Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Скрининг гена лейкоцитарной адгезии (BLAD-синдром) у животных черно-пестрого корня крупного рогатого скота

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Скрининг гена лейкоцитарной адгезии (BLAD-синдром) у животных черно-пестрого корня крупного рогатого скота"

V" 4

'о л

а

\Ь '

мя правах рукоящи

ИГНАТЬЕВ ВЛАДИМИР МИХАИЛОВИЧ

СКРИНИНГ ГЕНА ЛЕЙКОЦИТАРНОЙ АДГЕЗИИ (ПЬ АО-СИНД РОМ) у ЖИВОТНЫХ ЧЕРНО-ПЕСТРОГО КОРНЯ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

03.00.33 - Бнотезкологш;

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на ссжснакна учвяой стюгяня кандидата бяояоптчвсжкх лзуг

п.Дубровицы, Московская области ' 1998

Рябота выполнен* ьо Всероссийском тучио-исследоватсльском ивсппуга

«эиотноводсгаа

Научный руководитель: доктор бкологичесюся наук, профессор Н.С. КЦмано®

Официальные оппоненты:

доктор биологическое мук. профессор И Я Шихов кандидат биологически* наук, доцент Л .Ф. Новикова

Ведупця организация: Всероссийский н1учно-нсследоаательский

институт племенного дела

Защита диссертации состоится 19 января 1999 г в 10 часов но заседании диссертационного совета Д 020.16.02. при Всероссийском научно» исследовательской институте животноводства.

Адрес института : 142012, Московская облает». Подольский район, пос. Дуброаицы.

С диссертацией ы^жно ознакомиться к библиотеке ВИЖа. Автореферат разослан/^* декабря 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических на;

В.П. Губанова

судлрствеиная

библпотгкл__1 J

$ Y 3 У 1 .Общая характеристика работы

Актуальность темы. У различных видов п пород крупного рогатого сгота описано более 200 наследственных заболеваний (Lidauor, 1992). Точность диагностики многих из них значительно повысилась благодари достнаениям молекулярной генетики, развитию мояехулярно-гелетичесяих методов регистрации полиморфных локусов ДНК и мутационных изменений, созданию эффективных ДНК-диагностичоских процедур (Евграфов О.В., 1992; Горбунова D.H., Баранов B.C., 1997)

В литературе огранена большая группа молекул клеточной адгезии, вызывающих морфологические изменения в раннем эмбриогенезе и в органо • н гистогвнозе (Боценовский В.А., Барышников А.Ю., 1994). Их принято долнть на 4 суперсемейства: селек-типы, иммуноглобулины, аадхерины и интегрииы. Особую роль играют интегрииы - поверхностные клеточные белки, запускающие адгезию клеток путйм взаимодействия с различными белками мат-рихса. Они обеспечивают интеграцию un иду внутриклеточным цк-тоскелетопом л экстрацолямляриым ыатриксом. Интегрииы лейкоцитов, как и другие молекулы адгезии, играют пндушую роль в осуществлении впягиейших функций лейкоцитов. Прежде всего, это миграция лейкоцитов и» кровп в ткани, агрегация тромбоцитов, иммунологические процессы, восстановлении тканей при ранениях, радо процессов дифференцировки.

Дефицит лейкоцитарной адгезии (Bovine Leucocyte Adhesion Deficiency), или BLAD-синдром крупного рогатого » скота наследственная яутосомная болезнь роцессивного тип и обусловленная точковой мутацией в гене, иодирующем CD 18 (бета-субъединицп бета-два иитвгрииа), что приводит х замене аспарагиновой кислоты на гдицнн в 128 пояснении (D1280 аллель). Данное заболевание ранее было установлено как синдром гранулоцитопатии крупного рогатого скота и получило название болезнь Такахашн - Хагемозера (Hagernosor et al., 1983; Takahashi et al., 1987).

Мутация я гомозиготном состоянии обуславливает резкое снижение устойчивости телят к бактериальным инфекциям. Впервые это заболевание обнаружили у прямых потомков знаменитых американских быков - родоначальников голштинской породы (Kehrli et al., 1990; Giobet et al.. 1992) В США носителями данного аллеля являются 15% быков-производителей и маточного

поголовья скота. Ежегодный экономический ущерб от этого заболевания в США определяют в пределах 5 млн. долларов (Sliustcr et al.. 1992)

В большинстве развитых стран Европы и Америки созданы специальный лрогрздемы по снижению частоты встречаемости аллеля BLAD-синдрома в популяциях скота черно-пестрой породы (Kehrli et al.. ' 1990; Shuster et al., 1992; Agerholm et al., 1993;

Tammen, 1994). Выдающихся быков и реыонткый молодняк проверяют на носктельства мутантного гена, а результаты регулярно публикуют б каталогах по племенным быкам.

Цель и гадачи исследований. Целью данной работы жал«етс£ определение гена BLAD-снндрома у ч8рно-пестрогс корня крупного рогатого vKora, установление частоты его встречаемости» оценка генеалогии различных быков-проязэоднтелей носителей денного гена, определение продуктивности дочерей быкож-косятеясй BLAD.

Для риШОННА HOCl'ttBUCHHUX УЙДИЧ Gu.'iO HVOOXOiUiUUi

1. Разработать оптимальный режим выделения ДНК дня последующего выполнения ПЦР на BLAD.

2. Провести характеристику чбрко-пйсгрого корня крупного рогатого скота по частотам встречаемости мутантного алдеза 012SO к гекотнлов в яокусо Вг интггркна.

3.Дат! характеристику родословных йыког^поомэбоднтелей носителей рсяеесивного геий 8LAD.

4. Выполнить статистически® расчеты с целькз оц®кгсн бмков-проиэаодителеД носителей BLA.D по молочной продуктивности дочерей, связи с индексом лясмгтшоЙ цсииосгя.

Научной яизнзиа к зректическак «ййчимосгь работы. Впервые в условиях Российской Федерации вшгэлеио нссителйстьо мутантного reua BLAD-снндрома, Коектелжьш оказались бмкк-г.ронзводнтеян, постуияышн» а кашу страну ич Германия, Канады и США, а также одно хивоткос отечественной селекции. Носителями гена BLAD охазалнсь быкк-нреизводитеяи, прямые потомки одного из лидеров голштикской пороки быка Ссборндэйл Айвенго 1189879.

Положении, сыносимы« на защиту. Разработка режима ПЦР для вызглеиня гена BLAD-снндрома. Анализ родословных выдающихся быков-производктеяей носителей гена BLAD и продуктивности их дочерей.

Публикация материалов. По материалам диссертации опубликовано 2 научные работы.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы обсуадаяись при рассмотрении годовых отчетов на заседаниях отдела сертификации и эколого-генетическнх исследований, Ученого Совета ВНИИ животноводства в 19961998гг.. а такие на конференции аспирантов и молодых ученых ВНИИЖ, 1998г. Часть полученных материалов диссертации были "-представлены на научно-практической юбилейной конференции, посвященной 40-летию образования Молдавского НИИ животноводства и ветеринарии. Кишинев, 1997.

Объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, обсуждения, выводов, практических предложений,

спнскс литературы. Материал нзлоэен на ...... страницах

машинописного текста, содержит 7 тпблнп, 14 рксункое, 3 диатраммы. Список литературы вклгочвет 155 источников, в тем числе 131 на иностранных языках.

2. Материал и методы исследований Исследования проводили в лаборатории генэтпкн мпвотпых, отдела биотехнология Всероссийского НИИ кявотноводствн, а тшека в Института разведение н гинатяки аивотямх (Ганновер, ФРГ) сопнестно о к.5 ». Л.К. Поповым, к б.п. Н.А.Зиновьевой, доктором вотерпнарных наук Б. Харляциус (ФРГ), по слпдующзй еяеив (.ряс.}).

Взятки образцов крови и спермы

В ы л е л с к н аД11

[ Проведения"

Подбор специфических онигонукавотндм ы к прайиороаи оптимизация рлагимв ^ампл чфи ешщп

Первэсвмданкв ДНК

РестригтныЯ анализ Тв9-1 м Иве III дло разрезания участка ДНК, содержащий нужный фрагмент

Электрофорез я агчрозном геле, длл вышпаняи определенного фрагмента, соответстэугощего участку ДНК в норме и при иллинии мутзнтко_го гена ВЬАР

Аттестация животных чёрно-пёстрого корня крупного рогатого скота на носительство гена ВЬАО-сяидрома (п«17й). Установление частоты встречаемости алделей я генотипов с ВЬАО. Анализ родословных быков-лроизводктолек носителей ВЬАО. Выполнение статистических расчетов с целью оцелки быков-производителей носителей ВЬАО по молочной продуктивности дочерей (п~48б), связи с индексом -племенной ценности

Рисунок 1. Общая схема исследований

Согласна схеме исследований (ркс.1) отбор образцов крови и спермы осуществляли из ыатерналоп, поступавших в лабораторию

генетики енвотных ВНИИ животноводства, из Центральной станции искусственного осеменения (п.Быково Подольского района Московской области). Исследованы образцы крови, свезвелолученной н тлубокоэамороженной спермы, взятых от 176 яквотных черно-песгрого скота. Кровь и сперму хранили при температуре - 20 С в стеклянных и пластмассовых флаконах.

Для выявления носителей ыутантного теиа ВЬАО-снндром* использовали 2 типа праймероэ ( I и II ) по методу 31ш81сг е1 а1. (1992) с некоторыми модификациями. Оба типа праймеров подбирали к фрагменту ДНК, включающему в себя позицию 383, изменения в которой приводят к замене аденнна па гуанин (рис 2), что и является генетической основой ВЬАР ( Б)ш81 сг е1 а!., 1992).

нормальный an,иль (D 13S):

361 366 379 383 387

1 Í 5\ // • - AÜG Q-CC---П - - - АТ-С G АС CTG - // - 3-Аяр'"4

мутантпный аллель (D ¡28Q):

361 366 379 383 387

1 1 5' -// - - AGG G*CC---// - 1 1 1 - -АТС GCi"C CTG - • У/ - 3* Gly1J*

Рисунок 2. Участок ДНК крупного рогатого скота в корме и при наличии мутантного гена BLAD.

Праймеры типа I имели следующую последовательность! 5'-GAO GTC АТС САС CAT CGA GT-3; 5-ОТС AGG CA G TTG СОТ ТС А А-3' (соответственно Ivan 2 и Ivan3) (Tamman, 1994). Праймеры типа I синтезировали на ДНК/РНК синтезаторе - Модель 392 (Applied Biosystems, Вайтерштадт, ФРГ ) в отделе разведения я генетики животных Ветеринарного института (зав. отделом, д.в.н, Б.Харлициус) (Ганновер, ФРГ). Праймеры типа И были изготовлены Н.А.Зиновьевой в отделе биотехнологии животных НИИ аграрной биотехнологии (зав.отделом, профессор Г.Брем) (Австрия) и имели последовательность: "12.4" 5-GCC A AG GGC 'ГАС ССС АТС -3"; "12.5" 5' -GGA GTA GCT GCT ТСС ТСА CCA ATG -С- 3'. Смесь для Г1ЦР-анализа содержала 100 нг препарата ДНК, 0,4 мкМ каждого типа проймера, 1х ПЦР- буфера, по 200 мкМ/мл дезокси-нуклеотидтрнфосфатов, а также по 0,3...0,5 U Taq I, 1,5 мМ MgClj. ЛЦР-анализ проводили в объеме 25 мл в термоциклере фирмы "CyeloTemp" (Москва). Число циклов - 35 при режиме: 5 мин94° С, -

жзпатураяия ; 10 циклов по 30 сек 94* С (60 сек 56° С) 30 сек 72° С; 25 кнелов по 30 сек 90® С (60 сея 56я С) 30 сек 72" С - отаиг праЛмеров я 3 мин 72® С ' элонгацна. По 5 шел смеси бралн па рестрнхпнонлый анализ. Для выявление носителей мутапяи BLAD (шля пепользеъаим рестрнктазы HaeîII и Taq I. При использовании праймеров тшто И, состав реакционной смеси остаяолса стандартным. Электрофорез проводили а 4%-м агароэном геяе. Прп этом ПЦР-прояукты бнлн разделены на три частя перед рестрякяяояяыи анализом: 1- не обработенныИ ферментами; 2-оброботеняый ферментом: Taq Î; 3- обработанный ферментом Ha<s III. D качестве контроля использовали образцы ДНК от двух животнм.ч соответственно гомозиготных и гетерозиготных по данному рецессивному гену из отдела разведения к генетики местных (Ганновер, Германия}, яюбезпо предоставленные доктором Барбарой Харлнынус. Оценку результатов электрофореза проводили после окрашивания гелей бромнетыы зтмднем под ультрафиолетовым излучением на трансилдюмннаюре,

Цифровые материалы обрабатывали по формулам, описании?* Плохяяскнм Н,А.(1978), Марэаповым Н.С. (1991) с применением общепртипых программ персонального компьютера ГОМ PC.

Результаты собс7з«мнь<х исследований

Исследовали образны крови, свеаеполучеяпуто и глуСокозаморо-аеннум сперму, взятую от 176 животных черно-пестрого корн* крупного рогатого скота. Для экстракция ДНК использовали пробы крокн, защищенные от свертывания путей добавлений копс^рваип широко используемого для изучения групп epos« различных видов ггнвотныя. С нельк» выделения ДНК яз зеровл к спермы билл апробированы 4 метода: фенояьио-хлороформовий (Blin, SlafFurd (1976) в модификации Aueubel et al. (1987), солевой экстракции (Miller et al.,1988) я Кавасаки (1990), я из спермы модифицированный методы et al. (1988).

3.1. Лрнменвнме ПЦР-анализа для выявления гена BLAD-синдрома с использованием прайысроа Ivan2 и lvon3

Материалом для ПЦР служили кровь и сперма крупного рогатого скота. Забор исследуемого материала производили а стерильные пробирки. Для проведения реакций использовали препиэионный программируемый термостат "Cyclo Temp 106".

После проведения ПЦР, win доказательства наличия мутация, ампликопы обрабатывали рсстрнктаэамя Taq 3 н HaeîII, которые раэреэиют ГЩР-продукт в различных местах а зависимости от мугапии (рис 5).

»

1.ПЦР-

IV? П2

101 пи

2.0бработка реотркктазами: нормальный еллоль Taql*"

Haelll

52 ни .32 пн ,17пн 65пн 36 nil "......I -

иутептыый вллель

Taql 84 пи

17пк

nj

НаеШ""»

4бпн 19ян 36 пн —}

Рисунок 3. Лгарозный электрофор*^ адявл*й CD1S (DI28 к D12SG) после амплификации прайм»рами. Ivan-2 и Jvan-3 и обработки Taq 1-й НаеШ - рв^трикпхаэами; пн-нар нукп«огпидо£

Примечание; *- в этом участке при муташш разрушается сайт рестрикция для Teql;

з этом участке при мутации возникает дополнительный сайт рестрикции для НаеШ.

При использовании праймеров Ivan 2 я Ivan3 амплифнцируется 101 пара оснований ПЦР-продукта. После обработки рестрнктазой Нас III, амиллхон здоровых животных расщеплялся па 2 фрагмента 65 р 36 пар оснований, и соответственно 52, 32 я 17 пар оснований после обработки Tnq I (рнс.З).

У гомозиготного по BLAD-гену, после воздействия Нае III, ДНК расщеплялась ухе на 3 фрагмента - 19, 36 и 46 пар оснований. Как показал проводимый анализ в результате замены нуклеотндной последовательности в кодирующей части гена адещша на гуанин в 383 положении, возникает последовательность нуклеотидов гуанин-гуаннн-гштозин-цитозин, являющийся сайтом воздействия рестриктазы НаеШ, что проявляется в появлении дополнительного фрагмента, выявляемого при электрофорезе. Участок амллнкона нормального алиеля размером в 65 ни, у мутонтного аллеля расщепляется рестриктазой на 2 фрагмента в 46 н 19 пн.

После инкубации с Taq I. иутаятпый аллель расщепляло* только на 2 фрагмента, содержавших 84 и 17 пер нужлеотндов в кандон, тогда как нормальный пллель - на 3 фрагмента. Следовательно в результате мутация, исчезает сайт рестрнкпин Тоц 1, У нормального аллеая последовательность лукдеотидов зыгдядлт следующим образом; тншш-цнтозни-гувнин-адопин (в поргпке 370383 включительно), являющийся сайтом рестрикции для Та$ 1.

На электрофореграмме наглядно представлены результаты проведенного электрофореза (рис. 4).

Рисунок 4, Результаты электрофореза в 4И агароунон г*лв при применении прайм*pot Jvan 3 н Ivan 3

3L - гетерозиготная особь; TL - Здоровов гомозиготное животное;

U -Контрольная полоса, амляикон a JOJ пн не обработанный рестриктоэами

PBR 322- стандарт молекулярной массы (плазмчда P3R322 обработанная НаеШ ).

В случае яосительства BLAD, мутация в гене светила с заменой йденнна иа гуанин. Возникает нова« последовательность, я результате которой, естественный сайт рестрикции при муташт исчезает н Taq 1 не способен распознать этот участок. ДНК у носителей гетерозиготного гена содержало see фрагменты, выявляемые как у здоровых огобей, так н у больных, гомозиготных по BLAD янвотных в результате обработки Taq I- я Нас III-ферментамя.

3.2. Применение ПЦР-аналмза для выявления гона BLAD-емндроыа с использованием прайцороэ 12.4 и 12.5

При использовании праймеро» 12.4 и 12.5, для доказательства мутации, мы применяли также рестрпхтиый анализ с помощью Taq 1 и Нае III (рис 5).

1.ПДР J2J 12.

152 mi

2. Обработке р«страктазаыв>

нормальный МЛЛФЛЬ

Taql* НаеШ

134 пп 18пк 25 пп ЮЗпн 24пн

................,„ II III A I Tlj | ....... .it ............1

мутнытыый яллель

Taql НаеШ"" 152 лн 25пн 83пн 20пн 24пн --1 1 I ---1

Toqt Hae III Т/СОА GO/CC Taql Нав III T/CGA QQ/CC

152 пн -

134 пк - -

103 пн - -

S3 пн -

25 пв t -

24 пк - -

20 пн -

18 пн - -

— ненослтень (TL) D128 D123 носитель (BL) D128 D128G

Рисунок 5 . Агарозний адектрофореэ аллеяей CD18 (D128 и D128Q) пост амплификации праймврами'Ч2.4'} и "12.5" и обработки Taq 1-й Ha б III - рестрикюилзами; пн-цар иуклеотидов

Примечание: * - е атом участке при мутации разрушается сайт рестрикции для Taql; •*- в этом участке при мутации возникает дополнительный сайт рестрикции дня HaeJII.

При использовании праймеров 12.4 и 12.5 (ряо. 5) продукт ПЦР состоял из 152 пар нукдеотидов. В случае рестрикции ДНК Нас Ш у здоровых аивотных (некосителей) выявлены фрагменты длиной 103, 25 и 24 пар нукдеотидов, у гетерозиготных особей (носителей няк BL) появлялись дополнительные полосы соответствующие фрагментам длиной с 83 я 20 пар нукиеогндов. Что указывает я« появление нового сайта рестрикции. В мутированном аллеле 2 фрагмента 83 к 20 пи соответствуют исходному фрагменту нормальной аллели размером 103 пн.

При обработке Taq 1 у здоровых животных отмечено наличие 2-я фрагментов длиной 134 и 1В пар нухлеотидов, тогда как у носителей данной мутация появляется дополнительный фрагмент размер которого соответствовал 152 парам оснований. При наличии BLAD-мутацни у животных сайты рестрикции по Taq I отсутствовали. Оба подхода свидетельствуют о возникновении нового сайта рестрикции Нее Ш и элиминацией точки рестрикции Taq 1.

Проведенный сравнительный анализ двух типов праймеров (тип I, II) показал, что применение праймеров 12.4 и 12.5 давали лучшие результаты в двух случаях. Во-первых, получаемые фрагменты были более крупные, а следовательно, более четкие и хорошо видны на реакционном поле. Во-вторых, большая величина фрагментов способствовала более ускоренному завершению проводимого электрофореза.

3.3. Анализ родословных быков-производителей носителей гена В1.АО-синдром

Быка голштинской породы Осборндэйл Айвоиго 1189870, голландского происхождения, родившегося в 1952 году, считали выдающимся производителем. Спустя 40 лет, когда стало известно, что он является носителем гена ВЬАО-синдрома, его наследственный материал оказался широко распространенным среди черно-пестрых л храсно-п-гтрых пород крупного рогатого скота.

В настоящее время геи ВЬАО диагностирован во многих стрелах мира, где широко используются черно- и краен о-пестрые популяции высокомолочного скота. В таблице 1 приведены частоты встречаемости гена ВЬАО в некоторых странах мира в сравнении с собственными данными.

Таблица!,

Частота встречаемости г»во ВЬАБ в популяциях чорио-яестраго скоте а некоторых развитых страняЕ мира

Страна Половозрастная группа кивотиых Частота встречаемости {Ю Число иссдедоваиямх кнвоткых (гол.)

Двянж (Алоп, 1993) телята 22,6 1991

Германия (Оиенпая «1 о1., 1994): быки- производитвли <5 665

/иод, 1998 быкл ч4рно- пестрой породы 6,4 3076

быки красно- лйстрой породы 1.9 484

США (81иШег «1 &1„ 1992) племенные быки 14,1 2025

100 лучших быков США 17,1 100

популяция короа 17 1559

Чехи* (Нга<Ш. 3994) быки коровы б 377 61

Польша (1л»Ыеп1есЫ Я п1., 19$7) быкл • 5' 16В0

Украина (Гааз*о, 1997) быки 3 190

Россия (Собственные даяние) быки коровы обшее 5.6 6.7 5,7 161 И 176

В США 14,1% пламенных быков ( п«2025 ), а такие 17.1% яэ 100 самых л учтя я быков и 3.8И исследованной популяции коров (п™1559) оценены хах гетерозитоты. Проявление ВЬАО у родившихся телят лпходитс» в про девах 0,2%. В июле 1993 среди 100 лучших быков свыше 16% яап&дясь гетерозитотами ( Ргтк, ' 1994). Оиовтяп о1.,а1. ( 1994 ) » Германии при обследовании 665 быхов-про'иаводктеяей обнаружив среди яих 6% гвтероэпгот. И в этом случай»' г^торозиготные ппемвяяые быки продолжали слврл»

ваться о высокопродуктивными коровами в не контролируемых популяциях (Талипсп, 1994).

Наибольшая частота встречаемости BLAD-мутацни наблюдается а Данин (22,6%). Следует учесть, что в этой стране исследовались только телята среди которых, как известно, большая вероятность проявления дефектного гена. Согласно последним данным нэ Германии ( Zuchtwertschatznng, 1998), встречаемость генп BLAD составляет 6,4%, во Франции (б%), в Польше (5%), в Чехия (4?-i). На Украине и в России эти цифры состовлшт УЛ н 5,7 %. При этом нужно учитывать, что как в России, так и на Украине в настоящее время обследовано незначительное количество животных, что ns позволяет достоверно судить о распространении гене BLAD в России.

Поело проведения анализа родословных быкоь-пронэводителей, основным распространителей BLAD в мире, а также в России п Украине оказался американский голгатипский бык-производитель из родственной группы Осборндейл-Айвенго 1189870 - бык Карлин М. Айвенго Бедд 1667366. Использование его сыновей в нашей стране, параллельно с повышением генетического потенциала отечественных сгад» способствовало распространению гена BLAD. По результатам 1989 года Беля находился на 12 месте среди 100 лучших быков США н имел индекс племенной ценности (TPJ), разный +860. Несмотря на свои высокие племенные качества, on оказался носителем гена BLAD-снндрома, унаследованным от отда (рис.б).

Рисунок б.

Схемя родословной быко»-прочио6ителеИ, носителей гена BLAD в Российской Федерации

Осборндейл Айвенго 1189870 Ф

Пенстей? Карлин М. Айвенго Стер Айвенго Белл 1441440 *> 1667366 Ф

Билл 187 *

Диез 1843*

Билл Трой Жордал 1882797 Ф 48" Джесси 1842Э89 Ф

НО-НА-МЕ Ю.М.Георг

Фонд Мат Ф 338561 • Шейк

1392858 15632*

Сад 11*

быки-производитвли носители BLAD

H

Непосредственными его потомкам» оказались 2 его сына (Бнлл 187 и Днез 1843) л 2 внука (Жордан 48 и Сад 11). Шейк 15632 не является его потомком, муталтный геи он унаследовал от Осбсридейч Айвенго 1189370 через отца Ю.М. Георга 338561.

Носителем тона BLAD также оказался представитель линия Снлкиг Трайджун Рскхнт, бык-пронзводнтедь Жест 750 (рнс.7).

л

Рисунок 7.

Схема роФеелевпеп быкое-произвобитеяей, носителей гена Л LAD в ¡Российской teрении

Склинг Сииппг Райбрук

Трайднуп Ф Рокмэн Ф Старлайт . Ф Жест Ф Жест 750 Рокнт 252803 275932- 308691-241211 502259 МЧП-2538 240753

Жест 750 относится х немецкой черно-пёстрой породе, родился 1 августе 1983 года s "Л'РГ. Имеет 7/8 годппнно-фриэкой крови. Относится к клегсу эзяте-рскорд. Жквая мпсса в 2 года Î нес." составляла 710 кг. Его отцом является бык Жеот 502259, а матерью Никоя 3265711 1981 года рождения с удоем 9518 кг за 305 дней льктапин при анркомолочпостн 4,19 %. Никол 3265711 превосходила по удою свою мать Няни 534969 у которой удой составляя 7891 кг жирностью молока 4,47 Обе коровы относились к классу элита -рекорд. Эта инняя связана с линией Монтвнк Чифтейн через отаа матери Пенстейт Айвенго Стар-1441440, который является прямым потомком Осборндейл Айвенго я носителем ггне BLAD.

В яинин У ее Идеал обнаружен носитель гена BLAD, ям оказался Код 189 (рис 8).

Рисунок 8.

Схем« родословной 6ыко*-прои} водителей* носителей гене

BL/W> а Российской Федерации

У ее Скуй Эстем Скуй Веллн Пакламар

Идеал t> Сам Фесга Бугмакер«^ Л.Колумб Ф Код

933122 134434S Дубль 1450228 1724657 189

1396385

Код 189 родился 11 лвд!« 1984 в Канаде. В возрасте 2 года 4 месяца ого живая масса била относительно невысока - 650 кг. Его отцом являете» лучший бык Лнтфильд Колумбус ET 1724657 (индекс племенной ценности Солее +500 кг) из лянин Бутмайкера, входящий в список S Я» лучших быков. Мать Коде 189, Элен Дейри Гкаморас Айьи 8696;)<!í> ьмсяп продуктивность 11399 кг молока с

содержанием жира 4,1 se 3 05 дней лактации. Она является дочерыо быка Осборндейл Айвенго 118970. Как я Жест 730, Код 189 унаследовал геи BLAD через м&терннскою сторону родословной, позтому проверять на носктсльство re«s BLAD нужно не только быков, но и коров быколроизводящен группы

3.4, Миграция и поток гвнз BLAD

Ген BLAD являясь «шлейфом» высокой молочности распространился по всему миру. На рисунке 10 представлены основные пути поступления в Россию >того гена.

Рисунок 10. Поступлений в Россию гена BLAD-синдрома ,

Все быки, являющиеся носителями гена D128Q, поступили из-за рубежа. Наибольшее количество племенного материала, в том числе н гена BLAD, поступило из Канады (бь:кп Вилл 187, Код 189, Жордан 48, Шейк 15632 ), из США (быки Днез 1843 и Сад И), из Германии (Жест 750).

Проведенный анализ свидетельствует, что имеющийся а черно-пестрой популяции мутантный ген BLAD связан с завозом быков-производителей-носителей, являющихся прямыми потомками Осборндейл Айвенго. Животные-носители BLAD поступили в Российскую Федерацию в середине 80-х годов, т.е. до разработки метода ДНК-диагностики.

Миграция гена BLAD в популяциях отечественного, скота осуществляется в процессе приобретения племенного материала (закупка животных, замороженного семени или змбрнонов).

Поэтому при покупхе нлвотиых из этих стран следует ocoöoo внимание уделить диагностике носктеяьствй генов наследственная заболеваний и ь частности BLAD,

3.5.Характеристика продуктивности дочерей быкоэ-производнтелей, носителей гене В LAD

В тебл.2 представлена характеристике продуктивности дочерей быков гетерозиготных по BLAD, используемых на Центральной станции искусственного осеменения (ЦСИО).

Таблиц 2.

Малочи©я продуктивность дочерей быкоЕ-пропзводат#лсй, иосвт«лей reue BLAD

Клички быков Кол-во дочерей Показатели признака Дата завозе ET

Удоя % пира ± по удою ± по ииру ± по моп. ВИРХ- Категория

Жест 30 5421 4,04 +39 5 •0,02 + 15,2 А, 12.01.85 -

Жордан 206 5461 3.73 +203 40.01 +8.0 А| 12.09.89 ET

Диез 110 5535 3,75 +214 +0,03 + 9,8 А, 14.08.90 ET

Сод 18 5252 3,69 +276 -0,07 +7.6 А. 14.08.90 ET

Шейк 32 5398 3,97 +111 -0.02 -3,4 А, 28.04.87 -

Била 70 4477 3,85 +165 -0,01 +6.0 24.05.86 LfT

Код 20 4614 4,04 +52 +0.10 +6,7 Б, 24 05.86 -

Примечание: ЕТ- бык получен эм6риоп«р>>садкой

Наибольший удой имеют дочери Днеза (5535 кг). Жордана (2461 кг), Жеста (542J кг). Шейка (5398 кг) и Сада (5252 кг), а удой дочерей Билла (4477 кг) и Кода (4614 кг) значительно ниже. Вместе с тем потомки Кода отличаются высоким содержанием икра в молоке (4,04%) и он является улучшателем по агкриомолочности (+0,10%), имея категорию Б! Высокая племенная ценность Жеста 750 по удою (+395 кг) обеспечивала высокую племенную ценность по продукции молочного жира (+15.2 кг), а его ухудшающий эффект по содержанию жира в молоке (-0,02 %) был минимален. Поэтому он имел самый длительный период использования. Последние поступления быков, носителей гена BLAD, были в августе 1990 1°ода (Диез н Сад). По племенной ценности удоя они уступают лишь .Жесту (соответственно +214 кг н +276 jcr). Сад. являясь

улучкгателем по удою, одновременно сннягаег киряомодочность дочерей, из -0,07%..

Быки- производители, имеющие з геноме мутантный ген ВЬАВ, зачастую жалятся улу-отателяии по признакам молочной продуктивности. Это способствует распространению гена ВЬАО в популяякяя крупного рогатого скота ч4рно-паетрого корня, что, а свою очередь, требует четкой организации работ по диагностике яаскедсхвекннх заболеваний.

ВЫВОДЫ

7. Впервые в условиях Российской Федерации выявлено нос::тсльство мутантаого гена ВЬАО-сикдрома. Носителями охпзаяясь быкн-г.ронззодитегш, прямив потомки бккв-лидера гслишгасхоЯ породы Осборкяэйл Айвенго ¿185870, родлэшегося г Голландии 25 апреля 1952 года, к поступивши» з гашу страну из Германки, Канады и США. ■

2. Аттестация 176 голов чгрно-лсетрого корил методом ПЦР-аиалнза иа носнтельство геаа ВЬАО-синдрома показала «го наличие у 9 быхо»- производителей и одной коровы или у 5,7 % от тесла зсязотпых в исследованной группе.

3. Результаты проведенных исследований выглядели следующим образом: 166 агизотиых оказались гомозиготами по 0128 тепу (пеыссители), а 10 особей - гетерознготами (носителя?«) я имели ггкотпп 0123/01280. Частота встр$чаемости гека ВЬАЮ по исследованной популяции составила 0,0284. Гомозиготные особк по гаку Б1230 з исследованной популяции отсутствовали. что, возможно связало с анализом только взрослых животных, а гомозиготы по рецессивному гену погибают как известно почти полностью з молодом возрасте.

4.Распространение гена ВЬАО происходит в.равной стглеии как по материнской так я по отцовской линии. Бык Код 139 получил этот ген через свою мать, Эден Дейрн Гламорас Айви 8696068, которая была дочерью Осборндейд Айвенго. Бык Жест 750 унаследовал этот ген также через мать Никол 3265711, которая являлась дочерью Пенстсйт Айвенго Стар 1441440.

5. Анализ трех методов выделения ДНК из крови показал, что метод солевой экстракции ДНК не требует использования вредного для здоровья реактива фенола. Применение метода солевой экстракции позволяет добиться выделения высокомолекулярной ДНК (20-50кЬ) и высокой степени ее очистки, Недостатком метода Кавасаки является то, чю им невозможно выделение фрагментов ДНК дляной более 20 пи.

6. Сравнительный анализ использования двух типов праймеров показал, что применение праймеров. типа И дает лучшие результаты в двух случаях. Во-лервых, получаемые фрагменты более крупные, а следовательно, более чбткие и хорошо видны

не ре&хдяонном поле. Во-вторых, большая величина фрагментов способствует ускоренному завершению электрофореза.

7. В исследованиях установлено, что из всех быков-производнгелей носителей мутвнтного гена ВЬАО по индексу племенной пенностп 4 были категории А|, два других соответственно Аа и А5 т.е. улучшателямн по молочной продуктивности, тогда как 7-й - улучшателем по жиру(Б|).

Практически« приложение

Не основании статья 19 Федерального закона «О племенном животноводстве» от 1995 года рекомендуем проводить сертификацию элитпых быков-пропзюдителей, быкопроизводящих коров и племенного молодняка крупного рогатого скоте черно-пестрого корпя на носитель«»© гена BLAD-синдроив с помощью ПЦР, во избежание широкого распространения дефектного ал л е ля.

Список опубликованных работ

1,Марзанов Н.С., Попов А.Ы., Полежаева В.А.. Игнатьев В.М., Брем Г. Скрининг BLAD-синдрома у животных ч<рно-п4строго корня // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. -1997. -J&4.-C.59-61.

2.Попов А.Н., Мирэаяо» И.О., Зиновьева H.A., Брем Г., Полежаева В.А., Игнатьев В.М. Диагностика носнтельства гена BLAD-синдрома у быков черно-пестрого корня // Труды научно-практической юбилейной конференции, посвяшенкой 40-летию образования Молдавского НИИ животноводства к ветеринарии. Кишинев. - 1997, -С.40.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Игнатьев, Владимир Михайлович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1» Обзор литературы

1.1.Молекулы клеточной адгезии человека и животных

1.2.Суперсемейство ееяектинов

1.3. Суперсемейство иммуноглобулинов

1.4.Суперсемейство кадхеринов

1.5. Суперсемейство интегринов

1.5.1. /^-семейство

1.5.2. Дг-семейство

1.5.3. ßz- семейство

1.5.4. Лиганды интегриновых молекул

1.5.5. Регуляция экспрессии интегриновых молекул

1.5.6. Сигнальные функции интегринов

1.6.Дефицит лейкоцитарной адгезии у человека (LAD- 21 синдром), собак, мышей

1.7.Дефицит лейкоцитарной адгезии (BLAD-синдром) у черно- 25 пестрого корня крупного рогатого скота

1.8. Наследование гена В LAD и краткая характеристика его 30 распространения

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований

ГЛАВА 3, Результаты собственных исследований

3.1 .Реактивы для выделения ДНК и проведения ГЕЦР

3.2. При боры и материалы

3.3. Буферы и растворители

3.4.Методы выделения ДНК

3.4.1.Фенольно-хлороформовый метод

3.4.2,Метод солевой экстракции

3.4.3,Метод Кавасаки

3.4.4.Метод выделения ДНК из спермы

3.5. Анализ методов выделения ДНК

3.6. Определение концентрации ДНК

3.7. ПЦР-анализ с различимый тинами праймеров для диагностики гена ВЬ АО-синдрома у черно-пестрого корня крупного рогатого скота

3.7.1 .Применение ПЦР-анализ а для выявления гена ВЬАВ-синдрома с использованием праймеров 1уан2 и 1уапЗ

3.7.2.Применение ПЦР-анализа для выявления гена ВЬАХ)-синдрома с использованием праймеров 12.4 и 12.

3.8. Миграция и поток гена ВЬАБ в популяциях черно-пестрого корня крупного рогатого скота в различных странах 53 мира

3.9.Анализ родословных быков-производителей носителей гена ВЬ А»-синдром 58 ЗЛО. Характеристика продуктивности дочерей быков-произво- 69 дителей, носителей гена ВЬАО

ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Скрининг гена лейкоцитарной адгезии (BLAD-синдром) у животных черно-пестрого корня крупного рогатого скота"

Актуальность темы- У различных видов и пород крупного рогатого скота описано более 200 наследственных заболеваний (Lidauer, 1992). Быстрота и точность диагностики многих из них значительно повысилась благодаря достижениям молекулярной генетики, развитию молекулярно-генетических методов регистрации полиморфных локусов ДНК и мутационных изменений;, созданию эффективных ДНК-диагностических процедур (Евграфов О,В., 1992; Горбунова В.Н.» Баранов В,С,, 1997),

В литературе отражена большая группа молекул клеточной адгезии. вызывающих морфологические изменения в раннем эмбриогенезе и в орган о - к гистогенезе (Боценовский В.А., Барышников А,Ю,, 1994). Их принято делить на. 4 супереемейства: ее-лектины, иммуноглобулины,, кадхерины и интегрины. Особую роль играют интегрины - поверхностные клеточные белки, запускающие адгезию клеток путём взаимодействия с различными белками матрнкса, Они обеспечивают интеграцию между внутриклеточным цитоскелетоном и экстрацеллюляряым матриксом. Интегрины лейкоцитов» как и другие молекулы адгезии» играют ведущую роль в осуществлении важнейших функций лейкоцитов (Bauer-Sic, 1963). Прежде всего, это миграция лейкоцитов из крови в ткани. Интегрины участвуют в агрегации тромбоцитов, иммунологических процессах, восстановление тканей при ранениях, в ряде процессов дкфференцировки, пре- и поотнатальном развитии .

Мутации генов интегринов лежат в основе заболеваний у животных. Дефицит лейкоцитарной адгезии (Bovine Leucocyte Adhesion Deficiency), или BLAD-синдром крупного рогатого скота - наследственная аутосомная болезнь рецессивного типа, обусловленная точковой мутацией в гене, кодирующем CD 18 (бета-субъединица бета-два иитегрииа), что приводит к замене асларагкковой кислоты на глицин в 128 положении (D128G аллель), Данное заболевание ранее было установлено как синдром грану-лоцитопатии крупного рогатого скота и получило название болезнь Такахаши - Хагемозера (Hagemoser et al., 1983; Takahashi et al., 1987).

Болезнь - аналог LAD-синдрома человека (Crowley et al., 1980), Данная мутация обуславливает резкое снижение устойчивости телят к бактериальным инфекциям. Впервые это заболевание обнаружили у прямых потомков знаменитых американских быков - родоначальников голштинской породы (Kehrli et al., 1990; Grobet et al., 1992). В США носителями данного аллеля являются 15% быков-производителей и 6*Л маточного поголовья скота. Ежегодный экономический ущерб от этого заболевания в США определяют в пределах 5 млн. долларов (Sinister et al., 1992).

В большинстве развитых стран Европы и Америки созданы специальные программы по снижению частоты встречаемости ал-леля BLAD-синдрома в популяциях скота черно-пестрой породы (Kehrli et al., 1990; Sinister et al., 1992; Agerholm et al., 1993; Tamrnen, 1994). Выдающихся быков и ремонтный молодняк проверяют на носительства мутантного гена, а результаты регулярно публикуют в каталогах по племенным быкам (Bierma et а1.„ 1992),

Цель и задачи исследований. Целью данной работы является определение гена BLAD-синдрома у чёрно-пёстрого корня крупного рогатого скота, установление частоты его встречаемости > оценка генеалогий различных быков-производителей носителей данного гена, определение продуктивности дочерей быков-носитедей BLAD.

Для решения поставленных задач было необходимо:

1. Разработать оптимальный режим выделения ДНК для последующего выполнения ПЦР на BLAD.

2. Провести характеристику чёрно-пёстрого корня крупного рогатого скота по частотам встречаемости мутантного аллеля D128G и генотипов в локусе р2 интегрина,

3. Дать характеристику родословных быков-производителей носителей рецессивного гена BLAD.

4. Выполнить статистические расчеты с целью оценки быков-производителей носителей BLAD по молочной продуктивности дочерей, связи с индексом племенной ценности.

Научная новизна н практическая значимость работы.

Впервые в условиях Российской Федерации выявлено носитель-ство мутантного гена BLAD-синдрома. Носителями оказались быки-производители, поступившие в нашу страну из Германии, Канады и США, а также одна корова отечественной селекции. Носителями гена BLAD оказались быки-производители, прямые потомки одного из лидеров голштинской породы быка Осборндэйл Айвенго 1189879.

Положения, выносимые на защиту. Разработка режима ПЦР для выявления гена BLAD-синдрома. Анализ родословных выдающихся быков-производителей носителей гена BLAD и продуктивности их дочерей.

Публикация материалов. По материалам диссертации опубликовано 2 научные работы.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы обсуждались при рассмотрении годовых отчетов на заседаниях отдела сертификации и зколого-генетических исследований, Ученого Совета ВНИИ животноводства в 1996-1998гг., а также на конференции аспирантов и молодых ученых ВНИИЖ, 1998г. Часть полученных материалов диссертации были представлены на научно-практической юбилейной конференции, посвященной 40-летию образования Молдавского НИИ животноводства и ветеринарии. Кишинев. 1997.

Объем работы. Диссертационная работа состоит из ©ведения, трех глав, обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы. Материал изложен на 96 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц, 13 рисунков, 3 диаграммы. Список литературы включает 155 источников, в том числе Î31 на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Игнатьев, Владимир Михайлович

выводы

1. Впервые в условиях Российской Федерации выявлено носи-тельство мутантного гена ВЬАО-синдрома. Носителями оказались быки-производители, прямые потомки бык а-л и дера голштинской породы Осборндзйл Айвенго 1189870, родившегося в Голландии 26 апреля 1952 года, и поступившие в нашу страну из Германии, Канады и США.

2. Аттестация 176 голов черно-пестрого корня методом ПЦР-анализа на носительство гена ВЬ АО-синдрома показала его наличие у 9 быков- производителей и одной коровы или у 5,7% от числа животных в исследованной группе.

3. Результаты проведенных исследований выглядели следующим образом: 166 животных оказались гомозиготами по 0128 гену (иеносители), а 10 особей - гетерозиготами (носителями) и имели генотип 0128/01280. Частота встречаемости гена ВЪАГ) по исследованной популяции составила 0,0284. Гомозиготные особи по гену 01280 у исследованной популяции отсутствовали, что, возможно связано с анализом только взрослых животных, а гомозиготы по рецессивному гену погибают как известно почти полностью в молодом возрасте.

4. Распространение гена ВЬАО происходит в равной степени как по материнской так и по отцовской линии. Бык Код 189 получил этот ген через свою мать, Эден Дейри Гламорас Айви 8696068, которая была дочерью Осборндейл Айвенго. Бык Жест 750 унаследовал этот ген через мать Никол 3265711, которая являлась дочерью Пенстейт Айвенго Стар 1441440.

5. Анализ трех методов выделения ДНК из крови показал, что метод солевой экстракции ДНК не требует использования вредного для здоровья реактива фенола, Применение метода солевой экстракции позволяет добиться выделения высокомолекулярной ДНК (20-50кЪ) и высокой степени ее очистки. Недостатком метода Кавасаки является то, что им невозможно выделение фрагментов ДНК длиной более 20 пн.

6. Сравнительный анализ по использованию двух типов прай-меров показал, что применение праймеров типа II дает лучшие результаты в двух случаях. Во-первых, получаемые фрагменты более крупные, а следовательно, более чёткие и хорошо видны на реакционном поле. Во-вторых, большая величина фрагментов способствует ускоренному завершению электрофореза.

7. В исследованиях установлено, что из всех быков-производителей носителей мутантного гена ВЬАО по индексу племенной ценности 4 были категории Аь два других соответственно А2 и А3 т.е. улучшателями по молочной продуктивности, тогда как 7-й - улучшателем по жируСБ}).

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании статьи 19 Федерального закона «О племенном животноводстве» от 1995 года рекомендуем проводить сертификацию элитных быков-производителей, быкопроизводящих коров и племенного молодняка крупного рогатого скота черно-пестрого корня на носительство гена ВЬАО-синдрома с помощью ПЦР, во избежание широкого распространения дефектного алле-ля.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Игнатьев, Владимир Михайлович, п. Дубровицы, Московской обл.

1. Баранов B.C. О некоторых успехах и перспективах молекулярной диагностики наиболее распространенных наследственных заболеваний /У Цитология и генетика. -1992, -N.4. С.64-72.

2. V 2. Боценовский В. А.,Барышников А.Ю. Молекулы клеточной адгезии человека // Успехи современной биологии. 1994. -Т.114.- Вып.б.- С.741-753.

3. Вартапетян А.Б. Полимеразная цепная реакция /7 Молекулярная биология. -1991.- Т. 25. N 4. - С.926-936.

4. Глазко В.И.ДНК-технологии животных. Киев,-1997.- 173с.

5. Винничук Д.Т., Созинов A.A. Ген «BLAD» в наследственности голштинского скота /у В1сник аграрной науки. -1994. -N6. -С.44-46.

6. Горбунова В.Н., Баранов B.C. Введение в молекулярну») диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. Санкт-Петербург. Изд-во «Специальная литература», -1997. 286с.

7. Жигачёв А., Богачёва Т., Фогель С. Система контроля за вредными мутациями // Молочное и мясное скотоводство -1998. -N6-7. С.18-21.

8. Ю.Зиновьева H.A., Попов А.Н., Эрнст Л.К., Марзанов Н.С., Боч-карёв В.В., Стрекозов H.H., Брем Г. Методические рекомендации по использованию метода лолимеразной цепной реакции в животноводстве. -1998 47с.

9. П.Зиновьева H.A. Молекулярно-генетические аспекты в решении задач современного животноводства // Автореф.дисс. докт. биол. наук. Дубровицы. -1998.

10. Коствцкий И.Е., Кириленко С.Д., Глазко В.И. Диагностика BLAD у КРС, Тез, Межд, конф. по биотехнол. «М ол екулярно-генетические маркеры животных». Киев. -1997. С. 14.

11. Кузнецов В.М. Статистический анализ родословных // Зоотехния. 1998. -N2. - С.5-8.

12. Логинов Ж.Г. Быки-лидеры голштинской породы в США и Канаде // Зоотехния. =1989. -=N4. -С.75-78.

13. Марзанов Н.С. Иммунология и иммуногенетика овец и коз. Кишинев: Штиинца. 1991.- 237 с.

14. Марзанов Н.С,, Попов А.Н,, Зиновьева H.A., Полежаева В,А.» Игнатьев В.М., Брем Г. Скрининг гена BLAD-синдрома у животных чёрно-пёстрого корня // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. -1997. -№4.-С.59-61.

15. Меркурьева Е.К., Абрамова З.В., Б акай A.B., Кочнш И.И. Генетика. ВО «Агропромиздат». М -1991. -446 с.

16. Плохинский H.A. Математические методы в биологии. М.:МГУ.-1978.-265с.

17. Погребняк В.А. Селекционные аспекты повышения потенциала молочной продуктивности черно-пестрой породы Я Дисс. докт. с.-х. наук. Дубровицы. -1998.

18. Прудов А.И. Оценка генетических и селекционных признаков импортного немецкого чёрно-пёстрого скота // Методы повышення продуктивности повышения с.-х скота, -Саранск, 1982, -С. 17-23.

19. Прудов А,И. Дунин И.М. Использование голштинской породы для интенсификации молочного скота. -М.: «Нива России» « 1992, -191с.

20. Усенбеков Е.С. Генотипирование крупного рогатого скота по локусам каппа-казеина, бета-лактоглобулина и мутации BLAD // Автореф.дисс. канд. биол. наук. Санкт-Петербург-Пушкин.-1995.

21. Эрнст Л.К., Жигачёв А.И., Григорьев Ю.М. Крупномасштабная селекция и инбридинг // Сельскохозяйственная биология1992. N.4. - С.3-9.

22. Agerholm J.S.,Houe Н., Jorgensen С.В., Basse A, Bovine leukocyte adhesion deficiency in danish holstein-friesian cattle. II. Patho-anatomical description of affected calves //Acta vet.scand.1993.- Y.34.- P. 237-243.

23. Ackermarm M. R., Kehrli M. E., Morfitt D. C. Ventral dermatitis and vasculitis in a calf with bovine leukocyte adhesion deficiency // J. Am. Vet. Med. Ass. -1993. -V. 202. -P.413 415.

24. Altieri D. C,, Bader R., M annuo ci P, M,, Edgington T, S. Oligospecificity of the cellular adhesion receptor MAC-1 encompasses an inducible recognition specificity for fibrinogen // J, Cell. Biol. -1988. -V.107.- P.1893- 1900.

25. Altieri D, Q„ Edgington T. S, The saturable high affinity association of factor X to ADP-stimulated monucytes defines anovel function of the MAC-1 receptor // J, Biol, Chem, -1988b, -V, 263.- P.7007-7015.

26. Anderson D, C., Springer T. A. Leukocyte adhesion deficiency; an inherited defect in ine Mac-1, LFA-1 and pl50,95 glycoproteins // Ann. Rev. Med -1987. -V.38. P.175 - 194.

27. Anon. Erbfehler- Was ist Blad? /7 Hann. Land. Forstwirtsch. Ztg. 1991. 11.5.91,

28. Anon. VDS-Beschluß zu BLAD. Ostfr. Landvolk. -1992 -V. -107. P.28.

29. Anon. Was ist BLAD // Weser Ems Zeitung -1992.-V. 1.-S.5.

30. Argenbright L. W., Barton R. W. Interactions of leukocyte integrins with intercellular adhesion molecule 1 in the production of inflammatory vascular injury in vivo it J. Clin. Invesl. -1992.= V. 89.-P.259 272.

31. Arnaout M. A., Pitt J., Cohen H. J., Melamed J., Rosen F. S., Col ten H. R. Deficiency of a granulocyte-membrane glycoprotein (gpl50) in a boy with recurrent bacterial infections. -1982.«V.306. P.693-699.

32. Arnaout M. A., Colten H. R. Complement C3 receptors structure and function // Mol/'Immunol. -1984= -V.2L -PJ191 1199=

33. Arnaout M. A. Leukocyte adhesion molecules deficiency: its structural basis, pathophysiology and implications for modulating the inflammatory response if Immunol. Rev. -1990 .-V. 114. P. 145 - 180.

34. Arnaout M. A. Structure and function of the leukocyte adhesion molecules CD11/CD 18 // Blood. -1990.-V. 75.- P.1037- 1050.

35. Back A. L,4 Kwok W, W., Hickstein D. D. Identification of two molecular defects in a child with leukocyte adherence deficiency // J. Biol. Chiem. 1992.-V. 267. - P.5482 - 5487.

36. Bainton D. F., Kishimoto Т. K., Springer T. A. Leukocyte adhesion receptors are stored in peroxidase-negative granules of human neutrophils if Exp. Med. -1987. -V.166. -P. 1641 1653.

37. Bartholmes A. Zur Ätiologie der Nabelentzundung des neugeborenen Kalbes. Hannover. Tierarztl. Hochsch. Vet.-Med. -1994.

38. Beller D. I., Springer Т. A., Schreiber R. D. Anti-Mac-1 selectively inhibits the mouse and human type three complenent receptor // J. Exp. Med. -1982. -V. 156. -P. 1000 1009.

39. Bierma J. BLAD-Bulls in Europe // Euroworld. -1992.-V.807.-S.l 11.

40. Blin N., Stafford D.W. A general method for isolation of high molecular weight DNA from eucaryotes .// Nucleic. Asids Res.1976/- V,3.- P; 2303-2308.

41. Boichard £>., Ajmigues Y. Investigation on possible linkage beitwechti the ÖLAD gene and a QTL for production or type traits in Holstein cattle if 46th Annual Meeting of the European Association for Anmai Production. Prague. 1995. - P.4-7

42. Bowen T., Ochs H. D., Altman L. C., Price T. H., Van Epps D. E. et al. Severe recurrent bacterial infections assoeitied with defective adherence and chemiotaxis // J. Pediatr. 1982. V. 101. P. 932 940.

43. Boxer L. A., Hedley-Whyte E. T., Stossel T. P. Neutrophil actin dysfunction and abnormal neutrophil behaviour /7 N. Engl. J. Med. -1974. -V.291. -P.1093 1099.

44. Brem G. Neu Wege zur Tiergesundheit-Stand der Biotechnik // Zucht ungskunde.-1992. -V.6. -S.411-422.

45. Buescher» E. S., Gaither T., Nath J.v Callin J. I. Abnormal adherence-related functions of neutrophils, monocytes, and EPSTEIN-BARR virus -trans forme d B cells in a patient with C3bi receptor deficiency if Blood. -1985. -V.65. -P. 1382- 1390.

46. Bullock W, E.h Wright S. D. Role of the adherence-promoting receptors, CR3, LFA-1 and pl50,95 in binding of Histoplasma Capsutum by human macrophages II J. Exp. Med. -1987. -V. 165. -P.195 210.

47. Buther E.G. Cellular and molecular mechanism that direct leucocyte traffic if Am.J.Pathol. -1990. -V.136. -P. 3-11.

48. Cabanas C., Hogg N. Lymphocyte-fibroblast adhesion: a useful model for analysis of the interaction of the leucocyte integrin LFA-1 with ICAM-1 // Fed. Eur. Bioch. Societ. -1991. -V.292. -P.284 -288.

49. Chat.ila A.T, A., Geha R. S., Arnaout M. A. Constitutive and stimulus-induced phosphorylation of CD 11 /CD 18 leukocyte adhesion molecules /7 J.Cell Biol. -1989. -Y.I09. -P.3435 3444.

50. Cox E.„ Kuczka A., Tammen 1., Schwengel" B. Leukocytenadhesiedtficientie bij rund en hond: een erfelijke stoomis van het immuunstelsel // Viaams. Diergeneeskd, Tijdschr. -1993. -V.62. -P.71 79.

51. Crowley C. A.» Cumutte J.T., Rosin R.E. et al. An inlierited abnormality of neutrophil adhesion: its genetic transmission and its associations with a missing protein // N. Eng. J. Med. -1980. -V.3G2. «P.1163-1168.

52. Dana N., Styrt B., Griffin J. D.„ Todd III R. F., Klempner M. S. Arnaout M. A. Two functional domains in the phagocyte membrane glycoprotein Mol identified with monoclonal antibodies // Immunol. -1986. »V. 137. -P.3259 3263.

53. Davignon D.„ Reynolds M E. T., Kurz Inger K.> Springer T. A. Lymphocyte function associated antigen-1 (LFA-1): A surface antigen distinct from Lyt-2,3 participates In T lymphocyte-mediated killing // Proc. Natl. Acad. Sei. -1981 .-V.78. -P.4535 4539.

54. Defilippes F, M. Decontaminat ing the polymerase chain reaction. Biotechniques. -1991.-¥.10. » P.26 30.

55. Deragon J.-M., Sinne« D., Mitchell 0., Potier M. D. Labuda Use of y-irradiation to eliminate DNA contamination for PCR if Nucleic Acids Res. »1990. -V.18. -P.6149.

56. Dimanche-Boit re 1 M.-T.» Giiyot A., De Saint-Basile G., Fischer A., Grisell C. Heterogenicy in the molecular defect leading in the leukocyte adhesion deficiency // Eur. Immunol. -1988.-V. 18. -P.1575- 1579.

57. Dwyer D.E., Saksena N. Failure of ultra-violet irradiation and autociacing to eliminate PCR contamination // Mol. Cell. Probes. -1992.-V. 6. -P.87 88.

58. Engelhardt I. Inzucht, bedeutende Ahnen und Warscheinlichkeit fur BLAD-Merkmalstrager in der Deutschen Schwarzbunt zucht // Dissertation. -1996. -S. 155.

59. Forster M. Von Gendiagnostische Erbfehleranalyse zur Verbesserung der Tiergesundheit // Zuchtungskunde. -1992. -V.64. -S.405-410.

60. Funk D. BLAD, three years later if Holstein World. -1994. -Marz,-V.96. -P.96-106.

61. Gilbert R.O., Rebhun W.C., Kim C.A., Kehrli M.E., Shuster D.E., Ackerman M R. Clinical manifestations of leucocyte adhesion in cattle; 14 cases (1977-1991) // J. Am. Vet. Med, Assoc. -1993. -V. 202(3). -P.445-449.

62. Giger U., Golub E.E., Abrains W.R. et al. Deficiency of leucocyte surface glycoproteins Mol, LFA-1, and LEU M5 in a dog with re-currant bacterial infections; an animal model // Blood. -1987. -V.69. P. 1622-1630.

63. SO.Grobet L,,Charlier C.,Hanset R.Diagnostic genomigue de la BLAD (Bovine Leucocyte Adhesion Deficiency) if Ann. Med.Vet. -1993. -V. 137. -P 27-31.

64. Gustafson S., Proper I.A., Bowie E.J. W., Sommer S.S. Parameters affekting the yield of DNA from human blood // Anal. Biochem. -1987. -V. 165. -P.294-296.

65. Hagemoser W.A., Roth J.A., Lofstedt J,, Fagerland J. A. Granulocytopathy in a Holstein heifer if J. A. Vet. Med. Assoc. -19S3. -V183. -P.1093-1094.

66. Hamming U. Hoe kan er omgegaan worden met BLAD if Veeteelt -1992. -N.2. -P. 151.

67. Hemler M.E. VLA proteins in the integrin family: structures, functions and their role on leucocytes // Annu. Rev. Immunol. -1990. -V.8. P. 365-400.

68. Healy P.J. Bovine leucocyte adhesion deficiency (BLAD) another genetic defect of Holsiem/Friesians //Aust.Vet. J. -1992. -V. 69. N8. -P. 190.

69. Hradil R, Application of molecular genetic methods to the BLAD and PSS testing in bovine and pigs in Czech Republic. Proceedings of the XXVI International Conference on Animal Genetigs, Prague.1. P.83.

70. Hynes R.O. Integrins: a family of cell surface receptors // Cell. -1987. -V. 48. -P. 549-554.

71. Jorgensen C.B., Agerholm J.S., Pedersen J., Thorns en P.D. Bovine leukocyte adhesion deficiency in danish holstein-friesian cattle // Acta vet.scand.-1993.-V.34. -P.231 -236.

72. Kahle Kennzeichung des BLAD-Status weiblicher Tiere II Rind in Bild. -1994. N.2. -P.20.

73. Kawasaki E. 8. Sample preparation from blood, cell and other fluids. PCR protocols, a guide to methods and applications // Academic Press. San Diego. N.Y. -1990. -P.146-152.

74. Kehrli M.E.Jr., Smalsteig F.C., Anderson D.C.et al. Molekular defenition of the bovine granulocytopathy syndrome: Identification of deficiency of the Mac-1 (CDl lb/CD 18) glycoprotein II Am. J. Vet.Res.-1990.-V.51.-P. 1826-1836.

75. Kehrli M.E., Sinister D.E., Ackermann M.R. Leukocyte adhesion deficiency among holstein cattle//Cornell vet.-1992.-V.82.-P. 103109.

76. Keizer G.D., Tevelde A.A. Schwarting R., Figdor G., De Vries J.E. Role of pi50,50 in adhesion, migration, Chemotaxis and phagocytosis of human monocytes II Eur. J. Immunol. -1987. -V. 17. -P. 1317-1322.

77. Kishimoto T.K., Larson R S., Corbi A.L.,Dustin N.L. et al. The leukocyte integrins.// Adv.Immunol. -1989,-V.46. -P, 149-182,

78. Kornfeld R., Koinield S. Assembly of asparagino-linked uligosae-carides II Annu, Rev. Biochem. -1985. V, 54. -P.631-664,

79. Lidauer M. Bedeutung der Erbfehler fur die österreichische Braunviehzucht if Österreichisches Braunvieh. -1992. -N69. -S. 1618.

80. Linz U., Delling U. Systematic Studies on Parameter the Per-fomance of the Polimerase Chain Reaction // J. Clin. Chem. Clin. Biochem. -1990.-V.28. -P.5-13.

81. Linz U., Degenliardt H. Die Polymerase-Kettenreaktion if Naturwissenschaften. -1990.-V.77. -S.515-530.

82. Matsuura S., Kislii F., Tsukahara M. et al., Leucocyte adhesion deficiency: Identification of nofel mutations in two Japanese patients with a severe form // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1992. -V. 184 (3). -P. 1460-1467.

83. Matz-Rensing K., Rothe A., Kaup F.-J. Vorkommen und Bedeutung verschiedener Adhasiortmolekule Ubexsichtsreferat /7 Berl. Munch. Tierarzt!. Wschr.-1995. -V.108. -P. 294-298,

84. I.Miller L.E., Bainton D.F., Borregaard N., Springer T.A. Stimulated mobilization of monozyte Mac-1 and p 150,95 adhesion proteins from an intracellular vesicular compartment to the cell surface // J. Clin, Invest. -1987. -V.80, -P. 535-544.

85. Miller S.A., Dykes D.D., Polesky H.F. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells /7 Nucleis Acids Res. -1988. »V 16. -N.3. -P.1215.

86. Muller K., Bernadina W.E., Kaisbeek H.C. et al., BLAD: bovine leucocyte adhesion deficiency if Tijdschr. Diergeneeskd. -1993. -V. 118. -P.183-184.

87. MuIler K.E., Hoek A. Ahtigen-specific immune responses in Cattle with inherited ß2integrin deficiency. // Veter. Immunol. Immuno-pathol.-1997 -V.58.-N.1 -P.39-53.

88. Nagahata H., Hatakeyama K., Nöda H., Nochi H., Tamoto K. Two cases of Holstein calfes with bovine leukocyte adhesion deficiency if Dtsch. tierarztl. Wochenschrift -1994. V.101. -P.53-56

89. Nelson C,5 Rabb H.v Amaout M.A. Genetic cause of the leucocyte adhesion molecule deficiency // J. Biol. Chem. -1992. -V.265. N.5. -P. 3351-3357.

90. Rhenshaw H.W., Chatburn C., Brayn GM., Bartsch R.C. et al. Canine granulocytopathy syndrome: neutrophil dysfunction in a dog with recurrant infections // J. Am. Vet. Med. Assoc. -1975. -V. 166. -P. 443-447.

91. Rhens haw H. W. Davies W.C. Canine granulocytopathy syndrome: an inherited disorder of leukocyte function // Am, J. Pathol. -1979. -V95. -P.731-744.

92. Sanchez-Madrid F., Nagy J. A., Robbing E.3 Simon P. Springer. T. A. A human leukocyte differentiation antigen family with distinct a-subunits and a common ß-subunit // J. Exp. Med. -1983. -V. 158. -P. 1785 1803.

93. Sanger F,> Nicklen S,, Coulson A. R, DNA-sequencing with chain termination inhibitors if Proc. Natl. Acad. Sei. LISA -1977. -V.74. -P.5463 5467.

94. Sarkar G., Sommer S. S. Shedding light on PCR contamination. Nature (London). 1990. V.343. P.27.

95. Sastre L., Kishimoto T. K., Gee C., Roberts T. Springer T. A. The mouse leukocyte adhesion proteins Mac-1 and LFA-I: Studios on mRNA translation an protein glycosylation with emphasis on

96. Mac4 II Immunol.-1986.-V, 137, -P.1060 1065.

97. Schellander K., Peki J., Taka T. A., Kopp E. Diagnosis of bovine free mart inism by the polymerase chain reaction method // Anim. Genet.-1992. -V.23. -P.549 551.

98. Schwenger B., Tammen I.» Kuczka A. BLAD im Griff II Tiergesundheit 1993.-N.l. P. 32-35.

99. Springer T.A. Adhesion receptors of the immune system II Nature. -1990. -V. 346. P. 425-434.

100. Tammen I. Weiterentwicklung des DNA-Tests auf BLAD (Bovine Leukozyten Adliasions defizienz) fur den Einsatz in Rinderzucht und klinischer Diagnostik. Hannover. -1994. -128s.

101. Thornton C. G.„ Hartley J. L.» Rashtchian A. Utilizing uracil DNA glycosylase to control carryover contamination in PCR: Characterization of residual UDG activity following thermal cycling. Biotechniques -1992. -V.13. -P.80 184.

102. Tindall K. R., Kunkel T. A. Fidelity of DNA synthesis by the Thennus aquatic us DNA polymerase. Biochemistry -1988. -V.27.-P.6008 6013,

103. Treviranus A. Klinische Befunde und Abstammung von Jungrindern mit Boviner Leukozyten-Adhasions-Defizienz (BLAD), Hannover. Tierarzt. Hochsch. -1993.-152s.

104. Trowald-Wigh G., Hakans son L,, Johannis son A., N orrgran L. Leucocyte adhesion protein deficiency in Irish setter dogs //Vet.1.munol. Immunopathol. -1992. -V.3. -P.261 280,

105. Vogclsloin BGillespie D. Prcpcralivo and analytical purification of DNA from agarose // Proc, Natl. Acad, Sci. USA, -1979. -V.76. -P.615-619.

106. Wages J= M., Fowler A. K, Amplification of low copy number sequences // Amplifications. -1993. -VI1. -P. 1-3.

107. Wardlaw A, J.» Hibbs M. L., Stacker S, A., Springer T, A. Distinct mutations in two patients with leukocyte adhesion deficiency and their functional correlates. J, Exp. Med. -1990. -V. 172. -P.335 345.

108. Watson R. The formation of primer artifacts in polymerase chain reaction// Amplifications. -1989. -V.2.- P.5-6.

109. Weisman J. S., Berkow R. L=, Plaut G,> Torres M,, Mcguire W. A., Coates T. D., Haak R. A., Floyd A., Jersild R., Baehner R. L. Glycoprotein-180 deficiency: genetics and abnormal neutrophilactivation// Blood -1985. -V.65. -P.696 704.

110. Weitzmann J. B,, Wells C. E,» Wright A. H,, Clark P. A. Law S. K. The gene Organisation of the human p2-integrin subunit (CD 18) ii FEBS Lett. -1991. -V. 294. -P.97 103.

111. White M. B., Carvalhio M.» Derse D., O'brien S. J., Dean M. Detecting single base substitutions as heteroduplex polymorphisms // Genomics-1992. -V.12. -P.301 306.

112. CD 18-mutant mouse for study of inflammation // J, Immunol, -1993. -¥.151. -P. 1571 1578.

113. Womack I.E. Molecular genetics arrives on the farm // Nature. -1992. -V.36Ö. -P.108-109.15 5. Zucht Wertschätzung, -1998.N.2. 208s.