Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Смолевки секции Otites (Adans.) Otth рода Silene L.

ВАК РФ 03.02.01, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Смолевки секции Otites (Adans.) Otth рода Silene L."

На правах рукописи

Бадулина Анна Александровна

СМОЛЕВКИ СЕКЦИИ OTITES (ЛDANS.) ОТТН РОДА SILENE L.: ИНТРОДУКЦИЯ, ХЕМОТАКСОНОМИЯ, ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

03.02.01-Ботаника

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 0 НОЯ 2014

Томск-2014

005555441

005555441

Работа выполнена в федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего образования «Национальный исследовательский Томский государственный университет», на кафедре агрономии Института биологии, экологии, почвоведения, сельского и лесного хозяйства и в лаборатории фитохимии Сибирского ботанического сада.

Научный руководитель: доктор химических наук, старший научный сотрудник

Зибарева Лариса Николаевна

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

Ревушкин Александр Сергеевич

Официальные оппоненты:

Силантьева Марина Михайловна, доктор биологических наук, профессор, федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Алтайский государственный университет», кафедра ботаники, заведующая кафедрой

Загурская Юлия Васильевна, кандидат биологических наук, федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт экологии человека Сибирского отделения Российской академии наук, лаборатория интродукции растений, научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение

науки Центральный сибирский ботанический сад Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск

Защита состоится 18 декабря 2014 г. в 14.00 час. на заседании диссертационного совета Д 212.267.09, созданного на базе федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Национальный исследовательский Томский государственный университет» по адресу: 634050, г. Томск, пр. Ленина, 36 (Главный корпус).

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке и на официальном сайте федерального государственного автономного образовательного учреждения «Национальный исследовательский Томский государственный университет» www.tsu.ru

Автореферат разослан « 6 » ноября 2014 г.

Материалы по защите диссертации размещены на официальном сайте ТГУ: http://tsu.ru/content/news/announcement_of_the_dissertations_in_the_tsu.php

Ученый секретарь

диссертационного совета / Середина Валентина Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Выявление хемотаксономических особенностей экдистероидного и флавоноидного состава видов секции Otites (Adans.) Otth рода Silene L. с применением современных физико-химических методов исследования способствует решению спорных вопросов систематики секции.

Изучение распределения синтезируемых биологически активных веществ в процессе развития растений в течение вегетационного периода позволяет выявить вегетативные фазы с максимальным накоплением, а так же органы растений, аккумулирующие эти биологически активные вещества.

Определение микроэлементного состава надземных частей растений и количественная оценка содержания микро- и макроэлементов способствует установлению корреляций между количеством и уровнем синтезируемых растениями биологически активных веществ.

Экди стероиды и флавоноиды являются основами нетоксичных лекарственных препаратов с различными видами действия, включая адаптогенное, гемореологическое, радиопротекторное, противоопухолевое и др. Поиск и изучение видов с высоким содержанием биологически активных веществ является актуальной задачей современной науки.

Цель работы. Установить закономерности химического состава некоторых видов секции Otites рода Silene в условиях интродукции в Томскую область для выявления хемотаксономических особенностей и перспектив использования.

Задачи:

1. Выявление перспективных видов Silene секции Otites в условиях интродукции в Томскую область;

2. Изучение закономерностей накопления экдисгероидов в онтогенезе исследуемых видов;

3. Сравнительный ВЭЖХ анализ особенностей состава экди стероидов и флавоноидов восьми видов и одного подвида Silene;

4. Выделение и идентификация индивидуальных экдисгероидов и флавоноидов из надземной части Silene colpophylla Wrigley;

5. Выявление особенностей микроэлементного состава надземных частей видов Silene.

Научная новизна. Впервые введен в культуру новый источник экдистероидов и флавоноидов — Silene colpophylla, изучены его биологические особенности в условиях юга Западной Сибири. Из S. colpophylla впервые выделены семь экдистероидов и пять флавоноидов, структуры которых идентифицированы методами ВЭЖХ, масс-спектрометрии и ЯМР.

Методами ВЭЖХ проведено сравнение экдистероидных и флавоноидных профилей восьми видов и одного подвида Silene секции Otites, установлен состав мажорных экдистероидов.

Исследована динамика 20-гидроксиэкдизона в видах сверхконцентраторах экдистероидов, интродуцированных на территории Сибирского ботанического сада, в том числе S. colpophylla. Изучен микроэлементный состав некоторых видов Silene, входящих в секцию Otites,

установлена корреляция между количеством марганца и уровнями 20-гидроксиэкдизона.

Практическая значимость. Выявлен новый источник экдистероидов и С-гликозилированных флавонов - Silene colpophylla, перспективный для применения в медицине.

Разработаны рекомендации по технологии выращивания и сбора лекарственных растений в условиях Западной Сибири - видов секции Otites с высоким содержанием экдистероидов (S. otites Wibel., S. otites ssp. hungarica Wrigley, 5. baschkirorum Janisch., S. pseudotites Besser, ex Reichenb, S. roemeri Friv., S. sendtneri Boiss., S. colpophylla).

Экспериментальная часть работы по выделению и идентификации экдистероидов и флавоноидов выполнена в лаборатории фитохимии Сибирского ботанического сада Томского государственного университета, при сотрудничестве с лабораторией экологических исследований и хроматографического анализа Новосибирского института органической химии им. H.H. Ворожцова СО РАН и Department of Chemistry Faculty of Science Ramkhamhaeng University (Bangkok, Thailand). Период выполнения работы с 2011 по 2014 гг.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Виды Silene colpophylla, S. otites ssp. hungarica Wrigley, 5. otites Wibel. перспективны для интродукции в районах дерново-подзолистых почв Западной Сибири.

2. Silene colpophylla - новый перспективный источник экдистероидов и С-гликозилированных флавонов;

3. Исследованные виды: Silene otites Wibel., S. otites ssp. hungarica Wrigley, S. pseudotites Besser, ex Reichenb, S. baschkirorum Janisch., S. exaltata Friv., S. borysthenica (Gruner) Walters имеют сходный состав мажорных экдистероидов и флавоноидов.

Методология и методы. Для исследования смолевок секции Otites применен комплексный экспериментальный подход, включающий наблюдение за растениями, интродукцию, методы сравнения растительных образцов, полученных в разных условиях, а также изучение химического состава растений, с привлечением современных методов исследования: высокоэффективная жидкостная хроматография, хромато-масс-спекгрометрия, рентгеноструктурный анализ, ИК-спектроскопия, УФ-спектроскопия, методы ядерно-магнитного резонанса и атомно-эмиссионной спектрометрии.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены и обсуждены на шести международных и всероссийских конференциях: четвертой международной российско-корейской конференции «Current Issues of Natural Products Chemisüy and Biotechnology» (2012, Новосибирск), международной научно-практической конференции, посвященной 125-легию кафедры ботаники (2013, Томск), международной конференции «Trends in Natural Products Research» (2014, Оломоуц, Республика Чехия), пятой всероссийской конференции с международным участием «Новые достижения в химии и химической технологии сырья» (2012, Барнаул), всероссийских научных

конференциях «Физиология растений и микроорганизмов - взгляд в будущее» (2013, Томск), «Биоразнообразие, проблемы экологии Горного Алтая и сопредельных регионов: настоящее, прошлое, будущее» (2013, Горно-Алтайск).

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, шести глав, основных выводов, списка литературы и четырех приложений. Диссертация изложена на 169 страницах, содержит 33 таблицы, 24 рисунка. Список литературы включает 171 наименование.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, включая три статьи в реципируемых научных журналах, один из которых входит в международные базы цитирования SCOPUS и Web of Science, б тезисов докладов в сборниках конференций.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Во введении содержатся обоснование актуальности темы, научная новизна и практическая значимость работы, положения, выносимые на защиту, приведены данные об апробации работы, сформулированы цели и задачи исследования.

Первая глава посвящена обзору мировой литературы о последних достижениях в области изучения распространения экдистероидов в мировой флоре, хемотаксономических исследований, а так же возможности их применения для систематизации растений. Показано, что состав вторичных метаболитов может служить систематическим фактором при составлении классификаций на уровне различных таксонов (от семейств до секций). В главе описаны хемотаксономические маркеры, свойственные роду Silene L. Установлено, что ими являются ценные биологические вещества экдистероиды, активно изучаемые в настоящее время.

Показано, что фитоэкдистероиды обладают целым рядом биологических активностей, включая анаболическую, гепатопротекторную, гипогликемическую, адаптогенную, иммуностимулирующую, радиопротекторную, гемореологическую, противоопухолевую и др. Проанализированы современные методики исследования экдистероидов и флавоноидов методом ВЭЖХ. Установлено, что наиболее подходящими для получения экдистероидных и флавоноидных профилей являются системы градиентного анализа с использованием трифторуксусной кислоты. Помимо этого в первой главе обсуждается роль микро- и макроэлементов в жизнедеятельности смолевок (Silene). Проанализированы, имеющиеся в литературе данные об элементном составе видов рода Silene.

Во второй главе дана характеристика объектов и методов исследования, использованных в работе, а так же природно-климатические условия района исследования. Интродукцию и изучение объектов исследования проводили на территории учебно-экспериментального участка Сибирского ботанического сада Томского государственного университета (СБС ТГУ), который находится на юго-восточной границе города Томска (юг Томской области). Приведены общие рекомендации по выращиванию смолевок с учетом ряда

агроклиматических условий района интродукции. В качестве объектов исследования использованы надземные части следующих видов секции Odies: Silene colpophylla, S. sendtneri, S. roemeri, S. otites, S. pseudotites, S. otites ssp. hungarica, S. baschkirorum, S. exaltata, S. borysthenica. Семена изучаемых растений были получены из различных ботанических садов и научно-исследовательских институтов мира. Анализ фитоэкдистероидов в образцах осуществляли методом тонкослойной хроматографии с последующим спектрофотометрическим определением.

Выделение индивидуальных соединений проводили с помощью колоночной хроматографии разделением бутанольных фракций этанольного экстракта. Идентификацию индивидуальных соединений, контроль состава фракций, а так же изучение экдистероидных и флавоноидных профилей исследуемых видов растений проводили методом ВЭЖХ на жидкостных хроматографах: «Agilent 1100» (США), «Shimadzu LC 20» (Япония) с диодноматричными детекторами. Индивидуально-групповую идентификацию основных соединений проводили сопоставлением экспериментальных УФ- и масс-спектров с таковыми для стандартных образцов и литературными данными, а так же при помощи ЯМР-спектроскопии. Для определения микро- и макроэлементного анализа применяли метод атомно-эмиссионной спектрометрии.

В третьей главе приведена характеристика видов секции Otites. В настоящее время нет единого взгляда на систематику данной секции. В работе подробно рассмотрена тенденция по выделению секции Otites из рода Silene и присоединению ее к роду Otites Adans. (ушанки). По данным «Flora Europaea» секция Otites подразделяется на две подсекции и включает 18 видов: Silene sibirica (L.) Pers., S. ventricosa Adamovié, S. media (Litv.) Kleopow, S. hellmannii Claus, S. cyri Schischkin in Grossh., S. velebitica (Degen) Wrigley, S. wolgensis (Hörnern.) Otth in DC., S. donetzica Kleopow, S. densiflora DUrv., S. chersonensis (ZapaJ) Kleopow, S. colpophylla, S. exaltata, S. roemeri, S. sendtneri, S. borysthenica, S. baschkirorum, S. otites, S. pseudotites.

Виды секции распространены на территории Европы и юго-западной части России. Ареалы некоторых видов могут захватывать отдельные районы Азии, и Западной Сибири (S: sibirica, S. wolgensis и т.д.). Многие виды секции являются эндемиками - S. colpophylla, S. roemeri и т.д. Особенно часто эндемичные виды из данной секции встречаются на юге Западной Европы, что обусловлено располагающимися на данной территории протяженными горными массивами.

Помимо решения проблем систематики изучение смолевок представляет интерес с точки зрения фармакологии, медицины и биотехнологии. Среди видов секции Otites уже рекомендовано в качестве источников биологически активных веществ 11 видов, среди которых S. sibirica, S. roemeri, S. sendtneri, S. borysthenica, S. cyri, S. wolgensis, S. baschkirorum, S. otites, S. pseudotites, S. densiflora, S. exaltata. Однако экдистероидный и флавоноидный состав' многих из вышеперечисленных видов подробно не изучен.

Восточно-европейские и южно-европейские виды смолевок могут служить примером успешной адаптации смолевок в условиях Западной Сибири. Многие виды этой группы отличаются высоким содержанием экднстероидов (Зибарева и др. 2003, 2012). Однако небольшой ареал произрастания данных видов и труднодоступность для сборов усложняют процесс заготовки растительной биомассы для использования в фармакологии и биотехнологии. В связи с этим актуальным является изучение европейских видов с высокоактивным комплексом веществ в качестве интродуцируемых растений в различных климатических условиях.

В третьей главе приведены сведения об особенностях выращивания исследуемых видов в условиях СБС 11 У. Исходя из полученных данных виды: S. otites, S. otites ssp. hungarica и S. colpophylla рекомендованы для интродукции в условия юга Западной Сибири, как виды, проходящие полный жизненный цикл, и содержащие значительное количество экдистероидов и флавоноидов. Наблюдения в течение ряда лет за растениями позволили сделать вывод об успешности адаптации в условиях интродукции S. roemeri и S. sendtneri. Получены данные о сезонных ритмах развития растений.

В четвертой главе приведены результаты выделения биологически активных веществ из некоторых видов секции Otites и их идентификации. В результате проведения серии экспериментов по оптимизации условий экстракции исследуемых видов установлено, что максимальное извлечение биологически активных веществ из смолевок происходит при пятикратном экстрагировании 70% этиловым спиртом. Показано, что применение ультразвука сокращает время экстракции в шесть раз.

Проведен подбор хромато графических условий для изучения экдистероидных и флавоноидных профилей Silene. На примере модельных смесей проанализированы восемь хроматографических систем. Показано, что наиболее оптимальными системами для изучения комплексов фитоэкдистерондов в смолевках являются системы обращено-фазного градиентного анализа. Так при помощи системы метанол - 0,1% трифторуксусная кислота (ТФУ), в градиенте метанола от 2 до 100% было обнаружено и проанализировано 14 фитоэкдистероидов. Еще девять минорных соединений этой группы было обнаружено при помощи градиентной системы смеси ацетонитрил - изопропиловый спирт (3:2, v:v) в 0,1% ТФУ от 15 до 35%.

Данные хорошо коррелируют как при изучении модельных растворов, так и при межвидовом сравнении экдистероидных профилей смолевок. Кроме того, использующаяся градиентная система позволяет существенно снизить расход органических растворителей, поскольку содержание воды в ней составляет 65—85%.

Представлены результаты изучения экди стероидного и флавоноидного профилей нового источника экдистероидов Silene colpophylla в различных хроматографических системах. На рисунке 1 приведена хроматограмма

экдистероидной суммы, полученная при проведении ВЭЖХ/МС-анализа надземной части растения. Спектрально-хроматографические характеристики соединений, полученные методом масс-спектрометрии под действием электронного удара имеют характерный для экдистероидов распад, сходный с распадом стероидных соединений. Интенсивные пики в спектрах соответствуют фрагментам, полученным при отщеплении воды (М+-пН20). Так же наблюдается характерное отщепление мегильной группы при четвертичном атоме углерода как в виде иона М+-СН3, так и в виде дегидратированных пиков (^-СНг-пНгО).

Рисунок 1 - Хроматографичеекий профиль экдистероидной суммы тепе со1рорИу11а (X = 254 им), полученный при проведении ВЭЖХ/МС-анализа: 2-дезоксиэкдазон (17), 2-дезоксн-20-гвдроксиэвдизон (16), ждизон (14), полиподин В (И), 20-гндрокеиэкдизон (10), ннтегрисгерон А (б)

Методом колоночной хроматографии при изучении БИепе со1рорку11а выделены и идентифицированы с помощью ВЭЖХ, ВЭЖХ/МС и УФ-спекгроскопии следующие экдистероиды: 2-дезоксиэкдизон, 20-гадроксиэкдизон-2-ацетат, 2-дезокси-20-гидроксиэкдизон, полиподин В, 20-гидроксиэкдизон, экдизон, интегристерон А (таблица 1, рисунок 2). 20-гидроксиэкдизон-2-ацетат идентифицирован с помощью ВЭЖХ-анализа, сравнением со стандартом. Методами ВЭЖХ и масс-спкгрометрии проанализирована флавоноидная сумма экстракта 5. со1рорку11а, хроматографический профиль которой приведен на рисунке 3. Все пять соединений на хроматограмме (рисунок 3) имеют в УФ-спектрах основных пиков по два максимума поглощения, характерные для фенилпропаноидов Сб-Сг-С$ типа апигенина, что позволяет отнести эту группу соединений к флавонам. Это подтверждено ИК-спектрами. Молекулярные массы данных соединений превышают массы известных флавонов, что указывает на гликозилированную форму этих соединений.

№№ Экдисгероид Формула Молекулярная масса Масса, г Выход, %

1 2-Дезоксиэкдизон С27Н44О5 448 0,0382 0,0212

2 2-Дезокси-20-гидроксиэкдизон С27Н44О6 464 0,0706 0,0392

3 20-Гидроксиэкдизон-2-ацетат C29H4«Og 522 - -

4 Полиподин В С27Н44О8 496 — —

5 20-Гидроксиэкдизон С27Н44О7 480 0,6840 0,3800

6 Экдизон С27Н44О6 464 0,0855 0,0475

7 Интегристерон А С27Н44О8 496 0,0256 0,0142

Рисунок 2 - Структуры экдистероидов, выделенных из Silene colpophylla: 1) 2-дезоксизкдизон, 2) 20—гидрокснзкдизон—2—ацетат, 3) 2-дезокси-20-гидроксиэкдизон, 4) полиподин В, 5) 20-гндроксиэкднзои, 6) экдизон, 7) ннтегристерои А

Анализ полученных УФ- и масс-спектральных характеристик найденных флавоноидов позволил предположить, что эти соединения являются изомерными С-гликозидами флавононов, различающимися составом и положением углеводных фрагментов. УФ- и масс-спектр альные характеристики обнаруженных соединений приведены в таблице 2.

отдельных флавоноидов

Мажорный флавоноид имеет ярко-желтую окраску и мелкокристаллическую структуру. С помощью методов ЯМР 'н, ИК- и УФ-спектроскопии установлено, что это соединение имеет структуру С-дигликозида апигенина с молекулярной массой равной 564, у которого в молекуле один углеводный остаток имеет пентозную форму, а второй гексозную.

Таблица 2 — Характеристика флавоноидов обнаруженных в ЯНепе софоркуНа

Номер соединения ^inax» НМ (М-Н Tm/z (М+Н fm/z

1 274;336 563,4 565,17

2 272; 334 563,14 565,17

3 274; 330 563,14 565,17

4 272; 338 563,14 565,17

5 272; 338 739,19 741Д1

Окончательное установление структуры вьщеленного соединения будет возможно при проведении дополнительных ЯМР-исследований с замораживанием образца, для предотвращения вращения пары атомов водорода в положениях 2'и 6'.

В пятой главе приведены данные хемотаксономического изучения восьми видов и одного подвида Silene секции Otites. Рассмотрен ряд вопросов систематики:

- выделение секции Otites рода Silene или группы видов в отдельный род Otites (Ушанка);

- выделение Silene sendtneri и S. roemeri в отдельную секцию Capitellatae (Rohrb.) Schischk;

- определение родового статуса отдельных видов (пример, S. borysthenica)-,

- определение видового статуса S. otites ssp. hungarica.

Для хемотаксономического изучения выбраны: типовой вид - S. otites; виды, бесспорно относимые к роду Silene (S. colpophylla, S. sendtneri, S. roemeri); виды, имеющие спорный родовой стэтус (S. baschkirorum, S. exaltata, S. borysthenica), a так же близкородственные виды (S. pseudotites, S. otites ssp. hungarica).

Среди изучаемых видов выявлены виды сверхконцентраторы фитоэкдастероидов - S. colpophylla, S. sendtneri, S. roemeri, S. pseudotites (содержание 20-гидроксиэкдизона от 1,4 до 2,4%), виды с относительно низким содержанием экдистероидов - S. exaltata, S. borysthenica (содержание 20-гидроксиэкдизона 0,3-0,4%). Экдистероид-отрицательных видов обнаружено не было. В качестве видов сравнения взяты S. linicola С.С. Gmelin (секция Lasiocalycinae Chowdhuri), S. viridiflora L. (секция Siphonomorpha Otth), S. frrvaldszkyana Hampe (секция Sclerocalycina (Boiss.) Schischkin), состав которых изучен ранее (Зибарева 2009,2012).

При помощи ВЭЖХ/УФ-анализа получены эвдистероидные профили изучаемых 70% этанольных экстрактов надземных частей смолевок в

различных хроматографических системах. Данные свидетельствуют о наличии во всех исследуемых видах секции Otites таких мажорных экдистероидов как 20-гидроксиэкдизон, 2-дезокси-20-гидроксиэкжизон и 2-дезоксиэкдизон. Практически во всех видах секции (исключение составляют S. roemeri и S. sendtneri) обнаружен экдизон. Интегристерон А обнаружен лишь в некоторых видах, таких как S. otites ssp. hungarica; S. otites-, и S. colpophylla. Так же не во всех видах выявлен полиподин В, однако это может быть связано с условиями хроматографирования, которые не всегда позволяют проводить разделение 20-гидроксиэкдизона и полиподина В, находящихся в одной пробе. Согласно литературным данным из S. otites выделено более 30 различных экдистероидов (Bathori 1986, 1999), среди которых 5р-гидроксипроизводное 20Е, полиподин В не выявлен. Сравнение экдистероидных профилей видов секции Otites с профилями видов из других секций показало, что исследуемые виды имеют как общие для всего рода мажорные экдистероиды (20-гидроксиэкдизон или полиподин В) так и характерный для секции экдистероид с временем удерживания 29,6 мин.

Во всех видах экдистероидом с наибольшей концентрацией является 20-гидроксиэкдизон, исключение составили два вида S. otites ssp. hungarica и S. exaltata. В первом виде доминирующим экдистероидом оказался 2-дезоксиэкдизон, а во втором виде — неполярный экдистероид неустановленной структуры с временем удерживания 44,8 мин.

Вопрос о количестве подвидов S, otites до сих пор остается открытым. С точки зрения хемосистематики информативным может оказаться соотношение отдельных экдистероидов в экдистероидых профилях S. otites ssp. hungarica и S. otites. Полученные данные свидетельствуют о достаточно близком экди стероидном составе данных растений (таблица 3). Так в полярной части профиля 5. otites ssp. hungarica не обнаруживается пик экдистероида с временем удерживания 15,3 мин, который присутствует в экстракте S. otites. Напротив, в S. otites ssp. hungarica присутствует полиподин В, тогда как в S. otites - нет. Существенные отличия наблюдаются в среднеполярной части экди стероидного профиля, между 20-гидроксиэкдизоном (19,9 мин) и экдизоном (30,1 мин). У S. otites ssp. hungarica обнаружены два пика в этой области (пики с îr = 28,5 и 29,5 мин) в, тогда как в S. otites наблюдаются четыре экдистероидных пика (tR = 21,6; 22,2; 22,8; 29,6; 28,1 мин). В неполярной части экстракты имеют схожий состав, однако, в области от 35 до 40 мин в S. otites ssp. hungarica так же нет пиков экдистероидов, которые присутствуют в S. otites (пять экдистероидов с fo = 36,2; 37,3; 38,6; 40,0; 41,4 мин). Следует отметить, что доминирующие экдистероиды в данных видах так же различны, если в S. otites это 20-гидроксиэкдизон (содержание 20-гидроксиэкдизона превышает содержание 2-дезоксиэкдизона в 3,6 раза), то в S. otites ssp. hungarica этим экдистероидом является 2-дезоксиэкдизон (содержание 20-гидроксиэкдизона в 1,3 раза меньше концентрации 2-дезоксиэкдизона).

Таблица 3 - Экдистероидные профили Silene otites и S. otites ssp. hungarica в системе ацетоиитрил - изопропиловый спирт - вода (3:2) в градиенте от 15 до 35%

Экдистероид Время удерживания (tR), мин

Silene otites ssp. hungarica Silene otites

Экдистероид 1 — 15,2

Интегристерон А 16,5c 16,6c

Полиподин В — 19,2

20-гидроксиэкдизон 19,9 19,9

Экдистероид 2 - 21,6c

Экдистероид 3 — 22,2c

Экдистероид 4 _ 22,8c

Экдистероид 5 28,5 28,1

Экдистероид 6 29,5 29,6

Экднзон 30,1c 30,2

Экдистероид 7 - 30,7c

2-дезокси-20-гидрокснэкдизон 32,0 32,1

Экдистероид 8 32,8c 32,9c

Экдистероид 9 33,9c 34,1c

Экдистероид 10 34,5c 34,7c

20-гндроксиэкдизон-2-апетат 35,3c 35,4c

Экдистероид 11 — 36,2c

Экдистероид 12 — 37,3c

Экдистероид 13 - 38,6c

Экдистероид 14 — 40,0c

Экдистероид 15 — 41,4c

2-дезоксиэкдизон 43,4* 43,6

Экдистероид 16 44,6c 44,8

Примечание - структура экдистероидов 1-16 на данный момент не установлена

Таким образом, в химическом составе типового вида S. otites и подвида S. otites ssp. hungarica обнаружены общие, характерные для рода и секции экдистероиды, а так же видоспецифичные отличия.

Помимо большого числа подвидов S. otites часто образует гибриды с другими видами секции. Поскольку S. pseudotites является гибридом S. otites и S. colpophylla (Wrigley, 1986), то сравнение их экдистероидных профилей представляет важное хемотаксономическое значение. В ходе работы было проведено детальное изучение экдистероидных профилей этих видов и выявлены основные закономерности. Обнаружены экдистероиды, характерные для всех трех видов Silene, а так же экдистероиды содержащиеся в одном или двух родительских видах. Показано, что S. otites и S. pseudotites имеются шесть общих неполярных экдистероидов. Видоспецифичные экдистероиды родительских видов S. otites и S.colpophylla находятся большей частью в полярной и среднеполярной области экдистероидного профиля и не обнаруживаются в дочернем виде. Ранее Л.Н. Зибаревой с сотр. из S. pseudotites выделено три новых полярных экдисгероида - (2-дезокси-20Д6-дищдроксгокдизон, 2-дезоксгокдизон-22р-0-гликозид, 2-дезоксиполиподин В-30-О-гликозид), эти экдистероиды по-видимому наследуются от родительского вида S. colpophylla.

Дополнительные исследования полярной части экстракта S. pseudotites в системе растворителей циклогексан - изопропиловый спирт- вода (70:28:2, v:v:v) также показали наличие в полярной части экстракта S. pseudotites трех полярных экдистероидов. Кроме того в неполярной части экдистероидного профиля S. pseudotites обнаружены четыре экдистероида, не найденные в S. colpophylla и S. otites. Показано, что данные исследуемые виды имеют сходство не только экдистероидного, но и флавоноидного состава

Особое внимание заслуживает рассмотрение экдистероидного и флавоноидного состава S. borysthenica. Наряду с такими видами как S. exaltata, S. cyri и S. wolgensis некоторыми авторами предлагается выделить этот вид в род Otites Adans. (Цвелев, 2001 и т.д.). Полученные данные свидетельствуют о сходстве экдистероидных профилей S. borysthenica, S. exaltata и S. otites. Совпадение экдистероидного состава данных видов наблюдается как для мажорных, так и минорных экдистероидов, что является особенно важным, так как и S. borysthenica и S. exaltata относятся к видам с невысоким содержанием экдистероидов.

В ходе работы помимо экдистероидных профилей получены и проанализированы флавоноидные профили всех изучаемых видов смолевок. Выявлены основные закономерности состава и распределения флавоноидов. Все изучаемые виды имеют сходные времена удерживания мажорных флавоноидов (13,4-13,9 мин и 15,8-16,2 мин). Помимо мажорных флавоноидов, в экстрактах обнаружены и видоспецифичные соединения. S. pseudotites и S. sendtneri обладают наиболее разнообразным набором флавоноидов (по девять соединений), минимальное количество флавоноидов (один - два) в профиле обнаружено в S. baschkirorum, S.otites ssp. hungarica и S. exaltata. В остальных видах количество флавоноидов варьируется от пяти до семи. Количество флавоноидов в исследуемых видах лежит в интервале от 2 до 6%.

В шестой главе приведены результаты исследования динамики содержания экдистероидов в некоторых видах смолевок секции Otites, а так же рассмотрены перспективы их использования. Известно, что природно-климатические условия оказывают существенное влияние на химический состав растений, как вторичных метаболитов, так и микро- и макроэлементов. Естественные места произрастания Silene colpophylla - юго-восток Франции и прилегающие территории, находящиеся в альпийской и средиземноморской климатических зонах, лишь на востоке попадающий в континентальную зону, существенно отличаются от условий Томской области. Так как анализ накопления и возможности сохранения синтеза БАВ в растениях в различных условиях является важным фактором для разработки технологических схем заготовки растительного сырья, биотехнологических методик для промышленного получения экдистероидов и выбора района интродукции, то изучение их сезонного и возрастного распределения является крайне важной задачей. В связи с этим, проведено сравнение содержания мажорного соединения - 20-гидроксиэкдизона в различные фенофазы для двух поколений S. colpophylla

Первое поколение растений получено из семян, присланных из Muséum National d'Histoire Naturell (Париж, Франция). Второе поколение получено из семян репродукций СБС ТГУ. На рисунке 4 приведены данные о распределении 20-гидроксиэкдизона в различные вегетативные фазы S. colpophylla. Содержание 20-гидроксиэкдизона в различных образцах 5. colpophylla варьирует в пределах от 0,2 до 1,4 %. Пик максимального накопления 20-гидроксиэкдизона приходится на начало вегетации второго года жизни, минимальное значение - на момент созревания семян. Сравнение содержания 20-гидроксиэкдизона во всех исследуемых видах показало самое высокое значение в S. pseudotites в фазу начала вегетации второго года жизни - 2,4%, самое низкое - в S. exaltata - 0,3% (в пересчете на сухое сырье). Изучение сезонной динамики содержания 20-гидроксиэкдизона в надземной части исследуемых видов, проходящих весь цикл развития в условиях Томской области, позволило выявить фазы с максимальным содержанием. Пик максимального накопления 20-гидроксиэкдизона в S. sendtneri и S. colpophylla приходится на начало вегетации, тогда как у S. roemeri и S. otites - на бутонизацию. Минимальные значения наблюдаются в фазу цветения, что характерно для многих многолетних видов Silene.

Рисунок 4 - Сезонная дннамнка содержания 20-гидроксиэкдизона в надземной части Silene colpophylla

Исключением стал подвид S. otites ssp. hungarica, у которого пик максимального накопления 20-гидроксиэкдизона приходится на фазу цветения. Показано, что в фазы плодоношения и конца вегетации у S. sendtneri и S. roemeri происходит увеличение содержания экдистеровдов, что обусловлено появлением молодых нижних и прикорневых листьев в период плодоношения у многолетних растений (рисунок 5). Содержание экдистероидов в растениях S. colpophylla к концу вегетационного сезона резко снижается, что совпадает с моментом созревания семян и гибелью растения. По всей вероятности, это

обусловлено биологией развития вида, поскольку в условиях интродукции у него происходит завершение двулетнего жизненного цикла.

Рисунок 5 — Сезонная динамика содержания 20-гидроксиэкднзона в надземной части некоторых видов секции Otites рода Silene. 1 - фаза начала вегетации, 2 - фаза бутонизации, 3 - фаза цветения, 4 - фаза плодоношения, 5 - фаза конца вегетации

S. colpophylla является быстро возобновляемым сырьем с высокой биомассой на втором году жизни. В условиях Западной Сибири этот вид проявляет устойчивость к вредителям в отличие от другого вида сверхконцентратора экдистероидов - S. pseudotites, который не вступает в генеративные фазы и активно уничтожается в летний сезон даадцатачетырёхточечной божьей коровкой {Subcoccinella vigintiquatuorpunctata).

При выборе вида для использования в качестве сырья определяющим показателем является соотношение содержания биологически активных веществ и биомассы растения. Максимальный выход экдистероидов из одного растения наблюдается у таких видов как S. roemeri, S. sendtneri, S. colpophylla (таблица 4). На примере S. roemeri показано, что многолетние виды смолевок сохраняют способность синтезировать экдистероиды в течение продолжительного времени. Уровень 20-гидроксиэкдизона в S. roemeri повышается со второго до девятого года жизни (от 0,7 до 1,3%), после чего происходит резкое снижение количества синтезируемого экди стероида.

Ввиду того, что исследуемые виды рекомендованы в качестве перспективных источников биологически активных веществ, весьма полезной информацией является и данные об элементном составе этих видов растений. Среди макроэлементов растений обнаружены фосфор, кальций, магний, микроэлементов - железо, медь, бор, марганец, молибден. Кроме того, в смолевках выявлены алюминий, оказывающий токсичное действие на растения, титан, барий, ванадий, цирконий, кремний и олово. Среди видов концентраторов кальция и магния оказались S. borysthenica, S. pseudotites, S. otites ssp. hungarica, S. colpophylla, S. roemeri.

№ № Вид* Содержание 20E, % на абс. сухое сырье Масса надземной части 1 растения (сухого), г Масса 20Е на 1 растение, мг Кол-во раст. на 1 м2 Масса 20Е на 1 м2, г

1 S. colpophylla 0,86±0,056 7,5 64,5 74±8 4,8

2 S. otites 1,11±0,018 1,8 20,0 14±2 0,3

3 S. otites ssp. hungarica 0,85±0,050 1,5 12,8 15±4 0,2

4 S. sendtneri 0,84±0,045 27,1 227,6 28±8 6,4

5 S. roemeri 1,30±0,079 25,4 330,2 17±4 5,6

6 S. baschkirorum 0,93±0,074 1Д 11,2 59±11 0,7

7 S. pseudotites** 2,35±0,181 - - 15±3 _

* - Здесь и далее данные приведены для фаз бутонизации, исключение составляет 5. otiles ssp. hungarica, для которого пик накопления приходится на фазу цветения, 20Е - 20-гидроксиэкдизон. ** - Для указанного образца массу надземной части не определяли, а содержание 20Е определяли для фазы начала вегетации.

Показано, что железо и марганец накапливаются смолевками (рисунок 6). Количество железа практически во всех видах превышает среднее значение в несколько раз и лежит в пределах от 205 до 1550 мкг/г. Это согласуется с известными данными для растений, многие из которых в большом количестве накапливают железо, при повышенном содержании этого элемента в почве. Исключением стали S. baschkirorum и S. roemeri. Вероятно, накопление железа связано с высоким его содержанием в почвах Томской области, расположенной в пределах крупного Западно-Сибирского железорудного бассейна. Имеются литературные данные о корреляции содержания марганца и синтезируемых экдистероидов в Ajuga reptans (Алексеева, 2006). Из рисунка 6 видно, что самым высоким уровнем марганца отличаются S. sendtneri; S. pseudotites; S. colpophylla, S. roemeri - виды, которые характеризуются максимальным содержанием 20-гидроксиэкдизона. Исключение составляет S. otites и S. borysthenica. При анализе содержания титана и кремния выявлено, что распределение этих элементов в исследуемых видах имеет одинаковый характер. Указанный в литературе цинк, как свойственный смолевкам элемент (Дармограй, 1996), в исследуемых видах не обнаружен. Медь выявлена лишь в некоторых видах и в небольших количествах.

Проведено сравнение микроэлементного состава для различных фенофаз S. colpophylla, позволяющее выявить закономерности распределения элементов в фазах начала вегетации и цветения (таблица 5). В начале вегетации у этого вида повышено накопление бария, титана, фосфора и кремния. При достижении фазы цветения увеличивается накопление бора, по всей вероятности, в связи с ростом и развитием пыльцевых трубок, увеличением массы репродуктивных органов.

Так же происходит увеличение количества меди, циркония, молибдена и олова, что вероятно, связано с активным синтезом биологически активных веществ растениями в данный период. Количество марганца в фазу цветения начинает снижаться, это сопровождается уменьшением синтезируемых экдистероидов.

Sbo SS SBa SO SP SOH SCI SC2 Sft

ОСодержанме марганца, «r/t*iO li Содержание 20-тдроксиэкдиэона,%

Рисунок 6 - Содержание марганца и 20-гидрокснэкдизона в надземных частях некоторых видов Silene секции Otites

SBo — S. borysthenica; SS - S.sendtneri; SBa - S. baschkirorum; SO - S. otites; SP — S. pseudotites; SOH - S. otites ssp. hungarica; SCI - S. colpophylla (н.в.); SC2 - S. colpophylla (цв.); SR — S. roemeri.

Таблица 5 — Содержание элементов в Silene colpophylla

№№ Элемент, мкг/г Начало вегетации Цветение №№ Элемент, мкг/г Начало вегетации Цветение

1 А1 1920±190 2110±210 9 В 2,6±0,5 4,3±0,9

2 Са 10900±500 12850±600 10 Ва 50±5 11±1

3 Fe 1070±107 1170±116 11 Си 4,3±0,5 6,8±1,4

4 Mg 2220±220 2410±240 12 V 1,1±0.2 1,1±0,2

5 Mn 194±20 156±15 13 2г 2,3±0,4 13±1

6 Р 1290±130 685±70 14 Sn 0,4±0,1 17±2

7 Si 10080±500 7992±800 15 Mo <ао 1,9±0,4

8 Ti 278±28 204±20

ВЫВОДЫ

1. Виды Silene colpophylla, S. otites ssp. hungarica и S. otites успешно интродуцированы в Сибирском ботаническом саду Томского государственного университета.

2. Показано, что наиболее перспективными видами в качестве источников экдистероидов и флавоноидов являются Silene roemeri, S. sendtneri и новый продуцент S. colpophylla. При культивировании этих видов в условиях юга Западной Сибири способность к синтезу экдистероидов сохраняется в течение ряда поколений.

3. Из экстракта Silene colpophylla выделены и идентифицированы методами ВЭЖХ, ВЭЖХ/МС и ЯМР 7 экдистероидов: 20-гидроксиэкдизон, 2-дезоксиэкдизон, 2-дезокси-20-гидроксиэкдизон; 2-ацетат-20-гидроксиэкдизона, интегристерон А, полиподин В, экдизоп Выделенные из надземной части флавоноиды S. colpophylla являются С-гликозилированными флавонами с апигениновой структурой.

4. Исследование экдистероидного состава восьми видов и одного подвида Silene секции Otites показало, что данные виды имеют сходный состав экдистероидов: 20-гидроксиэкдизон, экдизон, 2-дезоксиэкдизон, 2-дезокси-20-гидроксиэкдизон и флавоноидов, структуры которых на данный момент не установлены.

5. Исследование химического состава типового вида секции Silene otites и подвида S. otites ssp. hungarica выявило ряд характерных видоспецифических экдистероидов.

6. Установлено, что максимальное накопление экдистероидов с учетом биомассы наблюдается в фазу бутонизации, исключение составляет Silene otites ssp. hungarica. Разработаны рекомендации по сбору растительного сырья видов секции Otites.

7. Показано, что исследуемые виды Silene среди макроэлементов накапливают преимущественно магний и кальций. Концентраторами этих элементов являются: Silene borysthenica, S. pseudotites, S. otites ssp. hungarica, S. colpophylla, S. roemeri. Наибольшее содержание титана и кремния обнаруживается в S. borysthenica, S. roemeri, S. colpophylla и S. pseudotites. Установлено, что все исследуемые виды накапливают марганец в надземной части, а сверхконцентраторы экдистероидов (S. pseudotites, S. roemeri, S. sendtneri и S. colpophylla) характеризуются максимальным содержанием этого микроэлемента.

Благодарности. Автор выражает благодарность научному руководителю доктору химических наук Ларисе Николаевне Зибаревой и научному консультанту доктору биологических наук, профессору Александру Сергеевичу Ревушкину, доктору биологических наук, профессору Александру Леоновичу Эбелю и доктору биологических наук, профессору Андрею Ильичу Пяку, доктору технических наук, профессору Владимиру Ильичу Отмахову и доктору биологических наук, профессору Татьяне Петровне Астафуровой, Валентине Ивановне Ереминой и Александру Анатольевичу Ермошину (Уральский федеральный университет, г. Екатеринбург). Коллективам лаборатории экологических исследований и хроматографического анализа Новосибирского института органической химии им H.H. Ворожцова СО РАН, Сибирского ботанического сада, лаборатории фитохимии и кафедры агрономии.

Публикации по теме диссертационной работы:

Статьи в журналах, включенных в Перечень рецензируемых научных изданий, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией при Министерстве образования и науки Российской Федерации для опубликования основных результатов диссертаций:

1. Зибарева, Л. Н. Изучение химического состава надземной части Silene colpophylla Wrigley / Л. H. Зибарева, А. А. Селиверстова (Бадулина), А. Suksamrarn, С. В. Морозов, Е. И. Черняк // Химия природных соединений. -2014. -№ 3. - С. 492. - 0,1 / 0,03 пл.

переводная версия:

Zibareva, L. Phytoecdysteroids from the Aerial Part of Silene colpophylla / L. Zibareva, A- Seliverstova (Badulina), A. Suksamrarn, S. Morozov, E. Chernayk // Chemistry of Natural Compounds. - 2014. - Vol. 50, № 3. - P. 571-572. - 0,15 / 0,03 njL-DOI: 10.1007/s10600-014-1021-x

2. Селиверстова (Бадулина), А. А. Закономерности распространения экди стероидов в растениях секции Olites Otth рода Silene L.: хемотаксономический подход / А. А. Селиверстова (Кадулина), JI. Н. Зибарева, В. И. Еремина // Вестник Томского государственного университета. Биология. -2014. - № 3 (27). - С. 101-114. - 0,85 / 0,6 пл.

3. Бадулина, А.А. Фотохимическое изучение некоторых представителей секции Otites Otth рода Silene L. (Caryophyllaceae) [Электронный ресурс] / А. А. Бадулина, Л. Н. Зибарева // Современные проблемы науки и образования. -2014. — № 5,- URL: http://www.science-education.ni/l 19-14898 - 0,7 / 0,41 пл.

Публикации в других научных изданиях:

4. Селиверстова (Бадулина), А. А. Фитоэкдистероиды Silene colpophylla / А. А. Селиверстова (Бадулина), Л. Н. Зибарева, В. И. Еремина // Новые достижения в химии и химической технологии сырья : материалы VI Всероссийской конференции. - Барнаул, 2012. - С. 276-277. - 0,1 / 0,03 пл.

5. Zibareva, L. N. The distribution of phytoecdysteroids in section Otites Otth of genus Silene L. / L. N. Zibareva, A. A- Seliverstova (Badulina), A. Suksamrarn, A. Athipornchai, O. Wonganan // 4й1 Annual Rassian-Korean Conference Current Issues of Natural Products Chemistry and Biotecnology. - Novosibirsk, 2012. -P. 139.-0,1/0,03 пл.

6. Селиверстова (Бадулина), А. А. Хемотаксономическое изучение секции Otites Otth рода Silene L. / А. А. Селиверстова (Бадулина), Л. H. Зибарева // Интеграция ботанических исследований и образования: традиции и перспективы: труды международной научно-практической конференции, посвященной 125-летию кафедры ботаники. - Томск, 2013. - С. 200-201. - 0,16 / 0,1 пл

7. Селиверстова (Бадулина), А. А. Исследование состава экдистероидов некоторых видов секции Otites Otth / А. А. Селиверстова (Бадулина), Л. Н. Зибарева, В. И. Еремина // Биоразнообразие, проблемы экологии Горного Алтая и сопредельных регионов : настоящее, прошлое, будущее : материалы III международной конференции.-Горно-Алтайск,2013.-С. 304-305.-0,18 /0,1 пл.

8. Селиверстова (Бадулина), А. А. Динамика содержания фитоэкдистероидов в новом продуценте Silene colpophylla Wrigley / А. А. Селиверстова (Бадулина), Л. Н. Зибарева // Физиология растений и микроорганизмов : сборник материалов Всероссийской научной конференции. - Томск, 2013. - С. 142-143. - 0,12 / 0,06 пл.

9. Zibareva, L. Effect of ultrasonic radiation on the completeness of the phytoecdysteroids extraction / L. Zibareva, O. Volkova, A. Badulina, E. Filonenko // Trends in Natural Products Research : International Conference, Olomouc, Czech Republic (Phytochemical Society of Europe, Palacky University Olomouc), 2014. -Olomouc, 2014. - P. 129. - 0,1 / 0,03 пл.

а

Подписано в печать 17.102014 г. Формат А4/2. Ризография Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 15/10-14 Отпечатано в ООО «Позитив-НБ» 634050 г. Томск, пр. Ленина 34а