае выявлено 16 местонахождений A. sibirica. Размножение этого вида в естественных условиях происходит только семенным путем. Установлено, что как и у A. vernalis, так и у A. sibirica принимают участие в семенном размножении преимущественно средневозрастные генеративные особи (g2). Общая численность в Asi составила 22 особи, в As2 - 246, в As3 - 257 особей.

В Asi к настоящему времени эффективная численность равна 3-м особям, в As2 и As3 - 89 и 77 особям соответственно. С ¡994 по 2008 тт. из-за строительства горнолыжной трассы общая численность Asi сократилась на 75.00 %, а эффективная численность - на 85.71% (рис. 1). Исследованные популяции А. sibirica находятся под антропогенным воздействием Asi сильной, As2 средней и As3 слабой степени.

1.3. Paeonia anómala L.

В северной части Пермского края Р. anómala представлен популяциями с большой стабильной численностью. В центральной части края из-за антропогенного воздействия численность популяций сокращается. Общая численность Pal составила 975 особей, а эффективная - 190 особей. Общая численность Ра2 в 1988 составляла 562 особи (Боронникова, 2002), а в 2008 году -377 особей, то есть за 20 лет сократилась на 41.04%. Эффективная численность популяции за этот же период сократилась с 402 до 224 особей, то есть на 44.28% (рис. 1). Одной из причин сокращения показателей численности Ра2 является усиление антропогенного воздействия в связи со строительством новой автомобильной трассы в 1 км от местонахождения Ра2. В РаЗ общая численность составила 441 особь, а эффективная - 146 особей. По нашим данным в природе Р. anómala размножается только семенным путем (Боронникова, 2002). Нами установлено, что в семенном размножении у Р. anómala принимают участие особи g2 , редко g,. Изученные популяции находятся под антропогенным воздействием средней степени, кроме Ра2, которая испытывает антропогенное воздействие сильной степени.

Asi Ра2

□ Общая численность ш Эффективная численность

Рис. 1. Динамика общей и эффективной численности первой популяции (Asi) А. sibirica и второй популяции (Ра2 ) Р. anómala

1.4. Adenophora lilifolia (L.) A.DC.

Общая численность вида в крае сократилась за последние 10 лет в среднем на 15-20% (Боронникова, 2008). В изученных популяциях Ad. lilifolia этот показатель варьировал от 59 особей в Ad.lil.4 до 293 особей в Ad.lil.l, а эффективная численность - от 36 в Ad.lil. 4 до 239 особей в Ad.lil.l. По нашим данным размножение вида в природе осуществляется и семенным и вегетативным, то есть комбинированным способом (Боронникова, 1999). Наибольший вклад в семенную продуктивность вносят особи g2 и g3, которые и определяют эффективную численность популяций. Сильную степень антропогенного воздействия испытывает популяция Ad.lil.4, среднюю - Ad.lil. 1, а слабую - Ad.lil.2 к Ad.lil.3.

1.5. Digitalis grandiflora Mill.

D. grandiflora на территории Пермского края встречается, в основном, в островной Кунгурской лесостепи, где и отмечено 12 местонахождений этого вида. Общая численность изученных популяций D. grandiflora варьировала от 56 (Dg3) до 487 особей (Dgl), а эффективная - от 40 до 304 особей соответственно. Для вида характерен комбинированный (семенной и вегетативный) способ размножения. При анализе показателей семенной продуктивности особей D. grandiflora разных возрастных групп генеративного периода было отмечено, что у средневозрастных особей показатели выше, чем у особей остальных групп (Боронникова и др., 20096). Эффективная численность у данного вида представлена особями g2 и g,. Изученные популяции D. grandiflora находятся под антропогенным воздействием сильной (Dg3), средней (Dgl, Dg2, Dg4) и слабой степени ([Dg5').

Таким образом, избранные для изучения пять редких реликтовых видов представлены в Пермском крае, кроме Р. anómala, небольшим числом популяций с низкой численностью. Три из изученных видов (A. vernalis, A. sibirica, Р. anómala) размножаются только семенным путем. Для Ad. lilifolia и D. grandiflora характерен комбинированный (и семенной и вегетативный) способ размножения. Эффективная численность популяций выявлена благодаря изучению участия в семенном размножении особей разных возрастных групп генеративного периода. Самые низкие значения данного показателя характерны для видов рода Adonis (три особи у A. sibirica и восемь особей у A. vernalis), а самые высокие - для Р. anómala (от 146 до 224 особей).

2. Анализ генофондов редких видов растений на основании оценок полиморфизма фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными микросателлитными повторами (ISSR-PCR маркеры)

2.1. Анализ генетического разнообразия популяций двух видов рода

Adonis

В изученных популяциях A. vernalis выявлено 109 амплифицированных ISSR-фрагментов ДНК, из которых 100 были полиморфными (Боронникова, Тихомирова, 2008а). Число амплифицированных фрагментов ДНК в общей выборке растений варьировало в зависимости от праймера от 19 (М9) до 29 (М12). В среднем при ISSR-анализе у A. vernalis один праймер инициировал синтез 22-х фрагментов ДНК. Число полиморфных ISSR-фрагментов A. vernalis варьировало от 16 до 29, а их размеры - от 210 до 1900 пн (рис. 2).

М 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1S 19

MW . ч* Ж- Ш г. • fft

Рис. 2. ISSR-cпeктp популяции Л^егпа115 (Лу7) с праймером М1: цифрами обозначены номера проб, М - маркер молекулярного веса, стрелками указаны некоторые полиморфные фрагменты ДНК; представлена часть спектра

Доля полиморфных локусов в общей выборке в среднем (при Р95) составила 91.74%. В популяциях данный показатель варьировал от 34.86% в Av2 до 62.39% в Av6. Ожидаемая гетерозиготность А. vernalis по локусам (НЕ) равна 0.290. Самое высокое значение этого показателя в Ау9 (Не=0.245), а самое низкое - в Ау7 (Я£=0.113). Абсолютное число аллелей на локус (в нашем случае на фрагмент ДНК) на общую выборку (л0) составило 1.973, а эффективное число аллелей на локус (пе) - 1.499. Число редких аллелей (фрагментов ДНК с частотой <=0.05) варьировало по популяциям от 0 {Ау4, Ау7, АуЮ) до 8 (Ау6).

Генетическая структура изученных популяций А. vernalis характеризуется тем, что ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в общей популяции выше (Я,. =0.301), чем в субпопуляциях (Д; =0.181). Коэффициент подразделенности популяций (С5Г) показывает, что на межпопуляционную компоненту 18

генетического разнообразия А. чегпаШ приходится 39.90% разнообразия, то есть изученные популяции сильно дифференцированы (Боронникова и др., 2009в). Наименьшее генетическое расстояние между популяциями А. уетаНя отмечено между Ау7 и АуЮ и (0=0.015), а наиболее генетически удаленными являются популяции Ау4 и А\>7 (£>=0.441), Ау4 и АуЗ(£>=0.430) и Ау4 и АуЮ (£>=0.424). На дендрограмме (рис. 3) популяции А. уетаИ.1; сформировали три кластера: в первом кластере к трем популяциям примыкает четвертая, второй и третий кластеры включают по 3 популяции. Узлы ветвления имеют высокую поддержку (индекс бутстрепа >90%).

0.4

—ь-

оз

—I—

0.2

"Г

100Г

100

- ау7

- а vi0

- а\3 ау1

Л\2

- а«5 ау8

- ау5

- Л\4 л\ч

Рис. 3. 1ЛЮМА дендрограмма генетического сходства 10 популяций А. уегпаШ, построенная на основании полиморфизма 18811-маркеров. Шкала сверху -генетические дистанции. На дендрограмме указаны значения бутстрепа (в %)

Среднее значение индексов разнообразия Шеннона (Но) в изученных популяциях А. \ernalis, рассчитанные по 188Я-праймерам, составило 0.274. Высоки эти показатели в Ау9 (0.363) и в А\5 (0.361). Индекс разнообразия Шеннона, рассчитанный на общую популяцию А. уегпаШ, равен 0.462. На долю внутрипопуляционного генетического разнообразия А. уегпаШ приходится 59.58%, а на долю межпопуляционного - 40.42%. Итак, оба подхода к определению генетического разнообразия, то есть определение показателя подразделенности популяций и коэффициента разнообразия Шеннона (#о) у А. уегпаНя дали близкие результаты (Боронникова, Тихомирова, 2008а; Боронникова и др., 2009в). Таким образом, самые высокие показатели генетического разнообразия отмечены в популяциях Октябрского района (Ау4, Ау5, Ау9), а самые низкие показатели - в самой северной популяции на Спасской горе (АVI) и в популяциях с низкой общей и эффективной численностью (Ар7,

AvlO). Необходимо сохранение как генетически уникальной Av2, в которой отмечены семь редких аллелей.

Полиморфизм структурных элементов генома A. sibirica был выявлен с использованием тех же ISSR-праймеров, что и у A. vernalis. В трех изученных популяциях A. sibirica при помощи ISSR-праймеров были получены 74 ампликона (существенно меньше, чем у A. vernalis), из которых 66 были полиморфными (Рк =89.19%). Размеры ампликонов у A. sibirica варьировали от 270 до 1620 пн. В среднем при ISSR-анализе у A. sibirica один праймер инициировал синтез 14.8 фрагментов ДНК, что значительно меньше, чем у A. vernalis (22 ампликона). Высокий процент полиморфизма ISSR-маркеров отмечен в As3 (Л,, =81.08%), а самый низкий - в Asi (Р95 =35.13%). Низкие значения ожидаемой гетерозиготности отмечены в Asi (//^ =0.142), а высокие - в As2 (//¿=0.243). В общей популяции А. sibirica ожидаемая гетерозиготность выше и составила 0.356. Абсолютное число аллелей на локус («„) на общую выборку A. sibirica составило 1.914. Этот параметр выше в As2 и ниже в Asi. Эффективное число аллелей на локус на общую популяцию составило 1.608. Наибольшее значение данного показателя отмечено в As3 («„=1.409), а его резкое снижение - в Asi (/¡,=1.257). Наибольшее число редких аллелей отмечено в As3 (R= 11). Редкие аллели отсутствуют в Asi, что свидетельствует об обеднение генофонда этой популяции. Генетическая структура популяций A. sibirica такова: ожидаемая доля гетерозиготных генотипов выше в общей популяции (Яг =0.334), чем в субпопуляциях (Я5 =0.214). Показатель генетической подразделенности популяций {GST) A. sibirica равен 0.358. Генетически более гетерогенна As3 (Р95 =81.08%; Я£=0.235; пе=1.409), а наименьшие основные показатели генетической изменчивости отмечены в Asi =35.13%; #,,=0.145; ле=1.257). Таким образом, на межпопуляционную изменчивость у A. sibirica приходится 35.77% генетического разнообразия. Наибольшее генетическое расстояние отмечено между As2 и As3 (D =0.290), а наименьшее - между Asi и As2 (D =0.166). Кластерный анализ показал, что Asi генетически ближе к As2. Третья популяция (As3J находится на большем генетическом расстоянии от первых двух популяций и характеризуется наименьшей степенью родства с ними. Среднее значение индексов разнообразия Шеннона (Яо ) в изученных популяциях A. sibirica, рассчитанных по ISSR-праймерам, составило 0.292. Выше этот показатель в As3. Индекс Шеннона,

рассчитанный на общую популяцию A. sibirica, равен 0.504. На долю внутрипопуляционного генетического разнообразия A. sibirica приходится 59.55%, а на долю межпопуляционного - 40.45% разнообразия.

Таким образом, молекулярно-генетический анализ двух видов рода Adonis показал, что полиморфизм ISSR-маркеров высок у обоих видов (91.74% у A.vermalis и 89.19% у A. sibirica). У A. vernalis большая часть генетической изменчивости (по данным G -статистики) является внутрипопуляционной (60.10%), на межпопуляционную изменчивость приходится 39.90% генетического разнообразия. У A. sibirica сохраняется та же тенденция: внутрипопуляционная изменчивость составляет большую часть (64.23%), на межпопуляционную изменчивость данного вида приходится 35.77% генетического разнообразия. Среди изученных популяций A. vernalis деградация генофонда отмечена в Av7 (Р95 =36.70%; НЕ =0.113; и,=1.181;Л =0) и в AvlO (Р„ =35.27%; Я£=0.119; п=\Л9Ъ\R =0), а тенденция к обеднению генофонда - в Av2 (Р95=34.86%; Я£=0.122; «е=1.199; R =7). Среди изученных популяций A. sibirica деградация генофонда выявлена у Asi (P,s=35.13%; Яг =0.145; /¡„=1.257; Л =0). Данная популяция находится в критическом состоянии и требует экстренных мер охраны.

2.2. Анализ генетической изменчивости Adenophora lilifolia (L.) A.DC

У Ad. lilifolia выявлено 56 амплифицированных ISSR-фрагментов ДНК, из которых 46 были полиморфными. Число амплифицированных фрагментов ДНК в общей выборке растений варьировало в зависимости от праймера от 9 (праймеры М8, Х10) до 15 (праймер М1), а их размеры - от 280 до 1370 пн. В среднем один праймер инициировал синтез 11 фрагментов ДНК. Доля полиморфных локусов в общей выборке в зависимости от ISSR-праймера колебалась от 75.00% в Ad.lil.4. до 90.91% в Ad.lil.l и, в среднем, составила /',„=82.14 %. Ожидаемая гетерозиготность Ad. lilifolia составила 0.228. Этот показатель выше в Ad.lil.3 (Я£ =0.275) и значительно ниже в Ad.lil.4 (Я£ = 0.159). Абсолютное число аллелей на локус (па) на общую выборку Ad. lilifolia равно 1.930, а эффективное число аллелей на локус (л,) - 1.412. Абсолютное число аллелей на локус выше в Ad.lil.l (л„=1.857), а эффективное число аллелей на локус выше в Ad.lil.3 (л,=1.463). Наименьшие значения эти показатели имеют в Ad.lil.4 (Я£=0.159; «а=1.518; л,=1.251). Ожидаемая доля гетерозиготных генотипов на общую популяцию Ad.

lilifolia (#r) составила 0.270; а в субпопуляциях этот параметр (Нs) равен 0.228. Итак, среднее выборочное генетическое разнообразие в субпопуляциях ниже, чем общее генетическое разнообразие в общей популяции. Коэффициент подраздел енности популяций (GST) показал, что на межпопуляционную компоненту Ad. lilifolia приходится 15.51% разнообразия (Боронникова, 2009г). Таким образом, при молекулярно-генетическом анализе Ad. lilifolia установлено, что доля полиморфных локусов и абсолютное число аллелей выше в Ad.lil.l, а эффективное число аллелей и ожидаемая гетерозиготность - в Ad.lil.3. Все выше перечисленные показатели генетического разнообразия достоверно ниже в Ad.lil.4.

2.3. Анализ генетической изменчивости популяций Digitalis grandiflora Mill.

При ISSR-анализе структурных элементов генома D. grandiflora выявлено 111 амплифицированных фрагмента ДНК, из которых 90 были полиморфными (Р95 =81.08%). Число ампликонов в общей выборке растений варьировало в зависимости от праймера от 15 (Х10) до 24 (М9), а их размеры - от 200 до 2200 пн. В среднем, при ISSR-анализе D. grandiflora один праймер инициировал синтез 22.2 фрагментов ДНК. Число полиморфных фрагментов в общей выборке варьировало от 14 до 22. Доля полиморфных локусов и в Dgl и в Dg2 составила 66.36%, а в Dg3 - 50.45%. Ожидаемая гетерозиготность D. grandiflora равна 0.237. Данный показатель выше в Dgl (НЕ =0.207). Абсолютное число аллелей на локус (па) на общую выборку D. grandiflora равно 1.991, а эффективное число аллелей на локус (пе)~ 1.394. Абсолютное число аллелей на локус ниже в Dgl (иа=1.649), а эффективное число аллелей на локус ниже в Dg2 (п„=1.280). Число редких аллелей у D. grandiflora выше, чем у других изученных видов и равно 18. Наименьшее их число отмечено в Dgl (R =3), а наибольшее - в Dg3 (R =17).

Анализ генетической структуры популяций показал, что ожидаемая доля гетерозиготных генотипов на подразделенную популяцию D. grandiflora (Нт) равна 0.261, а в субпопуляциях (Нs) - 0.190. Показатель генетической подразделенности популяций (GCT) D. grandiflora равен 0.272. Таким образом, на межпопуляционную изменчивость у данного вида приходится 27.22% генетического разнообразия. Среднее значение индексов разнообразия Шеннона ( На ) в изученных популяциях D. grandiflora, рассчитанные по ISSR-праймерам, составило 0.292. Кластерный анализ показал, что Dg2 генетически ближе к Dg3

(D =0.076). Dgl находится на большем генетическом расстоянии от Dg2 (D =0.269) и Dg3 (D =0.329). Среди изученных популяций D. grandiflora тенденция к обеднению генофонда отмечена в Dg3 (P9S =50.45%; #£=0.181; «,=1.281).

Таким образом, ISSR-маркеры позволяют получить ценные сведения о генетическом полиморфизме участков генома, фланкированных микросателлитными повторами, определить основные параметры генетического разнообразия и дифференциации популяций, на основании которых установить основные характеристики генофондов редких и исчезающих видов растений.

3. Анализ генетического разнообразия редких видов растений с использованием оценки полиморфизма инвертированных повторов ретротранспозонов (IRAP-PCR маркеры)

3.1. Использование ДНК-маркеров на основе ретротранспозонов для анализа полиморфизма ДНК редких видов растений

Клонирование последовательностей ретротранспозонов осуществляли с помощью нового универсального метода (Kalendar et al., 2008), основанного на использовании ПЦР с праймерами из консервативного участка связывания tRNA, непосредственно прилегающего к левому прямому повтору LTR в центральной части ретротранспозона (рис. 4).

М 12 3 4 6 б 7 S Э 10 11 12 13И 15 16 17 tS 10 20 21 22 23 21 25

_ - — ■ — ям — . ■ ■ т " m

Рис. 4. 1ЯАР-спектр Ау1 с праймером 2095 (5'-ОСТСООАТАССА-3'): цифрами обозначены номера проб, М - молекулярный маркер; стрелками указаны некоторые полиморфные фрагменты ДНК, представлена часть спектра

Для секвенирования последовательностей ЬТЯ ретротранспозонов были отобраны 96 клонов. Для подбора IRAP-пpaймepoв секвенированные последовательности клонов были отсортированы по общей последовательности. Выявлены уникальные последовательности концевых прямых повторов LTR

ретротранспозонов. С помощью выравнивания была определена консенсус последовательность для каждого кластера LTR.

Для IRAP-анализа 5-ти редких видов растений разработаны 70 праймеров (Календарь, Боронникова, 2007) и проведена оценка их эффективности. Установлено, что наиболее эффективно выявляют полиморфизм инвертированных повторов ретротранспозонов в геномах A. vernalis, A. sibirica, Ad. lilipholia, D. grandiflora, Р. anómala IRAP-праймеры, обозначенные номерами 2155, 2156, 2175, 2197, 2198,2201, 2202, 2204 (табл. 1).

Таблица 1

Эффективность праймеров из LTR- последовательностей ретротранспозонов

№ Нуклеотидная последовательность LTR-праймера (51—>3') Adonis vernalis, A. sibirica Digitalis grandiflora Paeonia anómala Adenophora lilifolia

2149 gtagtttcgggttcggaattgca 2 1

2153 atcttttgagaccaagcttccgtc 2 1

2155 agcttgatatcccgccccggtcaa 5 1

2156 acaagttgtccaagggctttcctc 2 1 5

2157 aggtgggcgccaaactgttttgg 2 4

2159 agcgaatcaacaggggctgcccga 2 3 3

2175 ttagacccggaaccgccgtg 4 1 2

2183 ttgcaaataccagtggcgggtcgt 2 2

2185 aattccacaaccgctagtggcg 4 1

2186 cggtttagaacgccacaaatgg 4

2197 gaagtaccgatttacttccgtgta 4

2198 atccttcgcgtagatcaagcgcca 4

2200 atgtgacagtcgactaaccac 3

2201 cctaggtggttagtcgactgtcac 5

2202 tggcgcttgatctacgcgaagga 5

2203 atcccacaacttggacgtttgctg 3 1

2204 aacttgatccagatcatctcc 4

2211 gttggagtgtatagtcccacatcg 3

Установлена видовая специфичность исследованных ШАР-праймеров (Календарь, Боронникова, 2007; Боронникова, 2008). С целью апробации ШАР-метода дана оценка полиморфизма структурных элементов геномов, фланкированных инвертированными повторами ретротранспозонов, некоторых

широко распространенных травянистых видов растений и одного древесного ресурсного вида растений (Боронникова и др., 2009а).

3.2. Анализ полиморфизма 1ЯАР-.маркеров А. \crnalis

В шести изученных популяциях А. уегпаШ выявлено 127 амплифицированных ЖАР-методом фрагментов ДНК, из которых 118 были полиморфными (Р95 =92.91%). Число выявленных ШАР-маркеров в общей выборке растений варьировало в зависимости от праймера от 19 (праймер 2202) до 31 (праймер 2197). В среднем при ШАР-анализе один праймер инициировал у А. \ernalis синтез 25 фрагментов ДНК (Боронникова, 2008; Боронникова, 2009а).

Число полиморфных фрагментов А. уегпаШ варьировало от 17-ти до 30-ти, а их размеры - от 190 до 2500 пн. Ожидаемая гетерозиготность по локусам (НЕ) составила 0.291. Эти показатели наиболее высоки в а минимальны - в Ау1. Абсолютное число аллелей на локус (п„) на общую выборку А. уегпаШ составило 1.992, эффективное число аллелей на локус (ие) - 1.497. Число редких аллелей варьировало по популяциям от 2 (Ау2) до 13 (Ау4), а на общую выборку равнялось 8. Отмечены уникальные фрагменты ДНК, например, в Ау2 - Ауц1 500^75.

Ожидаемая доля гетерозиготных генотипов на подразделенную популяцию А. \>ета1к (НТ), определенная на основании полиморфизма ШАР-маркеров, равна 0.305, а в субпопуляциях (Я5) - 0.225. Коэффициент подразделенности популяций () продемонстрировал, что на межпопуляционную компоненту генетического разнообразия А. уегпаИэ приходится 26.13% разнообразия. Среднее значение индексов разнообразия Шеннона (#о) в изученных популяциях А. уегпаИя,

рассчитанное по ШАР-праймерам, составило 33.83%. На долю внутрипопуляционного генетического разнообразия А. уегпаШ, выявленного посредством индекса Шеннона, приходится 72.15%, а на долю межпопуляционного - 27.85%. Итак, оба подхода к определению генетического разнообразия на популяционном уровне (коэффициент подразделенности популяций (С*0 и индекс разнообразия Шеннона (Но)) у изученного вида дали близкие результаты.

Таким образом, самые низкие показатели генетического разнообразия, определенные на основании полиморфизма ШАР-маркеров, отмечены в первой

(AvI) популяции A. vernalis (P9S =58.26%; Я£=0.177; «,,=1.281), а самые высокие показатели - в Av5 (P9S =77.16%; Я£ =0.270; и,=1.445).

3.3. Анализ полиморфизма IRAP-маркеров A. sibirica

При анализе фрагментов ДНК, амплифицированных в результате ПЦР с IRAP-праймерами, у A. sibirica выявлено 92 амплифицированный фрагмент ДНК, из которых 74 были полиморфными. Доля полиморфных локусов у A. sibirica составила (приР95) 80.43%. Число амплифицированных фрагментов ДНК варьировало в зависимости от праймера от 12 (праймер 2202) до 21 (праймер 2175) до а их размеры - от 270 до 2980 пн. В среднем при IRAP-анализе у A. sibirica один праймер инициировал синтез 18.4 фрагментов ДНК. Наибольшую долю полиморфных локусов выявил праймер 2204 (Я95 =93.33%), а наименьшую -праймер 2202 (Р95 =66.66%). Высокий полиморфизм IRAP-маркеров характерен для As3 (Р„ =61.96%). Резкое снижение данного показателя (Р95 =34.78%) отмечено в Asi также как и при анализе полиморфизма ISSR-маркеров. Ожидаемая гетерозиготность в общей выборке равна 0.360, выше данный показатель в As3 (Я£=0.235). Самое низкое значение этого параметра отмечено в Asi (Я£=0.143). Абсолютное (па) и эффективное (пе) число аллелей на локус выше также в As2 и As3, а самые низкие значения этих параметров отмечены в Asi. Наибольшее число редких аллелей (R =5) отмечено в As3.

Ожидаемая доля гетерозиготных генотипов на подразделенную популяцию A. sibirica (Яг), определенная на основании полиморфизма IRAP-маркеров, равна 0.336, а ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в субпопуляциях (Я5) - 0.207. Как следствие коэффициент подразделенности популяций (Gst) высок и составил 0.385. Изученные популяции сильно дифференцированы, так как 38.47% разнообразия приходится на межпопуляционную и 61.53% - на внутрипопуляционную изменчивость. Оценка генетического разнообразия посредством индекса Шеннона (Яо) дала сходные результаты - на долю внутрипопуляционного генетического разнообразия A. sibirica приходится 58.30%, а на долю межпопуляционного - 41.70%. Наименьшее генетическое расстояние между исследуемыми популяциями A. sibirica, рассчитанное на основе IRAP-анализа, отмечено между Asi и As2 (D =0.165), наиболее генетически удаленными являются Ля/ и As3 (D =0.345).

Итак, генетико-популяционные исследования с использованием IRAP-метода анализа полиморфизма ДНК выявили неоднородность генофондов редкого реликтового вида A. sibirica. Самые высокие показатели генетического разнообразия характерны для As3 (Рк =62.50%; НЕ=0350; ле=1,409). Деградация генофонда при снижении численности популяции и сильном антропогенном воздействии отмечена у Asi (Рп =33.65%; Я£=0.143; пе=1.253). Необходимо осуществление экстренных мер охраны данной популяции.

Таким образом, использование ДНК-фингерпринтинга на основе ретротранспозонов оказалось весьма эффективным для характеристики генофондов и оценки внутри- и межпопуляционного генетического разнообразия популяций редких и исчезающих видов растений.

4. Молекулярно-генетическая паспортизация редких видов растений 4.1. Методика молекулярно-генетической паспортизации

Методика молекулярно-генетической паспортизации редких и нуждающихся в охране видов растений разработана нами на примере природных популяций двух видов A. vernalis и A. sibirica (Боронникова, 2008, 2009а). Она включает в себя семь этапов: 1 - выбор эффективных стабильных молекулярных маркеров, 2 - сбор материала, 3 - подбор эффективных праймеров и проведение молекулярно-генетического анализа с использованием ПЦР, 4 - анализ выявленных ISSR- и IRAP-маркеров и определение идентификационных (мономорфных и полиморфных), а также составление молекулярно-генетической формулы (5 этап), штрих-кода (6 этап) и генетического паспорта (7 этап).

На первом этапе разработки методики была решена задача выбора эффективных стабильных молекулярных маркеров, позволяющих выявить высокий уровень полиморфизма ДНК, анализировать большую часть генома растений, получить четко воспроизводимые результаты на основании анализа данных молекулярно-генетических исследований двух видов рода Adonis, проведенных нами ранее (Боронникова, 2005, 2008; Боронникова и др., 2006; Боронникова, Тихомирова, 2008а). Всем этим требованиям отвечают ISSR- и IRAP-маркеры.

На втором этапе паспортизации в природных популяциях двух видов рода Adonis собраны фрагменты листьев, из которых выделена ДНК.

На третьем этапе были отобраны наиболее информативные четыре ISSR- и пять IRAP-праймеров, с помощью которых выявлены ISSR- и IRAP-маркеры у двух видов рода Adonis. Проведен ПЦР анализ выделенных проб ДНК.

На четвертом этапе для двух видов рода Adonis выявлены 10 ISSR- и 17 IRAP- мономорфных фрагментов и 9 ISSR- и 21 IRAP- полиморфных фрагментов ДНК. Четко воспроизводимые при амплификации у особей одного рода фрагменты ДНК названы нами «родовыми», а у особей одного вида - «видовыми».

На пятом этапе маркеры ДНК, избранные для паспортизации, представили в виде молекулярно-генетической формулы. Нами предложена новая оригинальная запись фрагмента ДНК (Боронникова, 2008; Боронникова, 2009а) с указанием типа фрагмента (родовой, видовой, полиморфный), длины фрагмента и указания праймера нижним индексом, например, Asv1510IR75 (табл. 2).

Таблица 2

Молекулярно-генетическая паспортизация популяций A. vernalis и A. sibirica

Обозначение популяции Тип фрагментов ДНК Молекулярно-генетическая формула

Avl rod ADr550xib ADr850,R9g; ADr480m3; ADr380Mi

vid Av» 830mi2 ; Avv710 iR<m; Av v 630 M]; Avv 490xn

polimorph Av p 900 m12; Av о 620 тог; Av p 440 IR97; Av „ 350 iR75

Av3 rod AD, 550 xi 1; ADr850IR98; ADr480M3; ADr 380Mi

vid Av v 830 m12 ; Avv7101r04; Av, 630 mi; Avv 490 xn

polimorph Av p 1200 ir97 ; Av p 760 ir97 ; Av p 620 iR02 Av D 610 iR75

Áv6 rod ADr550Xii; ADr850|R98; ADr480m3; ADr 380Mi

vid Av v 830 m12 ; Av„7101r04; Av v 630 mf, Av v 490 xl,

polimorph Av p 1100 ir98,Av „ 880 ir97; Av „ 750 жоз; Av D 650 |R7S

Asi rod ADr550xn; ADr850,R98; AD,480m3; ADr 380Mi

vid As у 1510IR75; As v930 m97; As „610 Xn; As v430 ]R98

polimorph As p 1370 [R75; As p 750 Mi2

As2 rod ADr550xn; AD r850 iR98; ADr480m3; ADr 380Mi

vid As v 1510 ir75", As v930 ir97; As v610 xn; As „430 ir9S

polimorph As p 1170 iro4j As p750 m12

Asi rod AD r550xn; AD r850 iR98; ADr480m3; ADr 380Mi

vid As v 1510 ir75; As „930 ir97; As v610xn; As „430 ,R98

polimorph As p 1020 ir75; As„320m|2

Первыми буквами названия рода (AD) мы обозначили. родовые идентификационные фрагменты ДНК с указателем «г» от «rod» нижним индексом, например, ADr550xii- Видовые идентификационные фрагменты обозначены как Av и As с указанием «v» от «vid», например, Av„830mi2- Полиморфные фрагменты ДНК предлагается обозначить индексом «р» от «polimorph», например,

Avp650ir75-, Как родовые, так и видовые фрагменты ДНК являются мономорфными и, в основном, установлены с использованием ISSR-метода. Полиморфные фрагменты ДНК (при их различных сочетаниях) позволили составить уникальную генетическую формулу популяции. Для паспортизации популяций видов рода Adonis было отобрано по 4 родовых и видовых фрагментов ДНК, а также от одного до четырех полиморфных фрагментов ДНК, сочетания которых специфичны для исследуемых популяций (табл. 2). Это минимальное число фрагментов ДНК, с помощью которых нам удалось провести паспортизацию. Гетерогенные природные популяции можно охарактеризовать разными сочетаниями полиморфных фрагментов ДНК, причем главную роль будут играть полиморфные фрагменты, амплифицированные IRAP-методом. Сочетания полиморфных фрагментов ДНК не совпадают ни у одной из изученных популяций.

На шестом этапе паспортизации предложена запись молекулярно-

Обозначение фрагмента Avp900Mi2

ADi8S0r98

AVv830mi2

Avv710®o4

Avv630Mi Avp620,Ro2

ADr 550xn

Avv490xi i ADr 480мз AVp440ir97 ADr380M, AVp350ir75

Рис. 5. Молекулярно-генетический штрих-код популяции Л. vernalis (Avl): AD r— фрагменты ДНК, общие для видов A.vernalis и A. sibirica; Avv- фрагменты ДНК, характерные для A. vernalis\ Avp - полиморфные фрагменты ДНК

Родовые фрагменты предлагается обозначить толстой линией, видовые -линией средней толщины, а полиморфные фрагменты - тонкой линией. Для штрих-кода предлагается использовать от 10 до 12 штрихов, из которых четыре

генетической формулы в виде штрих-кода (рис. 5).

Мощк. № фрагмента

маркер,пн Штрих-код ДНК

900

800

~™г "600"

500 __8

■мм

_ __10

400 мм 11 --12

характерны для рода, четыре - для вида, а от одного до четырех - для популяции. Фрагменты ДНК в штрих-коде располагаются в зависимости от их длины от большего к меньшему. Как молекулярно-генетическая формула (табл. 2), так и штрих-код (рис. 5), позволят идентифицировать принадлежность как растительного сырья, так и отдельных особей не только к роду и виду, но и к определенной популяции изученных видов редких реликтовых растений.

Таким образом, генофонд популяции документируется в виде формул и штрих-кода, отражающих состав аллелей в отдельных локусах генома.

На седьмом этапе молекулярно-генетической паспортизации рекомендуется составление генетического паспорта популяции. Нами разработана форма генетического паспорта популяции редкого вида растений, избраны общепринятые показатели состояния популяций и генетического разнообразия (Боронникова, 20096).

4.2. Молекулярно-генетическая паспортизация видов рода Digitalis

Проведено проращивание семян пяти видов рода Digitalis; из проростков выделена ДНК. После проведения ПЦР-анализа с использованием ISSR- и IRAP-праймеров выявлены четко воспроизводимые 11 мономорфных и 12 полиморфных фрагментов ДНК (Боронникова, 20096). Мономорфные фрагменты ДНК, общие для пяти проанализированных видов рода Digitalis, обозначены первыми тремя буквами латинского названия рода - DIG (например, DIGr460Mi). Мономорфные фрагменты ДНК, характерные для вида, обозначены как Dgv520xs>, а полиморфные - Dgp650iR55 (табл. 3).

Таблица 3

Молекулярно-генетическая паспортизация видов рода Digitalis

Вид Тип фрагментов ДНК Молекулярно-генетическая формула

D. purpurea rod DIGr 1260x9, DIGr640ir97, DIGr550Xio, DIG/t60M1

vid Dp, 1010 mi2, Dpv900x9, Dpv750 M12, Dpv680X9

D. lutea rod DIGrl 260x9, DIGr640iR97, DIGr550Xio, DIG/t60Ml

vid Diu» 1230 mi Dluvl 160 iro4, Dluv1020 X9, Dliw450 X9

D. ciliata rod DIG, 1260 x9, DIGr 640IR97, DIGr 550 xio, DlGr 460 mi

vid Dcv 2600 mi, Dcv 1020 X9, Dcv 970 xio, Dcv 610 X9

D.grandiflora rod DIGr 1260 X9, DIG, 640IR97, DIG, 550 Xio, DIGr 460 mi

vid Dgv 1020x9, DgylOOOiRoi, Dgv95Oxl0, Dgv 520 X9

Основная характеристика молекулярного маркера - его длина указана большими буквами после указания типа фрагмента - 0ру750м12- В молекулярно-

генетической формуле приведены тип и номер праймера нижним индексом. Например, Dgp810iR58 амплифицирован IRAP-методом посредством праймера под номером 2158. При ISSR-анализе праймер можно записать в виде короткой формулы, например, Dgp) 21 0(аос)«с- Для составления молекулярно-генетической формулы популяций видов рода Digitalis в соответствии с методикой отобрано традиционно по 4 родовых и по 4 видовых идентификационных фрагментов ДНК (табл. 3); а также от 1-го до 4-х полиморфных фрагментов ДНК, сочетания которых специфичны для исследуемых популяций.

Для генетической паспортизации популяций использованы от 10-ти до 12-ти молекулярных маркеров. Проведена молекулярно-генетическая паспортизация трех природных популяций редкого реликтового вида D. grandiflora. Запись молекулярно-генетической формулы популяции Dg2, к примеру, такова: DIGr1260X9; DIGr640IR97; DIGr550Xio; DIGr460M,; Dgv1020x9; Dgv1000,R01; Dgv950xlo; Dgv520x9; Dg„l 110M9; Dgp810IR58; Dgp650IR55; Dgp260IR59.

Результаты молекулярно-генетической паспортизации популяций D. grandiflora представленные в виде молекулярно-генетической формулы и штрих-кода, внесены наряду с общепринятыми показателями состояния популяций и характеристиками их генофондов в генетические паспорта (Боронникова, 20096).

4.3. Молекулярно-генетическая паспортизация видов рода Adenophora

Геномная ДНК выделена из проростков двух видов рода Adenophora (Ad. lilifolia и Ad. triphylla). После проведения ПЦР-анализа выявлены четко воспроизводимые 11 мономорфных и 11 полиморфных фрагментов ДНК. В соответствии с разработанной методикой были отобраны по четыре фрагмента ДНК, общих и специфических для двух видов этого рода. Составлены молекулярно-генетические формулы и штрих-коды 4-х изученных популяций Ad. lilifolia. Например, запись молекулярно-генетической формулы первой популяции (Ad.lil.l) такова: Adr1610]R59; Adr840Xio; Adr400M8; Adr370IR96; Ad.lilv1220,R9í; Ad.lilv1050M8; Ad.lilv920xn; Ad.lilv440iR56; Ad.lilpll00IR57; Ad.lilp920MI; Ad.lilp760iR59; Ad.lilp670[R56. Данные об изученных популяциях Ad. lilifolia и характеристики их генофондов внесены в генетические паспорта. С использованием разработанной методики молекулярно-генетической паспортизации составлены молекулярно-генетические формулы и штрих-коды для 22-х популяций 12 видов растений (Боронникова, 2009в, 2009д).

5. Концепция идентификации и оценки состояния генофондов редких и нуждающихся в охране видов растений

5.1. Характеристика генофондов на основании анализа полиморфизма ISSR- и IRAP-маркеров

Изучение генофондов редких видов растений с использованием

молекулярных маркеров ДНК опирается на оценки количественных характеристик генетического разнообразия популяций. Одной из основных количественных характеристик является процент (или доля) полиморфных локусов. Избранные для анализа состояния генофондов ISSR- и IRAP-маркеры являются высоко полиморфными, так как в зависимости от вида выявляют от 56 до 111 ISSR-маркеров и от 92 до 127 IRAP-маркеров. В среднем 1 праймер выявляет 17.6 при ISSR-анализе и 22.5 фрагментов ДНК при IRAP-анализе. Общее число выявленных у четырех редких видов растений ISSR-маркеров составило 350, а IRAP-маркеров - 450. Для проведения молекулярно-генетического анализа четырех редких видов растений проанализированы 88 978 ампликонов. Как следует из приведенных данных, IRAP-метод позволяет выявить большее число молекулярных маркеров. Стабильность избранных для изучения маркеров подтверждается их воспроизводимостью при повторных ПЦР. В совокупности избранные нами для изучения ISSR- и IRAP-маркеры позволяют характеризовать полиморфизм большей части геномов как широко распространенных, так и избранных для изучения редких реликтовых видов растений и установить основные показатели генетического разнообразия популяций, таких как процент полиморфных локусов (я95), ожидаемая гетерозиготность (Я£), абсолютное (па) и эффективное (пг) число аллелей, коэффициент внутрипопуляционного разнообразия (р), число (R) и долю (h) редких аллелей.

Таким образом, нами для характеристики генофондов редких и исчезающих видов растений предложены параметры генетического разнообразия популяций, установленные на основании анализа полиморфизма ISSR- и IRAP-маркеров; на большом фактическом материале убедительно доказано, что для оценки генетического разнообразия популяций редких и нуждающихся в охране видов растений эффективным является использование ДНК-фингерпринтинга (полилокусных спектров) высоко полиморфных и стабильных ISSR- и IRAP-маркеров.

5.2. Принципы множественного молекулярно-генетического геномного маркирования

Изученные редкие реликтовые виды растений послужили моделью для разработки и создания концепции идентификации генофондов на основании оценок полилокусного сочетания моно- и полиморфных участков ДНК. Тандемно организованные повторяющиеся последовательности ДНК различных типов широко представлены в эукариотических геномах. Они варьируют по длине кластера и размеру повторяющегося звена. Среди них наиболее полиморфными являются минисателлитные и микросателлитные ДНК, а также ретротранспозоны.

Основные принципы множественного молекулярно-генетического маркирования таковы:

- использование высоко полиморфных молекулярных маркеров, основанных на широко представленных в геномах тандемных повторах;

- использование не менее двух типов молекулярных маркеров ДНК, основанных на различных структурных повторяющихся элементах генома;

- один из используемых молекулярных маркеров должен быть основан на вариабельных элементах генома, например, мобильных генетических элементах -ретротранспозонах;

- оценка полилокусного сочетания моно- и полиморфных участков ДНК;

- выявление общих (идентификационных) для рода и вида мономорфных фрагментов ДНК и характеристика популяционных генофондов посредством сочетание полиморфных фрагментов ДНК;

- обобщение характеристик генофондов в виде молекулярно-генетической формулы, штрих-кода и генетического паспорта.

5.3. Оптимизация сохранения генофондов редких видов растений посредством молекулярно-генетической паспортизации на основании молекулярно-генетического анализа

Методика молекулярно-генетической паспортизации на основе ISSR- и IRAP-маркеров имеет высокую разрешающую способность, дает стабильно воспроизводимые результаты, характеризуется высоким уровнем стандартизации, как набора маркеров, так и техники выполнения анализа. Именно использование IRAP- вместе с ISSR-маркерами позволило нам провести паспортизацию гетерогенных природных популяций редких реликтовых видов растений.

Разработанная методика молекулярно-генетической паспортизации популяций редких реликтовых видов растений предлагается в качестве ключевого звена технологии идентификации генофондов редких и исчезающих видов растений, которая позволит установить уровень и состав генетического разнообразия на популяционном уровне, выявить популяции с типичными и специфическими характеристиками генофондов, рекомендовать научно обоснованные меры их сохранения, то есть оптимизировать процедуру сохранения генофондов наиболее уязвимых в растительных сообществах редких и исчезающих видов растений. Эта технология является одним из подходов оптимизации сохранения генетической компоненты биоразнообразия растительных сообществ.

5.4. Показатели генетической дифференциации популяций

Изученные редкие реликтовые виды растений, кроме Р. anómala, представлены небольшим числом популяций и характеризуются низкими показателями численности. Влияние общей и эффективной численности популяций на параметры генетического разнообразия изучено на примере 10 популяций A. vernalis, которые распределены по показателю общей численности в две группы: популяции с низкой (Av3, Avó, Av7, Av8, AvlO) и высокой (Avl, Av2, Av4, Av5, Av9) общей численностью. Нами установлено, что эффективную численность или эффективный размер популяций A. vernalis составляют, в основном, средневозрастные генеративные особи (g2).

Высокая линейная корреляция достоверно установлена между долей средневозрастных генеративных особей (g2) и индексом разнообразия Шеннона (г=0.6618; р=0.0371), ожидаемой гетерозиготностью (г =0.6355; р =0.0483) и числом эффективных аллелей (г =0.6462; р =0.0435). Аналогичная картина наблюдается, если сравнить данные показатели отдельно в популяциях с низкой и высокой общей численностью.

При изучении генетической структуры подразделенной популяции установлено, что в группе популяций с высокой общей численностью коэффициент подразделеной популяции (Gsr) составил 0.169, а в группе популяций с низкой общей численностью - 0.371. Нами достоверно (F (1.77) > FST (1.39)) установлено, что популяции Л. vernalis с низкой общей численностью дифференцированы в большей степени.

Таким образом, с учетом специфики редких реликтовых видов растений рекомендуемые нами генетико-статистические параметры позволяют установить характеристики их генофондов и дают адекватные и стабильные оценки генетической дифференциации популяций.

5.5. Отбор объектов для сохранения и меры охраны генофондов редких реликтовых видов растений

Для отбора в качестве объектов сохранения генофондов рекомендуются локальные группы популяций с наиболее типичными характеристиками генофондов, такие как популяции A. vernalis, расположенных в центральной части островной Кунгурской лесостепи: Av4 (Р95 =61.47%; Я£ =0.241; и,=1.482; R =0); Av5(P„ =57.80%; НЕ=0.222; «.=1.403; R =4); Av9 (Р95 =60.55%; НЕ=0.245; п = 1.422; R =0).

Кроме этого для сохранения генофондов в качестве генетически более гетерогенных рекомендуются отдельные популяции:

A. sibirica - As3 Ильинского района (Р95 =81,08%; Я£=0,235; ие=1,409; R =11), Ad. lili/olía-Ad.UI.3 Ординского района(/>„=75.00%; НЕ=0,275; ne=l,462; R =0), D. grandiflora - Dg2 Кунгурского района (Рк =66.36%; Я£= 0,182; и,=1,784;Д =14).

К объектам сохранения со специфичными характеристиками генофондов, то есть со специфическими сочетаниями полиморфных локусов, относятся:

- самая северная популяция A. vernalis на Спасской горе Av2(P,5 =34.86%; НЕ =0.122; ^=1.199; R =7);

- популяции островной Кунгурской лесостепи

A. vernalis-Avl (Р95 =44.95%; НЕ =0.147; л,=1.236; R =4), D. grandiflora-Dg3 (Я95 =50.45%; Я£ =0,181; «е=1,281; Я =17), lilifolia-Ad.lil. 1 (Я95 =80.36%; Я£ =0.250; «,=1.402; Л =0),

- популяции из центральной части Пермского края

/I. sibirica-Asl (Р95=35.13%; Не =0.141; и«=1,257; Л =0).

На основании обобщения данных, представленных в данной диссертационной работе, рекомендуются следующие меры по сохранению генофондов изученных редких реликтовых видов растений:

1. Поддержание генетического разнообразия популяций изученных видов путем сохранения на уровне не ниже исторически сложившегося эффективного

размера популяций за счет устранения или снижения антропогенного воздействия: прекращения изъятия щебня и строительства объектов туризма и зон отдыха на склонах, где обитают виды; снижения рекреационной нагрузки, предотвращения пожаров и ряд других мер.

2. Картирование на местности избранных для сохранения генофондов популяций и строгое их сохранение, учет их уникальности при планировании и проведении строительных, нефтедобывающих, хозяйственных и иных работ.

3. Мониторинг популяционных характеристик и генетического разнообразия избранных для сохранения популяций редких реликтовых видов растений.

4. Молекулярно-генетическая идентификация и паспортизация на популяционном уровне и выявление на ее основе объектов для сохранения генетического разнообразия.

5. Для третьей (Av3), шестой (Avó), седьмой (Av7) и десятой (AvIO) популяций A. vernalis, первой (Asi) популяции A. sibirica, третьей (Dg3) популяции D. grandiflora необходимы экстренные меры охраны, а именно снижение общей антропогенной нагрузки (запрет на разрушение местонахождений популяций, ограничение выпаса скота и посещения людей путем создания ОППТ).

6. Для сохранения генофондов D. grandiflora и Ad. lilifolia помимо сохранения in situ рекомендуется отбор особей из популяций как с наибольшим типичными (Dgl, Ad.lil.3), так и со специфичными характеристиками генофондов (Dg2, Ad.lil.l) для введения в культуру в ботанические сады с последующей реинтродукцией.

7. В связи с ограниченной возможностью разведения в культуре двух изученных видов рода Adonis необходимо охранять природные популяции этих видов. Кроме этого рекомендуется консервация в генетических банках полноценных семян, отобранных в связи с сильной генетической дифференциацией популяций на основе максимальной представленности генетического разнообразия каждой из немногочисленных природных популяций этих видов.

8. При сильной дифференциации популяций рекомендуется создание промежуточных популяций с целью поддержания генетического разнообразия.

выводы

1. Для оценки генетической изменчивости редких и исчезающих видов растений рекомендуется метод ДНК-фингерпринтинга с использованием высоко полиморфных стабильных ISSR- и IRAP-маркеров, позволяющий эффективно оценить полиморфизм локусов в геноме и выявить основные показатели генетического разнообразия популяций.

2. С целью оптимизации сохранения генетической компоненты биологического разнообразия растительных сообществ разработаны принципы множественного молекулярно-генетического геномного маркирования и создана концепция идентификации и оценки состояния генофондов редких и нуждающихся в охране видов растений на основании оценок полилокусного сочетания моно- и полиморфных участков ДНК на примере модельных редких реликтовых видов растений Пермского края рода Adonis, Ad. lili/olia и D. grandiflora.

3. Показано, что изученные редкие реликтовые виды растений характеризуются высоким уровнем генетической изменчивости:

на основании полиморфизма ISSR-маркеров установлены доля полиморфных локусов (Р9;) в пределах от 81.08% до 91.74%, ожидаемая гетерозиготность (НЕ) - от 0.234 до 0.356, а эффективное число аллелей (пе) - от 1.394 до 1.608;

на основании полиморфизма IRAP-маркеров - доля полиморфных локусов в пределах от 80.43% до 92.91%, ожидаемая гетерозиготность - от 0.291 до 0.432, а эффективное число аллелей - от 1.496 до 1,759.

4. Выявлено, что генетическая изменчивость у исследованных редких реликтовых видов растений варьирует в узких пределах (уровень полиморфизма ISSR-маркеров - от 81.08 % у D. grandiflora до 91.74 % у A. vernalis', уровень полиморфизма IRAP-маркеров - от 80.43% у A. sibirica до 92,91% A. vernalis), несмотря на небольшую эффективную численность популяций, а также их дифференциацию и изолированность.

5. Установлено, что основные показатели генетического разнообразия изученных популяций A. vernalis достоверно (г =0.636; р =0.048 для ожидаемой гетерозиготности; г =0.646; р =0.044 для числа эффективных аллелей; г =0.662; р=0.037 для индекса разнообразия Шеннона) и линейно коррелируют с долей

средневозрастных генеративных особей (g2), составляющих эффективную численность изученных популяций.

6. Виды рода Adonis характеризуются высоким уровнем межпопуляционной дифференциации ( GST равен 39.90% у A. vernalis и 35.77% у A. sibiricá). Величина параметра ниже у D. grandiflora (27.22 %) и Ad. lilifolia (15.51%).

7. Генофонд исследованных популяций D. grandiflora способен самовоспроизводиться без вмешательства извне при условии сохранения существующих популяций, их эффективной численности (как определено в работе, изменяющийся в популяциях от 40 до 304 особей) и существующего уровня семенной продуктивности (в среднем около 2350 полноценных семян на особь в год). Генофонд Ad. lilifolia обеднен из-за отсутствия редких аллелей, но также способен к самовоспроизводству при сохранении существующей эффективной численности популяций (от 36 до 239 особей) и при формировании на каждой особи около 570 полноценных семян в год.

8. Выявлено, что у A. vernalis и A. sibirica часть популяций находится на пороге деградации генофонда из-за антропогенных факторов, среди которых преобладает разрушение местонахождений из-за строительства горнолыжной трассы (Asi), нефтепровода (Av7), дорог (Av3, AvlO), а также из-за вытаптывания вследствие выпаса скота и посещения людьми.

9. Для отбора в качестве объектов сохранения рекомендуются локальные группы популяций с наиболее типичными характеристиками генофондов, такие как популяции A. vernalis, расположенные в центральной части островной Кунгурской лесостепи (Av4, Av5, Av9), а также отдельные популяции, такие как третья (As3) популяция A. sibirica из Ильинского района, третья (Ad.lil.3) популяция Ad. lilifolia из Ординского района и вторая (Dg2) популяция D. grandiflora из Кунгурского района Пермского края.

10. Установлены специфические характеристики генофондов (уникальные сочетания аллелей многих локусов) для ряда популяций: самой северной популяции (Av2) A. vernalis на Спасской горе; (Avi) A. vernalis и (Dg3) D.grandiflora, расположенных в островной Кунгурской лесостепи; а также (Ad.lil.l) Ad. lilifolia, расположенной на горе Подкаменной, и (Asi) A. sibirica из центральной части Пермского края.

11. С помощью разработанной нами технологии идентификации генофондов редких видов растений и ее ключевой части (методики молекулярно-генетической паспортизации) на основании молекулярно-генетического анализа установлены уровень и состав генетического разнообразия популяций, выявлены популяции с типичными и специфическими характеристиками генофондов, даны научно обоснованные рекомендации по сохранению генофондов с учетом уровней внутри- и межпопуляционного генетического разнообразия, то есть разработана модельная система оптимизации сохранения генофондов редких и исчезающих видов растений.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Боронникова С.В. Семенная продуктивность некоторых видов сем. Campanulaceae (Пермская обл.) // Раст. ресурсы. 1999. Вып.2. С.43-48.

2. Боронникова С.В. Семенная продуктивность Liliutrt martagon L. subsp. pilosiusculum (Freyn) Miscz. Ex Iljin и Paeonia anomala L. (Пермская обл) // Раст. ресурсы, 2002. Вып.З. С. 50-53.

3. Боронникова С.В.. Кокаева З.Г., Гостимский С.А., Дрибноходова О.П., Тихомирова Н.Н. Анализ ДНК-полиморфизма реликтового вида Урала наперстянки крупноцветковой (Digitalis grandiflora Mill.) с помощью RAPD- и ISSR-маркеров // Генетика. 2007. Т.43, №5. С.653-659.

4. Боронникова С.В.. Тихомирова Н.Н. Анализ генетической изменчивости популяций двух редких лекарственных видов рода Adonis с использованием ISSR-маркеров // Известия ТСХА. 2008а. Nsl. С.86-94.

5. Боронникова С.В. Молекулярное маркирование и генетическая паспортизация ресурсных и редких видов растений с целью оптимизации сохранения их генофондов // Аграрный вестник Урала. 2009а. №2 (56). С. 57-59.

6. Боронникова С.В. Молекулярно-генетическая паспортизация редких реликтовых видов растений // Вестник Новосибирского государственного университета. 20096. Т.7, вып.З. С.3-8.

7. Боронникова С.В. Генетическая паспортизация популяций редких видов растений рода Adonis с использованием ISSR- и IRAP-маркеров // Известия ТСХА. 2009в.№1.С. 83-89.

8. Боронникова С.В. Исследование генетической изменчивости популяций редкого вида Урала Adenophora lilifolia (L.) A.DC. на основании анализа полиморфизма ISSR-маркеров // Генетика. 2009г. Т. 45, №5. С.652-655.

9. Боронникова С.В. Генетическая паспортизация редких видов растений как основа оптимизации сохранения их генофондов // Вопросы современной науки и практики. Университет им. В.И.Вернадского. 2009д. №3 (17). С.8-15.

10.Боронникова С.В., Светлакова Т.Н., Бобошина И.В. Изучение генетического полиморфизма Populus trémula L. с использованием ISSR- и IRAP- маркеров // Аграрная Россия. 2009а. №2. С.20-22.

11 .Боронникова С.В.. Тихомирова Н.Н. Семенная продуктивность редкого лекарственного вида Digitalis grandiflora Mill, в Пермском крае // Раст. ресурсы. 20096. №2. С. 17-22.

12. Боронникова С.В., Тихомирова Н.Н., Кравченко. О.А. Характеристика генофондов редкого лекарственного вида Adonis vernalis L. с использованием ISSR-маркеров // Аграрный вестник Урала. 2009в. № 5 (59). С.67-70.

Монографии

1. Боронникова С.В. Молекулярно-генетическая идентификация и паспортизация редких и находящихся под угрозой уничтожения видов растений. Перм. ун-т. Пермь, 2008. 120 с.

2. Красная книга Пермского края / М.А. Бакланов, С.В. Баландин, Т.П. Белковская, В.Д. Белоногова, С.В. Боронникова и др. Под общ. ред. А.И. Шепеля. Пермь: Книжный мир, 2008. 256 с.

Учебно-методическое пособие

1. Молекулярная генетика: учебно-методическое пособие / под. ред С.В. Боронниковой: Перм. ун-т. Пермь, 2007. 150 с.

Публикации в других изданиях

1. Боронникова С.В. Изучение репродуктивной биологии редких видов растений Урала // Содержание и формы экологического образования в педвузе. Часть 2. Тезисы второго республиканского совещания-семинара. Пермь, 1990. С. 104-106.

2. Верещагина В.А., Боронникова С.В. Охрана генофонда дикорастущих декоративных растений Предуралья // Охраняемые природные территории. Проблемы выявления, исследования, организации систем: Тезисы докладов межвузовской научной конференции. Часть 2. Пермский университет. Пермь, 1994. С.8-10.

3. Боронникова С.В. Репродуктивная биология колокольчиковых // Вестник Пермского университета. Биология. 1995. Вып. 1. С. 28-36.

4. Боронникова С.В. Репродуктивная биология декоративных дикорастущих видов растений Предуралья. Тезисы докладов V научной конференции памяти проф. А.А.Уранова. // Популяции и сообщества растений: экология, биоразнообразие, мониторинг. Кострома, 1996. Ч. 2. С. 102-103.

5. Боронникова С.В. Влияние антропогенного фактора на семенную продуктивность колокольчиковых // Жизнь популяций в гетерогенной среде. 4.2. Йошкар-Ола: Периодика Марий Эл, 1998. С. 151-152.

6. Боронникова С.В. Репродуктивная биология некоторых охраняемых растений Предуралья // Флористические и геоботанические исследования в Европейской России: Материалы Всероссийской научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения проф. Фурсаева. Саратов, 2000. С.403-405.

7. Боронникова С.В.. Жуйкова Н.А., Матюшина М.А. Некоторые аспекты репродуктивной биологии колокольчиковых // Вестник Пермского университета. Заказник "Предуралье". Вып. 3. Пермь, 2000. С. 164-167.

8. Боронникова С.В., Куницына Е.Г. Оценка состояния двух ценопопуляций пиона уклоняющегося в Пермской области // Вестник Пермского университета. Биология. Вып.4. Пермь, 2001. С. 17-21.

9. Боронникова С.В., Бердникова Ю.В., Галиева Т.А Оценка состояния ценопопуляций некоторых редких видов растений в Пермской области // Фундаментальные и прикладные проблемы популяционной биологии. Сборник тезисов докладов VI Всероссийского популяционного семинара. Нижний Тагил, 2002. С. 16-18.

10. Боронникова С.В. Семенная продуктивность редких видов Пермской области // Ботанические исследования в азиатской России: Материлы XI съезда Русского ботанического об-ва. Барнаул: Изд-во АзБуки, 2003.Т.З. С.292-293.

11. Боронникова С.В.. Стамикова Е.И. К оценке состояния ценопопуляций некоторых редких видов растений П Растительный покров Пермской области и его охрана: межвузовский сборник научных трудов. Пермь, 2003. С.38-44.

12. Боронникова С.В. Гетерогенность ценопопуляций двух видов рода Adonis L. // Вестник Пермского университета. Биология. Вып. 6. Пермь: ПГУ, 2005. С.22-36.

13. Tihomirova N.N., Boronnikova S.V. Kokaeva Z.G., Gostimsky S.A. Molecular genetic investígations of medical plants // Proceedings of the IV Baikan Botanical Congress. (Sofía, 20-26 June 2006). Sofía, 2006. P.35.

14.Кокаева З.Г., Боронникова C.B.. Тихомирова H.H., Дрибноходова О.П. Анализ генетического разнообразия популяционных систем редких и ресурсных видов растений // IV Международная научная конференция «Биотехнология -охране окружающей среды». Доклады МОИП. Москва, 2006. С. 75-79.

15. Кокаева З.Г., Гостимский С.А., Боронникова С.В. Анализ изменчивости природных популяций редкого вида растений Предуралья Digitalis grandiflora Mili, с помощью молекулярных маркеров // Материалы международной научно-практической конференции и VII Международного симпозиума «Нетрадиционные

и редкие растения, природные соединения и перспективы их использования». Белгород, 2006. Т.2. С.12-16.

16. Тихомирова Н.Н., Боронникова С.В. Структура ценопопуляций и семенная продуктивность Digitalis grandiflora Mili, в Предуралье // Бюллетень Ботанического сада Саратовского государственного университета. Вып.5. Материалы Всероссийской научной конференции «Ботанические исследования в Поволжье и на Урале», посвященные 50-летию Ботанического сада СГУ им. Чернышевского. Саратов, 2006. С.77-82.

17. Тихомирова Н.Н., Боронникова С.В. ДНК-полиморфизм и демографические характеристики популяций некоторых редких видов растений Предуралья // Международная конференции «Генетика в России и мире», посвященная 40-летию Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН. Москва, 2006. С.200.

18. Боронникова С.В.. Кокаева З.Г., Тихомирова Н.Н. Генетическое разнообразие популяций некоторых редких видов растений Пермского края при антропогенных воздействиях // Международная научно-практическая конференция «Антропогенная динамика природной среды»: Материалы международной научно-практической конференции. Пермь, 2006.Т. II. С. 107-112.

19. Календарь Р.Н, Боронникова С.В. Анализ молекулярно-генетического полиморфизма природных популяций редких видов растений Урала с помощью ретротранспозонов // Материалы Четвертого Московского международного конгресса «Биотехнология состояние и перспективы развития». М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2007.4.2. С.121.

20. Тихомирова Н.Н.. Боронникова С.В.. Кокаева З.Г., Гостимский С.А. Анализ генетического разнообразия популяций лекарственных и редких видов растений Урала // Материалы Четвертого Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2007.4. 2. С. 122-123.

21. Боронникова С.В. Популяционно-генетический мониторинг генофондов редких ресурсных видов растений Пермского края // Флора Урала в пределах бывшей Пермской губернии и ее охрана: материалы межрегиональной конференции, посвященной 140-летию со дня рождения П.В.Сюзева / под ред. Е.И.Демьяновой / С.А.Овеснова / Л.Г.Переведенцевой. Пермь, 2007. С.37- 43.

22. Боронникова С.В. Анализ генетического разнообразия популяций редких видов растений как критерий оценки их состояния // Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века: Материалы Всероссийской конф. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2008а. Ч.З. С.323-326.

23. Боронникова С.В.. Календарь Р.Н. Ретротранспозоны в геномах лекарственных растений // Нанотехнологии в сельском хозяйстве: Доклады

Международной научно-практической конференции. М.: Изд-во РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева, 2008. С. 20-21.

24.Боронникова C.B.. Тихомирова H.H. Анализ генетической изменчивости некоторых редких лекарственных видов растений // Научное наследие Н.И.Вавилова - фундамент для развития отечественного и мирового сельского хозяйства. М.: Изд-во РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева, 20086. С. 222-229.

25. Боронникова C.B.. Дрибноходова О.П., Кокаева З.Г. и др. Динамика генетического разнообразия и структуры популяционных систем ресурсных растений Пермского края при антропогенных воздействиях // Региональный конкурс РФФИ-Урал. Пермь, Екатеринбург, 2008в. 4.2. С.60-63.

26. Боронникова C.B.. Тихомирова H.H., Светлакова Т.Н. и др. Использование микросателлитов для анализа геномов редких видов растений // Нанотехнологии в сельском хозяйстве: Доклады Междунар. научно-практической конференции. М.: Изд-во РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева, 2008г. С. 107-108.

27. Светлакова Т.Н., Бобошина И.В., Королева Ю.А. Боронникова C.B. Использование ДНК-технологий для оценки состояния популяций ресурсных видов растений // Нанотехнологии в сельском хозяйстве: Доклады Междунар. научно-практической конференции. М.: Изд-во РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева, 2008д. С.109-110.

28.Тихомирова H.H., Боронникова C.B. Анализ геномов лекарственных растений с использованием молекулярных маркеров // Материалы Пятого Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И.Менделееева, 2009. 41. С.213.

29. Боронникова C.B. Молекулярно-генетическая паспортизация и идентификация редких лекарственных растений // Материалы Пятого Московского междунар. конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И.Менделееева, 2009ж. Ч. 1. С.269-270.

30. Боронникова C.B., Календарь Р.Н.. Использование молекулярных маркеров на основе ретротранспозонов для анализа и сохранения генофондов редких видов растений // Материалы Пятого Московского междунар.конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделееева, 2009.4.2. С.201.

31. Боронникова C.B. Генетическая паспортизация природных популяций редких видов растений с использованием ISSR- и IRAP-маркеров // Материалы Съезда генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина, Пятого Съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. М., 2009. 4.II. с. 149.

Список использованных сокращений

ОППТ - особо охраняемая природная территория

IPTG - isopropyl-p-D-1-thiogalactopyranoside

IRAP - Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism

1SSR - Inter Simple Sequence Repeats

NCBI National Center for Biotechnology Information

LTR - Long Terminal Repeats

pGEM-T - плазмидный вектор для E.coli (Promega)

X-Gal - 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-P-D-galactopyranoside

UPGMA - unweighed pair-grup method using arithmetic average

БОРОННИКОВА СВЕТЛАНА ВИТАЛЬЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГЕНОФОНДОВ РЕДКИХ И ИСЧЕЗАЮЩИХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ ПЕРМСКОГО КРАЯ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Лицензия ПД № 11-0002

Подписано в печать 15.09.2009. Формат 60x90/16.

Набор компьютерный. Усл.печ.л. 2. _Тираж 100 экз. Заказ № 597/2009._

Отпечатано в типографии «Пресстайм» Адрес: 614025, г. Пермь, ул. Героев Хасана, 105

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Боронникова, Светлана Витальевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ ОХРАНЫ ГЕНОФОНДОВ РЕДКИХ И ИСЧЕЗАЮЩИХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ

1.1 .Генетическая компонента биологического разнообразия.

1.2.Использование молекулярных маркеров для анализа полиморфизма ДНК растений.

1.3.Характеристика генофондов редких и исчезающих видов растений на основании анализа полиморфизма молекулярных маркеров.

1.4 .Проблемы молекулярно-генетической идентификации и паспортизации растений.

1.5.Популяционно-генетические исследования редких и исчезающих травянистых видов растений Урала.

1.6.Проблема выявления объектов сохранения генофондов.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ, РЕГИОН И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Характеристика региона исследований.

2.2. Объекты исследований.

2.3. Методы исследований.

ГЛАВА 3. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РЕДКИХ РЕЛИКТОВЫХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ И ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗБРАННЫХ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ПОПУЛЯЦИЙ

3.1 .Adonis vernalis L.

Ъ.2.Adonis sibirica Patrin exLedeb.Ill

3.3 .Paeonia anomala L.

3.4. Adenophora lilifolia (L.)A.DC.

Ъ.5.Digitalis grandiflora Mill.

ГЛАВА 4. АНАЛИЗ ГЕНОФОНДОВ РЕДКИХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ НА ОСНОВАНИИ ОЦЕНОК ПОЛИМОРФИЗМА ФРАГМЕНТОВ ДНК, ФЛАНКИРОВАННЫХ ИНВЕРТИРОВАННЫМИ

МИКРОСАТЕЛЛИТНЫМИ ПОВТОРАМИ (ISSR-PCR МАРКЕРЫ)

4.1. Анализ генетического разнообразия популяций двух видов рода Adonis.

4.2. Анализ генетической изменчивости Adenophora lilifolia (L.)A.DC.

4.3. Анализ полиморфизма ISSR-маркеров Digitalis grandiflora Mill.

4.4. Применение ISSR-маркеров для молекулярно-генетического анализа генофондов растений.

ГЛАВА 5. АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ РЕДКИХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ОЦЕНКИ ПОЛИМОРФИЗМА ИНВЕРТИРОВАННЫХ ПОВТОРОВ РЕТРОТРАНСПОЗОНОВ (IRAP-PCR МАРКЕРЫ)

5.1. Использование ДНК-маркеров на основе ретротранспозонов для анализа полиморфизма ДНК редких видов растений.

5.2. Анализ полиморфизма IRAP-маркеров A. vernalis.

5.3. Анализ генетической изменчивости A. sibirica.

ГЛАВА 6. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ПАСПОРТИЗАЦИЯ РЕДКИХ И ИСЧЕЗАЮЩИХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ

6.1. Методика молекулярно-генетической паспортизации.

6.2. Молекулярно-генетическая паспортизация видов рода Digitalis.

6.3.Молекулярно-генетическая паспортизация видов рода Adenophora.

ГЛАВА 7. КОНЦЕПЦИЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ ГЕНОФОНДОВ РЕДКИХ И ИСЧЕЗАЮЩИХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ

7.1. Характеристика генофондов на основании анализа полиморфизма ISSR- и IRAP- маркеров.

7.2. Принципы множественного молекулярно-генетического геномного маркирования.

7.3. Показатели генетической дифференциации популяций.

7.4. Оценка состояния генофондов редких видов растений на основании молекулярно-генетического анализа.

7.5. Отбор объектов для сохранения и меры охраны генофондов редких реликтовых видов растений.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетический анализ генофондов редких и исчезающих видов растений Пермского края"

Актуальность проблемы

Сохранение биологического разнообразия занимает особое место среди глобальных проблем современности (Вахрамеева, 1988; Конвенция о биологическом разнообразии., 1992; Алтухов, 1995; Hebert et al., 2003; Динамика популяционных генофондов., 2004). Основой биологического разнообразия является его генетическая компонента. Сокращение видового и генетического разнообразия представляет реальную угрозу для биосферы, поскольку устойчивость воспроизводства природных экосистем и агроэкосистем непосредственно связана с их генетически обусловленным потенциалом к адаптациям к меняющимся условиям окружающей среды (Мэгарран, 1992; Глазко, 1998; Лебедева и др., 1999, Жученко, 2001, Динамика., 2004). К середине текущего столетия прогнозируется увеличение числа видов растений, находящихся под угрозой исчезновения, с 7 до 60 тысяч (Frankel et al., 1995; Стратегия сохранения., 2004).

Впервые концепция о необходимости контроля и мобилизации мировых растительных ресурсов была разработана Н.И. Вавиловым, что легло в основу планомерной работы по созданию банков растительных ресурсов в разных странах. К настоящему времени в них собраны миллионы образцов, однако до сих пор нет универсальных принципов их отбора (Жученко, 2001). Необходимость сохранения внутривидовой изменчивости, как на межпопуляционном, так и на внутрипопуляционном уровнях, недостаточно учитывается при изучении редких видов растений (Тихонова, 1985). Популяционный подход остается наименее разработанным в области сохранения биоразнообразия растений, поскольку до сих пор отсутствуют общепринятые методы идентификации не только популяционных, но даже видовых особенностей генофондов. Анализ молекулярно-генетических маркеров полиморфизма белков и различных участков геномной ДНК позволил выявлять внутривидовое генетическое разнообразие, оценить гетерозиготность, реконструировать филогенетические взаимоотношения между видами и пространственные взаимосвязи между популяциями (Алтухов, 1975, 1995а,б; Янбаев и др., 2007; Политов, 2007). В то же время, эффективность использования традиционных молекулярно-генетических маркеров (структурных генов, мини- и микросателлитных локусов) для исследований генофондов до сих пор остается достаточно низкой из-за ограниченности количества локусов, доступных для одновременного генотипирования особей. Это требует поиска новых подходов одновременного молекулярного маркирования многих геномных участков, которые могли бы позволить создавать «геномный портрет» каждого отдельного индивидуума и таким образом, наиболее объективно оценивать своеобразие генофондов популяций. Особую важность разработка таких методов имеет для решения главной проблемы в поддержании биоразнообразия - отбора наиболее типичных представителей популяций и создания генетически обоснованных программ по их сохранению. К настоящему времени у редких эндемичных видов растений Урала изучен ряд характеристик внутривидовой изменчивости (Кучеров, Щелокова, 1987; Кучеров и др., 1993; Янбаев и др., 2000; Янбаев и др., 2007), но практически не исследована генетическая изменчивость травянистых реликтовых редких видов растений, в том числе и в Пермском крае.

Актуальность диссертационной работы обусловлена: а) недостаточной теоретической разработанностью молекулярно-генетических подходов к изучению геномов дикорастущих редких видов растений, представленных популяциями с низкой численностью; б) важностью определения молекулярно-генетических основ генетического разнообразия редких видов растений на популяционном уровне; в) отсутствием экспериментальных методов молекулярного маркирования многих участков геномов редких видов растений, пригодных для массового анализа; г) недостатком методов для оптимизации сохранения генофондов редких и исчезающих видов растений.

Цель и задачи исследования

Цель работы — разработать принципы множественного молекулярно-генетического геномного маркирования и технологию идентификации и паспортизации генофондов редких реликтовых видов растений Пермского края в качестве модельной системы оптимизации сохранения генофондов редких и исчезающих видов растений.

Для достижения цели были поставлены следующие основные задачи:

2. Исследовать генетическое' разнообразие популяций некоторых редких реликтовых видов растений, распространенных на территории Пермского края.

4. Установить популяции с типичными и специфическими характеристиками генофондов.

Положения, выносимые на защиту

4. Для оптимизации сохранения генетического разнообразия на популяционном уровне необходима молекулярно-генетическая идентификация и паспортизация генофондов редких и исчезающих видов растений, позволяющая на основании оценок полилокусного сочетания моно-и полиморфных участков ДНК составить молекулярно-генетическую формулу, штрихкод популяций и обобщить данные в виде генетического паспорта.

Научная новизна полученных результатов

Впервые разработана концепция идентификации генофондов редких и нуждающихся в охране видов растений с использованием оценок геномного распределения повторов, таких как микросателлиты и ретротранспозоны. Впервые получены и систематизированы данные о генетическом разнообразии популяций ряда редких травянистых реликтовых видов растений, произрастающих на территории Пермского края: адониса весеннего Adonis vernalis L., адониса сибирского Adonis sibirica Patrin ex Ledeb., бубенчика лилиелистного Adenophora lilifolia (L.) A.DC., пиона уклоняющегося Paeonia anomala L., наперстянки крупноцветковой Digitalis grandiflora Mill. Впервые оценена эффективность в исследованиях генофондов редких видов растений IRAP-метода, который основан на использовании в полимеразной цепной реакции (ПЦР) в качестве праймеров терминальных последовательностей ретротранспозонов. С целью анализа геномов редких реликтовых видов растений были клонированы и секвенированы последовательности ДНК пяти редких видов растений Пермского края. Нуклеотидные последовательности LTR-ретротранспозонов некоторых редких видов растений были включены в мировую базу генетических данных GenBank NCBI под номерами: EF191000-EF191012 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

С целью изучения взаимосвязи генетического разнообразия с показателями численности выявлены общая и эффективная численность популяций и изучены биологические особенности модельных реликтовых редких видов растений, такие как преимущественный способ опыления, способ и эффективность размножения. Даны характеристики изученных популяций с определением степени антропогенного воздействия в соответствии с рекомендациями, разработанными автором диссертационной работы. С целью оптимизации сохранения генофондов редких и нуждающихся в охране видов растений разработана методика молекулярно-генетической паспортизации на популяционном уровне, которая включает в себя анализ полиморфизма стабильных ISSR- и IRAP-маркеров, выявление идентификационных мономорфных (родовых и видовых) и полиморфных фрагментов ДНК, составление молекулярно-генетической формулы, штрихкода и генетического паспорта. Анализ генетического разнообразия редких видов растений на основании оценки полиморфизма ISSR- IRAP-маркеров предложен в качестве критерия оценки состояния их генофондов. На основании полученных данных рекомендованы научно обоснованные меры сохранения генофондов изученных редких реликтовых видов растений и разработаны подходы оптимизации сохранения генофондов редких и нуждающихся в охране видов растений.

Практическая значимость и реализация результатов исследований

Использование ретротранспозонов для анализа геномов открывает новые возможности изучения организации и функционирования геномов редких и исчезающих видов растений, являющихся наиболее уязвимым звеном в растительных сообществах, выявления механизмов их устойчивости. Поддержание исторически сложившегося уровня генетического разнообразия популяций как основы сохранения их адаптационного потенциала в естественно колеблющейся и антропогенно трансформированной среде является необходимым условием их существования и развития. Изучение генетической изменчивости природных популяций, оценка их состояния позволяют рекомендовать научно обоснованные меры сохранения популяций редких видов растений.

Разработанная технология идентификации генофондов и ее ключевое звено (методика молекулярно-генетической паспортизации) позволяют оптимизировать сохранение генофондов растений, включая редкие и исчезающие виды растений. Научные выводы работы и рекомендации непосредственно используются при проведении мониторинга популяционного разнообразия редких и нуждающихся в охране видов растений Пермского края, так как автор диссертационной работы является куратором пяти редких реликтовых видов растений от Управления по охране окружающей среды Пермского края. На основе динамики показателей численности и генетического разнообразия бубенчик лилиелистный (Adenophora lilifolia (L.)A.DC.) внесен в Красную книгу Пермского края (2008). Результаты и выводы исследований могут быть использованы для сохранения генофондов редких и нуждающихся в охране видов растений и оптимизации сохранения генетического разнообразия на популяционном уровне и в других регионах страны.

Связь работы с научными программами

Диссертационная работа выполнялась в ходе подготовки и реализации ПГУ приоритетного инновационного национального проекта «Образование» в части «Молекулярная генетика». Популяционно-генетические исследования частично связаны с последовательным циклом программ Управления по охране окружающей среды Пермской области (2006 г): гос. контракты № 6/2006 от 03.04.2006, № 90203 от 10.04.2006, № 90202 от 01.06.2006, № 90211 от 01.06.2006; а также с программами Министерства градостроительства и развития инфраструктуры Пермского края: гос. контракты № 65-0 от 20.06.2007, № 56/1-0 от 13.06.2007, № 11-0 от 18.02.2008, № 43-0 от 17.03.2008.

Часть исследований проводились в связи с тематикой гранта РФФИрурала № 07-04-96032 «Динамика генетического разнообразия и структуры популяционных систем ресурсных растений Пермского края при антропогенных воздействиях» (2006-2009 гг.), гранта РФФИрурала №0704-96016 «Влияние нефтяных загрязнений почв на популяции микроорганизмов и растений Пермского края» (2006-2009 гг.), гранта РФФИ АНФз №08-04-92673 «Участие в российско-австрийском семинаре «Молекулярно-генетические маркеры, филогеография и популяционная генетика для устойчивого лесного хозяйства: Евроазиатская^ перспектива» (2008-2009 гг.). • 0 ^ . >

Личный вклад автора

Разработка подходов, и программы молекулярно-генетических исследований; выбор типов молекулярных маркеров? и объектов исследований; планирование, организация? и проведение полевых; и лабораторных исследований; обработка; обобщение- и< интерпретация представленных в диссертационной работе результатов, их сопоставление с литературными сведениями, разработка теоретических положений;, подготовка практических рекомендаций и- публикаций; написание и: оформление текста;: диссертации; проведены, лично автором- работы. Идея создания' концепции идентификации генофондов; разработка методики молекулярно-генетической паспортизации, выявление мономорфных и полиморфных: идентификационных фрагментов ДНК, а также составление молекулярно-генетической формулы и молекулярно-генетического паспорта единолично принадлежат автору диссертационной! работы. Для гетерогенных природных популяций ; растений1 диссертантом . предложена: запись молекулярно-генетической- формулы в виде: штрихкода. Автор диссертационной работы, является; инициатором' и одним из соавторов обоснования" внесения Adenophora lilifolia (L.) A.DG. в Красную книгу Пермского края- (2008); с категорией угрожаемого состояния 3 (R) -- редкий вид. Результаты части исследований, проведенных совместно е соискателями и аспирантами диссертанта, опубликованы; ссылки на них приведены в соответствующих разделах работы.

Благодарности?

Автор выражает искреннюю признательность за помощь при обучении, повышении квалификации, освоении современных методов молекулярно-генетического анализа, , подготовке диссертационной работы и консультации с.н.с. лаборатории гетерозиса растений ИЦиГ СО РАН В.И. Коваленко и зав. лабораторией академику РАН В.К. Шумному, академику РАЕН, РАСХН (иностранный член) В;И1 Глазко и проф. Т.Т. Глазко;.проф. каф. ботаники и генетики растений ПГУ В.А. Верещагиной, Н.В: Москвиной, зав. кафедрой ботаники и генетики растений ПГУ проф. С.А. Овеснову; сотрудникам группы проф. С.А. Гостимского (особенно с.н.с. З.Г. Кокаевой) и всей кафедре генетики Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова; зав. лабораторией растительной геномики Института биотехнологии университета Хельсинки (Финляндия) проф. А.Х. Шульману и доц. Р.Н. Календарю; зав. лабораторией популяционной генетики ИОГен имени Н.И. Вавилова РАН д.б.н. Д.В. Политову. Выражается искренняя благодарность соавторам по публикациям, а также всем, кто поддерживал и поддерживает развитие молекулярно-генетических исследований в ПГУ. Особая благодарность родным и близким.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Боронникова, Светлана Витальевна

выводы

3. Показано, что изученные редкие реликтовые виды растений характеризуются высоким уровнем генетической изменчивости: на основании полиморфизма ISSR-маркеров установлены доля полиморфных локусов (Р95) в пределах от 81.08% до 91.74%, ожидаемая гетерозиготность (HL ) — от 0.290 до 0.356, а эффективное число аллелей (ис) -от 1.394 до 1.608; на основании полиморфизма IRAP-маркеров — доля полиморфных локусов в пределах от 80.43% до 92.91%, ожидаемая гетерозиготность - от 0.291 до 0.432, а эффективное число аллелей - от 1.496 до 1.759.

4. Выявлено, что генетическая изменчивость у исследованных редких реликтовых видов растений варьирует в узких пределах (уровень полиморфизма ISSR-маркеров - от 81.08 % у D. grandiflora до 91.74 % у А. vernalis; уровень полиморфизма IRAP-маркеров - от 80.43% у A. sibirica до 92.91% A. vernalis), несмотря на небольшую эффективную численность популяций, а также их дифференциацию и изолированность.

5. Установлено, что основные показатели генетического разнообразия изученных популяций A. vernalis достоверно (/-=0.636; р =0.048 для ожидаемой гетерозиготности; r=0.646; р =0.044 для числа эффективных аллелей; г =0.662; р =0.037 для индекса разнообразия Шеннона) и линейно коррелируют с долей средневозрастных генеративных особей (g,), составляющих эффективную численность изученных популяций.

6. Виды рода Adonis характеризуются высоким уровнем межпопуляционной дифференциации (Gsr равен 39.90% у A. vernalis и 35.77% у A. sibirica). Величина параметра ниже у D. grandiflora (27.22 %) и Ad. lilifolia (15.51%).

8. Выявлено, что у A. vernalis и A. sibirica часть популяций находится на пороге деградации генофонда из-за антропогенных факторов, среди которых преобладает разрушение местонахождений из-за строительства горнолыжной трассы (Asl), нефтепровода (Av7), дорог (Av3, AvlO), а также из-за вытаптывания вследствие выпаса скота и посещения людьми.

9. Для отбора в качестве объектов сохранения рекомендуются локальные группы популяций с наиболее типичными характеристиками генофондов, такие как популяции A. vernalis, расположенные в центральной части островной Кунгурской лесостепи (Av4, Av5, Av9), а также отдельные популяции, такие как третья (As3) популяция A. sibirica из Ильинского района, третья (Ad.lil.3') популяция Ad. lilifolia из Ординского района и вторая (Dg2) популяция D. grandiflora из Кунгурского района Пермского края.

10. Установлены специфические характеристики генофондов (уникальные сочетания аллелей многих локусов) для ряда популяций: самой северной популяции (Av2) A. vernalis на Спасской горе; (Avl) A. vernalis и (Dg3) D.grandiflora, расположенных в островной Кунгурской лесостепи; а также (Ad.lil.l) Ad. lilifolia, расположенной на горе Подкаменной, и (Asl) А. sibirica из центральной части Пермского края.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Боронникова, Светлана Витальевна, Пермь

1. Айала Ф. Введение в популяционную и эволюционную генетику. М.: Мир, 1984. 230с.

2. Аксельрод Д.М. Биологические особенности и приемы возделывания горицвета весеннего // Дикорастущие и интродуцируемые полезные растения в Башкирии. Уфа, 1961. Вып. 1. С. 25—36.

3. Алтухов Ю.П. Динамика генофондов при антропогенных воздействиях // Вестн. ВОГиС. 2004. Т. 8, № 2. С. 40-59.

4. Алтухов Ю.П. Внутривидовое генетическое разнообразие: мониторинг и принципы сохранения // Генетика. 1995а. Т. 31. С. 1333-1357.

5. Алтухов Ю.П. Генетика популяций и сохранение биоразнообразия // Соросовский образоват. журн. 19956. №1. С.32-43.

6. Алтухов Ю.П. Генетика природных популяций и ресурсы биосферы // Вестн. АН СССР. 1975. №10. С.37-45.

7. Алтухов Ю.П. Генетические процессы в популяциях: Учеб. пособие. 3-е изд., перераб. и доп. / Отв. ред. Л.А. Животовский. М.: ИКЦ «Академкнига», 2003. 431с.

8. Алтухов Ю.П., Крутовский К.В., Духарев В.А. и др. Биохимическая генетика популяций лесных древесных растений // Материалы междунар. симп. «Лесная генетика, селекция и физиология древесных растений». М.: Наука, 1989. 222 с.

9. Алтухов Ю.П., Салменкова Е.А. Полиморфизм ДНК в популяционной генетике //Генетика. 2002. Т. 38, № 9. С. 1173-1195.

10. Андреева И.З. Онтогенез бубенчика лилиелистного (Adenophora lilifolia (L.) A.DC.) // Онтогенетический атлас. Т.5. С. 110-114.

11. Артюкова Е.В., Козыренко М.М., Корень О.Г. и др. RAPD- и аллозимный анализ генетической изменчивости Panax ginseng С.A. Meyer и P. quinquefolius L. // Генетика. 2004а. Т. 40, №2. С. 239-247.

12. Артюкова Е.В., Холина А.Б., Козыренко М.М., Журавлев Ю.Н. Анализ генетической изменчивости редкого эндемичного вида Oxytropis chankaensis Jurtz. (Fabaceae) на основе RAPD-маркеров // Генетика. 20046. Т. 40, № 7. С. 877-884.

13. Байрамгулов Н.Р., Янбаев Ю.А. Генетическая изменчивость и субпопуляционная дифференциация Rhodiola iremelica Boriss. // Неделя науки: материалы науч. конф. Сибайск. ин-та БашГУ. Сибай, 2001. С. 24-25.

14. Байрамгулов Н.Р., Янбаев Ю.А. Внутрипопуляционная дифференциация родиолы иремельской // Сб. науч. тр. асп. и мол. препод. Сибайск. ин-т БашГУ. Сибай, 2003. С. 40-43.

15. Банникова А.А., Матвеев В.А., Крамеров Д.А. Опыт использования интер-SINE-nHP в изучении филогенеза млекопитающих // Генетика. 2002. Т. 38, №6. С. 853-864.

16. Барыкина Р.П., Чубатова Н.В. Онтогенез пиона уклоняющегося (Paeonia anomala L.) // Онтогенетический атлас растений. Йошкар-Ола: Изд-во МарГУ, 2007. Т. V. С. 191-196.

17. Белковская Т.П., Овеснов С.А. Охраняемые виды растений Пермской области // Растительный мир Прикамья. Пермь: Перм. кн. изд-во, 1988. С. 155-161.

18. Бельтюкова Н.Н., Боронникова С.В., Кариева Л.Г. Исследование генетического полиморфизма лекарственного вида Digitalis grandiflora Mill, с использованием анализа ретротранспозонов // Аграрная Россия. 2009. №4. С. 20-23.

19. Беляев А.Ю., Васфилова Е.С. Аллозимный полиморфизм и клоновая структура в популяциях солодки на Южном Урале и в Приуралье // Современное состояние и пути развития популяционной биологии. Ижевск: Книгоград, 2008. С. 332-334.

20. Бирюкова В.А., Зайцев B.C., Хавкин Э.Е. и др. ДНК-маркеры в селекции картофеля // Достижения науки и техники АПК. 2003. №10. С. 38— 41.

21. Боронникова С.В. Репродуктивная биология колокольчиковых // Вестн. Перм. ун-та. 1995. Вып. 1. Биология. С. 28-36.

22. Боронникова С.В., Лееникова Н.Н. Биологические особенности растений Предуралья, нуждающихся в охране // Проблемы региональной Красной книги: межведомствен, сб. науч. тр. Пермь, 1997. С. 123-125.

23. Боронникова С.В. Семенная продуктивность некоторых видов сем. Campanulaceae (Пермская обл.) // Раст. ресурсы. 1999. Вып. 2. С. 43-48.

24. Боронникова С.В. Куницына Е.Г. Оценка состояния двух ценопопуляций пиона уклоняющегося в Пермской области // Вестн. Перм. ун-та. 2001. Вып.4. Биология. С. 17—21.

25. Боронникова С.В. Семенная продуктивность Lilium martagon L. subsp. pilosiusculum (Freyn) Miscz. Ex Iljin и Paeonia anomala L. (Пермская обл) // Раст. ресурсы. 2002. Вып. 3. С. 50-53.

26. Боронникова С.В. Гетерогенность ценопопуляций двух видов род Adonis L. //Вестн. Перм. ун-та. 2005. Вып. 6. Биология. С. 22—36.

27. Боронникова С.В. Молекулярно-генетическая идентификация и паспортизация редких и находящихся под угрозой уничтожения видов растений / Перм. ун-т. Пермь, 2008а. 120 с.

28. Боронникова С.В., Тихомирова Н.Н. Анализ генетической изменчивости популяций двух редких лекарственных видов рода Adonis с использованием ISSR-маркеров // Изв. ТСХА. 2008. №1. С. 86-94.

29. Боронникова С.В. Молекулярное маркирование и генетическая паспортизация ресурсных и редких видов растений с целью оптимизации сохранения их генофондов // Аграрный вестник Урала. 2009а. №2 (56). С. 5759.

30. Боронникова С.В. Молекулярно-генетическая паспортизация редких реликтовых видов растений // Вестн. Новосибир. гос. ун-та. 20096. Т. 7, вып. 3. С. 3-8.

31. Боронникова С.В. Генетическая паспортизация популяций редких видов растений рода Adonis с использованием ISSR- и IRAP-маркеров // Изв. ТСХА. 2009в. №1. С. 83-89.

32. Боронникова С.В. Исследование генетической изменчивости популяций редкого вида Урала Adenophora lilifolia (L.) A.DC. на основании анализа полиморфизма ISSR-маркеров // Генетика. 2009г. Т. 45, №5. С. 652— 655.

33. Боронникова С.В. Генетическая паспортизация редких видов растений как основа оптимизации сохранения их генофондов // Вопр.современной науки и практики / Ун-т им. В.И. Вернадского. 2009д. №3 (17). С. 8-15.

34. Боронникова С.В. Технология идентификации и оценки состояния генофондов растений // Аграрный вестник Урала. 2009е. №8 (61). С. 71-73.

35. Боронникова С.В., Тихомирова Н.Н. Семенная продуктивность редкого лекарственного вида Digitalis grandiflora Mill, в Пермском крае // Раст. ресурсы. 2009. №2. С. 17-22.

36. Боронникова С.В., Светлакова Т.Н., Бобошина И.В. Изучение генетического полиморфизма Populus tremula L. с использованием ISSR- и IRAP- маркеров // Аграрная Россия. 2009а. №2. С. 20-22.

37. Боронникова С.В., Тихомирова Н.Н., Кравченко. О.А. Характеристика генофондов редкого лекарственного вида Adonis vernalis L. с использованием ISSR-маркеров // Аграрный вестн. Урала. 20096. № 5 (59). С. 67-70.

38. Брик А.Ф., Сиволап Ю.М. Молекулярно-генетическая идентификация и паспортизация сортов сои // Генетика. 2001. № 37(9). С. 1266-1273.

39. Вайнагий И.В. Методика статистической обработки материала по семенной продуктивности растений на примере Potentilla aurea L. // Раст. ресурсы. 1973. Т. 9, вып. 2. С. 287-296.

40. Вайнагий И.В. О методике изучения семенной продуктивности растений // Ботан. журн. 1974. Т. 59, №6. С. 826-831.

41. Вахрамеева М.Г. Охрана растительного мира. М.: Изд-во МГУ, 1988. 96 с.

42. Вахрамеева М.Г. Охрана флоры // Итоги науки и техники. Сер. ботаника. Т.11: Проблемы охраны растительного покрова. М. 1991. С. 3-62.

43. Вдовиченко Л.Д., Глазко В.И. ISSR-PCR маркеры при паспортизации пшениц // Сельскохоз. биология. 2007. №3. С. 33-37.

44. Верещагина В.А., Боронникова С.В. Охрана генофонда дикорастущих декоративных растений Предуралья // Охраняемые природные территории. Проблемы выявления, исследования, организации систем: тез. докл. межвузов, науч. конф. Пермь, 1994. Ч. 2. С. 8—10.

45. Верещагина И.В. Зеленое чудо Алтая. Барнаул: Алтайское книжное изд-во, 1983. 152с.

46. Верещагина И.В. Пион степной — Paeonia hybrida Pall. // Биол. основы охраны редких и исчезающих растений Сибири. Новосибирск: Наука, 1990. С. 131-158.

47. Вержбицкий И.Б., Беляев А.Ю. Аллозимный полиморфизм солодки (Glycyrrhiza L.) в пойменных ландшафтах среднего течения реки Урал // Проблемы глобальной и региональной экологии: материалы конф. молодых ученых. Екатеринбург: Академкнига, 2003. С. 31-33.

48. Гвоздев В.А. Подвижная ДНК эукариот. Роль в регуляции активности генов и эволюции генома // Соросовский образоват. журн. 1998. №8. С. 15-21.

49. Георгиев Г.П. Гены высших организмов и их экспрессия. М.: Наука, 1989. 254 с.

50. Глазко В.И. Агроэкологический аспект биосферы: проблема генетического разнообразия Краснодар: Нора-принт, 1998. 208.С.

51. Глазко В.И., Глазко Г.И. Введение в генетику. Биоинформатика. ДНК-технология. Генная терапия. ДНК-экология. Протеомика. Метаболика Киев: КВЩ, 2003. 640 с.

52. Глазко В.И., Дубин А.В., Календарь Р.Н. и др. Генетические взаимоотношения между сортами сои, оцененные с использованием ISSR-маркеров //Цитология и генетика. 1999. Т. 33, №5. С. 47.

53. Глазко Т.Т, Глазко В.И. Молекулярно-генетические подходы в селекции зерновых // Изв. ТСХА. 2006, №4. С. 100-107.

54. Глазко В.И., Глазко Т.Т. Перспективы и ограничения использования нанотехнологий в геномных исследованиях // Нанотехнологии в сельском хозяйстве: докл. междунар. науч.-практ. конф. М.: Изд-во РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева. 2008. С. 20-21.

55. Голубев В.Н., Молчанов Е.Ф. Методические указания к популяционно-количественному и эколого-биологическому изучению редких и эндемичных растений Крыма. Ялта, 1978. 41с.

56. Горчаковский П.Л., Шурова Е.А. Редкие и исчезающие растения Урала и Предуралья. М.: Наука, 1982. 283 с.

57. Гостимский С. А., Кокаева З.Г., Коновалов Ф.А. Изучение организации и изменчивости генома растений с помощью молекулярных маркеров // Генетика. 2005. Т. 41, № 4. С. 480-490.

58. Денисова Л.В., Никитина С.В., Заугольнова Л.Б. Программа и методика наблюдений за ценопопуляциями видов растений Красной книги СССР / ВНИИ охраны природы и заповедного дела. М.: Госагропром СССР, 1986. 34 с.

59. Дикорастущие полезные растения России / под ред. А.Л. Буданцева, Е.Е. Лесиовской. СПб.: Изд-во СПХФА, 2001. 663 с.

60. Динамика популяционных генофондов при антропогенных воздействиях / под ред. Ю.П. Алтухова. М.: Наука, 2004. 619 с.

61. Драгавцев В.А., Дьяков А.Б. Теория селекционной идентификации генотипов растений по фенотипам на ранних этапах селекции // Фенетика популяций. М.: Наука, 1982. С.30-37.

62. Евгеньев М.Б. Мобильные элементы и эволюция генома // Молекулярная биология. 2007. Т. 41, №2. С. 234-245.

63. Жеребцова М.И. Генетическая структура популяций дикорастущих тюльпанов // Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях. Звенигород, 2008. С. 26.

64. Животовский Л.А. Показатель внутрипопуляционного разнообразия //Журн. общ. биологии. 1980. Т. 41, № 6. С. 828-836.

65. Животовский Л.А. Популяционная биометрия. М.: Наука, 1991. 271с.

66. Животовский Л.А. Статистические методы анализа частот генов в природных популяциях // Итоги науки и техники. Общая генетика. М.: ВИНИТИ АН СССР. 1983. Т. 8. С. 76-104.

67. Журавлев Ю.Н., Козыренко М.М., Артюкова Е.В. и др. ПЦР-генотипирование женьшеня с использованием произвольных праймеров // Докл. Академии наук. 1996. Т. 34, №1. С. 111-114.

68. Журавлев Ю.Н., Корень О.Г., Музарок Т.И. и др. Молекулярные маркеры для сохранения редких видов растений Дальнего Востока // Физиология растений. 1999. Т. 46, №6. С. 953-964.

69. Жученко А.А. Адаптивная система селекции растений (эколого-географические основы): монография: в 2 т. М.: Изд-во РУДН, 2001. 1489с.

70. Зайцев B.C., Хавкин Э.Е. Идентификация генотипов растений с помощью ПЦР-анализа рассеянных повторов последовательностей R173 // Докл. РАСХН. 2001. №2. С. 3-5.

71. Зеленин А.В. Геном растений // Вестн. Росс. Академии наук. 2003. Т.73, №9. С. 797-806.

72. Злобин Ю.А. Принципы и методы изучения ценотических популяций растений: учеб.-метод. пособие. Казань: Изд-во Казан, ун-та, 1989. 146 с.

73. Иванина Л.И. Род Digitalis L. и его практическое применение // Тр. ботан. ин-та им. В.Л. Комарова АН СССР. Л., 1955. Т. 1, вып. 2. С. 198 -308. .

74. Иллюстрированный определитель растений Пермского края / С.А. Овеснов, Е.Г. Ефимик, Т.В. Козьминых, О.Г. Баранова и др.; под ред. С.А. Овеснова. Пермь: Книжный мир, 2007. 743 с.

75. Ишмуратова М.М. Rhodiola iremelica (Crassulaceae) на Южном Урале // Ботан. журн. 2002. Т. 87, № 5. С. 38-50.

76. Ишмуратова М.М. Родиола иремельская на Южном Урале. М.: Наука, 2006. 252 с.

77. Кайданов Л.З. Генетика популяций: учеб. для биол., мед. и с.-х. спец. вузов/ под ред. С.Г. Инге-Вечтомова. М.: Высш. шк., 1996. 320 с.

78. Календарь Р. Н., Глазко В.И. Типы молекулярно-генетических маркеров и их применение // Физиология и биохимия культурных растений. 2002. Т. 34, №.4. С. 141-156.

79. Камелин Р.П., Овеснов С.А., Шилова С.И. Неморальные элементы во флорах Урала и Сибири. Пермь: Изд-во Перм. ун-та, 1999. 83 с.

80. Кокаева З.Г., Боронникова С.В., Тихомирова Н.Н., Дрибноходова О.П. Анализ генетического разнообразия популяционных систем редких и ресурсных видов растений // Докл. МОИП. М., 2006. С. 75-79.

81. Кокаева З.Г., Гостимский С.А. Изучение генетического разнообразия сортов, линий и мутантов гороха посевного с помощью ДНК-маркеров, полученных на основе ретротранспозонов // Сельскохоз. биология. 2006. №5. С. 1-5.

82. Конарев А.В. Адаптивный характер молекулярного полиморфизма и его использование в решении проблем генетических ресурсов растений и селекции // Аграрная Россия. 2002. №3. С. 4-11.

83. Конарев В.Г. Белки растений как генетические маркеры. М.: Колос, 1983.320 с.

84. Конвенция о биологическом разнообразии Электронный ресурс. Рио-де-Жанейро, 1992. URL: http://www.isu.ru/inst/botcad/cbd/cbd rus.htm (дата обращения: 10.06.2009).

85. Коржинский С.И. Следы древней растительности на Урале // Изв. Росс. Академии наук. 1894. Т. 1. Сер.5. С. 21-31.

86. Корочкин Л.И., Серов. O.JL, Пудовкин А.И. и др. Генетика изоферментов. М.: Наука, 1977. 275 с.

87. Кочерина В.А., Драгавцев В.А. Введение в теорию эколого-генетической организации полигенных признаков растений и теорию селекционных индексов. СПб: СЦДБ, 2008. 88с.

88. Красильников П.К. Методика полевого изучения частей растений (с учетом специфики ресурсоведческих исследований) JI.: Наука, 1983. 208с.

89. Красная книга Пермского края / М.А. Бакланов, С.В.Баландин, Т.П. Бедлковская и др.; под общ. науч. ред. А.И. Шепеля. Пермь: Книжный мир, 2008. 256 с.

90. Красная книга Республики Башкортостан. Т.1 .Редкие и исчезающие виды высших сосудистых растений / Е.В.Кучеров, А.А. Мулдашев, А.Х. Галеева. Уфа: Китап, 2001. 280 с.

91. Красная книга РСФСР: Растения / отв. ред. A.JI. Тахтаджян. М.: Росагропромиздат, 1988. 590с.

92. Красная книга Свердловской области. Электронный ресурс. Екатеринбург, 2008. URL: http:// www.redbook.ru/artical 1054.html (дата обращения: 10.06.2009, 26.10.2009).

93. Красная книга Среднего Урала (Свердловская и Пермская области): Редкие и находящиеся под угрозой исчезновения виды животных и растений. Екатеринбург: Изд-во Урал, ун-та, 1996. 279 с.

94. Красная книга Удмуртской Республики. Сосудистые растения, лишайники и грибы / под ред. В.В. Туганаева. Ижевск: Изд-во Удмурт, ун-та, 2001.290 с.

95. Красный список особо охраняемых редких и находящихся под угрозой исчезновения животных и растений. 4.3.1. Семенные растения. М., 2005. 352 с.

96. Крылов П.Н. Флора Западной Сибири. 2-е изд. Томск: Изд-во Том. ун-та и Том. отд-ния ВБО, 1931. Вып. 5. С.981-1227.

97. Кудрявцев A.M. Создание системы генетических маркеров твердой пшеницы (Т. durum) и ее применение в научных исследованиях и практических разработках: автореф. дис. д-ра биол. наук М.: Изд-во ИОГен им. Н.И. Вавилова РАН, 2007. 47 с.

98. Юб.Кулаева О.Н. Белки теплового шока и устойчивость растений к стрессу // Соросовский образоват. журн. 1997. № 2. С. 5-13.

99. Кутлунина Н.А. Генотипическое разнообразие в популяциях клонообразующих растений // Материалы X Всероссийского популяционного семинара «Современное состояние и пути развития популяционной биологии». Ижевск, 2008. С. 345-347.

100. Кутлунина Н.А., Беляев А.Ю. Генотипическое разнообразие и клоновая структура в популяциях двух близкородственных видов тюльпанов на Южном Урале // Вестн. Оренбург, гос. ун-та. 2008. №2. С. 93-98.

101. Кучеров Е.В. Дикорастущие пищевые растения Башкирии и их использование. Уфа, 1990. С. 68-69.

102. Кучеров Е.В., Мулдашев А. А., Галеева А. X. Эколого-ценотическая характеристика Adonis vernalis L. на Южном Урале // Раст. ресурсы. 1993. Вып. 2, №2. С. 11-16.

103. Кучеров Е.В., Щелокова Л.Г. Наперстянка крупноцветковая на Урале и ее рациональное использование. Уфа: Изд-во БФАН СССР, 1987. 124 с.

104. Лакин Г.Ф. Биометрия: Учеб. пособие для биол. спец. вузов. 4-е изд., перераб. и доп. М.: Высш. шк., 1990. 352 с.

105. Лебедева Н.В. Измерение и оценка биологического разнообразия. Ростов н/Д: УПЛ РГУ, 1999. Ч. 2. 94 с.

106. Лебедева Н.В., Дроздов Н.Н., Криволуцкий Д.А. Биоразнообразие и методы его оценки. М.: МГУ, 1999. 94 с.

107. ЛевонтинР.С. Генетические основы эволюции. М.: Мир, 1978. 351 с.

108. Любомирская Н.В., Ильин Ю.В. Мобильные генетические элементы эукариот: прошлое, настоящее, будущее // Молекулярная биология. 1999. Т.ЗЗ, №6. С. 958-968.

109. Малышев С.В., Урбанович О.Ю., Картель Н.А. Идентификация и паспортизация сортов сельскохозяйственных культур (мягкой пшеницы, картофеля, томата, льна и свеклы) на основе ДНК-маркеров: метод, рекомендации. Минск, 2006. 28 с.

110. Метаковский Е.В., Коваль С.Ф., Созинов А.А. Генетические формулы глиадина у сортов мягкой яровой пшеницы северного Казахстана // Селекция и семеноводство. 1988. №1. С. 11-13.

111. Молекулярная генетика: учеб.-метод. пособие / под. ред. С.В. Боронниковой; Перм.ун-т. Пермь, 2007. 150 с.

112. Мулдашев А.А. Флористические находки в Башкортостане (Россия) //Ботан. журн. 2003. Т. 88, № 1. С. 120-129.

113. Мэгарран Э. Экологическое разнообразие и его измерение. М.: Мир, 1992.184 с.

114. Назаров Н.Н. География Пермского края. 4.1. Природная (физическая) география. Пермь, 2006. 139 с.

115. Николаева М.Г., Разумова М.В., Гладкова В.Н. Справочник по проращиванию покоящихся семян. JL: Наука, 1985. 347 с.

116. Нухимовский E.JL, Нухимовская Ю.Д. Экологическая морфология некоторых лекарственных растений в естественных условиях их произрастания. 5. Paeonia anomala L. // Раст. ресурсы. 1978. Т. 14, вып. 3. С. 347-355.

117. Овеснов С.А. Конспект флоры Пермской области. Пермь: Изд-во Перм. ун-та, 1997. 203 с.

118. Оганисян А.С., Кочиева Е.З, Рысков А.П. Маркирование видов и сортов картофеля с помощью метода RAPD-PCR // Генетика. 1996. Т. 32, №3. С. 448-451.

119. Особо охраняемые природные территории Пермской области: реестр. Пермь: Книжный мир, 2002. 464 с.

120. Политов Д.В. Генетика популяций и эволюционные взаимоотношения видов сосновых (сем. Pinaceae) Северной Евразии:автореф. дис. д-ра. биол. наук. М.: Изд-во ИОГен им. Н.И. Вавилова РАН, 2007. 47 с.

121. Политов Д. В. Применение молекулярных маркеров в лесном хозяйстве для идентификации, инвентаризации и оценки генетического разнообразия лесных ресурсов // Лесохозяйственная информация. 2008. Т. 34. С. 24-27.

122. Пономарев А.Н. Лесостепной комплекс северной окраины Кунгурской лесостепи // Изв. Естест.-науч. ин-та при Молотов, ун-те. 1948. Т. 12, вып. 6. С. 225-233.

123. Пошкурлат А.П. Европейская часть ареала Adonis vernalis L. // Ботан. журн. 1974. Т. 59, №9. С. 1347-1358.

124. Пошкурлат А.П. Род горицвет Adonis L. Систематика, распространение, биология. М.: Наука, МАИК «Наука / Интерпериодика», 2000. 199 с.

125. Путенихин В.П. Популяционная структура и сохранение генофонда хвойных видов на Урале: автореф. дис. . д-ра. биол. наук. Красноярск, 2000. 48с.

126. Путенихин В.П., Фарукшина Г.Г. Методы сохранения генетической гетерогенности при создании искусственных "популяций" лесообразующих видов // Хвойные бореальной зоны. 2007. Т. XXIV, № 2 3. С. 272-278.

127. Работнов Т.А. Жизненный цикл многолетних травянистых растений в луговых ценозах // Тр. ботан. Ин-та АН СССР. 1950. Сер. 3, вып. 6. С. 7204.

128. Работнов Т. А. Методы изучения семенного размножения травянистых растений в сообществах // Полевая геоботаника. М., Л., 1960. Т. 2. С. 20-40.

129. Рамазанова С.А. Идентификация сортов сои с использованиеммолекулярно-генетических методов: автореф. дис. канд. биол. наук. Краснодар, 2008. 26 с.

130. Ратнер В.А. Математическая популяционная генетика (элементарный курс). Новосибирск: Наука, 1977. 75 с.

131. НЗ.Редькина Н.Н Состояние генофонда эхинацеи, интродуцированной в Башкирском Зауралье // Материалы междунар. науч. конф. «Растительный мир и его охрана». Алма-Ата, 2007. С. 250-252.

132. Рысков А.П. Мультилокусный ДНК-фингерпринтинг в генетико-селекционных исследованиях биоразнообразия // Молекулярная биология. 1999. №6. С. 997-1011.

133. Рябинина H.JL, Банникова А.А., Шереметьева В.А. и др. Анализ ДНК высших приматов с помощью интер-SINE-nilP // Генетика. 2008. Т. 44, №3. С. 315-322.

134. Салина Е.А., Егорова Е.М., Адонина И.Г. и др. ДНК-маркеры для генотипирования линий мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) с генетическим материалом Aegilops speltoides Tausch и Triticum timopheevii Zhuk. // Вестн. ВОГиС. 2008. Т. 12, №4. С. 620-628.

135. Сациперова И.Ф. Основные аспекты и методы изучения репродуктивной биологии травянистых растений при интродукции // Тр. ботан. ин-та им. B.JI. Комарова РАН. СПб, 1993. Вып. 8. С. 25-35.

136. Серебровский А.С. Генетический анализ. М.: Наука, 1970. 342с.

137. Серебровский А.С. Геногеография и генофонд сельскохозяйственных животных // Науч. слово. 1928. № 8. С. 7-42.

138. Смирнов Е.С. О кодировании признаков для таксономического анализа//Журн. общ. биологии. 1971. Т.32, № 2. С. 224-228.

139. Смирнов Е.С. Таксономический анализ. М., 1969. 187 с.

140. Соболев В.В., Карлов Г.И., Соболева А.Г. и др. Использование ISSR-маркеров для молекулярно-генетической идентификации и паспортизации сортов малины // Сельскохоз. биология. 2006. №5. С. 48-52.

141. Состояние окружающей среды Пермского края в 2006 году. Пермь, 2007. 237 с.

142. Стегний В.Н. Системная реорганизация генома при видообразовании // Эволюционная биология: материалы конф. «Проблема вида и видообразования». Томск, 2001. Т. 1. С. 128-137.

143. Стратегия сохранения редких и находящихся под угрозой исчезновения животных, растений и грибов. Электронный ресурс.: приложение к приказу МПР России от 06.04.2004. №323. URL:http://www.mpr.gov.ru/old. (дата обращения: 10.06.2009).

144. Строкова Н.П К вопросу о биологии и экологии горицвета весеннего Adonis vernalis L. в Челябинской области // Вопр. биологии и экологии доминантов и эдификаторов растительных сообществ. Ученые зап. Т. 84. Пермь, 1968. С. 137-143.

145. Строкова Н.П., Пошкурлат А.П. Численность и возрастной состав популяций горицвета весеннего на Южном Урале // Флора и растительность Урала и пути их охраны: межвуз. сб. науч. тр. Челябинск: ИГПН, 1983. С. 6076.

146. Строкова Н.П., Акшенцев Е.В. Онтогенез горицвета весеннего {Adonis vernalis L.) // Онтогенетический атлас. 5-е изд. Йошкар-Ола, 2007. С. 163-168.

147. Сукачев В.Н. О полиморфизме и апомиксисе у видов рода Adenophora Fisch. // Ботан. журн. 1940. Т. 25, № 4-5. С. 297-303.

148. Тахтаджан A.JI. Система магнолиофитов. JL: Наука., 1987. 438 с.

149. Тахтаджян A.JI. Порядок Пионовые (.Paeoniaceae) // Жизнь растений. Т.5, 4.2. М.: Просвещение, 1981. С. 16-18.

150. Тимофеев-Ресовский Н.В., Яблоков А.В., Глотов Н.В. Очерк учения о популяциях. М.: Наука, 1973. 277 с.

151. Тихонова B.JI. Стратегия мобилизации и сохранения генофонда редких и исчезающих видов растений. Консервация генетических ресурсов. Пущино, 1985. 34 с.

152. Уиттекер Р. Сообщества и экосистемы. М.: Прогресс, 1980. 326с.

153. Уранов А.А. Возрастной спектр фитоценопопуляций как функция времени и энергетических волновых процессов // Науч. докл. высш. шк. Биол. науки. 1975. № 2. С. 7-33.

154. Федоров Н.И., Редькина Н.Н., Михайленко О.И. и др. Аллозимная изменчивость эндемичного растения Южного Урала Delphinium nralense Nevski и широко распространенного Delphinium dictyocarpum DC. // Вестн. Оренбург, гос. ун-та. 2007. № 75. С. 373-376.

155. Федоров Н.И., Редькина Н.Н., Михайленко О.И., Янбаев Ю.А. Географическая изменчивость аллозимов Aconitum lycoctonum L. (Ranunculaceae) на Южном Урале//Ботан. журн. 2008. Т. 93, № 1. С. 80-87.

156. Флора СССР / под ред. В.Л. Комарова. М; Л.: Изд-во АН СССР, 1937. Т. 7. С. 528-536.

157. Флора СССР / под ред. В.Л. Комарова. М; Л.: Изд-во АН СССР, 1957. Т. 24. С. 502.

158. Флора СССР / под ред. В.Л. Комарова. М; Л.: Изд-во АН СССР, 1958. Т. 22. С. 520.

159. Фризен Н.В. Семейство Paeoniaceae Пионовые // Флора Сибири. Т. 6. Portulacaceae—Ranunculaceae. Новосибирск: Наука, 1993. С. 98.

160. Хавкин Э.Е. Молекулярная селекция растений: ДНК-технологии создания новых сортов сельскохозяйственных культур // Сельскохоз. биология. 2003. №3. С. 26-39.

161. Хавкин Э.Е. Молекулярные маркеры в растениеводстве // Сельскохоз. биология, 1997. №5. С. 3-21.

162. Хедрик Ф. Мир биологии: генетика популяций. М.: Техносфера, 2003. 592 с.

163. ХлесткинаЕ.К., СалинаЕ.А. SNP-маркеры: методы анализа, способы разработки и сравнительная характеристика на примере мягкой пшеницы // Генетика. 2006. Т. 42. С. 725-736.

164. Хромосомные числа цветковых растений: справочник / сост. З.В. Волховских, В.Г. Гриф, О.И. Захарьева, Т.С. Матвеева. Д.: Наука, 1969. 236 с.

165. Цветков И.А., Иванов А.Н., Глазко В.И. Генетическая дифференциация сортов риса по IRAP-маркерам // Изв. ТСХА. 2006. №4. С. 155-159.

166. Ценопопуляции растений (основные понятия и структура) / под ред. Т.И. Серебрякова, Т.Г. Соколова. М.: Наука, 1976. 216 с.

167. Чесноков Ю.В ДНК-фингерпринтинг и анализ генетического разнообразия у растений // Сельскохоз. биология. 2005. № 1. С. 20-40.

168. Чопик В.И. Редкие и исчезающие растения Украины. Киев: Наукова думка, 1978. 128 с.

169. Чопик В.И. Редкие и исчезающие растения Украины. Киев: КВЩ, 2000. 248 с.

170. Шипчинский Н.В. Пион Paeonia L. // Флора СССР. Т. VII. M.;JT.: Изд-во АН СССР, 1937. С. 24-35.

171. Шнеер B.C. О видоспецифичности ДНК: 50 лет спустя // Биохимия. Т. 72, №12. С. 1690-1699.

172. Шнерр B.C. ДНК-штрихкодирование видов животных и растений -способ их молекулярной идентификации и изучения биоразнообразия // Журн. общ. биол. 2009. Т. 70, №4. С. 296-315.

173. Щелокова Л.Г., Глумов Г.А. Наперстянка крупноцветковая в Предуралье // Раст. ресурсы Южного Урала и Среднего Поволжья и вопр. рационального их использования. Уфа, 1974. С. 39-40.

174. Яковлев М.С., Иоффе М.Д. Эмбриология некоторых представителей рода Paeonia. Морфология цветка и репродуктивный процесс у покрытосеменных растений. Л.: Наука, 1965. С. 61—73.

175. Яковлев М.С., Некратова Н.А., Гусева Л.И. Пион уклоняющийся, марьин корень, чегна, шегня Paeonia anomala L. // Биол. особенности растений Сибири, нуждающихся в охране. Новосибирск: Наука, 1986. С. 148— 178.

176. Янбаев Ю.А., Косарев М.Н., Бахтиярова P.M. и др. Генетические аспекты сохранения биологического разнообразия. Уфа, 2000. 108 с.

177. Янбаев Ю.А. Эколого-популяционные аспекты адаптации лесообразующих видов к условиям природной и техногенной среды: автореф.дис. д-ра биол. Наук /ИЭВБ РАН. Тольятти, 2002. 35 с.

178. Янбаев Ю.А., Байрамгулов Н.Р., Редькина Н.Н., Муллагулов Р.Ю. Популяционная структура и принципы сохранения генофонда родиолы иремельской на Южном Урале. Уфа, 2007. 183 с.

179. Allard R.W. Genetic changes associated with the evolution of adaptedness in cultivated plants and their progenitors // J. Hered. 1988. V. 79, №4. P. 225-238.

180. Alvarez I., Wendel J.F. Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference // Mol. Phylogenet. EV. 2003. V. 29, № 3. P. 417-434.

181. Ananiev E.V., Ananiev E.V., Gvozdev V.A. et al. Reiterated genes with varying tion in intercalary heterochromatin regions of Drosophila melanogaster polytene chromosomes // Chromoson. 1978. V. 70. P. 1-17.

182. Arkhipova I.R., Lyubomirskaya N.V., Ilyin Y.V. Drosophila retrotransposons. Austin. TX Molecular Biology Intelligen. Unit: KR.G Landes Company, 1995. 130 p.

183. Arkhipova I.R., Pyatkov K.I., Meselson M. et al. Retroelements containing introns in diverse invertebrate taxa // Nature Genet. 2003. V. 33. P. 123-124.

184. Baumel A., Ainouch M., Kalendar R. et al. Retrotransposons and genomic stability in populations of the young allopolyploid species Spartina anglica Hubard (Poaceae) //Molecular Biology and Evolution. 2002. V. 19. №8. P. 1218-1227.

185. Baymiev A.K., Chemeris A.V., Chemeris D.A. et al. Digital identification of genetic materials and methods for acquiring data for it // Patent Cooperation Treaty. PCT WO 03/066899 Al. World Intellectual Property Organization. 14. 2003. P. 39.

186. Brown P.T.H., Lange F.D., Kranz E., Lorz H. Analysis of single protoplasts and regenerated plants by PCR and RAPD technology // Mol. Gen. Genet. 1993. V. 237. P. 311-317.

187. Caetano-Anolles G. MAAP: a versatile and universal tool for genome analysis // Plant Mol. Biol. 1994. V. 25. P. 1011-1026.

188. Caetano-Anolles G. Scanning of nucleic acids by in vitro amplification: New developments and applications // Nature Biotechnology. 1996. V. 14. P. 1668-1674.

189. Cavalli-Sforza L.L., Bodmer W.F. The genetic of humans populations San-francisco: Freeman, 1971. 962 p.

190. Capy P., Bazin C., Higuet D., Langin T. Dynamics and evolution of transposable elements. New York: Chapman and Hall, 1998. 197 p.

191. Chalmer K.J., Waugh R., Sprent J.I. et al. Detection of genetic variation between and within populations of Gliricidia sepium and G. maculata using RAPD markers //Heredity. 1992. V. 69. P. 465^172.

192. Chase M.W., Salamin N., Wilkinson M. et al. Land plants and DNA barcodes: short-term and long-term goals // Phil. Trans. R. Soc. B. 2005. V. 360. № 1462. P.1889-1895.

193. Chung M.Y., Lopez-Pujol J., Suh Y. et al. Clonal and fine-scale genetic structure in populations of a restricted korean endemic, Hosta jonesii (Liliaceae) and the implications for conservation // Ann. Bot. 2005. V. 96. P. 279-288.

194. Crawford D.J., Ruiz E., Stuessy T.F. et al. Allozyme diversity in endemic flowering plant species of the Juan Fernandez Archipelago, Chile: ecological and historical factors with implications for conservation // Am. J. Bot. 2001. V. 88. P. 2195-2203.

195. Flavell A.J., Knox M.R., Peace S.R., Ellis T.H.N. Petrotransposon-based insertion polymorphisms (RBIP) for higt throughput marker analysis // Plant J. 1998. V. 16. P. 643-650.

196. Folmer O., Black M., Hoeh W. et al. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome с oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates //Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1994. V. 3. P. 294-299.

197. Ford E. Polymorphism and taxonomy // The new systematic. Oxford: Clarendos press, 1940. P. 493-513.

198. Frankel O.H., Brown A.H.D., Burdon J.J. The conservation of plant biodiversity. Cambridge: Univ. Press, 1995. 135 p.

199. Gerasimova T.I., Matjunina L.V., Mizrokhi L.J. et al. Successive transposition explosions in Drosophila melanogaster and reverse transpositions of mobile dispersed genetic elements // EMBO J. 1985. V. 4. P. 3773-3779.

200. Gonzales-Astorga J., Castillo-Campos G. Genetic variability of the narrow endemic tree Antirhea aromatica Castillo-Campos Lorence, (Rubiaceae, Guettardeae) in a tropical forest of Mexico // Ann. Bot. 2004. V. 93. P. 521-528.

201. Gonzalez-Astorga J., Cruz-Angon A., Flores-Palacios A. et al. Diversity and genetic structure of the Mexican endemic epiphyte Tillandsia achyrostachys E. Morr. ex Baker var. achyrostachys (Bromeliaceae) II Ann. Bot. 2004. V. 94. P. 545-551.

202. Gribbon B.M., Pearce S.R., Kalendar R. et al. Phylogeny and transpositional activity of 7^7-copia group retrotransposons in cereal genomes // Mol. Gen. and Genom. 1999. №261. P. 883-891.

203. Hamrick J.L. Godt M.J.W. Allozyme diversity in plant species // Plant population genetics, breeding, and genetic resources. 1989. P. 43-63.

204. Нао В., Li W., Linchun M. et al. A study of conservation genetics in Cupressus chengiana, an endangered endemic of China, using ISSR-markers // Biochem. Genet. 2006. V. 44. P. 31-45.

205. Hebert P.D.N., Ratnasingham S., de Waard J.R. Barcoding animal life: cytochrome с oxidase subunit 1 divergences among closely related species // Proc. R. Soc. Lond. В. 2003a. V. 270. P. 96-99.

206. Hebert P.D.N., Cywinska A., Ball S.L., de Waard J.R. Biological identifications through DNA barcodes // Proc. R. Soc. Lond. B. 2003b. V. 270. P. 313-321.

207. Hiramatsu M., Li K., Okubo H. et al Biogeography and origin of Lilium longiflorum and L. formosanum (Liliaceae) endemic to the Ryuky Archipelago and Taiwan as determined by allozyme diversity // Am. J. Bot. 2001. V. 88. P. 12301239.

208. Hunter R.L., Markert C.L. Histochemical demonstration of enzymes separated by zone electrophoresis in starch gels // Science. 1957. V. 125, № 3261. P. 1294-1295.

209. Ilyin Y.V., Tchurikov N.A., Ananiev E.V. et al. Studies on the DNA fragments and adjacent sequences // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1978. V. 42. P. 959-969.

210. Jaccard P. Nouvelles rescherches sur la distribution florale // Bull. Soc. Vaud. Sci. Nat. 1908. V. 44. P. 223-270.

211. Jeffreyes A.J., Wilson V., Thein S.L. Individual specific «fingerprints» of human DNA // Ibit. 1985. V. 316. P. 76-79.

212. Kalendar R., Grob Т., Regina M. et al. IRAP and REMAP: two new retrotransposon-based DNA fingerprinting techniques // Theor. and Applied Genetics. 1999. V. 98. P. 704-711.

213. Kalendar R., Schulman A.X. IRAP and REMAP for retrotransposon-based genotyping and fingerprinting // Nature Protocols. 2006. V. 1, №5. P. 24782484.

214. Kalendar R., Tanskanen J., Chang W. et al. Cassandra retrotransposons carry independently transcribed 5S RNA // PNAS. 2008. V. 105, №15. P. 58335838.

215. Kalendar R., Tanskanen J., Immonen S. et al. Genome evolution of wild barley (Hordeum spontaneum) by BARE—1 retrotransposon dynamics in response to sharp microclimatic divergence // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97, №12. P. 6603-6607.

216. Kalendar R., Vicient C.M., Peleg O. et al. Large retrotransposon derivatives: abundant, conserved but nonautonomous retroelements of barley and related genomes // Genetics. 2004. V. 166, №3. P. 1437-1450.

217. Kalendar R.N., Glazko V.I. Types of molecular-genetic markers and their application // Physiology and biochemestry of cultural plants. 2002. V. 34, № 4. P. 279-296.

218. Kang M., Ye Q., Huang H. Genetic consequence of restricted habitat and population decline in endangered Isoetes sinensis (.Isoetaceae) // Ann. Bot. 2005. V. 96. P. 1265-1274.

219. Kang U., Chang C.S., Kim Y.S. Genetic structure and conservation considerations of rare endemic Abeliophyllum distichum Nakai (Oleaceae) in Korea // J. Plant Res. 2000. V. 113. P. 127-138.

220. Kapitonov V.V., Jerzy J. A universal classification of eukaryotic transposable elements implemented in Repbase // Nat. Rev. Genet. 2008. №9. P. 411-412.

221. Khiestkina E.K., Huang X.Q., Quenum F. J.B., Chebotar S. et al., Genetic diversity in cultivated plants-loss or stability // Theor. Apll. Genet. 2004. V. 108. P. 1466-1472.

222. Kidwell M.G., Lisch D.R. Transposable elements as sources of genomic variation // Mobile DNA. 2002. V. 2. P. 59-93.

223. Kimura M., Crow J.F. The number of alleles that can be maintained in a finite population // Genetics (US). 1964. V. 49. P. 725-738.

224. Knuth P. Handbuch der blutenbiologie. Leipzig, 1898. Bd. 2. P. 14.

225. Kress W.J., Erickson D.L. A two-locus global DNA barcode for land plants: the coding rbcL gene complements the non-coding trnH-psbA spacer region // PLoS ONE. 2007. V. 6. P. 508.

226. Kress W.J., Wurdack K.J., Zimmer E.A. et al. Use of DNA barcodes to identify flowering plants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102, № 23. P. 8369-8374.

227. Kugler H. Blutenokologie. Stuttgart, 1970. 345 s.

228. Kumar A., Bennetzen J. Plant retrotransposons // Annu. Rev. Genet. 1999. V. 33. P. 479-532.

229. Leigh R, Kalendar R., Lea V. et al. Comparison of the utility of barley retrotransposon families for genetic analysis by molecular marker techniques // Mol. Genet, and Genom. 2003. V. 269, №3. P. 464-474.

230. Lewin B. Genes. Oxford, New York: Oxford Univ. Press, 2000. P. 457505.

231. Lewontin R.C. The apportioment of human diversity // EV. Biol. 1972. №6. P. 381-398.

232. Manninen O., Kalendar R., Robinson J., Schulman A.X. Application of BARE-1 retrotransposon markers to the mapping of a major resistance gene for net blotch in barley // Mol. Genet, and Genom. 2000. V. 26. P. 325-334.

233. McClintok B. Controlling eleasments and the gene // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1956. V. 21. P. 197-216.

234. Microsatellites. Evolution and Application / Eds D.B. Goldstein, C. Slotterer. New York: Oxford Univ. Press Inc. 1999. 352 p.

235. Millar C.I., Westfall R.D. Allozyme markers in forest genetic conservation //New forests. 1992. V. 6. P. 347-371.

236. Montalvo A.M., Ellstrand N.C. Nonlocal transplantation and outbreeding depression in the subshrub Lotus scoparius (Fabaceae) // Amer. J. Bot. 2001. V. 88. P.258-269.

237. Morgante M., Olivieri A.M. PCR amplified microsatellites markers in plant genetics // Plant J. 1993. V. 3, №1. P. 175-182.

238. Mortberg U.M, Balfors В., Knol W.C. Landscape ecological assessment: a tool for integrating biodiversity issues in strategic environmental assessment and planning // J. Environ Manage. 2007 . V. 82, № 4. P. 457-470.

239. Mullis K.B., Faloona F., Schnarf S. et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: The polymerase chain reaction // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1986. V. 51. P. 263-273.

240. Mullis K.B., Faloona F. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction//Meth. Enzymol. 1987. V. 155. P.335—350.

241. Neel M.C., Ellstrand N.C. Conservation of genetic diversity in the endangered plant Eriogonum ovalifoliam var. vineum (.Polygonaceae) // Conserv. Genet. 2003. V. 4. P. 337-352.

242. Neel M.C., Ellstrand N.C. Patterns of allozyme diversity in the threatened plant Erigeronparishii (Asteraceae) // Am. J. Bot. 2001. V. 88. P. 810-818.

243. Nei M. Genetic distance between populations // Amer. Naturalist. 1972. V. 106. P. 283-292.

244. Nei M. Molecular evolutionary genetics. N.Y.: Columbia Univ. press, 1987. 512 p.

245. Nei M., Li W.-H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. V. 76. P. 5269-5273.

246. Nevo E. Genetic variation in natural populations: patterns and theory // Theor. Pop. Biol. 1987. V. 13, №1. P. 121-177.

247. Nevo E., Beiles A. Genetic diversity of wild emmer wheat in Israel and Turkey. Structure, evolution, and application in breeding // Theor. Appl. Genet. 1989. V. 77, №3. P. 421-455.

248. Nevo E., Beiles A., Kaplan D. Natural selection of allozyme polymorphisms: a microsite test revealing ecological genetic differentation in wild barley//Evolution. 1986. V. 40. P. 13-20.

249. Nybom H. Comparison of different nuclear DNA markers for estimating intraspecific genetic diversity in plants // Mol. Ecol. 2004. V. 13. P. 1143-1155.

250. Park K.R. Comparisons of allozyme variation of narrow endemic and widespread species of Far East Euphorbia (Euphorbiaceae) //Bot. Bull. Acad. Sin. 2004. V. 45. P. 221-228.

251. Peakall R., Smouse P.E. GenAlEx6: Genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research // Mol. Ecol. Not. 2006. V. 6. P.288-295.

252. Ramsay L., Macaulay M., Cardie L. et al. Intimate association of microsatellite repeats wich retrotransposons and other dispersed repetitive elements in Barley // Plant J. 1999. V. 17. P. 415-423.

253. Safijovska, L.D. Zur Embryologie der Adenophora lilifolia Led. // Zh. Inst. Bot. Kijyv, 1934. № 11. p. 85 -98.

254. SanMiguel P., Jin Y.K., Motchoulskaia N. et al. Nested retrotransposons in the intergenic regions of the maize genome // Science. 1996. V. 274. P. 765—768.

255. Schannon C.E., Weaver W. The mathematical theory of communication Urbana: Univ. of Illinois Press, 1949. 284p.

256. Schnabel A., Krutovskii K.V. Conservation genetics and evolutionary history of Gleditsia caspica: inferences from allozyme diversity in populations from Azerbaijan // Conserv. Genet. 2004. V. 5. P. 195-204.

257. Shi W., Yang C.-F., Chen J.-M., Guo Y.-H. Genetic variation among wild and cultivated populations of the Chinese medicinal plant Coptis chinensis (Ranuncidaceae) // Plant Biol. 2008. №3. P. 1-7.

258. Shirasu K., Schulman A.X., Lahaye T. et al. A contiguous 66 kb barley DNA sequence provides evidence for reversible genome expansion // Genom. Res. 2000. V. 10. P. 908-915.

259. Sneath P.H.A., Sokal R.R. Numerical Taxonomy. San Francisco, 1963. 573p.

260. Suoniemi A., Tanskanen J., Pentikainen O., Johnson M.S. et al. The core domaine of retrotransposon integrase in Hordeum: Predicted structure and evolution // Mol. Biol. EV. 1998. V. 5. P. 1135-1144.

261. Тео C.H., Tan S.H., Ho C.L. et al. Genome constitution and classification using retrotransposon-based markers in the orphan crop banana // J. Plant Biol. 2005. V. 48, №1. P. 96-105.

262. Tihomirova N.N., Boronnikova S.V., Kokaeva Z.G., Gostimsky S.A. Molecular genetic investigations of medical plants // Proceedings of the IV Balkan Botanical Congress. Sofia, 2006. P. 35.

263. Torres A.M., Weeden N.F., Martin A. Linkage among sozyme, RFLP and RAPD markers in Viciafaba II Theor Appl. Genet. 1993. V. 5. P. 937-945.

264. Torres E., Iriondo J.M., Perez C. Genetic structure of an endangered plant, Antirrhinum microphyllum (Scrophulariaceae): allozyme and RAPD analysis // Am. J. Bot. 2003. V. 90. P. 85-92.

265. Travis S.E, Maschinski J., Kleim P. An analysis of genetic variation in Astragalus cremnophylax var. cremnophylax, a critically endangered plant, using AFLP markers // Mol. Ecol. 1996. V. 5. P. 735-745.

266. Udupa S.M., Baum M. High mutation rate and mutational bias at (TAA)n microsatellite loci in chickpea (Cicer arietinum L). 11 Mol. Genet. Genomics. 2001. V. 265. P. 1097-1103.

267. Vicient C.M., Kalendar R., Schulman A.X. Envelope-class retroviruslike elements are widespread, transcribed and spliced, and insertionally polymorphic in plants // Genom. Res. 2001. V. 11. P. 2041-2049.

268. Vicient C.M., Kalendar R., Anamthawat-Jonsson K. et al. Structure, functionality, and evolution of the BARE-1 retrotransposon of barley // Genetica. 1999. V. 107, № 1-3. P. 53-63.

269. Vicient C.M., Kalendar R., Schulman A.X. Variability, Recombination and Mosaic Evolution of the Barley BARE-1 Retrotransposon // J. of Mol. EV. 2005. V. 6, №3. P. 75-91.

270. Vitte C., Panaud O. LTR-retrotransposons and flowering plant genome size: emergence of the in crease/decrease model // Cytogenet. Genome Res. 2005. V. 110. P. 91-107.

271. Waugh R., McLean K., Flavell F.J., Pearce S.R. et al. Powell Genetic distribution of BARE-1 retrotransposable elements in the barley genome revealed by sequence-specific amplification polymorphisms (S-SAP) // Mol. Gen. Genet. 1997. V. 253. P. 687-683.

272. Welsh J., Honeycutt R.J., McClelland M., Sobral B.W.S. Parentage determination in maize hybrids using the arbitrarily primed polymerase chain reaction // Theor. Appl. Genet. 1991. V. 82. P. 473-476.

273. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR wich arbitory primers //Nucl. Acids Res. 1990. V. 18. P. 1713-1718.

274. Wicker Т., Sabot F., Hua-Van A. et al. A unified classification system for eukaryotic transposable elements //Nature Rev. Genet. 2007. №8. P. 973-982.

275. Widen B. Cronberg N., Widen M. Genotypic diversity, molecular markers and spatial distribution of genet in clonal plants, a literature survey // Folia Geobotanica Phytotaxonomica. 1994. V. 29. P. 245-263.

276. Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J. at al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucl. Acids Res. 1990. V. 18. P. 6531-6535.

277. Wolfe К. H., Li W.-H., Sharp P.M. Rates of nucleotide substitution vary greatly amoung plant mitochondrial, chloroplast, and nuclear DNAs // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84, №24. P. 9054-9058.

278. Wright S. Evolution in mendelian populations I I Genetics. 1931. V. 16. P.97- 159.

279. Wright S. Evolution and genetics of populations // Chikago: Univ. Chikago press, 1969. V. 2. 511 p.

280. Xia Т., Chen S. et al. Genetic variation within and among populations of Rhodiola alsia (Crassulaceae) native to the Tibetan Plateau as detected by ISSR // Biochem. Genet. 2005. V. 43. P. 87-101.

281. Xie G.W., Wang D.L., Yuan Y.M. et al. Population genetic structure of Monimopetalum chinense (Celastraceae), an endangered endemic species of eastern China // Ann. Bot. 2005. V. 95. P. 773- 777.

282. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification // Genomics. 1994. V. 20. P. 176-183.

Информация о работе

Боронникова, Светлана Витальевна
доктора биологических наук
Пермь, 2009
ВАК 03.00.15

Диссертация

Молекулярно-генетический анализ генофондов редких и исчезающих видов растений Пермского края - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы