Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние препаратов гидролитических ферментов на реактивность иммунотропных систем крови человека

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Казацкая, Жанна Александровна, Нижний Новгород

{У

V

к/

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НИЖЕГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им.Н.И. Лобачевского

На правах рукописи

КАЗАЦКАЯ ЖАННА АЛЕКСАНДРОВНА

ВЛИЯНИЕ ПРЕПАРАТОВ ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ НА РЕАКТИВНОСТЬ ИММУНОТРОПНЫХ СИСТЕМ

КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

03.00.13 - физиология человека и животных

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

ДОБРОТИНА НАТАЛИЯ АРКАДЬЕВНА

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор

КРЫЛОВ ВАСИЛИЙ НИКОЛАЕВИЧ

НИЖНИЙ НОВГОРОД -1999 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение 4

1. Обзор литературы

1.1. Современные проблемы иммуномодуляции и иммунокорригирующей терапии 10

1.2. Краткая характеристика и физиологическая роль гидролитических ферментов 19

1.2.1. Лизоцим 19

1.2.2. Протеазы 24

1.2.3. Липазы 30

1.3. Реактивность клеточных систем крови человека,

некоторые феномены и способы оценки , 32

Собственные исследования л ,

2. Материалы и методы

2.1. Препараты, используемые в работе 49

2.2. Методы определения антимикробной активности лизоцима 51

/

— определение активности по диффузии фермента в агаре 53

— метод серийного разведения 53

— капельный метод 53

2.3. Турбидиметрический метод определения активности лизоцима 54

2.4. Получение популяции лимфоцитов периферической крови человека 54

2.5. Оценка функциональной активности Т-лимфоцитов методом спонтанного розеткообразования 56

2.6. Метод изучения адгезивных свойств иммунокомпетентных клеток 58

2.7. Изучение активации системы комплемента по гемолизу в геле агарозы 58

2.8. Метод определения антикомплементарной активности белковых препаратов 60

2.9. Определение уровня циркулирующих иммунных комплексов 62

2.10. Статистическая обработка результатов 65

3. Результаты собственных исследований

3.1. Полифункциональная активность лизоцима 67

3.1.1. Общие вопросы характеристики препарата лизоцима 67

3.1.1.1. Удельная активность лизоцима 67

3.1.1.2. Антимикробная специфичность лизоцима 69

3.1.2. Влияние лизоцима на клеточные реакции иммунитета и факторы неспецифической резистентности 71

3.1.2.1. Влияние лизоцима на жизнеспособность лимфоцитов 71

3.1.2.2. Действие лизоцима на функциональную активность Т-лимфоцитов 72

3.1.2.3. Влияние лизоцима на адгезивные свойства иммуно-компетентных клеток 82

3.1.2.4. Действие лизоцима на систему комплемента 86

3.1.2.5. Комплексирование активности лизоцима и у-глобулина 88

3.1.2.6. Лизоаминидаза - комплексный препарат на основе лизоцима 90

3.2. Роль гидролаз микробного происхождения в регуляции активности элементов крови человека in vitro (протеазы, липаза, РНК-аза) 99

4. Заключение 110

Выводы 123

Список литературы 125

СПИСОК ОБЩЕПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

1. АГ - антиген

2. АТ - антитело

3. БАВ - биологически активные вещества

4. ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа

5. ИК - иммунные комплексы

6. ИКК - иммунокомпетентные клетки

7. ИС - иммунная система

8. ЛПС - липополисахарид

9. МДП - мурамилдипептид

10.МКА - моноклональные антитела 11 .ПГ - пептидогликан

12.ПЭГ - полиэтиленгликоль

13.РО - розеткообразование

14.РОК - розеткообразующие клетки

15.УФО - ультрафиолетовое облучение

16.ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы 17.ЭБ - эритроциты барана

18.ЭК - эритроциты кролика

19. С - комплемент

20.У5С - лимфоидная стволовая клетка

21. РТС - предшественники Т-клеток

22.РВС - предшественники В-клеток

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В настоящее время в результате агрессивного повреждающего действия антропогенных, экологических факторов на различные системы организма человека, наиболее остро встает проблема нормализации иммунитета и поиска природных физиологически активных веществ-иммуномодуляторов, адагггогенов на основе ферментов, прежде всего гидро-лаз, обладающих иммуномодулирующими свойствами, регулирующих различные стадии иммунного ответа и иммуногенеза.

На современном этапе на приоритетное место выходит экологическая иммунология, понимание иммунологического, физиологического здоровья, специфическая и неспецифическая профилактика, иммунодиагностика, и, в связи с этим, различные проблемы коррекции нарушений иммунной системы (ИС). Повреждающие факторы и механизмы действия на ИС многочисленны (Истамов, 1994). Особенно опасны комбинированные воздействия на ИС, которые проявляются ее комплексным поражением (Хаитов и др., 1997). Несмотря на то, что развитая ИС как сложная многокомпонентная, многофакгор-ная, наиболее тонко регулируемая и саморегулирующаяся, имеет колоссальные резервы адаптогенности, подчас она находится на пределе резервных возможностей, например, при различных инфекционных заболеваниях, при так называемой, поствирусной астенизации. Это приводит к функциональным иммуно-дефицитам в критические переходные периоды (в том числе ранний детский возраст) (Bronstoff et all, 1991).

Различные типы физиологической адаптации взаимосвязаны с реакциями иммунитета и неспецифической резистентности. Физиологическая полифункциональность препаратов исследована совершенно недостаточно, традиционно подчеркивается узкоспецифическая активность ферментов, однако при изучении физиологической иммунорегуляции и иммуномодуляции познаются их новые дополнителльные активности, их полифункциональность. Скрининг,

отбор иммунокомплементарных ферментов имеет большое значение. Принципиальный интерес представляет оценка иммунокомпетентности некоторых факторов неспецифической резистентности (лизоцим), т.е. доказательства дополнительных (иммунотропных) физиологических функций.

В последние годы описано большое количество иммунотропных препаратов различного происхождения (животного, растительного, микробного, а также полученных путем химического синтеза) (Алехин и др., 1995, Алимова и др., 1991, Воложин, 1997, Земсков и др., 1998, Лазарева, Алехин, 1985, Утешев и др. 1995, Пинегин, Андронова, 1998; Кульберг, Беркун, 1998, Bach J-F., 1979, Lustes M.I., 1980, Jognson A.J., Lederman H.M., 1979, Drews О., 1980, O'Rourke Anne, 1995).

Данные литературы свидетельствуют о наличии в медицинской практике многочисленных иммунорегуляторов, однако среди них практически нет ферментных препаратов, тогда как в последнее время большое внимание уделяется системной энзимопрофилактике и энзимотерапии, например, применение таких препаратов как "Вобэнзим" и "Флогэнзим", куда включены гидролазы, в том числе протеазы и лизоцим (Ноуз, 1994).

В связи с этим актуально и обосновано исследование влияния различных физиологически активных веществ на основе ферментных препаратов с целью выявления их иммунотропности и выяснения механизмов иммуномодулирую-щих эффектов.

Цель работы. Изучение влияния ферментных препаратов различного происхождения (животного и микробного) на реактивность иммунотропных систем крови человека

Задачи исследования. 1. Изучение физиологического и цитотоксического действия ферментных препаратов на популяции выделенных иммунокомпетентных клеток крови человека.

2. Исследование влияния ферментных препаратов различного происхождения (лизоцим, лизоаминидаза, протеазы, липазы, РНК-азы), на функциональную активность Т-лимфоцитов периферической крови человека.

3. Изучение механизмов изменения функциональной активности иммуноком-петентных клеток (адгезия) под действием ферментных препаратов (лизоцим, лизоаминидаза, протеазы, липазы, РНК-азы).

4. Исследование влияния ферментных препаратов на факторы неспецифической резистентности организма человека (комплемент).

5. Изучение действия лизоцима на показатели клеточных реакций и факторы неспецифической резистентности организма в норме и при патологии (заболевания желудочно-кишечного тракта, ожоговая болезнь, бронхолегоч-ная патология).

6. Апробация разработанной модельной системы, включающей комплекс лабораторных методов in vitro, для оценки действия различных физиологически активных веществ на реактивность клеточных систем крови человека и факторов неспецифической резистентности.

Положения, выносимые на защиту.

1. Ферментные препараты животного и микробного происхождения: лизоцим, трипсин, лизоаминидаза Xanthomonas species, протеаза Str.spheroides, бациллярный препарат субгилис, липаза Rizopus oryzae, РНК-азы, исследованные в работе, по данным розеткообразования, адгезии, активации системы комплемента и изменения уровня циркулирующих иммунных комплексов, обладают иммуномодулирующими свойствами.

2. Иммуномодулирующее действие ферментных препаратов носит дозозависи-мый характер.

3. Эффект влияния лизоцима зависит от первоначального состояния иммунной системы. В опытах in vitro и на целостном организме показано, что лизоцим

не изменяет нормальный уровень и повышает значительно сниженный уровень розеткообразующих клеток в крови больных с различной патологией. Лизоцим относится не только к факторам бактерицидности и неспецифической резистентности, но и к регуляторам иммунологических реакций. 4. Апробированная модельная система лабораторных реакций является адекватной для оценки действия различных биологически активных веществ на реактивность иммунотропных систем крови человека

Научная новизна.

Работа включает новые данные о влиянии ферментных препаратов гидролитического действия (лизоцим, лизоаминидаза, протеазы, липаза, РНК-азы) на клеточную иммунореакгивноеть организма человека и факторы неспецифической резистентности (система комплемента) in vitro. Впервые доказано, что исследованные ферментные препараты являются выраженными иммуномоду-лягорами, которые могут действовать непосредственно и опосредованно через промежуточные продукты расщепления.

Впервые описан различный характер влияния ферментов микробного и животного происхождения на функциональную активность клеточных систем крови человека.

Выявлено выраженное стимулирующее влияние протеазы Str.spheroides на функциональную активность лимфоцитов периферической крови человека и ингибирующее действие трипсина, снижающего уровень розеткообразующих клеток.

Изучены механизмы действия и физиологической активности лизоцима в экспериментах in vitro (элементы крови человека) и на целостном организме больных бронхолегочными заболеваниями.

Теоретическая и практическая значимость.

Полученные в работе результаты о роли ферментных препаратов, в частности, гидролаз (лизоцим, лизоаминидаза, протеазы, липаза, РНК-азы) в кор-

рекции нарушений иммунитета на уровне клеточных реакций значительно дополняют существующие в настоящее время подходы к классификации имму-номодуляторов.

— Обосновано применение ряда биотехнологически значимых ферментных препаратов животного и микробного происхождения (лизоцим, протеазы, липаза и другие) в качестве иммуностимулирующих средств при различных им-мунодефицитных состояниях.

— Предложенная лабораторная система, включающая комплекс иммунохими-ческих реакций (тест на жизнеспособность клеток крови человека, различные варианты реакций розеткообразования и адгезии, активация системы комплемента, уровень циркулирующих иммунных комплексов) является адекватной для оценки иммуномодулирующей активности ксенобиотиков и протекторных препаратов в комплексе с общеизвестными ГОСТ-реакциями.

Новые свойства ферментных препаратов (иммуномодулирующий эффект) могут быть использованы в дальнейшем для их практического применения как отдельных иммуномодуляторов, так и в комплексной энзимотерапии.

Апробация работы.

Основные положения работы обсуждены на III, IV Симпозиумах "Химия протеолитических ферментов" (Москва 1993, 1997 г.); ХЗ Всероссийской конференции "Ферменты микроорганизмов" (Казань, 1998 г.); II Международном симпозиуме "Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов" (Воронеж, 1998 г.); на расширенном заседании кафедры молекулярной биологии, иммунологии Нижегородского государственного университета им. Н.И.Лобачевского (1999 г.).

Публикации: по теме диссертации опубликована 21 работа.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Материал диссертации изложен на 141 странице. Работа иллюстри-

рована 25 таблицами и 16 рисунками. Библиографический указатель включает 184 отечественных и иностранных источника.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1.Современные проблемы иммуномодуляцин и нммунокорригирующей

терапии

Развитие иммунологии отражает уровень биомедицинских исследований, а также эффективность диспансеризации и санации (оздоровления) населения. На современном этапе на приоритетное место выходит экологическая иммунология, понимание иммунологического здоровья, профилактическая иммунология и донозологическая диагностика иммунопатологии, в связи с этим, различные проблемы коррекции нарушений иммунной системы (ИС). В настоящее время актуальная проблема иммунореабилитации включает различные подходы к корригирующей терапии, которая объединяет экстраиммунную иммунотерапию и собственно иммунотерапию (Хаитов и др., 1997).

Антропогенные, экологические факторы острого и хронического действия в больших и даже малых дозах наиболее агрессивно повреждают, прежде всего, ИС, наряду с нервной и некоторыми другими (Соп1еу, 1995).

Вмешательство в работу ИС, исправление дефектов ее функционирования путем стимуляции или супрессии либо целостной системы, либо ее отдельных клеточных субпопуляций, стимуляция или блокада клонов конкретной специфичности - называется иммунокоррекцией. Она проводится фармакологическими препаратами (Априкян и др., 1992; Базарный, Ястребов, 1993), физико-химическими методами: гемоинженерия - управление состоянием крови (гемосорбция, иммуносорбция), квантовая терапия (лазер и УФО кро-ви)(Горяйнов и др., 1998), гипер- и гипобарическая оксигенация, действие ги-пероксигенированных растворов; а также с помощью генной инженерии (фенотипическая коррекция) (Прокопенко, Сипливая, 1992; Воложин и др., 1997).

В истории использования иммуностимулирующих препаратов выделяют два этапа. Первый характеризуется применением веществ, одновременно

влияющих на различные популяции и субпопуляции Т-, В-лимфоцитов, и способных интегрально стимулировать клеточный, а также гуморальный иммунный ответ. Второй этап - это осуществление физиологического воздействия на клетки, конкретно участвующие в данном иммунном ответе (Ширинский, Жук, 1994).

Анализ литературы и наш, более чем десятилетний, опыт изучения различных адалтогенов поднимает вопрос о необходимости подбора иммуномо-дуляторов, которые в отличие от радикальной иммунобиосгимуляции или им-муносупрессии, способствовали бы именно нормализации работы ИС. Поиск средств и способов избирательного воздействия на отдельные субпопуляции клеток ИС - актуальное направление иммунофармакологии и иммуномодуля-ции (Лесков и др., 1997). Под избирательностью следует понимать способность препарата воздействовать на популяцию им субпопуляцию клеток одного типа и не влиять на другие клетки, даже находящиеся в контакте с первыми. Различия в избирательности могут быть как количественные, так и качественные. Учет качественных отличий предусматривает возможность создания средств с высокой селективностью действия. Проблема избирательности иммуностимулирующих препаратов чрезвычайно актуальна, поскольку она касается не только адекватной коррекции иммунного ответа при многих заболе-

\

ваниях, но и новых принципов доклинического скрининга.

До настоящего времени не существует единой классификации иммуно-модулирующих препаратов. Их делят на подгруппы по происхождению, способам получения, химической структуре и т.д. К сожалению во всех работах большое внимание уделяется химическим иммуномодуляторам, и недостаточно таким физиологическим препаратам, как ферменты.

Лазарева Д.Н., Алехин Е.К. (1985) предлагают следующую классификацию иммуномодуляторов (табл. 1)

Таблица 1

Классификация иммуиомодуляторов

Группа Вещества Активность

ЛПС грамотрицатель-ных бактерий пирогенал продигиозан левамизол сальмозан обзидин активируют лейкоцитарный и макрофагальный фагоцит, повышают толерантность к бактериальным токсинам, активируют В-сисгему

Дрожжевые полисахариды зимозан глюканы пропермил дексграны декстрансульфат активируют МФС, оказывают влияние на Т- и В-сисгему

Вакцины БЦЖ стимуляция фагоцитарной активности макрофагов

Препараты нуклеиновых кислот РНК нуклеинат Ыа поли ИЦ поли ГЦ поли АУ активируют макрофаги, стимулируют антителообра-зование, противоопухолевая защита

Производные пиримидина и пурина метилурацил пентоксил оксиметилурацил 2-метил-4-амино-6- оксипиримидин цитозин суперацил активаторы антиинфекционной резистентности, повышают активность макрофагов, повышают резистентность к вирусам

Продолжение таблицы 1

Группа Вещества Активность

Производные пиримидина и пурина тимин амиглурацил мерадин изоприназ