Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СО2-газообмен и кинетические параметры рибулозобисфосфаткарбоксилазы фотосинтезирующего листа тритикале

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "СО2-газообмен и кинетические параметры рибулозобисфосфаткарбоксилазы фотосинтезирующего листа тритикале"

РГЗ 03

и 1 I. •'■> РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИИ имени К.А.ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

ЦЮРЮПА Сергей Николаевич

СОд-ГА300БМЕН И КИНЕТИЧЕСЮЕ ПАРАМЕТРЫ Р»БУЛОЗОБИСФОС-ШКАРБОКСИЛАЗЫ ФОТОСЖТЕЗИРУКЩГО ЛСТА ТРИТИОУЕ

•(03.00.12 - физиология растений)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 1ЭЭЗ

Работа выполнена в группе кинетики фотосинтеза Института почвоведения и фотосинтеза Российской Академии Наук.

доктор биологических наук, профессор Романова А.К.

доктор биологических наук Шульгин И.А., кандидат биологических наук Чмора С.Н.

Московская ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени сельскохозяйственная академия имени К.А.Тимирязева.

Защита состоится "¿3 " марта 1993 г. на заседании Специализированного совета по присуждению ученой степени кандидата биологических наук К.002.45.01 при Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, Ботаническая ул., 35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН.

Автореферат разослан 1993 г.

Научный руководитель: Официальные опоненты: Ведущая организация:

Л а

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

/Л.И.Сергеева/

Общая характеристика работы

Актуальность теш. В решении глобальных проблем стоящих перед человечеством (продовольственной, энергетической и в последнее время экологической) важнейшее место занимает познание фотосинтеза растений - основного процесса, обеспечивающего существование жизни на Земле. Исходя из обобщенного уравнения фотосинтеза, интенсивность этого процесса мокно определять по потоку С0а в лист. Ранее были развиты методы регистрации СО,-газообмена, которые соотносились главным образом с продуктивностью растений и привели к созданию основ теории фотосинтетической продуктивности растений, сформулированных А.А.Ничипоровичем. Эти работы несомненно представляют интерес, однако, носят эмпирический характер и не раскрывают фундаментальных механизмов регуляции СО,-газооОмена. Структура и функции фотосинтетического аппарата интенсивно изучаются на фрагментах организма (хлоропласта, белки) главным образом биохимическими методами. Существуют принципиальные трудности построения из этих данных целостной системы функционирования процессов фотосинтеза и дыхания в листе в силу огро.чного количества различных рэгуляторных связей. Как следствие, возникает вопрос адекватности получаемых in vitro биохимических параметров системы действительным значениям tn vivo. Реальным способом проникновения в суть функционирования процесса фотосинтеза является экспериментальное исследование закономерностей его протекания во времени на целых листьях (исследование кинетики фотосинтеза), что ранее было успешно продемонстрировано /Лайск, 1977; 1991/. Мощным инструментом интерпретации кинетических исследований фотосинтеза, является математическое моделирование процесса фотосинтеза и дыхания. Такие модели нуждаются в со-вершенствованио на базе современных знаний и ведут к созданию общей теории фотосинтеза.

Объектом экспериментального исследования в работе служила культура тритикале. Известная низкая экологическая приспосабливаемость этого гибрида требовала детального изучения влияния отдельных экологических факторов на его продукционный процесс /Сулима, 1976/.

Цель и задачи исследования.

Цель данной работы - экспериментальное исследование С03-газооб-

Сснсращения: ИВК - измерительно-вычислительный комплекс; ИКГА - инфракрасный газоанализатор; Ж - листовая камера; РБФ - рибулозо-бисфосфат; РИК - рибулозобисфосфаткарбоксилаза. Обозначение некоторых величин: с - концентрация С0а в хлоропласте; Р - скорость реакции карбоксилирования; Рп - скорость СО^-газообмена; R - концентрация РБФ в хлоропласте; Rp - скорость фотодахания; Rd - скорость темнового дыхания. Величина"- значение при выключении света.

мена и кинетических характеристик РБФК фотосинтезирующего листа тритикале. В связи с этим были поставлены задачи:

1. Разработать методические подходы, позволяющие определять кинетические параметры РБФК in vivo газометрическим методом.

2. Создать газометрическую экспериментальную установку для реализации различных методических подходов исследования кинетики СО,-газообмена листа и кинетических параметров РБФК.

3. Создать математическую модель С03-газообмена листа С,-растения, пригодную для анализа результатов кинетических исследований процессов фотосинтеза и дыхания.

4. Определить кинетические параметры РБФК листа тритикале tn vivo.

5. Изучить влияние климатических условий выращивания растений тритикале на кинетические параметры С0,-газообмена листа и кинетические параметры РБФК.

Научная новизна.

В диссертационной работе предложены и апробированы методы исследования нестационарного режима СО,-газообмена листа, которые открывают новые экспериментальные возможности: а) усовершенствование измерительной аппаратуры и математическое моделирование переходных процессов в измерительном комплексе позволило проводить количественные измерения нестационарного СОа-газообмена листа; б) такие измерения в переходе свет-темнота и развитая в работе модель послесветового газообмена листа стали основой метода определения внутриклеточных параметров нестационарного СОа-газообмена фотосинтезирующего листа (таких как составляющие потоки, концентрации и сопротивления); в) численная оценка последних величин дала возможность экспериментального исследования кинетики реакции карбоксили-рования tn vivo. Такая информация для листа, фотосинтезирующего в естественных условиях, ранее была практически недоступна.

В диссертационной работе впервые показано, что существует отличная от нуля величина сопротивления растворения С0а (переноса через границу газ-жидкость) в мезофилльных клетках листа, и устранена распространенная ошибка расчета концентрации растворенной в листе С0а, связанная с использованием закона Генри (равновесной растворимости газов), существенно завышающем расчетную величину этой концентрации. У листьев тритикале получено приблизительное равенство диффузионного сопротивления транспорта С0а в жидкой фазе и сопротивления карбоксилирования. Тем самым экспериментально установлена неправомерность в общем случае гипотезы о доминировании последнего в суммарном сопротивлении мезофилла /Лайск, 1977/.

В работе проведены комплексные исследования процесса фотосинтеза и дыхания тритикале при различных климатических режимах выращи-

?ания растений. Впервые получена информация о величинах скорости Х)2-газообмена и его составляющих, о распределении концентрации Ю2 в фотосинтезирующем листе, о сопротивлениях на пути транспорта в лист, о кинетических характеристиках РБФК тритикале, об уг-юкислотной, световой и температурной зависимости С02-газообмена да культуры тритикале при различных климатических условиях выра-давания растений. Впервые исследована изменчивость кинетических :арактеристик РБФК под влиянием факторов выращивания растений.

Теоретическая и практическая ценность работы.

Созданные в работе методические разработки могут применяться (ля широкого круга задач по исследованию кинетики процессов фото-:интеза и дыхания высших наземных растений. Полученные в работе юзультаты расширяют современные представления о транспорте С02 в ютосинтезирукхцем листе, о адаптивной изменчивости in vivo кинети-еских параметров РЕФК. Результаты комплексных исследований про-.есса фотосинтеза и дыхания тритикале при различных климатических ежимах выращивания растений могут быть использованы при разработ-е модели продукционного процесса тритикале.

Апробация работы: Результаты исследований по теме диссертац»-. олокены и обсуждены на: IV Конференции молодых ученых Института очвоведения и фотосинтеза АН СССР (Пущино, 1989); Международной онференции "Итоги и перспективы энзимологических исследований ме-аболизма углерода при фотосинтезе" (Душанбе, 1991); Межреспубли-анской конференции молодых ученых "Актуальные проблемы физиологии астений и генетики" (Киев, 1992); научном семинаре отдела фото-интеза Института почвоведения и фотосинтеза РАН.

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 12 работ.

Структура диссертации: Работа состоит из введения, 4 глав (в эторых излагаются литературный обзор, методы и результаты иссле-эваний), обсуждения, заключения и выводов. Список цитируемой ли-зратуры включает 192 источника, из которых 92 на иностранных язы-ах. Работа изложена на 181 машинописных страницах, включает 27 лсунков и 15 таблиц.

Материа/ы и метод* исследований

Методика выращивания растений. Исследовали растения тритикале ггiticaie) сорта "Немига-2". Растения выращивали в вегетационных эсудах в фитотроне, создавая стандартные условия минерального и >дного питания /Журбицкий, 1968/. Продолжительность фотопериода -: час. Исследования проведены при четырех сочетаниях светового и ¡мпературного режима выращивания растений. Выращивание проводили ¡я двух серий опытов, отличающихся постановкой задач. Поэтому ве-гошы температурного и светового режимов выращивания растений че-

сколько отличаются и приведены в табл.1 (температурный вариант выращивания 1-ой серии помечен *.

Таблица 1. Клииатаческиа реаимы выращивания растения тритакала.

Варианты выращивания Паранеары нкшнсп среда

Освааенность листьев Вг/н* ФАР Температура воздуха, с (день/ночь) Влазносяъ воздуха

сг* От* <я* сг* 150 ± 15 150 ± 15 70 ± Э 70 ± 3 28/21 ± 1 22/17 ± 1 28/21 ± 1 22/17 ± 1 45 ± 5 75 ± 5 45 ± 5 75 ± 5

ст От СТ сг 160 ± 15 160 ± 15 70 ± 3 70 ± 3 35/25 ± 1 15/12 ± 1 35/23 ± 1 15/12 ± 1 45 ± 5 75 ± 5 45 ± 5 75 ± 5

Мобильная газолещмчссная ус- Рис.х. йох-схеиа автоматизированной

тановка для исследования С03-га- газометрической установки для иссле-

чооблтп лигтьря тгтрнчЛ мт«- Дования кинетики С0а и Н20-газооблеш зооолена листьев растений харак- листьев растений с возио*ность» реги-

теризовалась следующими особенно- "Рации быстропротекаицнх процессов: стями: дифференциальное включение ж-

ИКГА; стабилизация концентрации в -вшорашватель; РМ -расходомер. С02 в подводимом к листу воздухе; применение ИВК на базе программируемого калькулятора "Электроника МК-64"; применение прямоточног Ж размером 72x10 мм. На установке регистрировали скорость видимого фотосинтеза, "темнового" дыхания и суточную динамику С0,-газо-обмена листьев непосредственно в условиях выращивания растений.

Автолапизированиая газолеприческая установка для исследование кинетики СО,- и Н20-газооблепа листьев растений изображена нг рис.1. Газосмесительный динамический блок установки позволяет составлять газовые смеси различного содержания гг2, о2, со2 и н2о. Поддержание физиологических режимов растения в установке осуществляет климатокамера. Схема газовых переключений обеспечивает градуировку психрометра и ИКГА непосредственно перед измерением. Исход* из задачи данной экспериментальной серии, ИКГА± настроен на работ! с концентрациями С02 до 1500 ррт (для исследования углекислотно! зависимости в диапазоне 0*1500 ррт), а ЖГА3 настроен на работу < концентрациями до 340 ррт (для исследований начального участка уг-лекислотной кривой). Использовали термостатируемую ЛК с вентилятором; включаемая в газометрическую систему площадь листа - 12 см2 Прилистовое сопротивление для паров воды - 0.13 с/см. Температур: листа с точностью ±0.07°С измеряли термопарами. ИВК выполнен ш базе микро-ЭВМ БК-ООЮ с линией связи с РО АТ. Метрологические па рг£Метры: точность измерения концентрации С02 составляет ±2 ррт точность измерения концентрации паров вода ±0.3% относительно]

влажности; абсолютная ошибка измерения скорости С02-газообмена листа ±0.2 мкмоль м~гс"1, транспирации ±0.02 кмоль и~г с"1.

Исследование сбетлобыл:, углекислотных и тедпераяурмыт зависимостей С03-газооблеш листа проводили, варьируя: концентрацию СО, в подводимом к листу воздухе в пределах 00.2%-, интенсивность падающей на лист ФАР в пределах 10+500 Вт/мг; температуру исследуемого листа, заключенного в термостатируемую Ж, в пределах 1Ен-45°С. Количественный анализ характеристик углекислотной и световой кривой каждой в отдельности проводили с использованием нерегулярной гиперболы /Marshall & Biscoe, 1980; Гейтс и др., 1382/.

Установка и летодит Зля исследования быст.рошленжщигся параметров С03-газооблена листа. Применены два известных подхода в преодолении инерционности аппаратуры: аппаратурный (уменьшение постоянной времени измерительной аппаратуры) и вычислительный (расчет нестационарных параметров с использованием модели динамических процессов в газометрической системе).

Быстродействующий измерительный комплекс для исследования быст-роизменявщегося СО,-газообмена листа создан на базе автоматизированной газометрической установки (см. выше). При этом установка дополнена ИКГА СО, быстрого ответа (рис.1, ItKrAj.), в который при регистрации быстропротекащих процессов газообмена непосредственно поступает газ, выходящий из ЛК. Для регистрации нестационарного СО,-газообмена в переходе свет-темнота использовали ЛК, окно которой для освещения листа имеет светонепроницаемую крышку, меняющую положение под управлением ИВК. ИКГА быстрого ответа имел кюветы длиной 101 юл и объемом 25.7 см3. Рабочий объем ЛК 4.8 см3. Усилитель ИКГА быстрого ответа модернизирован с целью уменьшения его инерционности. Паразитную чувствительность ИКГА быстрого ответа к парам воды устраняли фильтрацией ИК-излучения интерференционными фильтрами (4.27 мкм, завод "Арсенал" г.Киев).

Метрологические параметры быстродействующего измерительного комплекса в стационарном режиме уступают параметрам, характеризующим базовую газсметрическую установку. В стационарных условиях предпочтительно работать в базовой компоновке, в нестационарных - в быстродействующей (переключение осуществляет К3, рис.1).

На рис.2 представлены переходные характеристики быстродействующего измерительного комплекса. Время установления 95% уровня сигнала измерительного комплекса в целом составляет 2.2 с, а ИКГА быстрого ответа - 1.9 с, т.е. ИКГА вносит решающий вклад в инерционность измерительного комплекса. На рис.3 представлен ответ ИКГА на импульс концентрации СО, в ЛК. Видно, что импульс с периодом более 5 с передается без существенного изменения амплитуды, а им-

пульс с периодом I с подвергается существенному сглаживанию. Поэтому для процессов, характеризующихся временем изменения более 2.2 с, в принципе, допустимо рассчитывать концентрации (потоки) по стационарным формулам, а для процессов, характеризующихся меньшим временем, при расчетах необходима корректировка на инерционность.

Ответ ИНГА Ответ ИКГА_____

1 0.8

2 3 Врекя

РИС• 2.Переходные характеристики: 1- быстродействующего измерительного комплекса в ответ на изменение концентрации С03 на входе Ж в 1000 ррш; 2 - быстродействующего ИКГА в ответ на аналогичное изменение концентрации С02 на его входе; 3-усилителя в ответ на иммита-цию аналогичного изменения концентрации С0а.

ЭД1С.З. Ответ быстродействующего измерительного комплекса на прямоугольный импульс концентрации С02 0-» 1000ррт длительностью: 1с (1 ); 5с (2 ) и Юс (3).

Метрологические характеристики быстродействующего измерительно го комплекса при исследования нестационарного газообмена с характерным временем 10 с: точность измерения концентрации С02 составляет ~3 ррт; ошибка измерения скорости С02-газообмена листа ~Ю%.

Нестационарная лодель для излерения С03-газоо0лена в переходных процессах. Известны два подхода в математическом анализе нестационарных измерений газообмена: первый описывает процессы газообмена в интегральной /Palovsky & Hak,1988,1989/, второй в дифференциальной форме /Peterson,1983/. Процессы газообмена, проходящие в измерительном комплексе в нестационарных условиях, довольно сложны, и интегральная форма анализа является результатом определенных упрощающих допущений. При этом существенно ускоряется процедура расчета. В нестационарной модели для измерения СОа-газообмена в переходных процессах нами использованы оба вида вычислительных формул, причем дифференциальная форма использована как уточняющая. Отличительной особенностью математического анализа нестационарного газообмена в этой работе является учет влияния инерционности усилителя ИКГА. Переходные процессы усилителя (рис.2, кривая 3) удовлетворительно описываются выражением:

U(t)=U' + (U(0)- U') exp(-j|) (I),

где Та - постоянная времени. Для усилителя ИКГА быстрого ответа 6

та=0.23 с, у обычного усилителя ЖГА "1п1Гга1у(.-4" Т.=0.87 с.

На рис.4 приведен пример, иллюстрирующий возможности быстродействующего комплекса и вычислительного метода. Как видим, величина поправки на нестационарность существенна.

Сопротивление растворения СОр. Измерение суммарного сопротивления в газовой фазе, как и оценка отдельных слагаемых, не вызывает принципиальных трудностей /Егоров, 1989/. В отношении элементарных сопротивлений транспорту риС.4.диамина С02-газообмена лис-СО, В мезофилльной клетке В нас- та в переходе свет-темнота: покаэа-

ние ИКГА (1): скорость газообмена, тоящее время нет Общепризнанных ^(.„„„„„¡ц, по стационарной форму-

методов их измерения. Эксперимен- ле кг) и по модели (3). тально измерима лишь их суммарная величина /Лайск,1977/. Рассматривая вопрос о доле в этом сопротивлении сопротивления карбоксили-рования гх и сопротивления транспорта С02 в жидкой фазе г , исследователи не принимают в расчет сопротивление растворения С02 гй -сопротивление перехода С0а через границу фаз газ-жидкость. Для растворов щелочи, являющихся упрощенным аналогом ассимилирующего листа, нами экспериментально измерена величина сопротивления растворения. Экстраполированное к чистой воде значение этого сопротивления, равно 0.048 ±0.008 с/см. На основе этого (с учетом анатомических особенностей листа мезофита: площадь поверхности мезофилль-них клеток обычно в 20 раз превосходит площадь листа /ЯоЬе1,1973/, а площадь жидкой фазы на поверхности клетки составляет -1% площади поверхности мезофилльной клетки /Поляков,Карпушкин,1981/) проведена оценка величины гй в фотосинтезирующем листе мезофитного растения и получено значение 0.24 с/см. Отмечено увеличение величины гл с уменьшением активности воды при увеличении концентрации соли или щелочи в растворе. Очевидное следствие наличия в фотосинтезирущем листе сопротивления растворения - существенное завышение при расчете с использованием закона Генри концентрации С02 в поверхностном слое жидкости (с ). Расчет следует производить по формуле:

ся=р С,-(3 Рп г/ (2),

где р - коэффициент растворения С02. В естественных условиях ошибка составляет 7% и 20%, соответственно для типичного С3- и С„-рас-гения. Сама практика применения закона Генри в фотосинтезирующем листе является некорректной, так как требует условий динамического

Ответ ИКГА Скорость газообмена ив мкиоль С03 и~2с~1

380 370 ЗвО

350

10 20

Время

30

с

равновесия, то есть отсутствия видимого С02-газообмена.

Модель фотосинтеза и оихания в переходе свет-телнста создана для корректного описания процесса С02-газообмена фотосинтезирующе-го листа в переходе свет-темнота и отличается от ранее известных моделей некоторыми принципиальными особенностями. Это прежде всего - уравнение для скорости реакции карбоксилирования, учитывающее механизм функционирования РБФК; учет эффекта реассимиляции С02; учет сопротивления растворения С02; описание С02-газоо0мена листа в первые минуты перехода свет-темнота. Модель С02-газообмена основана на следующих допущениях: движение С02 в листе подчинено законам диффузии (включая и облегченную диффузию /Семененко и др., 1985/); поглощение С02 проходит только в строме хлоропластов в реакции, катализируемой РБФК; фотодыхание представлено гликолатным метаболизмом (в описании динамики фотодыхания при переходе свет-темнота пренебрегаем менее значимым. декарбоксилированием С3- и С„-кислот /Кээрберг, 1989/), и гликолат синтезируется только в ок-сигеназной реакции РБФК (пренебрегаем синтезом РБФ в транскетолаз-ной реакции /Кээрберг, 1989/); диффузионное сопротивление транспорту С02 между митохондриями и оболочкой хлоропластов принимается равным нулю (как правило, близко расположены друг к другу /Кумбс, 1989/); а сопротивление через оболочку хлоропласта г =0.1 с/см (теоретическая оценка /Nobel, 1973/). Характер кинетики реакции карбоксилирования зависит от количественных соотношений фермента с субстратами /Farquhar, 1980/. Концентрацию С02 в хлоропласте легко поднять до насыщающей, так что скорость реакции карбоксилирования описывается кинетикой Михаэлиса по С02. На концентрацию РБФ в хлоропласте можно воздействовать посредством света, под действием которого вырабатываются энергетические кофакторы, генерирующие РБФ. Однако, таким опосредованным влиянием концентрацию РБФ нельзя сделать сколь угодно большой. Если концентрация РБФ превышает концентрацию каталитических центров РБФК, то скорость реакции карбоксилирования описывается выражением /Farquhar, 1979/

p=v° -5- -м- (3),

ш С+К Rí+K* с г

где - максимальная скорость карбоксилирования, Ко - константа Михаэлиса для С02, Rf - концентрация свободной РБФ, - эффективная константа Михаэлиса для РБФ. То есть проявляет насыщение по РБФ. При высоких концентрациях каталитических центров РБФК (обычных iп vivo), превышающих концентрацию РБФ, Р пропорциональна R. В этом случае при анализе кинетики реакции карбоксилирования по С02 удобно оперировать величиной скорости реакции, приведенной к единичному уровню РБФ. Такая величина ранее введена /Laisk et al.,

1984/ и названа удельная скорость карбоксилирования на единицу ассимиляционного заряда (Ао), е=|0». в настоящей работе эта величина названа эффективностью карбоксилирования по РБФ. При этом,

E = EmOiIC <4)'

с

где Е - максимальная эффективность карбоксилирования по РБФ.

Поведение в переходе свет-темнота потоков, составляющих СО,-га-зооСмен листа, различно. Установлено, что значительного дополнительного синтеза РБФ в темноте за счет запаса энергетических кофакторов, образовавшихся на свету, не происходит /Вийль и др., 1986/. Таким образом, после выключения света происходит лишь потребление фонда РБФ, имеющегося в фотосинтезирующем листе в момент затенения,- в карбоксилирущей и оксигенирующей реакции РБФК. В модели, постулируется кинетика первого порядка по РБФ реакций карбоксилирования и оксигенирования РБФ. Фонд (концентрация) РБФ в переходе свет-темнота, следовательно, изменяется по показательному закону, что подтверждено прямыми измерениями /Laisk et ai., 1984/. Явный вид функции P(t) в переходе задается ур.З. Динамику скорости тем-нового дыхания в переходе свет-темнота описывали линейной функцией, а фотодахания простой показательной функцией, что справедливо при наличии "узкого" места в цепи реакций фотодыхательного метаболизма углерода, причем реакции первого порядка.

Полагали, что в переходе свет-темнота лишь сопротивление карбоксилирования гх=р претерпевает существенные изменения во времени. СО,-газообмен листа в первые послесветовые минуты задается выражением, учитывающим эффект реассимиляции (с - концентрация СО, над листом; rt - суммарное сопротивление транспорта СО, в лист): с (t) г (t)+r

рп<*> = IVO*Rd<t>] ^ТТГ (5)'

Методы определения кинетических паралетров СО^-газооблена листа (концентрации, составляющие потоки, сопротивления) в газовой фазе не отличаются от общепринятых /Лайск, 1977/. Внутриклеточные кинетические параметры оценивали из совокупности экспериментальных данных, используя модель фотосинтеза и дыхания листа. Это, во-первых, стационарное значение СО,- и Н,0-газообмена, температуры листа, а также концентраций СО, и паров воды в Ж. Во-вторых, участок моментальной РСа-кривой для концентраций СО, 50 и юо ррт, из которого рассчитывали /Лайск,1977/ видимое дыхание на свету и суммарное сопротивление потоку СО, в лист. И, наконец, динамика СО,-газообмена листа в первые 100 с после выключения света, которая способна, благодаря быстрому прекращению ассимиляции СО, после выключения света, дать численную оценку величины истинного дыхания на свету. Проявляющийся эффект реассимиляции СО,, дает оценку ве-

личины сопротивления карбоксилирования и скорости поглощения С02 хлоропластами, а следовательно, концентрации С02 в хлоропласте и диффузионного сопротивления транспорту С02 в жидкой фазе мезофил-льной клетки. В действительности, проводили не последовательный расчет, а решали оптимизационную задачу поиска модельных параметров системы, динамические характеристики которых обеспечивают совпадение экспериментальной и модельной кривой ответа газоанализатора в переходе свет-темнота. Экспериментальная процедура обеспечивает уменьшение числа неизвестных параметров модели до 3 и тем самым увеличивает достоверность решения оптимизационной задачи.

Определение концентрации РБФ в хлоропласте основано на методике /Вийль и др., 1986/. Однако, оценку фонда РБФ в хлоропласте ранее обычно проводили при отсутствии 0г или при низкой концентрации 0£ /Laisk et al., 1984/. При этом скорость оксигеназной реакции РБФК (V ) в значительной степени подавлена, так что учитывали расход РБФ только в реакции карбоксилирования РБФ. В нормальных условиях жизнедеятельности листа одновременно с реакцией карбоксилирования идет реакция оксигенирования РБФ, и для вычисления фонда РБФ необходимо знать количественные характеристики скорости этой реакции. Стационарную величину Vq можно оценить по скорости выделения С02 в процессе фотодыхания, учитывая стехиометрическое соотношение между поглощением 02 в этой реакции и выделением С02 в гликолатном цикле: V s&R° /Farquhar 8с von Caemmerer, 1982/. Учитывая постоянство о р

в переходе специфичности РБФК /Расулов, 1991/, в присутствии 02

фонд РБФ в хлоропласте в момент выключения света: 00 00 V со

Ао°= £(P+Vo) dt = ¿О+р2)? dt = /( 1+2R°/P°)P dt (6).

Концентрацию РБФ в хлоропласте R=Ao°/(Vs n) рассчитывали с использованием анатомических характеристик листа: удельного объема стро-мы хлоропласта Vs=50 мкл/(мг Хл) и поверхностной плотности хлорофилла N=600 (мг Хл)/м2 /Чайка и др., 1991/.

Методика исследования кинетических кривых РЕФК. Лист адаптировали к заданным условиям среды, то есть к текущей освещенности листа (~4 мин) и концентрации С02 над листом (-25 мин), контролируя при этом скорости С02- и Н20-газообмена листа, которые выходили на стационар. Проводили процедуру измерения кинетических параметров С02-газообмена листа, описанную выше, при сочетании концентрации С02 в подводимом к листу воздухе {340,200,100,50,0,340,500, 700,1000,1500} ррш с освещенностью листа 400 Вт/мг ФАР и далее 1500 ррш с {400,250,140,87,63,44,23) Вт/мг ФАР. То есть В условиях наибольшего проявления каждого фактора. Таким образом, достигали достаточно полного экспериментального описания функции P(C,R), так

как варьируемые величины эффективно влияют на с и R.

Расчет кинетических параметров С02-газообмена и концентрации РБФ в фотосинтезирующем листе позволяет корректно регистрировать кинетические кривые РБФК tп vivo. Выше приведена процедура численной оценки величин Pi,ci и R¿, описывающих функцию P(C,R) в i-ой точке. Проиллюстрируем расчет параметров нестационарного С02-газо-обмена листа с использованием модели. На рис.5 представлена динамика показаний ИКГА при измерении С02-газообмена в переходе свет-темнота листа тритикале варианта СТ и динамика'модельного ответа ИКГА (результат решения оптимизационной задачи). Измерения проведены при температуре листа 25'С, интенсивности света 300 Вт/мг ФАР, влажности воздуха в ЛК 68%, концентрации С02 в ЛК 296 ррт. В этих условиях стационарные значения Рп=19.0 мкмоль м~гс~1, rt=5.2 с/см, сопротивление газовой фазы 1.7 с/см. На рис.6 представлены соответствующие этому приближению характеристики модели: динамики суммарной скорости С02-газообмена и составляющих потоков. Приведем также расчетные величины некоторых параметров С02-газообмена на момент выключения света: р=27.8, поток С02 в лист - 22.7, реассимиляция - 5.1, Rd=0.6, Rp=8.2 (все потоки в мкмоль м~2с"1), диффузионное сопротивление транспорта в жидкой фазе 1.3 с/см, сопротивление карбоксилирования 2.1 с/см; с=5.6 мкМ и R=7.0 мМ.

Ответ газоанализатора СОг

Скорость потока СОг

» -1

20

40 60

Время

ВО

100

Время

РИС.6. Динамика скоростей потоков, составляющих суммарный С02-газооб-мен: Н1» - видимое дыхание на свету (см. список сокращений).

РИС.5. Динамика ответа газоанализатора при исследовании С02-газо-обмена листа в переходе свет-темнота : 1 -эксперимент, 2 - модель.

Численная оценка кинетических характеристик РБ$К. Искомые пара метры РБФК - параметры аналитического представления функциональной зависимости Их численную оценку проводили методом наи-

меньших квадратов, используя системы статистической обработки графиков statgraphi.ce и ЕпгНиег. Для этого в нелинейном регрессионном анализе использовали ур.З или ур.4 (в случае лимитирования реакции карбоксилирования уровнем РБФ). Заметим, что выравнивание

с

зависимости Р(о,й), с использованием преобразования Лайнуивера-Берка (обратные величины), является полезным. Однако, полученные для линеаризованного выражения параметры могут служить лишь первым приближением и требуют дальнейшего уточнения /Румшинский, 1971/.

Характеристики РБФК Iп 1>«го измерены для частично очищенных на колонке с сефадексом 075 препаратов по методике /Романова, 1980/.

ВЛШЕ КЛИМАТИЧЕСКИХ УСЛСШ1 ВЬРА^ЗАНИ НА

со2-газообмен лстьев тршкале

Результаты измерения средней скорости фотосинтеза листьев тритикале в условиях выращивания для различных фаз онтогенеза представлены в табл.2. Достоверного различия скорости С02-газообмена у температурных вариантов "Т*" и "т*" не обнаружено в обоих условиях освещенности. С изме-

Тайлш» 2. Интенсивность ОСЬ-газообмена листьев тритикале для климатических вари-

ашов шращшания растений (ккмоль ц-^с-1).

«аза. онтогенеза Бар!!анг шршциаакия

сг» ОТ* СГ» сг*

Второй лист Третий лист Ллагсвий лист 17.2+1.0 17.011.0 18.411.3 15.811.0 16.012.1 16.211.0 8.110.9 7.5+0.9 7.710.0 9.210.8

нением светового режима выращивания фотосинтетический С02-га-зообмен менялся практически пропорционально. Характер температурных кривых фотосинтетического С03-газообмена исследуемых растений зависел от условий тестирования.Лри концентрации С0Х 300 ррш в исследуемом диапазоне 1Б+40°С не наблюдали резко выраженного температурного оптимума. Полученные закономерности поведения световых, углекислотных и температурных зависимостей 002-газообмена листьев тритикале не отличались от известных для других С3-расте-ний. Количественная оценка параметров углекислотной и световой кривых на примере второй серии опытов (большая разница температур) представлена в табл.3. Начальный наклон углекислотной кривой фотосинтеза, отражающий, в частности, эффективность процесса карбокси-лирования, практически не зависел от температурного варианта выращивания в световом варианте "С". Однако, в световом варианте "с" и наклон, и плато углекислотной кривой падают (особенно существенно в тепловом варианте выращивания "Т"). Кривизна всех углекислотных кривых не зависела от варианта выращивания тритикале. На плато и

Таблица. 3. Параметры аппроксимации углекислотой и свегговой кривой Фотосикгеза листа, тритикале нерегулярной гиперболой для различных вариантов выращивания.

Вариант выращивания Параметры углекислотной кривой Параметр« световой кривой

Наклон ниоль/ма/с/ррш Плато гашоль/и2/с КриЕиана Наклон даоль/Дх Плато мкмоль/м2/с Кривизна

СГ СГ сТ сг 79 ± 5 78 ± 6 26 ± 1 68+6 39.7 ±3.9 52.8 ±3.0 18.2 ±1.3 33.9 +4.7 0.95+0.03 0.92+0.07 0.98±0.01 0.98+0.01 165 ± 18 280 ± 38 157 1 17 193 + 18 44.0 ±4.8 52.7 ±2.4 18.7 ±0.4 34.7 ±6.2 0.89±0.04 0.9110.03 0.8710.07 0.9010.04

начальный наклон световой кривой (отражающий эффективность первичных процессов фотосинтеза) в значительной мере' оказали воздействие световые условия выращивания растений, причем угол наклона больше, а плато существенно выше в световом варианте "С", чем в варианте "с". Параметры световой кривой также проявляли зависимость от температурного режима выращивания: в варианте "Т" наклон, и плато световых кривых меньше, чем в. варианте "т".

Таким образом, ведущим фактором воздействующим на фотосинтетические характеристики тритикале на стадии раннего онтогенеза являлся свет, который регулировал как скорость ассимиляции С02, так и эффективность преобразования световой энергии в хлоропласте. Температурные режимы выращивания первой серии опытов, слабо влияли на фотосинтетические характеристики листа, и, вероятно, находились в зоне толерантности. Больший контраст температурного режима выращивания выявил слабую зависимость фотосинтетических характеристик листа от тешературы выращивания.

Таблиц* 4. Углекислотный газообмен листа триткале и его составлящие потоки в зависимое™ от климатического варианта, выращиншия растений (мкиаль^м-^1).

Вариант Видимый Скорссть Темно- Фото— Вадимов Геасси- Поток

шращи- газо- карбокси- вое ды- дыхание дакание миляция в лист

вания обмен лирования хание

ст 20.6+3.2 30.5±3.7 0.7±0.3 9.110.9 3.710.7 6.215.3 24.313.8

Сг 19.0±1.8 29.8+2.4 1.610.4 9.211.8 3.410.4 7.413.9 22.412.1

СТ 6.б±0.8 10.4+0.4 1.410.5 2.410.2 1.010.3 2.810.7 7.710.6

ст 16.211.1 23.0±1.0 1.010.5 6.610.5 2.410.3 8.114.7 15.711.2

Во второй серии опытов результаты ¿тестирования в стандартных условиях (освещенность листа -300 Вт/м ФАР, концентрация С02 над

листом 340 ррт, температура 25*С) показали, что при выращивании растений в световом варианте "С" изменение температурного режима также существенно не влияло на величины потоков, составляющих суммарный С02-газообмен (табл.4). Напротив, в световом варианте "с" при увеличении температуры выращивания величины потоков С02 значительно падали. При этом (независимо от температуры) увеличение освещенности при выращивании тритикале по-прежнему приводило к значительному росту величин этих потоков. У тритикале реассимилирует-ся 2/3 выделяющегося в процессе дыхания С02, причем реассимилируе-мая доля практически не зависела от варианта выращивания. Картину движения С02 дополняют результаты, представленные в табл.5. Заметим, что в листьях тритикале различных климатических вариантов выращивания наблюдали приблизительное равенство диффузионного сопротивления транспорту С02 в мезофилле и химического сопротивления реакции карбоксилирования. В световом варианте "С" их величины не отличались у исследуемых температурных вариантов. Однако, в свето-

вом варианте "с" они возрастали, особенно в варианте сТ. Концентрация С0Я в хлоропласте существенно не зависела от варианта выращивания, что обеспечивалось соответствущей регуляцией сопротивлений. Изменение скорости карбоксилирования у вариантов связано главным образом с изменением концентрации другого субстрата - РБФ.

Таили» 5. Сопротивления потоку ССь. распределзние СОа в листа тришхале и концекгрвхфы РЕ® в хлоропласте в зависимости от варианта, шршдааания рвстешй.

Вари- Сопротивление, с/си Концентрация углекислого газа Кон-

це!гг-

шра- хвдюй карбок- У в меа- поверх. В ХЛО- ряция

щива- суммар- УСТЬИЧ- tasы ме- силиро- листа клетни- ХЦЦХОП ропва- РБ5.

ния ное ное aajsuma вания РЕИ ке, ррю íasu.мха cra.raü KU

CT 5.010.9 1.910.9 0.9 10.2 1.7+0.2 29717 195 125 6.5 5.610.6 8.210.8

Cr 5.4±0.6 2.310.5 1.0 10.5 1.610.3 300±4 180 ±22 7.0 5.1+0.6 8.810.8

CT 17.411.4 8.612.2 3.6 12.0 4.911.0 32711 186 ±40 6.4 5.2+0.3 2.610.1

CT 6.610.5 2.210.4 1.8 10.3 2.110.2 30613 211 ±12 7.0 5.2+0.4 6.310.3

Mpdouxmipo&urc*

ВАШЕ КГШАШ-ЕСКИХ УСЛОКЯ вьРАэашя НА КННЕТКЧЕСЮЕ ХАР/КТЕВЮТШ) PBÍK ТРИТШУЕ На рис.7 представлена типичная зави- ClcpoeTl симость tn vivo скорости реакции карбоксилирования от концентрации субстратов (С02 и РБФ) для варианта выращивания растений ' СТ, полученная при вариации концентрации С02 над листом (а) и вариации освещенности листа (Ь). С изменением уровня РБФ скорость реакции карбоксилирования не проявляла видимого насыщения РБФ вплоть до наблюдаемых величин концентрации -10 мМ, что не противоречит характеру кинетических кривых реакции карбоксилирования tn vivo для других культур /LaiBk et al., 1985/. Тем не менее, так как концентрация активных центров РБФК обычно -4 мМ, отсутствие насыщения трудно интерпретировать. Возможное ингибирование РБФК фосфатами при низкой концентрации РБФ /Лайск

КОЯЦДВТрАЦЕВ РЕ®

i а з 4

Кояд«*трацнх РБФ

РЕС.7.3алиси*ость P(C,R) листа тритикале варианта СТ.

1991/ представляется правдоподобным. Заметим, что регистрируемая in vitro низкая величина константы Миха-элиса РБФК для РБФ (-50 мкМ), явно не противоречит результатам исследований кинетики in «iuo, поскольку: I) регистрируемое tn vivo видимое значение константы Михаэлиса увеличивается при наличии конкурентных РБФ ингибиторов; 2) возможно увеличение константы Михаэлиса по РБФ, связанное с регуляторным влиянием РБФ, проявляще-14

еся in vivo и не проявлявдееся in vitro в силу особенностей измерений; 3) возможно, что видимая ы vivo зависимость скорости реакции карбоксилирования от концентрации РБФ отражает не столько каталитические функции свободной РБФК, сколько функциональное свойства надмолекулярного комплекса ферментов карбоксилирования (разрушающегося при существующей процедуре выделения РБФК).

На рис.8 представлены зависимости эффективности карбоксилирования по РБФ от концентрации С03 в хлоропласте для различных климатических вариантов выращивания растений тритикале. Полученные из этих зависимостей кинетические параметры РБФК приведет в табл. 6." В вариантах СТ, сТ, ст их величины не шали достоверных различий, однако существенно отличны от соответствующих величин варианта Ст. Как видим, РБФК тритикале способна проявлять изменчивость кинетических характеристик в зависимости от условий выращивания растений, а наблюдаемый значительный разброс значений константы Михаэлиса по С02 <n uttro (для шпината 6+25 мкМ /Романова, 1991/) может быть обусловлен предысторией жизнедеятельности листа. В табл.6 приведены также величины фактора специфичности РБФК, рассчитанные на основе данных табл.4 и табл.5. Ранее было замечено /Кээрберг, 1989/, что этот фактор видоспецифичен (изменяется от 60 до 140 у различных Cg-растений). По-видимому, проявляемая РБФК тритикале изменчивость фактора специфичности (табл.6) обусловлена изменением конформации фермента (возможность этого ранее показана /Азвche et al., 1987/), в частности изменением доли мембранно связанной и растворимой форм РБФК /Алиев и др., 1984/.

Тйвжга 6. Кинеличваига параметры Таблица 7.Характеристики PDXK in vitro для РВЙС in vivo для различных Еа- различных вариантов выращивания.

риангов Еыращивания тритахале. Варгант выращивания Содерха-нив растворимого белка,г/к2 Карбокся-лааная aK-HŒHOCTb, мкиоль/м2/с СКсиге-наэная активность икиоль/ка/с

Вариант шра-щива-шм Константа Киха- элиса ДЛЯ СОа. (ОСИ Иакс. эффективность карбоксилирования по РВХ>. 1/с Фактор специфичности

СТ* От* сг* СТ* СТ СТ 4.4 ±0.2 5.1 ±0.2 5.0 ±0.1 4.8 ±0.6 23.5 ±4.0 33.0 ±4.3 27.2 ±4.2 27.7 ±4.3 27.2 ±4.3 53.9 ±5.3 3.8 ±0.4 4.8 ±0.6 2.а ±о.э 3.8 ±0.3

err От СТ СТ 21.912.1 48.4±1.1 25.9+3.1 19.5±3.0 0.52 ±0.03 1.32 ±0.23 0.78 ±0.06 0.58 ±0.05 71114 79±20 105±12 88± 9

Эффективность карбоксилирования по РБФ

Концентрация СОг

РКС.8.Зависимость эффективности карбоксилирования по РБФ от концентрации С02ов хлоропласте у листьев тритикале при 25 С для различных вариантов выращивания растений.

Заметим, что, по данным in vitra, содержание растворимого белка (состоящего главным образом из РБФК) практически не зависело от климатического режима выращивания (табл.7). Карбоксилазная активность при более холодном варианте выращивания растений выше. При этом различие активности РБФК, практически не проявляющееся в вариантах сТ* и ст*, становилось заметным в вариантах СТ* и Ст* и существенным в вариантах сТ и ст (больший температурный контраст).

Кинетические параметры РБФК листьев тритикале достоверно изменились лишь в варианте выращивания Ст. При этом падение сродства фермента к С02 компенсировалось увеличением максимальной эффективности карбоксилирования по РБФ, так что у вариантов СТ и Ст наблюдались практически равные скорости реакции карбоксшшровашя. Возможно, изменение сродства фермента к С02 произошло под влияшшм эффекторов (измонение концентрации РБФ демонстрирует табл.5). Однако, более вероятно, что наблюдаемое изменение кинетических свойств РБФК тритикале связано с проявлением качественной стратегии адаптации (изменением структуры форманта). Такое изменение может быть вызвано, во-первых, изменением конформации РБФК тритикале в варианте выращивания растений Ст при медленной динамике конфор-мационных переходов фермента в стандартных условиях тестирования. Во-вторых, изменение конформации РБФК мог;ет быть вызвано преимущественным синтезом в варианте Ст изофермента РБФК, связанного с генами другой родительской формы исследуемого гибрида. На возможность первого указывает изменение энергии активации фермента под влиянием температуры /Карпилова и др., 1984/, а второго - гетерогенность стромальных белков тритикале /Рашетникау i 1нш., 1986/. С точки зрения адаптации растения к факторам среды возникающие структурно-функциональные изменения фермента должны бы благоприятствовать жизнедеятельности растения в новых условиях. Заметим что в температурных вариантах выращивания "т", в сравнении с вариантами "Т", растворимость С0а увеличивается почти вдвое. По-видимому, поэтому растение допускает падение сродства фермента к С02.

При исследовании кинетики фотосинтеза листа следует считать перспективным использование методов, имеющих дело с нестационарными условиями. Конечно, с точки зрения методической и аппаратурной оснащенности (необходимость математического моделирования и быстродействующих измерительных систем), такой подход требует существенно больших затрат, но одновременно раскрывает новые возможности: экспериментальное исследование внутриклеточных кинетических параметров С02-газообмена фотосинтезирующего листа вплоть до исследования кинетических параметров tn vivo ферментов, определяющих характеристики С02-газообмена (РБФК в Са-растении).

вывода.

1. Выращивание тритикале при" температурных, режимах (день/ночь) 22/17 и 28/21*С и световых режимах 160 и 70 Вт/м2 ФАР показало, что в сравнении с температурой свет является ведущим'фактором, определяющим фотосинтетические способности листа тритикале.

2. Сопротивление растворения С03 в фотосинтезирующем листе мезо-фитного растения приближено равно 0.24 с/ом и его следует учитывать при описании кинетики СО,-газообмена в листе.

3. Концентрация СО, в поверхностном слое жидкости мезофилльных клеток фотосинтезирующего листа при широко распространенном расчете с использованием закона Генри существенно завышается, при этом относительная ошибка составляет 7% и 20% соответственно для типичного С3- и С„-растения в естественных условиях.

4. Предложенный в работе способ определения внутриклеточных кинетических параметров СО,-газообмена листа (сопротивления, составляющие потоки и концентрации СО,) позволяет исследовать эти параметры в широком диапазоне газового состава над листом и интенсивности освещения листа.

5. У тритикале в естественных физиологических условиях расчетные значения диффузионного сопротивления транспорта СО, из межклетника в хлоропласт и сопротивления карбоксилирования сопоставимы по величине. Следовательно, распространенное мнение о доминировании сопротивления карбоксилирования в суммарном сопротивлении мезофилла не соответствует- действительности.

G. Математическая модель, созданная для описания кинетики СО,-газообмена листьев С3-растений в первые послесветовые минуты, не противоречит известным результатам исследований в данной области и успешно описывает переходные процессы фотосинтеза и дыхания тритикале в течение 100 с после выключения света.

7. Величина tn и too константы Михаэлиса для СО, РБФК листьев тритикале, выращенных при сочетании высокой интенсивности освещения и низкой температуры значительно отличается от величин этой константы для других исследуемых климатических вариантов выращивания. Следовательно, тритикале проявляет, адаптивную изменчивость кинетических параметров РБФК.

8. Созданные газометрический комплекс быстрого ответа и программное обеспечение компьютера, реализующее моделирование переходных процессов СО,-газообмена в измерительном комплексе и фотосинтезирующем листе соответствуют современному научно-методическому уровню и могут применяться для широкого круга задач по исследованию кинетики процессов фотосинтеза и дахания высших наземных растений.

Список РАБОТ.

опубликованных по теле диссертации:

' I. Егоров В.П., Цюрша С.Н., Карпушкин л.Т. Автоматизирована газометрическая установка для исследования Н,0- и СО--газообмен) листвев растений //Физиология растений 1985 Т.32. С.II96.

2. цюрша С.Н., Егоров В.П., Карпушкин JI.T. Газометрическа: установка для исследования кинетики CO.- и Н,0-газообмена растений: A.c. 1284468 СССР//Б.И. 1987. *3.

3. Чугунова Н.Г., Цюрша С.Н., Бойченко В.А., Карпилова И.Ф. Романова А.К. Влияние климатических факторов на продукционные i фотосинтвтические характеристики тритикале (в условиях фитотрона) МТ, 1989. 38 с. Деп. В ВИНИТИ Ä3494-B89.

4. Цюрша С.Н. Изучение фотосинтетических характеристик листь ев тритикале, выращенных в разных условиях температуры и влажное ти// Тезисы докладов IV конференции молодых ученых ЙШС АН СССР Пущино. 1989- С.98.

5. Чугунова Н.Г., Цюрша С.Н., Карпилова И.Ф., Романова А.К Некоторые продукционные и фотосинтетические характеристики трити кале, выращенной в разных условиях температуры и влажности// Физи ология растений. 1990. Т.37. Л4. С.659.

6. Цюрша С.Н., Егоров В.П. Модернизация промышленного ик-га зоанализатора "lnfralyt-4"// Инфракрасные газоанализаторы в изуче нии газообмена растений. Сб.научных статей. М.: Наука, 1990. С.90

7. Чайка М.Т., Решетников В.Н., Романова А.К...... Цюрюп

С.Н., Чугунова Н.Г. Фотосинтетический аппарат и селекция тритика" ле. Мн.: Навука i тэхн!ка, 1991. 240 с.

8. Фридлянд Л.Е., Цюрша С.Н. Ингибирование фотосинтез сверхоптимальными концентрациями С0а и возможные механизмы этог явления// Физиология растений. 1992. Т.39. Вып.4. С.769.

9. Цюрша С.Н. Измерение С0а-газообмена листа в переходе свет темнота и определение его составляющих-на основе модели фотосинте за и дыхания// Актуальные проблемы физиологии растений и генетики Тезисы докладов межреспубликанской конференции молодых ученых (26 28 мая 1992). Киев, 1992. С.149.

10. Цюрша С.Н., Карпушкин Л.Т. Кинетика растворения С0а водных растворах и расчет концентрации растворенной С0а в водны растворах// Актуальные проблемы физиологии растений и генетики тезисы докладов межреспубликанской конференции молодых учены (26-28 мая 1992). Киев, 1992. С.20.

11. Цюрюпа С.Н., Егоров В.П. Измерение быстропротекающих пара метров СО,-газообмена листа// Физиология растений. 1993. Т.40. »1 (В печати).

12. Цюрша С.Н., Карпушкин Л.Т. Кинетика растворения С0а в фо тосинтезирующем листе// Физиология растений. 1993. Т.40. Ml. ( печати).

1.03.93 г. Зак.БЗЗбР Тир. 125 экз. Уч.-изд.л. 1.0 Отпечатано на ротапринте в 0Н1И ПНЦ РАН