Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование белкового состава почки и морфо-функциональных структур нефрона у человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование белкового состава почки и морфо-функциональных структур нефрона у человека"

С' ! I

На правах рукописи

1

ЦОМАРТОВА ДИБАХАН АСЛАНБЕКОВНА

ИСССЛЕДОВАИИЕ БЕЛКОВОГО СОСТАВА ПОЧКИ И МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СТРУКТУР НЕФРОНА У ЧЕЛОВЕКА.

03.00.4 - биохимия 14.00.23 - гистология, цитология, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1997

Работа выполнена на кафедре гистологии с курсом эмбриологии Северо-Осетикской медицинской академии и секторе химии белков научно-исследовательского центра Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор К.Д. Салбиев доктор медицинских наук П.З. Хасигов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Ребров Л.Б.

доктор медицинских наук, профессор Котовский Е.Ф.

Ведущ ая организация

Научно-исследовательский институт медицинской и биологической химии РАМН . •

Зашита состоится * В » 5997 Г- в « » ч. щ

зарецании диссертационного совета Д 053.22.02 в Российском университете дружбы народов (по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.8, медицинский факультет)

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая,- д.б.

Автореферат разослан «_ £~ > ¡997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

профессор В.Э. Торбек

Актуальность темы. Изучение молекулярных основ функционирования специализированных структур тканей, органов и клеток человека-традиционная и интенсивно разрабатываемая область биохимии. Морфологическая гетерогенность уакого важного для поддержания гоме-остаза органа как почка, состоящего из целого ряда специализированных структур, и выполняющих различные функции, обуславливает сложные межклеточные взаимодействия, которые можно оценить,изучая различия в их белковом составе. Многие аспекты функционирования выдетительной системы (молекулярных основ) широко представлены в литературе. Активно изучаютсг структурные компоненты, формирующие разные отделы почки [Templeton et al.,1990; Хасигов П.З. и со-авт.,1996]i гормональная регуляция [Koeclln et al.,1989; Tejedor et al., 1988], механизмы реабсорбции белка [Gelbel, 1990; Nielsen, 1990] и пр. Важная сторона исследований - изучение изменений в белках почек при различных видах патологических процессов, таких как, нарушения гомеостатической деятельности почки в утилизации азотистых продуктов распада белков, регуляции водно-солевого баланса, выполнение экскреторной, эндокриной и метаболической функций, что также широко освещено в литературе СВельтищев р.Р,, Игнатова М. С., 1992: Karam et al. ,1995; Jardine, 1995].

В соответствии с этим, проведение наиболее полной характеристики белков, составляющих почку и ее морфологические компоненты, представляет явный теоретический и практический интерес.' Развитие методической база исследований - модифицирование и разработка новых методов получения морфологических структур, а также методов разделения и анализа, . открывает новые существенные возможности получения дополнительной информации о процессах, протекающих в организме человека. За последние годы зарубежными и отечественными исследователями достигнут существенный прогресс в изучении метаболизма и функционировании почек, что выражалось в расширении наших знаний, начиная от выявления новых генов и балков, и заканчивая решением' ряда вопросов этиологии и патогенеза, а также выявлении новых био-маркеров ряда патологий почки человека [Kleppel . et al., 1987; Furuse et al., 1992: Кузнецов В. А. и соавт.. 1993: Sa-lusky et al.. 1995; Krieg et al., 1995; Kreisberg-et al.,1995).

Новые возможности в изучении особенностей деятельности генетического аппарата, и его продуктов, возникли благодаря техническому прогрессу, развитию биохимической и ..олекулярной генетики, обосновавшей фундаментальные положения о взаимоотношениях между генами и белками, а также развитию методологии анализа белков как продуктов генной экспрессии [Anderson and Anderson. 1982; Klose. 1995; Cells et al., 1993, 1996]. Появление высокоразрешаедего

- О -

двумерного (2ДЭФ) электрофореза [O'Farrell, 1975, 1977], позволяющего анализировать тысячи индивидуальных белков, стало началом формирования комплексного подхода к изучению особенностей функционирования генетического аппарата в клетках разных типов и отдельных органах и тканях. Этот подход, получивший название "системный", нашел применение в изучении геномов ряда организмов и. человека [Inter.Meet. "2D Electrophoresis: from protein maps to genomes" 1994; Int. Meet. "From genome to proteome', 1996]. Исследования на, базе системного подхода ткани почки человека, и особенно ее структур, отражены лишь в незначительном количество публикаций, , в основном посвященных исследованиям отдельных аспектов [Smith et al.,1980; Tracy et al.. 1982; Zlal et al.,1984; Кирри-лова И. А. и соавт.Д988; Ковалев Л. И. и соавт.. 1988; Хасанбаева Г. Ш. и соавт.,1992]. Вместе о тем, значительный потенциал системного подхода в изучении особенностей экспрессии генома в ткани почки остается пока неполностью использованным. ,

В настоящей работе представлены результаты изучения на базе системного подхода белкового состава ткани почки, .и,отдельных клеток и морфологических структур, с развитием унифицированного 2ДЭФ каталога белков почки, совместимого С 2ДЭФ каталогом поперечнополосатой мышечной ткани. .Для.полученной базы данных начато применение в изучении ряда патологических процессов у человека.

Цель и задачи исследования. Целью .настоящей. работы явилось создание базы данных на основе системного анализа, ДМ изучений особенностей белкового состава компонентов Нефрона, включая клубочки, канальцы и эпителиальные клетки, а также изменений,обусловленных физиологическими и патологическими процессами в ткани суммарной почки. '

В рамках исследования этих проблем в работа были поставлены следущие. задачи: ' ' '

1. Получение основных структурных компонентов нефронаг клубочков, проксимальных отделов канальцев и .эпителиальных клеточ Канальцев и проведение 2ДЗФ анализа ос бенностей белкового состава выделенных структур. . .

2. Формирование базы данных (двумешого электрофоретического каталога белков почки человека), совместимой с базой Других тканей человека. На основе полученной базы данных' проведение анализа специфичности белкового состава разных морфологических структур.

3. Идентификация белков почки человека на 2ДЭФ картах.

.. Использование полученной базы данных для анализа изменений

в составе белков почки человека, и других объектов, при выраженных патологических поражениях почек.

Научная новизна работы. С помощью модификации метода О'Фаррел-ла построена 2ДЭФ карта и каталог распределения 190 наиболее представленных белков почки, отдельных морфологических' структур и клеток почки, в диапазоне Мм 12,5-200 кДа и р1.4,8-7,20. Для 190 полипептидных Фракций определены значения мол. массы и р1. Каталог1 сделан в единой системе обозначений, и совместим с существую-. • щим каталогим поперечнополосатой мышечной ткани человека, что позволило расширить сводный каталог до 482 полипептидов. На построенной карте идентифицированы 3 полипептидные фракции.

Оптимизирована методика получения эпителиальных клеток проксимальных канальцев почки. Проведен 2ДЭФ анализ белкового состава суммарной почки и отдельных морфологических структур. Впер- ые по- . лучены данные по особенностям—белкового состава эпителиальных клеток проксимальных канальцев. Проведено изучение и выявлен ряд белков, специфичных дМ ряда морфо-фун^циональных структур нефро-на. которые Могут являться потенциальными маркерами поражения соответствующих структур.

Изучена возможность использования . полученных результатов для анализа патологических образцов. ■ Выявлено при хроническом отторжении трансплантата сердца появление в ткани почки в атипичных количествах белков, идентифицированных микросеквенированием- как еб-цепь В кристаллика ( В) и еГо продукта деградации, возможно кар-диального генеза. Также, обнаружено появление в ткани почки при терминальной стадии хронической почечной недостаточности в выраженных количествах атипичного варианта белка, идентифицированного микросеквенированием как глицеральдегид-3-фо сфат дегидрогеназа. . Теоретическая и практическая значимость Работы. Охарактеризован комплекс 190 основных белков ткани цельной почки, отдельных морфологических структур и клеток почки, которые можно рассматривать как своеобразный "белковый портрет" исследованных объектов. Полученная информация использована для формирования наиболее пол-' ной сгодной базы данных белков почек человека.

Построенная двумерная карта белков почки и ее компонентов открывает возможности, изучения изменений белкового спектра по 190 полипептидным фракциям при различных физиологических и патологических состояниях, и открывает возможности исследования молекулярных механизмов функционирования экскреторной системы человека.

Использование полученной базы данных позволило выявить ряд

Силков-маркеров, как отторжения трансплантатов миокарда и почки, тал и хронической почечной недостаточности, что открывает новые возможности в изучении патогенеза этих патологических процессов.

Внедрдкие результатов работы. Практические рекомендацич, разработанные по результатам щхтеденного исследования применяются.в практической работе кафедра биохимии Московской медицинской академии им, И.М.Сеченова, Москва; кафедры гистологии Северо-Осе-тинскои" медицинской академии, Владикавказ; Медико-генетическом научном центре РАМН, Институте Сшомедицинской химии РАМН, Москва; ЙШ наследственных и врожденных заболеваний МЗ Белоруссии, Минск.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. На основе фракционирования белковых экстрактов почки человека, а также отделов и ряда морфо-функцноналъных структур и клеток почки 2ДЭФ по О'Фарреллу постройча схема распределения наиболее представленных белков, отражающая особенности их белков ого состава Комплекс основных белков почки человека в координатах иэоэлектрическая точка/' мол. масса, дополненный информацией по белкам эпителиальных клеток, составил 190 полипептидов.

2. Полученные данные суммированы с двумерным электрофоретичес-ким каталогом белков поперечнополосатой мышечной ткани человека и сводный каталoi- расширен с 312 до 482 полипептидов.

3. Идентифицированы на двумерной карге, пспольвуя микросекве-ниров ние, полипептидные пятна Б криоталлина, митохондриальной сулероксиддисмутазы -и фасфатидилэтаноламин связывающего белка.

4. Выявлен ряд изменений а белковом составе почки, представляют« интерес как бпо-маркери патологии: появление при хроническом отторжении трансплантата сердца в ткани почки в атипичных количества;: белков, идентифицированных микрооеквенированием как В крисТаллин и его. продукт деградации, и при терминальной почечной недостаточности появление, атипичного белка, идентифицированного мпкросеквенированием как глицеральдегид-З-фосфзт дегидрогеназа.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на. Международной встрече злектрофоретического' общества (QUA,1991), на 22 Международной встрече ФЕБО (Швеция,1993), на 16 международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Индия, 1954). на . (Ш) Российском съезде медицинских генетиков (Мссквз, 1994), на Ученом Совете Северо-Осетинской медицинской академии (.1997).

Публикации. 11с теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

GOi ей и структура диссертации Диссертация содержит следующие раз; -ды: введение, обзор литературы, материалы и методы исследовании, результаты и обсуждение, выроды, заключение, список литературы. Работа изложена на 131 страницах машинописного текста и иллюстрирована 2 таблиц m ч 16 рисунками. Список литературы со-рердит 201 источник, включая 1Б9 работ зарубешых авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Основной материал для изучения - аутопсийные образцы 15 почек и 10 образцов левого желудочка сердца, от лиц, погибших в результате несчастного случая, без признаков патологии (норма). Патологические образцы почек (п<=8) и сердца (п=3): операционный (1 - 2 ч) или аутопсийный материал (до 24 ч. с момента смерти). В экспериментах использовали корковое вещество почек. Клубочки и канальцы получали модифицированным методом дифференциального просеивания/разделения в магнитном поле [Krakower et al.1951; Carlson et al. 1978]. Клетки эпителия проксимальных канальцев получали модифицированным методом дифференциального просеивания, используя криодиссоциацию и ультразвуковую дезинтеграцию [Westoerg et al. 1970; Langeveld et al, 19F51. Для получения базальных мембран проксимальных канальцев использовался метод Вестберга и Нихаэла [Westberg and MicMel. 1979].

Образцы для фракционирования и 2ДЭФ по О'Фаррелу проводили с некоторыми модификациями [Kovalyov et al.,1995]. Одномерный ЭФ проводили по Laemmly, 1970. Для определения концентрации белка в пробах использовали калориметрический метод Flores (1978).

Детекция белков после электрофореза проводилась 4 V ацетатом К (Hlgglns et al.. 1979), окрашиванием кумасси голубым R-250 (Fairbanks et al, 1971) и азотнокислым серебром (Blum, 1984). Идентификацию белков проводили коэлектрофорезом и иммунохимиче^ки по Towbln et. al. (1979). При иммуноблоттинге применяли МКАТ против десмина (D 1033 фирмы "Sigma". США) и иммунопероксидазный конь-югат против lg мыши ("Sigma". США). Как маркер мол. массы использовали экстракт белков сердца мыши, полученный как описано ранее [Ковалев Л. и соавт., 1986]. Маркерами р! служили карбомилирован-ные производные карбоангидразы и креатинфосфокиназы фирмы Pharmacia (Швеция). Пр:1 коэлектрофорезе использовали экстракт белков сердца человека, полученный как описано [Kovalyov et al, 1995]. Пептиды белков получали трипсинолизом (Cells et al. 1990] и фракционировали ВЭЖХ [Лаптев А.В. и др..1994]. Определение аминокислотной последовательности пептидов выполняли на газо-жидкостном секвенаторе 816 фирмы "Knauer" (ФРГ) по методике и программе производителя. Поиск аминокислотных последовательностей проводили с помощью пакета программ GENEBEE по банку аминокислотных послздо-вательностей SWISSPROT (версия 21). Денситометрию электрофорег-рамм осуществляли на лазерном денситометр" Ultrascan XL (Pharma-

cia-LKB, Швеция) в комплексе с компьютером IBM РС/АТ-386, используя пакет программ GelScan 2.1. При статистической обработке ис-пользовапи общепринятые методы (УрбахВ.Ю., 1975):

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Создание двумерной злектрофоретаческой карты и каталога суммарных белков почки человека. На первом этапе работы были проанализированы суммарные гомогенаты ткани почки человека (п=15). используя 2ДЭФ разделение белков по О'Фарреллу. Полученные'элект-рофореграммы характеризовались высокой воспроизводимостью спектра белков по качественному и количественному содержанию, с малыми вариациями в количестве некоторых полипептидов. При детекции белков кутсси R-250 на электрофореграммах выявлялось до 200 белковых .пятен, использование азотнокислого серебра позволяло увеличить число фракций в 3 - 4 раза. В основных экспериментах для окрашивания применяли кумасси R-250, либо для проведения микросек-венирования детекцию в нефиксирующих условиях 4 М ацетатом калия.

описание детектируемых поыпептидных пятен проводилось в сис-темег прямоугольных координат, отражающих молекулярную массу и изоэлертрическую точку белков. При определении координат' пятен белков почек, для построения калибровочных кривых, мы использовали результаты коэлектрофореза с белками миокарда человека, для которых ранее были определены значения молекулярной массы и pi.

Так как большая часть выявляемых при 2ДЬФ белков неидентифици-рованны. для систематизации полученных данных и формирования 2ДЭФ каталога использовалась нумерация белковых.-пятен, с определенной м )дификацией, предложенной для описания белков миокарда [Kovalyov etal.,1995]. Это позволило каждому белку присвоить уникальный номер, состоящий из семи знаков. Первые четыре знака номера - десятичный логарифм от определенной нами величины *юл. массы, три последних- - величина pi (запятые после целых цифр опускаются). Обобщение результатов анализа 30 2Д элект'рофореграмм белков почек. позволило построить схему их распределения - двумерную карту и пронумеровать о/и белки (Рис.1). Их физико-химические характеристики - мол. масса и pi суммированы для 143 наиболее крупных белков в виде таблицы.

Следующий огагг работы заключался в получении и исследовании основных структурных компонентов нефрона - препаратов клубочков, проксимальных отделов канальцев и эпителиальных клеток канальцев.

rz

цшя

«я*«

ияГ «л/«« •«Л^ЛЕГ^.'&Л^

-«л «-Ч^в^йг:

4ми .Mtm

«вам*»« **

—¿Г л.-«Г—.

Jtf*

«iitue* «¿Г

ш«^ тя Jtaw

«ft* ibzr«s>

ЯМ М 4,0 ДО го ЦК />/

Рис.1. Схематическое изображение двумерной карты главных белков почки человека. Обозначения пятен номерами согласно каталогу. Внизу даны значения градиента рн.

2. Получение изолированных морфо-йункциональных структур и модификация способа получения эпителиальных клеток проксимальных канальцев почки человека. Используя метод Карлсона [Carlson et al., 1978J - дифференциального просеивания через сита с разным диаметром пор, были получены фракции клубочков, проксимальных отделов канальцев и эпителиальных клеток проксимальных канальцев при контроле чистоты препаратов фазово-контрастной микроскопией и показана высокая степень чистоты полученных препаратов (Рис.2). Загрязнение другими элементами составляло не более 2 - 3 %.

Использование замораживания - оттаивания выделенных препаратов проксимальных канальцев позволило существенно сократить время выделения и повысить выход эпителиальных клеток канальцев, активно диссоциирующих от базальной мембраны в таком случае.

Полученные препараты проксимальных канальцев, клубочков, эпителиальных клеток, коркового и мозгового вещества почки были оце-

I, ч '

И^ш«^.; Mn.4iW.-n. ма^шЫ"-*»

Рис. 2..'А - изолированные клубочки, Б - изолированные проксимальные канальцы почек человека, В изолированные эпителиальные клетки проксимальных канальцев. Увеличение х 200.■

нг :ы по электрофоретическому спектру белков. По результатам фракционирования можно было.отметить выраженное сходство в распределении франций белков, но выявлялись и специфичные для анализируемого обьекта полипептиды. Для препаратов клубочков можно было отметить 7 белков, н .иболее крупные из которых - 5477507. 4618613, 4263593, 4581650. .4592649 И 4618699. Аналоги некоторых из них имеется и в других объектах, в частности белки 5477507 и 4263593 в каталоге белков лиокарда (Ноуа1уоу е1 а1.,1995). К специфичным Оелкам канальцев относился один нолипептид - 4735544. К специфичным челкам эпителия проксимальных канальцев, по результатам коэ-лектрофореза очищенных структур, относились 12 пятен: 4260480, 474044. 4740560. 4282677, 4340695 и характерный трек чз 7 пятен - 4782644, 4782647, 478^652, 4782657, 4732661, 4782665 и 4781668

Специфичным для эпителия явилось и отсутствие двух пятен 4735554 и 4840676. умеренно представленных в клубочках и в канальцах.

Вся информация по физико-химичес им свойствам белков исследованных структур и субструктурной специфичности 190 белков сведена в единый каталог. Полученный каталог белков почки можно использовать для дополнения существующего-каталога белков поперечнополосатых мышц человека и формирования в виде электронных таблиц сводного каталога белков человека, сделанного в единой системе нумерации. К 312 полипептидам в каталоге мышц можно добавить 170 из 190 каталога белков почки (20 совпадают в изученных тканях). Таким образом, сводный каталог включает 48<: белка. - экстрагируемых из 5 мг ткани при детекции кумасси голубым R-250, и может дополняться информацией по другим тканям и клеткам.

3. Идентификация полип^птидор на 2Д электроФ чреграммах суммарных белков почки человека. По результатам коэлектрофореза 5елков миокарда и почки 20 полипептидов совпали по координатам с белками каталога белков миокарда человека. Их номера: ■ 4089706, 4089726. 4263593,4318709. 4334540, 4345703, 4402544. ,4616645, 461853?. 4634537, 4660682, 4660702, 4670518, 4700682, 4826608, 4835560. 4850569, 4900660, 4995590, 5477507. Семь из НИХ идентифицированы [Kovalyov et al.. 1995].и соответствуют: 4089626 - белку, связующему жирные кислоты, 4634537 - актину, 4700682 - цепи митохондри-альной АТФ синтетазы, 4Г?660й - альбумину, 4900660 - трансферри-ну. 4318709 - В кристаллину и 4345703 - митохондриальной супе-роксиддисмутазе (СОД).. Используя МКАТ к белку десмину, иммуиоб-лоттингом детектировалось одно из полипептидных пятен (4735544), очевидно, являющееся десмином. Мол. масса и pi трех i элипептидных пятен почки - 4318709, 4345703 и 4329724 совпадают с координатами пятен, представленными в миокарде человека и идентифицированными на карте белков миокарда [Kovalyov et al.,19953. Это пятна b крксталлина (4318709), митохондриальной СОД (4345703) и'фосфати-дилзтаноламин связующий белок (4329724). По данным литературы, в этой области 2Д электрофореграмм ряда клеток и тканей - таких как макрофаги, клетки гепатобластомы. гепатоциты, миокарда также идентифицировано положение этих белков [JungLiut et al.,1994; Sanches et al.,1995], но не в ткани почки (Рис.3).

пятна, соответствующие этим белкам были вырезаны из 50 двумерных электрофореграмм, используя проявление 4 М ацетата калия. Количество белка в накопленных пятнах соответствовало 25 - 40 мкг, как расчитывалось ранее_по калибровочным кривым с известны i на-

Рис.3. Фрагменты электрефореграмм зоны кристаллина, СОД и фосфати-дилэтаноламин связующего белка. А - миокард. Б - почка, В - печень человека (по Sanchez et al., 1995).

несениями количества белка и окрашиванием кумасси R-250 [Ковалев Л.И.,1995). Белок в геле подвергался триптическому расщеплению в соотношении белок - трипсин 30:1 на протяжении 4 часов при 37°С, Полученные пептиды элюировались из геля. Элюат концентрировался лиофилизацией до 200 мкл и.далее,пептиды разделялись ВЭЖХ.

' Для пятна 4345703 были определены фрагменты последовательности двух пептидов KHSLPDLP и HAAYV(D)(D)L, которые совпали с 25 - 32 и 55 - 62 позициями аминокислотной последовательности митохондри-альной СОД соответственно [Wlspe et al. ,19891,' за исключением двух позиций во второй секвенированном пике , где вместо аспара-гииа определялась аспарагиновая кислота. Для пятна 4318709 были определены три фрагмента последовательности VLGDV, VKHFSPEEL И EEKPAVTAA, которые совпали'с позициями 93 - 97, 81 - 89 и 163 -171 аминокислотной последовательности В кристаллина человека [Dublin et а1.,1990]. Для пятна 4329724 был получен фрагмент LYTL-VLTDPD, совпавший с 63 - 72 позициями последовательности фосфати-дилэтаяоламин связующего белка [Horl et al..1994].

Таким образом, по совпадению характеристик мол. массы, pi. Фрагментов аминокислотной последовательности и результатов коэ-лектрофореза с белками миокарда, данные пятна можно идентифицировать . как соответствующие митохондриальной супероксиддисмутазе, альфа цепи В кристаллика и фосфатидилэтаноламик-связувдему белку.

Для проведения адекватного ' анализа патологических образцов также было необходимо изучить аутолитическую деградацию белков в норме, что может в ряде случаев иммитировать наличие первичных патологических признаков.

4. Изучение вутопиуической деградации белков почек человека. Используя .биопсийные образцы почки (п=3). было проведено изучение аутолитической деградации белков в двух различных отделах - корковом и мозговом веществе, до трех суток инкубации при 25°С. При анализе изменений в корковом веществе, помимо уменьшения числа пятен и содержания белка в пятнах, выявлялась определенная специ-

Г/»* v.

■P. ■ _

i Phosphatidyl-

Superoxide®* othanolamine dismutase binding proten

- И -

фичность. Отмечалось выраженное усиление пятна 4850569 в зависимости от срока аутолиза, что может быть связано с деградацией надмолекулярных комплексов белков, и соответственно усилением экстрагируемости диссоциированных полипептидов при солюбилизации. Отмечалось усиление пягна 4428496 к 2 суткам (предположительно группы тропомиозинов) и усиление пятна 4334540. Как признак деградации. можно было отметить выраженное уменьшение к 1 суткам пятен 4665677 и 4660702, и к 3 суткам пятна 4426614. Последний имеется и в миокарде, но по нему не выявлялось подобных изменений, что может соответственно являться специфичным для почки. '

Таким образом, в результате проведенного анализа мы выявили ряд признаков аутолитических изменений в белках почки, что позволило перейти к анализу белкового состава патологических образцов с целью поиска первичных, существенных для развития патологии признаков. Предварительные результаты изучения белков почк;: у пациента с трансплантацией сердца, показали накопление одного из белков возможно кардиального генеза. Данная находка потребовала изучения изменений в составе белков трансплантированного обьекта.

5. Изменения полипептидного состава в трансплантатах сердца. С этой целью было проведено' изучение состава белков в образцах трансплантатов сердца (п=3) при хроническом отторжении трансплантата, по сравнению с нормой (п=10) и образцами миокарда реципиентов (п=3). Общим для всех образцов трансплантата явилось (Рис.4) выраженное увеличение количества в пятнах белков 4313685 (MW 20.60 kD/pI 6.85), 4263672 (MW 18.30 kD/pI 6.72) и уменьшение количества материала в пятне 4318709 (MW 20.80 kD/pI 7.09). Нумера-чия дана по номеклатуре.для 2ДЗФ каталога миокарда и почки человека [Kovalyov et al.,1995; Обельчук Л.И. и соавт., 1997). Полипептид 4316709 был ранее идентифицирован на двумерных электрофо-реграммах белков миокарда человека как В кристаллин [Kovalyov et al.,1995], и был идентифицирован нами в ткани почки (см: выше). Ложно предположить, учитывая уменьшение количества белка в исходном пятн'з кристаллина, что более низкомолекулярные компоненты могут являться продуктами его деградации. Степень деградации в исследованных случаях различалась от выраженной до умеренной.

Данные изменения в известной мере коррелируют с естественным 1утолитическим процессом в миокарде в этой зоне 2Д электрофорег-эамм, что изучалось ранее [Цветкова М.Н. и соавт., 1993). И. Риг. 5 токазаны изменения в интенсивности пятен белков в зоне кристалли-m на сроках аутолиза до 3 суток. Увеличение количества белка в

данных пятнах является одним из ранних признаков аутолиза, который достоверно определяется после 1 суток инкубации при 37°С. В анализируемых образцах изменения соответствовали 1 - 3 суткам инкубации по данному признаку, но забор материала осуществлялся не позднее 2 -3 часов от момента смерти. В связи с этим, изменения нельзя отнести к обусловленным аутолитической деградацией. Не отмечалось' и других характерных признаков нормального аутолитичес-кого распада, например появления дополнительных полипептидов в зоне легких цепей миозина к 1 суткам, изменений в количестве легкой цепи миозина 2 ко 2 суткам и в зоне пятна АТФ-синтазы и др.

Можно предположить, что В кристаллин при хроническом отторжении трансплантата, ишемии миокарда и обусловленной ею утечки мио-кардиальных белков, начинает играть активную роль в транспорте выводимых полипептидов, но подвергается более медленной утилизации в организме, и обладает способностью накапливаться в других органах на путях метаболизма белков, особенно в ткани почки.

Для проверки данного предположения был проанализирован образец ткани почки, от пациента с хроническим отторжением трансплантата сердца. В образце было выявлено (Рис.б) наличие в атипичных количествах двух пятен в зоне расположения кристаллина. Используя компьютерную денситометрию -(по площади и интегральной оптической плотности пятен), было определено количественное содержание более высокомолекулярного пятна. В норме количество составляло 0,5+0.1 мкг белка в пятне. В патологическом случае количество белка составляли 30 + 1 мкг, т.е. наблюдалось 60-кратное превышение.

Используя для разделения белков почки полупрепаративный 2ДЭФ по О'Фарреллу, мы получили эти два полипептида в 41. лш виде, подвергли их триптическому расщеплению и разделили ВЭЖХ получение пептиды.- Учитывая сходство полученных хроматограмм с имеющимися хроматограммами В кристаллина из почки человека, мы использовали Гомологичные пики для проведения микросеквенирования и идентификации этих пятен. Для пятна 4318709 с молекулярной . массой 20.8 кДа и р1 7.09 были определены фрагменты аминокислотной последовательности УЬС0У1Б.и УКНЕЗРЕЕЬК в однобуквенном прочтении, которые при поиске по бапам данных аминокислотных последовательностей совпали с 93-99 и 81-90 позициями последовательности В кристаллина человека соответственно, т.е. они совпали с нашими результатами идентификации В кристаллина в почке в норме. Для пятна 4295677 (МИ 19.80 "О, р1 6.77) был определен фрагмент УМРАБУПРЬ, который совпал с 122-131 позициями последовательности В кристал-

5В Ч •<»

"г?

-о ^ * о

¡Г • » ^

<Г> •

* * . -

Рис.4.Фрагменты 2Д электрофореграмм белков миокарда зоны кристаллика. А - норма. Б, В и- Г - образцы миокарда при хроническом отторжении трансплантата разных пациентов. Стрелками отмечено положение фракции кристаллина и пятен увеличенных в количестве.

- «£»

- т

Рис.5. Фрагменты двумерных электрофореграмм с изменениями в белках в зоне кристаллина при аутолитическом процессе. Последовательно - О ч, 1 сутки. 2 суток и 3 суток. Кристаллин отменен стрелкой.

Рис.6. Фрагменты 2Д электрофореграмм белков . почек зоны В кристаллина: \ - норма. Б - при хроническом отторжении трансплантата. Отмечены атипичные белки.

лин'а. Следовательно, можно считать, по совпадению трех независимых характеристик - мол.массы, р1 и фрагментов аминокислотной последовательности, что при хроническом отторжении трансплантата сердца в ткани почки наблюдается резкое увеличение количества белка В кристаллина и его продукта деградации.

При хроническом отторжении трансплантата почки (п-3) изменений в уровне экспрессии В кристаллина в ткани трансплантата не наблюдалось. что позволяет считать выявленные изменения специфичными для хронического отторжения трансплантата сердца.

6. Изменения полипепуидного состава в трансплантатах .почки.

<3>

«сз>

[вПЯС

Ч

О

4 О*

о

При сравнительном исследовании образцов трансплантатов почки человека с хроническим отторжением трансплантата (п=4. 2-5 мес от момента трансплантации) и случая острого отторжения (инфаркт трансплантата на 3 сутки от пересадки) были выявлены изменения в составе белков транплантатов. Во всех образцах с хроническим-отторжением отмечалось появление разной степени выраженности двух' наборов' атипичных полипептидов (5-7 пятен) с мол. массой около 22 и 55 кДа. и различающимися по pl. Данные фракции сходны по pl и мол. массе с фракциями легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов, идентифицированными по литературе в плазме и других объектах {Anderson and Anderson, 1991: Wiederkerhr et al., 1991]. Выявленное изменение коррелирует с известным фактом отложения Ig в ткани трансплантата при хроническом отторжении. По своему количественному содержанию атипичные полипептиды присутствовали в большем количестве в ткани коркового вещества по сравнению с мозговым.»

Гаюже отмечалось усиление двух полипептидов в кислой зоне градиента pH электрофореграмм. обычно отсутствующ^ в ткани почки. По мол. массе и pl данные полипептида соответствовали и л цепям тропомиозина, и они характерны для поперечнополосатой мышечной ткани человека, но не ткани почки. В ткани почки наличие таких белков характерно для ранних сроков развития метанефроса, по данным литературы,до 7-8 нед развития [Ковалев Л.И. и со-авт.,1988]. Возможно наличие данных белков обусловлено регенеративными процессами, идущими-в ткани почки при трансплантации. Других существенных отлший в анализируемых белках не выявлялось.

7, Кзмечешя Р ПОЛНПеПШНОМ состав? ТШИ ПРЧКИ „ПРИ терминальной хронической почечной недортаточности. В 4 обследованных случаях, при проведении трасплактации почки, были также изучены и образцы' почек реципиентов, где определялась терминальная стадия хронической почечной недостаточности..На полученных электрофорег-раммах отмечались выраженные " изменения в составе, белков почек, часть из которых (уменьшение количественного содержания ряда белковых пятен, появление низкомолекулярных компонентов) коррелировала с аполитическими изменениями в Почке в норме, но отмечалась и выраженная специфика. Отмечалось (Рис. 7), масивное накопление атипичного белка, отсутствующего в норме. Координаты данного полипептида были определены как 4552706 (35.7 кД, pl 7.06). Белок был получен для идентификации аналогично вышеописанному способу. По результатам мик^осеквенирования был определен фрагмент последовательности I1SNASCTTH, который после поиска по банкам данных

аминокислотных последовательностей SWISS-PROT и HUGEN был найден в последовательностях мышечной и печеночной изоформы глицеральде-ггд 3-фосфат дегидрогеназы (К.Ф.1.2.1.12) и срответствовал 145 -154 позициям аминокислотной последовательности белка. Данный фермент представлен практически во всех типах клеток, но можно отметить его специфичность появления в ткану почки в атипичных количествах при терминальной почечной недостаточности. Кроме того, по литературным данным pi глицеральльдегид - 3 - фосфат дегидрогеназы, при 2ДЭФ определяется величиной в 7. 64 для миокарда [Knvalyov et al., 1995) и 8.89 у кератиноцитов человека [Cells et al.,1991).

* ^«г» -О

r <г» _

Рис.7. Фрагмент 2Д электрофореграммы белков почек. Специфичность при хронической почечной недостаточности. А -'Норма, Б - хроническая Почечная недостаточность. Пятно 4552706 отмечено стрелкой.

В нашем случае Величина pi составляла 7.06, что может свидетельствовать о появлении атипичной/модифицированной изоформы глице-ральальдегид-3-фосфат дегидрогеназы в ткани почки. Выявленное наличие атипичного белка при данной патологии, может служить основой для разработки диагностического теста почечной недостаточности, по ферментативной активности, и/или наличию массы белка в моче с использованием иммунологических тестов. В случае его выявления среди белков мочи терт может иметь прогностические значение.

ВЫВОДЫ

1. На основе фракционирования суммарных белковых экстрактов лочки человека, а также отделов и отдельных морфо-функциональиых структур и клеток почки 2ДЭФ по О'Фарреллу построена усредненная схема распределения наиболее представленных белков, отражающая особенности их белкового состава. Комплекс наиболее представлении х белков почки человека, дополненный информацией по белкам эпителиальных клеток составил 190 полипептидов.

2. Полученные данные суммированы с 2ДЭФ каталогом белков поперечнополосатой мышечной ткани человека и сводный каталог расширен с 312 до 482 полипептидов.

I

3. Идентифицированы на двумерной карте белков почки, используя микросеквенирование, полипептидные пятна В кристаллина, мито-хондриальной супероксиддисмутазы и фосфатидилэтаноламин связывающего белка.

4. При хроническом отторжении трансплантата сердца выявлено появление в ткани почки в атипичных количествах белков, идентифицированных как В .кристаллин и его продукт деградации.

5. Обнаружено появление в ткани почки при терминальной стадии почечной недостаточности в выраженных количествах атипичного варианта белка, идентифицированного микросеквенированием как глице-ральдегид-3-фосфаг дегидрогеназа.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хасигов П.З., Обельчук Л.И., Рубачев П.Г.. Салбиев К.Д., Дзгоева И.Б.. Цомартова Д.А., Николаев А.Я. Анализ белков базаль-ной мембраны проксимального отдела канальцев Почек двумерным электрофорезом.// Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины. - М., 1990.- С. 40-41.

2. Khaslgov P.Z., Obelchuk L. I.. Rubachev P. G., SalbleVK.D.. Dzgoeva I.В.. Tsomartova D.A.. Nlkolaev A.Y. Analysis of basement membranes proteins from proximal portions of renal tubules by two-dimensional electrophoresis: Abstr. Intern. Meet. Electrophoresis' Soc. - USA. Washington. 1991. -W 801. - P. 40.

3. Khaslgov P.Z., Kovalyov 1.1.. Grachevs. V., Obelchuk L. I.. Tsomartova D.A.. Salblev R.D., Rubachev P.G.. Shlshkln S.S. Studies of the tissue specific proteins of renal glomeruli and tubu-lus as result of cell differentiation: Proc. 22 Meet. FEBS. -Sweden. Stockholm, 1993. - N 163. - P.85

4. Хасигов П.3., Обельчук Л.И., Цомартова Д.А., Щеглова М.В. Белковые продукты генной экспрессии в разных морфо-функциональных структурах почки: Тез. докл. 1(3) Росс, съезда мед. генет. - М.. 1994. - 4.1. - С. 61-62.

5. Обельчук Л.И.. Цомартова Д.А., ЕФимочкин А.С.. Хасигов П.З. Изучение аутолитичесиой деградации белков почки у мыши.// Вопросы медицинской химии. - 1997. - N1. - С,17 - 23.

6. Обельчук Л.И., Цомартова Д.А.. Ковалев Л.И., Хасигов П.3.. Рубачев П.Г., Грачев С.В., Шишкин С.С.. Березов Т.Т. стандартизованный и расширенный каталог основных белков почки человека.// Биохимия. - 1997. - Т. 62. - вып. 2. - С. 225 -234.

THE IHVESTIGATIOH OP THB PROTEIN'S COMPOUND .CP КГОНЕГ АШ

цамрно-гтомош» strucitoe с® иернеонв in мая Diba A. Tsomarfcova (RUSSIA.) '

On the Ъаз1а of the factionality of the general protein extracts, the kidneys of the man, аз *?ell a a of the sections and individual norpho-funotional structures and the kidneys со Из, obtained, with, the help of the modified methods, using two-measured electrophoresis by 0"Farrail, an average chene of the distribution of the most presented proteins was built, reflecting the particular faatures of their proteins compound. The complex of the most presented proteins of the nan's kid. -nays, enlarged by tha information on the proteins of the epithelial cells composed 190 polypeptides. The received facts are aunaariaed with the catalog of the transverse-striped muscular tissue of the man, and the general catalog of the oan'a proteins is expanded from the 312 to 482 polypeptides. The spots of tha B-crystallina, nytochodrial auperoxydlsmytaaa and phosphotidilatonolamln of the oonnoctivo protein were indonti-fied on the two-aoasvred card, using microsequination. la chronio of the transplancat of the heart the antltypical quantity of the proteins, identified as B-crystalline and it's product of degradation was revealed. An acute quantity of the atypical variant of protein, identified by microsequination as glyceraldegid -3-phosphat of the degidxogenesia was revealed in kidney tissue in terminal stage of the kidney insufficiency.

29.04797г.

OdbQtvi In. л._______Тир. 100

Тип. ЛШ, Орджоникидзе» 3 ■

Зак. 318