Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Системная оценка генетической активности медицинских препаратов бактериального происхождения

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Системная оценка генетической активности медицинских препаратов бактериального происхождения"

|2;5: 0 5 9,2

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ ЫВДЩНСКИХ НАУК Всесоюзный научный кэдико-генетический Центр

На правах рукописи уда 615.371/.372.001.5:575.ИЗ

ВОЛГАРЁВА Галина ШссаПловна

СИСТЕМНАЯ ОЦЕНКА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ АШИЕКОСШ ЦВДЩНСКИХ ПРШАРАТОВ БАКТЕРИАЛЬНОГО ПРШСХОЗДЕНИЯ

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

" .■■'■ли

г'

тдел :сертлцшЛ

РОССИЙСКАЯ АКАДШ1Я МВДЩШСКИХ НАУК

Всесоюзный научный медико-генетический Центр

На правах рукописи УДК 615.371/.372.001.5:675.ИЗ

ВОЛГАРЁВА Галина Нихайловна

СИСТЕШАЯ ОЦЕНКА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЩЩЩ1НСКИХ ПРЕПАРАТОВ БАКТЕРИАЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

Работа выполнена в ШИ" вакцин й сывороток им.И.И.Мечникова АМН СССР, г.Москва

Научный консультант - доктор биологических наук Ю.А.Ревазова

Официильше' оппонеити - доктор медицинских наук, профессор

Н.П.Кулеазов

- доктор биологических наук, профессор А.П.Акифьев

- доктор биологических наук Г.Г.Порошенко

Ведущее учреждение - Институт общей генетики им.Н.И.Вавилова РАН

Защита состоится " £ " ¿¿АРА^ 1992 г. в часов

на заседании Специализированного совета Д.001.16,01 при ВсесоюзН! научном ыедико-генетическом Центре РАШ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного' научного медико-генетического Центра РАШ

Автореферат разослан "_"_;_ 1992 г.

Учёный секретарь Специализированного совета

доктор биологических наук, .

профессор Л.Ф.Курило.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИССЛВДОВАШЯ Актуальность проблемы. Препараты бактериального происхождения, в том числе вакцины, в отличие от других лекарственных препаратов в нашей стране пока не проходят проверки на мутагенность. Учитывая факты, свидетельствующие о тяжёлых последствиях контакта человека с мутагенами, Всемирная организация здравоохранения поставила пе -ред национальными службами здравоохранения задачу "безотлагательно развернуть исследования химических веществ на мутагенность... и принять надлежащие меры для борьбы с вредными веществами"(ВОЗ»Серия технических докладов, №282, 1965). В условиях осложнения экологи -ческой ситуации в стране мы проанализировали целесообразность включения контроля на мутагенность в систему доклинической проверки безвредности медицинских препаратов бактериального происхождения.

Актуальность данной экспертизы определяется тем, что, обладая, как правило, митогенным действием, в случае мутагенности бактери -альные иммуностимулирующие препараты могут оказаться идеальными канцерогенами, наделёнными как инициирующим опухолевый рост действием (обусловленным мутациями), так и действием промоторным (т.е. стимулирующим размножение клеток). Опасность мутагенных последствий использования этих препаратов возрастает ввиду того, что многие из них предназначены для обязательного, нередко - для повторного применения большими контингентами людей, не вышедших, как правило, из репродуктивного возраста; многие вакцины вводятся детям.

В последние годы сформировалась тенденция рассматривать при -вивки по формуле "польза-риск"(Брагинская, Соколова,1990).При этом оценка экономической выгоды иммунизации как правило не вызывает затруднений, тогда как полная совокупность информативных тостов для суждений о реактогенности вакцин не определена. Рассматривая возмо-Ожные генетические последствия вакцинаций^ нельзя не учитывать рецес-

сивный' характер большинства вновь возникающих мутаций (Тимофеев-Ресовский и др., 1973). В силу этого всесторонняя оценка той или иной вакцины как потенциального мутагена непосредственно на груше при -витых ею людей невозможна. Увеличение частоты новых мутаций выявится в популяции лишь спустя несколько поколений и не будет расценено как результат применения конкретного препарата; в балансе "польза*-риск" неблагоприятный генетический эффект вакцинации окажется неучтённым. Ввиду этого возрастает актуальность комплексной доклинической оценки потенциальной мутагенности бактериальных имыунологи-чески активных препаратов в лабораторных тест-системах.

Объектом настоящего исследования явились бактериальные иммуно-логнчески активные препараты. Наш выбор обусловлен тем, что о генетической активности вирусов, в т.ч. вакцинных вирусных штаыыов, ухе получен большой экспериментальный материал; в подавляющем большкн -стве случаев вирусы оказывались мутагенами (Прокофьева-Бельгосскал, 1969; Блюмкин, Жданов, 1973; Гершензон, 1986). В противоположность вирусным ва&цинам препараты бактериального происхождения исследовались на мутагенность сравнительно редко. При интерпретации данных, полученных в опытах с бактериальными препаратами, мы сочли целесооС разным дать экспериментальные ответы на такие вопросы как: можно Л1 считать исчерпанной проблему потенциальной генетической опасности ' группы препаратов на основании преимущественно отрицательных резуш татов испытаний ряда препаратов из этой группы в нескольких тестах' является ли гарантией генетической безопасности препарата отсутствие у него ДЩ-тропности?, является ли природное происхождение гарантией немутагенности препарата? и т.д. Для получения ответов на подобные вопросы и была проведена данная работа.

Цель исследования. Целью настоящего исследования было оценить необходимость включения контроля на мутагенность в систему доклинической проверки безвредности медицинских препарате бактериального происхождения.

В задачи исследования входило: [. Оценить потенциальную мутагенность бактериальных иимунологнчеспл активных препаратов на основании данных литературы.

2. Разработать и модифицировать ряд методов оценки генотоксичности медицинских препаратов бактериального происхождения.

3. Исследовать генотоксичность ряда бактериальных иммунологически активных препаратов.

4. Исследовать генотоксичность нескольких вспомогательных веществ,, используемых при создании бактериальных препаратов, а также смесей "бактериальная вакцина плюс химическая добавка".

5. Дать научное заключение о целесообразности или нецелесообраз.-ности доклинического контроля мутагенности бактериальных иммуноло-гически активных препаратов. В случае утвердительного ответа -предложить набор тестов для такого контроля.

Научная новизна исследования. Впервые в цитогенетических экспериментах показано отсутствие мутагенной активности у ряда инак -тивированных бактериальных вакцинных препаратов: протейного, клеб-сиеллёзного, менингококкового, четырёхкомпонентного (содержащего антигенные комплексы-клебсиеллы, стафилококка, протея и кишечной палочки), двух коклюшных - корпускулярного и бесклеточного, а также у двух бактериальных препаратов с иммуностимулирующей актив -ностью - томицида и СТО. Установлена немутагенность перечисленных препаратов по отношению к клеткам индикаторных штаммов сальмонелл (менннгококковнй препарат в данном тесте не испытывался).

Два химических агента, используемых при приготовлении бактериальных влкцип, - солянокислый гидроксилзмин и мертиолат, - впервые

испытаны в тестах, обязательных для оценки генотоксичности лекарственных средств. Показана немутагенность'этих химических добавок, для клеток костного мозга мышей в опытах in vivo и для клеток индикаторных штаммов сальмонелл в' тесте Эймса "sainoneiia /микро-сош".

ВпЬрвые в опытах на мышах in vivo (путём учёта аберраций, хромосом в костном мозге) исследована мутагенность экспериментальной смеси "вакцина олгс химическая добавка". Обсувдаются возможные причины значимого генотоксического действия такого комплекса.

Два вещества, использованных в работе в качестве позитивных контролей, фторафур и ханерол, впервые охарактеризованы как мутагены. Получены данные, уточняющие механизмы их действия.

Впервые в прикладном исследовании по химическому мутагенезу 'использован высокочувствительный метод регистрации генетических повреждений в половых клетках - микроскопический анализ тотальных препаратов синаптонемных комплексов вакцинированных мышей (СК-тес Дано обоснование для включения СК-теста в систему методов оценки цутагенности бактериальных препаратов. Показана пригодность светс вой микроскопии СК для учёта генетических аномалий. С помощью рлектронной микроскопии СК выявлена генотоксическая активность бесклеточного клебсиедлёзно.го вакцинного препарата.

Впервые рекомендовано использовать животных с иымунодефици • тами в качестве моделей для оценки мутагенности бактериальных пр< Паратов. Мыши с генетически детерминированным иммунодефицитом (бестимусные) использованы при испытании на генотоксичность бес клеточного коклюшного вакцинного препарата. Показано отсутствие у этой вакцины повреждающей хромосомы активности по отношению к клеткам костного мозга бестимусных мышей.

На модели гибридом-продуцентов моноклональных антител к 6at

гериальным антигенам показано дестабилизирующей хромосомный аппарат действие микоплазм, иногда сопровождающееся утратой секреторной функции. Продемонстрирована возможность восстановления способности секретировать моноклональные антитела путём клонирования ги-бридомной культуры при параллельном кариологическом анализе.

Впервые дано научное обоснование необходимости контроля на мутагенность бактериальных иммунологически активных препаратов и предложена совокупность методов для такого, контроля.

Практическая значимость и пути реализации проведённой работы

Материалы диссертации использованы в лекциях на факультете усовершенствования врачей в курсе "клиническая иммунология" (теш "Неспецифическое действие вакцин", "Вакцинопрофилактика'и иыцуно-дефицитные состояния", "Проблема безопасности вакцин") в 1991 г.

По результатам исследования подготовлены методические реко -мендации "Оценка мутагенной активности бактериальных препаратов", утверждённые 14.08.91 г. зам. Главного Государственного санитар -ного врача СССР.

Данные, полученные при испытании на мутагенность протейной и бесклеточной коклюшной вакцин, использованы при подготовке ЭПР сухой протейной вакцины из антигенов №106-88 и Инструкции по изготовлению и контролю бесклеточной коклюшной вакцины соответственно.

Результаты экспериментов с гибридомами использованы в "Методических рекомендациях по получению гибридом-продуцентов монокло-нальных антител к бактериальным антигенам" (М.,1986).

По материалам диссертации опубликовано 36 печатных работ.

Положения, выносимые на защиту I. Обоснована необходимость комплексного доклинического контроля мутагенности бактериальных иммунологически активных препаратов на Основе методологии, учитывающей специфические особенности этих прг паратов и ориентированной на выявление возможных слабых эффектов.

'¿. Проверка в тестах, рекомендованных для контроля лекарств на мутагенность (тест йймса вБа1шоче11а /ыихросомы",' цятогенетичоский ала -лиз клеток костного мозга ышш) позволяет охарактеризовать как генетически безвредные ряд инактивированных бактериальных 1Е£лунологнчгс~ кн активных препаратов и химических добавок, входящих в состав отнх препаратов.'

3. Действие бактериальных препаратов на генетический аппарат людей

с дефгктаыи иммунитета ыогшо моделировать проведением цитогенетичес-ких экспериментов на иымунодефицитных яиватннх.

4. Использование высокочувствительного метода учёта аномалий, возникающих в половых метках, - анализа тотальных препаратов синаптонем-ных комплексов экспериментальных животных, - даёт возыозшость оценивать генетические последствия вакцинаций в ряду поколений.

Апробация диссертации.

Материалы диссертации были представлены и обсувдены на IX Вйе -союзном симпозиуме "Генетическая и биохимическая характеристика ало-качественного превращения клетки" (Ленинград; 1976); на конкурсих молодых учёных Всесоюзного онкологического научного центра АМН СССР (Москва, 1976 и 1977); на 1У Советско-Американском симпозиуме "Генетика соматических клеток млекопитающих и проблема рака" (Тбилиси,

1977); на Всесоюзной конференции молодых учёных-онкологов (Суздаль,

1978); на Х1У Международном генетическом конгрессе (Москва, 1978); на Международном совещании вкспертов стран СЭВ по проблеме "Хромосо« мы и рак" (Врио, 1979); на I Всесоюзном совещании по генетике сома* тических клеток в культуре (Звенигород, 1981); на II Всесоюзной коо] динационном совещании "Эколого-генетические последствия воздействия на окружающую среду антропогенных факторов" (Сыктывкар, 1989); на Всесоюзной симпозиуме "Актуальные вопросы диагностики инфекционных болезней лабораторных животных" (Москва, 1989); на международном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты биотехнологии лабора

торных животных" (Пущино, 1989); на II Всесоюзной конференции по генетике и цитологии мейоза (Новосибирск, 1990); на Всесоюзной научной конференции "Монпнгококковая инфекция и гнойные менингиты"(Новосибирск , 1990); на заседании секции биотехнологии общества шпгробл-ологов (Москва, 19СО); на Всесоюзной научной конференции "Недико-биологические и гигиенические аспекты охраны окружающей среды"(Ста-рая Купавна, 1991).

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырёх разделов, посвященных изложению и анализу полученных экспериментальных данных, заключв -ния, выводов, указателя цитируемой литературы (184 отечественных к 244 иностранных источников). Диссертация изложена на 277 странл -цах машинописного текста, включает 55 таблиц и 25 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Известны факты, свидетельствующие об учащении хромосомных аберраций у больных некоторыми инфекционными заболеваниями бактериаль -ной природы (скарлатиной, дизентерией, туберкулёзом). Имеются сообщения о цитогенетических экспериментах с четырьмя бактериальными вакцинами: инактивированной спиртовой брюшнотифозной, а также тремя живыми - бруцеллёзной, туляремийной и БЩ. У людей, вакцинированных бруцеллёзной и БЦК-вакцинами, частота лимфоцитов с хромосомными аномалиями после прививки значимо превышала контрольный показатель (Ильинских,1974; Ильинских и др.,1986); живая туляремийная вакцина в однократной дозе, рекомендуемой для накожной или внутрикожной прививки человека (именно эти способы применяются при вакцинациях людей) не учащала хромосомных аберраций в клетках костного мозга крыс, однако при подкожном введении в дозе, соответствующей 12-25 Оэднократным, и у этого препарата была зарегистрирована повреждающая хромосомы активность (Зильфян и др., 1986); прививка людей

спиртовой брюшнотифозной вакциной не вызывала учащения аберраций хромосом в их лимфоцитах (Ильинских, 1974). Индукция цитогенеткчес-ких аномалий зарегистрирована на различных экспериментальных моделях при воздействии золотистыми стафилококками, шигеллами йлексне-ра, возбудителями аэромоноза карповых рыб, продуктами жизнедеятельности риккетснеподобных бактерий растений. Цутагенные свойства установлены у двух типов коммерческих препаратов бактериального происхождения - экзотоксинов и рестриктаз. Имеются косвенные свиде тельства в пользу потенциальной мутагенности нуклеиновых кислот бактериальной клетки.

Таким образом, данные литературы не могут служить обоснованием- немутагенности бактериальных компонентов иммунологически ш:тш ных препаратов.

Мутагенность выявлена в тех или иных тестах у многих химкчес ких добавок, присутствующих в бактериальных препаратах. К числу ких добавок относятся формальдегид, гидроксилашш, тиомочевина, ртуть-органические соединения (в эту группу входит и используемый в качестве консерванта мертиолат). Формальдегид и тиомочевина ока зывают канцерогенное действие на лабораторных животных. Некоторые из этих веществ, в частности, присутствующий во многих вакцинах и анатоксинах формальдегид, способны взаимодействовать с биологичес кими субстратами (с белками, РНК), сообщая мутагенные свойства «тим макромолекулам. Данное обстоятельство позволяет высказать опасение, что генотоксические свойства микробной массы, обработш ной этими веществами, могут быть выражены сильнее, чем можно был< бы ожидать, исходя из следовых количеств химических примесей в п товых препаратах. Некоторые органические производные ртути облад ют колхициноподобным действием, причём эта активность у них обна ружнвается в дозах, значительно меньших, чем у известных митоста тиков (колхицина, колцемида).

Особую проблему представляет присутствие в бактериальных иммуностимулирующих препаратах одновременно нескольких химических добавок. Неясен вопрос о том,, влияет ли, и если да, то как именно, н^ генотоксические споПсгва бактериальных компонентов технологический процесс приготовления этих препаратов. Мутагенность смесей "бакте <~ риальное начало пляс химическая добавка" не исследовалась. Данные литературы о мутагенных свойства« других смесей позволяют допускать возможность появления у смеси бактериального начала с химическим нового непредсказуемого генетического качества, - как сверхаддитив— ной мутагенности, так и подавления генотоксических свойств одного компонента препарата другим. Разработки, проводимые в современной вакцинологии с целью усовершенствования методов доставки антигенных комплексов к биологическим мишеням (например, использование липосом и других современных носителей) своим конечным результатом могут иметь не только повышение иммунологической эффективности вакцина -ций, но и проявление у некоторых минорных примесей, содержащихся в этих препаратах, мутагенных свойств, не зарегистрированных ранее в условиях менее совершенной доставки.

Имеются факты, позволяющие рассматривать людей с дефектами иммунитета как группу повышенного риска к мутагенным воздействиям. Примерами первичных иммунодефицитов человека, при которых иммунологическая неполноценность коррелирует с повышенной спонтанной и ин -дуцированной мутабильностью, являются т.н. "синдромы ломкости хро -мосом": атаксия-телеангиэктазия, анемия Фанкони, синдром Блюма. Рецессивные аутосомные мутации, обусловливающие эти редкие заболева -ния, в контексте настоящего исследования представляют интерес как возможные прототипы мутаций, генеративных и соматических, детерми -нирувщих более распространённые вторичные иммунодефицита. Сущест Овенно в связи с этим то, что аномально высокая чувствительность к

мутагенам выявлена не только у больных с перечисленными синдромами, но, во многих случаях, - также у гетерозиготных носителей соответ-'-ствующих мутаций, что значительно увеличивает доле в популяции людей, характеризующихся повышенной «(увствитсльностьи к мутагенным воздействиям.

Экспериментальная индукция иммунодефицитов у лабораторных еи-вотных нередко сопровождается повышением уровня спонтанных аберраций хромосом, а также появлением большего, чем у интактных кивот ~ них, числа клеток с хромосомными перестройками в ответ на мутагенные воздействия.

Ввиду отмеченного в последние десятилетия учащения вторичных иммунодефицитов в человеческих популяциях (по некоторым оценкам, juw поражено до 1/3 всех людей), а также с учётом неслучайного боз никновения инфекционных заболеваний у лиц с иммунологическими де ~ фектами представляется весьма актуальным учитывать иМмунологичзску неполноценность как возможный провокационный фон в методологии вак цинного мутагенеза. Очевидно и значение данной проблемы для при -клодного мутагенеза в целом.

Антимутагенные свойства, выявленные у ряда иммунологически активных препаратов, в том числе у некоторых лекарственных средстг микробного происхождения, могут служить основой для компенсации aj фектов различных мутагенов.

Материалы и методы исследования.

В качестве экспериментальных объектов использованы - мыши: нелинейные из разводки Kv;sHK; нелинейные бестимусные (пи /пи ) и гетерозиготные ( пи/+); инбредные линий C57BI/6J, СВА BALB/c, nFR, A/sn, бестимусные Swiss (пи /пи );

• нелинейные джунгарские хомячки;

• первичные культуры лимфоцитов периферической крови человека и эмбриональных фибробластов джунгарского хомячка;

- клетки длительно пересеваемых линий джунгарского и китайского хомячков, мыши и человека;

- индикаторные штакки Salmonella typhimurium ТА 97, ТА 98 и ТА 100.

В работе использованы методы учёта аберраций хромосом (Бочков и др., 1972), микроядер (Sohnid ,1975), сестринских хроыатидных обменов (СХО, — Korcnberg, Freediender ,1974), генных мутаций в локусе Г5РТ в ¡слетках млекопитающих in у:11го(Ш8Лиро,Варшавер,1975), генных мутаций в гистидиновом локусе в клетках сальмонелл (тест Эймса " salmonella /микросомы", - Ашез et al ,1973,1975), структурных аномалий синалтонемных комплексов (СК-тест, световая и элё-ктронная микроскопия, - Fletcher ,1979, й Dresser, Moses ,1979, соответственно; классификация аномалий СК - по Allen et al,1988).

В схемах экспериментов учтены рекомендации "Оценка мутагенности новых лекарственных средств" (М.,1988). В опытах in vivo пре -параты вводили внутрибрюшинно.

Испытания бактериальных препаратов и их химических добавок в тесте Эймса "Salmonella /микросомы" проведены совместно с нашими соавторами к.м.н. В.Д.Толчеевым (ВШЦ АМН СССР, лаб. клинической бактериологии, зав.- д.м.н. А.З.Смолянская) и Е.К.Кривцовой (ВНИИ ПТиД МЗ СССР, лаб. мутагенеза, зав. - д.б.н. Ю.А.Ревазова).Эксперименты с фторафуром на бестимусных мышах, а также опыты по индукции этим препаратом СХО выполнены совместно с нашим соавтором к.б.н. О.И.Соковой (ВСНЦ АМН СССР, лаб. цитогенетики, зав. - д.б.н., про -фессор Е.Е.Погосянц).

Для статистической обработки результатов применяли критерии t Стьюдента и 'Х?; данные теста Эймса обрабатывали по методу мно -жественных сравнений Даннета.

В работе была изучена мутагенная активность следующих препаратов: корпускулярной коклюшной вакцины (коклюшного компонента АКДС-

вакцины); бесклеточной коклюшной вакцины; клебеиеллёзной.вакцины; протейной вакцины; полихомпонентной вакцины из условно патогенных микроорганизмов (Ш4); менингококкового (серогруппн В) белково-по -диеахарвдного антигенного комплекса; двух препаратов с иымуноыоду -лирующей активностью • тсмицида и СИ, полученных из среды культи -вирования стрептококков. Использовали коммерческий корпускулярный коклюшный препарат, выпускаемый предприятием Еиомед Ыиныедбиопрома СССР. Экспериментальные образцы остальных бактериальных препаратов, разработанных в ШИВС иы.И.И.Мечникова АМН СССР, были предоставлены для опытов нашими соавторами.

В корпускулярном коклюшном препарате присутствуют в виде примесей формалин (не более 0,03$) и ыертиолат (не более 0,01%). Бос-клеточный коклюшный препарат содержит формалин (до 0,03$) и гидроокись алюминия (0,27 ыг в одной дозе). В получаемых с помощью солянокислого гидроксилаыина протейном, нлебсиеллёэном, поликомлоненг-ном, ыенингококковом препаратах данная примесь содержится в коли -честве, не.превышающем 1,0 мкг/мл.

Исследовали генотоксичность двух химических агентов, используемых при приготовлении и хранении бактериальных препаратов: соля • нокислого гидроксилаыина отечественного производства, а также ыер-тиолата производства двух фирм, " Serva "(ФРГ) И " Sigraa "(США).

Изучили также повреждающее хромосомы действие экспериментальных смесей "протейная вакцина плюс мертиолат", в состав которых вносили 0,01$ (доза, используемая для консервации бактериальных препаратов) мертиолата " Serva " или " Sigma ".

Выбирая именно эти препараты, мы руководствовались следующим Коклюшный компонент является наиболее реактогеннам в АКДС-вакциие применяемой для плановых вакцинаций детей. С этой же целью соэдаё ся бесклеточная коклюшная вакцина. Мертиолат вввду его присутстви

во многих препаратах, в том числе в АКДС-вакцине и в ряде анатоксинов, также является агентом, вводимым обязательно большим группам людей, Остальные испытанные нами бактериальные препараты или уже применяются ограниченными контннгентами людей (протейная вакцина, томицид), или разрабатываются для этих целей.

В качества позитивных контролей в цитогенетических экспериментах мы использовали три цитостатика: алкилирущий препарат циклофос-фгмид (ЦЗ), синтетический антиметаболит из Группы фторированных пи-рнмидинов фторафур (5т), являющийся фурановкы производным созданного ранее 5-фторурацила, а также выделенный из соцветий растения ив ая-чай препарат ханерол (Хан), отнесённый к классу гндролиэуешх тан -нкнов.

Результаты исследований и их обсуждение. I. Исследование генотоксичности бактериальных препаратов и их химических добавок.

Данные, полученные при испытании бактериальных препаратов и их химических добавок, а также ссылки на публикации, в которых мы опи» сывали эти.данные подробно, приведены в табл.1.

Тест Эймса " salmonella /микросомы" для большинства препаратов ставили на двух индикаторных штаммах - ТА 98, позволяющем регистрировать мутации типа сдвига рамки, и ТА IGO, дающем возможность выявлять мутации типа замен оснований. Корпускулярный и бесклеточный коклюшные препараты, а также мертиолат " Serva " были исследованы на трёх штаммах з. typhimurium : ТА 97 (являющемся моделью для /чёта мутаций типа сдвига рамки), ТА 98 и ТА 100. Выли проведены пак прямые эксперименты (без метаболической активации), так и опыты з активацией испытуемых препаратов мнкросомной фракцией S9, полученной из печени крыс. Исключение составил солянокислый гидрокеил -»мин: на основании дчнных лчтррат,урн (Аупрбях, 1978) можно бчло

Основные результаты проведённых испытаний

Таблица I

Препарат

Индукция Индукция цитогенети-

генных ческгас аномалий в кле- м„»

мутаций у тках млекопитающих Публикация

сальмонелл —--- ■ . -

соматических половых

Вакцины: лратейная клебсиеллёзная

поликомпонентная

менпнгококковый антигенный комплекс

коклюшная карпуску -лярная

коклюшная бесклеточная

Дрепараты с иммуномоду-лирувщими свойствами

томицид

СИ

Химические добавки

гидроксиламин солянокислый

мертиолат " Serva "

мартиолат " Serva и

мертиолат " Sigma "

Смесь "протейная вакцина плюс мертиолат "Sigma »

то же с мертиола -

ТОМ " Serva' "

Позитивные контроля

Jf Jt JBBt

18

23, 27

20, 33 23, 27 29, 33 28

30

34, ЗЬ

35, 36

17

22, 24

18, 32

21, 32 34

32

18 21

*

к - СК-тест, световая микроскопия; як - ОС-тест, электронная микроскопия; юм - метафазный анализ спериатогониев

юн« - здесь и далее в тексте цифры соответствуют номерам наших статей в списке работ, опубликованных по теме диссертации (см. стр. 44-48).

ожидать, что этот агент способен без предварительной активации индуцировать мутации типа замен оснований, поэтому он был испытан только в прямых опытах на.сальмонеллах штамма ТА 100. Обязательным условием учёта результатов этих опытов являлся значимый эффект позитивных контролей. В качестве примера конкретных результатов кы приводим данные опита с мертиолатом "serva " (табл.2).

Ни один из исследованных бактериальных препаратов не проявил мутагенных свойств в тесте Эймса "saimonelia /микросомы"; эти свойства не были также выявлены ни у мертиолата "serva ни у солянокислого гидроксиламина.

Цитогенетические эксперименты проведены на клетках костного мозга мышей. СТП и менингококковый антигенный комплекс были исследованы в микроядерном тесте; во всех остальных случаях мы учитывали аберрации хромосом на метафазных пластинках. В опытах с мертиолатом " Serva и мы кроме того учли аберрации хромосом в спленоци-тах и в эмбриональных гепатоцитах мышей. В подавлявшем большинстве этих экспериментов были зарегистрированы отрицательные результаты на фоне достоверных эффектов позитивных контролей.

Неодинаковая чувствительность мышей разных генотипов к экзогенным мутагенным воздействиям (Малашенко, Косарев, 1984; результаты наших опытов с см.ниже) может явиться причиной регистрации отрицательных результатов при испытании некоторых слабых мутагенов. Учитывая это, часть препаратов ны испытали на животных не -скольких генотипов. Так, клебсиеллёзная вакцина была исследована на мышах линий СВА и C57BL/6J , бесклеточная коклюшная вакцина -на мышах C57BL/6-J и на аутбредных бестимусных мышах; солянокис -лый гидроксиламин - на мьплах линий СВА и C57BL /6j ; мертиолат ".;-rva " - на животных линий C57BL/6j и ВА1В/с.

Таблица 2

Действие мертиолата " Serva " на индикаторные штаммы бактерий в тесте Эймса " Salmonella /микросомы"

i Штамм, ^Препарат Доза пре- Среднее геомет- Степень

папата, рическое числа Кратность мутагенного

вариант мкг/чашка ревертантов на превышения аффекта

чашку х. в баллах

ТА 97, Контроль 176,13 1,00 0

1ШАС Ыертиолат 0,05 166,32 0,94 0

!o,i 161,33 0,92 ' 0

. 0.2 _ I80j72 1,03 0

ТА 97, Контроль' 181,19 1,00 0

ШАС Ыертиолат 0,05 159,84 0,88 • 0

0,1 168,87 . 0,93 0

0,2 224,36 1,24 0

9-амино- 0 162,86 1,00 0

____адэидин_ _ _10,0___ 4I2_,45 2,53 I

ТА 98, Контроль 29,18 1,00" о"

1ШАС Ыертиолат 0,05 19,49 0,67 0

0,1 33,47 1,15 0

0,2 26,83 0,92 0

Бромид 0,00 29,18 1,00 0

етидия 10,00 IOOOjOO 34,48 2

ТА 98, Контроль 20,94 1,00 0

НЫАС Ыертиолат 0,05 17,97 0,86 0

0,1 25,10 1,20 0

0,2 14,07 0,67 0

Бромид 0,00 20,94 1,00 0

8ТИДИЯ 10,00 29,73 1,42 0

дали 0,00 32,16 1,00 0

10,00 850^00 26,43 г

ТА 100.Контроль 118,55 1,00 0

ПМАС Ыертиолат 0,05 113,50 0,96 0

0,1 126,33 1,07 0

.0,2___ Ша4б 0,94 0

ТА 100,Контроль 115,72 1,00 0

НЫАС Ыертиолат 0,05 122,67 1,06 0

0,1 112,00 0,97 0

0,2 126,47 1,09 0

Азид 0,00 115 72 I 00 9

натрия 10,00 561 25 4 85 I

я - НЫАС - неполная, ПМАС - полная ммкросомная активирующая смесь

Генетические аномалии в половых клетках мы исследовали в экс -периментах с тремя бактериальными препаратами: протейным, клебсиел-лёзным и поликомпонентным. Поликомпонентный препарат не индуцировал аберраций хромосом в сперматогониях мышей. Эффекты протейной и клебеиеллёзной вакцин были изучены на тотальных препаратах СК из сперма-тоцитов вакцинированных мышей. При электронной микроскопии СК у клебсиеллёзного препарата было выявлено значимое генотоксическое действие. Подробнее эти данные мы представим ниже.

В одном из нашга экспериментов смесь, содержащая немутагенный антигенный комплекс из Proteua vulgar!а и мертиолат " sigma " в условиях 5-кратного введения индуцировала хромосомные аберрации в клетках костного мозга мышей линии GBA. В другом эксперименте при . однократном введении смесь, содержащая тот же бактериальный препарат и мертиолат " serva ", не певреждала хромосомы клеток костного мозга мышей линии BALB/c. Существенно, что ни мертиолат "Serva ", ни мертиолат " ;;igina ", введённые сами по себе даже в дозе, в 10 раз превосходившей испытанную в смеси, не индуцировали хромосомных аберраций в костном мозге мышей линии C67BL/б j , высокочувствитель -ных к мутагенам прямого действия. Какая из причин обусловила несов -падение результатов двух экспериментов, в которых мы испытывали смесь мертиолата с вакциной, - разные генотипы использованных животных, различия в схемах введения или в.марках препарата, - неясно. Не исключено, что какие-то изменения в составе мертиолата происходят при длительном его храпении, в результате чего образовавшиеся производные непосредственно или опосредованно через вакцину могут вызы -вать генотоксический эффект.

При рассмотрении возможных последствий двух зарегистрированных нами генотокоичос.ких эффектов, - повреждающего СК действия клобсиел-.лёзной вякциш.1 и учащения аберраций хромосом в костном мозге под

действием экспериментальной смеси протейного препарата с мертиола-тоы, - целесообразно учитывать, что оба эти феномена имели место в условиях 5-кратного, с интервалом в сутки, введения препаратов мы -швы, по I человеческой дозе при каждой инъекции. С учётом разницы в массе человека и мыаш количество этих препаратов на единицу мае -сы тела мышей в этих опытах более чем в 100 раз превосходило дозу их, получаемую человеком при вакцинации на единицу массы тела.Вмесив с тем, эти эффекты свидетельствуют, что инактивированные бакте -риальные препараты могут оказывать генотоксическое действие.

К рассмотрению вопроса о том,- могут ли полученные нами отрицательные результаты служить полной гарантией немутагенности исследованных бактериальных препаратов и их добавок для человека(мы вер -немея в разделе о позитивных контролях.

2. Факультативные методы в контроле бактериальных препаратов на мутагенность, а).Контроль за спонтанным фоном цитогенетических аномалий у экспериментальных животных.

При испытании некоторых препаратов мы регистрировали в костном мозге мышей контрольной группы уровень клеток с цитогенетическими аномалиями, в 2-3 раза превышавший норму, приводимую в публикациях другими исследователями: до 2,0-2,5$ метафаз с перестройками хромосом (обычно этот показатель не превышает 1,0%) и до 7,8$0 полихро -ыатофильных эритроцитов с микроядрами (при норме около 2,5%« ).Присутствие (постоянное или периодическое, но достаточно частое) неизвестного мутагенного фактора в наших опытах ставило под сомнение корректность получаемых результатов, поэтому мы провели анализ возможных причин такого фона и попытались его устранить (26).

Поводом для экспериментальной проверки предположения, что мутагенный фактор имеет биологическую природу, послужили полученные нам!

в условиях того же вивария данные, касающиеся хромосомной неста -бильности гибридом (15,16). Рассмотрение вопроса о хромосомной не -стабильности гибридом при анализе причин повышенной частоты хромб -сомных аномалий у ккзей in vivo уместно ввиду зависимости многих этапов гибридомной техники от качества лабораторных животных (19). В некоторое из гибрндомных клеточных клонов мы зарегистрировали до 14 - 33 % метафаэ с аберрациями хромосом. Преобладание среди аберрч-цнй перестроек нестабильного типа, - одиночных и парных фрагментов,-свидетельствовало о том, что эти аномалии постоянно возникали dp novo . Самые высокие уровни метафаз с аберрациями хромосом были зарегистрированы в гибридомных клонах, клетки которых, по данным проведённых нами микробиологических и цитохимических исследований, оказались заражены микоплазмами. Эти результаты согласовывались с данными других исследователей, описавших повреждающее хромосомы действие микоплазм ( Fcgh, l'ogh , 1965; Кузьмина, Неустроева, 1971; Пс Gürriiy et ni , 1984). Микоплазменнул контаминацию мы обнаружили только в тех клонах, которые какое-то время поддерживались на шстах in vivo . Эти результаты - косвенное указание на возможность заражения гибридом микоплазмами через милей, которым прививались клетки.

Полученные результаты побудили нас проверить существование биологического мутагенного фактора в условиях вивария НИИВС им .И .И.Мечникова АМН СССР. Эксперимент был проведан на беспородных мышах разводки Kv:eHK, которых немедленно после поступления из питомника разделили на две группы: одну содержали в обычном боксе вивария, а другую поместили в барьерные условия - в термошкаф "Технипласт"(Италия) с подачей стерильного воздуха через фильтры HEPA. Термошкаф перед помеченном в него животных обработали 70° этанолом. Животных обеих групп корчили грянулирейшпл» комбикормом ПК-131-7, простери-

лизованным облучением Со в дозе 2,5 Ырад. Клетки, решётки и воду для животных, содержавшихся в шкафу, стерилизовали автоклавированием ' (1,5 атм, 121°С, 30 мин). Эксперимент длился 44 дня, после чего с помощью метафазного анализа и путём учёта микроядер в клетках костного мозга мышей (в каждом случае - на пяти животных из шкафа и пяти из бокса) мы сопоставили уровни патогенетических аномалий у мышей этих. двух групп.

Результаты метафазного анализа представлены в табл. 3.

Таблица 3

Хромосомные аберрации в костном мозге мышей

Проанали- % метафаз Число раз-__ Типы _аберраций_ __

■®Ж!НТ- рировано с абер - ртвов хро-х т 1п е Хроматвдные опыта метафаз рациями мосом на н£е ^ фр£гмен_ обмены _______________клетку ^ _рывы _ _ ты___________

Термошкаф 428 0,93+0,25 0,009+0,001 13-

Бокс 500 4,80+1,08* 0,056+0,013** 14 6 4

* - ^»3,5, Р-О.ОП прИ сопоставлении показателей, полученных кк - 1"3,6; Р^0,01} в двух варианта^ опыта

Клетки с аберрациями хромосом у животных из бокса обнаруживались в Б раз чаще, чем у животных из шкафа; все обнаруженные аберрации были нестабильными. У мышей, содержавшихся в барьерных условиях (в термошкафу) частота метафаз с аберрациями хромосом не превысила 1,0%.

Эти наблюдения мы подтвердили в ходе учёта микроядер в клетках костного мозга мышей. Частота полихроматофильных эритроцитов с микроядрами составила (4,0+0,49)5?»у животных из шкафа и (16,6+1,64)$»у мышей из бокса.

Биологическая природа мутагенного фона вивария следует из про -демонстрированной нами возможности устранить его действие путём поме-

щения животных в барьерные условия: ни от химических мутагенов (в условиях идентичного кормления простерилизованным кормом), ни от физических экранировать животных этим приёмом бь!ло бы невозможно|. Различий между группами мышей, содержавшихся в конвенциональных и в барьерных условиях, ми не обнаружили бы, если бы причиной высокой нестабильности хромосом являлась какая-то инфекция, занесённая из питомника. Фильтры типа HEPA не являются барьером для вирусов. По-видимому, повреждающее хромосомы действие оказывают какие-то более крупные микроорганизмы.

Насколько постоянен этот фактор для вивария, в котором он был зарегистрирован, насколько характерен этот фон для институтов подобного профиля, а также какой именно микроорганизм (микроорганизмы) . обусловливают этот фон, - эти вопросы остаются пока открытыми.

Описанный в настоящем разделе приём, позволивший снизить частоту клеток с цитогенетическими аномалиями у интактных животных до нормального уровня, был применён нами при испытании большинства препаратов: корпускулярного и бесклеточного коклюшных, поликомпо -нентного, менингококкового, клебсиеллёзного (при проведении опытов на мышах G57BI/5 Д),мертиолата обеих марок (на мышах C57BL/6 J); солянокислого гидроксиламина (на животных линии C57BI/6 J)*.

б).Использование иммунодефицитных (бестимусных) мышей.

Данные литературы, свидетельствующие, что иммунологическая неполноценность может являться провокационным фоном для мутагенных воздействий, побудили нас испытать бесклеточный коклюшный вакцинный препарат на бестимусных (гомозиготных по гену пи ) мышах.

к - СК-тест mj проводили на мышах линии C57BL/6 J, содержавшихся в конвенциональных условиях вивария ИЭМЭЖ им.А.Н.Северцова АН СССР; аутбпеяные мьпки'ш/ пи и пи/+ содержались в отсеке вивария ВОНЦ AMh СССР, njедназначенном для бестимусных животных.

На данной модели мы провели два эксперимента. В одном из них материал был зафиксирован через 24 ч после введения мышам 20 мкг вакцини (что составляет одну человеческую дозу). Во втором опыте клетки костного мозга были зафиксированы через 100 ч после введения вакцины в дозе 25 ыкг/мышь.

Дефицитность бестимусиых иышей не позволяет проводить на них ■ опыты большого объёма и оценивать эффект препарата одновременно в нескольких дозах и на нескольких сроках.

При фиксации материала через сутки после введения вакцины (стандартная схема, принятая в лекарственном мутагенезе) мы не выя -вили повреждающего хромосомы действия у этого препарата (табл.4).

Таблица 4

Аберрации хромосом в клетках костного мозга нелинейных бестимусных мышей в опыте с бесклеточной коклюшной вакциной (20 мкг/мышь, фиксация через 24 ч)

Вариант опыта Всего мышей Проанализировано метафаз % метафаз с аберрациями хромосом Число разрывов хромосом на • клетку

Контроль 4 300 0,50+0,44 0,005+0,004

.Вакцина 4 456 1,18+0,75 0,013+0,008

к - при сопоставлении с контролем: t=0,78; Р?0,05

Во втором эксперименте мы учли временные параметры иммунного ответа - нарастание количества продуцирующих иммуноглобулины клеток вплоть до 4-го - б-го дней после введения антигена. Поскольку при дифференцировке лимфоцитов в процессе иммуногенеза происходят функциональные перестройки грнома, ведущие к объединению разобщённых сегментов в один непрерывный отрезок и, по-видимому, сопровождаемые элиминацией разобщающих зги сегменты участков ДЩ, нельзя было ис-

ключить, что оптимальные сроки для выявления генотоксических

»

свойств иммунологически активных препаратов - большие, чем для других лекарственных средств. Исследуя эффект вакцины "на проВо -кационном фоне", на мышах с генетически детерминированным иммунодефицитом, в качестве группы сравнения в этом опыте мы использовали мышей-гетерозигот по гену 1 , не имеющих дефектов тимуса. .

Вакцина в лозе 25 мкг/мышь через 100 ч после введения оказы -вала выраженное стимулирующее клеточную пролиферацию действие и на бестимусных, и на гетерозиготных по гену - мышей: 43,25+3,30 %„ и 51,00+6,09 %с делящихся клеток у опытных животных по сравнению с 15,50+0,42 %„ и 13,70+1,20 /ь..у контрольных м-/м- и пи/+ мышей соответственно. Таким образом, момент, в который мы провели учёт аберраций хромосом в клетках костного мозга вакцинированных животных, отвечал поставленной задаче: исследовать цитогенетический эффект вакцины на фоне вызванной антигеном клеточной пролиферации. В этих условиях ни у бестимусных, ни у мышей с нормальным тимусом ( ■ /+) вакцина не индуцировала аберраций хромосом: мы зарегистрировали 1,00+0,Ь0,'£ аберрантных метафаз у бестимусных вакцинирован -ных мышей при 0,53+0,24% их в контроле (Р>0,05) и 0,6740,52 % у вакцинированных гетерозиготных /+ при 0,81+0,35% - у контрольных.

Таким образом, результаты проведённого эксперимента не дают оснований пересматривать принятые в лекарственном мутагенезе схемы оценки генотоксичности для бактериальных иммунологически активных препаратов в направлении отказа от 24-часовых фиксаций и обязательного продления сроков экспозиции с испытуемым агентом. По-видимому, молекулярные перестройки генома в процессе иммунного ответа не сопровождаются учащением микроскопически обнаруживаемых ■чберраций хромосом; данные литературы, которые могли бы служить

подтверждением существования такой связи, нам неизвестны.

В целом результаты двух опытов с бесклеточной коклшной вакциной, проведённых нами на мышах с иммунодефицитом (бестимусных), свидетельствуют об отсутствии у Данного препарата, негенотоксич -ного для обычных линейных мышей, повреждающей хромосомы активности и нй этой модели. •

в). Анализ генетических нарушений в половых клетках на тотальных препаратах синаптонемных комплексов (СК-тест).

Введение некоторых бактериальных препаратов в ходе плановых прививок большим группам людей является основанием для оценки действия их на наследственные структуры половых клеток. Учитывая это, аффекты двух бактериальных вакцин, протейной и клебсиеллёзной, мы изучили на тотальных препаратах синаптонемных комплексов (GK) мы -шей.СК-это белковые структуры, формирующиеся в профазе первого деления мейоза и точно повторяющие конфигурацию хромосом; СК обеспечивают синапсис, кроссинговер и сегрегацию гомологов ( Counoe, Meyer ',1973).

СК-тест привлёк наше внимание высокой чувствительностью: заведомо присутствующие в сперматоцитах 1-го порядка аберрации хромосом удаётся с его помощью выявлять вдвое эффективнее, чем при метафазном анализе первого•мейотического деления (cawooa.Brcckon.l Каликинская и др.,1986).Кроме того, преимущественно белковая природа СК позволяет предполагать, что некоторые агенты окажутся избирательными генотоксикантами по отношению только к половым, но н к соматическим клеткам. Наша работа является первой попыткой испо льзования метода СК в прикладных исследованиях по химическому мутагенезу (контроль новых веществ на генотоксичность). В качестве

позитивного контроля мы использовали 1|5, эффект которого на CK по -дробно изучен ( Allen et al , 1987, 1988; Backer et al ,1988).

Многократное введение вакцин самцам мышей линии C57BL /6 J по различным схемам мы применили в этих опытах потому, что не располагали данными о Механизмах генотонсичесиого действия этих препара -тов, тогда как известно, что сроки обнаружения аномалий CK после введения мутагенов разных классов существенно различаются ( Allen et al, 1988). Поскольку разовая доза этих вакцин для человека со етавляет 100-200 мкг, животным вводили по 100 мкг испытуемых препаратов за I инъекция (в одном из экспериментов наряду с этой дозой применили также дозу I мкг за инъекцию, - ем. табл. 6). Ранее мы представили подробные результаты учёта аномалий CK в этих экспериментах с помощью световой (27) и с помощью электронной (33) микроскопии. ,

Объектом анализа являлась гетерогенная популяция клеток, полученных из семенников. Чаще других субстадий профазы и в контроль -ном, и в опытном материале встречалась средняя пахитена. У вакцинированных мышей не происходило накопления клеток На более ранних стадиях пахитены по сравнению с контролем, что свидетельствовало об отсутствии выраженной цитотоксичности исследованных вакцин на дан -ной модели.

Результаты учёта аномалий CK с помощью светового микроскопа представлены в табл.б.

1|8 вызывал настолько сильные повреждения CK, что в подавляющем большинстве клеток определить стадию профазы не удавалось. Среди

Л

62 профаз аномалии CK не были выявлены лишь в одной. Частота аберрантных клеток в нашем опыте составила 98%. Эти результаты согласуются с данными, полученными другими исследователями при алектронно-микроскопическом исследовании действия ЦВ на CK: через 4 суток пос-

ле введения этого цитостатика в дозе 100 мкг/г повреждения СК были обнаружены в 86,7$ пахитен ( :uC,. .-t. ni , 1988); по данным той же группы исследователей, через 5 суток после инъекции ЦБ в дозах 100 и 2ÙO мкг/г соответственно 65% и 94% профаз имели аномалии СК ( л lien et al ,1987). Число СК у животных, которым мы за 96 ч до фиксации ввели Ц5, не просчитывалось из-за фрагментации, множест -венных участков всинапсиса (в которых нити СК были вдвое тоньше, чем в местах нормальной конъюгации), а также из-за многоосевых конфигураций, отражающих, по-видимому, обмены хромосомного материала.

Таким образом, продемонстрирована принципиальная возможность регистрации с помощью светового микроскопа повреждений СК при действии сильного мутагена.

Идентифицируемые единичные аномалии СК мы наблюдали в контроле и в материале, полученном от вакцинированных животных. У интактных мышей частота клеток с аномалиями СК равнялась Ь,0%, у животных, которым вводили протейную вакцину, - 2,7%, у мышей, вакцинированных клебсиеллёзным препаратом, - 6,0^. Таким образом, в вариантах опытов с вакцинами не было зарегистрировано учащения аномалий СК по сравнению с контролем. Поэтому повреждения СК, обнаруженные у контрольных и у опытных животных, мы рассматривали в совокупности. Среди 22 аномалий более половины (59,1%) составили разрывы аутосомных СК, около четверти (27,35?) - разрывы между Х- :i У-осями. Помимо этого, по одной клетке содержали разрыв оси У-хромосомы, петлю и дополнительный половой пузырёк.

Результаты учёта структурных аномалий СК в пахитенньгх сперма-тоЦитах с помощью электронного микроскопа приведены в табл.6. Значимое повреждающее СК действие в этом материале мы установили не только у служившего позитивным контролем но и у клеОсиеллёзной

Таблица 5

Частота аномалий СК в сперматоцитах вакцинированных ьошей (световая микроскопия).

GxeMa введения Jf препарата мыши Про анализ иро-- вано клеток - Из них - с аномалиями СК Ста д и и па х и т е н и

ранняя средняя поздняя

к 0 н т р 0 л ь

- I 4 0 I 3

- 2 32 I 16 IÓ

- 3 30 О 30

- 4 34 3 I 23 10

всего 100 6 2 72 26

про т е й пая в а к ц и н а

Ь-кратно через 24ч, фиксация через 24ч после поел.введен. 5 30 I 2 23 5

3-кратно через фиксация через и 7дн, 24ч 6 7 12 11 0 0 12 8 3

3-кратно: за 7,5 и I день до фиксации 8 21 I 6 II б

всего 74 2 7 54 13

клебсиеллёзная вакцина

5-кратно через 24ч, фиксация через 8дн 9

5-кратно через 24ч, фиксация через 24ч 10

11

12 13

дважды:за 4 и 1 сутки до фиксации

всего

50 3 16 35

23 0 22 I

5 I Б

5 0 2 з

50 4 14 29 7

¿33 8 16 74 43

циклофосфамид

100 мкг/г,фиксация

через 96 ч 14 32 32

200 »/кг/г,фиксация

через 96 ч 1Ь 30 29

В подавляющем большинстве клеток стадию определить невозможно

вакцшш, введённой мышам по 100 мкг 5-кратно с интервалом в 24 ч (суммарно - 33,0 мкг/г). Частота клеток с аномалиями СК в этом варианте опыта с вакциной превысила контрольный показатель в 10 раз: (48,5+9,0)$ и (4,7+3,8)$ соответственно. Значимого генотоксического эффекта этой вшсцины при введении её по той же схеме в дозе I мкг за I инъекцию (что на единицу массы тела более чем в 10 раз превосходит дозу, получаемую человеком при вакцинации) мы не выявили. В варианте опыта с протейной вакциной (33,0 мкг/г) достоверного учащения пахи-тен с.аномалиями (Ж отмечено не было.

Значения показателя "число аномалий СК на клетку" также свидетельствуют о достоверном повреждающем СК действии ДФ и клебсиеллёз-ной вакпкны в дозе 33,0 мкг/г и об отсутствии такого эффекта у протейного препарата и у клебсиеллёзной вакцины в дозе 0,33 мкг/г.

Типы аномалий GK, зарегистрированных при электронной микроскопии, представлены в табл.7. Большую часть повреждений, индуцированных клебсиеллёзной вакциной, составляли разрывы аутосомных СК и отдельных боковых элементов СК. Помимо этого были отмечены также случаи аномального синапсиса, асинапсис аутосомных СК; по одной пахите-не содержали разрыв оси Х-хромосомы и синалсис "на себя" оси Х-хромосомы. Среди аномалий GK, отмеченных в экспериментах с ЦБ, преоб -ладали разрывы и асинапсис.

Полученные данные свидетельствуют о способности клебсиеллёзной вакцины б субтоксической дозе при многократном введении оказывать повреждающее (Ж действие. Результаты, касающиеся протейной вакцины, имеют предварительный характер ввиду небольшого объёма проанализи -рованного материала.

Рассмотрение спектра аномалий СК, зарегистрированных под элект ронным микроскопом, позволяет уяснить причины несовпадения данных, касающихся клебсиеллёзной вакцины, полученных нами с помощью свето-

-¡.¿Аилпца и

Частота аномалий CK в пвхитенных сперматоцитах вакцинированных икзей "(электронная микроскопия)

Изучено Клетки с аномалиями G К Число аномалий CK на клетку

Вариант опыта Число спер-

«ыптпО мятатш общее ' ргзультат статпс- оезультат статис-

атоци~число частота (,%) тической обработ- • среднее тической обра -

тов кк ботки

контроль 3 20 I 4,8 ± 3,8 0,05 + 0,04

протейная вакцина, 33,0 мкг/г 2 10 I 8,3 + 5,9 t =0,51; IVO,05 0,09 + 0,06 t = 0,51; P>0,05

клебснеллёзная вак-цкна, 0,33 мкг/г 2 45 3 21,3 +13,3 t -1,18; РЯ),05 0,31 + 0,21 t = 1,27; P>0,05

33,0 мкг/г 3 38 19 48,5 + 9,0 t »4,46; t -3,78; B4),Q0I P-43,001 0,74 + 0,17 t - 4,02; P^O.OOI

3 43 34 78,9 + 0,8 t =19,0; P^0,00I 2,44 + 0,12 t =18,33; PO,001

200,0 мкг/г I 4 4 100,0 5,50

к - сравнен« с контролем ж - сравнение с протейной вакциной

»■ей к плектронной микроскопии. Так, около 40% всех идентифицирован -т.тх под электронны;.! микроскопом аномалий было представлено разрывами осей половых хромосом и разрывами аутосомных СК. Именно эти повреж ~ допил пи обнаруживали в опытах с клебсиеллёзной вакциной под свето -г.ым микроскопом. Вероятно, не все истинные разрывы СК и разрывы оси К-хромосомы под световым микроскопом были учтены: иногда, отмечая просветы в СК, не сопровождавшиеся сдвигом фрагмента, мы считали это особенностью окраски и, как и при учёте ахроматиновых пробелов в хромосомах, относили такие пахитены к числу неповреждённых. Более чет ~ рерти всех структурных нарушений СК составили разрывы отдельных бо -повых элементов, выявить которые с помощью светового микроскопа не -гозможпо. Наконец, клетки с многоосевыми конфигурациями СК при све -тэвой микроскопии, вероятно, исключались из анализа как не поддающиеся точному просчёту СК.

Таблица 7

т?

Типы аномалий СК

Всего Разрывы Разрывы Многоо- Асинап-Синап- Разрывы

Вариант анома- боковых аутосом-севые сис ау-сис"на осей по-

опыта лий элемен- ных СК конфигу-тосом- себя" ловых

, СК тов СК рации ных СК Х-оси хромосом

Контроль I . - I - - -

Протейная вак- I I

цина, ЗЗмкг/г

Клебсиеллёзная

вакцина, 0,ЗЗмкг/г 4 3 I

33 мкг/г 29 8(27,6) 10(34,4) 5(17,2) 4(13,8) 1(3,Ь) 1(3,Ь)

IfS, 100 мкг/г 106 16(15,1) 70(66,0) 1(0,9) 13(12,3) - 6(5,7)

200 мкг/г 22 10(45,5) 12(54,Ь) - -

* — в скобках приведены, проценты от общего числа аномалий СК

Существенно, что при идентичном режиме введения клебсиеллёзная вакцина (33,0 мкг/г) не учащала в наших опытах аберраций хромосом в клетках костного мозга мышей той же линии; этот препарат не инцуцч-

ровал генных мутаций в клетках гистидин-зависшшх сальмонелл.

Таким образом, электронная микроскопия GC - это единственный тест, в котором мы выявили генотоксическое действие бесклеточнои бактериальной вакцины, ПрИГОТОВЛСНИОЙ ИЗ Klebsiella pneumoniae г). Позитивные контроли при экспериментальной оценке генотоксичности бактериальных препаратов. В описанных виге экспериментах для подтверждения адекватности тест-снстеш задаче оценки мутагенности нового препарата мы как правило включали в опыты позитивный контроль.

В настоящем разделе, привлекая результаты экспершентов с трэ-ня цитостатикш;и, Ст, Хан и Ц5, ш рассмотрели некоторые особенности проявления мутагенного потенциала химических соединений. Pese -ние вопроса о целесообразности контроля на мутагенность бактериальных препаратов предполагает учёт этих особенностей. '

Позитивные контроли выполняют в нашей работе следующие функции:

1. служат группой сравнения;

2. позволяют оптимизировать методику и оценить значение для итога испытаний такте-факторов как тип регистрируемых генетических по -вреждений, используемая модель, протокол эксперимента (режим обработки веществом, срок учёта результатов, режим культивирования клеток в опытах in vitro , влияние метаболической активации и т.д.)

3. иллюстрируют возможность обнаружения мутагенных свойств у препаратов природного происхождения;

4. свидетельствуют, что в ходе проверки на генотоксичность могут быть получены результаты, углубляющие представления о механизме мутагенного и, возможно, также лечебного действия препарата;

5. демонстрируют, что ДНК-тропность - необязательное условие му -тагенности вещества;

6. отражают эволюцию представлений о группах веществ, потенциально

опасных дпя генетического аппарата человека.

Рассмотрим эти положения.

(2). Оптимизация методики испытаний.

В этом разделе мы суммировали экспериментальные данные, свиде-чспьствующие, что характеристика препарата как мутагена зависит от чою, какие именно мутации, на какой модели, при каких режимах воздействия учитывались в опытах с этим препаратом.

Так, St в наших экспериментах не индуцировал СХО в культивируемых клетках млекопитающих (7,10), но учащал генные мутации в культивируемых опухолевых клетках джунгарского хомячка (11,12); повреждайте хромосомы действие этого препарата варьировало особенно ши -роко: от полного отсутствия эффекта на некоторых моделях vivo и 1 и vitro до появления хромосомных аберраций в 100% культивируемых злокачественных фибробластов джунгарского хомячка (1-Ю, 14).

Хан, не влиявший на частоту СХО в клетках линии 4/2Í дкунгар -ского хомячка, вызывал полиплоидизацию этих клеток и индуцировал в них (но не в других типах клеток) аберрации хромосом (13).

Ц5 в експериментах, проведённых нами in vivo на мышах пяти инбредных линий (табл.8), индуцировал в клетках костного мозга дос1 верно больше аберраций у животных линии BALB/c, чем у мышей линий HFR и СВА, Мыши линий C67BI/6 J значимо превосходили по чувствител! ности к повреждающему хромосомы действию ЦЬ мышей линии СВА. Резул* таты, полученные на мышах линии А/ ."п , характеризовались большими межиндивидуальными колебаниями, и поэтому не отличались статистиче< ки значимо от показателей, полученных на животных четырёх других линий.

Определяю аую роль режима обработки веществом (длительная без отмывания - краткосрочная с отмыванием) и срока учёта результатов мы продемонстрировали в опытах с отмыванием Фт, проведённых парал ■

Таблица 8

Повреждающее хромосомы действие Щ (26 мкг/г, 24 ч) на клетки костного мозга.мышей разных инбредных линий

Проана- % Число раз- Результаты статис-Линия Число■.лизиро- аберрантных рывов хро- тической обработки мъшей мышей вано метаоаз мосом на мвтафаз " клет»^

ПА13/с 5 '500 14,31+1,69 0,21*0,02 с CBA:t«3,86;P-<0,0I; с NH?:teI,97;Р-^0,0б; с C57BL/Q j: t=I, 65: R>0,Ó5; с A/sn :Ы),2;Р>0,0Б

A/sn Б • Б00 13,47+3,89 0,28j;0,09 с CBA:t=I,73;R>0,05; с nFE?:t=0,99;P>0,06

C673L/6J б ЕЮ 10,60+1,68 0,12+0,02 с llFR:t=0,56;P>0,05; с CBA:t=2,I5;P<0,05

иге б 350 9,19+1,95 0,11+0,03 с CBA:t»I,25;ÍM),05

G3A ' б 460 6,47*1,13 0,09+0,03 ■

лельно на культурах нормальных и трансформированных эмбриональных фибробластоа дяунгареного хомячка (9). Здееь, в частности, было установлено повреждающее хромосомы действие Фт на нормальные фибробласты, не обнаруженное ранее при 24-часовом воздействии без отмывания: частота метафаз с аберрациями в опытах на данной модели значимо возрастала после 2-6-часового воздействия препаратом, отмывания его и фиксации материала через 24 ч после введения Фт. В то же время ни в 48-часовой, ни в 72-часовой фиксациях повреждающий хромосомы эффект ®т на данной модели зарегистрирован не был. Зависимость частоты абер -рентных метафаз от режима обработки Фт и срока фиксации в параллель— ных опытах на злокачественных фибробластах оказалась иной, но и на этой модели доля клеток с хромосомньми перестройками в 24-часовой фиксации была наибольшей, а в 72-часовой - наименьшей при одинаковых режимах воздействия препаратом.

Полученные данные подтвердили наше предположение о том, что Фт оказывает избирательное ингибирутацее митотическую активность действие на нормальные фибробласты. Оптимальность 24-часовой фиксации для выявления эффекта Фт, продемонстрированная в этих опытах, согласуется с резким преобладанием хроматидных разрывов над другими типами повреждений среди аберраций, индуцированных этим препаратом как в нормалысых, так и в злокачественных клетках: именно к концу первого митотического цикла (приближающегося по длительности к 24 ч) эти нестабильные аберрации возникли, но ещё не утратились в ходе последующих делений клеток.

При попытке индуцировать Фт генные мутации 'в культивируемых злокачественных фибробластах линии 4/21 джунгарского хомячка исчерпывающие свидетельства мутагенности препарата мы получили лишь поел! синхронизации клеток (12). В табл.9 представлены результаты двух типичных экспериментов. В первом из них мы исследовали способность Фт

Таблица 9

Индукция £т мутаций ГФРГ" в клетках млекопитающих

& Фт, Частота мутаций

опыта Культура 0,06мг/мл абсолютная (хЮ~®) на выжившую клетку(хЮ~^

1 асинхронная ~ 4,8 3,8 6,7 16,7

2 синхронная 8,9 19,0 9,1 2Ь,0

вызывать мутации резистентности к 8-азагуанину на асинхронной, во втором - на синхронизированной культуре клеток. В первом случае пр! подсчёте мутантных колоний на чашках с селективным агентом мутагенность препарата как правило не была очевидна, и лишь внесение т.н.

"поправки на эффективность клонообразования", которая позволяет учесть разницу в жизнеспособности клеток в контроле и после обработки их препаратом, дало нам возможность зарегистрировать мутагенный аффект $т в двух из четырёх экспериментов.

На синхронные культуры (полученные путём стряхивания со дна [ршконов слабо прикреплённых клеток, находящихся в митозе, и поьгорного рассева этой клеточной фракции) мы воздействовали От в момент, когда большинство клеток вступило в период синтеза ДНК, - подтверл -дениэ этому мы полумили в эксперименте с %-тимидином. Несмотря на то, что срок воздействия препаратом в этом случае мы сократили в 6 раз (до 3 ч по сравнению с 24 ч в экспериментах на асинхронных клетках), честота »утаций во всех четырёх опытах с синхронизирован ными клетками значимо превосходила соответствующие контрольные показатели не только с учётом поправки на выживаемость, но и по абсолютному значению числа зарегистрированных мутантных колоний. Эти результаты согласуются с прздставленилми о повышенной чувствительности точки репликации к некоторым мутагенным воздействиям ( Cerda Olmedo et al, 1968), а также о том, что локус ГВРТ в клетках млекопитающих репли -цируется в ранней 3-фазе ( Aeberaold ,1979;Hakamura, Okada , 1979).

Иллюстрацией определяющей роли метаболической активации при исследовании генотоксичности препарата служат результаты наших опытов ç Хан (13): в то время как неактивированный Хан оказывал повреждав -щее хромосомы действие на культивируемые фибробласты линии 4/21 джун-гарского хомячка, в культурах, в которые этот препарат был введён одновременно с микросомной фракцией s 9, частота метафаз о аберра -циями хромосом не превысила контрольного показателя. Итак, мутагеном являлся испытуемый препарат непосредственно, а в процессе метаболизма из него быстра возникали немутагешше дериваты.

Таким образом, итоги испытания на мутагенность новогр вещества, в том числе бактериального иммуностимулирующего препарата, могут зависеть от многих методических параметров. Они влияют не только на степень мутагенности вещества, выявляемую в экспериментах", но, нередко, - и на возможность установления самого факта мутагенности. Этими параметрами, по результатам наших исследований, являются: тип гене -тических аномалий, регистрируемых в экспериментах с данным препара -том; модель, на которой проводятся испытания; режимы обработки веществом; срок учёта результатов опыта; режим культивирования клеток, служащих моделью; введение в тест-систему ферментов, осуществляющих метаболическую активацию испытуемых веществ.

Рекомендовать на основании данных, полученных в опытах с пози -тивными контролями, проведение проверки на мутагенность каждого но -вого.вещества с учётом такого количества методических переменных (а приведённый нами перечень этих переменных не претендует на полноту) мы считаем нереалистичный. Единственный практический вывод из результатов наших опытов с ЦБ, Фт и Хан - это вывод о целесообразности возможно более комплексного испытания каждого нового препарата, с при -влечением разных моделей и схем экспериментов, в условиях учёта му -' таций разных типов..

Очевидно в связи с этим, что отсутствие у препарата мутагенной активности в опытах на какой-нибудь одной модели не может рассматриваться как гарантия его абсолютной немутагенности. Положительные результаты одного теста (или даже нескольких тестов) не могут быть в полном объёме экстраполированы на человека; они являются лишь предупреждением о потенциальной генетической опасности этого препарата.

(3). Препараты природного происхождения могут обладать генотоксическими свойствами.

У Хян мы зчрегттрировчли пппгкую генетическую активность: в

культурах трансформированных фибробластов джунгарского хомячка препарат Еызывал аберрации хромосом (преимущественно - хроматидные разрывы), а также полиплоидизацию клеток (13).

Сообщения о генотоксичности разнообразных растительных субстанций весьма многочисленны. На общебиологический смысл мутагенности различных природных агентов указали Anes et al (1987), считающие, в частности, что последствия воздействия на человека естественных мутагенов и канцерогенов (среди них - афлатоксккы, нитрозаиины, вирусш и проч.) во того раз опаснее, чем учитываемые более тщательно последствия контакта ладей' с искусственными агентами. По ходу рассмотрения вопроса о целесообразности испытаний бактериальных препаратов на му -тагенность уместно отметить формирующуюся тенденцию: не противопоставлять т.н. "натиЕные" агенты искусственный и не считать последние по -тенциально более опасными для генетического аппарата человекаj Сфор -мулированную точку зрения подтверждают и результаты наших опытов с Хан.

(4). Результаты испытаний на генотоксичность позволяют

углубить представления о механизме действия препарата. Тезис о том, что возможности испытания на мутагенность не исчерпываются получением ответа на вопрос "Обладает ли данный препарат способностью вызывать мутации?" мы проиллюстрировали результатами «• двух работ, в одной из которых (3,14) был исследован механизм возникновения аберраций хромосом под действием Фт, а в другой (13) - уточ -нён способ полиплоидизации клеток в присутствии Хан. «

Исследуя мутагенные свойства Фт, мы предположили, что аберрации хромосом этот препарат вызывает в результате метаболических превра -щений, в итоге которых в клетке возникает дефицит тимиДиловых нуклео-тидов. В целях проверки этого предположения мы провели на злокачест -венных фиброблаетах джунгарского хомячка следующие эксперименты:

I) сравнили мутагенное действие Фт с-эффектами двух его вероятных метаболитов, 5-фгорурацила и фтордеэоксиуридина; 2)проверйли чувствительность клеток в а 2~ и 3 -фазах цикла к повреждающему хромосомы действию £т и 5-фторурацила с помощью фиксации материала через разные промежутки времени (от I до 24 ч) с момента введения испытуемых веществ; 3) попытались ингибировать мутагенный эффект Ст и 5-фторурацила экзогенным, тимидином.

Результаты этих экспериментов подтвердили выдвинутое предположение. Удалось, в частности, подобрать экспериментальный релям, при котором экзогенный тимидин полностью подавлял эффект £>т и его вероятного метаболита 5-фторурацила. Причиной повреждающего хромосомы действия этих цитостатиков, по-видимому, действительно является тими-ноеие "голодание", не позволяющее клетке успешно завершить реплика -цию ДНК.

Что касается Хан и его полиплоидизирующего действия, то мы убедились, прежде всего, в отсутствии у этого агента митостатического эффекта: на препаратах, полученных из культур, не обработанных кол -хицином, доля постметафазных стадий митоза от общего количества де -лящихся клеток оказалась приблизительно одинаковой для всех испытанных доз Хан при разных режимах обработки, она не отличалась от контрольного показателя.

Анализируя вероятность одного из двух способов полиплоидизации клеток Хан, - за счёт блока цитокинеза в делящейся клетке или путём гибридизации клеток, » второй способ мы сочли более вероятным: в культурах, обработанных Хан, мы встретили многоядерные клетки с не -чётным числом ядер (наряду с синцитиями, имеющими чётное их число). Если бы полиплоидизация клеток происходила за счёт нарушений цито -кинеза, то число это могло бы быть только чётным. С обнаруженным нами полиплокдизирующим действием Хан, осуществляющимся, по-видимому.

путём гибридизации клеток, согласуется отмеченная создателями Хан способность его вызывать агглютинации некоторых типов клеток млекопитающих (Пухальская и др., 1970).

(5) .ДИС-тропность не является обязательный условием

мутагенности

Степень сродства бактериальных ¡э.^муностимул^ующих препаратов :с дезоксирибонуклеопротеиду клеток млекопитающих систематически не пссдэдозалась. Независимо от того, как этот вопрос будет решаться , в дальнейшем, очевидно,- об этом свидетельствуют, в частности, и результаты нааих опытов с фторафурйм и ханеролсм, - что Наличие или отсутствие у испытуемых препаратов такого сродства не должно влиять на заключение о целесообразности или нецелесообразности контроля этих препаратов на генотоксичность.

(6). Представления о группах веществ, потенциально опасных для генетического аппарата человека, эволюционируют.

Вынести это банальное утверждение в название 'отдельной рубрики и проиллюстрировать его, в числе прочих, и собственными данными нас побудил опыт проведения в НШВС им.И.И.Мечникова АШ СССР факультативного контроля вакцин на мутагенность. Этот опыт свиде -тельствует, что в условиях нетрадиционности для вакцинного дела испытаний вакцин на мутагенность авторы препаратов нередко стра -мятся "защитить" свой препарат от генетического контроля. Чаще других возражений против испытаний -бактериальных препаратов на генотоксичность приводится следующее: контроль не нужен, поскольку никогда ранее он не практиковался. В качестве ответа на такой "аргумент" мы и приводим следующий пример.

В 1965 г. в техническом докладе ВОЗ №£82 "Генетика человека и

r>6uественное здравоохранение" был дел прогноз, что антиметаболиты, испытанные к тому времени только на растениях и микроорганизмах, по-видимому, не представляют мутагенной опасности для млекопитающго Установленная нами мутагенность антиметаболита От, вызывающего в клетках млекопитающих не только аберрации хромосом, но и генные мутации, как и многочисленные сообщения других исследователей о гено -токсическом действии на клетки млекопитающих различных антиметаболг• tob ( Kunz ,1988; Lölm,-Löhn ,1988) опровергли-этот про -

гноз.

Таким образом, раяее не проверявшиеся на мутагенность npenapaToi a priori оцененные специалистами как генетически безвредные, при проведении соответствующих испытаний могут оказаться генотоксикантг-м

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании данных литературы и результатов собственных иссле-допаний мы пришли к выводу, что доклинические испытания бактериаль -ных иммунологически активных препаратов на мутагенность необходимы. В пользу такого решения мы приводим следующие аргументы:

1. невозможность обоснования генетической безвредности этих npenapv тов данными литературы;

2. возможная повышенная чувствительность людей, которым предназначены бактериальные иммунологически активные препараты, к экзогенным Мутагенным воздействиям;

3. обнаружение нами генотоксического эффекта в двух случаях в ходе испытаний бактериальных препаратов и их химических добавок;

4. недостаточность отрицательных результатов, полученных при испытании препарата на мутагенность в одном тесте (или в небольшом числе тестов) на одной экспериментальной модели или на ограниченном их кру ге(для заключения об абсолютной немутагенности данного препарата.

Методологию комплексного испытания новых препаратов, принятую а

лекарственном мутагенезе (Вонатейн и др.,1977; Ревазова,1983;Ывтоды первичного выявления генетической актотности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем (методические указания), 1985; Оценка мутагенности новых лекарственных средств (методические рекомендации), 1988), ):ы считаем рациональной основой и для исследовытя гонотоксичеекпх свойств бактериальных препаратов. Для более полного утата специфики биологического действия и особенностей применения лекарственных средств данной группы целесообразен дальнейший методн» ческий поиск с постепенным деполнеш:ем сущзствупщзй cxe:.ru нспытазшй ноешл! факультативными тестами.

К числу особенностей бактериальных гаалунологичееки активных прэпаратов могут быть отнесены следующие. Цпхеиьв этих препаратов в организме являются лимфэидные клетки. Рассматриваемые препараты обладают митогенным действием (сопоставимым, по онкологической терято -логии, с прзуоторкыи). Эти препараты часто применяются людьми с да -фактами иммунитета. Введение некоторых из них в организм человека является (в ходе плановых прививок) обязательным для больших групп людей, не вышедших из репродуктивного возраста. Наконец, многие из препаратов данной группы предназначены для повторного введения в организм человека.

Учитывая изложенное выше, мы подготовили методические рокоман « дации "Оценка мутагенной активности бактериальных препаратов"(11., 1991). Наряду с тремя традиционными методами лекарственного мутаге -неза: учётом генных мутаций на индикаторных бактериях в тесте Эймса 11 salmonella /микросоыы", учётом хромосомных аберраций в клетках

• О

костного моэга мышей и учётом доминантных летальных мутаций в ааро -дышевых клетках мышей (Оценка мутагенности новых лекарственных средств; методические рекомендации, 1988), - в качестве факультативных в эти рекомендации включены три новых теста. Это выявление гене-

тических аномалий в полов их клетках ца тотальных препаратах CK мышей (световая и электронная микроскопия), учёт хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей с генетически детерминированными кмцуно-дефицитами, а таюпе мотафазниЛ анализ лккроцитов периферической крови человека, культивируемых в присутствии испытуемого бактериального препарата и ингибитора репарации. Два из рекомендованных нами факультативных методов, анализ ОС я использование галмунодефициткых мышей гак модели для метафаэного анализа, - это результаты наших экспери'-ментальных разработок. Что касается метафаэного анализа лимфоцитов периферической крови, то этот тест взят нами из литературы (iiaason et al ,1984; Залинян и др.,1990). большинство тестов, вошедпих в рекомендации, проводится на мышах in vivo . Поэтому в подготовленном методическом материале нашла отражение и разработка, в кото -рой мы показали роль содержания животных в барьерных условиях для повышения чувствительности цитогенетических тестов in vivo .

Предложенная совокупность методов- открыта для дальнейшего со -вершенствования.

ВЫВОДЫ

1. Впервые обоснована необходимость введения обязательного контроля на мутагенность бактериальных иммунологически активных препаратов.

2. С помощью теста Эймса " Salmonella /микросомы" и цитогене-тического анализа клеток костного мозга мышей (учёт микроядер и хромосомных аберраций) показано отсутствие мутагенных свойств у ряда бактериальных препаратов и химических добавок, используемых при приготовлении этих препаратов: у вакцинных препаратов корпускулярного коклюшного, бесклеточного коклюшного, клебсиеллёзного, протейного, поликомпонентного из условно патогенных микроорганизмов (ВП4), ме -лингококкового белково-полисахарзднсго, у двух препаратов с иммуно-

модулирующей активностью, - тэмицида и СТО, а также у солянокислого гидроксилемина и мертиолата ("Serva ' " и "Sigma ").

3. Обосновано включение микроскопического анализа синаптонемннх комплексов (СК-теста) в систему методов оценки генотоксичности бак -териальных препаратов. Продемонстрирована применимость световой ми -кроскопки для учёта как множественных, так и некоторых типов единичных нарушений СК. При электронной микроскопии у одного из вакцинных

препаратов (полученного из Klebsiella pneumonia ) выявлена пй-

3

предающая СК активность в дозе, эквивалентной 10 доз, рекомендуе -mux для человека.

Л. Депо обоснование целесообразности пртзненил в прикладных исследованиях по химическому мутагенезу экспериментальных животных с иммунодефиците:::!, в том числе, для оценки генотоксического действия бактериальных препаратов, - бестимусных мышей. г

5. С помощью использованных в работе позитивных контролей про -демонстрировано, что исследования генетической активности медицин -ских препаратов могут способствовать уточнению механизмов их действия; что ДНК-тропность не является обязательным условием мутагенности вещества; что препараты природного происхождения могут оказывать мутагенное действие на клетки млекопитающих; что представления о группах веществ, опасных для генетического аппарата человека, эволюционируют .

6. Предложен комплекс методов для генетического контроля бактериальных препаратов, учитывающий преимущественное действие этих препаратов на лимфоидные клетки организма, повторное, иногда - обяза -тельное (в ходе календарных прививок) введение многих из них больший группам людей, на вышедших, как правило, из репродуктивного возраста, нередкую иммунологическую неполноценность людей, применяющих эти препараты.

7. Для практики здравоохранения важным представляется собо -купность результатов проведённого исследования, свидетельствующих о генетической безвредности испытанных иммуностимулирующих препаратов, в том числе вакцин, предназначенных для плановых прививок:

Список_работа оп^бликованных_по теме_диссертации_

1. Сокова О.И., Волгарёва Г.М., Погосянц Е.Е. Действие фтора -фура на хромосомы нормальных и опухолевых клеток джунгарского хомяч-ка//Генетика.- 1976. - №3. - С.156-159.

2. Сокова О.И., Волгарёва Г.М. Действие фторафура и 5-фторура-цила на хромосомы нормальных и опухолевых клеток in vivo //Вопр. онкологии. - 1977.- Т.23. - »2. - С.94-97.

3. Волгарёва Г.М., Сокова О.И., Погосянц Е.Е. Изучение механизма повреждающего хромосомы действия фторафура // Генетика.-1977. -№3. - С.461-467.

4. Волгарёва Г.М., Сокова О.И., Погосянц Е.Е. Действие фторафура на хромосомы нормальных и опухолевых клеток джунгарского хомячка in yitro // Генетика. - 1978. - Х"=3. - С.444-448.

5. Волгарёва Г.М., Сокова О.И., Погосянц Е.Е. Действие фтора -фура на хромосомы нормальных и опухолевых клеток человека i" vitro / Генетика. - Í979. - Т.15. - №l. - C.I57-I6I.

6. Сокова О.И., Волгарёва Г.М., Погосянц Е.Е. Перевиваемая опухоль (штамм 0-1552) молочной железы джунгарского хомячка // Вопр. оь кологии. - 1978. - Т.24. - №9. - С.82-85.

7. Сокова'0.И., Волгарёва Г.М. Действие фторафура и 5-фторура -цила на хромосомы нормальных и опухолевых клеток млекопитающих // 14 Международный генетический конгресс: Тезисы докладов (ч.2). Моек ва. - 1978. - С.463.

- 46 -

I

8. Сокова О.И., ВолгарэвА Г.М. Действие фтерафура и 5-фторура -цила на хромосомы культивируемых клеток опухоли человека//Генетизса.-1979.- Т.1Б.- - С.855-861.

9. Волгарёва Г.М. Действие, фторефура на хромосоьи нормальны опухолевых клеток джунгарского хвмячка in vitro .//Вопросы эксп^ ментальной и клшшческой онколегии: Сборник научных трудов. Москва.*•

- 1979,- С.10-12.

10. Claatogenicity and aioter chrorr-atid exchange induction by ftorafur /Логосянц E.E., Сокова О.И., Волгарёва Г.М. и 13! соавторов ИЗ стран СЭВ // Neoplasma.- 1981.- V.28.- N4.- Р.397 - 402.

11. Волгарёва Г.М., Ставровская A.A., Погосянц Е.Е. Изучение мутагенного действия фторафура на соматические клетки джунгарского хоыячка//Первое Всесоюзное совещание по генетике.соматических клеток в культуре: Тезисы докладов. Москва.- 1981.- С.9.. i

12. Волгарёва Г.М., Ставровская A.A., Погосянц Е.Е.Индукция генных мутаций противоопухолевым препаратом фторафуром//Генетика.-1982.-

- Т.18.- G.758-763.

13. Цитогенетические эффекты ханерола /Сокова О.И., Волгарёва Г.М., Кулагина O.E., Копнин Б.П., Пососянц Е.Е.//Экспериментальная онколо -гия.- 1982,- Т.4.- »I.- С.42-46."

14. Волгарёва Г.М. Действие фторафура на хромосош соматических клеток млекопитающих: Автореф.дие. ... канд.биол. наук., Москва: ШЦ АМН СССР.- 1977.- 17с.

15. Волгарёва Г.М., кеустроева В.В., Свиридов В.В. Заражение мнкоплазмами гибридом ,как возможный фактор их нестабильности//Моле-кулярн. генет., микробиол., вируеол.- 1985,- Jtt.- С.34-38.

16. Волгарёва Г.М..Наркологическое исследование мышиных В-кле -точных гибридом//Цитология.- 1985.- T.28.-»I2.-C.I394-I4C3.

17. Влинкова Л.П., Волгарёва Г.М. Испытание томицида на цута -

генность/ДМЗД,- 1988. - С. < 19- i2,0.

18. Волгарёва Г.Ы., Толчеев Ю.Д. Изучение безвредности вакцин -ного препарата из микробов рода Proteua : отсутствие мутагенных скойств/ДМШ.- 1930.- te?.- G.70-76.

19. Методические рекомендации по получению гибридом-продуцентэв ионоклональных антител к бактериальным антигенам / Свиридов В.В., Вслгарёва Г.М., Зайцев Е.М. и др. - Москва,- 1985,- 38 с.

20. Генетические аспекты безвредности вакцинного препарата, по -лученного из микробов рода Klebsiella /Волгарёва Г.М., Толче -ев Ю.Д., Курбатова Е.А. и др. //ЩИ.-1989.- Ш.- С.120-12I.

21. Волгарёва Г.М. Цитогенетическрй контроль безвредности мер -тиолата//ШИ,- 1989,- »II.- С.46-52.

22. Волгарёва Г.М., Савранская С.Я. Оценка мутагенности нового иммуномодулятора в микроядерном тесте//Эколого-генетические последствия воздействия на окружающую среду антропогенных факторов: Тезисы докладов II Всесоюзного координационного совещания. Сыктывкар. -1989,- G.49-50.

23. Волгарёва Г.М., Сафронова Л.Д. Исследование синаптонемных комплексов для оценки генетических последствий вакцинаций//Первый Всесоюзный съезд иммунологов: Тезисы докладов (т.1). Москва.-1989.-G.27.

24. Контроль на мутагенность нового иммуномодулятора/Волгарё -ва Г.М., Савранская С.Я., Толчеев Ю.Д., Анг.илогова 0.Р.//5ШЭИ, -

. 1990.- #3.- C.56-6I.

25. Спонтанный уровень кариотипических аномалий в костном мозге мышей как показатель качества их содержания / Волгарёва Г.М., Силин A.M., Ёлкина С.И. и др.//Ш11.—1090.- -0.14-1».-*"

26. Естественный фон хромосомных аномалий в клетках костного • мозга мышей и контроль вакцин на генотонсичность / Волгарёва Г.М.,

Силин A.M., Ёлкина С.И. и др.//23131.- 1990.- !?5. - СД4Л7.

27. Волгарёва Г.П., Сафронова Л.Д. Исследование синаптонемных комплексов вакцинированных мишей//Цмология и генетика.- 1990.-Т.24.«

"-в.- С.11-17.

28. Исследование !,!утагенностн новой поликомпонентной вакцины из .антигенов клсбсиеллы пневмонии, стафилококка, протея и кишечной палочки/ Волгарёва Г.М., Толчеев Ю.Д., Анпилогова O.P. и др./Д1'31.-1991 .-- }(6. - С.50-52.

29. Волгарёва ГЛ., Сафронова Л.Д. Электронно-микроскопический анализ синаптонемных комплексов мышей после вакцинацни//1!звестия СО АН СССР.- 1990. - Вып.2. - С.30.

30. Волгарёва Г.Ы., Силин A.M., Анпилогова O.P. Исследование цито«-генетически эффектов менингококкового (серогруптты В) антигенного комплекса// Менингококковая инфекция и гнойные менингиты:'Тезисы докладов Всесоюзной научной конференции (т.1). Новосибирск. - 1990.- С.70-72.

31. Волгарёва Г.М., Толчеев Ю.Д. Генетические аспекты безвредности иммуностимулирующих препаратов//Экологические проблемы иммунологии и аллергологии: Тезисы докладов I съезда иммунологов Белоруссии. Ыинск.-1990. - С.101-102'.

32. Волгарёва Г.М.Исследование повреждающего хромосомы действия двух химических контаминантов вакцин//ШЭИ.-1991,- №4.- G.41-45.

33. Волгарёва Г.М., Сафронова Л.Д. Контроль генетических последствий вакцинаций: электронно-микроскопический анализ синаптонемных комплексов мыши//Генетеда.- 1991.- Т.27.- №8.- C.I4I0-I422.

^Опечатка. Следует читать: врнальных вакцин//

сальные вопросы диагностики ктика> лечение: Ыате-K'ÏÏÎPr* болезней лабораторкьпс и.Москва.-1991.-С.14.

/Волгарёва Г.М., Кривцова Е.К., Ревааова Ю.А. и др.//ЖМШ.~ 1992.- » С.

36. Цитогенетический анализ эффекта бесклеточной коклюшной вакцины 1> костном мозге бестинусных (пи / пи) мышей и мышей-г'етерози -гот пи А /Волгарёва Г.Ц., Ревазова D.A., Ревазова Е.С. и др.// 8МШ.~ 1992.- # С.

РОТАПРИНТ 11СПО РФ 3 АК. 1 10 и-г 27.03.Г лр. I Oil