Молекулярно-генетический анализ природных популяций западной расы Larix sibirica Ledeb. (Larix sukaczewii dyl.) на Среднем и Северном Урале

Нечаева, Юлия Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетический анализ природных популяций западной расы Larix sibirica Ledeb. (Larix sukaczewii dyl.) на Среднем и Северном Урале
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ природных популяций западной расы Larix sibirica Ledeb. (Larix sukaczewii dyl.) на Среднем и Северном Урале"

На правах рукописи

С^гО^"

НЕЧАЕВА ЮЛИЯ СЕРГЕЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПРИРОДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ ЗАПАДНОЙ РАСЫ ЬАШХ БШтСА ЫШЕВ. (¿ЛШХЗиКАСХЕ1У11ОУЬ.) НА СРЕДНЕМ И СЕВЕРНОМ

УРАЛЕ

03.02.07 - генетика

11 НОЯ 2015

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа-2015

005564264

Работа выполнена на кафедре ботаники и генетики растений Федерального государственного бюджетного учреждения высшего профессионального образования «Пермский государственный национальный исследовательский университет» (ПГНИУ)

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Путенихин Валерий Петрович

Доктор биологических наук, профессор

Ветчинникова Лидия Васильевна

Доктор биологических наук, доцент

Ведущая организация:

Доктор биологических наук, профессор Боронникова Светлана Витальевна

ФГБУН Ботанический сад-институт Уфимского научного центра РАН, заведующий лабораторией дендрологии и лесной селекции

ФГБУН Институт леса Карельского научного центра РАН, заведующий лабораторией лесных биотехнологий

ФГБУН Институт общей генетики имени Н. И. Вавилова РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится «16» декабря 2015 г. в «13.00» часов на заседании Диссертационного совета Д 002.133.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, пр. Октября, 71. ИБГ УНЦ РАН

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: Уфа, пр. Октября, 71; с электронной версией - на сайтах ВАК РФ и ИБГ УНЦ РАН: vak.ed.gov.ru; ibg.atub.ru, e-mail: rnolgen@aiirb.ru.

Автореферат разослан

Ученый секретарь у

диссертационного совета Д 002.133.01 Г ф- к°рытина

доктор биологических наук, доцент >7

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность н степень разработанности темы. Сведения о популяционно-генетической структуре лесных древесных растений являются основой оценки внутривидового генетического потенциала и разработки для каждого из них комплекса мероприятий, направленных на максимальное сохранение генетических ресурсов видов в процессе их использования и воспроизводства (Янбаев, 2002; Политов, 2007; Биоразнообразие лиственниц..., 2010). Особенно актуальны исследования закономерностей распределения генетической изменчивости для видов, занимающих обширные ареалы и имеющих хозяйственное значение (Генетическое разнообразие..., 2014). Виды рода Larix Mill, являются самыми распространенными древесными растениями России и всей планеты в целом (Пугенихин и др., 2004). Лиственничные леса имеют большое экономическое, экологическое и биосферное значение (Дылис, 1981; Урусов и др., 2007).

На Урале род Larix представлен западной расой лиственницы сибирской Larix sibirica Ledeb. (Семериков и др., 2007), которую Н. В. Дылис (1947) выделил как лиственницу Сукачева (Larix sukaczewii Dyl.). Генетическая изменчивость природных популяций лиственницы Сукачева в этой части ареала вида изучена В. П. Путенихиным и 3. X. Шигаповым с соавторами (Пугенихин, Старова, 1991; Пугенихин, 1993; Пугенихин и др., 2004; Шигапов и др., 2009) с использованием изоферментных маркеров, а также на Приполярном Урале и на восточном макро-склоне Уральских гор В. JI. Семериковым с соавторами (Семериков, 2006; Семериков и др., 2013) с использованием изоферментных, митохондриалышх, хлоропластных, AFLP-маркеров и выявления нуклеотидного полиморфизма некоторых потенциально адаптивно-значимых генов. По данным многолетних исследований (Дылис, 1947; Игошина, 1963; Putenikhin, Maitinsson,1995) на Урале, в том числе и в Пермском крае, ярко выражена фрагментарность насаждений лиственницы. Кроме того, в данном регионе располагается «безлиственничный язык» западного макро-склона Уральских гор (Дылис, 1947; Simak, 1979). Вместе с тем, именно в этой, выделенной В. П. Путенихиным с соавторами (2004) в качестве «пермско-камской предуральской» популяции, отмечен наиболее высокий уровень разнообразия вида на Урале, установленный с помощью комплекса данных морфологического и изоферментного анализов. В связи с

этим, изучение генетического разнообразия и генетической структуры популяций L sibirica западного макро-склона Уральских гор на основе анализа ДНК-маркеров перспективно для оценки состояния генофондов бореальных хвойных видов растений, что является актуальной задачей для сохранения популяций лесных древесных видов, продуктивных и устойчивых к действию различных факторов среды. Несмотря на большой научный интерес к видам рода Larix, генетическое разнообразие популяций L. sibirica на Среднем и Северном Урале с использованием анализа полиморфизма ISSR-PCR (Inter Simple Sequence Repeats) маркеров и нуклеотидных последовательностей потенциально адаптивно-значимых генов ранее не изучалось.

Цель исследований - изучить генетическое разнообразие, генетическую структуру и дифференциацию природных популяций западной расы L. sibirica (L. sukaczewii), а также дать оценку состояния их генофондов на Среднем и Северном Урале.

Дня достижения цели были поставлены следующие задачи:

1) провести молекулярно-генетический анализ десяти популяций L. sibirica с использованием 1SSR-PCR маркеров;

2) изучить генетическую структуру и дифференциацию популяций L sibirica на Среднем и Северном Урале;

3) провести подбор праймеров к 10 локусам потенциально адаптивно-значимых генов L. sibirica, установить эффективные праймеры и отобрать информативные локусы;

4) определить нуклеотидные последовательности отобранных для изучения локусов и выявить их нуклеотидный полиморфизм в популяциях L. sibirica;

5) дать оценку состояния генофондов изученных популяций лиственницы сибирской Среднего и Северного Урала на основании анализа полиморфизма ISSR-PCR маркеров и нуклеотидных последовательностей потенциально адаптивно-значимых генов L. sibirica.

6) дать рекомендации для сохранения популяционных генофондов L. sibirica на основании данных молекулярно-генетического анализа.

Научная повпзна. Впервые проведен молекулярно-генетический анализ популяций L sibirica на Среднем и Северном Урале с использованием межмикросателлитного анализа полиморфизма ДНК, на основании которого получены данные о генетическом разнообразии, генетической структуре и дифференциация популяций L. sibirica, установлены коэффициенты

генетической оригинальности популяций (КГО). Определены нуклеотидные последовательности трех локусов потенциально адаптивно-значимых генов L. sibirica: ресеквенированы два локуса (4CL1-363, sSPcDFD040B03103-274), а один локус (ABA-WDS) у L. sibirica секвенирован впервые. Полученные нуклеотидные последовательности включены в мировую базу генетических данных GenBank NCBI под номерами: КТ364889-КТ365131 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/'). Впервые в изученных популяциях L. sibirica установлены показатели нуклеотидного полиморфизма, такие как общее гаплотипическое (Hd) и нуклеотидное разнообразие (п, в№). В нуклеотидных последовательностях исследованных локусов определены позиции SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) и выполнен анализ их частот в популяциях лиственницы сибирской. На основании данных молекулярно-генетического анализа, полученных с помощью двух типов ДНК-маркеров (ISSR-PCR и SNP-маркеры), разработана шкала и проведена оценка состояния генофондов изученных популяций L. sibirica, а также даны рекомендации для их сохранения на Среднем и Северном Урале.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты работы вносят вклад в понимание процессов формирования и динамики генетической структуры лесообразующих видов растений, расширяют представления об организации сложных геномов хвойных растений. Знания о генетическом разнообразии популяций L. sibirica, находящихся в гетерогенных условиях Уральских гор и прилегающих территорий, могут способствовать разработке стратегии сохранения и воспроизводства вида с учетом генетической структуры и дифференциации его популяций в регионе. Данные молекулярно-генетического анализа популяций L. sibirica так же могут быть использованы для проведения эффективного мониторинга состояния генофовда вида и в других регионах страны. Полученные результаты, научные выводы и практические рекомендации диссертации предлагаются для использования Министерству природных ресурсов и экологии Российской Федерации, научными учреждениями, высшими учебными заведениями в целях разработки программ сохранения, восстановления и рационального использования генофонда вида на популяционном уровне и других лесных генетических ресурсов с привлечением методов молекулярного маркирования, создания селекционно-генетической основы для совершенствования лесосеменного дела. Результаты работы внедрены в учебный процесс ФГБОУ ВПО «Пермский

государственный национальный исследовательский университет» (ПГНИУ) и ФГБОУ ВПО «Пермская государственная сельскохозяйственная академия имени академика Д.Н. Прянишникова», что подтверждено актами внедрения.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Изучение полиморфизма ISSR-PCR маркеров и нуклеотидных последовательностей локусов потенциально адаптивно-значимых генов (4CL1-363, sSPcDFD040B03103-274, ABA-WDS) позволило установить высокий уровень генетического разнообразия природных популяций западной расы L. sibirica на Среднем и Северном Урале, большая часть которого сосредоточена внутри популяций.

2. Исследованные популяции L. sibirica на Среднем и Северном Урале подразделяются на четыре группы: горные, предгорные, равнинные североуральские и равнинные среднеуральские.

3. Из трех изученных локусов потенциально адаптивно-значимых генов L. sibirica наиболее консервативным является локус 4CL1-363, а самым изменчивым - локус sSPcDFD040B03103-274.

4. Для оценки состояния генофондов и отбора с целью сохранения природных популяций L. sibirica необходим учет их типичности и специфичности, а также показателей нуклеотидного полиморфизма локусов потенциально адаптивно-значимых генов.

Степень достоверности и апробация результатов. Молекулярно-генетический анализ проведен на достаточном объеме экспериментального материала: проанализирован полиморфизм 123 ISSR-PCR маркеров у 298 деревьев (36654 позиции); секвенированы последовательности трех локусов у 244 деревьев L. sibirica, суммарная длина проанализированной последовательности у каждого дерева равна 2865 п.н. Достоверность результатов обеспечена высоким уровнем научно-методического выполнения эксперимента, проведенного на современном сертифицированном оборудовании. В работе применяли общепринятые методы молекулярно-генетических исследований, такие как ПЦР-анализ и метод автоматического ферментативного секвенирования. Анализ генетического разнообразия проведен с помощью двух типов молекулярных маркеров ДНК (ISSR-PCR и SNP-маркеры). Использованы новые методы биоинформационного анализа и обработки данных с применением таких компьютерных программ, как POPGENE 1.31, STRUCTURE 2.3.4, GeneScan vl, BioEdit v7.2.5., SAMOVA 2.O.,

ОИАБР у5, БТАТОПСА 12.0. Основные результаты работы были представлены на восьми научных и научно-практических форумах, в их числе две Международные конференции: «Синтез знаний в естественных науках. Рудник будущего: проекты, технологии, оборудование» (Пермь, 2011), «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2013); три Всероссийские с международным участием: конференция ВОГиС «Проблемы генетики и селекции» (Новосибирск, 2013), «Симбиоз-Россия 2013» (Иркутск, 2013), «Симбиоз-Россия 2014» с получением диплома 1-й степени за устный доклад в секции популяционная генетика (Екатеринбург, 2014); Первый международный семинар «Развитие функциональной и сравнительной геномики хвойных видов растений - реализация прикладных аспектов для продуктивных и устойчивых лесов» исследовательского проекта РгоСоОеп, финансируемого ЕС (Латвия, Рига, 2013), VI съезд ВОГиС (Ростов-на-Дону, 2014); и региональная молодежная конференция «Фундаментальные и прикладные исследования в биологии и экологии» (Пермь, 2015).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 4 в журналах из перечня ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 202 страницах, содержит 22 таблицы и 21 рисунок; включает в себя введение, обзор литературы (глава 1), регион, объекты и методы исследований (глава 2), результаты и их обсуждение (главы 3, 4, 5), заключение, выводы и список литературы, включающий 330 источников, из которых 155 на иностранных языках, 2 приложения.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность за руководство диссертационной работой научному руководителю д.б.н., профессору С. В. Боронниковой; за освоение новых методов молекулярно-генетического анализа сотрудникам отдела генетики Австрийского федерального научно-образовательного центра лесов, опасных природных явлений и ландшафта и лично руководителю отдела доктору Бертольду Хайнце; за консультации заведующему лабораторией экологии леса ЕНИ ПГНИУ д.б.н. М. В. Рогозину; за помощь в организации экспедиций научному сотруднику Государственного заповедника «Вишерский» к.б.н. Т. П. Белковской; за ценные советы и помощь в период подготовки диссертации коллегам по лаборатории и соавторам по публикациям.

РЕГИОН, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В 2011-2015 годах проведен молекулярно-генетический анализ десяти природных популяций западной расы лиственницы сибирской Larix sibirica Ledeb. (Larix sukaczewii Dyl.) на Северном и Среднем Урале. Восемь из изученных популяций L. sibirica располагаются в следующих районах Пермского края: в Красновишерском - в Государственном заповеднике «Вишерский» на западном склоне хребта Тулымский камень (Lsl) и на юго-восточном склоне горы Ишерим (Ls2), около г. Красновишерск (Ls3); в Чердынском (Ls4), в Гаинском (LsS), в Добрянском (is7), в Осинском (Ls8), в Суксунском (Ls9) районах, а также две популяции находятся в Свердловской области: на восточном склоне горы Качканар (Lsó), и вблизи пос. Билимбай (LslO). Географические расстояния между популяциями изменяются в больших пределах: от минимального - 30 км (популяции Lsl и Ls2, располагающиеся на склонах разных хребтов Северного Урала) до максимального - 508 км между наиболее удаленными популяциями (Ls5 и LslO). Четыре из десяти изученных популяций L. sibirica (Lsl, Ls2, Ls7, Ls9) расположены на территориях ООПТ различных категорий. Исследование пространственно-генетической структуры популяций проводили по двум группам: горные (Lsl, Ls2, Lsó, Ls9, LslO), расположенные вдоль Среднего и Северного Урала на высоте от 250 до 900 м над уровнем моря; и равнинные (Ls3, Ls4, Ls5, Ls7, Ls8), расположенные на высоте местности 190-200 м над уровнем моря.

Для проведения молекулярно-генетического анализа собрана хвоя индивидуально с 28-30 деревьев в каждой из десяти популяций. Для выделения ДНК использовали методику С. Роджерса (Rogers, 1985), модифицированную с участием автора (Нечаева и др., 2011). Навеска растительного материала составляла 20 мг. Концентрацию и спектральную характеристику ДНК определяли на приборе

Spectrofotometr™NanoDrop2000 («Thermo scientific», США). Для проведения ПЦР концентрацию ДНК каждой пробы выравнивали до 10 нг/мкл.

Молекулярно-генетический анализ проведен с использованием ISSR-(Inter Simple Sequence Repeats) метода анализа полиморфизма ДНК (Zietkiewicz et al., 1994) и выявления нуклеотидного полиморфизма

потенциально адаптивно-значимых генов. Эффективность 20 ISSR-PCR праймеров оценили в соответствии со шкалой (Календарь, Боронникова, 2007) от 1 (самый низкий) до 5 (самый высокий) и отобрали из них 5 наиболее эффективных. Реакционная смесь объемом 25 мкл для полимеразной цепной реакции содержала: 2 единицы 7а»-полимеразы; 2,5 мкл стандартного 10х буфера для ПЦР; 2,5 мМ MgCb («Сипекс М», Россия); 0,25 мМ dNTP («Fermentas», Литва); 25 пМ праймера («Синтол», Россия); 5 мкл тотальной ДНК. В качестве отрицательного контроля (К-) в реакционную смесь для проверки чистоты реактивов добавляли вместо ДНК 5 мкл деионизированной воды. Амплификацию ДНК проводили в термоциклере GeneAmp PCRSystem 9700 («Applied Biosystems», США) по стандартной для 1SSR-PCR метода программе. Температура отжига в зависимости от G/C состава праймеров варьировала от 46°С до 56°С. Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 1,7% агарозном геле в Ix TBE буфере, окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете в системе гель-документации Gel Doc XR («Bio-Rad», США). Для определения длин фрагментов ДНК использовали маркер молекулярного веса (100 bp +1.5 + 3 Kb DNA Ladder, ООО «СибЭнзим-М», Москва) и программу Quantity One («Bio-Rad», США). Всего проанализирован полиморфизм 298 деревьев с пятью праймерами, то есть 1490 проб. Для проверки достоверности полученных результатов ПЦР и электрофорез повторяли не менее трех раз.

Для анализа нуклеотидного полиморфизма L. sibirica были проанализированы десять пар праймеров к 10 локусам потенциально адаптивно-значимых генов с наибольшими показателями гаплотипического разнообразия. Для амплификации были использованы соответствующие праймеры, приведенные в литературных источниках. Для дальнейшего анализа отобраны три локуса. Амплификация локусов 4CL1-363 и sSPcDFD040B03¡03-274 проведена методом гнездовой ПЦР (Семериков и др., 2013). Для амплификации локуса ABA-WDS использовали реакционную смесь объемом 25 мкл следующего состава: 10х буфер для ПЦР («Силекс М», Россия); 1,5 мМ MgCl2; 0,2 мМ каждого dNTP; 1 мкМ каждого праймера; 0,5 ед. /¿íg-полимеразы; 10 нг тотальной ДНК. Температура отжига праймеров в зависимости от G/C состава варьировала от 57°С до 60°С. Далее продукты амплификации разделяли электрофорезом в 2%

агарозном геле и экстрагировали с использованием коммерческого набора «Цитокин» (Санкт-Петербург, Россия). Ферментативную очистку продуктов ПЦР проводили смесью ферментов Exol и F AST-АР («Fermentas», Литва). Для реакции секвенирования был использован BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit («Applied Biosystems», USA) и прямая, а затем обратная последовательности из пары праймеров к соответствующим локусам. Амплификацию проводили в термоциклере Gene AmpPCR System 9700 («Applied Biosystems», США), по программе: 5 мин - 94°С, следующие 30 циклов (94°С - 30 секунд, ТОТЖ°С - 45 сек, 72°С - 2 мин), 72"С - 10 мин. Очистку продуктов реакции секвенирования от не вступивших в реакцию меченых нуклеотидов осуществляли с помощью набора BigDye® XTerminator™ Purification Kit («Applied Biosystems», USA). Капиллярный электрофорез проведен на 24-капиллярном генетическом анализаторе Genetic Analyzer 3500xL («Applied Biosystems», США) в двух направлениях. Секвенирование последовательностей локусов L. sibirica осуществлялось в двух, а для отдельных локусов в трех повторностях. Полученные нуклеотидные последовательности трех локусов 244 деревьев L. sibirica общей длиной 250391 нуклеотид внесены в мировую базу генетических данных GenBank NCBI под номерами: КТ364889-КТ365131.

Для количественной оценки генетического разнообразия данные молекулярно-генетического анализа были представлены в виде матрицы бинарных признаков. Компьютерный анализ полиморфизма ДНК поводили с помощью компьютерных программ POPGENE 1.31 (Yeh et al., 1999) и специализированного макроса GenAlExó (Peakall, Smouse, 2006) для MS-Excel с определением доли (P9¡) полиморфных локусов (Williams et al., 1990), абсолютного (па) числа аллелей, эффективного (пе) числа аллелей (Kimura et al., 1964), ожидаемой (H¿) гетерозиготности (Nei, 1987), информационного (I) Индекса Шеннона (Lewontin, 1972). Для описания генетической структуры изученных популяций были использованы следующие параметры (Nei, 1975): ожидаемая доля гетерозиготных генотипов (Нг) во всей популяции, как мера общего генного разнообразия; ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в субпопуляции (Hs), как мера ее внутрипопуляционного разнообразия; доля межпопуляционного генетического разнообразия в общем разнообразии (Gst), а так же пакет AMO VA (Analysis of Molecular Variance) с вычислением показателя подразделенности популяций (Фрт) при использовании 1000

раундов премутаций (Assoumane et al., 2012). Для выявления структуры внутрипопуляционного разнообразия применяли показатель внутрипопуляционного разнообразия <ji) и долю (h) редких морф (Животовский, 1980). На основе матрицы бинарных признаков была рассчитана матрица генетических (DN) расстояний (Nei, Li, 1979) и невзвешенным парно-групповым методом (UPGMA - unweighed pair-grup method using arithmetic average) построена дендрограмма, отражающая степень сходства исследуемых популяций по ISSR-PCR спектрам при помощи компьютерных программ Treecon 1.3Ь и POPGENE 1.31. Кластерный анализ изученных популяций был проведен с помощью программы STRUCTURE 2.3.4 (Falush et al., 2003), которая использует методы Монте Карло по схеме Марковской цепи, что позволяет минимизировать неравновесие Харди-Вайнберга (Smulders et al., 2008). Количество кластеров (К) находилось в диапазоне от 1 до 12. Для визуализации результатов, их математического подтверждения методами Evanno (Evanno et al., 2005) была использована веб-программа STRUCTURE Harvester (Earl et al., 2012), которая позволяет выявить наиболее вероятное число генетических групп путём индивидуального перебора. Кроме того, для визуализации пространственно-генетической структуры популяций L. xibirica была использована программа SAMOVA 2.0. (Spatial Analysis of Molecular Variance), метод которой направлен на максимизацию доли общей генетической дисперсии на основе различий между группами популяций (Dupanloup et al., 2002), Так же был использован метод главных компонент (РСА - Principal Component Analysis), реализованный в программе GenAlExó (Orloci, 1978). Для определения корреляции между параметрами генетической дифференциации популяций и географическими расстояниями был применён общепринятый тест Мантела (Mantel, 1967).

Редактирование нуклеотидных последовательностей проводили в программе GeneScan vi («Applied Biosystems», США), местоположение полиморфных позиций определяли посредством множественного выравнивания в компьютерной программе BioEdit v7.2.5. (Hall, 1999). Секвенированные последовательности сравнивали с имеющимися в генетической базе данных NCBI посредством системы автоматического online выравнивания BLASTN 2.2.26+. В программе DNASP v5 (Librado, Rozas, 2009) были реконструированы гаплотипы и на основе сравнения их

нуклеотидных последовательностей рассчитаны следующие индексы нуклеотидного полиморфизма: число вариабельных сайтов (5) и число гаплотипов в популяции (h„), общее гаплотипическое разнообразие {НО) по М. Нею (Nei, 1973), нуклеотидное разнообразие (л), оценивающее среднее число парных различий между двумя последовательностями на сайт, параметр нуклеотидного разнообразия, вычисленный исходя из числа мутаций (в,у) или оценка Уоттерсона (Nei 1987). Для оценки соответствия характера нуклеотидных замен гипотезе нейтральности в изученных популяциях для каждого локуса выполняли D-тест Таджимы, его значимость оценивали путем 10000 симуляций (Tajima, 1989). Статистическая обработка полученных данных проведена с использованием стандартных для популяционно-генетических исследований методов (Животовский, 1983, 1991; Лакин, 1990), программ MS-Excel и STATISTICA 12.0 (StatSoft I., 1998). Для оценки достоверности разницы показателей генетического разнообразия использовали следующие методы: критерий Фишера с преобразованием ср (Урбах, 1963) для показателя доля полиморфных локусов (РР5); критерий Уилкоксона (Wilcoxon, 1945) для сравнения средних показателей ожидаемой гетерозиготности (НЕ), эффективного числа аллелей (пе) и информационного индекса Шеннона (/).

При анализе генофондов популяций L. sibirica использованы общепринятые подходы и методики (Lewontin, 1972; Nevo, 1987; Алтухов, 2003; Динамика..., 2004). Оценка состояния генофондов популяций проведена в соответствии с методикой С. В. Боронниковой (2009). Методика оценки состояния генофондов популяций древесных видов растений с использованием ДНК-маркеров была разработана и апробирована с участием автора на примере семи популяций Р. trémula Пермского края (Светлакова и др., 2012). Выявление специфических особенностей генофондов было проведено по модифицированной методике определения коэффициента генетической оригинальности - КГО (Потокина, Александрова, 2008). Для оценки состояния популяционных генофондов десять избранных показателей генетического разнообразия разделены на четыре группы, а их значения приведены в шкалу оценки состояния генофондов хвойных древесных видов растений, разработанную на примере изученных природных популяций L. sibirica Среднего и Северного Урала.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ПОПУЛЯЦИЙ ЯНИШСА НА ОСНОВАНИИ ПОЛИМОРФИЗМА ^К-РСИ МАРКЕРОВ

Проведен молекулярно-генетический анализ с использованием РСЯ маркеров, амплифицированных пятью праймерами, в десяти природных популяциях Ь. мЫпса на Среднем и Северном Урале. Для проведения молекулярно-генетического анализа полиморфизма ДНК I. ыЫпса были отобраны следующие ^БЯ-РСЯ праймеры: МЗ - (АС)«СТ, Х10 - (АСС)6С, XI1 - (А0С)60,18811-8 - (САС})6С, СК-215 - (СА)6ОТ.

В десяти популяциях I. .и"Ыпса было выявлено 123 ^И-РСЯ маркера, из которых 117 были полиморфными (Р9, = 0,951). В среднем один праймер в ПЦР инициировал синтез 24,6 ампликонов (рис. 1).

М 1 2 5 4 5 6 7 М 8 9 10 11 12 13 14 15

ЗОЮ —

1500 1 г= г= тт

700 <00 500 400 ЕЖ 111 — — ~ — --~

300 200 ~ 2Т ~ """

Рисунок 1 - ^БЯ-РСК спектр четвертой популяции ¿. эШпса (1ч4) с праймером XII; цифрами сверху обозначены номера проб, М - маркер молекулярного веса; цифры слева - длины фрагментов маркера молекулярного веса; стрелками указаны некоторые полиморфные ^Я-РСЯ маркеры

Их размеры варьировали в зависимости от праймера от 200 п.н. (праймер 01-215) до 1500 п.н. (праймер XII). Доля полиморфных локусов выше в популяции ¿$/0 (Р95 = 0,871), а ниже в популяции (Р95 = 0,741). Средняя ожидаемая гетерозиготность (Нк) на общую выборку I. тЫпса составила 0,202. Этот показатель наибольший в популяции 1л 10 (НЕ = 0,246), а наименьший - в популяции ¿«7 (НЕ= 0,171). Установлено, что абсолютное и эффективное число аллелей так же имеют наибольшие значения в популяции

Ь$10 («„= 1,715; пе= 1,418), а меньшие в популяции (и„=1,512; «,,-1,292). Данные различия носят достоверный характер при р <0,05.

Анализ генетической структуры изученных популяций Ь. вШпса показал, что ожидаемая доля гетерозиготных генотипов (Нг) на общую выборку составляет 0,287, а ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в отдельной популяции по всем локусам (Я5) равна 0,202. Коэффициент подразделенности популяций (бэт) свидетельствует, что на межпопуляционную компоненту приходится 29,7% всего генетического разнообразия (табл. 1).

Таблица 1 - Генетическая структура и дифференциация 10 изученных популяций L. sibirica

ISSR-PCR праймер Нх Hs Gsr

МЗ 0,309 (0,025) 0,216(0,013) 0,301

CR-215 0,237 (0,030) 0,151 (0,014) 0,364

ISSR-8 0,241 (0,026) 0,172 (0,014) 0,285

Х10 0,303 (0,024) 0,227 (0,016) 0,250

XII 0,314 (0,020) 0,220 (0,013) 0,299

На общую выборку 0,287 (0,025) 0,202 (0,014) 0,297

Примечание: Н-, - ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в общей популяции; Hs - ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в отдельной популяции; (hr -показатель подразделенности популяций; в скобках даны стандартные отклонения

Анализ молекулярных варианс (AMOVA) подтвердил, что большая часть всего генетического разнообразия L. sibirica сосредоточена внутри популяций (70%), а на долю межпопуяяционной изменчивости приходится 30% всего наблюдаемого генетического разнообразия. Проведен кластерный анализ с использованием метода UPGMA и программы STRUCTURE 2.3.4. На дендрограмме все популяции обособились в отдельные ветви с высокой поддержкой бутстрепа (100%), что говорит о достоверности межпопуляционных различий. Анализ в программе STRUCTURE Harvester с использованием метода Evanno выявил, что наиболее вероятным является подразделение общей выборки на 9 генетических групп, при этом наиболее близкими оказались популяции Lsl и Ls2 (Dv=0,034), находящиеся так же на

наименьшем географическом расстоянии (рис. 2). На дендрограмме изученные популяции сформировали 4 кластера. Узлы ветвления имеют высокий индекс бутстрепа (>50%), что свидетельствует о значимости межкластерных разлитой (рис. 2).

О О О О О —

Рисунок 2 - Структура распределения генотипов в популяциях L. sibirica при К=9 (слева) и UPGMA-дендрограмма генетического сходства 10 популяций (справа), построенные на основании полиморфизма ISSR-PCR маркеров; по горизонтали - доля частот аллелей соответствующего кластера; шкала сверху -генетические дистанции; на дендрограмме указаны значения бутстрепа (в %); Lsl-LslO - обозначения популяций; I, II, III, IV - номера кластеров

Разделение популяций на четыре кластера подтверждают результаты анализа главных компонент, проведенного на основании Фп-индекса, вычисленного по результатам AMOVA. При ординации популяции распределились неравномерно (рис. 3), обособились те же четыре группы: в группу 1 вошли три горных популяций (Lsl, Ls2, Ls6), в группу 2 - две предгорные популяции Среднего Урала (Ls9 и LslO) в группу 3 - три равнинные популяции Северного Урала (Ls3, Ls4, LsS), а в группу 4 - две равнинные популяции (Ls7, Ls8), расположенные на широте Среднего Урала (центральная часть Пермского края).

/ • 159 • 1_б10 у ____Группа II ........Гр Группа III уппа IV • ЬзЗ \

......л • 158 >-'.157 • ьаб : Ч • • 1-52 .--'Группа I

Главная компонента 1

Рисунок 3 - Ординация изученных популяций /.. аЫпса с помощью анализа главных компонент, полученная на основании Фрт-матрицы генетических расстояний

При проверке пространственно-генетической структуры изученных популяций на соответствие модели «изоляция расстоянием» в двух группах популяций (горные и равнинные) выявлена статистически значимая положительная корреляция генетических (Ду) и географических расстояний в каждой группе (г=0,580; р=0,024 и г=0,822; />=0,010 соответственно). Кроме того, выявлена достоверная корреляция между степенью генетической дифференциации (Фрт) и разницей в высоте произрастания популяций над уровнем моря (г'=0,860; р=0,008), то есть изоляция популяций может быть обусловлена не только географической удаленностью, но и их высотно-поясным расположением. При анализе молекулярных варианс (АМОУА) с учетом двух групп популяций обнаружено, что большая часть всего генетического разнообразия также сосредоточена внутри популяций (67%), на изменчивость между группами горных и равнинных популяций приходится 11 %, а межпопуляционная компонента наблюдаемого генетического разнообразия составляет 22%.

2. АНАЛИЗ НУКЛЕОТИДНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ЛИСТВЕННИЦЫ СИБИРСКОЙ

Для анализа нуклеотидного полиморфизма Ь. нШпса были отобраны три из десяти проанализированных локусов потенциально адаптивно-значимых генов, выявивших по литературным данным наибольшие показатели

гаплотипического разнообразия (Ш). В результате секвенирования определены последовательности следующих трех локусов L. sibirica: 4CL1-363, sSPcDFD040B03103-274, ABA-WDS. В результате проведенной идентификации обнаружены гомологичные последовательности генов в различных родах хвойных видов растений, степень сходства которых составляла от 84% у рода Picea (Р. glauca) до 99-100% у рода Larix (L. sibirica). В изученных трех локусах L. sibirica определены частоты однонуклеотидных замен (SNPs). Всего обнаружено 54 SNP-маркера. Наименее изменчивым оказался локус 4CL1-363 (1 SNP на 123 п.н.) В среднем частота SNPs в изученных популяциях L. sibirica по трем локусам составила 1 SNP на 53 п.н. (табл. 2; рис. 4).

4CI_LS2_2_

*a_Ls2_3_ 4C1_LS2_4_ 4d_Ls2_4_ 4d_Ls2_5_ 4d_Ls2_S_

*CLls2_7_ ■*a_Le2_7_ 4d_ls2_8_

4CI_LS2_9_

CCCCGTCA

ABA_LS4_26 T С А G G С Т G G С с , с с , Т Л т

A&4_LS4_26 T c. С G С Т G G С

A6A_LS4_2B T С А G С С Т G G С С Т G G Т Т А д Л Г

I С G G С Т G G С

ABA_LS4_29 T с А G G С. Т G G С Т Л Т л

ABA_LS4_29 т с Л G С С T G G С т л Л Г

ABA_LS4_30 т С А G G С Т G G С С С G G С Т А т А А Г

ABA_Ls4_30 I с А G G С Т G G Г С С G G С Г Л т А л с

G G С Т G С. С

ABA_LsS_10 т с А G G С Т в G С Т Л т А

A&*_Ls5_l_ т с А G G С Т G G С Г А т А

ABA_LS5_1_ т с А G G С Т в G С. т А

ABA_Ls5_2_ т С А G G С Т G G С С Т G в Т т л Л

ABA_LS5_2_ т с А G С С Т G G С С С G G С Т А Т А А С

1 с G С С Т G G С С т с с т

т с Л С G С Т G G С С С G G С Т А т А А С

Рисунок 4 - Нуклеотидные замены, выявленные в локусах L. sibirica: А -4CL1-363; Б-ABA-WDS

Как и у других видов растений, наиболее часты замены в интронах и в некодирующих элементах. В экзонах исследуемых трех локусов Ь. хШпса выявлено 19 ЭЫРэ, из которых несинонимичными были 5 замен (табл. 2).

Таблица 2 - в последовательностях трех локусов /,. sibirica

Локус Длина локуса, п.н. Всего SNPs Несинонимичные замены Молчащие замены

4CL1-363 1110 9 (1/123) 2 7

sSPcDFD040B03103-274 1395 36(1/39) 0 36

ABA-WDS 360 9 (1/40) 3 6

Всего: 54 5 49

Примечание: локус 4СЫ-363 - кодирует фермент 4-кумарат:СоА лигазу; локус ¿ЯРсОРТХИОВОЗ103-274 - кодирует МАОЯ-Ьох транскрипционный фактор; локус АВА-ШОБ- кодирует АБК-индуцибельный белок, дегидрин; в скобках даны частоты 8МРэ; 1 число синонимичных замен и замен, расположенных в некодирующих сайтах

При определении показателей нукпеотидного полиморфизма изученных локусов Ь. зЛтса установлено, что общее гаплотипическое разнообразие (НсГ) изменялось от 0,881 (локус АВА-МХЧ) до 0,916 (локус .^РсШ<7)040В03103-274) и в среднем составило 0,896. Показатель нуклеотидного разнообразия (л) имел наибольшее значение в локусе ЛВА-№ПЗ (л = 0,010), а наименьшее - в локусе 4СЫ-363 (л = 0,002), и в среднем по трем локусам /,. хШпса составил 0,007 (табл. 3). Нуклеотидное разнообразие, вычисленное исходя из числа мутаций (0№), было наибольшим так же в локусе АВА-ШП$ (в№- = 0,025), а меньшим - в локусе 4СЫ-363 (0№ = 0,004). Это свидетельствует о том, что 4СЫ-363 является самым консервативным из трех изученных локусов. При проверке гипотезы нейтральности имеющегося полиморфизма обнаружено, что по всем трем локусам значения />теста Таяодимы (От) были отрицательными, что указывает на избыток аллелей с низкой частотой (табл. 3).

Таблица 3 - Общее гаплотипическое, нуклеотидное разнообразие и Э-тест на нейтральность для трех локусов I.Ыпса

Локус Нс1 X От

4Ш-363 0,890 (0,012) 0,002 (0,000) 0,004 -0,997

х^ЧРсОРО040В03103-274 0,916(0,017) 0,009 (0,001) 0,017 -1,574

АВА-ШК 0,881 (0,016) 0,010 (0,001) 0,025 -1,807

Среднее 0,896 (0,010) 0,007 (0,002) 0,015 -1,459

Примечание: Ш - общее гаплотипическое разнообразие; к -нуклеотидное разнообразие; 9,у - нуклеотидное разнообразие, вычисленное из числа мутаций; £>г - коэффициент ¿»-теста Таджимы; в скобках указаны стандартные отклонения

Изученные популяции I. яШпса на Среднем и Северном Урале характеризуются высоким уровнем нуклеотидной изменчивости по сравнению с другими видами хвойных растений, но в целом полученные данные согласуются с показателями нуклеотидного полиморфизма, характерными для данного вида.

3. АНАЛИЗ СОСТОЯНИЯ ГЕНОФОНДОВ ПОПУЛЯЦИЙ ЛИСТВЕННИЦЫ СИБИРСКОЙ НА СРЕДНЕМ И СЕВЕРНОМ УРАЛЕ

Оценку состояния проводили на примере генофондов девяти популяций [,. .пЫпса на Среднем и Северном Урале. Установленные при молекулярно-генетическом анализе параметры генетического разнообразия /.. яМпса разделены на четыре группы. К первой группе (I) отнесены такие показатели как доля полиморфных локусов (Р95) и ожидаемая гетерозиготность (Нц). Вторую группу (II) составляют показатели внутрипопуляционного разнообразия: индекс Шеннона (/), показатель внутрипопуляционного разнообразия {р) и гаплотипическое разнообразие {Нс1). Параметры группы III характеризуют генетическую структуру и дифференциацию популяций с помощью показателя доля редких морф (Л), рассчитанного на основании полиморфизма ^К-РСЛ (Лдж) и БЫР-маркеров (Адар). Четвертая группа (IV) показателей отражает «специфику генофондов», и включает число уникальных аллелей, выявленных с помощью [ЭБИ-РСЯ (1/и/н») и БИР-маркеров (№дур), а также коэффициент генетической оригинальности (КТО), рассчитанный на основании полиморфизма ^БЯ-РСЯ маркеров. С помощью КТО установлено, что наиболее специфичными генофондами обладают популяции Ьв5 и ЬяК) (КГО=1,171 и 0,939 соответственно); а самым типичными (КГО=0,587) -популяция 1л4 (табл. 4).

Таблица 4 — Оценка состояния генофондов популяций Л. йЬтса

Популяция I. Основные показатели генетического разнообразия II. Внутрипопуля-ционное разнообразие Ш. Генетическая структураи дифференциация VI. Специфика генофондов

Рп НЕ 1 Л Ш Ь is.sk ¡Ыр ипгв/тир КТО

А«/ 0,772 0,172 0,271 1,639 0,872 0,181 0,154 0/1 0,935

1л2 0,806 0,182 0,287 1,664 0,871 0,168 0,075 0/1 0,925

¿5 3 0,806 0,189 0,298 1,698 0,887 0,151 0,111 1/2 0,760

Ш 0,821 0,225 0,313 1,703 0,857 0,148 0,117 0/0 0,587

£«5 0,871 0,223 0,338 1,774 0,836 0,113 0,078 1/1 1,171

0,816 0,213 0,328 1,714 0,859 0,143 0,091 2/1 0,776

1л7 0,741 0,168 0,258 1,626 0,883 0,187 0,160 0/5 0,703

0,768 0,200 0,305 1,664 0,636 0,168 0,258 0/1 0,930

0,872 0,242 0,369 1,738 0,911 0,131 0,126 1/1 0,939

Примечание: £/«луж«л'/> - число уникальных аллелей, выявленных с помощью ^ЗЯ-РСЯ и БЫР-маркеров

Для оценки состояния генофондов популяций все избранные показатели генетического разнообразия переведены в разработанную на примере изученных природных популяций I. хМпса шкалу оценки состояния генофондов (табл. 5).

Таблица 5 - Шкала оценки состояния генофондов популяций L. sibirica

Состояние генофонда P9S НЕ I И Hd hlSSRJSNf Un1 KI'O

[ Удовлетворительное >0,750 >0,170 >0,300 >1,650 >0,750 <0,200 >3 >0,900

1а высокая степень >0,820 >0,220 >0,350 >1,700 >0,870 <0,150 >1,100

16 средняя степень 0,7500,820 0,1700,220 0,3000,350 1,6501,700 0,7500,870 0,2000,150 0,9001,100

[I Обеднение генофонда 0,5500,750 0,1000,170 0,2000,300 1,5001,650 0,5500,750 0,3000,200 1-2 0,5000,900

Иасредняя степень 0,6500,750 0,1300,170 0,2500,300 1,5501,650 0,6500,750 0,2500,200 0,7000,900

Пбсильная степень 0,5500.650 0,1000,130 0,2000,250 1,5001,550 0,5500,650 0,3000,250 0,5000,700

III Деградация генофонда <0,550 <0,100 <0,250 <1,500 <0,550 >0,300 <1 <0,500

Шасредняя степень 0,4500,550 0,0500,100 0,2000,250 1,3001,500 0,4500,550 0,3500,300 0,4000,500

Шбсильная степень <0,450 <0,050 <0,200 <1,500 <0,450 >0,350 <0,400

Примечание: Айж/5-Л7> - доля редких морф, рассчитанная на основании [ЗБЯ-РСЯ и БЫР-маркирования; Ш1- общее число уникальных аллелей, выявленных с помощью геБЯ-РСЯ и БИР-маркеров

На основании анализа полиморфизма КБК-РСК и БЫР-маркеров установлено, что в высокой степени удовлетворительное состояние (1а) характерно для генофондов двух популяций (¿$5, ¿5/0); в средней степени удовлетворительном (16) состоянии находятся генофонды шести популяций I. ¡1Ыпса (¿5/, ¿5.2, Ш, Ш, Ььб, ¿$9), а в одной популяции наблюдается тенденция к обеднению генофонда (¿$7), его состояние оценено как средняя (На) степень обеднения (рис. 5).

Таким образом, для отбора в качестве объектов сохранения генофондов и резерва генетической изменчивости рекомендованы популяции со специфическими генофондами, обладающие высоким уровнем генетического разнообразия (¿55 и ¿5/0) и с типичным генофондом (¿54), а также популяция с обедненным генофондом (¿57), которая характеризуется его спецификой, выявляемой на нуклеотидном уровне ((У/Гш'=5).

кго

tlSSR

Ls7

Состояние генофонда ^^ I удовлетворительное Н 1а (высокая степень) Н'6 (средняя степень) II обеднение генофонда IIa (средняя степень) 116 (сильная степень)

■ 1П деградация генофонда Ша (средняя степень) Ш6 (сильная степень)

Ls10

Рисунок 5 - Оценка состояния генофондов на примере двух популяций I. .чШпса; Р95, НЕ, I, Нй, ц, А/етг, И5М>, С/и/5Ж, 1/пш,, КГО - показатели генетического разнообразия; справа - шкала оценки состояния генофондов

На основании результатов исследований даны следующие рекомендации по охране генофондов изученных популяций I. ыЫпса:

1. Отбор популяций для сохранения генофондов хвойных видов растений рекомендовать после проведения оценки их состояния на основании данных молекулярно-генетического анализа с использованием как минимум двух типов молекулярных маркеров.

2. Разработанные на примере популяций I. ьШпса подход и шкала могут быть рекомендованы для оценки состояния генофондов популяций других хвойных видов растений после уточнения в связи с особенностями выборок и генофонда каждого вида.

3. Для отбора популяций Ь .\ibirica с целью сохранения их генофондов рекомендуются североуральске равнинные популяции с типичным (1*4) и со специфичным (¿«5) генофондами, среднеуральская предгорная популяция со специфичным генофондом (Ш№), а также популяция с обедненным генофондом (£л7).

4. Рекомендовать Управлению по охране окружающей среды и природопользования Министерства природных ресурсов, лесного хозяйства и экологии Пермского края и Министерству природных ресурсов и экологии Свердловской области включить в сеть ООПТ в качестве лесных генетических резерватов территории, на которых расположены популяции А» в Пермском крае и ¿5/0 в Свердловской области.

5. Для сохранения популяций (Ш, Ш) Ь. эМпса в Государственном заповеднике «Вишерский» необходимо соблюдение мер охраны, предусмотренных статусом заповедника, для девятой популяции (Ш) -

соблюдение мер охраны статуса ботанического памятника природы «Лиственничная роща»; для популяции с обедненным генофондом (Ls7) -соблюдение мер охраны статуса охраняемого ландшафта «Полазненский бор».

ВЫВОДЫ

1. В десяти популяциях западной расы l.arix sibirica Ledeb. (ixtrix sitkaczewii Dyl.) на Среднем и Северном Урале выявлены 123 ISSR-PCR маркера, из которых 117 являются полиморфными (Ррз= 0,951).

2. В изученных популяциях L. sibirica установлен высокий уровень генетического разнообразия (.P« = 0,951; Нп -= 0,202; пе = 1,471), значения показателей которого изменялись в пределах: доля полиморфных локусов (Рм) от 0,741 до 0,871; ожидаемая гетерозиготность (Нг) от 0,171 до 0,246, а эффективное число аллелей (пе) от 1,292 до 1,418.

3. Изученные популяции L. sibirica на Среднем и Северном Урале в значительной степени дифференцированы (Gsr = 0,297). Они сформировали четыре группы в соответствии с высотно-широтной зональностью региона -горные (Lsl, Ls2, Ls6), предгорные (Ls9, LslO), равнинные североуральские (Ls3, Ls4, Ls5) и равнинные среднеуральские (Ls7, Ls8) популяции.

4. Проверка пространственно-генетической структуры популяций на соответствие модели «изоляция расстоянием» выявила статистически значимую корреляцию между географическими и генетическими расстояниями в пределах групп горных (г = 0,580;р = 0,024) и равнинных популяций (Г = 0,822;/? =0,010).

5. Степень гомологии секвенированных последовательностей трех локусов (4CLI-363, sSPcDFD040B03103-274, ABA-WDS) с аналогичными в базах данных составляла от 84% (род Picea) до 99-100% (род l.arix). Изученные популяции L sibirica характеризуются высоким уровнем нуклеотидного полиморфизма {Hd = 0,896; ж - 0,007; 0,,- = 0,015).

6. В трех локусах L sibirica выявлены 54 SNPs. В среднем частота полиморфизмов составила 1 SNPs на 53 п.н. Наименее изменчивым из исследованных является локус 4CLI-363 (1 SNP на 123 п.н.). В экзонах локусов выявлено 5 несинонимичных замен.

7. Установлено, что в удовлетворительном состоянии находятся генофонды восьми изученных популяций, а в одной популяции (Ls7) отмечены признаки обеднения генофонда.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах из перечня ВАК:

1. Нечаева Ю.С. Изучение полиморфизма ISSR-маркеров в природных и искусственных популяциях лиственницы / Ю.С. Нечаева. СБ. Боронникова, P.P. Юсупов, Б. Хайнце // Фундаментальные исследования. - 2013. - №6. - 4.6. - С. 1426-1431.

2. Светлакова Т.Н. Эколого-генетаческий анализ популяционной структуры Populus trémula L. в Пермском крае / Т.Н. Светлакова, И.В. Бобошина, C.B. Боронникова, Ю.С. Нечаева // Экологическая генетика. - 2012. - Вып.3. - С. 43-47.

3. Нечаева Ю.С. Молекулярно-генетический анализ популяций хвойных видов растений на Урале и востоке европейской части России для сохранения и возобновления лесных ресурсов / Ю.С. Нечаева. C.B. Боронникова, А.И. Видякин, Я.В. Пришнивская, Р.Р. Юсупов // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2014. -T.16.-№l(3).-C. 878-882.

4. Нечаева Ю.С. Анализ полиморфизма ISSR-PCR маркеров и генетической структуры некоторых популяций лиственницы сибирской на Урале [Электронный журнал] / Ю.С.Нечаева. C.B. Боронникова, Я.В.Пришнивская, Е.И. Чумак, Р.Р.Юсупов // Современные проблемы науки и образования. - 2014. - №6. - Режим доступа: http://www.science-education.nl/I20-16047 (13.12.2014).

Публикации в других изданиях:

1. Нечаева Ю.С. Оптимизация методик выделения ДНК некоторых хвойных видов растений Пермского края / Ю.С. Нечаева. H.H. Бельтюкова, Я.В. Пришнивская, К.Е. Тайман // Материалы Международной научной конференции «Синтез знаний в естественных науках. Рудник будущего: проекты, технологии, оборудование». - Пермь. -2011.-С. 278-282.

2. Боронникова C.B. Анализ полиморфизма ДНК геномных маркеров растений с целью изучения биоразнообразия / C.B. Боронникова, H.H. Бельтюкова, Т.Н. Светлакова, И.В. Бобошина, Ю.С. Нечаева, С.А Кольцов // Материалы Международной научной конференции «Синтез знаний в естественных науках. Рудник будущего: проекты, технологии, оборудование». - Пермь. - 2011. - С.288-292.

3. Боронникова C.B. Молекулярно-генетический анализ и оценка состояния генофондов популяций редких и ресурсных видов растений / C.B. Боронникова, H.H. Бельтюкова, Т.Н. Светлакова, И.В. Бобошина, Ю.С. Нечаева//Тезисы докладов Научной конференции ВОГиС «Проблемы генетики и селекции». - Новосибирск - 2013. - С. 18.

4. Нечаева Ю.С. Использование ISSR-маркеров для изучения полиморфизма ДНК лиственницы в Пермском крае / Ю.С. Нечаева. P.P. Юсупов, C.B. Боронникова // Тезисы VI Всероссийского с международным участием биологического Конгресса молодых ученых-биологов «Симбиоз-Россия 2013». - Иркутск. -2013. - С. 297-299.

5. Нечаева Ю.С. Геномные и постгеномные технологии в изучении генов биосинтеза лигнина древесных видов растений / Ю.С. Нечаева. Т.Н. Лисина, C.B. Боронникова

//Материалы V Международной научно-практической конференции ((Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины». - Ростов-на-Дону. - 2013. - С. 208-209.

6. Боронникова C.B. Оценка состояния генофондов ресурсных видов растений Урала в условиях антропогенной трансформации среды / C.B. Боронникова, И.В. Бобошина, М.А. Данилова, Т.Н. Лисина, Ю.С. Нечаева. ЯВ. Пришнивская, А.Р.Ахметов, КЛ. Сыромятников // Материалы V Международной научно-практической конференции ((Актуальные проблемы биологии, нагогехнолопш и медицины». - Ростов-на-Дону. -2013.-С. 373-374.

7. Боронникова C.B. Оценка генетической оригинальности и состояния генофондов древесных видов растений Урала / C.B. Боронникова, Т.Н. Лисина, И.В. Бобошина, Ю.С. Нечаева. // Материалы VI съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС). - Ростов-на-Дону. -2014. - С. 136-137.

8. Нечаева Ю.С. Молекулярно-генетический анализ некоторых хвойных видов растений в Пермском крае / Ю.С. Нечаева. C.B. Боронникова, Я.В. Пришнивская // Евразийский Союз Ученых (ЕСУ). - 2014. - №5 (13). - 4.5. - С. 114-116.

9. Нечаева Ю.С. Анализ генетического разнообразия и структуры некоторых популяций Larix sibirica Ledeb. на Урале с помощью SSR-маркеров /Ю.С.Нечаева. Е.В. Чумак, М..Ю. Андриянова // Материалы VII Всероссийского с международным участием биологического Конгресса молодых ученых-биологов ((Симбиоз-Россия 2014». -Екатеринбург. - 2014. - С. 294-297.

10. Нечаева Ю.С. Генетическое разнообразие и дифференциация некоторых популяций Larix sibirica Ledeb. на Урале / Ю.С. Нечаева // Национальная ассоциация Ученых (НАУ). - 2014. - №4. - С. 67-71.

П.Юсупов P.P. Молекулярно-генетический анализ некоторых популяций лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) в Пермском крае / P.P. Юсупов, Ю.С. Нечаева // Материалы региональной молодежной конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в биологии и экологии». - Пермь. - 2015. - С.19-22.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АБК Абсцизовая кислота

ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота

КГО Коэффициент генетической оригинальности

ООПТ Особо охраняемая природная территория

ПЦР Полимеразная цепная реакция

AMOVA Analysis of Molecular Variance

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

dNTP Deoxynucleoside triphosphate

ISSR Inter-Simple Sequence Repeats

NCBI National Center for Biotechnology Information

PCA Principal Coordinates Analysis