Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сканирующая микрокалориметрия в исследовании биологических мембран

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Сканирующая микрокалориметрия в исследовании биологических мембран"

Тбилисский ордена Трудового Красного Знамени государственный университет

На правах ружтков Еныров Bas.epW Леонидович

7ДК 536.711: 577.352

\

СХАКНРУЩАЯ ШЖРОКМОРКШТРШ В ИССЛЕДОВАНИИ ШШЖЕСШ МШЕМН

03.C0.02 - С.чофпзика

Автореферат диссертащн на сйксканиэ ученой степени доктора бгологнческшс says

Тбшиса - IS 89

U- у=ф crj /е-/о-s J

Работа выполнена в Институте биологической физики АН СССР

Официальные оппоненты: чл.-корр.АН БССР, д.б.н, професоор Конев C.B.,

д.ф.-м.н. Малеев В.Я., д.ф.-м.н. Мревлишвшш Г.М.

Ведущая организация: биологический факультет 'Московского государственного университета им. M. В. Ломоносова

Защита состоится " "____ 19 г. в

■ " -. часов 'на заседании специализированного совета Д 05V.03.I9 по защите докторских диссертаций по специальности "биофизика" при Тбилисском государственном университете по адресу: 380043, Тбилиси, ул. Университетская, 2, ПУ,' биологический факультет.

V

м

С диссертацией ыокно ознакомиться в библиотеке Тбилисского государственного университета.

Автореферат разослан " "__ 19 года.

Ученый секретарь

специализированного совета

доктор биологических наук U Р

п. н.Г.Котрикадзе

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. В современной физико-химической биологии одной из центральных проблем является выяснение свойств и механизмов функционирования биологических мембран. Фронт исследований в этом направлении настолько широк и шток информации настолько огромен, что вряд ли кто-либо отважится на пошлин полно очертить -состояние вопроса на сегодняшний день и дать однозначные рекомендации о правильных путях развития мембранологии. Ясно одно - прогресс в понимании функционирования биологических мембран невозможен без исследования их физико-хймических свойств. Биологиче<>-кие мембраны являются сложными кооперативными системами, состоящими из множества различных белков, встроенных в ва-сокоупорядоченную липиднув матрицу и/зли поверхностно контактирующих с ней. Мембранные и примембранные белки взаимодействуют как друг с другом, так и с лшшдным бислоем, причем, эти взаимодействия исключительно существенны для функционирования всей системы. Со этой причине исследование кооперативных явлений в биологических мембранах, определяющихся взаимодействием белков и липддов, является в настоящее время чрезвычайно актуальной задачей. Наиболее отчетливо кооперативные явления в биологических мембранах проявляются при их термотропных превращениях, которые шжно ззучать различными физико-химическими методами. Наиболее адекватным и прямым в атом случае является метод сканируи-яей микрокалориметрш, который вместе о дополнительными эффективными методами анализа позволяет охарактеризовать структурные особенности биологических мембран, что необходимо для нахождения связи шзду структурой и функцией. Не-тод сканирующей микрокалориметрш наиболее хорошо развит в настоящее время в применении к растворимым биополимерам. Исследование де мембранных систем (особенно получение количественных данных) этим методом наталкивается до сих пор на очень серьезные трудности, связанные, в пернув очередь, с интерпретацией сложных термогракм.

В связи с этим в данной работе была доставлена педь разработать экспериментальные подходы к количественному зермодинамаческому анализу отдельных компонент биологических мембран и других биологических объектов, характеризую-'

щихся сложным контуром тошюпоглощеккя. При этом били поставлены следующие задачи:

1. Разработать метод, позволяющий разделять сложный контур топлотоглощениа биологических мембран и других надмолекулярных структур на элементарные составляющие.

2. В сложном контура теплопоглощения, характерном для всех биологических мембран, провести отнесение его элементарных составляющих определенным мембранным структурам.

3. На примере хорошо изученных биохимически и Функционально охарактеризованных биологических мембран (фрагментов фоторецепторных клеток и пурпурных мембран галофилов) с использованием разработанного методического подхода определить термодинамические параметры процесса тепловой инактивации некоторых мембранных белков.

4. Исследовать влияние рН и ионного состава среда, различных физико-химических и протеолиткческпх модификаций на термопндуцированныз превращения различных биологических мембран.

Научная новизна тэа.боты. Впервые комплексом физико-химических методов исследован процесс тепловой инактивации целого ряда различных биологических мембран. Предложен экспериментальный подход (метод последовательного отжига), позволяющий количественно охарактеризовать элементарные составляйте сложных контуров теплопоглощения биологических мембран и некоторых других надмолекулярных образований (доменные белки, фаги, сперматозоида и т.д.). С его помощью впервые определены термодинамические параметры цроцесса тепловой денатурации родопсинов и опсинов некоторых позвоночных в составе фрагментов фоторецепторных клеток и бак-териородопсина в составе пурпурных мембран галофилов. В эритроцитарных мембранах различных животных выявлены структурные домены, обладавдие различной термэ стабильностью. Впервые показано, что белкошй состав этих доменов различается от вида к ввду. Для некоторых животных обнаружено рН-зависимое изменение конформационных свойств мембранных белков в зоне физиологических значений рН. Обнаружены необычные термоицдуцяровашые переходы в пурпурных мембранах галофилов, связанные с изменением кристалличности белковой упаковки и образованием из исходно плоских мембран сферических пузырьков (везикул) с однонаправленной ориентацией

цитоплазматической поверхности во внелнот среду. Вперше показано влияние радиочастотного излучения дециметрового диапазона малой интенсивности (удельная поглощенная мощность не более 10 Вт/ет) на термотропноа поведение эрптро-цитарннх мембран. Показаны различи в организации и количественном составе белюз в мембранах эритроцитов человека я крысы при первичной гипсртензии. .

Практическое тгоплокение работы охватывает области фи-зико-химичеезюй биологии, медицинской биофизики и экологии. Результаты, получешше в работе, являются дополнительным фундаментом для исследований структурной организа»-ции и функциональных изменений биологических мембран. Кроме того, развитые в работе методические приемы могут быть полезны в исследовании и других надмолекулярных 1:01,талек-сов. Обнаруженные отличия в физико-химических свойствах мембран эритроцитов при первичной гипертензпи могут бить основой для направленных исследований ыолеодлярной природы мембранного дефекта при этом заболевашш. Существенный интерес для офтальмологии могут представлять результаты, полученные при исследовании кинетики и термодинамики процесса тепловой денатурации зрительных пигментов. Результаты, получешше при исследовании действия СВЧ-излучеякя дециметрового диапазона на эритроцитарные мембраны, могут быть использованы в экспериментальной экологии. А результаты микрокалориметрического исследования-сперматозоидов (см. Приложение) могут и уже используются при тестировании оплодотворяющей способности 1фиоконсервированного генетического материала, равно как и для выбора условий крноконсервирова-■ния. Кроме этого, результаты настоящей работы используются в учебных курсах по биофизике в Дальневосточном государственном университете, а предложенный метод анализа слостсс контуров тешгопоглощения биологических мембран используется в ряде научных учреждений у нас в стране и за рубежом.

На защиту выносятся следующие основтоа голодания:■ I. Метод анализа сложного контура тешгопоглощения биологически мембран, заключающийся в последовательном огашге частично или полностью необратимых пиков тешгапоглощения, соответствукгих термоинактивации отдельных кооперативных блоков системы, и последующей апроксимацни кривой тепгопог^ лощения суммой выявленных элементарных составляющих. Ыетод

предполагает минимальные физически разумные допущения: симметрию элементарного контура тешгапоглощения, по меньшей мере, частичную необратимость и независимость термоиндуци-рованшх переходов.

2. Результаты исследования тершиндуцированных превращений различных биологических мембран цри их Физико-химических и протеолитических модификациях, позволившие обнаружить сле-дущие закономерности:

а) выявляемые в сложном контуре теплопоглощения мембран элементарные составляющие (контуры) характеризуют термоинактивации мембранных блоков (доменов), состоящих как правило из различных белков;

б) функционально подобные мембраны различных животных существенным образом отличаются друг от друга ш структурной организации (составу) этих блоков;

в) тепловая денатурация мембранных белков характеризуется .термодинамическими параметрами близкими по своей величине к' ташвым для большинства водорастворимых глобулярных белков. ?

3. Результаты исследования физико-химических свойств биологических мембран при различных Физиологических и патофизиологических состояниях. Так, при исследовании фоторецептор-нкх мембран сетчатки ряда животных было показано, что цри . обесцвечивании зрительных пигментов свободная энергия стабилизации нативной белковой структуры при физиологических значениях рН и температуры снижается в 2-4 раза, что может цриводить к спонтанной тепловой денатурации опсина. При первичной гипертензии (гипертоническая болезнь человека и ее экспериментальная модель - спонтанная генетическая ги-портензкя крыс) изменена структурная организация эритроци-тарных мембран. При этом показано увеличение содержания белка полосы 3 (основного анионного транспортера) на 1030? по сравнению с нормой.

Ашюбация работы. Основные результаты работы были представлены на I и Ш СоБзтско-Швайцарском симпозиуме "Биологические мембраны. Структура и функции" (Тбилиси, 1979; Ташкент, 1983) ;*У и 71 Всесоюзном симпозиуме по конформацион-ным изменения^! биополимеров в растворе (Телави, 1980; Тбилиси, 1985); 1У и У Всесоюзной конференции го спектроскопии биошлшоров (Харьков, 1981; 1984); Международном симпозиу-

ив ю биокалоркметрии (Тбилиси, 1981); Ш Созэтско-Швадсиом симпозиуме по физико-хишчесвэй биологии (Тбилиси, 1981); I Всесоюзном биофизическом съезда (Москва,. 1982)} Цегдуга- • родном микроволновом симпозиуме (Бостон, 1983); УШ Европейском конгрессе го электронной шифосюлин (Будапешт, 1984); Моздуиародноы силпозиумэ "визико-хикическио свойства биополимеров в растворе и клетках" (Пущино, 1985); I международной иколе по электромагнитным полям и биомембранам (Плоеон, IS86); УП Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пэптвдов (Таллинн, 1987); Всесоюзном симпозиуме "Механизма биологического действия электромагнитных излучений" (Пуци-по, I9S7); Всесоюзной школэ-семинарэ "Современные метода бпоорганической химии" (Владивосток, 1988); 10 конференции ИШАК по химической термодинамике (Прага, IS88); У1 Всесоюзном симпозиуме ."Механизмы сенсорной рецепций" (Коскза, 1983).

'' Пгбтдтатад. Результаты работы опубликованы в 42 работах D отечественных и зарубежных научных изданиях: 23 статьи и 19 тезисов в материалах съездов, симпозиумов и конференций.

Структура у объm работ;;. Диссертация состоит из введения, чот1фох глав, заключения, выводов, приложения а списка цитируемой литературы. В раоото отсутствует отдельная глава обзора литературы. Вместо этого, о обзора литература начинается каядзя кз экспериментальных глав. Работа изло.'зна на 317 страницах, питает 16 таблиц и 101 рнсуксх. Список цд-тгруслой лкгоратурн состоит ra 4S3 ЕаиаэнОашяЙ.

' ¡УТЕШАЛ! И МЕТОда КССЯВД0ЕШ1Я

Пропэра™Г1Шнэ г.емда

'1?с®эт2. хфоюдглась'ва коксах xsssz Кгого-Егвтар ( шаг) в гсзрг.сто 10-12 ксдоль различного соха» При гсследовзниа «»пзшхноззяссгсг: свойств эр:лрощггарншс г;е*лбр-эн гшгартек-1фкс работу проводили на йквотенх ленки shr ( Spoa-trncounl;' hypertensive Kyoto 'Jistar rat я ). Лрн SSCIi IIO-хсда:со фззачоскоо развития, пол з возраст крыо в шшртсн— ".T"::oiî :: ;:ормэтевзпвной грунтах подбирались одинаковыми. Лргеякалмю* дапяеюю у крив sbh било 160-200 км рт. от., ' а у - 83-130 га рт.ст. ICposs. у крнс забирает Z3

йг^уртетстя Сргздай лорза под офцошм наркозом.

Л райогэ гаюяьзогаш йесгородянэ чрфщ с массой тела

18-35 кг. Кровь у наркотизированных собак забирав из боны пароднзй лапы.

Цри исследовании эритроцитарных мембран человека использовала либо цельнуа кроьь доноров, либо консервированную эрптроцитарную кассу.

Во всех случаях в качества антикоагуляпта использовала раотвор гепарина (5000 ел/иг.), которым' смачивала шприц, и который добааяшш в пробирки дад крови из расчота 250 t-кл на 10 мл крови. Кровь до получения мембран эритроцитов хранили на льду на более I часа. Кровь центрифугировали (IOOOg , 5 .мин, 0-4°С) и освобоздали от плазмы и клеток белой крови. Осадок эритроцитов тризды промывали при тех ае условиях центрифугирования трех-четырех-кратным объемом среда, содержащей 150 мМ хлористого натрия и 5 мУ фосфата натрия, рН 8,0. Эритроциты гемолизо вали в 20-25-кратном объеме 5 id.i фосфата.натрия, рН 8,0, при 2-4°С и центрифугировали (30000s , 20 мин, 0-4°С). Осадок промывали при тех аё'условиях центрифугирования три-четыре раза средой гемолиза и как минимум 2 раза средой, а которой проводили последующа измерения.

Все используемые в работе модификации эритроцитарных мембран были ранее предложены для мембран эритроцитов человека п применены в данной, работе с некоторые: усовершенствованиям.

2. Фотот>9иепторнне мамбран^.

В работе использовали глаза крупного рогатого скота, крыс, лягуиек, морских рыб и кальмаров. Извлачениэ сетчаток и всю препаративную работу по получению фотороцэпторных мзмбран проводили при температуре но выше 4°С при красном свете (длина волны более 670 нм). Выделение фоторецептор-ных мембран крупного рогатого скота и лягуиек проводили в соответствии с ранее описанной методикой (Вегяал at al., 1977), а крыс - по схеме, предложенной в работе Стоуна с соавторами (stone et ей., 1979 ). Выделение фотбрецопторнше мембран рыб проводили по схеме, в основу которой полонен принцип разделения субклеточных фракций комбинированием методов дифференциального и равновесного центрифугирования, йотореценторные мембраны из сетчаток кальмара Ецделйли по методике описанной в работе Бармана и Чнрковской (1974). З^.Дургнщнне мембранч.

Пурпурвно пембракн ::з клеток ПоЗ,оЬм1аг1ия 2ю1оЪ1ия • выделяли по глмвфвсфованноЯ мотодедэ, црэдЕйгэяиоН в работе (Оез*егЬоЗЛ» В'гоэеЬсп^о, 1974 ).

Пурпуршэ камбрана превращала в апогзе:лбраЕН фотопняу-щтрованншл гздроксалаиинализои (0,5 М гчцройошшмзл; рН 9,0*0,2; 20-25°С; светофильтр 20-18). Восстгяогяеяпэ аяь-дешнной связи бактэрпородопслна па .свету дрз 4°С проводила в термостатцруеыоЗ ковэтэ, гспользуя в качэствэ осветителя галогеннуэ дампу 250 Ет с фокусирующей системой, топ-лоенм фильтром и светофильтром 20-18. Реакцию с боргпдрндои натрия (1мг/кл) проводили в 54 мМ аммоний-бикорбакатном -буфере (концентрация белка 4-10"%, рН 10,0). Отщепление от бактериородопсина С-концевого фрапданта (232-248) папа- ' игом проводили согласно работе (АЪй'Лоеу е* а1., 1973 ). Образцы для электронной микроскопии замораживали без 1фио- ' протекторов в жидком пропане при -190°С в медных пластинах - "сендвичах" з устройстве, позволяющем напылять одновременно до девяти различзшх препаратов. Платикоуглеродаые реплики, полученные в соответствии с методикой предложенной з работе (ВоготгуазЗл е4 а1., 1982 ), просматривала с пскспз>э электронного микроскопа ЛЕ,'-юоз (Лео1, Япония). Аиапитнчэсхза кзгоды

I. Скантаустяя .ттаКЬеренштальная .микрокалоркмегргя.

Тегшературнуп зависимость избыточного тешгапоглещения измеряли на дифференциальных адиабатных сканирующих мик-рокалориглетрах ДШЛ-Ш и ДАСМ-4 (НПО "Биоцрнбор" АН СССР). Для анализа слотк контуров теплоноглощения, характерных для биологических мембран, суперспиральных, доменных и ряда других белков в работе был предложен метод последовательного отжига. Основная идея этого метода, применяемого к полностью клд частично необратимым перехода:,!, заключается з следующем. После нахождения средних значений температуры переходов при первом (обзорном) сканировании (это локаль-ннэ максимумы вдцпмыв или, экспериментально определяемые, на :фзвой теплоютлощения) аналогичный образец прогревается з калерклетрэ до температуры первого максимума н снова . оглацдается до исходной температуры - те?швратуры начала сканирования;1 второе сканирование останавливается вблизи зегятэратуры второго е/акси^-а (на 0,5-1°С еыпзэ), образец вновь охлаждается до температуря, с которой начинали ска-

нирование и т.д. Таким образом, получаются контуры переднего фронта элементарных составляющих, которые можно достроить до полных контуров, сделав логичное предположение об их симметрии. Окончательный вид контуров элементарных переходов получается путем подбора коэффициентов их амплитуды для оптимизации приближения суперпозиции, полученных таким образом контуров, к исходной кривой теплопогло-щения. Дзкшй метод предполагает независимость тепловых превращений в компонентах систеш, характеризующихся элементарными контурами теплопоглощения, и в отличие от других методов, постулирующих этот факт, является на практике способом проверки этой независимости. Кроме того, все методы, использующие математические подходы к анализу сложных контуров, не позволяют с определенностью утверждать, на какой из элементарных стадий происходит последенатура-ционный "скачок" теплоемкости. Наоборот, в предлагаемом методе величина паследенатурацпошгаго изменения теплоемкости ' определяется экспериментальна ш отклонению начального уровня сканирования после каждого последовательного отжига.

2. Спектры собственной белковой Флуоресценции измеряли с передней поверхности кюветы па спектрофлуориметро лабораторного изготовления, описанном ранее ( Гсгтуакоу е1; о1., 19??). Во все спектры флуоресценции вводили поправку на спектральную чувствительность установки, экранировку и реабсорбцил (Бурлтейн, 1968).

3. ИшЬракрасннд спектры поглощения регистрировали на автоматическом спектрофотометре ик-20 (Карл Цейс, Иена, ГДР).

4. Электрофорез проводили в плоских гелях с линейным градиентом пористости полиакриламвда (5-15%) в присутствии 0,15? додоцилсульфата натрия. Основше np-.ici.-i формирования геля и проведения электрофореза описаны в работе Остермана (1981). Гели сканировали на автоматическом сканирующем денситометре ДСА-1 (НПО "Биоприбор" АН СССР). Для термогель-анализа аликвоты мембран по 50-100 мкл помещали в герметичные пробирки. Эти пробирки устанавливали в водяной бане, где их-нагревали с заданной скоростью. В процессе нагрева при определенных температурах пробирки последовательно вынимали и охлаздали. Все пробы выдерживали 10-12 часов при 4-6°С, посла чего образцы солибилпзировали в

объемном отношении 1:2 в солвбимэяруЕцем растворе и проводила ¡электрофорез.

5. Сгтзктрч: кругового лтртогзуя регистрировали на автоматических спектрополярпметрах J ¿SCO модели J-20 и J-500.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИСШВДОЕАШЙ Эритроцитарше измбракы . i. Теплотой tot>qxoim в этгитропптатжых уембранах крыс.

Несмотря' на большой шСср методов для изучения Ензван- " них теплом переходов в биологических мембранах, наиболее иформатявшв данные были получены методам дифференциальной сканирующей кикрокалоригетряй/ -Зтот метод дает возможность .непосредственно регистрировать тепловой эффект перестроек, происходящих как в лишдной, так и в белковой фазах мембраны. Мембрана эритроцитов содерулт большое количество холестерина. По этой причине в ранних исследованиях не было обнаружено лпгадных переходов (iadbrooko et til., 196Q ). После удаления 80$ холестерина из суммарной фракщш липццов эритроцитарных мембран человека наблвдалзя переход при 25°С ( Jackson et al., 1973 ). В более вы соко температурной области (45-90°С) в эритроцитарных. мембранах человека удалось зарегистрировать ряд необратимых переходов (Jackson et al.„ 1973 )• Поскольку такие перехода не наблюдались для везикул из суммарных липвдов мембран, авторы предположили, что они обусловлены денагурацией мембранно-связанных белков. В ряде последующих работ эти перехода были изучены более детально (Brandts et el., 1977) 1978Т. При физиологических значениях рН 7,4 и промежуточных значениях ионной силы на кривой теплопоглощзния ннблвдались максимумы при '50, 57, 66 и 77°С, названные соответственно А, В, С и переходами.

Поскольку в практике биологических и медицинских исследований часто не правомерно переносят данные, полученные на одних объектах (гпвотных) на другие, как правпло, руководствуясь только внешним ц/пли функциональным подобием элементов яивого (см., например,Sreadta et ей., 1978 ), представляется весьма важным уточнение разумных границ такого пзреноса. 3 связи с чем ;л .провели сравнительное изучение • терморезистентных и некоторых других физико-химических свойств мембран эритроцитов крысы н собаки, являщихся сд-: ними из наиболее распространенных лабораторных животных.

На рис. 1А приведены результаты мшсрокалориметрическо-го исследования эритроцитарных мембран крыс в 5 мМ фосфате натрия, рН 7,4. Можно видеть, по меньшей мере, 4 пика теп-лопоглощения, названных А, В, С и в переходами аналогично

Рис. I. Температурная зависимость избыточной теплоемкости .(А); эллиптичности на длине волны 224 км (В); полуширины полосы поглощения амид I и максимума полосы амцд I в инфракрасном спектре поглощения (С); положения спектра тршггофано-вой флуоресценции - X , относительного квантового выхода - $ и интенсивности рассеянного света на длине волны 313 нм -*313 ^ ® ^ суспензии мембран эритроцитов крысы В • 5 Ш фосфате натрия, РН 7,4

"о » « ю ю *с

работе (Brandts et ей., 1977). Максимумы переходов лежат при 43°С - А; 50,5°С - В; 60,5°С - С и 70°С - D . При температуре А перехода наблюдается изменение кругового дихроизма на длине волны 224 нм (рис. IB) и длинноволновый сдвиг спектра триптофаяозой флуоресценции (рис. ID). В переход сопровождается большими изменениями в круговом дихроизме на длине волны 224 нм (уменьшение количества о-спирали), увеличением ширины ИК-полосы поглощения с максимумом около 1650 см-1 (увеличений количества $> -структуры (рис. 1С) и длинноволновым сдвигом спектра собственной белковой флуо- '

ресценции. С переход не сопровождается заметными спектральными изменениями, в переход коррелирует с дальнейшим уменьшением эллиптичности на длине волны 224 нм, увеличением ширины полосы 1650 см-1 в ИК-спектре поглощения и длинноволновым сдвигом спектра триптофановой флуоресценции.

На рис. 2 показана рН-зависимость положения спектра триптофановой флуоресценции и относительного квантового выхода для мембран эритроцитов крысы в 5 мМ фосфате натрия

УЛ-

Рис. 2. pH-зависимость параметров триптофано- • вой флуоресценции мембран эритроцитов крыс в 5 мМ фосфате натрия при 20°С: Л - положение спектра; В - относительный квантовый выход - s и интенсивность рассеянного света при

313 нм - 1313; С - рН-зависимость положений тепловых переходов А, В и С (калориметрия)

при 20 С. Кроме того, на рис. 2 показаны рН-зависимость интенсивности рассеянного света при 313 нм и рН-зависнмое положение тепловых переходов А, В и С. Увеличение рН от 7 до 8 индуцирует малый длинноволновый сдвиг спектра флуоресценция, увеличение относительного хвантового выхода и сдвигает положение А и В переходов к более низким температурам, а положение С перехода к -1олеэ высоким. Этот переход лежит в физиологической области рН и, вероятно, играет функциональную рать.

На рис» 3 приведена термограымы для теней эритроцитов :о. измеренные при рН 7,4 в фосфате натрия различной кон-'

центрации. Хорошо видно, что изменение концентрации буфера от 5 до 30 мМ вызывает довольно сильную трансформацию 'термограмм, связанную, по всей видим стн, с изменением ультраструктуры мембран.

\ л\ Ь аЫ Рис. 3. Избыточная

J 1 /\ \ теплоемкость как функ-

} V/ \ 9 id ция температуры для

мембран эритроцитов

5фысы в фоофате^натрия

• / А \ И.З ^ различной концентрации,

рН 7,4. Вертикальная

отметка: 100 ДжД»кг

_У г Л Л^

j • '_L.

20

т.°с

Обработка эритроцигарных мембран крыс наиболее специфическим ингибитором анионного транспорта ( dids) приводит к исчезновению С перехода и появлению полосы теллопоглощенния с максимумом около 72°С. А, В и D переходы п.4:: этом практически не затрагиваются. Этот факт является убедительным доказательством того, что С переход (его большая часть) имеет отношение к тепловой инактивации системы анионного транс-; порта эритроцитов. u

Внешняя протеолитическая обработка эритроцигарных мембран 1фысы папаином приводит к изменейиям В и D переходов. Таким образом, белки, денатурация которых характеризуется Bhd перехбдами, локализованы в основном на внешней поверхности эритроцитарной мембраны. А и С переходы не затрагиваются при этой обработке. °

Обработка эритроцигарных мембран фосфолипазоЕ Ag приво-

дит к значительным изменениям термограмм. Всо переходы затрагиваются этой обработкой, что пообща говоря но удивительно, т.к. при данных условиях эксперимента фосфолипаза переваривает все гликофосфолипиды эритроцитарных мембран.

Одна из главных задач при изучении термодинамических свойств биологических мембран заключается в правильном отнесении наблюдаемых микрокалориметрически переходов конкретным структурным компонентам. Отдельные переходы можно соотнести с определенными структурами путем направленной химической и/или ферментативной модификации эритроцитарной мембраны. Однако, в этом варианто все-таки остается вероятность неоднозначного отнесения, так как при воздействии реагентов монет нарушиться система взаимодействий, поддерживающих целостность интактной мембраны и предсказать заведомо последствия такого нарушения не всегда удается. Cava по себе калориметрия не способна ответить на вопрос, какие мембранные компоненты включаются в тот или иной переход. Поэтому, наиболее оптимальным, на наш взгляд, является соотнесение данных микрокалорикетрии с данными метода терио-гель-анализа ( Lysko et al., 1901). Результаты анализа этим методом в виде значения температур, при которых происходит полумаксимальное уменьшение плотности электрофоретических полос белков эритроцитарных мембран (нумерация электрофоретических полос по Стеку ( steck, 1974)), представлены в табл. I. Исходя из этих данных, в эритроцитарных мембранах человека белки по терморезистентности располагаются в ряду: 1*2<2.1<4.2<4.9< 5<4.1< 3<5«7. Аналогичный ряд для белков мембран эритроцитов }фысы сущест-'венно отличается:

2.1 = 2.2< 2.3=52.4« 2.5« 4.9 < 1< 3«7< 2< 4.2« 4.5 < 6«5.

2. Тотхтовче переходы з эритроцитарных мембранах собаки.

Зритроцитарше мембраны собаки характеризуются, по крайней мере, шестью тепловыми переходами, которые мы, как и ранызе, обозначили A, Bp В2, С, D1 и э2 в соответствии с возрастанием температуры.

Комплексные трансформации переходов, вызванные изменением pH, показаны на рис. 4. Этот рисунок демонстрирует рН-зави-сгаость положения спектра флуоресценции, относительного квантового выхода п интенсивности рассеянного света на длина гол!и 355 нм. Еидно, что флуоресцентные параметры оста-

Таблица I. Относительный молекулярный по с и температура денатурации полилоптвдоб мембран эритроцитов человек, крысы и собаки по данным тормо-гель-анзлиза.

Полипоп-тида (нумерация полос по данным электрофореза)

Относительный молекулярный вес (кд)

Темлератпх1.11.. радии (°С)

нату-

человек крыса собака чзловок крыса собака

I 260 240 240 49 60 49

2 225 225 220 50 65 45

2.1 215 210 210 52 49 49

2.2 190 175 49 49

2.3 175 160 52 49

2.4 140 130 52

2.5 Т15 115 . 52 " 49

3 '89 92 94 62 62 63

4.1 78 78 85 61 83 58

4.2 72 • 73 79 54 71

4.5 54 70 71 54

4.9 45 48 45 56 53 48

43 43 42 58 90

6 35 34 38 67 76 56

7 29 28 81 62

8 23 24 50

ются практически постоянными в широкой области рН от 6 до 9, тогда как изменение рК приводит к изменению максимумов-тепловых переходов различных мембранных компонент.

Рис. 5 показывает, что основные изменения, которые происходят при экстракции спектрина, связаны почти с полным исчезновением А перехода. Остальные перехода не изменяют своей интенсивности и местоположения. Кривая 2 на рис. 5 демонстрирует тенлопоглощение солюбилизированного спектрина. Этот белок имеет переход с максимумом при 48,-5°С и плечо при 57°С.

Как и для других эритроцит-арных мембран, в случае собаки МРЗ приводит к исчезновению С 'перехода й появлении нового перехода с максимумом около 76°С. А, В и о переходы остаются при этом практически неизменными. В случае щелочной обработки, мембран, из которых солюбшшзирован спектрин, термограммы имеют в 20 мМ фосфате натрия при рН 7,4 два перехода с максимумами 63 и 78°С (С и в переходы). При этом чувствительным к ингибитору анионного транспорта является только С переход. Электрофорез в полиакриламидном геле, об-

Рис, 4. рН-зависимость томпора-тури перехода. Та , (а) и параметров трипто(?)ановой флуоресценции при 20°С: положение спектра в нм (Ь ), относительного квантового выхода (с) и. •интенсивности рассеянного света на длине волны 365 нм (а ) для мембран эритроцитов собаки в 20 м<! буфере

Рис. 5. Избыточная теплоемкость как функция, температуры для ин-'тактннх (I) и "бес-спектриновых" (3) мембран эритроцитов собаки в 20 vtl фосфате натрия, pH 7,4. 2 -теплопоглощение спект-рина

работанных щелочью "бесспекгринсвых" мембран эритроцитов собаки, обнаруживает при охфаске гелей Кумасси две полосы с ; кажущимися молекулярными массами около 90 и около 30 кД, а

при окраске по Шиффу ввдно, что с мембраной связаны почти вез гликопротещщ. Следовательно, можно ожидать, что б термограммах обработанных щелочью мембран эритроцитов собаки "спрятаны" тепловые переходи всех осташихся в мембране структур. Используя процедуру "удаления" глпко1>орипа ('Ло1о-в!п et о1., 1977 ), мы noKii3a.ni наличие перехода, связанного с его денатурацией, которий маскирован белее интенсивным С переходом.

Интересно срап:лть данные по теплого» инактивации мембран эритроцитов собаки с подобными данными для человека и крысы. Если не считать некоторых различий п калориметрических 1фишх для сравниваем!ос объектов, то мы не заметили принципиальных различий в термодинамических параметра процесса тепловой денатурации спектрнна и болка полосы 3. Однако, в отличие от эритроцнтаршсс мембран крысы для мембран собаки не наблюдается рН-завис1:мый переход в области Физиологических значений рН. Наблюдается некоторые отличил и при 'исследовании эритроцитарных момбргш собаки методом тормо-голь-анализа (см. Табл. I). Кроме незначительных отличий в относительных молекулярных массах основных полипоптидов эритроцитарных мембран ш можем отметить существенные различия в формировании отдельных блоков, которые проявляются в калориметрических псслодокашшх б виде отдельных тепловых переходов. Так, для человека, первый блок, инактг.вируемый при средней температуре около 50°С, сформирован из белков электрсфсрстичоских полос I, 2, 2.1; у крысы - это полосы 2.1-2.5, 8; а у собаки - I, 2, 2,1-2.5, 4.9. Второй блок, инактикфуемый при средней температуре около 55°С, сформирован у человека из белков элоктрофоретичоских полос 4.2 и 4.9; у крысы - 4.9; а у собаки - 4.5 и С. Третий блок (средняя температура инактивации около 62°С) сформирован у чело-виса из белков полос 3, 4.1, 5, 6; у крысы - I, 2, 3, 7; а у собаки из полос 3 и 4.1. И, наконец, четвертый блок включает в себя в случае человека белок полосы 7, в случае крысы - белки полос 4.1, 4.2, 4.5, 5 и 6; а в случае собаки -вероятно, белок полосы 7. Нагл представляется, что это является убедительным доказательством различий в организации эритроцитарных мембран различных видов позвоночных.

В последние годы установлено, что спонтанная генетическая гипертензия у крыс сопрововдается нарушением функций

мембраны эритроцитов (ее проницаемости для одновалентных катионов, связывания и АТ<5-зависпмого транспорта кальция) и это связано с существенным нарушением ее структуры (Орлов и др., 1981; Ко1Пеипу-Саго81;1ег ег а1., 1983 ). С ПОМОЩЬЮ иикрогечсриметриа с использованием метода последовательного отжига !■".'.• !;о;У13.и!и, что интенсивность тегоюпоглощения в С переходе для спонтшшо гипертензивных крыс достоверно выше (на 10*), чем у нормотензивных. Сравнительный анализ дашгых гель п.олст; "!'.ропа по/сазал, что различие в количестве белка полосы 3 действительно существует. В соответствии с гипотезой Дуг.,1 Ясккера (1983) ионы щелочив металлов могут проникать через мембрану эритрамтов в ввдо отрыштельно заряженных одновалентных аниоттх пар с некоторыми двухвалент-!1!Г.:н аннонами, в частности, с кярбонат-аниоиом. Если подобный транспорт натрия в эритроцитах существует, то повышенное содержание болкя полосы 3 у гипертензивных крыс может вносить спой вклад в повышенную константу скорости Иа+/Иа+ обмена.

Из постно, что фушеционалыше нарушения эритроцитарных мембран у крысы и человека при гппортошш одинаковы ( Ог1оу, Роз поV, 1982 ). !3 мембранах эритроцитов больных гипертонической болезнью при использовании метода последовательного отч:пга !"и обнаружили, что максимумы Вд и С переходов сдвинуты в область болсо высоких температур, а В^ переход су-1![г'стпсш10 ушпрон. Эти результаты свидетельствуют о нарушении упакошеи болкошх молекул в мембране при патологии. Для С перехода в мембранах эритроцитов больных гипертонией наблюдается почти 30^ увеличение энтальпии, что, как и в случае гипертензивных крыс, указывает на обогащенность этих мембран белком, обеспечивающим шгаошшй транспорт.

Эффективным оказалось использование метода сканирующей микрокалориметрии для изучоши влияния электромагнитного излучения радиочастотного диапазона на мембраны эритроцитов. Воздействие излучения частотой 330 мГц (УПМ менее 10 Вт/кг) приводит к изменению начального уровня теплоемкости, уменьшении энтальпии всех элементарных переходов и к изменению температуры С перехода (снижается на 2-3°0). Все эти изменения необратимы.

Фоторецепторные мембраны

Несмотря на значительные успехи, достигнутые в последние

года в расшифровке аминокислотных последовательностей целого ряда зрительных пигазнтов позвоночных (жрр1еЪигу, Наг£-гауе, 1986 ),до сих гор остается открытым вопрос о связи структуры с функциональными и физико-химическими свойствами рецепторной клетки. Учитывая сложность организации и многообразие взаимодействупаих компонент в клетке, нам представляется, что именно такие интегральные методы как ми:-:рокалориметрия, способны внести существенный вклад в понимание организации зрительных пигментов в составе фоторецепторной клетки, ее изменений при различных типах воздействий.

На рис. 6 приведены данные, характеризующие зависимость избыточного теплопоглощения суспензии наружных сегментов палочек сетчатки (НСШ быка от температуры для темповых (а) и

Рис. 6. Температурная зависимость избыточного теплопоглощения • суспензии темповых (а) и обесцвеченных (ъ ) НСП быка в 0,1 11 фосфате натрия, рН 6,8. Концентрация зрительного пишента -1,91 иг/мл. Вертикальная отметка: 10~® Дк/К. Теплопоглощение фоторецепторного белка заштриховано

обесцвеченных (ь ) препаратов в 0,1 М фосфате натрия, рН 6,8. Как ввдно из рисунка, тепловая инактивация НСП представляет собой сложный многостадийный процесс, цростираю-щийся от 40 до 80°С. Для идентификации переходов, наблвда-емых в этом температурном диапазоне, мы, как и в случае эритроцитарных мембран, использовали метод гермо-гель-ана-лиза. Полученные таким образом результаты позволяют сделать

40 50 Ю 70 СО

*.*с

весьма надежное относенио пиков теплопоглощения для родопсина и, что особенно ценно, для опсина в НСП. Измеренные термодинамические параметры, характеризующие денатурации зрительных пигментов сведены в табл. 2.

Известно, что мерой стабильности кативной белковой структуры является свободная энергия перехода из нативного состояния в денатурированное или разность свободных энергий нативного и денатурированного состояний при какой либо конкретной температуре - дсг. Расчетные значения свободной энергии денатурации для родопсинов (опсинов) в НСП исследуемых хивотйр: в широком диапазона температур приведены на рис. 7.

Рис. 7. Температурная зависимость разностей свободных энергий для нативного и денатурированного состояний фото-рецепторных белков.

1 - родопсин быка,

2 - опсин быка, 3 -родопсин крысы. 4 -опсян крысы, 5 - родопсин лягушки, 6 -опсин лягушки. 0,1 М фосфат натрия, рй 6,0

Величина свободной энергии стабилизации нативной структуры родопсинов в области физиологических температур дая исследованных животных оптимальна, т.к. известно, что в бшлогичоских процессах энергия, как правило, обменивается порциями 20-40 кД-е/моль и, следовательно, те же величины должна иметь верхняя граница ¿информационной стабильности белка. Как следует из полученных результатов, огромный вклад д естабилизацию нативной структуры родопсинов вносит простатическая группа - ротиналь. Для родопсина быка и кры-. сы при 37°С этот вклад составляет соответственно 30 и &0%, - -а для лягушки при 10-15°С - около 70#. Неолвданши оказалось,, ' 21.

Таблица 2. Термодинамические параметры тепловой денатурации зрительных пигментов

в 0,1 и фосфате натрия, рН 6,8

Родопсин

Олеин

Лпвотноа

лН

(кДх/моль)

(кЛж/К* моль)

Та (К)

дН (кДж/моль)

(кПд/К* моль)

Та (К)

Бик

Крыса

Лягушка

630±12 416±Ю 4Ю±Ю

14,2±1,1 347±1 490±10 4,3±0,4 340^1 269±7 6,2±0,4 340±1 158±3

4,3±0,3 5,8±0,4 3,5^0,3

332±1 320±1 319-1

что два отдаленных "взда позвоночных - крыса п лягушка характеризуются сходными термодинамическими параметрами стабилизации структур родопсинов и опсиков. При этом посла обесцвечивания свободная энергия стабилизации структуры опенка крысы при 37°С становится соизмеримой с величиной iiL, что в свою очередь может приводить к его спонтанной термоденатурации.

Пурпурные мембраны Hßlot>actcriun halobiun п Основным компонентом пурпурных мембран (ПМ) является белок с молекулярной массой 26,7 кЛ. На долю этого белка приходится V5% сухого веса мембран, а остальные 25% составляют фосфолипццы, доминантным из iкоторых является фосфати-дилглицерофосфат. При микрокалориметричеекзх исследованиях ПМ'в перЕых работах (Jocksoa, sturtsveat, 1978; Лазарев, Шяыров, 1979) было обнаружено два термопццуцированвых перехода: •низкотемпературный - 80°С-переход (полностью обратил) и высокотемпературный - 100°С-переход (необратимый). Низкотемпературный переход коррелирует с изменениями в спектре поглощения бактериородопсина (Е?) в видимой области спектра. С повышением температуры походная штоса поглощения в видимой области спектра с максимумом 560 ел уяиряется п г сдвигается к меньшим длинам волн. Применяя известный способ разложения спектрального контура на компоненты по Алленцаву (Фок, 1972), можно показать, что смещенная поль-оа представляет собой суперпозицию двух компонент с дагеимуй^ма 560 и 490 нм, форма которых практически не измендется в .юследуе-мом диапазоне температур. Дошшёниз' температуры сопровозда- ' ется "перекачкой" интенсивности из полосы с максимумом 560 -нм з полосу с максимумом 490 нм. Поэтому можно продпалолпть, что мы игле ем дело с двумя различными состояниями хромофора - "формой 560" и "формой 490". Первый максимум на 1фивой тегиопоглощени,! совпадает с серединой перехода "формы.560" в "фор!лу 490". Эта корреляция сохраняется в широком интервала pH. При оолее высоких температурах, когда появляется второй пик теплопоглощения, поведение системы приобретает '.иной характер. Возникает полоса поглощения о максимумом 370 нм ("форма 370"). Эта вторая стадия сопровождается существенными изменениями ИК-спектра°ПМ, особенно отчетливо' проявляющимися в области валентных колебаний пептидных С0-групп (амид I). Полоса аывд'1, форма которой на протяжениг

пергой стадии теплопоглощения оставалась неизменной, в области второго пика теплопоглощения деформируется, в ней появляются компоненты с максимумами поглощения при 1635 и 1690 характерные для полипаптвдных цепей, упакованных

в 5> -структуру. Охлаадение суспензии не цриводит к восстановлению исходной конформации белка, что указывает на отсутствие обратимости. 1

Полоса поглощения с максимумом 490 ш возникает не только при нагревании ИМ, но и при увеличении рН больше II, добавлении в среду суспендцрования Ш органических растворителей, при обезвоживании Ш и других воздействиях, связанных всегда с нарушением кристаллической упаковки ЕР в Ш (Шкроб, Родионрв, 1978; Оеа1егЬе1Л et а1., 1973; Ьавогеу, 1егривоу, 1960).

С целью идентификации, наблюдаемых микрокалориметрически и спектрофогометрически, термотропных переходов в Ш были проведены работы по исследованию ультраструктурных изменений мембран методом электронной мшдгаскопии. При этом, в связи с проблемой цространственного строения ЕР мы проверили, как различные модификации полипептвдной цепи хромофора этого белка могут сказываться на ультраструктурной организации и вызванных нагреванием структурных перестройках мембран. Злектронномшфоскопическое исследование методом заморакивания-скалывания показало, что Ш в суспензиях любой концентрации выглядят как плоские пластины, ориентированные преимущественно параллельно друг другу. На репликах, полученных при достаточно малых углах оттенения, хорошо выявляется ре1улярная упаковка белка на Р-поверхностях (гидрофобная поверхность расщепленной половины мембраны, прилежащой к вуклеоаду бактерии) и регулярный рельэф на комплементарных к нигл Е-поверхностях. При нагревании суспензии ИМ до 60-65°С плоские мембраны в основном превращаются в полусферы, а незначительная их часть замыкается в сферические пузырьки. При 75-85°С Есе мембраны фрагыантируются и большая часть фрагментов замыкается в пузырьки. Инкубация суспензии при 90°С соцровогдаэтся дальнейшей фрагментацией мембран е замыканием всех фрагментов. При образошшш замкнутых пузырьков ШД всегда ориентированы ЦЕГопльешигаеской' (нуклеоидной) поверхностью наруку» аяеажрошюьшщюскошчео-яое изучение сожазало, что Ш пра рЫ больше 12 фрамлентпру-

ются и замыкаются в сферические пузырька точно так за, как и при высоких температурах, однако при этом не удается наблюдать четкий регулярный рельеф на Р-поверхностях мембран, обычно выявляемый при нагреве вплоть до 90°С. По всей видимости, изменения структуры мембран обусловлены денатураци-онными переходами в участках пептидной цепи БР, локализованных вблизи цитоплазматической поверхности ПМ. Зти участки, вероятно, определяют регулярность упаковки белка, которая в свою очередь придает определенную жесткость плоским пурпурным "бляшкам" в бактериальной мембране. При денатурации таких ключевых участков жесткость белкового кристалла нарушается,' мембрана фрагментируется, а фрагменты стремятся принять сферическую замкнутую конфигурацию, характерную для фрагментов биологических мембран различного происхождения. При этом однозначность ориентации мембран в замкнутых пузырьках указывает на асимметрию в распределении белка.

На рис. 8 приведены термограммы суспензий ПМ я их модифицированных производных в 0,05 М боратном буфере при

Рис. 8. Изменение избыточной удельной теплоемкости суспензии пурпурных мембран- и их модифицированных производных з 0,05 № боратном бусроре, рН 9,55: 1 - интактные Щ (штамм 353-Ш, 2 - мембраны, содержащие И? без С-кониевого фрагмента, 3 - апомекбраны, 4 - мембраны с ретинилбактериоон-сином, 5 - интактные ИМ (штамм г^м-, ) б - ПМ, содер.тащпе аналог БР, получонный биоскнтетичесглй замепой триптофана на 5-фтортриптофан

рН 9,55. Видно, что отщепление С-концевого фрагмента ЕР приводит к сдвигу максимума теплопоглощен»¡я высокотемпературного перехода от 80 к 83°С. Как показало электронномик-

роскс зтческое исследование, при отщеплении 0-концевого фраг-. иента ЕР не утрачивается присущая наганным мембранам способность образовывать цра нагревании везикулы, ориентированные цнтоплазматпческоЁ поверхностью паругу. Формирова- . нею этих везикул отвечает обнаруживаемый ышфокалорикетри-чески структурный переход с максимумом теплопоглощення при 75°С. Превращение ЕР в бактерис опсин при обработке Ш гцд-роксплаыином на свату сопровоздается образованием ез> плоских нативных мембран сферических пузырьков и полусфер, ориентированных цитоплазматической поверхностью наружу, и значительным нарушением гексагональной упакрвки белка. Такая обработка Ш приводила к сдвигу иаксвдуыа теплопоглощенпя высокотемпературного перехода от 88 до 68°С, т.е., к значительной дестабилизации мембран. Инкубация апомембран с экзогенным полностью транс-реткналем приводила к появлению популяции плоских мембран, идентичных натквным ПМ, В отлична от гццроксилампнолиза восстановление Шилова' основания • ЕР приводит к стабилизации мембран. Из электронномикроско-плческих исследований этих мембран видно, что они сильно искривляются, часто приобретая сферическую форму с ориентацией цитоплазматической поверхностью нарушу, однако при этом сохраняется гексагональная упаковка белка в Ш. Нагревание мембранной суспензии до 85°С приводит к формированию более мелких везикул с той же ориентацией мембран и сохранением рельефов гидрофобных поверхностей.

Из совокупности приведенных ваше данных следует, что нагревание суспензии Ш или их модифицированных производных приводит к постадпЕныы структурным переходам. Исследование ТЫ клеток штамма 352-П методом шхрокалориметрии позволило выделить не менее трех стадий. Первая стадия начинается при температуре около 40°С, имеет максимум на кривой теплопоглощения в диапазоне 50-70°С (в зависимости от рН среды) и полностью обратима. Вторая стадия обнаруживается в узком температурном диапазоне (73-80°С для интакткых Ш) и проявляется на термограыьлх по-разному: а) в виде разрешенного пика теплопоглощения в случае интакткых мембран (для штамма - не разрешается), б) в в аде отчетливого плача в случае Ш без С-концевого фрагмента ЕР, в) в виде неявно выра-кенного плеча с низкотемпературной стороны высокотемпературного парохода в случае мембран, содержащих ре'хинил-бак-

териородопсин. Зха стадам тзршдгпг&ячбсет нео братка п соответствует процессу образования везикул. Третья стадия соответствует денатурация белкового компонента ИМ.

Заключения содержит краткий итог проведенных исследований, на основании которых сформулированы выводы.

0СН0ЕНЫ2 ЕБ0Д1

1. Для анализа сложных контуров теплопоглоцения, характерных для большинства надмолекулярных систем, предложен метод последовательного отжига, основанный на минимуме допущений: симметрия элементарного контура теплопоглощения и частичная или полная необратимость деиатурационных стадий. Метод предполагает независимость- термоиндуцированных превращений в частях (блоках, доменах) системы, теплопоглощение которых представлено элементарными контурами, и ка практика является способом проверки этой независимости.

2. Применение метода последовательного отяяга з сочетании с 70, 1<Л и ИК спектроскопией, собственной бзлковоЗ флуоресценцией, термо-гель-анализом, химической н протеолитической модификация!«',!!, электронной микроскопией к исследованию ряда биологических мембран позволило выявить некоторые общие закономерности:

а) элементарные составляющие сложных контуров теплопоглощения характеризуют термогатктивацию отдельных мембранных блоков (доменов), состоящих как правило из набора болков;

б) функционально подобные мембраны различных животных отличаются друг от друга по составу этих блоков (домзнов);

в) процесс тепловой денатурация мембранных балкоа харантз-ризуотся терглякнамячоскика параметрами Ляизкиет го сгоай величине к таковым для больякнетвз водорастворшягх глобулярных белков.

3. При исследовании эритрецптарных мембран показало, что, для человека, первый блок, инактивируемыЯ при средней температуре около 50°С сформирован из болков элоктрофоретичос-кях полос I, 2, 2.1; у крысы - это полосы 2.1-2.5, 8; а у

.собак:! - I, 2, 2.1-2.5, 4.9. Второй блок, инакттзируешй при средней температуре около 55°С, сформирован у человека из белков электрофоретических полос 4.2 я 4.9; у крысы -4.9; а у собаки - 4.5 я б. Третий блок (средняя температура. инактивадии около 62°С) сформирован'у чоловока пэ белков-полос 3, 4.1, 5, 6; у крысы - I, 2, 3, 7; а у собаки из

полос 3 ы 4.1. И, наконец, четвертые, caiaü термостабилышй блок, вюшчазт в себя в случао человека балок полосы 7, в случае краен белки полос 4.1, 4.2, 4.5, 5 и 6, а в случаа собаки - вероятно белок полосы 7.

4. При исследования наружных сегментов палочек сетчатки ряда животных были идентифицированы тепловые перехода, связанные с денатурацией родопсинов (опсинов). Показано, что при обесцвечивании»зрительных пигментов свободная энергия стабилизации пативной белковой структуры при физиологических значениях pH в температуры (~40 кДк/иоль) снижается в 2-4 раза. Высказано предположение, что такое снижение значения свободной энергии может приводить к спонтанной тепловой денатурации о псина.

5. При исследовании пурпурных мембран iiaiotacteriun halo-Ъ1из обнаружены необычные термоиндуцированные переходы, связанные с изменением надмолекулярной организации. Процесс термоЕнактивации этих мембран протекает в три стадии. На первой стадии происходит нарушение кристалличности упаковки бактериородопсина з мембране без изменения конформации • белка. На Бторой стадии ез есходно плоских мембран образуются сферические везикулы, ориентированные цитоплазматичес-кой стороной во внешнюю среду с частичным сохранением гексагональной упаковки белка в мембране. На третьей стадии происходит денатурация бактериородопсина. На основании данных, полученных из методов сканирующей юперокалориметрш н электронной микроскопии предложена новая модель укладки голипэптидных цепей бактериородопсина, согласно которой белок расположен в основном с ютгоплазыатической сторош мембраны.

6. Обсуждается возшжность применения метода сканирующей микрокалориметрии для решения некоторых медико-биологических задач. Так, показано, что при первичной гппертензии (гипертонической болезни человека и ее экспериментальной модели - спонтанной генетической гипертензии крыс) изменена структурная организация мембран эритроцитов, на 10-3 увеличено содержание белка полосы 3, что ыэжет вносить вклад в наблюдаемое при первичной гипертонии повышение скорости ионного обмена.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕ® ДИССЕРТАЦИИ

1. Берман А.Л., Сьетапгев В.П., Рычяова М.П., Шныров В.Л. ЛипидныЯ состав фоторецэпторных мембран сетчатка и температурная стабильность родопсинов у морских рыб Японского Торя // ФИЗИОЛОГИЯ И бИОХЛМИЯ морских И ПРЭСКОЕОД-ных животных. Л.: Наука, 1979. С. 172-180.

2. Лазарев Ю.А., Шныров В.Л. Исследование тепловой денатурации бакгериородопспяа из Hnlobaatartun halobiun // Епоорган. химия. 1979. Т. 3« Д I. С. I05-II2.

3. Ошров В.Л., Борман А.Л., Лазарев D.A. Изучение тепловой денатурации родопсина, в наружных сегментах палочек сетчатки быка методом .инфракрасной спектроскопии // Биофизика. 1979. Т. 23. й 3. С. 752-754.

4. Еныров В.Л., Багироз Я.Г., Берман А.Л. и др. Исследование термокадуцироЕшашх кскформациошшх переходов в белковых компонентах, фоторецепторных мембран позвоночных и беспозвоночных животных // Химия и физика белков и пептидов: Тезисы докладов У Всесоюзного симпозиума. Баку, 1980. С. 142.

5. Шныров В.Л., Лазарев Ю.А. Ыикрокаяорпмзтриче склэ и спектральные исследования тепловой денатурации родопсинов различного происхождения // КонфоркационЕыэ изменения биополимеров в растворе: Гезпсн Всесоюзного совещания. Телави, 1980. С. 73.'

6. Берман А.Л., Еныроз В.Л., Багнров И.Г. и.да. влияние освещения на устойчивость родопсина быка и кальмара к тепловой денатурации // Докл. АН СССР. 1981. Т. 256. JS 2. С. 487-491.

7. Шшров В.Л., ТараховскпЗ Ю.С., Боровягш В.Л. Изучение структурны:: изменений з пурпурных мембранах из Halobao-teriun holoblun при температурной и щелочной денатурации // Биоорган, химия. 1981. Т. 7. й 7. С. 1054-1059.

8. Шныров В.Л., йилиппова Е.А., Чокулаева Л.Н., Сухомудрен-ко А.Г. Анализ конформаций и тзрмокндуцпрованнкэ превращения бактердародопспна в пурпурных мембранах из Hoi.obr.o-

о г lira halobiua // Биооргал. химия. IS8I. Т. 7. ü 9. С. I3I8-I327.

9. Алдапэв A.A., Закис В.И., Курятов А.Б., Опзчхста Г.2,, Шкыроз-В.Л., Цетлин В.И. Топография участка связыванЕ,?

. . хромофора в бактерЕородопспна // Структура и фушпгси

белков в нуклеиновых кислот: Тезисы докладов 6 Советско-Французского симпозиума. Цхалтубо, 1982. С. 124-125.

10. Шныров В.Л., Боровягин В.Л., Лазарев Q.A. и др. Термо-индуцированные превращения в пурпурных мембранах Halo-baoteriuo h&Iobium // I Всесоюзный биофизический съезд: Тезисы докладов. Москва, 1982. С. 174.

11. Гулак П.В., Орлов С.Н., Шныров В.Л. и др. Некоторые особенности мембранных белков эритроцитов крыс со спонтанной гшертензией // Кардиология. 1983. Т. 23. Л 12. С. 59-61.

12. Жадан Г.Г., Ким Ю.А., Шныров В.Л. н др. Калориметрический подход к исследованию влияния электромагнитного излучения радиочастотного диапазона на плазматическую мембрану эритроцитов // Докл. АН СССР. IS83. Т. 269. К 3. С. 747-749.

13. Орлов Н.Я., Тиценков В.Г., Багиров И.Г., Шныров В.Л. Гуанозин-трифосфатный комплекс в наружных■сегментах палочек сетчатки лягушки // Биофизика. 1983. Т. 28. Je 5. С. 793-799.

14. Орлов С.Н., Шныров В.Л., 2эдан Г.Г. и др. Микрокалориметрическое исследование суспензии мембран эритроцитов в норме и при гипертонической болезни // Балл, экспер. . биол. мед.■1983. Т. 46. й 9. С. 55-56.

.15. Цетлин В.И., Закис В.И., Алдашев A.A., Курятов A.B., Овечкина Г.В., Шныров В.Л. Топография ретшальсвязыва-пдего участка в восстановленных щюезбодных бактерио-родопсина // Еиооргая. химия. 1983. Т. 9. К 12. С. 1589 -1605.

16. Енцров В.Л., Закис В.И., Боровягин В.Л. Етяние химической и ферментативное модификации бактериородопснка на структуру пурпурных мембран // Е;;од. ¡.-собрали. 1884. Т. I. J3 4. С. 319-355.

17. Шныров В.Л,, Сухоглудрекко Л.Г. Дшиипчоокио свойства пурпурных г.с«бр?а // Спектроскопии й'аопсапиеров: Токи-си У Есасоюзиои icoßjopßttcsi. Хорькоа, ISS4. С, 2SS-27I,

18. Шнцров В.1., Саяая Ц.Х., 2йдаи Г.Г., Порядков Е.А. Ка-лорглойричесвое псакщогаага струкгягснк переходов в ггрггродаз&раой tsröpaas крыс // Фпзшсо-заицческпэ свойства бшполг^эрав а растворе и клетка:: Тоска: докладов селюзгу.,2.. Цувдно, 1985. 0. IS5-ISS.

19. Шныров В.Л., Салия Ц.Х., Жадан Г.Г., Пермяков Е.А. Исследование физико-химических свойств мембран эритроцитов крыс // Конформационные изменения биополимеров в растворах: Тезисы У1 Всесоюзного симпозиума. Тбилиси,

1985. С. 79.

20. Акоев И.Г., Алексеев С.И., Тяхелов З.В., Фоменко Б.С., Шныров В.Л. Первичные механизмы действия радиочастотных излучений // Биологические эффекты электромагнитных полей. Вопросы их использования и нормирования. Пущино,

1986. G. 4-14.

21. Веденкийа Н.С., Ишыров В.Л., Островский A.B.- и др. Индуцируемые теплом 'структурные перестройки стержневой части молекулы миозина // Биофизика и биохимия биологической подвижности: Тезисы докладов УШ Всесоюзного симпозиума. Тбилиси, 1987. С. 12.

22. Шныров В.Л., Берман А,Л. Калориметрическое исследование тепловой денатурации зрительных пигментов позвоночных // Химия белков и пептидов: Тезисы докладов УП Всесоюзного симпозиума. Таллинн, 1987. С. 138.

23. Шныров В.Л., Ладан Г.Г. Сканирующая микрокалоримбгрия как метод исследования взаимодействия радиочастотного излучения с биологическими объектами // Механизмы биологического действия электромагнитных излучений: Тезисы докладов симпозиума. Пущино, 1987. С. 14-15.

24. Бобровский Р.В., Исламов Б.И., Жадан Г.Г., Буевэт В.А., Шныров В.Л. Влияние внелегочной фторуглеродной оксиге- ' нации крови на термотропные свойства мембран эритроцитов собаки // Тезисы докладов Ш съезда Всероссийского научного медицинского общества анестезиологов а реаниматологов. Ростов на Дону, 1988. С. 21-22.

25. Салия Ц.Х., Жадан Г.Г., Пермяков Е.А., Шныров В.Л. Влияние pH и концентрации буферного раствора на тепловую денатурацию тоней эритроцитов крыо // Изв. АН ГССР.' Сер. биол. 1983. Т. 14. К I. С. 57-61.

• 28. Терещенко A.B., Шныров В.Л. Тепловая денатурация сперматозоидов петуха // Еаучн.-техн. бш. УНИИП. 1988. № 24. С. 33-37.

27. ШннрозВ.Л., Левицкий Д.И., Ведепкипа Н.С. к др. Ломанная структура субфрагмента I миозина // Докл. АЦ СССР. ' 1989. Т. 304. Л 6. С. 1497-1499.

28. Bersaa JUL. t Shnyrov V.L., Ryohkova !■'.?., Semen'kov P.G. Thermostability of see fish rhodopsins // Vision Ree. 1981. V. 21. No A- P. 731-737.

29« Shnyrov V.L., Sukhomudrenlco A.G. Phase transitions in rhodopcin-ccntainins membranes // Bio-calorimetry: abstracts of international symposium. Tbilisi, 19B1. P. 27.

30. Borovyagin V.L. Shnyrov V.L. Study of ultrastructural and thermodynamic properties of purple membranes of Halobacterium halobium // Biological membranes: structure and function: Abstracts of III poviet-Srriss symposium. Tashkent, 1983* P. 16.

31• Permyakov E.A., Shnyrov V.L. A speotrofluorimetric study of the environment of tryptophans in bacteriorho-dopsin // Biophys. Chem. 1983. V. 18. Ho 2. P. 145-152.

32. Permyakov E.A., Shnyrov V.L. Environment of tryptophane residues in purple membranes of Halobaoteriuia halo-biun // Biological membranes: structure and function: Abstracts of III Soviet-Sniss symposium. Tashkent, 19B3. P. 136.

33. Borovyagin V.L., Shnyrov V.L. Comparative study of ultrastructural end thermodynamics! properties of photoreceptor and purple membranes // Abstracts of 8th Europ. Cong. El. Microscopy. Budapesht, 1984. V. 2. P. 1501-1502.

34. Gulak P. V., Orlov S.N., Pokudin H.I., Postnov Yu.V., litvinov I.S., Orlov N.Ya., Shnyrov V.L. Microcalori-mstry end electrophoresis of the erythrocyte membrane of spontaneously hypertensive rata // J. Hypertension. 1964. V. 2. % 1. P. 81-84.

35. Shnyrov V.L., Zhadan G.G., Akoev I,G. Calorimetrie measurements of the effect of 33°-iiHz radiofrequency radiation on human erythrocyte ghosts // Bioelectromeg-netics. 1984. V. 5. No 4. P. 411-418.

36. Shnyrov V.L., Solijo C.H., Zhadan G.G., Permyakov E.A. Thermal transitions in rat erythrocyte ghosts // Bio-mad. Biochim. Acta. 19&6. V. 45. % 9. P. 1111-1119.

37. Shnyrov V.L., Sukhosufir6nl:o A.G. Dynamic properties of baoteriorhodopaia la purple Esmbreneo upon haat treatment // Biopfcyc. Chemlatry. 1SB6. V. 24. Ifo 1. P. 1-4.

38. Shnyrov V.L., Zhadan G.G.,Theraal transitions in rat erythrocyte ghoatn // Electromagnetic fielda and bio-tnenbranea: Abstracts of lot school. Pleven, 1986. P. 116.

39. Zhadan G.G., Shnyrov 7.1. Effect of radiofrequency radiation on the human erythrocyte ghosts // Electromagnetic fieldo and bioaembranea! Abstracts of 1st international school. Pleven, 1936. P. 161.

40. Shnyrov V.L., Berrien A.L. Colorimetric study of thermal denaturation of vertebrate visual pigments // Bioraed. Biochinj Acta. 1988. Y. 47. No 4/5. P. 355-362.

41. Shnyrov V.L. Microealorinetric studies of the biological membranes // Chemical thermodynamics! Abstracts of 10th IUPAC conference. Prague, 1988. P. 66.

42.. Zhadan G.G., Bobrovski R.V., Akoev V.R., Permyafajv E.A., Shnyrov V.Ii. Thermal transitions in dog erythrocyte membranes // Chemical thermodynamics: Abstracts of 10th IUPAC conference. Prague, 1988. P. 68.