Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Системный анализ белков почки человека в норме и при некоторых видах патологии

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Системный анализ белков почки человека в норме и при некоторых видах патологии"



*

На правах рукописи

ОБЕЛЬЧУК ЛЮБОВЬ ИОСИФОВНА

СИСТЕМНЫЙ АНАЛИЗ БЕЛКОВ ПОЧКИ ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ И ПРИ НЕКОТОРЫХ ВИДАХ ПАТОЛОГИИ.

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1997

Работа выполнена в лаборатории биохимической г&нзтики Медико-генетического научного центра РАМН и Научно-исследовательском центре Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор С.С.Шишкин, доктор медицинских наук П.З.Хасигов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Тогузов Р. Т.. доктор биологических наук Абакумова 0.Ю.

Ведущая организация, - Московский медицинский стоматологический институт им. Н. А. Семашко.

заседании диссертации

Задита состоится

университете дружбы народов по адресу: 117198. Москва, ул.Миклухо-Маклая, д..8. медицинский факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета друнбы народов по адресу: 117198. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.

Автореферат разослан

УчекыЛ секретарь диссертационного совета доктор ыедоцннсклх наук, профессор

В. Э. Торбек

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение особенностей генной экспрессии и соответствующего синтеза белков в разных видах тканей и органов человека, в частности органов моче-половой системы, является одной из интенсивно разрабатываемых областей биохимии. Большой интерес к белкам почки во многом обусловлен важностью функционирования этого органа для поддержания гомеостаза в организме, а также распространенностью и тяжестью почечной патологии. За последние десятилетия появились тысячи публикаций, которые были посвящены изучению белковых компонентов ткани почки. Например, активно изучалось распределение ряда ферментных систем в сегментах нефрона [Wright P. et al.,1990), калликреин-кининовой системы [Omata К. et al.,1982], процессов реабсорбции белка [Gelbel J..1990; ,], исследования гормональных рецепторов CKoeclln N. et al.,1989] и т.д. Много внимания уделялось и изучению изменений почечных белков при различных патологических процессах (Lapin et äl, 1989; Вельтищев Ю. В.. Игнатова Н. С., 1992].

Вместе с тем, в последние годы биохимические исследования белков приобрели некоторые новые черты. Вследствие развития представлений о связи между генами и кодируемыми ими белками, а также, благодаря развитию новых технологий изучения белков, возникло особое научное направление на стыке биохимии и биохимической генетики,. получившее название - "системный подход к изучению белковых продуктов генной экспрессии" [Anderson . Anderson, 1979; Шишкин С.С.,1985: Klose, 1989; .Cells et al, 1990]. Этот подход аккумулирует исследования, конечной целью которых является формирование каталога(ов) белков для всех типов клеток, тканей, органов и биологических жидкостей человека. Для достижения цели предполагается использовать широкий арсенал методов, центральное место среди которых отводится двумерному электрофорезу белков по О'Фаррел-лу (2ДЕ) [O'Farrell, 1975, 1977]. Обладая чрезвычайно высокой разрешающей способностью, 2ДЕ позволяет эффективно проводить разделение белковых смесей, состоящие из тысяч белков, и характеризовать их по независимым физико-химическим характеристикам - молекулярной массе (Mm) и изоэлектрической точке (pi).

Результаты 2ДЕ-анализа белков служат основой для составления соответствующих белковых каталогов, в которые стараются вклачить и всю биохимическую информацию, полученную при исследованиях белков традиционными методами (Klose, 1989; Cells et al, 1ЭЭЗ,15СЧ!.

Некоторые такие каталоги уже доступны для пользователей через компьютерные сети. (2-D PAGE databases [Cells et al. 19963 и SWISS - 2D PAGE databases [Hostrasser et al. 1996]). Обобщенная и 6i тро расширяющаяся биохимическая информация о белках человека приобретает несомненную теоретическую и практическую значимость. Она становится основой изучения особенностей генной экспрессии в самых разнообразных обьектах. отражая специфику процессов диффе-ренцировки и развития. Кроме того, она важна для изучения патогенеза заболеваний, создания эффективных методов их диагностики и . лечения. Сравнительный анализ белковых спектров нормальных и патологических образцов уже позволил обнаружить биохимические маркеры некоторых патологических состояний [ Miller, Harrison 1992; Hall. Matheson, 1994].

Пока лишь в очень немногих работах, посвященных изучению по-чечк х белков, использовалась стратегия системного подхода, что. вероятно, обусловлено морфологической сложностью строения почки [Smith et al. 1.980; Tracy et al, 1982; Zlal et al, 1984; Хасанбае-ва Г.Ш. и соавт.,19921. 2ДЕ-анализ суммарных белков почки человека практически не проводился, за исключением отдельных работ, . в которых оценивались способы получения морфо-функциональных структур ,почки , были построены предварительные двумерные карты корко-• вого вещества; клубочков и базальных мембран клубочков [Хасанбае-ва Г.Ш. и соавт,.¿991: 1992]. Соответственно, исследования, направленные на получение более полной характеристики белкового состава почки и составляющих ее морфологических структур, имеют большой теоретический и практический интерес.

В данной работе построен новый вариант каталога и создан комплект двумерных карт, последовательно от суммарного гомогената белков почки человека к анатомическим отделам - корковому и мозговому- веществу почки, отдельным морфо-функщональным структурам , (клубочки, проксимальные отделы канальцев и базалыше мембраны), а также' результаты идентификации некоторых белков, выявления белкового полиморфизма и признаков аутолитической деградации.

Цель и задачи исследования.Целью настоящей работы явилось изучение и выявление комплекса наиболее количественно представленных белков (белковых продуктов генной экспрессии), как в суммарной ткани почки, так и в отдельных морфо-функциональных структурах, а также сравнительное „ изучение генетически детерминированных ссо-бзнностей строения ткани 'почек человека и линейных животных, признаков аутолитической деградации белков и изменений, обуслов-

ленных патологией.

Для достижения этих целей в работе решались следующие задачи:

1. На основе метода двумерного электрофореза по О'Фарреллу и ряда сопутствующих методов охарактеризовать физико-химические свойства комплекса наиболее представленных белков почки человека и ряда морфо-функциональкых структур.

2. Построить двумерные карты и каталог белков почки человека. Используя полученные карты выявить наиболее представленные и специфичные белки отдельных морфологических структур (коркового и мозгового вещества, клубочков, канальцев, базальных мембран).

3. Идентифицировать ряд белков почки на двумерных электрофо-реграммах и изучить наличие полиморфных вариантов белков, как в ткани почки человека, так и у инбредных линий мышей.

4. Провести изучение и выявить белковые маркеры аутолитической деградации в ткани почки человека и инбредных линий мышей.

5. Проверить возможность использования полученных результатов для изучения изменений белкового состава почек человека'при патологии.

Научная новизна работы. Оптимизирован ряд методик получения отдельных морфологических структур почки человека и проведен 2ДЕ-анализ содержащихся в них белков. Построена новая версия обобщенного каталога почечных белков, включающего 175 белков, охарактеризованных по значениям Mm и pi. а также по ряду других параметров. Отличительными чертами построенного каталога являются использование унифицированной системы обозначений белков (что делает полученные материалы совместимым с построенным ранее каталогом белков мышечной ткани человека [Kovalyov L. et al., 1995]), а также существенное расширение белковых характеристик. В частности, определены белки, специфичные для отдельных морфо-функцио-нальных структур почки, и осуществлена идентификация 9 почечных белков. При изучении вариабельности электрофоретических свойств полипептидных цепей почки человека и мыши обнаружено 9 полиморфных вариантов белков почки мыши, для которых выявились разные закономерности наследования у гибридов первого поколения.

Представлены новые данные о почечных белках, изменяющихся на ранних стадиях аутолиза. а также при различных патологических процессах в почках.

Теоретическая и практическая значимость работы. Охарактеризован комплекс из наиболее представленных почечных белков, который отражает особенности генной экспрессии в этом органе. Построенный

каталог почечных белков и двумерные карты позволяют вести целенаправленный поиск новых почечных белков, включая тканеспецифи-'ческие белки. Показано, что некоторые полипептидые фракции достаточно специфично локализуются в определенных морфо-функциональных структурах почки человека, и это открывает возможность их использования в качестве молекулярных маркеров при поражения отдельных почечных структур. Охарактеризованы ранние признаки протеолити-ческой деградации при аутолизе, как в ткани почки человека, так и в ткани почек лабораторных животных.

Полученные результаты могут быть использованы при изучении патогенеза различных болезней почни, что подтверждается проведенным анализом изменений в белковом составе почек при развитии почечной недостаточности разного генеза. '

Внедрение результатов работы. Практические рекомендации, разработанные на основании проведенного исследования применяются в практической работе кафедры биохимии Московской медицинской академии им, И.М.Сеченова, Москва; кафедры гистологии Северо-Осе-тинского государственного медицинского института. Владикавказ; Медико-генетическом научном центре РАМН, Институте биомедицинской химии РАМН; Москва; НИИ наследственных и врожденных заболеваний МЗ Белоруссии. Минск.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Сформирован.двумерный электрофоретический каталог и карта основных наиболее представленных белков почки человека, включающий 145 полипетидных цепей. Все фракции охарактеризованы по координатам молекулярной массы и изоэлектрической точки. При изучении морфологических структур почки допрлнитбльно выялено и.введено в каталог 30 полипептидов до суммарного количества 175.

2. Идентифицировано на двумерной карте положение фракций альбумина. актина, белка связующего жирные кислоты, альфа цепь АТФ-синтазы, аконитазы, альфа В кристаллика, десмина и 13 других белков', гомологичных с белкеии мышечной ткани.

3. Изучена сдецифичн.;ть белков морфологических структур почки человека ч ; выявлен ряд полипептидов специфичных для Коркового и мозгового вещества почки, проксимальных отдзлов канальцев, ба-зальной мембраны канальцев и клубочков. ,

4. Изучена вариабельность белков почки человека и выявлен ряд количественных различий. У инбредных линий мышей обнаружен ряд полиморфных вариантов белков почек с разным типом наследования.

5. Обнаружены маркеры аутолитинеской деградации, как общие для

мыши и человека, так и специфичные для человека и для отдельных структур почки.

6. Выявлены белковые маркеры хронической почечной недостаточности человека разного генеза.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на Международной встрече электрофоретического общества (США.1991), на 22 Международной встрече ФЕБО (Швеция,1993), на 1(3) съезде медицинских генетиков России (1994), на 16 Международном когрессе по биохимии и молекулярной биологии (Индия,1994), на совместном научном семинаре НИИ генетики человека МГНЦ РАМН и сектора биохимии белков НИЦ ММА (1996).

Публикации, По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Объем и структура диссертация. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, заключение, список литературы. Работа излозхена на 131 страницах машинописного текста и иллюстрирована 3 таблицами и 23 рисунками. Список литературы содержит 203 источника, Еключая 170 работ зарубежных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и-методы исследования. Основной материал для' изучения - аутопсийные образцы 30 человеческих почек, от лиц. погибших в результате несчастного случая, без признаков патологии почек (норма). Патологические образцы - операционный или аутопсийный материал (до 1 суток с момента смерти). Образцы представ/?ены из лаборатории консервирования и типирования органов Института трансплантологии и искуственных органов МЗ РФ. бюро судебно- медицинской экспертизы 2 Морга Иосгорздравотдела.

В исследованиях использовались почки инбредных линий мышей С 57 Bl/6JSto. DBA/2JSto, AKR/JSto. BALB/cJLacSto и CBA/CaLacSto. полученных иэ питомника " Столбовая " и гибридов первого поколения. полученных скрещиванием особей линий BALB и СБА.

В основных экспериментах использ вали корковое вещество неза-мороксекнх почек. Препараты клубочков и канальцев получали модифицированным методом дифференциального просеивания и разделения в магнитном поле [Krakower et al, 1951; Carlson et al, 1978]. Фракция базальных мембран проксимальных отделоз канальцев получена модифицированным методом с использованием криодиссоциации и ультразвуковой дезинтеграции [Westberg et al. 1970; Langeveld et al.

- б -

1985).

Подготовку образцов для двумерного фракционирования и двумерны-'йэлектрофорез по О Фаррелу проводили с некоторыми модификациями (Ковалев Л.И. и др.¡1986; Tsvetkova et al. 1991). Одномерный электрофорез проводили по Laemmly, 1970. Для определения концентрации белка в пробах использовали калориметрический метод Flores (1978).

Детекция белков после электрофореза осуществлялась в нефикси-рующих условиях 4 M р-ром ацетата К (Hlgglns, Dahmus. 1979), окрашиванием кумасси голубым R-250 (Fairbanks et al, 1971) и азотнокислым серебром (Blum, 1984). Идентификацию белков на электро-фореграммах проводили коэлектрофорезом. иммунохимически по Towbin et. al. (1979). При иммуноблоттинге применяли моноклональные антитела против десшша (штамм D 1033 фирмы "Sigma", США) и иммуно-перс .сидазный коньюгат против lg мыши ("Sigma", США; В качестве маркеров мол. массы применяли экстракт белков сердечной мышца мыши, приготовленный, как описано ранее [Ковалев Л.И.и соавт.,

1986], В качестве маркеров р! служили препараты карбомилярованных производных -карбоангидразы и креатинфосфокиназы фирмы LKB-Pharmacia (Швеция). При проведении коэлетрофореза использовали экстракт белков мио..арда человека, который получали как описано tKovalyov et al, 19953'. Пептидные фрагменты белков получали трипсинолизом (Cells et al, 19^0) п фракционировали ВЭЖХ (Лаптев А/8. И др.,1994). Определение N-концевоЙ последовательности белков и внутренних пептидов выполняли на газо-жидкостном секвенаторе 816 фирмы ','Кпаиег" (ФРГ) ло методике и программе фйрмы-про'изводителя. совместно с Ц. А. Егоровым и А. X. Мусалямслзд. Поиск аминокислотных последовательностей проводили с помощью пакета программ GENE-BEE по банку аминокислотных последовательностей SWISSPROT (версия 21). Денситометрию' электрофореграмм осуществляли на лазерном ден-с. /ометре Ultrascan XL (Pharmacla-LKB, Швеция) в комплексе с компьютером IBM РС/АТ-386, с использованием пакета программ GelScan Z. 1 и программы обработки видеоизображения Gelwlev (Ефимочкин А.С.). При статистической обработке использовали общепринятые методы (Урбе B.D., 1975).

г. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1.Построение двумерной злектроФоретической карты и каталога белков рочки человека. Используя суммарный гомогенат ткани почки

человека, мы провели исследование стабильности белкового состава почки 2ДЭФ по О'Фарреллу. Результаты электрофореза белков ткани почки, полученных от разных доноров, показали постоянство и воспроизводимость белкового спектра по качественному и количественному составу с незначительными вариациями в количественном содержании ряда белков. Типичная двумерная электрофореграмма белков почки, экстрагированных из 5 иг ткани при окрашивании красителем ку-пасси голубым R-250 представлена на рис.1.

Далее мы провели описание полипептидных пятен в системе прямоугольных координат, отражающих мол. массу и pi белков, используя калибровочные кривые, построенные по белкам с известными значениями мол. массы и pi. С этой целью анализировались результаты коэ-лектрофореза с белками миокарда человека, параметры которых были определены ранее выше указанным способом в условиях разделения, аналогичных нашим [Пуляева и др., 1991: Kovalyov et al. 1995]. Таким образом были определены координаты мол. массы и pi 145 наиболее представленных белков, детектируемых в суммарном экстракте почек. На Рис. 2 представлено схематическое распределение (двумерная белковая карта) основных белковых пятен почки. Каждому пятну присвоен свой уникальный семизначны! номер, В нумерации использовались. определенные нами, значения мол. масс (их десятичный логарифм - первые четыре цифры номера, и pi - последние три- цифры семизначного номера) аналогично тому, как это было сделано ранее для белков миокарда [Kovalyov et al. 1995].

Используя сформированный каталог наиболее крупных белков почки человека, мы провели изучение особенностей полипептидного состава отдельных морфологических структур почки человека.

2.Сравнительный анализ полипептидного состава коркового и мозгового вещества почки человека. При сравнении электрофореграмм коркового и мозгового вещества, а такие результатов коэлектрофо-реза этих тканей можно было выделить 4 белка, специфичных для мозгового вещества. По предложенной номеклатуре в каталоге белков ПОЧКИ ОНИ получили номера 4900660, 4581650, 4402544 И 4830604.

Более гетерогенное по своему составу корковое вещество, показало более выраженные отличия от мозгового вещества. К специфичным можно было отнести 13 белков, с соответствующими номерами: 4950704, 4840676, 4722683, 4722701, 4660705, 4660703, 4660702, 4662656, 4616690, 4584699, 4494650 4426700, 4402697, 4426614 И 4318709.

- о -

450»ЙЧ »!>5Л94

. -¿а-

4

I,

•■■¿.г

______: .473554,1 • ' ;

«34537

И

щыа-

'• ' " - • ■ ■ - - - »иЙиИ»»»««"«

Рис. 1. Типичная двумерная электрофореграмма белков почки человека. Окрашивание кумасси голубым К-250. Слева - одномерное разделение белков миокарда человека с обозначением мол. масс основных белковых полос. Обозначены некоторые из идентифицированных белков: 4634537 (актин), 4826608 (альбумин), 4700682 (АТФ-синтетазд), 4900660 (трансферрин), 4735544 (десшн), 4318709 (альфа-цепь В кристаллина), 4345703 (ми' тохондриальная суперонеиддисмутаза).

При исследовании отдельных структур (за очет увеличения белковой нагрузки) удалось детектировать 11 полипептидов, которые в ткани целой почки не выявлялись, но обнаруживались'как в корковом вом. так к в мозговом веществе. Координаты этих белков были определены как 4412675, 4410676, 4410678, 450|612, 4503612, 4614614, 4680607, 484557, 4870601,4873662 И 4995658.

Тагам образом, помимо 143 полипептидов, представленных в базовом каталоге ткани суммарной почки при исследовании белковых составов керкового и мозгового вещества, удалось дополнить сводный каталог до 169 белков,

3, Сравнительный ана \з поли'пептидноро состава отдельных морфологических, структур почки человека. Сравнение мозгового вещества - канальцев - базальных мембран канальцев и коркового вещества .- клубочков. При использовании разработанной' модификации выделения'были получены чистые препараты клубочков, проксимальных отделов канальцев и багальных мембран проксимальных отделов канальцев. При 2ДЭФ анализе этих фракций, дополнительно удалось детектировать ряд специфичных белковых фракций. Для фракции канальцев-(

белки '1760646, 4760644 цев- белок 4722693.

4688683 и 4336697, для фракции БМ каналь-

^---

--4-

5,0 5у25 !у5 5,0 6,25 6,5 <У5 7,25 Рис, 2. Двумерная карта белков суммарной почки человека (контур-, ное изображение).

Сравнение коркового вещества - клубочков позволило выявить до-, полнительно 11 пятен с координатами: 4840670, 4840692, 4836693, 4089523, 4075522, 4075544, 4073588, 4283689, 4616615, 4583649 И 4414674. После изучения белков отдельных морфологических структур сводный каталог Смл доложен до 175 полипептидных Фракций.

Мы попытались выделить и несколько наиболее крупных и специфичных белков таких основных морфологических структур почки, как клубочки и канальцы, которые могли бы служить маркерами пора:."э:;"п этих отделов о целью детекции их среди белков мочи.

К специфичным белка!.! канальцев можно отнести только один полипептид с номером 4735544,^ а для клубочков можно отнести до 7 полипептидов, основные из которых:' 5477507, 4618613, 4263593, 4581650, 4592649 И 4618699. Аналога некоторых из этих белков представлены и в других объектах, в частности белки 547750?. и 4263593 - в каталоге белков миокарда (Kovalyov et al, 1995). 'с связи с этим, больший интерес, для первоочередной , идентификации приобретают-оставшиеся 4 бёлкя' " *

4. Идентификация полипептидов на двумерной карте белков почки человека. По результатам коэлектрофореза белков почки и миокарда 18 пятен совпали по значениям Мг/pl с белками, представленными в каталоге белков миокарда человека. Их номера в каталогах белков миокарда и почни: 4089706. 4089726, 4263593, 4334540, 4402544, 4616615, 4618532, 4634537.4660682, 4660702.4670518. 4700682, 4826608, 4835560. 4850569. 4900S60. 4995590. 5477507. Из НИХ 5 -408S626 (белок связующий тарные кислоты), 4634537 (актин), 4700682 (¿¿-цепь митохондриальной АТФ синтетазы), 4826608 (альбумин) и 4900660 (трансферрин) в каталоге белков миокарда идентифицированы тем или иным способом (Kovalyov et al, 1995). В ткани коркового вещества выявлялся белок с номером 4318709 - соответствующий по координатам Фракции ¿-цепи В кристаллина,что было подтверждено методом секвенирования. При использовании монокло-нальных антител к белку десмину иммуноблоттингом удалось детектировать одно из полипептидних пятен (4735544), как реагирующее с данными антителами и, очевидно, являющееся десмином. На рис.1 обозначены идентифицированные полипептидные пятна.

5. Формирование комплексного белкового каталога почки человека В соответствии со стратегией системного подхода построение двумерной белковой карты приводит к необходимости Формирования белкового каталога, который можно дополнять разносторонней информацией о каждом обнаруженном виде полипептидной 'цепи.

Все собранные материалы о мажорных белках почек, благодаря стандартизованной системе нумерации, были обобщены -нами в виде компьютерного каталога в формате электронной таблицы Exel 5.0 и дополнены некоторой информацией (о свойства идентифицированных белков) из банков данных SWISS-PROT и Hugen.

6. Изучение генетического полиморфизма белков почки человека и модельных кивотннх. Основное распределение белков почки мыши и человека характеризуется выраженным сходством по координатам и количественной представленности наиболее крупных пятен. На основании этого мы попытались выявить полиморфные варианты у инбред-ных линий мышей, с целью дальнейшего поиска аналогов среди белков почки человека.

При изучении белкового состава почки человека не было найдено вариантов, которые могли бы коррелировать с двухаллельным состоянием (изменениями по заряду), все различия детектировались только по количеству или наличию и отсутствию белкового пятна. По литературным данным (Smith et al. 1980) такие отмечались только коли-

чественные различия, что может бить обусловлено как недостаточностью проанализированной выборки, так и высокой консервативностью главных почечных белков.

Из анализируемого нами спектра белков ыти Инбредных линий мышей различия выявлялись по 9 группам (около 5%), что соотвестеуег литературным данным.

Эти изменения характеризовались, в частности, изменениями белка с мол.массой 30 кДа у двух линий по pl. У гибридов нишей Fl этих линия присутствуют оба белка, но со снижением в количеств, что свидетельствует о кодоминантном типе наследовании данного признака. В другом случае полиморфизма у 2 линий присутствовал дополнительный полипептид с мол.м&.ооп 20 кД. не детектируемый у других линий. У 8 проанализированных гибридов этих линий дополнительный полипептид не выявлялся, возможно, вследствие другого ти- • па наследования и недостаточного количества проанализированных гибридов. Третий вариант характеризовался отсутствием белка с мол. массой 43 кД и pl 6.45 у 2 линий. У гибридов данный белок присутствовал, но наблюдался эффект дозы гена, что также может свидетельствовать о кодоминантном типе наследования.

Для двух первых вариантов, выявленных у инбредных линий,, можно ожидать возможность обнаружения аналогов у человека, т.к. зоны распределения полипептидов сходны.

7, Изучение аутентической деградации в белках почек человека и модельных адотных. В связи с изучением патологических аутоп-. сийных образцов почки, были предварительно изучены признаки ауто-литических изменений в белках почки мыши и человека, на сроках от 3 часов до 3 суток аутолиза. По результатам компьютерной деисито-метрий одномерно! фракционирования белков почки мыши удалось выявить ряд белковых зон, где наблюдались 'вменения в количественной представлености. 2ДЭФ удалось выявить специфичные изменения во фракции 54 кДа/р1 7.12. где между 1 и 2 сутками аутолиза белпк практически полностью исчезает, а расположенное ниже, пятно другого белка значительно увеличивается, очевидно, оно является продуктом деградации белка 54/7,12.

Изучение аутолитической деградации белков почки человека в корковом и мозговом веществе (до 3 суток инкубации при 25°С) доказало, что в корковом веществе, помимо общего уменьшения количества пятен и количественного содержания белка в пятнах, выявлялись и некоторые специфичные изменения. Отмечалось .(рис.3),усиление пятна белка 4850569 b'зависимости от срока аутолиза. Анало-

гично отмечалось усиление пятна 4428496 к 2 суткам (возможно, из группы тропомиозинов) и усиление пятна 4334540 к 2 суткам. Признаком деградации моюю было отметить выраженное уменьшение к 1 сут!сам пятен 4665677 и 4660702, и к 3 суткам белка 4426614 В мозговом веществе можно было отметить равномерное ослабление полипептидных пятен к 3 суткам без выраженной специфики.

Сопоставление полученных результатов с литературными данными свидетельствует, что темпы аутолитической деградации в ткани почек оказались более высокими в сравнении с тканью сердца и скелетной мышцы. В почках изменения детектировались уже к 3 часам посмертного аутолиза.

Таким образом, в результате проведенного анализа мы получили ряд признаков аутолитических изменений в белках почки, что позволило перейти к анализу белкового состава патологических образцов почек человека с целью поиска первичных, существенных для развития патологии признаков.

£ ! % . ; "З ( --«о

с «V - г <4 , » V у {С?* V с V /

г—> V да» V-». *• V на ^ г/ . Г»

Г • о» чсг-> «О'' , А ч£2» 4 ...

Рнс.З. Фрагменты двумерных электрофореграмм, иллюстрирующие ауто-литические изменения в корковом веществе почки человека по отдельны).! полипептидным пятнам. А - усиление пятна 4850569 (последовательно О, 1 сутки, 2 и 3; Б - усиление пятна 4428496 и 4334540; В - уменьшение количества белка в пятнах 4665677 и 4660702; Г - ослабление пятна 4426614.

8._Оценка возможности использования полученного двумерного каталога и карты.для анализа изменений белкового состава.почки человека при патологии. Используя биопсийные и аутопсийные образцы почек человека от лиц с выраженной почечной и комбинир эанной патологией (п»5), мы провели изучение возможности использования полученных результатов для изучения патологии. Анализировались образцы почек от лиц с хронической почечной недостаточностью (п-3), клапанной патологии сердца (п-1) и ортотопической трансплантацией сердца с отторжением трансплантата (п-1). В последнем случае отмечаюсь появление трех атипичных белков (рис.4) в мажорных ко.ш-чествах. отсутствующих или имеющихся в минорных количествах в норме.

Координаты данных полипептидов были определены как 4295677 (20.2 КД, р! 6.77), 4318709 (20.8 КД, р! 7.09) и 4552706 05.7 КД

о

I «я»

•Т

Рио.4. Фрагменты двумерных электрофореграмм белков почек зоны альфа В кристаллина: А - норма. Б - при хроническом оттор-. жении трансплантата сердца. Стрелками отмечены полипептидные пятна увеличивающиеся при отторжении.

pl 7.06). Координаты пятна 4318709 совпали с координатами пятна, идентифицированного на карте белков миокарда как цепь В кристаллина. Для более полного выяснения природы этих полипептидов была проведена идентификация двух из них. используя микросеквени-рование.

Для пятна 4295677 был определен фрагмент в 10 аминокислотных остатков - YRIPADVDPL в однобуквенном прочтении. При поиске в банке аминокислотных последовательностей он совпал с позициями 122 - 131 последовательности цепи В кристаллина человека [Dübln et.al, 19903, и его можно расценить как укороченный фрагме""" цепи кристаллина человека.

Для пятна 4318709 определены фрагменты последовательности VLGDV и VKHFSPEEL, которые совпали с позициям.93 - 97 и 81 - 89 аминокислотной последовательности цепи кристаллина человека

mJЬзШ!^ .

[Dübln et, al, 1990].

Ei другом случае с хроничнской почечной недостаточностью на фоне патологии миокарда (протезирование клапана) накопления данного белка не наблюдается.

Причина появления данного белка в таких количествах в ткани почки вызывает интерес как в диагностических целях для детекции развития отторжения трансплантата, так и для изучения механизмов осложнений при трансплантации сердца - почечной недостаточности.

Можно ожидать, что при использовании МКАТ против-кристаллина его моязю будет детектировать в сыворотке крови, либо среди белков мочи. При накоплении статистического материала, возможна разработка неинвазивного теста в диагностике отторжения, что представляет практический интерес для здравоохранения. ' Третий атипичный полипептид 4552706 был найден также во всех трех случаях хронической почечной недостаточности, и очевидно может являться маркером соответствующей патологии, что обуславливав ет необходимость выяснения его природы и проведения идентификации.

ВЫВОДЫ

1. По результатам фракционирования электрофоретическими методами белковых экстрактов из препаратов почки -человека охарактеризован комплекс наиболее представленных белков, который отражает особенности генной экспрессии в данном объекте:

а)в различных экстрактах (включая из препаратов отдельных морфологических структур почки) выявлено 175 белковых фракций, для каждой из которой определены молекулярная мае-,а и изоэлектричес-кая точка, что послужило основой для составления сводного компьютерного каталога;

б) использование универсальной системы описания фракций позволило осуществить сопоставление белков, присутствующих в разных морфологических структурах почки, а также отметить 20 белков, сходных по электрофоретическим свойствам с белками сердечной мышцы;

в) среди почечных белков идентифицировано 9 белков (альфа В кристаллик, альбумин, митохондриальная супероксиддисмутаза. актин, белок связующий жирные кислоты, альфа - АТФ синтаза, транс-феррин. десмин) методами коэлектрофореза. иммуноблоттинга и мик-росеквенирования.

2. разработана оригинальная модификация получения очищенных препаратов нефрона: клубочков, проксимальных отделов канальцев и

базальных мембран канальцев, сочетающая методы дифференциального просеивания, разделения в магнитном поле и криодиссоцичции.

3. Обнаружены проявления полиморфизма изучавшихся почечных

белков:

а) в образцах почки человека выявлены Л группы белкогш Фракция, характеризующихся выраженной вариабельностью по количественной представленности;

в) в образцах почек мышей (особей инбредных линий и их гибридов первого поколения) показано существование 9 групп полимор^н:* белков, что позволяет оценить уровень белкового полиморфизма в ткани почки величиной около 5%.

4. Выявлены маркеры аутолитической деградации белков почки, как общие, так и специфические для человека и мш .

5. Изучена специфичность в распределении белков морфологических структур почки человека. Для коркового вещества почки человека обнаружено 4 специфичных белка, для мозгового вещества 13 белков, для проксимальных канальцев 1 специфичный белок и для клубочков - 7 белков.

6. Обнаружены белковые маркеры патологии, меняющие количественную представленность и представляющие интерес для дальнейшего изучения с целью разработки диагностических тестов отторжения миокарда при ортотопической трансплантации и при хронической почечной недостаточности у человека.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хасигов П.З., Обельчук Л. К., Рубачев П. Г., Салбиев К. Д.. Дзгоева И. Б., Цомартова Д.'А., Николаев A ..i. Анализ белков Назальной мембраны проксимального отдела канальцев почек двумерным, электрофорезом// Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины. - М. , 1990. - С. 40-41.

2. Khaslgov P.Z., Obelchuk L. I., Rubachev P.G., Salbiev К.D.. Dzgoeva I.В.. Tsomartova D.A.. Nlkolaev A.Y. Analysis of basement membranes proteins from proximal portions of renal tubule" by two-dimensional electrophoresis: Abstr. Intern. Meet. Electrophoresis Soc. - USA. Washington. 1991.- W 801.- P. 40.

3. Khaslgov P.Z,, Kovalyov L.I., Grachev S.V.. ObelchUK L. I.. Tsomartova D. A.. Salbiev'R.D.. Rubachev P.G.. Shishkln S.S. Studies of the tissue specific proteins of renal glomeruli and tubu-lus as result of cell differentiation: Proc. 22 Meet. FEBS.- Swe-

-lü-

den. Stockholm. 1993.- N. 163. - P. 85.

4. Shlshkln S.S.. Kovalyov L.I.. Khaslgov P.Z.. Rubachev P.G.. Khudaldatov A. I.. Obelchuk L.I.. Grachev S.V.. Egorov T. A. Human genora analysis based on the proteins from different human tissues and cultured human cells: Proc. 16-th. Intern. Congress of biochemistry and molecular biology. - India, New Delhi. 1994.- v.2. - P. 122.

5. ХаоиговП.З.. Обельчук л. И., Цомартова Д. А., Щеглова М. В. Белковые продукты генной экспрессии в разных морфо-функциональных структурах почки: Тез. докл. 1(3) Росс, съезда мед. генет.- М., 1994,- ч.1. - С. 61-62.

6. Обельчук Л.И.. Цомартова Д.А., Ефимочкин А.С.. Хасигов П.3. Изучение аутолитической деградации белков почки у мыши// Вопросы медицинской химии.- 1997.- HI.- С.17-23.

7. Обельчук Л.И.. Цомартова Д.А.. Ковалев Л.И., Хасигов П.3., Рубачев П. Г., Грачев С. В.. Шишкин С. С.. Березов Т. Т. Стандартизованный и расширенный каталог основных белков почки человека// Биохимия.- 1997.- т. 62,- вып. 2,- С. 222 -234.

Luba I. Obelchuk (Russia)

SYSTEMIC ANALYSIS OF HUMAN RENAL PROTEINS IN HEALTH AND SOME TYPES OF PATHOLOGY

A new version of 2DE database of renal protein containing Information about 175 proteins from various parts of the human kidney was obtained. Some proteins were Identified by different methods (comigration. immunoblottlng, microsequencing), namely, -chain B crystalline, albumin, mitochondrial superoxide dlsmuta-se. ATP synthase -chain (mitochondrial), transferrins, aconltase. desmine. and fatty acid binding protein. Definite features in protein distribution for several morpho-functlonal structures of the kidney were revealed by comparative electrophoretlcal analysis. 4 proteins demonstrated speciflty for the kidney cortex and 13 proteins had medullar speciflty. Samples of proximal tubules revealed one specific protein, and glomerular samples seven specific proteins.The study of renal protein from five different 11-

nea of mice detected1 9 groups of polymorphic variants of proteins. It was observed Only quantitative variation of protelna in human renal samples was observed. Speol^ens of humar kidney with different time of autolysis (up to 2 days) had some typical changes In protein dlstrlbualon, and few,proteins can be used as markers of autolytlo degradation. Several protein alterations were revealed at chronic renal failure. Protein markers, which might be of interest for the development of immunochemical diagnostic test3 of kidney transplant rejection and chronic renal fallur ' i man were detected.

ra.0s.97fj_ckeu Irrj j>,_Tup.'100 - 3^.111

Tan. W OrutacoHUKiwae, 3