Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Содержание эндогенных этилового спирта и ацетальдегида в крови коров при различных физиологических состояниях

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Содержание эндогенных этилового спирта и ацетальдегида в крови коров при различных физиологических состояниях"

На правах рукописи

004602307

Постнова Татьяна Вячеславовна

СОДЕРЖАНИЕ ЭНДОГЕННЫХ ЭТИЛОВОГО СПИРТА И АЦЕТАЛЬДЕГИДА В КРОВИ КОРОВ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЯХ

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2010

2 0 [■.'Ай 20

004602307

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Омском государственном аграрном университете Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Степанова Ирина Петровна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук и доктор биологических наук, профессор Зайцев Сергей Юрьевич

доктор биологических наук Букова Наталия Константиновна

Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства»

Защита диссертации состоится «19» мая 2010 г. в 14 часов 30 минут

на заседании диссертационного совета Д 220.042.04

при ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной

медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина».

Адрес: 109472 г. Москва, ул. ак. К.И.Скрябина, 23

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина».

Автореферат разослан

к

и/.

2010 г.

диссертационного совета

Ученый секретарь

В.Д. Фомина

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Количественное определение этилового спирта и ацетальдегида в крови и тканях животных сопровождается рядом технических трудностей. Например, при использовании ферментных методов результаты в значительной степени зависят от техники предварительной обработки проб (характер дистилляции, способ депротеинизации и др.) РО.М. Островский, и др., 1986; В.В. Рогожин, Т.В. Рогожина, 2004]. В литературе описаны методы количественного определения этилового спирта с применением цветных реакций [М.Д. Швайкова, 1975; Ю.В. Родионов, и др., 2002]. Широкое применении в 60-е годы получили так называемый «нитритный» метод и способ Видмарка [V. КПх^иНег е! а!., 1968]. «Нитритный» метод очень трудоемок, требует быстрой обработки исследуемого материала двойной перегонкой с водяным паром, большого количества исследуемого материала (около 200300 г). Кроме того метод недостаточно специфичен. Способ Видмарка применяется с целью определения степени опьянения живых лиц. Для проведения исследования требуется незначительное количество исследуемого материала (около 0,6 мл крови), что, несомненно, является преимуществом этого метода, хотя работа с такими навесками существенно влияет на погрешность проводимого исследования.

С появлением газохроматографического оборудования в конце 60-х годов был разработан метод определения этилового алкоголя в крови и моче [Методическое письмо от 22 апреля 1968 г. № 10-95/14-32]. Метод позволяет получать точные и воспроизводимые результаты, но, все-таки не обладает достаточной специфичностью, так как при обнаружении в исследуемом материале наряду с этиловым спиртом пропилового и изопропилового алкоголя количественно определить этиловый алкоголь не представляется возможным.

В связи с вышеизложенным становиться понятным, что имеется необходимость в разработке новых методик количественного определения содержания ацетальдегида и этилового спирта в крови, основанных на использовании современного газохроматографического оборудования.

Применение биохимических тестов, позволяющих выявлять отклонения в метаболизме на ранних стадиях, способствует сохранению здоровья крупного рогатого скота и повышению его продуктивности [Б.В. Уша, и др., 2003]. В настоящее время возникла необходимость в разработке новых тестов, позволяющих зафиксировать отклонения в содержании эндогенных этанола и ацетальдегида крови, метаболизм которых непосредственно связан с углеводным и ли-пидным обменом. Уровень этанола и ацетальдегида в крови и тканях млекопи-

тающих животных зависит от множества факторов, в частности от различных фаз репродуктивного цикла, системы кормления, внешних воздействий окружающей среды и т.п. Эндогенный и экзогенный уровень этих веществ в крови и тканях некоторых млекопитающих хорошо изучен [М.Д. Швайкова, 1975; Ю.М. Островский, и др., 1986; С.М. Зиматкин, 2007], в то время как у крупного рогатого скота подобные исследования не проводились и информация о содержании этилового спирта и ацетальдегида в крови этих животных отсутствует.

Обеспечение животных полноценными кормами является одной из первостепенных задач современного скотоводства. Для решения этой задачи в рацион сельскохозяйственных животных в настоящее время широко применяют включение отходов пивоваренных (пивная дробина) [В.А. Блинов, И.А. Сазонова, 2005; Г.А. Пелевина, Н.И. Чернышев, 2007] и спиртовых (спиртовая барда) производств [А.С. Ушаков, 2007; М. Маликова, М. Сабитов, 2007]. В литературе имеются сведения о положительных эффектах применения этих концентратов - увеличивается интенсивность белкового и липидного обмена, молочная продуктивность, выход молочного белка и жира [П.А. Науменко, и др., 2004; Л.В. Романенко, 2007; Н.В. Воробьева, и др., 2008; Е.Ю. Герасимов, 2008]. Большое значение имеет также и экономический эффект за счет снижения себестоимости молока и получения дополнительной прибыли [М.П. Кириллов, и др., 2004]. Однако влияние этих добавок на содержание этилового спирта и ацетальдегида в крови животных не изучалось, хотя известно, что при превышении физиологических концентраций эти метаболиты, и особенно ацетальдегид, способны оказывать токсическое действие на организм [С.М. Зиматкин, 1989; С.М. Зиматкин, и др., 1993; M.V. Singer, S. Teyssen, 2001; Е.В. Васильева, и др., 2004; G.D. Castro et al., 2006; Ю.М. Пархоменко, и др., 2007; S.S.R. Bhupanapadu et al., 2008]. Поэтому информация о содержании эндогенных этилового спирта и ацетальдегида в крови крупного рогатого скота представляет большой интерес.

Цель исследовании. Разработка методики количественного определения этилового спирта и уксусного альдегида в крови коров и изучение содержания этих метаболитов в крови клинически здоровых коров черно-пестрой породы при различных физиологических состояниях для разработки нового биохимического теста.

Задачи исследования:

1. Разработать методику количественного определения этилового спирта и ацетальдегида в крови коров методом капиллярной газовой хроматографии.

2. Изучить содержание эндогенного этилового спирта и ацетальдегида в крови коров при различных физиологических состояниях.

3. Изучить содержание эндогенных этилового спирта и ацетальдегида в крови коров при стандартном рационе и при включении в рацион пивной дробины.

4. Провести корреляционный анализ содержания эндогенных этилового спирта и ацетальдегида крови коров при различных физиологических состояниях с основными биохимическими показателями азотистого (активность ферментов аланинаминотрансферазы (АлАТ К.Ф. 2.6.1.2), аспартатаминотрансфе-разы (АсАТ К.Ф. 2.6.1.1), гаммаглутамилтрансферазы (ГГТ К.Ф. 2.3.2.4)), углеводного (глюкоза) и липидного (триацилглицериды, активность щелочной фос-фатазы (ЩФ К.Ф. 3.1.3.1)) обменов.

Научная новизна. Разработана методика количественного определения этилового спирта и ацетальдегида в крови коров методом капиллярной газовой хроматографии, позволяющая получать достоверные и воспроизводимые результаты. Подана заявка №2009148528 приоритет от 25.12.2009 г. на изобретение «Способ определения содержания этилового спирта и уксусного альдегида в крови».

Впервые получены данные о концентрации эндогенных этанола и ацетальдегида в крови клинически здоровых коров черно-пестрой породы при различных физиологических состояниях: самое высокое содержание этилового спирта отмечается на начальной стадии сухостойного периода, самое низкое его содержание - на 2-ой и 3-ий месяц лактации. Содержание эндогенного ацетальдегида в крови коров при различных физиологических состояниях статистически не отличается. Содержание эндогенного этанола на порядок выше концентрации ацетальдегида.

Впервые установлено, что введение в рацион изучаемых животных пивной дробины (15 % по массе от общего количества корма в течение 6-ти месяцев) вызывает увеличение концентрации этанола крови. При этом содержание ацетальдегида крови не изменяется.

Впервые выявлена высокая положительная корреляция между содержанием этанола и активностью ГГТ крови изучаемых животных при различных физиологических состояниях.

Практическая значимость. Разработанная методика количественного определения этилового спирта и ацетальдегида в крови коров может бьггь рекомендована для использования при проведении научных исследований по биохимии крови полигастричных животных.

Данные физиолого-биохимических исследований о содержании эндогенных этанола и ацетальдегида в крови коров могут быть использованы в качестве стандартных параметров при осуществлении контроля над метаболическим статусом животных при различных физиологических состояниях и при смене рационов.

Полученный новый фактический материал о содержании эндогенных этилового спирта и ацетальдегида у крупного рогатого скота может быть использован при написании соответствующих разделов и справочных руководств по биохимии и физиологии сельскохозяйственных животных.

Внедрение результатов. Результаты исследования используются в учебном процессе ФГОУ ВПО ОмГАУ (изданы методические указания «Биохимия крови: Содержание эндогенного этилового спирта и ацетальдегида у крупного рогатого скота» для студентов в рамках ООП ВПО 110401 - «Зоотехния», 111201 - «Ветеринария», 110501 - «Ветеринарная санитарная экспертиза» (утверждены на заседании секции животноводства Центра научного обеспечения АПК Омской области протокол № 6 от 24.09.09 г.)) и в практической деятельности ветеринарных врачей (изданы методические рекомендации для ветеринарных врачей «Определение содержания ацетальдегида и этилового спирта в крови методом капиллярной газовой хроматографии» (утверждены на заседании секции животноводства Центра научного обеспечения АПК Омской области протокол № 7 от 22.10.09 г.)).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработана методика количественного определения эндогенных этилового спирта и ацетальдегида в крови коров методом капиллярной газовой хроматографии, позволяющая получать воспроизводимые и достоверные результаты.

2. Содержание эндогенного ацетальдегида в крови клинически здоровых коров черно-пестрой породы при различных физиологических состояниях не отличается. В то же время наблюдается снижение эндогенного этилового спирта в крови коров от периода сухостоя к периоду раздоя: наибольшее значение концентрации этанола отмечается на начальной стадии сухостойного периода, с развитием лактационной доминанты отмечается тенденция к снижению уровня этилового спирта крови.

3. Введение в рацион коров отходов пивоваренного производства (сухая пивная дробина 15 % по массе от общего количества корма в течение 6-ти месяцев) вызывает увеличение содержания эндогенного этилового спирта крови. Для эндогенного ацетальдегида подобных отличий не установлено.

Апробация работы. Материалы исследований представлены на международном форуме по проблемам науки, техники и образования (Москва, 2008), региональной научно-практической конференции «Естественнонаучная составляющая высшего аграрного образования Сибирского федерального округа: современное состояние и перспективы развития; опыт совершенствования и инновации» (Омск, 2007) и внутривузовских научно-практических конференциях профессорско-преподавательского состава ОмГАУ (Омск, 2006 - 2009).

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 114 страницах печатного текста, содержит 17 таблиц, 16 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, изложения материалов и методов исследования, 5-ти глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений и приложения. Библиографический список включает 133 источника, в том числе 48 на иностранном языке.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 2 работы в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

1. Материалы и методы исследований

Диссертационная работа является частью научных исследований по теме кафедры химии («Биохимические механизмы развития, методы диагностики и способы коррекции токсикозов у сельскохозяйственных животных в условиях Омской области» (№ Гос. регистрации 01.200.202505)), входящей в научно-исследовательскую программу ФГОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет».

Научные исследования выполнялись в течение 2005-2009 гг. Проводилось несколько серий исследований.

Современными методами количественного определения этанола и аце-тальдегида являются высокочувствительные методы газовой хроматографии [F. Tagliaro et al., 1992]. Они, несомненно, обладают рядом существенных преимуществ перед химическими и ферментативными методами исследования этилового спирта и уксусного альдегида, но в тоже время имеют и некоторые недостатки. Так алкилнитритный метод недостаточно специфичен, требует проведения калибровки прибора при его повторном включении вследствие плохой воспроизводимости калибровочного графика, колонка обеспечивает хорошую воспроизводимость только при проведении на ней не более 30 анализов,

после чего требуется ее замена. Поэтому, первая серия исследований посвящена разработке новой методики количественного определения этилового спирта и адетальдегида в крови млекопитающих методом капиллярной газовой хроматографии, основанной на использовании современного аналитического оборудования (хроматограф «Хыолетт Паккард» (США) модель 5890 серия 2 с пламенно-ионизационным детектором и системой электронного регулирования потока газа-носителя, колонка кварцевая капиллярная «НР-РРАР», внутренний стандарт 1,2-пропил енгликоль).

Вторая серия исследований выполнялась на цельной крови клинически здоровых коров черно-пестрой породы при различных физиологических состояниях, содержащихся в хозяйстве «Рассвет» Любинского района Омской области в типовых животноводческих помещениях в осенне-зимний стойловый период. Клинически здоровые коровы были распределены по пяти группам (по 10-ти голов в каждой). Изучались следующие группы животных: 15 сутки сухостойного периода (группа 1), 50-53 сутки сухостойного периода (группа 2), 15 суток после отела (группа 3), 30 суток после отела (группа 4) и 3-4 месяца после отела (группа 5). Коровы были подобраны в группы по принципу парных аналогов (числу лактаций, продуктивности, живой массе). Все животные получали одинаковый по структуре и питательности рацион. Коровам готовили концентрированную смесь, в состав которой входили ячмень, отруби пшеничные, подсолнечный шрот, меласса, трикальцийфосфат, соль поваренная, мел кормовой. Концентрированную смесь скармливали на фоне основного рациона, который состоял из кормов, имеющихся в расположении хозяйства (сенаж однолетних трав, сено кострецовое, силос кукурузный). Воду животные получали без ограничения.

Третья серия исследований проведена на цельной крови (п = 10) клинически здоровых коров черно-пестрой породы одинакового физиологического состояния (15 суток после отела), получавших принятый в данном хозяйстве рацион (группы 3 и 6). В рацион коров 6-ой группы в течение шести месяцев вводилась сухая пивная дробина (15% по массе от общего количества корма). Образцы крови отбирались для исследования по окончании этого периода. Кровь для исследований брали из яремной вены в утреннее время до кормления. Схема проведения исследований представлена на рисунке 1.

Исследования выполнены методом капиллярной газовой хроматографии с использованием новой методики количественного определения этилового спирта и ацетальдегида в дистиллятах крови [Т.В. Постнова, 2006] на базе лаборатории Экспертно-криминалистического центра Управления внутренних

дел по Омской области и кафедры химии ФГОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет».

Рис. 1. Схема проведения исследований.

В работе изучались также основные биохимические показатели углеводного (глюкоза), липидного (триацилглицериды, активность ЩФ) и азотистого (активность ферментов АлАТ, АсАТ, ГГТ) обменов, которые определялись унифицированными методами на биохимическом анализаторе Autolab (Италия) с помощью стандартных наборов реактивов фирмы «Human GmbH» (Германия) на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия».

Статистическая обработка результатов проведена с помощью параметрических и непараметрических критериев (Спирмена (rs), Ньюмена-Кейлса (q), Даннета (q')) [С. Гланц, 1998]. Математическая обработка данных и их графическое отображение выполнены на персональном компьютере с использованием программ «HP CheraStation» А 08 03 RUS [847] Copyright Interlab Inc., (по лицензии Agilent Technologies 2001), «STATISTICA for Windows», ver. 5.1 (StatSoft, Inc., 1996), «Primer of Biostatistics», ver. 4.03, by Stanton A. Glantz, 1998.

Выражаем благодарность заслуженному деятелю науки РФ, доктору биологических наук, профессору А.Я. Рябикову, принявшему участие в обсуждении результатов исследования.

2. Результаты исследований

2.1 Разработка методики количественного определения этилового спирта и ацетальдегида в крови коров

Метод основан на газохроматографическом разделении исследуемых компонентов с использованием капиллярной колонки и последующем количественном определении этилового спирта и ацетальдегида в дистиллятах цельной крови.

Разделенные на хроматографйческой колонке компоненты смеси поочередно поступают в пламенно-ионизационный детектор, сигналы которого регистрируются в виде ряда хроматографических пиков. Установление подлинности веществ производится по времени их удерживания, которое исчисляется от момента введения анализируемого вещества в колонку до появления максимума пика.

Расчет концентрации ацетальдегида и этилового спирта производят с помощью внутреннего стандарта. Внутренний стандарт - 1,2-пропиленгликоль.

Время хроматографирования - 32 минуты.

Условия хроматографирования

Температурная программа термостата колонки: начальная температура -50 градусов Цельсия, 10 мин. в изотерме, далее программирование температуры со скоростью 15 градусов в минуту до 220 градусов Цельсия, 10 мин. в изотерме;

Температура инжектора- 150 градусов Цельсия;

Температура детектора - 230 градусов Цельсия;

Газ-носитель - азот; 1

Деление потока - 1:40.

Хроматограф предварительно калибруют по ацетальдегиду, этиловому спирту и 1,2-пропиленгликолю, используя не менее трех калибровочных смесей.

Подготовка пробы и ход определения

Взвешивают от 10 до 50 г цельной крови в перегонную кодбу вместимостью 500 см3, затем добавляют 50 см3 дистиллированной воды. Смесь перемешивают. Колбу со смесью присоединяют к дефлегматору с каплеуловителем и холодильником с прямой трубкой.

При осторожном нагревании (бурное вспенивание) смесь подвергают прямой дистилляции и собирают точно 25 см3 дистиллята в мерную колбу вместимостью 25 см3. Ацетальдегид и этиловый спирт отгоняются с первыми миллилитрами дистиллята. Приемную колбу необходимо дополнительно охлаждать.

В 25 см3 полученного дистиллята вносят 2 мм3 внутреннего стандарта. Внутренний стандарт - 1,2-пропиленгликоль. Смесь тщательно перемешивают и подвергают хроматографическому исследованию. Достаточно провести два определения. За результат измерения принимают среднее арифметическое значение двух параллельных определений.

Контроль точности результатов измерений

Для оценки правильности результатов измерений были проведены исследования стандартных растворов этанола по новой методике и известной ранее [Методическое письмо от 22 апреля 1968 г. № 10-95/14-32] (табл. 1). Кроме того, правильность и воспроизводимость предлагаемой методики оценивалась методом добавок (табл. 2).

В ходе статистической обработки данных установлено, что различия средних значений достоверно незначимы с вероятностью 95 %. Таким образом, полученные результаты подтверждают, что разработанная методика газохромато-графического определения эндогенного этанола в крови коров дает правильные и воспроизводимые результаты.

Метод Концентрация этанола в стандартном растворе, % Найдено, % Абсолютная погрешность, %

ГЖХ, алкил-нитриты 0,01 0,0096±0,0007 0,0003

ГЖХ 0,01 0,0098±0,0003 0,0001

Примечание: р < 0,05

Таблица 2. Оценка правильности и воспроизводимости методики

определения

Проба, п=2 Найдено в про-бе, мкг Добавка, мкг Найдено в пробе с добавкой, мкг Найдено в добавке, мкг Относительная по- греш- ность, % Воспроизводимость, %

0,0001 % р-р этанола 24,88 5,0 29,79 4,95 0,7 5,2

0,0001 % р-р ацеталь-дегида 24,92 5,0 29,86 4,98 0,5 4,7

Хроматограмма дистиллята цельной крови коровы представлена на рисунке 2.

о, Я Ю. 16 20 .„ _______30 .......... ..... о*

Рис. 2. Хроматограмма дистиллята цельной крови коровы

Расчет концентрации этилового спирта и ацетальдегида в цельной крови проводился по формуле:

1000 -т

где а - результат хроматографического исследования, мг/дм3;

V - объем дистиллята, см3;

ш - масса навески цельной крови, г.

Итак, в ходе проведенных исследований установлено, что предлагаемая к рассмотрению в данной работе новая методика газохроматографического определения содержания этанола и ацетальдегида в крови коров позволяет получать достоверные и воспроизводимые результаты.

2.2 Содержание эндогенного этилового спирта в крови коров при различных физиологических состояниях и при различных рационах

Содержание эндогенного этилового спирта в крови коров при различных физиологических состояниях изменяется в диапазоне от 0,42-10"3 % до 0,80-10'3 % (от 0,10 ммоль/л до 0,18 ммоль/л). Наблюдается снижение эндогенного этилового спирта в крови от периода сухостоя к периоду раздоя: наибольшее значение концентрации этанола отмечается на начальной стадии сухостойного периода, с развитием лактационной доминанты отмечается тенденция к снижению уровня этилового спирта крови.

Выявлено достоверное увеличение содержания этилового спирта в крови коров при введении в рацион животных пивной дробины (рис. 3). Установлено, что концентрация этанола крови животных 6-ой группы примерно в 6 раз выше по сравнению с коровами 3-ей группы. Отмечается также значительная вариабельность этого показателя в изучаемой группе животных, что, вероятно, определяется особенностями рациона. Повышенное содержание этилового спирта согласуется с данными М.П. Кириллова и др., согласно которым применение пивной дробины усиливает биохимические процессы в рубце, что приводит к интенсификации липидного и углеводного обмена, и, следовательно, должно приводить к повышению концентрации этанола.

В ходе статистической обработки данных установлено, что различия в содержании эндогенного этанола в крови коров при различных физиологических состояниях достоверно незначимы с вероятностью 95 % (рис. 3).

.1 -.-,-,-.-----.-.-

1 2 3 4 5 6

Группа

Рис. 3. Содержание эндогенного этилового спирта в крови коров при различных физиологических состояниях (группы 1-5) и при различных рационах (группа 6).

Примечание: *** - достоверность отличий по сравнению с 3-ой группой р < 0,001.

2.3 Содержание эндогенного ацетальдегида в крови коров при различных физиологических состояниях и при различных рационах

В результате проведенных исследований установлено, что концентрация эндогенного ацетальдегида крови коров при различных физиологических состояниях изменяется в диапазоне от 0,05-10'3 % до 0,08-10"3 % (от 0,01 ммоль/л до 0,02 ммоль/л). Соотношение этанол/ацетальдегид (по медиане) принимает значение 13,3; 9,3; 9,2; 4,9; 3,9 и 41,8 группа 1-6 соответственно.

Данный факт может быть объяснен большой реакционной способностью ацетальдегида и его высокой биологической активностью. Эндогенный этиловый спирт может регулировать концентрацию ацетальдегида в клетках млекопитающих и являться его поставщиком в необходимых для обменных процессов количествах, что и объясняет более высокое его содержание в крови. Эти данные еще раз подтверждают представления о том, что ферментные системы, ответственные за метаболизм этилового спирта и уксусного альдегида, ведут себя как адаптивные системы, обеспечивающие гомеостатические функции поддержания оптимального уровня ацетальдегида в организме [Ю.М. Островский, 1982].

В ходе статистической обработки данных установлено, что различия в содержании эндогенного адетальдегида в крови коров при различных физиологических состояниях и различных рационах достоверно незначимы с вероятностью 95 % (рис. 4).

Введение в рацион животных пивной дробины не вызывает изменения содержания эндогенного ацетальдегида в крови, в отличие от этанола. В б-ой группе отмечаются значительная вариабельность концентрации эндогенного ацетальдегида крови различных животных (рис. 4). Аналогичная картина в данной группе наблюдалась и для эндогенного этилового спирта (рис. 3). Этот факт может быть объяснен тем, что в самой системе этанол/ацетальдегид существуют сложные взаимоотношения, которые в значительной мере определяются индивидуальными особенностями организма животных, активностью и слаженностью действия ферментных систем.

О 0.16

1 0.14

% 0.12

1 •л 0.10

а

о

Ы от

от

0.04

0Д2

ООО

а Мвсйап I—12256-75%

Группа

Рис. 4. Содержание эндогенного ацетальдегида в крови коров при различных физиологических состояниях (группы 1-5) и при различных рационах (группа 6).

Примечание-, р < 0,05.

Проведение корреляционного анализа показало наличие высокой сопряженности связи между содержанием эндогенных этанола и ацетальдегида в крови коров на 15-ые сутки после отела независимо от рациона (группа 3 и 6). Коэффициент Спирмена принимает значения 0,56 и 0,77 соответственно (р < 0,05).

2.4 Взаимосвязь эндогенного этанола кровн коров при различных физиологических состояниях с основными биохимическими показателями азотистого (АлАТ, АсАТ, ГТТ), углеводного (глюкоза) и лнпидного (триа-цилглицернды, ЩФ) обменов.

При изучении корреляционных взаимоотношений между содержанием эндогенного этанола и активностью ГТТ сыворотки крови коров при различных физиологических состояниях установлено, что коэффициент Спирмена принимает значения 0,32 (р > 0,05); 0,58; 0,54; 0,56 и 0,55 (р < 0,05) группы 1-5 соответственно. Полученные результаты позволяют сделать вывод о наличии высокой сопряженности связи между содержанием эндогенного этилового спирта и активностью ГТТ крови коров (кроме 1-ой группы животных).

При изучении сопряженности связи в парах этанол - АлАТ, этанол -АсАТ, этанол - глюкоза, этанола - триацилглицериды, этанол - ЩФ взаимосвязи между содержанием этанола и показателями азотистого, углеводного и ли-пидного обменов не установлено.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АлАТ (К. Ф. 2.6.1.2) - аланинаминотрансфераза АсАТ (К. Ф. 2.6.1.1) - аспартатаминотрансфераза ГТТ (К. Ф. 2.3.2.4) - гаммаглугамилтрансфераза ЩФ (К. Ф. 3.1.3.1) - щелочная фосфатаза

ВЫВОДЫ

1. Разработана новая методика количественного определения этилового спирта и ацетальдегида в крови коров, позволяющая получать воспроизводимые и достоверные результаты.

2. У клинически здоровых коров черно-пестрой породы при различных физиологических состояниях содержание эндогенного этилового спирта крови изменяется от 0,42-10'3 % до 0,80-Ю"3 % (от 0,10 ммоль/л до 0,18 ммоль/л). Наблюдается снижение эндогенного этанола в крови коров от периода сухостоя к периоду раздоя: наибольшее значение концентрации этанола отмечается на начальной стадии сухостойного периода, с развитием лактационной доминанты отмечается тенденция к снижению уровня этилового спирта крови.

3. У клинически здоровых коров черно-пестрой породы при различных физиологических состояниях содержание эндогенного уксусного альдегида крови изменяется от 0,05-10"3 % до 0,08-10'3 % (от 0,01 ммоль/л до

0,02 ммоль/л). Концентрация эндогенного ацетальдегида в крови коров при различных физиологических состояниях статистически не отличается.

4. У клинически здоровых коров черно-пестрой породы содержание эндогенного этанола крови зависит от рациона. Введение в рацион изучаемых животных отходов пивоваренного производства (сухая пивная дробина 15 % по массе от общего количества корма в течение б-ти месяцев) вызывает достоверное увеличение содержания эндогенного этилового спирта в крови. Для эндогенного уксусного альдегида подобных отличий не установлено.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Новая методика количественного определения эндогенных этилового спирта и ацетальдегида в крови коров методом капиллярной газовой хроматографии может быть рекомендована для проведения исследований в ветеринарной практической деятельности.

2. Результаты исследований могут быть использованы в учебном процессе аграрных вузов по дисциплине «Биохимия» при подготовке студентов по специальностям «Зоотехния», «Ветеринария» и «Ветеринарно-санитарная экспертиза».

3. Данные физиолого-биохимических исследований о содержании эндогенных этанола и ацетальдегида в крови коров могут быть использованы в качестве биохимических тестов для определения референтных величин при изучении метаболизма крупного рогатого скота при различных физиологических состояниях (беременность, сухостойный период, период лактации) и при смене рационов, а также при написании соответствующих разделов учебных и справочных руководств по биохимии и физиологии сельскохозяйственных животных.

Список опубликованных работ:

1. Биохимические аспекты функционирования системы детоксикации крупного рогатого скота: монография / под ред. И.П. Степановой. - Омск: ФГОУ ВПО «ОмГАУ», 2008.

2. Мицуля, Т.П. Возрастные особенности содержания эндогенных ацетальдегида и этанола крови крупного рогатого скота / Т.П. Мицуля, Т.В. Постнова // Естественнонаучная составляющая профессионального образования разных уровней: опыт формирования, инновации и перспективы совершенствования качества: сборник научных трудов. - Омск, 2007. - С. 149-152.

3. Мицуля, Т.О. Коэффициент этанол/ацет альдегид крови крупного рогатого скота разного возраста, пола и физиологического состояния / Т.П. Мицуля, Т.В. Постнова, И.П. Степанова // Известия Самарского научного центра Российской Академия наук. - 2009. - Т. 11. - № 1(2)(27). -С. 102-106.

4. Постнова, Т.В. Новая методика определения эндогенных ацеталь-дегвда а этилового спирта в крови крупного рогатого скота методом капиллярной газовой хроматографии / Т.В. Постнова // Омский научный вестник. Омск, 2006. - № 3(36). - С. 158-161.

5. Постнова, Т.В. Содержание эндогенных ацетальдегида и этилового спирта крови коров при различных физиологических состояниях и рационах / Т.В. Постнова, И.П. Степанова // Омский научный вестник. Омск, 2007. -№ 1(53).-С. 41-43.

6. Постнова, Т.В. К вопросу об активности ферментов и содержанию эндогенных ацетальдегида и этилового спирта в крови коров при различных физиологических состояниях / Т.В. Постнова, И.П. Степанова, Я.С. Макарова // Труды международного форума по проблемам науки, техники и образования: под. ред. В.В. Вишневского. - М., 2008. - Т. 2. - С. 76-78.

7. Постнова, Т.В. Определение содержания ацетальдегида и этилового спирта в крови методом капиллярной газовой хроматографии / Т.В. Постнова, Т.П. Мицуля // Методические рекомендации. - Омск: ФГОУ ВПО «ОмГАУ», 2009.

8. Постнова, Т.В. Биохимия крови: содержание эндогенных этилового спирта и ацетальдегида крови крупного рогатого скота / Т.В. Постнова, Т.П. Мицуля, И.П. Степанова // Методические указания для студентов по дисциплине «биохимия». - Омск: ФГОУ ВПО «ОмГАУ», 2009.

На правах рукописи

Постнова Татьяна Вячеславовна

Содержание эндогенных этилового спирта и ацетальдегида в крови коров при различных физиологических состояниях

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 09.04.2010. Формат 60x84 1/6. Гарнитура Times New Roman. Усл. печ. л. 1,0. Печать оперативная. Тираж 100 экз. Отпечатано с оригинал-макета в типографии «Вариант-Омск» 644043, г. Омск, ул. Фрунзе, 1, корп.З. Тел./факс: 211-600

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Постнова, Татьяна Вячеславовна

03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Ирина Петровна Степанова

0мск

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Пути обмена эндогенных этилового спирта и ацетальдеги-да в организме, биологическое значение, физиологическая роль, токсикологическое действие.

1.2 Методы определения этилового спирта и ацетальдегида в крови.

ГЛАВА 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Материалы и методы исследований.

2.2 Разработка методики количественного определения этилового спирта и ацетальдегида в крови.

2.2.1 Принцип метода.

2.2.2 Средства измерения, вспомогательное оборудование, реактивы и материалы.

2.2.3 Подготовка к выполнению измерений.

2.2.4 Выполнение измерений.

2.2.5 Обработка результатов измерений.

2.3 Содержание эндогенного этилового спирта в крови коров.

2.3.1 Содержание эндогенного этилового спирта в крови коров при различных физиологических состояниях.

2.3.2 Содержание эндогенного этилового спирта в крови коров при стандартном рационе и при включении в рацион пивной дробины.

2.4 Содержание эндогенного ацетальдегида в крови коров.

2.4.1 Содержание эндогенного ацетальдегида в крови коров при различных физиологических состояниях.

2.4.2 Содержание эндогенного ацетальдегида в крови коров при стандартном рационе и при включении в рацион пивной дробины.

2.5 Взаимосвязь эндогенного этанола крови коров при различных физиологических состояниях с основными биохимическими показателями азотистого (АлАТ, АсАТ, ГГТ), углеводного глюкоза) и липидного (триацилглицериды, ЩФ) обменов.

ГЛАВА 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Содержание эндогенных этилового спирта и ацетальдегида в крови коров при различных физиологических состояниях"

Актуальность исследования. Количественное определение этилового спирта и ацетальдегида в крови и тканях животных сопровождается рядом технических трудностей. Например, при использовании ферментных методов результаты в значительной степени зависят от техники предварительной обработки проб (характер дистилляции, способ депротеинизации и др.) [Ю.М. Островский, и др., 1986; В.В. Рогожин, Т.В. Рогожина, 2004]. В литературе описаны методы количественного определения этилового спирта с применением цветных реакций [М.Д. Швайкова, 1975; Ю.В. Родионов, и др., 2002]. Широкое применении в 60-е годы получили так называемый «нитритный» метод и способ Видмарка [V. Klixgmuller et al., 1968]. «Нитритный» метод очень трудоемок, требует быстрой обработки исследуемого материала двойной перегонкой с водяным паром, большого количества исследуемого материала (около 200-300 г). Кроме того метод недостаточно специфичен. Способ Видмарка применяется с целью определения степени опьянения живых лиц. Для проведения исследования требуется незначительное количество исследуемого материала (около 0,6 мл крови), что, несомненно, является преимуществом этого метода, хотя работа с такими навесками существенно влияет на погрешность проводимого исследования.

С появлением газохроматографического оборудования в конце 60-х годов был разработан метод определения этилового алкоголя в крови и моче [Методическое письмо от 22 апреля 1968 г. № 10-95/14-32]. Метод позволяет получать точные и воспроизводимые результаты, но, все-таки не обладает достаточной специфичностью, так как при обнаружении в исследуемом материале наряду с этиловым спиртом пропилового и изопропилового алкоголя количественно определить этиловый алкоголь не представляется возможным.

В связи с вышеизложенным становиться понятным, что имеется необходимость в разработке новых методик количественного определения содержания ацетальдегида и этилового спирта в крови, основанных на использовании современного газохроматографического оборудования.

Применение биохимических тестов, позволяющих выявлять отклонения в метаболизме на ранних стадиях, способствует сохранению здоровья крупного рогатого скота и повышению его продуктивности [Б.В. Уша, и др., 2003]. В настоящее время возникла необходимость в разработке новых тестов, позволяющих зафиксировать отклонения в содержании эндогенных этанола и ацетальдегида крови, метаболизм которых непосредственно связан с углеводным и липидным обменом. Уровень этанола и ацетальдегида в крови и тканях млекопитающих животных зависит от множества факторов, в частности от различных фаз репродуктивного цикла, системы кормления, внешних воздействий окружающей среды и т.п. Эндогенный и экзогенный уровень этих веществ в крови и тканях некоторых млекопитающих хорошо изучен [М.Д. Швайкова, 1975; Ю.М. Островский, и др., 1986; С.М. Зиматкин, 2007], в то время как у крупного рогатого скота подобные исследования не проводились и информация о содержании этилового спирта и ацетальдегида в крови этих животных отсутствует.

Обеспечение животных полноценными кормами является одной из первостепенных задач современного скотоводства. Для решения этой задачи в рацион сельскохозяйственных животных в настоящее время широко применяют включение отходов пивоваренных (пивная дробина) [В.А. Блинов, И.А. Сазонова, 2005; Г.А. Пелевина, Н.И. Чернышев, 2007] и спиртовых (спиртовая барда) производств [А.С. Ушаков, 2007; М. Маликова, М. Сабитов, 2007]. В литературе имеются сведения о положительных эффектах применения этих концентратов — увеличивается интенсивность белкового и липидного обмена, молочная продуктивность, выход молочного белка и жира [П.А. Науменко, и др., 2004; Л.В. Романенко, 2007; Н.В. Воробьева, и др., 2008; Е.Ю. Герасимов, 2008]. Большое значение имеет также и экономический эффект за счет снижения себестоимости молока и получения дополнительной прибыли [М.П. Кирилов, и др., 2004]. Однако влияние этих добавок на содержание этилового спирта и ацетальдегида в крови животных не изучалось, хотя известно, что при превышении физиологических концентраций эти метаболиты, и особенно ацетальдегид, способны оказывать токсическое действие на организм [С.М. Зиматкин, 1989; С.М. Зиматкин, и др., 1993; M.V. Singer, S. Teyssen, 2001; Е.В. Васильева, и др., 2004; G.D. Castro et al., 2006; Ю.М. Пархоменко, и др., 2007; S.S.R. Bhupanapadu et al., 2008]. Поэтому информация о содержании эндогенных этилового спирта и ацетальдегида в крови крупного рогатого скота представляет большой интерес.

Цель исследования. Разработка методики количественного определения этилового спирта и уксусного альдегида в крови коров и изучение содержания этих метаболитов в крови клинически здоровых коров черно-песгрой породы при различных физиологических состояниях для разработки нового биохимического теста.

Задачи исследования:

• Разработать методику количественного определения этилового спирта и ацетальдегида в крови коров методом капиллярной газовой хроматографии.

• Изучить содержание эндогенных этилового спирта и ацетальдегида в крови коров при различных физиологических состояниях.

• Изучить содержание эндогенного этилового спирта и ацетальдегида в крови коров при стандартном рационе и при включении в рацион пивной дробины.

• Провести корреляционный анализ содержания эндогенных этилового спирта и ацетальдегида крови коров при различных физиологических состояниях с основными биохимическими показателями азотистого (активность ферментов аланинаминотрансферазы (АлАТ К.Ф. 2.6.1.2), аспартатаминотрансферазы (АсАТ К.Ф. 2.6.1.1), гаммаглутамилтрансферазы (ГГТ К.Ф. 2.3.2.4)), углеводного (глюкоза) и липидного (триацилглицериды, активность щелочной фосфатазы (ЩФ К.Ф. 3.1.3.1)) обменов.

Научная новизна. Разработана методика количественного определения этилового спирта и ацетальдегида в крови коров методом капиллярной газовой хроматографии, позволяющая получать достоверные и воспроизводимые результаты. Подана заявка №2009148528 приоритет от 25.12.2009 г. на изобретение «Способ определения содержания этилового спирта и уксусного альдегида в крови».

Впервые получены данные о концентрации эндогенных этанола и ацетальдегида в крови клинически здоровых коров черно-пестрой породы при различных физиологических состояниях: самое высокое содержание этилового спирта отмечается на начальной стадии, сухостойного периода, самое низкое его содержание - на 2-ой и 3-ий месяц лактации. Содержание эндогенного ацетальдегида в крови коров при различных физиологических состояниях статистически не отличается. Содержание эндогенного этанола на порядок выше концентрации ацетальдегида.

Впервые установлено, что введение в рацион изучаемых животных пивной дробины (15 % по массе от общего количества корма в течение

6-ти месяцев) вызывает увеличение концентрации этанола крови. При этом содержание ацетальдегида крови не изменяется.

Впервые выявлена высокая положительная корреляция между содержанием этанола и активностью ГГТ крови изучаемых животных при различных физиологических состояниях.

Практическая значимость. Разработанная методика количественного определения этилового спирта и ацетальдегида в крови коров может быть рекомендована для использования при проведении научных исследований по биохимии крови полигастричных животных. Методика позволяет определить в рамках одного исследования кроме ацетальдегида и этилового спирта, такие метаболиты организмов животных как метиловый и этиловый эфир уксусной кислоты, ацетон, пропиловые, бутиловые и амиловые спирты и другие соединения.

Данные физиолого-биохимических исследований о содержании эндогенных этанола и ацетальдегида в крови коров могут быть использованы в качестве стандартных параметров при осуществлении контроля над метаболическим статусом животных на разных стадиях репродуктивного цикла и при смене рационов.

Полученный новый фактический материал о содержании эндогенных этилового спирта и ацетальдегида у крупного рогатого скота может быть использован при написании соответствующих разделов и справочных руководств по биохимии и физиологии сельскохозяйственных животных.

Внедрение. Результаты исследования используются в учебном процессе ФГОУ ВПО ОмГАУ (изданы методические указания «Биохимия крови: Содержание эндогенного этилового спирта и ацетальдегида у крупного рогатого скота» для студентов в рамках ООП ВПО 110401 — «Зоотехния», 111201 - «Ветеринария», 110501 - «Ветеринарная санитарная экспертиза» (утверждены на заседании секции животноводства Центра научного обеспечения АПК Омской области протокол № 6 от 24.09.09 г.)) и в практической деятельности ветеринарных врачей (изданы методические рекомендации для ветеринарных врачей «Определение содержания ацетальдегида и этилового спирта в крови методом капиллярной газовой хроматографии» (утверждены на заседании секции животноводства Центра научного обеспечения АПК Омской области протокол № 7 от 22.10.09 г.)).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработана методика количественного определения эндогенных этилового спирта и ацетальдегида в крови коров методом капиллярной газовой хроматографии, позволяющая получать воспроизводимые и достоверные результаты.

2. Содержание эндогенного ацетальдегида в крови клинически здоровых коров черно-пестрой породы при различных физиологических состояниях не отличается. В то же время наблюдается снижение эндогенного этилового спирта в крови коров от периода сухостоя к периоду раздоя: наибольшее значение концентрации этанола отмечается на начальной стадии сухостойного периода, с развитием лактационной доминанты отмечается тенденция к снижению уровня этилового спирта крови.

3. Введение в рацион коров отходов пивоваренного производства (сухая пивная дробина 15 % по массе от общего количества корма в течение б-ти месяцев) вызывает увеличение содержания эндогенного этилового спирта крови. Для эндогенного ацетальдегида подобных отличий не установлено.

Апробация работы. Материалы исследований представлены на международном форуме по проблемам науки, техники и образования (Москва, 2008), региональной научно-практической конференции

Естественнонаучная составляющая высшего аграрного образования Сибирского федерального округа: современное состояние и перспективы развития; опыт совершенствования и инновации» (Омск, 2007) и внутривузовских научно-практических конференциях профессорско-преподавательского состава ОмГАУ (Омск, 2006 - 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Постнова, Татьяна Вячеславовна

ВЫВОДЫ

1. Разработана новая методика количественного определения этилового спирта и ацетальдегида в крови коров, позволяющая получать воспроизводимые и достоверные результаты.

2. У клинически здоровых коров черно-пестрой породы при различных физиологических состояниях содержание эндогенного этилового спирта крови изменяется от 0,42-10"3 % до 0,80-10"3 % (от 0,10 ммоль/л до 0,18 ммоль/л). Наблюдается снижение эндогенного этанола в крови коров от периода сухостоя к периоду раздоя: наибольшее значение концентрации этанола отмечается на начальной стадии сухостойного периода, с развитием лактационной доминанты отмечается тенденция к снижению уровня этилового спирта крови.

3. У клинически здоровых коров черно-пестрой породы при различных физиологических состояниях содержание эндогенного уксусного альдегида крови изменяется от 0,05-10" % до 0,08-10" % (от 0,01 ммоль/л до 0,02 ммоль/л). Концентрация эндогенного ацетальдегида в крови коров при различных физиологических состояниях статистически не отличается.

4. У клинически здоровых коров черно-пестрой породы содержание эндогенного этанола крови зависит от рациона. Введение в рацион изучаемых животных отходов пивоваренного производства (сухая пивная дробина 15 % по массе от общего количества корма в течение 6-ти месяцев) вызывает достоверное увеличение содержания эндогенного этилового спирта в крови. Для эндогенного уксусного альдегида подобных отличий не установлено.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Постнова, Татьяна Вячеславовна, Омск

1. Анохина, И.П. Этанол и обмен веществ / И.П. Анохина, Б.М. Коган, Н.В. Нечаев. Минск, 1982. - С. 55-71.

2. Афанасьева, А.Н. Сравнительная оценка уровня эндогенной интоксикации у лиц разных возрастных групп / А.Н. Афанасьева // Клин, лаб. диагностика. 2004. - № 6. - С. 11-13.

3. Бережной, Р.В. Руководство по судебно-медицинской экспертизе отравлений / Р.В. Бережной и др.. М.: Медицина, 1980. - С. 251.

4. Блинов, В.А. Применение биотрансформированной дробины в производстве / В.А. Блинов, И.А. Сазонова // Зоотехния. 2005. - № 12. -С.11-12.

5. Боброва, Н.П. Этанол и обмен веществ / Н.П. Боброва. Минск, 1982.-С. 104-117.

6. Божко, Г.Х. Исследование обмена липопротеинов у абстинентов / Г.Х. Божко, В.В. Соколик, B.C. Чурсина // Укр. 6ioxiM. ж. 2004. - Т. 76. -N 2. - С. 87-92.

7. Борисова, JI.A. Сравнительное исследование влияния алифатических спиртов на энергозависимую аккумуляцию Са во внутриклеточных мембранных структурах гладкой мышцы / Л.А. Борисова и др. // Укр. биохим. ж. 2000. - Т. 72, N 2. - С. 28-35.

8. Бортникова, Н.А. Влияние этанола на активность ферментов мозга / Н.А. Бортникова // Вестн. Рос. гос. мед. ун-та: тез. 2-ой Международной (11 Всероссийской) Пироговской студенческой науч. мед. конференции. М., 2007. -N 2. - С. 253-254

9. Бровкина, И.Л. Иммунометаболические нарушения в условиях экспериментальной этанольной интоксикации / И.Л. Бровкина и др. // Вестн. нов. мед. технол. 2007. - Т. 14. -N 2. - С. 9-11.

10. Буров, Ю.В. Нейрохимия и фармакология / Ю.В. Буров, Н.Н. Ведерникова. М., 1985, 238 с.

11. Быкова, А.А. Иммунные и аутоиммунные эффекты этанола / А.А. Быкова, Н.С. Сединина // Эксперим. и клин, фармакол. 2002. -Т. 65,N6.-С. 60-63.

12. Васильева, Е.В. Ацетальдегид и некоторые биохимические параметры при алкогольных интоксикациях / Е.В. Васильева и др. // Суд.-мед. экспертиза. 2004. - Т. 47, N 2. - С. 23-27.

13. Воробьева, Н.В. Применение минерально-витаминной добавки Глюковит в кормлении л актирующих коров / Н.В. Воробьева, Т.П. Логинова, Е.Ю. Герасимов // Зоотехния. 2008. - № 2. - С. 8-10.

14. Гамалея, Н.Б. Иммунодиагностика хронической алкогольной интоксикации / Н.Б. Гамалея // Российский психиатрический журнал. -2003.-№6. -С. 30-36.

15. Герасимов, Е.Ю. Резервы кормовой базы в центральной зоне Нижегородской области / Е.Ю. Герасимов // Зоотехния. 2008. - № 4. -С.12-13.

16. Гланц, С. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. / Гланц. М.: Практика, 1998. - 459 с.

17. Гриненко, А .Я. Скорость снижения концентрации этанола в крови в условиях психоэмоционального стресса / А .Я. Гриненко и др. // Учен. зап. СПбГМУ. 2002. - Т. 9, N 1. - С. 88-91.

18. Душкин, Е.В. Физиолого-биохимическое обоснование лабильности липидно-углеводного метаболизма и его коррекции у крупного рогатого скота: автореф. дис. . докт. биол. наук / Е.В. Душкин. -Орел, 2009. 57 с.

19. Живодеров, Н.Н. Экспертная оценка данных количественного определения этилового алкоголя / Н.Н. Живодеров, В.А. Балякин //

20. Актуальные вопросы судебной токсикологии. Тезисы пленума правления Всесоюзного общества судебных медиков. М. - Ставрополь, 1974. -С. 53-54.

21. Жуков, В.Н. Фармакология эксперементального алкоголизма /

22. B.Н. Жуков. -М., 1982. С. 60-73.

23. Забродский, П.Ф. Действие спиртов и их метаболитов на антителообразующую функцию Т- и В-лимфоцитов in vitro / П.Ф. Забродский, В.Ф. Киричук, О.В. Осипов // Бюл. эксперим. биол. и мед. 2002. - Т. 133.-N3.-C. 301-303.

24. Зиматкин, С.М. Окисление этанола в мозге / С.М. Зиматкин // Вопр. наркол. 2007. - N 2. - С. 58-63, 77.

25. Зиматкин, С.М. Структурные изменения в коре мозга крыс, вызываемые алкоголем в сочетании с ингибиторами альдегиддегидрогеназы / С.М. Зиматкин // Арх. анат., гистол. и эмбриол. -1989.-Т 10.-С. 13-20.

26. Зиматкин, С.М. Метод исследования окисления этанола в живом мозге / С.М. Зиматкин, A.JI. Бубен // Бюл. эксп. биол. и мед. 2006. -№9.-С. 357-360.

27. Зиматкин, С.М. Концентрация ацетальдегида в крови у интактных крыс при алкогольной интоксикации и действии ингибиторов альдегиддегидрогеназы / С.М. Зиматкин, П.С. Пронысо, А.Б. Кузьмич // Вопросы наркологии. 1993. - Т. 3. - С. 40-42.

28. Зиматкин, С.М. Альдегидметаболизирующая система мозга крыс с различной алкогольной мотивацией в условиях острого стресса /

29. C.М. Зиматкин, П.С. Пронько, Ю.А. Тарасов // Нейрохимия. 1989. -Т. 2. - С. 269-272.

30. Кершенгольц, Б.М. Этанол и ацетальдегид в организмах растений и животных: автореф. дис. . д-ра биол. наук / Б.М. Кершенгольц. М., 1991.-49 с.

31. Кирилов, М.П. Включение сухой пивной дробины в комбикорм для коров / М.П. Кирилов и др. // Зоотехния. 2004. - № 5. - С. 10-13.

32. Курилов, Н.В. Физиология и биохимия пищеварения жвачных / Н.В. Курилов и др.. М.: КолосС, 1971. 432 с.

33. Левахин, В.И. Стресс-факторы в промышленном животноводстве и антистрессовое действие на животных некоторых кормовых добавок и биологически активных веществ / В.И. Левахин и др. // Вестник РАСХН. -2007.-С. 124.

34. Лифанова, С.П. Стресс-факторы и их последствия в молочном скотоводстве / С.П. Лифанова // Вест. Ульяновской гос. с-х акад. 2004. -№ 15.-С. 123-125.

35. Лосенок, С.А. Изменение иммунометаболических параметров при алкогольной интоксикации / С.А. Лосенок, И.Л. Бровкина // Курск, науч.-практ. вестн. "Человек и его здоровье". 2007. -N 1. - С. 5-10.

36. Маликова, М. Использование белково-минеральных добавок в бардяных рационах коров / М. Маликова, М. Сабитов // Зоотехния. 2007. -№ 1.-С. 21-22.

37. Масленникова, А. Влияние этанола на дыхательную систему животных / А. Масленникова, Ю.В. Нестеров, Г.Н. Протасевич // Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря. Астрахань, 2006. -С. 278.

38. Науменко, П.А. Влияние скармливания пивной дробины на белковый обмен у бычков / П.А. Науменко, Д.А. Бодров, Н.В. Крутий // Зоотехния. 2004. - № 12.-С. 12.

39. Островский, В.Ю. Биоорганическая химия / В.Ю. Островский, И.И. Степуро.- 1986, Т. 5. С. 1161-1170.

40. Островский, Ю.М. Этанол и обмен веществ / Ю.М. Островский. -Минск. 1982.-С. 6-41.

41. Островский, Ю.М. Пути метаболизма этанола и их роль в развитии алкоголизма / Ю.М. Островский, М.Н. Садовник // Токсикология, ВИНИТИ. 1984. - С. 93-150.

42. Островский, Ю.М. Биологический компонент в генезисе алкоголизма / Ю.М. Островский, В.И. Сатановская, М.Н. Садовник. -Минск: Наука и техника, 1986. С. 40-64.

43. Об обнаружении и определении этилового алкоголя в крови и моче методом газожидкостной хроматографии: Методическое письмо от 22 апреля 1968 г. № 10-95/14-32.

44. Пархоменко, Ю.М. Характерные метаболические нарушения в тканях крыс, вызванные длительным приемом алкоголя / Ю.М. Пархоменко и др. // Укр. 6ioxiM. ж. 2007. - Т. 79, N 3. - С. 61-69.

45. Пелевина, Г.А. Применение пивной дробины в комбикормах для кур-несушек / Г.А. Пелевина, Н.И. Чернышев // Зоотехния. 2007. - № 7. -С. 15-16.

46. Пиголкина, Е.Ю. Ацетальдегид: нейромодулятор алкогольной интоксикации / Е.Ю. Пиголкина, Ю.Е. Морозов, Ю.И. Тарасов // Рос. вестн. перинатол. и педиатрии. 2002. - Т. 47, N 4. - С. 40^16.

47. Прокопьева, В.Д. Молекулярные механизмы влияния этанола и его метаболитов на клеточные мембраны in vitro и in vivo: автореф. дис. . д-ра биол. наук / В.Д. Прокопьева. Томск, 2003. - 46 с.

48. Пронько, П.С. Влияние пирувата, треонина и фосфоэтаноламина на обмен эндогенного ацетальдегида у крыс с токсическим поражением печени / П.С. Пронько и др. // Вопр. мед. Химии. 2002. - Т. 48. - N 3. -С. 278—285.

49. Селевич, М.И. Особенности метаболизма липидов у крыс, предпочтительно потребляющих воду или этанол: автореф. дис. . канд. биол. наук / М.И. Селевич. Л., 1982. - 26 с.

50. Родионов, Ю.В. Фотометрический метод определения этанола / Ю.В. Родионов, О.И. Кеппен, М.В. Сухачева // Прикл. биохимия и микробиол. 2002. - Т. 38, N 4. - С. 459-461.

51. Романенко, JT.B. Полноценность кормления высокопродуктивных коров и методы его контроля / JI.B. Романенко // Зоотехния. 2007. - № 3 . -С. 10-14.

52. Самарцев, В.Н. Влияние этанола на разобщение пальмитиновой кислотой окислительного фосфорилирования в митохондриях печени / В.Н. Самарцев и др. //Биохимия. 2002. - Т. 67, N 11.-С. 1502-1510.

53. Сметании, В.А. Влияние этанола на активность карбоксипептидазы М в гипоталамусе и стриатуме самок крыс /

54. B.А. Сметанин, Ж.С. Бардинова, М.Т. Генгин // Медико-биологические и психолого-педагогические аспекты адаптации и социализации человека. -Волгоград, 2008. Т. 1 - С. 354-356.

55. Степанова, И.П. Биохимические аспекты функционирования системы детоксикации крупного рогатого скота. Монография / И.П. Степанова и др.. Омск, 2008. - С. 58-63.

56. Сторожок, С.А. Изменения физико-химических свойств биологических мембран при развитии толерантности к этанолу /

57. C.А. Сторожок и др. // Вопр. мед. Химии. 2001. - Т. 47, N 2. -С. 189-208.

58. Ткачук, В.А. Клиническая биохимия / В.А. Ткачук и др.. М.: ГЕОТАР-МЕД, 2002. - 360с.

59. Уша, Б.В. Клиническая диагностика внутренних незаразных болезней животных: учебники и учеб. пособия для высш. учебн. заведений / Б.В. Уша, И.М. Беляков, Р.П. Пушкарев. М.: КолосС, 2003. - 487 с.

60. Ушаков, А.С. Обмен кобальта у молодняка крупного рогатого скота при откорме на барде / А.С. Ушаков // Зоотехния. 2007. - № 12. -С. 10-12.

61. Харченко, Н.К. Роль onioifliioi системи в мехашзмах формування алкогольно! залежност1 / Н.К. Харченко // Фчзюл. ж. 2000. - Vol. 46, N 5. -Р. 9-13.

62. Ходос, О.А. Особенности протеолиза в ткани головного мозга крыс при хронической алкогольной интоксикации / О.А. Ходос, Л.Г. Гидранович, М.М. Сачек // Вестн. Витеб. гос. мед. ун-та. 2008. -Т. 7, N 1.-С. 24—31.

63. Хохрина, Н.Т. Изменения активности аминопептидаз в нейронах мозга крыс с длительной алкогольной интоксикацией / Н.Т. Хохрина и др. // 14 Съезд психиатров России. М., 2005. - С. 499-500.

64. Шабанов, П.Д. Дофаминергические системы мозга: участие в эффектах психостимуляторов, кортикостероидов и этанола / П.Д. Шабанов // Мед. акад. ж. 2001. - Т. 1, N 1. - С. 41-57.

65. Шабанов, П.Д. Руководство по наркологии / П.Д. Шабанов. СПб: «Лань», 1992. ~ С. 48.

66. Швайкова, М.Д. Токсикологическая химия / М.Д. Швайкова. -М.: Медицина, 1975. С. 97-99.

67. Ширяева, А.П. Состояние дыхательной цепи митохондрий печени крыс с экспериментальным токсическим гепатитом / А.П. Ширяева и др. // Цитология. 2007. - Т. 49, N 2. - С. 125-132.

68. Akihito, Н. A signal detection approach to the combined effects of work stressors on alcohol consumption / H. Akihito, T. Kimio, N. Koichi // J. Stud. Alcohol. 2001. - Vol. 62. - N 6. - P. 798-805.

69. Aloe, L. Alcohol intake during prenatal life affects neuroimmune mediators and brain neurogenesis / L. Aloe // Ann. 1st. super, sanita. 2006. -Vol. 42.-N l.-P. 17-21.

70. Bhupanapadu, S.S.R. Cell death is associated with reduced base excision repair during chronic alcohol administration in adult rat brain / S.S.R. Bhupanapadu, S. Umakanta, B. Phanithi, Prakash // Neurochem. Res. -2008.-Vol. 33.-N6.-P. 1117-1128.

71. Castro, G.D. Ethanol-induced oxidative stress and acetaldehyde formation in rat mammary tissue: Potential factors involved in alcohol drinking promotion of breast cancer / G.D. Castro et al. // Toxicology. 2006. -Vol. 219. - N 1-3. - P. 208-219.

72. Collins, M.A. Brain and plasma tetrahydroisoquinolines in rats: effects of chronic ethanol intake and diet / M.A. Collins et al. // J. Neurochem. 1990. -V. 55.-P. 1507-1514.

73. Collins, M.A. Stable acetaldehyde adducts with brain proteins / M.A. Collins, N. Ung-Chhun // Alcohol and alcoholism. 1988. - V. 3. - P. 31.

74. Cox, W.M. Motivational structure and alcohol use of university students across four nations / W.M. Cox et al. // J. Stud. Alcohol. 2002. -Vol. 63.-N3.-P. 280-285.

75. Davis, V.E. Augmentation of alkaloid formation from dopamine by alcohol and acetaldehyde in vitro / V.E. Davis, M.J. Walsh, Y. Yamanaka // J. Pharmacol Exp. Ther. 1970. -V. 174. - P. 401-412.

76. Djouma, E. The effect of chronic ethanol consumption and withdrawal on 'мю'-opioid and dopamine Dl. and D[2] receptor density in fawn-hooded rat brain / E. Djouma, A.J. Lawrence // J. Phannacol. and Exp. Ther. 2002. -Vol. 302. - N 2. - P. 561-569.

77. Eriksson, C.J.P. The role of acetaldehyde in the action of alcohol (update 2000) / C.J.P. Eriksson // Alcohol Clin. Exp. Res. 2001. - V. 25, №5.-P. 15-32.

78. Eriksson, C.J.P. Human blood acetaldehyde (update 2000) / C.J.P. Eriksson, T. Fukunaga // Alcohol Alcohol. Suppl. 1993. - V. 2. - P. 9-25.

79. Ferrier, L. The gut microflora is involved in ethanol metabolism and ethanol-induced impairment of the epithelial barrier in rodents / L. Ferrier et al. // Gut. 2005. - Vol. 54. - P. OP-G-317/1.

80. Flanagan, D.E.H. Alcohol consumption alters insulin secretion and cardiac autonomic activity / D.E.H. Flanagan et al. // Eur. J. Clin. Invest. -2002. Vol. 32. - N 3. - P. 187-192.

81. Forn-Frias, C. The possible role of acetaldehyde in the brain damage caused by the chronic consumption of alcohol / C. Forn-Frias, C. Sanchis-Segura // Rev. Neurol. 2003. - V. 37. - P. 485-493.

82. Galindo, R. Alcohol is a point stimulang of immature neuronal networks: Implications for fetal alcohol spectrum disorder / R. Galindo,

83. P.A. Zamudio, C.F. Valenzuela // J. Neurochem. 2005. - Vol. 94. - N 6. -P. 1500-1511.

84. Gemma, S. Individual susceptibility and alcohol effects: Biochemical and genetic aspects / S. Gemma, S. Vichi, E. Testai // Ann. 1st. super, sanita. -2006. Vol. 42. - N 1. - P. 8-16.

85. Gill, K. Enzymatic production of acetaldehyde from ethanol in rat brain tissue / K. Gill et al. // Alcohol Clin. Exp. Res. 1992. - V. 16. -P. 910-915.

86. Hamitouche, S. Ethanol oxidation into acetaldehyde by 16 recombinant human cytochrome P450 isoforms: Role of CYP2C isoforms in human liver microsomes / S. Hamitouche et al. // Toxicol. Lett. 2006. -Vol. 167.-N3.-P. 221-230.

87. Heezoo, Kim. Oxidative damages in the DNA, lipids, and proteins of rats exposed to isofluranes and alcohols / Kim Heezoo et al. // Toxicology. -2006.-Vol. 220. -N 2-3. P. 169-178.

88. Holownia, A. Acetaldehyde cytotoxicity in cultured rat astrocytes / A. Holownia et al. // Brain Res. 1999. - Vol. 833. - P. 202-208.

89. Hopfer, C.J. Common genetic and environmental vulnerability for alcohol and tobacco use in a volunteer sample of older female twins / C.J. Hopfer, M.C. Stailings, J.K. Hewitt // J. Stud. Alcohol. 2001. - Vol. 62. -N6.-P. 717-723.

90. Hu, Yanqiu. Влияние внутриутробного воздействия алкоголя на нейроапоптоз в гиппокампе у крыс / Ни Yanqiu et al. // J. Zhengzhou Univ. Med. Sci.-2007.-Vol. 42.-N5.-P. 851-853.

91. Huang, Chi-Chang. Effects of long-term ethanol consumption on jejunal lipase and disaccharidase activities in male and female rats / Huang Chi-Chang et al. // World J. Gastroenterol. 2005. - Vol. 11. - N 17. -P. 2603-2608.

92. Hunt, W.A. Role of acetaldehyde in the action of ethanol on brain a review / W. A. Hunt//Alcohol.- 1996.-V. 13.-P. 147-151.

93. Jamal, M. In vivo study of salsolinol produced by a high concentration of acetaldehyde in the striatum and nucleus accumbens of free-moving rats / M. Jamal et al. // Alcohol Clin. Exp. Res. 2003. - V. 27. - P. 79-84.

94. Jin, Wu-pi. Связь между апоптозом гепатоцитов, Р450 2Е1 и окислительным стрессом при алкогольной патологии печени у крыс / Jin Wu-pi et al. // Chin. Crit. Care Med. 2007. - Vol. 19. - N 7. -P. 419-421,

95. Kang-Park, Maeng-Hee. Presynaptic 'дельта' opioid receptors regulate ethanol actions in central amygdala/ Maeng-Hee Kang-Park et al. // J. Pharmacol, and Exp. Ther. 2007. - Vol. 320. - N 2. - P. 917-925.

96. Klixgmuller, V. Photometric estimation of Widmark's ethanol determination; evaluation scale / V. Klixgmuller, W. Nuglisch, N. Weyss // Clinica Chimica Acta. 1968. -V. 22, № 3. - P. 317-325.

97. Kostowski, W. Role of cytochrome P450 in the metabolism of ethyl alcohol / W. Kostowski // Pol. J. Pharmacol. 2002. - Vol. 54. - N 5. - P. 532.

98. Lieber, C.S. Alcohol: Its metabolism and interaction with nutrients / C.S. Lieber // Annu. Rev. Nutr. Palo Alto (Calif.). - 2000. - Vol. 20 -P. 395-430.

99. Mashimo, K. Ethanol hyperpolarizes mitochondrial membrane potential and increases mitochondrial fraction in cultured mouse myocardial cells/ K. Mashimo, Y. Ohno // Arch. Toxicol. 2006. - Vol. 80. - N 7. -P.421-428.

100. Michnik, A. DSC study of the association of ethanol with human serum albumin / A. Michnik // J. Therm. Anal, and Calorim. 2007. - Vol. 87. -N1.-P. 91-96.

101. Milotova, M. Changes of hippocampal neurons after perinatal exposure to ethanol / M. Milotova et al. // Physiol. Res. 2008. - Vol. 57. -N2.-P. 275-282.

102. Myers, R.D. Multiple metabolite theory, alcohol drinking and the alcogene / R.D. Myers // Prog. Clin. Biol. Res. 1985. - Vol. 183. -P. 201-220.

103. Nakamura, K. Acetaldehyde adducts in the brain of alcoholics / K. Nakamura et al. // Arch. Toxicol. 2003. - Vol. 77. - P. 591-593.

104. Nakamura, K. Immunohistochemical study on acetaldehyde adducts in alcohol-fed mice / K. Nakamura et al. // Alcohol Clin. Exp. Res. 2000. -Vol. 24.-P. 93-96.

105. Nechifor, M. Chronic ethanol consumption affects the activity of antioxidant enzymes in the rat liver / M. Nechifor et al. // Rom. J. Physiol. -2001.-Vol. 38,-N 1-4.-P. 127-134.

106. Nordskog, B.K. Diurnal gene expression patterns of T-type calcium channels and their modulation by ethanol / B.K. Nordskog, J.A. Hammarback, D.W. Godwin // Neuroscience. 2006. - Vol. 141.-N3.-P. 1365-1373.

107. Piquet, М.Л. Chronic ethanol ingestion increases efficiency of oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria / M.A. Piquet et al. // FEBS Lett. 2000. - Vol. 468. -N 2-3. - P. 239-242.

108. Qi-ying, Jiang. Нейроапоптоз в зрительной коре мышей после пренатального воздействия этанола / Jiang Qi-ying et al. // Acta anat. sin. -2007. Vol. 38. - N 4. - P. 400-404.

109. Quertemont, E. Is ethanol a pro-drag? The role of acetaldehyde in the central effects of ethanol / E. Quertemont, S. Tambour // Trends. Pharmacol. Sci. 2004. - Vol. 25. - P. 130-134.

110. Quertemont, E. The role of acetaldehyde in the neurobehavioral effects of ethanol: a comprehensive review of animal studies / E. Quertemont, S. Tambour, E. Tirelli // Prog. Neurobiol. 2005. - Vol. 75. - P. 247-274.

111. Rintala, J. Evidence of acetaldehyde-protein adducts formation in rat brain after lifelong consumption of ethanol I J. Rintala et al. // Alcohol. 2000. -Vol.35. - P. 458-463.

112. Robin, Marie-Anne. Ethanol increases mitochondrial cytochrome P450 2E1 in mouse liver and rat hepatocytes / Marie-Anne Robin et al. // FEBS Lett. 2005. - Vol. 579. - N 30. - P. 6895-6902.

113. Sabol, D.A. Coagulation protein function VII. Diametric effects of acetaldehyde on factor VII and factor IX function / D.A. Sabol et al. // Dig. Diseases and Sci. 1999. - Vol. 44. -N 12. - P. 2564-2567.

114. Saito, M. Ethanol alters lipid profiles and phosphorylation status of AMP-activated protein kinase in the neonatal mouse brain / M. Saito et al. //J. Neurochem.-2007.-Vol. 103.-N3.-P. 1208-1218.

115. Sillaber, I. Enhanced and delayed stress-induced alcohol drinking in mice lacking functional CRH1 receptors /1. Sillaber et al. // Science. 2002. -Vol. 296. - N 5569. - P. 931-933.

116. Singer, M.V. Alkoholassoziierte Organschaden. Befunde in der Inneren Medizin, Neurologie und Geburtshilfe/Neonatologie / M.V. Singer, S. Teyssen // Dtsch. Arztebl. 2001. - Vol. 98. - N 33. - P. 1702-1713.

117. Sippel, H.W. The acetaldehyde content in rat brain during ethanol metabolism / H.W. Sippel // J. Neurochem. 1974. - Vol. 23. - P. 451^152.

118. Sjoquist, B. The effects of alcoholism on salsolinol and biogenic amines in human brain / B. Sjoquist, E. Perdahl, B. Winblad // Drug Alcohol. Depend.- 1983.-Vol. 12.-P. 15-23.

119. Smith, B.R. Catalase and production of brain acetaldehyde: a possible mediator of the psychopharmacological effects of ethanol / B.R. Smith, C.G. Aragon, Z. Amit // Addiction Biology. 1997. - Vol. 2. - P. 277-289.

120. Steinberg, J.J. The formation and measurement of DNA neuroadduction in alcoholism. Case report / J.J. Steinberg, G.W. Oliver, A. Cajigas // Am. J. Forensic Med. Pathol. 1997. - Vol. 18. - P. 84-91.

121. Tagliaro, F. Chromatographic methods for blood alcohol determination (Review) / F. Tagliaro et al. // Journal of Chromatography: Biomedical Applications. 1992. - Vol. 580, № 1-2. - P. 161-190.

122. Takeuchi, M. Neurotoxicity of acetaldehyde-derived advanced glycation end products for cultured cortical neurons / M. Takeuchi et al. // J. Neuropathol. Exp. Neurol. 2003. - Vol. 62. - P. 486-496.

123. Thiele, G.M. Acetaldehyde and malondialdehyde protein adducts as markers for alcohol liver disease / G.M. Thiele et al.. The Board of Regents of the Univ. of Nebraska - N 09/318080; Заявл. 25.05.99; опубл. 09.11.04.

124. Wagner, E.F. Racial/ethnic and gender differences in the incidence and onset age of DSM-1V alcohol use disorder symptoms among adolescents / E.F. Wagner, D.A. Lloyd, A.G. Gil // J. Stud. Alcohol. 2002. - Vol. 63. -N5.-P. 609-619.

125. Wartburg, J. Biology of disease. Alcoholism and aldehydism: new biomedical concepts / J. Wartburg, R. Buhler // Lab. Invest. 1984. - № 1. -P. 5-15.

126. Worrall, S. Protein adducts in type I and type II fibre predominant muscles of the ethanol-fed rat: Preferential localisation in the sarcolemmal and subsarcolemmal region / S. Worrall et al. // Eur. J. Clin. Invest. 2001. -Vol. 31.-N8.-P. 723-730.

127. Xiao, Zhe-man. Влияние этанола на вольтаж-зависимые и ионофорные кальциевые каналы в культуре клеток верхнего шейного ганглия / Xiao Zhe-man et al. // J. Wuhan Univ. Natur. Sci. Ed. 2005. -Vol. 51. -N 6. -P. 762-766.

128. Xu, J. Ethanol impairs insulin-stimulated neuronal survival in the developing brain. Role of PTEN phosphatase / J. Xu et al. // J. Biol. Chem. -2003. Vol. 278. - N 29. - P. 26929-26937.

129. Zhiming, W. Alterations in hippoeampal phospholipid profile by prenatal exposure to ethanol / W. Zhiming, K. Hee-Yong // J. Neurochem. -2004. Vol. 89. - N 6. - P. 1368-1377.

130. Zimatkin, S.M. Ethanol metabolism in brain / S.M. Zimatkin, R. A. Deitrich // Addiction Biology. 1997. - Vol. 2. - P. 387-399.

131. Zimatkin, S.M. Distribution and kinetics of ethanol metabolism in rat brain / S.M. Zimatkin, A.V. Liopo, R.A. Deitrich // Alcohol Clin. Exp. Res. -1998.-Vol. 22.-P. 1623-1627.