Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Реакции ограниченного протеолиза в пищеварительном процессе и образовании физиологически активных веществ

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Реакции ограниченного протеолиза в пищеварительном процессе и образовании физиологически активных веществ"



Мм с ?а / (. ¿{и :р /'/ (.4 /Уг.

АКАДЕМИЯ НАУК СССР у ¿-' '/ ^ 6 ' ^

ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ км „И .П. ПАВЛОВА. /,,¿1* ¿¿¿¿/-(. ¿-р

На правах рукописи УДК 612;3:612.015.012

САВДЕАЕБ\ Лояахон Мухамедовна

РЕА1ЩИИ ОГРАНИЧЕННОГО ПРОТЕОЛИЗА В ПИЩЕВАРИТЕШОМ ПРОЦЕССЕ И ОБРАЗОВАНИИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

03.00.13 - физиология человека и гопвомшх

Автореферат диссертации на соискаш!е ученой степени доктора биологичеоких наук

Ленинград, 1939

Работа выполнена в Андижанском медициноком институте им.М.И.Калгопша

Официальные оппоненты! доктор биологических наук, профессор А.Д.НОЭДРАЧЕВ доктор биологических наук В.Б.ТР0ЩШ1 доктор медицинских наук В.И.ОГОШНИКОВ

Ведущая организация - ордена В.И.Ленина Военно-медицинская академия им.С.М.Кирова

Защита состоится и__"_19 г. в_часов

на заседании специализированного оовета по защите диссертаций на соиокание ученой степени доктора наук (Д 002.36.01) при Институте физиологии им.И.П.Павлова АН СССР (199034, Ленинград наб.Макарова, 6 ).

С диссертацией ыоено ознакомиться в библиотеке Институт! физиологии им.И.П.Павлова АН СССР.

Автореферат разослан "_"_19 г.

Ученый секретарь Специализированного оовета доктор биологичеоких наук

Н.М.ВАВДООВА

J "

"s |Актуальность проблемы. В пищеварительном конвейера, эффективном гидролизе питательных веществ, особенно белков,желудку принадлежит большая роль. Вопрос о конкретной роли секреторной деятельности желез желудка в пищеварительном конвейере и его као-кадной организации все еще недостаточно исследован. Это касается ряда аспектов, в том числе изменения свойств желудочного оока в зависимости от его рН у лиц с нарушением секреторной деятельности желудка, локализации желудочного пищеварения (Г.Ф.Коротько, 1971,1980; И.Л.Янсонэ, 1975; Н.Ш.Амиров,Н.И.Белостоцкий,19В4 и другие).

Отсутствие в литературе достаточно полных данных о свойствах желудочного сока повышать скорость и глубину гидролиза бел -ков другими протеолитическими ферментами в зависимости от рН среды объясняется тем, что исследования проводились на упрощенных моделях in vitro и преимущественно при одном значении рН, в то время как в желудочном соке действует несколько протеаз с различными оптимумами рН и в различных зонах пищевого содержимого желудка складываются неодинаковые условия для протеолиза. По вопросу, как изменяются свойства желудочного сока в этих условиях, в литературе наг единого мнения.

В этом аспекте недостаточно изучены скорость гидролиза белков и изменение энергии активации реакций протеолиза при различных рН и значение предварительного, относительно кратковременного действия желудочного сока для дальнейшего гидролиза белков трипсином.

Остается во многом невыясненным вопрос о гидролизе различных белков с учетом каскадности этого процесса на уровне всего пищеварительного тракта.

Такое изучение желудочного протеолиза позволяет определить его место и роль в гидролитическом конвейере всего пищеварительного тракта, как функционально целостной сиотемы.

Роль протеолитических ферментов не ограничивается их учаотием в процессах пищеварительного гидролиза. В последнее время большой интерес вызывают регуляторные функции этих фар-ментов. Характерной особенностью регуляторных функций протеаз является однонаправленность и необратимость их действия(обзор: Л.А.Логапина, 1977). Этот тип регуляции отличается от других типов биологического

контроля в организме» При помощи протеолитк— ческкх фер:.:;;ггов осуществляются многие регуляторные процессы.

Из них наиболее изучены так называемые реакции ограниченного протеолиза. Эти реакции, являясь одним из важнейших этапов биосинтеза белка, имеют большое значение в образовании биологически активных веществ пептидной природы.

Показано, что образующийся в результате активации трип-синогена пептвд обладает гормональными свойствами ( Abita et al. 1973; Bower et al . , 1974). Свойства же продуктов,образующихся при активации пепсиногена, не изучены. Остается неисследованной реакция пищеварительных желез на внутривенное введение продуктов гидролиза зимогенных протеиназ, а также их возможная биологическая роль. В связи с этим актуальна разработка доотуп-кых методов выделения фракций гвдролизатов пепсиногена и трип-синогена, изучение их регуляторной роли не только в сещгации пищеварительных желез, но и в деятельности других органов и систем организма.

Цель работы заключается в изучении физиологической роли ограниченного протеолиза в пищеварительном конвейере и образовании физиологически активных пептидов из зимогенных протеиназ пищеварительных желез, в выяснении спектра их физиологической активности.

Основные задачи исследования:

1. Изучить процессы последовательного пептического и триптического гвдролиза белков и дать им характеристику в .зависимости от рН среды..

2. Провести сравнение частичного протеолиза in vitro и in vivo в связи о топографией гидролитической деятельности желудка.

3. Изучить локализацию поэтапного гидролиза пищевых белков в желудке и влияние желудочного сока на триптическую атаку-емость белков, показать зависимость гидролитических свойств желудочного сока от величины его рН.

4. Изучить возможные механизмы изменения ферментной атакуемости белков.

5. Выделить фракции гидролизатов зимогенов и изучить их влияние на деятельность главных пищеварительных желез и некоторые другие функции.

Научная новизна. В работе на большом экспериментальном материале количественно охарактеризован процесс внутрижелудоч-ного протеолиза белков и вл'ивше желудочного coica на их трипти-

ческую атакуемость с учетом топографии пищевого желудочного содержимого, рН, времени действия пепсина на белки, секреции желудочных желез.

Показано значение желудочного пищеварения в повышении ферментной атакуемости пищевых белков. Установлено, что предварительное действие на пищевые белки желудочного сока в широком диапазоне рН обеспечивает увеличение скорости гидролиза и повышение триптической атакуемости.

Впервые определены доли вклада факторов, обеспечивающих повышение триптической атакуемости пищевых белков в желудке (пепсины, рН, время пребывания пищевого содержимого в желудке, его гидродинамика и топография). Установлено, что наибольший вклад в этот процесс вносит секреция железами желудка пепсино-гена. Доля вклада этого фактора зависит от вида пищевого белка и топографии пищевого содержимого желудка.

Впервые показано, что нарушения желудочной секреции в реализации повышения триптической атакуемости пищевых белков могут быть компенсированными и декомленсированными в зависимости от свойств протеаз желудочного сока.

В работе .впервые получены результаты, доказывающие физиологическую активность фракций гидролизатов пепсиногена и трипсиногена - изменение под их влиянием секреторной деятельности главных пищеварительных желез. Установлено свойство этих продуктов участвовать в регуляции деятельности пищеварительных желез.

Предложены методы ввделения фракций гидролизатов пепсиногена и трипсиногена, способ определения гидролитических свойств желудочного coica при различных рН.

Впервые приведены данные об изменении энергии активации реакций гидролиза белка ферментами в широком диапазоне рН.

В опытах in vitro и in vivo проведено сравнение "макет,ильно возможного" гидролиза белков при данной величине рН и времени пребывания пищи в желудке и "максимально возможный" гидролиз этих белков при оптимальном рН. Показано, что в желудочком протеолизе наибольшее значение имеет примукозальная зона желудочного содержимого, где создаются, оптимальные условия для активации пепсиногена и последупдего гидролиза пищевых белков пепсинами.

Научно-практическая ценность.

Исследование гидролитической деятельности хелудга о

учетом свойства его секрета повышать атакуемооть белков для других протеодитичеоких ферментов позволяет установить возможность трансформации гидролитического конвейера при патологии желудка, что имеет непосредственное отношение к вопросам клинической гастроэнтерологии.

Данные о рэгуляторной роли продуктов гидролиза пепсино-гена и трипсиногена в секреторной деятельности главных пищеварительных желез создают теоретическую основу для изучения ранее практически неизвестного способа регуляции секреторной деятельности пищеварительных келез, значительно расширяют возможности их целенаправленного применения.

Внедрение результатов исследования, Разработанные методы применяются в научно-исследовательской работе и используются в учебном процессе на кафедрах нормальной физиологии и биохимии, терапевтических кафедрах Андижанского медицинского института, оформлены в виде рацпредложений.

Основные положения работы о рагулягорных свойствах продуктов ограниченного протеоляза пепонкогена и трипсиногена могут быть использованы при чтении лекций по разделу "Физиология пищеварения" для студентов 2-го курса медициноких институтов и студентов 3-4-го курсов педагогических институтов. Избирательное действие выделенных фракций зиыогенов на секрёторную деятельность пищеварительных келеэ открывают возможность их дальнейшего целенаправленного изучения и синтеза аналогов, селективно действующих на определенные функции.

Результаты исследований роли гидролитической деятельности желудка в повышении атакуемости пищевых белков должны учитываться в лечении больных с желудочно-кишечными заболеваниями, в даето- и энзимотерапии.

На защиту выносятся следующие основные положения и данные:

1. Предварительное действие желудочного ооха на белки играет существенную роль в изменении их трилтической атакуемости, повышение которой обеспечивается действием пепсина (пепсинов) в пироном диапазоне рН и зависит от вида белка в составе пищи.

2. Ата1суемость пищевых белков трипсином после предварительного действия желудочного сока зависит от их локализации в желудке, времени действия и величины рН.

3. При патологических состояниях желудка пепоины проявляют свою активность при других рН, отличающихся от оптимальных для действия пепсина, что частично компенсирует процессы гидролиза белка в желудочно-кишечном тракте больных о пониженной секрецией желудочных желез.

4. 'фракции гидролизатов пепсиногена и трилсиногена стимулирует или угнетают секреторную деятельность пищеварительных желез, влияют на мочеобразование и желчевыделение и могут рассматриваться как- физиологически активные вещества, принимающие участие в функциональной интеграции главных пищеварительных желез.

5. Фракции гидролизатов пепсиногена изменяют эффективность окислительного фосфоршшровагшя в печени крыс.

6. Комплексное изучение преемственности действия ферментов в опытах tn vitro и in vivo , анергии активации этих реакций, важно для адекватного сувдения об этапах-пищеварения и значения желудочной секреции в гидролитическом конвейере желудочно-кишечного тракта.

Апробация работы. Основные результаты проведенных исследований и положения диссертации докладывались на II-ой конферен- * ции физиологов Узбекистана (Ташкент,1973), Всесоюзной конференции "Ферментоввделительная деятельность пищеварительных желез и ее регуляция (Андашзн,1974), конференциях ЦНИИ медвузов Узбекистана (Самарканд,1974; Андижан,1976; Ташкент, 1978; Самарканд, 1981), Н конференции физиологов республик Средней Азии и Казахстана (Ташкент,1976), ХП, ХШ, Х1У, ХУ съездах Всесоюзного физиологического общества пм.И.П.Павлова (Тбилиси, 1975; Алт-Ата,1979; Баку,1983; Клейнов, 1987), Ш-ем съезде физиологов Узбекистана (Ташкент, 1983), га республиканской конференции "Вопросы ранней диагностики и современного консервативного и хирургического лечения заболеваний органов пищеварения" (Андижан,1984), на Всесоюзной конференции "Система мозговых и внемозговых пептидов" (Ленинград,1984) и на заседаниях Андижанского физиологического общества.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 26

работ.

Объем и структура работа. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава I), описания методов и объема исследована (глава 2), 5 глав с изложением результатов собст-

/

венных экспериментальных исследований, заключения, выводов и списка литературы.' Работа изложена на 389 страницах, иллюстрирована 26 рисунками и 65 таблицами. Список литературы включает 538 библиографических наименований. Объем машинописного текста диссертации 285 страниц.

Содержание работы

Методы исследования. Работа представляет собой экспериментальное исследование, выполненное в опытах in vivo и i" vitro. В опытах использована 61 собака и ВО крыс.

Изучение топографии гидролиза и триптической атакуемости питательных веществ в желудке проводилось в опытах in vivo после скармливания животным различных пищевых продуктов (мясной фарш, хлеб, паста сухого молока и яичного порошка). Для исследования пищевого желудочного содержимого животных разработаны или модифицированы следующие методы:

Определение аротеолитической активности желудочного содержимого проводилось модифицированным методом Лоури (1951).

Определение в желудочном содержимом аминокислот и суммарного количества продуктов гидролиза пищевого белка (спектрофото-метрически).

Определение изменения атакуемости желудочного содержимого трипсином. При исследовании протеолиза in vitro в различных вариантах инкубации изучено гидролитичеокое действие пепси-на0 трипсина и химотрипсина на казеин, белки хлеба, сухого молока и яичного порошка. Изучена преемственность действия ферментов на фибрин, гемоглобин, белки плазмы крови и яичный белок (нативный).

Определение свободных аминокислот в гидролизатах проводилось методом К.Х.Ходжиева, Ю.М.Мусаева, М.К.Усманова (1966).

На ЭВМ "Наири"-К произведен расчет энергий активаций для пепсина и трипсина при различных рН среды о использованием математичеокой модели, предложенной В.П.Апраксиным (1976).

На ЭВМ "Минск"-32 сделаны расчеты долей вклада различных факторов в обеспечение повышения триптической атакуемости белков в желудке (В.Г.Сухотерин, В.П.Апраксин, 1982),

Определение гидролитичеокях свойств желудочного сока человека проводилооь при различных рН среды.

В желудочном соке проводилооь определение рН (потениио-

метр ЛПУ-0,1 со стекляшим электродом), свободной соляной кислоты и общей кислотности титрометрически. Пепсин определялся методом Hirnhoivitz (1955).

Для изучения влияния продуктов ограниченного протеолиза пепсиногена и трипсиногена на ферментовыделительную деятельность главных пишеварительных желез были разработаны определенные методические приемы.

Выделение фракций гидролизатов пепсиногена и трипсино-гена производилось методом гель-фильтрации. Пептидные гидроли-заты пепсиногена готовились путем инкубации его раствора (40 г/л) с пепсином при рН 5,3 (в течете I ч при 37° ). Пептидные гидролизаты трипсиногена били приготовлены инкубацией его раствора (40 г/л) с трипсином при рН 8 в течение I ч при 37° в присутствии 0,5 мл 0,2 M хлористого кальция. После инкубации белки осаждали 10% трихлоруксусной кислотой. Фильтрат вносили в хроматографическую колонку с гелем Г-25 (67x2,3 см). Элюирущий раствор - дистиллированная вода. Измерение фракций элюата проводилось на СФ-26 при длина волны 280 нм. Выделено 6 фракций трипсиногена, не обладающих протеолитической активностью.

Был исследован аминокислотный состав выделенных фракций с помощью аминокислотного анализатора lkb -4101 ( Anino-acid Analyner Blochron).

Изучение влияния фракций гидролизата пепсиногена на функциональную активность митохондрий печени крыс проводилось полярографическим методом с вращающимся платиновым электродом ( Chance,Williams , 1955). Ввделение митохондрий печени проводилось методом дифференциального центрифугирования.

Техника проведения экспериментов на собаках. Влияние фракций гидролизатов пепсиногена и трипсиногена на оекреторную деятельность главных пищеварительных желез изучено в острых опытах на собаках под гексеналовым наркозом, при искусственном дыхании (миорелаксант - тубокурарин, аппарат ДП-8 ).

В ходе экспериментов через трубку, укрепленную в стенке изолированного лигатурами от пищевода и двенадцатиперстной кишки желудка получали содержимое путем его откачивания каждые 30 гам после введения в желудок 20 мл физиологического раствора.

Поджелудочный сок собирался ЗО-мпнутными порциями из канплировакч то панкреатического протока (при лигированном дополнительна : протоке). Секреция ее стимулировалась интрадуоде-

налышм капельным введением 0,1 н HCI (4 мл за 30 мин). Теми же периодами собирались моча и желчь из кагатированных мочеточников и общего желчного протока (при дотированной шейке желчного,пузыря). Фракции гидролизатов зимогеиов вводились внутривенно в количестве 2,4,8 мг в 5 мл физиологического раствора.

В ходе экспериментов регистрировалось кровяное давление в бедренной артерии. Эти показатели учитывались до и после введения фракций гидролизатов.

В желудочном содержимом определялся пепсиноген ( Hirsho-witz , 1955) и рН.

В ооке поджелудочной железы определялись общая протео-литическая активность, липаза, амилаза. Общая протеолитическая активность определялась спектрофотометрическим методом (Нор -троп и др., 1959). Липаза определялась методом А.Н.Курзанова (1975), основанном на учете образующегося при липолизе глицерина о использованием в качестве субстрата трибутирина. Амилаза - методом Смита и Роу (Smyth, Roe , 1949). Теми же методами в моче определялись пепсиноген, амилаза и липаза.

В плазме крови, которая кавдый час бралась из катетеризованной вены бедра, определялись пепсиноген, амилаза, липаза . и общая протеолитическая активность.

В желчи определялись амилаза и липаза.

Аналогичные по задачам острые эксперименты' проведены на крысах (под уретановым наркозом).

Полученные данные подвергнуты статистической обработке по Стьвденту-Фишеру с выведением критериев достоверности различий сравниваемых показателей. Некоторые данные подвергнуты корреляционному анализу. Статистическая обработка результатов экспериментов проводилась с использованием программ на микрокалькуляторе "Электроника" B3-34 (Г.Ф.Коротько, В.Г.Сухотерин, В.¡¡.Апраксин, 1984). Энергию активации вычисляли по формуле:

I I

К2

!Г~

ТГ —q j

где Kj, К2 - константы скоростей, Tj.Т^ - температура в °К,Еа энергия активизации, R - универсальная газовая постоянная (8,31 дя/град °К). Значения Kj- и Ко получены из обработки

кривых пептического и триптического гидролиза казеина (20 г/л) при Tj = 25°С = 298°К и Т2 = 37°С = ЗГ0°К.

В качестве исходных показателей этих расчетов использованы данные, полученные в опытах in vitro .

В работу вкшочены данные 39906 биохимических исследований.

Внугрижелудочный протеолиз. Повышение триптической ата-

куемости пищевых белков в желудке как проявление его пищеварительной функции

Работа состоит из 2-х частей. В первой части изучалось значение желудочного пищеварения в гидролитическом конвейере, в том числе в последующем гидролизе пищевых белков панкреатическими протеазагяи.

В предварительных экспериментах на небольшой группе (13) животных в двух сериях опытов изучен внутрикелудочный гидролиз белков и его локализация в желудке в динамике 3-х (9 собак) и 8 (4 собаки) - часового пищеварения.

Первая группа животных кормилась молотым мясом из расчета 50 г на I кг массы тела животных,которые забивались через 20,40,60,80,100,120,140,160 и 180 минут после кормления.

Полученные данные показали, что оптимальные условия для действия пепсина создаются в примукозальной зоне желудка. Так, в примукозальной зоне скорость образования продуктов гидролиза за 3 часа колеблется от-8,2 до 16,7$, в центральной зоне - от 6,2 до 14,5$ (за 100$ принято 130 мг/л аминокислот, образовавшихся в результате гидролиза белков мясного фарша при оптимальном рН - "максимально возможный" гидролиз).

Данные 2-ой серии опытов (животные получали мясной фарш в количестве 40 г/кг и забивались через 2,4,6 и 8 часов после кормления) показали, что через 2 часа после кормления более высокое (130$) оодержание продуктов гидролиза было в примукозальной зоне, чем в центральной (50$), в последующие часы обо зоны желудочного содержимого имели почти одинаковое количество этих продуктов (210$ и 200$ - соответственно).

Таким образом, полученные.данные свидетельствуют о том, что скорость гидролиза белка в желудке невелика, но различна в примукозальной и центральной зонах. Анализируя результаты этих эксперименте, можно заключить, что в первые часы после корлло-ния тавотных мясом гидролиз осуществляется в относительно

- 10 -

узкой примукозальной зоне желудочного содержимого, в центральной его части в это время гидролиз незначителен. Это подтверждается разной концентрацией продуктов гидролиза белка в приму-козальной и центральной зонах желудочного содержимого. В приму-козальной зоне в области малой кривизны гидролиз идет более интенсивно, чем в области большой кривизны.

Для суждения об эффективности гидролиза белков в желудке были оделаны расчеты "максимально возможного" гидролиза белков при данной величине рН и при данной длительности пребывания съеденной пищи в желудке, а также "максимально возможного" гидролиза этих белков при оптимальном рН. Эти показатели сравнивались с протеолитической активностью желудочного содержимого и Триптической атакуемостью пищевых белков желудочным соком, полученными в опытах in vitro .

Под термином "пептическая" и "триптическая" атакуемость мы подразумевали пиролиз белка пепсином или трипсином после предварительного действия на него желудочного сока.

Несмотря на то, что полученные результаты являются предварительными, они свидетельствуют о существенной роли желудка в общем гидролитическом конвейере желудочно-кишечного тракта и показывают своеобразную топографию начального гидролиза пищевого белка в желудке.

Начальный частичный гидролиз белков желудочным соком существенно повышает триптическую атакуемость пищевых белков.

В острых опытах на собаках, накормленных хлебом, пастой сухого молока и пастой яичного порошка проведено изучение гидролиза трипсином различных пищевых белков,предварительно подвергнутых действию желудочного сока непосредственно в желудке с учетом специфической топографии его содержимого. У животных через 2,4,6 и 8 часов после кормления брали замороженное желудочное содержимое, которое разделяли на 3 части - кардиаль-ную, фуццальную, преантральную. Из каждой части брали по 4 пробы - 2 из примукозальной зоны большой и малой кривизны и 2 - из внутренней, центральной зоны. •

Полученные данные показывают, что в результате действия на пищевые белки желудочного сока триптическая атакуемость их значительно повышается. Это повышение было наибольшим в первые 6 часов после кормления тавотных пастой сухого молока в приму-козлпьной зоне желудочного содержимого (табл.1). Через 8 часов

Таблица I

Трипгическая атакуемость белков' желудочного содержимого (в мг/л гидролизатов,образующихся при инкубации о трипсином 100 мг желудочного оодержимого в течение 8 часов; М )

Пищевой !___Время после кормления. ч

продукт ! 2 ! 4 ! 6 ! 1 р 8

Паста сухого молока 39,6+10,5 4,7+ 0,8 63,6+12,3 23,2+ 9,0 51,4+12,0 15,9+ 3,7 19,1+ 2,5 17,0+ 8,3

¿0,01 ¿итог ¿0,001 ¿0,01 ¿0,001

Р2 ¡.0,01 ¿0,02 ¿0,01 -

Хлеб *>1 5,3+1,8 3,4+0,8 4,9+0,9 5,3+1,7 9,4+2,3 5,6+1,7 ¿0.01 ¿и,05' Желудочного содержимого недостаточно для анализов

Р2 - - - -

Паста яичного порошка 0,7+0,3 0,8+0,4 10,0+1,8 5,9+3,1 4,4+1,2 2,1+0,4 5,1+0,9 3,0+1,8

Р1 • - ¿0.001 ¿0,02 ¿0,001

Р2 - - - -

Прилечания: I. В результате 30-минутного действия трипсина на пасту сухого молока в инкубируемой смеси образовалось 7,1 мг/л, на хлеб - 2,5 мг/л и на пасту яичного порошка - 1,25 мг/л гвдролизатов.

2. Числитель - в примукозальном содержимом желудка, знаменатель - в центральном.

3. ру - достоверность различий показателей гидролиза в каждом из слоев химуса по сравнению о показателями гидролиза пищевых белков, не находившихся в желудке.

4. р? - достоверность различий показателей гидролиза между пр:ялукозальной и центральной зонами.

после кормления набдвдалось снижение атакуемости в примужо-8альной зоне, в центральной зоне она практически не изменилась, что можно связать с уменьшением секреторной активности желудочных желез в этот период.

Триптическая атакуемость белков хлеба в первые 2-4 часа повышалась незначительно. Через 6 часов после кормления она в примукозальной зоне была увеличена более чем в 3,5 чраза, а в центральной зоне желудочного содержимого - более чек в 2 раза. Однако в зоне, расположенной ближе к антральной части желудка, триптическая атакуемость белков хлеба всегда была высокой. Это говорит о том, что подготавливаемое к эвакуации желудочное содержимое имеет повышенную трштическую атакуемость (табл.1).

Данные, полученные в опытах при скармливании собакам пасты яичного порошка показывают, что через 2 часа после кормления триптическая атакуемость ее белков в желудке не изменилась. Через 4 часа, в период максимальной секреции, атакуемость белков была высокой и в центральной, и в примукозальной зонах содержимого желудка (табл.1).

Тагам образом, повышение триптической атакуемости пищевых белков обеспечивается пепсином (пепсинами) желудочного сока, действующими в широком диапазоне рН и зависит от вида белка в составе пищи. Наличие в желудочном соке протеаз, действующих в широком диапазоне рН, является одной из причин повышения триптической атакуемости белков при слабокислой реакции желудочного сока.

Степень повышения атакуемости белка трипсином зависит от кислотности желудочного содержимого. Эти данные подчеркивают отмеченное выше повышение триптической атакуемости пищевого белка и при достаточно высоких значениях рН (5).

Анализ результатов экспериментов показал, что повышение триптической атакуемости белка в результате действия желудочного сока является общей закономерностью и тесно связано с активностью пепсина. Несмотря на то, что в повышении триптической атакуемости белка вместе с ферментовыделительной деятельностью желудка участвует и кислотовццеление, доля гес участия в обеспечении этого процесса неодинакова.

В реализации гидролитической деятельности желудка,роли его в повышении триптической атакуемости белка пришп.иют участие многие факторы, взаимосвязанные между собой. Представляло интерес, рассчитать доли вкладов каждого из этих факторов (кон-

центрация соляной кислоты и активность пепсина, время пребывания пищевого содержимого в желудке, его гидродинамика и топография) в результирующий эффект - изменение триптической атакуемости белков. Эти расчеты проводились с использованием математической модели процессов переваривания различных веществ в желудке в форме нелинейных множественных регрессионных зависимостей (В.Г.Сухотерин, В.П.Апраксин,1982). Использование этого метода позволило произвести детальный анализ процесса гидролиза белков в желудке, множественную и парную корреляции вышеуказанных факторов.

Результаты расчетов показали выраженную связь между всеми факторами, принимающими участие в изменении триптической атакуемости пищевых белков в желудке. Этот процесс в центральной и примукоэальной зонах пищевого содержимого желудка имеет свои особенности, которые определяются различными условиями его гидродинамики и кинетики гидролиза пищевых белков.

Математический анализ пищеварения в желудке позволил количественно охарактеризовать долю вклада каждого из изучаемых факторов в повышение триптической атакуемости.

Доля вклада пепсина в повышение триптической атакуемости белков хлеба в примукозальной зоне составила 64,1$, а для белков пасты сухого молока и яичного порошка - 16,1$ и 8,1$ соответственно.

Таким образом, в триптической атакуемости белков определенную роль играют рН, время переваривания пищи в желудке -и топография :.---лудочного содержимого. Значение этих факторов в зависимости от вида пищевого белка различно.

Несмотря на то, что в желудке гидролизуется 10-15$ всех пептидных связей (обзоры: В.В.Мосолов,1971; М.П.Черников,1975; В.К.Антонов,1983), желудочное пищеварение играет существенную роль в последующем гидролизе белков панкреатическими протеазами. Каскадный принцип организации ггротеолиза, зависимость пептического и триптического гидролиза белков от рН среды В опытах in vitro была изучена преемственность действия пепсина и трипсина на белковые субстраты при различных рН, что имитировало последовательность действия ферментов в естественных условиям гидролиза пищевого белка. Предварительно изучалось также действие каждого из этих ферментов на белки в отдельности. Был изучен гидролиз белков хлеба, сухого молока к яичного

порошка при различных рН под действием пепсина (р" 1,8; 3, 4, 5, 7) и трипоина (рН 4,5,6,7,8,9), инкубация проводилась в течение 2-х часов 30-минутными периодами при 37°. В этой же серии изучался гидролиз фибрина под действием тех же ферментов.

Эффективный гидролиз трипсином белков сухого молока наблвдался при всех указанных рН во все периоды инкубации, в то время как гидролиз белков хлеба и яичного порошка начинался только через 60 мин при рН 4,5,7, в последующие периоды инкубации интенсивность пщролиза этих белков была ниже, чем белков сухого молока. Это можно объяснить высокой буферной емкостью белков хлеба и яичного порошка.

Кривые пщролиза, полученные при длительной (8 час) инкубации били использованы в дальнейшем для расчета гидролиза, "максимально возможного" в данных условиях и в условиях, оптимальных для пепсина или трипсина. Эти расчеты использовались для выражения гидролиза белков in vivo (в опытах с изучением топографии гидролиза и атакуемости белков) в % к максимально ВОЗМОЖНОМУ ГИДРОЛИЗУ ЭТИХ беЛКОБ in Vitro .

Кроме того, производился расчет величины гидролиза при соответствующем рН за определенный промежуток времени (2,4,6, 8 часов) к максимально возможному гидролизу при фактическом рН, который принимался за 100$.

Для определения значения последовательного пщролиза белков в желудке в процессе начального гидролиза белка было изучено действие пепсина на белки плазмы крови, казеин, гемоглобин, яичный белок (нативный) при различных рН (3,4,5) с последующим гидролизом их при оптимальном для пепсина рН (1,8 - для белков хлеба и сухого молока и 1,5 - для яичного белка).

Полученные результаты показали, что после кратковременной инкубации белка с пепсином при рН 3,4,5 и последующего изменения его на 1,8 скорость гидролиза увеличивается. Это увеличение достигает величины, которая характерна для гидролиза при рН 1,8, а иногда превосходит ее. Этот эффект наиболее выражен для казеина и гемоглобина и слабо выражен для белков плазмы крови и яичного белка (рис.1).

Как было показано ранее с нашим участием (Г.Ф.Коротысо л соавт.,1975; Л.К.Чалпков,1977), гидролиз белков осуществляется в относительно узкой примукозалыгой зоне, непосредственно примы-

/1Г/л

Рис.1. Значение предварительного действия пепсина на-белки при различных рН для последующего гидролиза их пепсином при оптимальном рН

Примечания:

1 - по оси абсцисс - время инкубации белков о пепсином при

различных'рН ;

2 - по оси ординат - количество продуктов гидролиза, обра-

зовавшееся в результате действия пепсина при разлэтных рН, мг/л ;

3 - стрелками обозначено время изменения рН га 1,8 после

предварительной инкубации белков о пепсином при различных рН (3,4,5) ;

4 - сплошные линии - гидролиз белков при рН 1.8 после-

предварительного действия пепсина при рН 3,4,5 .

кающей к слизистой оболочке желудка, затем зона гидролиза постепенно расширяется по мере приближения к антральной части желудка, в которой содержимое относительно гомогенно.

Таким образом, по характеру гидродинамики и гидролиза желудок не может быть представлен как хивгческий реактор идеального перемешивания, а приближается к химическим реакторам идеального вытеснения (Г.Ф.Коротько и соавт.,1975), что обеспечивает наибольшую эффективность гидролитической деятельности желуд:ь.

Полученные результаты позволяют захлггвггь, что пришил

- 10 -

своеобразного конвейера действия пепсина на белки при различных значениях рН реализуются в различных частях содержимого желудка, куда может проникать желудочный сок. Наличие гидролитического конвейера в желудке особенно важно для предварительной обработки пищевого белка при снижении кислотности желудочного сока.

Известно, что в переваривашш белков наиболее выраженная роль принадлежит ферментам поджелудочной железы, вместе о тем, гидролитическое действие трипсина и химотрипсина проявляется в большей мере, если белки предварительно подвергались действию пепсина (А,А.Покровский, И.Д.Ертанов, 1965; Н.Г.Сторо-.жук,1979; Ц.Г.Маоевич и соавт.,1973).

В опытах in vitro было изучено значение предварительного кратковременного действия пепсина на белки при относительно высоких рН (3,4,5), характерных для желудочного содержимого первых часов после кормления, для последующего гидролиза их трипсином.

Результаты исследования свидетельствуют о том, что предварительное действие пепсина на белки играет существенную роль в повышении триптической атакуемости белков. Причем, эффект повышения скорости гидролиза белков трипсином обеспечивается пепсином в широком диапазоне рН. Оообенно заслуживает внимания повышение триптической атакуемости белков под действием пепсина при рН 3,4 и 5. Эффекты повышения триптической атакуемости белков после предварительного действия пепсина при рН 3,4,5 , могут объяснить компенсаторные процессы, развивающиеся при недоотаточности киолотоввделительной функции желудочных желез.

Исходя из результатов, приведенных в настоящем фрагменте работы, можно предположить несколько возможных причин повышения ферментной атакуемости белков в различных условиях, но экспериментальное исследование этих причин в отдельности пока неосуществимо. Одна из возможностей состоит в том, что молекула фермента претерпевает какое-то конформационное изменение. Количественная оценка конформациотгой гибкости молекулы затруднена. Как правило, для этой цели пользуются комплексом физико-химических показателей. Проотой и непосредственный метод выявления оубстрат-завиоимых конформационных изменений заключается в изучении окорости реакции белка при добавлении таких соединений, как сульфгидрилышй реагент или протеолитичоскиП фермент. Гак, повшешш скорости гидрат л за белков мы наблюдали при опре-

деленных условиях инкубации белков в присутствии пепсина и трипсина.

Предположив, что о увеличением скорости протеолиза и количества разрываемых пептидных связей изменяется и концентрация освободившихся свободных аминокислот в гидролизате, мы изучили аминокислотный состав гидролизатов во всех сериях проведенных ранее опытов in vitro .

Анализ аминокислотного состава пептических гидролизатов различных белков показал изменение количества свободных аминокислот в ходе гидролиза. В зависимости от степени расщеплешш белка в гидролизате выявлены глутаминовая кислота и основные аминокислоты (аргинин, лизин, гистидин), появление которых свидетельствуют о глубине гидролиза ( Cook , 1967), то есть предварительное действие пепсинов при различных рН увеличивает атакуемость белков пепсином же при оптимальном рН, обео-печивая более полный их гидролиз.

Увеличение количества аминокислот, образующихся в результате гидролиза белков при последующем действии трипсина также свидетельствует о значении внутрижелудочного гидролиза белков в повышении их триптической атакуемости.

В плане продолжения изучения механизма увеличения ата-куемости белков во внутрижелудочном гидролитическом конвейере и преемственности действия разных протеиназ на пищевые белки был сделан расчет энергии активации этих реакций (совместно с В.П.Апраксиным): I) для пепсина при различных рН (3,4,5) и после изменения его на 1,8; 2) для трипсина - при рН 8,0 после предварительной инкубации белка с пепсином при различных рН (3,4,5). Для сравнения рассчитаны энергии активация при рН 1,8 - для пепсина и рЯ 8,0 - для трипсина. В качестве оуб-страта использовался 20 г/л раствор казеина. Инкубация проводилась при 25° и 37°.

Получе1гные результаты показали, что при гидролизе пепсином минимальные величины энергии активации достигаются после предварительной обработки белка пепсином при рН 4, аналогично для трипсина - после предварительной обработки казеига пепсином при рН 3. Такие результаты ооглаоуотоя о данными экспериментов на собаках, полученными наж ранее, в которых было показано, что желудочное содержимое в центральной зоне желудка имело рН, как правило, равный 4-5, в примукогальной

зона он был равен 2. Этот факт имеет значение для понимания организации сложного гидролитического конвейера в пищеварительном тракте, обеспечивающем преемственность гидролиза пищевых веществ. Не исключено также, что в регуляции гидролитической деятельности в пищеварительной системе определенное значение имеет сложный химизм конформационных преобразований, обеспечивающий гидролиз пищевых белков с максимально полезным результатом.

Трансформация свойств желудочного сока как компонента пищеверительного конвейера при патологии Показано, что протеолитические ферменты желудочного сока проявляет свою активность в широком диапазоне pH (Г.Ф.Ко-ротько,1971,1980; Н.Ш.Амиров,Д.В.Антонов,1981; Taylor ,1982). По данным литературы, при патологических состояниях желудка изменяется кислотность желудочного сока и активность его ферментов. Исследования изменений протеолитической активности желудочного сока при различных патологических состояниях основаны преимущественно на определении активности пепсина в желудочном соке при оптимальном значении pH. Однако, этот показатель не отражает истинной протеолитической активности желудочного сока.

Определение протеолитической активности желудочного сока проводилось разработанным нами опособом при различных pH желудочного -сока. Протеолитическая активность желудочного сока изучалась при фактическом pH оока, при pH 2,3 и 5, что дало возможность в одном и том же образце желудочного сока изучить его гидролитические возможности при различных pH. При этом создавались оптимальные условия для действия различных протеаз, имеющихся в желудочном ооке.

По нашим данным, при нормальной секреторной деятельности желудочных желез человека желудочный сок имел высокую гидролитическую активность при воех исследованных pH. Это свидетельствует о том, что желудочное пищеварение эффективно не только при выраженной кислой реакции желудочного содержимого, но и при слабокислой реакции.

Абсолютные показатели активности гидролиза казеина . желудочным соком у здоровых лиц через 30 мин инкубации при pH 1,0 составляли 1,45-Ю,02 мг/л, при pH 2,0 - 1,49+0,03 мг/л, при pH 3,0 - I,0Э+С,СЗ~мг/л, при pH 5,0 - С,23+0,01~мг/л.

- Г9 -

Гидролиз казеина пепсином (атакуемость пепсином) после предварительного действия желудочного сока составлял соответственно - 2,57+0,02 мг/л; 2,90+0,01 мг/л; 2,10+0,01 мг/л; 0,36+0,02 мг/л .

Предварительное действие желудочного сока на казеин также вызывало увеличение триптического гидролиза белка (трип-тическая атакуемость) при всех пследованных рН (соответственно-3,70+0,01; 4,32+0,01; 3,17;(р,02; 0,76+0,04 мг/л).

Бил исследован желудочный сок больных о гастритами, язвенной болезнью желудка и язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки. Показатели протеолитичеокой активности желудочного сока больных сравнивались с аналогичными показателями у здоровых.

Полученные результаты показали, что при различных патологических состоящих желудка вместе с изменением протешшти-ческой активности желудочного сока происходит изменение соотношений секретируемых желудком протеиназ. Это выражалось в проявлении протеолитичеокой активности при другом, более высоком рН, не характерном для лиц с нормальной секреторной деятельностью желудка. Особенно это важно для больных с пониженной секрецией желудочных желез. На другой оптимум рН пепсина у таких больных по сравнению со здоровыми указывает И.Л.Янсоне (1975). Предварительное действие желудочного сока этих больных также способствует лучшему гидролизу белка панкреатическими протеазами в тонкой кишке. Такие изменения протеолитических свойств желудочного сока рассматриваются как компенсаторные.

В группу больных (15) с гипацидным гастритом вошли лица с рН желудочного сока 3,5-7,9 .

Как показали полученные результаты, эффект повышения пептической атакуемости наблвдался не у всех больных с пониженной желудочной секрецией. Этот эффект наблвдался у больных с рН желудочного сока 3,2-3,7. У больных о рН желудочного сока 4,1-7,9 эффект повышения атакуемости белка пепсином отсутствовал. Из этих данных можно заключить, что повышение трипти-ческой атакуемости белка обеспечивается незначительны.! начальным пепткческим гидролизом. .

В группу больных с нормацидным гастритом (10) воали лица, у которых рН. желудочного сока составлял 1,7-3,0 .

Как показали наши исследования, атакуемость белка пепсином гтрп рН 5 не достигала уровня этих показателе!! у здоровых

лиц (0,12+0,02 мг/л, рл 0,01).

Триптическая атакуемооть казеиш после предварительного действия на него желудочного сока болью« с нормальной кислотностью увеличивалась, но менее значительно, чем у здоровых.

В группу лиц с гиперацидным гаотритом (II) вошли больные с рН желудочного сока 1,4-1,7 .

Атакуемооть казеина пепсином у этой группы больных также, как и у больных о нормальной кислотностью желудочного сока,была ниже, чем у здоровых; через 30 мин инкубации при рН 2 - 0,08+ 0,02 мг/л; при рН 3 - 0,12+0,02 мг/л; при рН 5 - 0,16+0,02 мг/л). Наибольшее увеличение гидролиза казеина трипсином наблюдалось после предварительной инкубации белка при рН 5 (0,16+ 0,02 мг/л).

Для всех трех групп больных с различными формами нарушенной секреторной деятельности желудка также, как и у здоровых, было характерно повышение триптической атакуемости белка под влиянием предварительного действия на него желудочного сока. Однако у больных о пониженной секрецией желудочных желез через 30 мин инкубации атакуемооть трипсином не достигала его уровня у здоровых лиц. Черев 60 мин инкубации этот показатель был в тех же пределах, что и у здоровых лиц. У больных с нормацидным гастритом желудочного сока атакуемооть трипсином во все периоды инкубации была ниже, чем у здоровых.

У больных язвой желудка и язвой двенадцатиперстной юшки пептическая и триптическая атакуемооть белка была выше, чем у здоровых. -

Исходя из результатов наших модельных экспериментов и исследования свойств желудочного сока здоровых и бальных лиц, можно заключить, что предварительное действие желудочного сока при различных рН оказывает существенное влияние на последующий гидролиз пищевых белков протеолитиче скигли ферментами желудочно-кишечного тракта. В зависимости от рН, при котором происходит йцфоляз белка, нарушения желудочной секреции могут быть компенсированными, как вто наблюдалось у группы больных с рН желудочного сока 3,2-3,7. У больных с более высоким рН желудочного оока аффект повышения гкдролиеа белка отсутствовал. Такие нарушения желудочной секреции можно рассматривать как декомпен-ояроваюше. Однако наблюдаемое в этих условиях повышение ата-' куемости продуктов пептического гидролиза казеина трипсином

еще раз подчеркивает значение предварительного действия на пищевые белки кислых протеаз желудочного сока.

Результаты изучения гидролитической деятельности желудка с учетом его свойств изменять атакуемость белка при различных pH позволяет сделать вывод о том, что гидролиз белка в желудке как этап пищеварительного конвейера осуществляется не только при выраженной кислой реакции желудочного содержимого, . но и при слабокислой реакции. Это особенно важно для пищеварения не только при нормальной секреторной деятельности желез желудка, но и у лиц о секреторной недостаточностью при снижении у них кислотовццеления желудочными железами.

Предварительное действие желудочного сока повышает триптическую атакуемость белка. Вполне вероятно, что это определенным образом компенсирует недостаточность секреторной деятельности желудочных желез, как это видно у больных с пониженной кислотностью желудочного сока. Не исключено, что здесь проявилась одна из приспособительных функций пищеварительных желез в гидролитическом конвейере.

Вторая часть работы посвящена выяснению возможной роля продуктов ограниченного протеолиза пепсиногена и трипсиногена на секреторную деятельность пищеварительных желез.

В острых опытах на собаках (13) и крысах (56) изучены свойства гидролизатов пепсиногена (3 серии) и трипсиногена (2 серии опытов), не обладавших протеолитичеокой активностью.

Фракции гидролизатов пепсиногена (П, Ш и 1У) и трипои-ногена (1У и У1 - в опытах на крысах) вводились внутривенно в количестве 2,4,8 мг в 5 мл физиологического раствора (0,13? 0,26? 0,53 мг/кг маосы животного).

Гидролизаты пепсиногена как физиологически активные вещества

По литературным данным, зимогенные формы протеияаэ обладают стимулиругацим влиянием на секрецию ферментов пищеварительными железами. Показано, что подобным свойотвсм обладают полипептиды, образуются при получении препаратов пепсина по принципу аутолиза ( Buchs , 1979). Выявлено, что они являются биологически активными веществами, которые отямулируют биосинтез пепсина в слизистой оболочке желудка (П.Г.Сторояук . и соавт.,1981).

Инкретиру©>ий железами желудка пепокноген обладает

способностью стимулировать ферментоввделктельную деятельность поджелудочной железы, на оказывая выраженного влияния на объем ее секреции и ввделение электролитов (В.А.Алейник, Л.Н.Курзанов, 1977; В.А.Алейник,1982). Н.Ф.Камакинш и соавт. (1983) установлено, что пепсиноген существенно влияет на эндокринную функцию поджелудочной железы и высвобождение гастрина 0 -клетками желудка. Внутривенное введение гидролизата. пепсина вызывало снижение желчеввделения (П.К.Климов и ооавт.,1983).

Приведенные данные позволяют.допустить, что продукты гидролиза' пепсиногена могут обладать достаточно широким спектром физиологических и фармакологических эффектов. Нами было изучено влияние продуктов гидролиза пепсиногена на функциональную активность митохондрий печени крью. Фракции вводились в поляризационную ячейку в количестве 15 и 30 мкг/кг. Полученные результаты показали, что эти фракции вызывали переотройку энергетических процессов в митохондриях, изменяли скорость их дыхания в различных метаболических состояниях.

Введение П и 1У фракций в дозе 30 мкг/кг снижало интенсивность поглощения кислорода в присутствии оубстратов окисления и фоофоршшрования (65+5,0 и 62+4,0, соответственно, по сравнению с контролем (без введения гидролизата) - 110+10. Скорость дыхания выражалась в ммкатоках кислорода, поглощенного за I мин в раочете на I мг белка. Это состояние сопровождалось уменьшением коэффициента дыхательного контроля (1,9+0,8 и 1,00+0,05 соответственно, при контроле - 3,00+0,08).

Малая доза Ш фракции (15 мкг/кг) не изменяла скорость фосфорилирования. По действием большой дозы этой фракции наблвдалооь уменьшение скорости дыхания и коэффициента дыхательного контроля.

Наибольшее подавление величины коэффициента дыхательного контроля отмечалось после действия большой дозы 1У фракции гидролизата пепсиногена,что вызывало незначительное снижение о'тносзшш АДФ/0 (1,2+0,07, контроль -1,7+0,1). Этот эффект свидетельствует об уменьшении зависимости интенсивности дыхания митохондрий, от АДФ.

Результаты ошггбв о внутривенным введешем фракций гад-ролдаата. пепслногена собаки.? также доказали наличие физиологической активности вгих фракций, П фракция независимо от дозы вызывала торможение секреция желудочных желез (73+3$, р г 0,01-объви сока, протеодятнчеокая акткзность - 55+7 в % к пока-

зателям до введения фракции гидролизата), малая доза (0,13 от/кг) увеличивала объем (275+355?) стимулированной интрадуоде— нальным введением соляной кислоты панкреатической секреции; при увеличении дозы увеличивался диурез (355+42$); влияния на желчеотделение были неопределенными. Ш фракция обладала иными свойствами: только при высоких дозах снижала секрецию желудочных желез (83+2$), но влияла на объем панкреатической секреции и диурез, высокие дозы существенно повышали желчеотделение (175+30$). 1У фракция только в максимальной дозе тормозила желудочную секрецию (77+4$), малая доза этой фракции усиливала секрецию поджелудочной железы (205+23$), обладала диуретическим эффектом и в большие дозах резко угнетала процесс желчеобразования (63+5$). Ни одга из фракций не вызывала выраженных изменений кислотности желудочного, сока и па протяжении всего эксперимента свободная HCl в зэлудочном соке не проявлялась.

Еще более сложны эффекты влияния 'фракций гидролизата пепсиногена на секреторную деятельность поджелудочной железы. П фракция повышала общую протеолитичеокую и липолитическую активности поджелудочного сока (116+5$ и 151+15$ соответственно)^ фракция гидролизата снижала протеолитическую и амилоли-тическую активности (49+11 и 77+8$) и не изменяла липолитичео-куи активность сока. 1У фракция гидролизата снижала протеолити-ческую, но резко повышла липолитичеокую активность панкреатического секрета.(табл.2).

Так как было показано, что содержание пепсиногена в крови оказывает стимулирующее влияние на секрецию ферментов поджелудочной железой (В.А.Алейник,1981), представляло теоретический и прикладной интерес изучение содержания пищеварительных ферментов в крови под действием фракций гидролизатов пепсиногена.

По нашим данным, П фракция гидролизата снижала уровень плазмопепсиногена, Ш фракция, особенно вцеокие ее дозы, вызы-'вали гиперпепсиногенемип.

Триптическая активность плазмы крови значительно повивалась после введения высокой (0,53 иг/кг) дозн Ш фракции (144+8$, р*. 0,001). Четкие эффекты отмечены по амллолитпческой активности плая.тн крови: низкие дозы П фракции гидролизата снижали (78+2$), а высокие дозы повышали ео (130+2$); наиболее

выраженная гиперамилаземия вызывалась Ш фракцией гидролизата (237+41$); эффекты 1У фракции были менее выражены.

Таблица 2

Влияние фракций гидролизата пепсиногена (П,Ш,1У) на ферментативную активность панкреатического секрета (в % к показателям до введения гидролизата , М + т )

Гидролазы ! Дозы ! ! фракций ! п | " Ш | 1У

Протеиназы Г . 116+ 5 49 +11 60 +13

2 , 147+ 3 35 + 2 46 +12

3 221+17 56 + 4 -

Амилаза I 71+ 2 77+8 59+8

2 86+ 2 116+14 42 + 3

3 99+ I П2~+ 7 98 +12'

Липаза I 151+15 112+ 7 259 + 22

2 113+13 116 +16 231 + 56

3 124+ 6 122 +11 -

Примечания: 1,2,3 - дозы с фракций гидролизата: 0,13; 0,26; мк/кг массы тела соответственно.

Вое дозы фракций гидролизата пепсиногена увеличивали амилолятическую активность желчи, липолитическая активность ее при увеличешш дозы уменьшалась.

Отмечено увеличение активности уропепсиногена после введения высоких доз всех фракций гидролизата. Наиболее четкая гшерамилазурия наблвдалаоь после действия П и 1У фракций, Ш, фракция тормозила амилсиштическую активность мочи. Липолитическая активность мочи увеличивалась после введения всех доз исследованных фракций.

Введение фракций гидролизата пепсиногена крысам вызывало аналогичные изменения секреторной деятельности поджелудочной железы.

Тормозным влиянием на желчеотделение крыс обладали вое дозы Ш в 1У фракций и Калыа дозы П фракции. Высокие дозы П фракции• вызывали увеличение желчеотделения (126,4+13,655, по отношению к показателям до введения). Амилолитическая актив-

ность желчи после введения П и РУ фракций уменьшалась независимо от дозы, Ш фракция гидролизата в больших дозах незначительно (127,5+5,6$) повышала ее.

Проведенная корреляция между содержанием ферментов в крови и их выделением с мочой и желчью позволяет сделать вывод о том, что исследованные фракции принимают непосредственное участие в обеспечении ферментного гомеостаза.

Во всех опытах действие изученных фракций начинало проявляться через короткий промежуток времени после его внутривенного введения. Такой же эффект наблюдался П.К.Климовым и сотр.(1983) после введения гидролизата пепсиногена. Кроме того, следует отметить наличие тесной связи между уровнем ферментов в крови и желчи и секреторной деятельностью главных пищеварительных желез (odsop: Г.Ф.Коротько,А.Н.Курзанов, 1978).

Таким образом, результаты настоящего исследования позволяют заключить, что фракции гидролизата пепсиногена обладают свойствами физиологически активных веществ.

Гидролизаты трипсиногена как физиологически активные вещества

Как показывает анализ литературы, трипсин, его ингибитор и трипсиноген могут оказывать стимулирующее или ингиби -рующее влияние на секреторную деятельность пищеварительных желез (Г.Ф.Коротько, В.Г.Сухотерин, 1977,1978; Г.Ф.Коротько, Н.Ф.Камакин, 1978; Г.Ф.Коротько, 1983; Bucha , IS8I). Возможно, что этот эффект достигается при участии пептидов, образующихся при активации трипсиногена в процессе ограниченного протеолиза.

Из 6 фракций, выделенных из гидролизата трипсиногена в острых опытах на собаках, на секреторную деятельность главных пищеварительных желез было изучено влияние I/ фракции.

Как показали каши исследования, 1У фракция гидролизата трипсиногена вызывала увеличение общей протеолптической, амп-лолитической и липолитической активностей, поджелудочного сока (табл.3). С увеличением дозы препарата наблюдалось повышение обшей протеолитической и амилолнтичзской активностей поджелудочного сока, причем этот эффект не бал связан с объемом секрета. Объем поджелудочного сока повышался после введения малых доз (0,13 мг/кг) препарата, высокая доза (0,53 мг/кг)

тормозила секрецию. Объем желчи и мочи увеличивался независимо от вводимой дозы гидратазата.

Таблица 3

Влияние 1У фракции гидролизата трипсиногена на секреторную деятельность поджелудочной железы (А- активность гидролаз, Б- часовой дебит выделения в % к показателям до введения, М + т )

Гиотолазы ! I ! 2 ! 3

! А ! Б ! А ! Б ! А ! Б

Протеиназы 122+8 162+8 109+11 149+24 195+20 105+8

Амилаза 161+22 215+35 184+7 271+44 203+17 134+11

Липаза 115+9 134+7 46+3 99+6 60+6 29+2

Примечания: 1,2.3 - дозы фракций гидролизата: 0,13; 0,26; 0,53 кг/кг массы тела, соответственно.

Амилолитичеекая активность желчи под влиянием высокой дозы препарата была ниже исходного уровня. Остальные дозы вызывали незначительное увеличение его выделения, связанное с увеличением объема желчи. Отмечен четкий эффект повышения липолитической активности желчи.

С увеличением диуреза наблюдались изменения в ферментном спектре мочи. Обедам для уропепсиногена и амилазы мочи било повышение их выделения под влиянием малых доз препарата. Липолитическая активность мочи при всех дозах была ниже исходной величины.

Уровень гидролаз в крови собак уменьшался о увеличением дозы вводимой фракции'гидролизата.

В острых опытах на крысах были изучены физиологические свойства 1У (8 крыо) и П (10 крыо) фракций гидролизата трип-оиногена. •

■ Наибольшей эффект повышения секреции наблюдался после введения максимальной дозы (0,53 мг/кг) 1У фракции гидролизата. Введение этой дозы вызывало увеличение общей протеолитической (157+16,5$, р* 0,001), амилолитической (177,4+13,1%, p¿ 0,001) и лзшолитичеокой (129,7+11,31, р* 0,05) активностей поджелу -

дочного сока. Под действием У1 фракции наблюдалось уменьшение секреции поджелудочной железы и активности протеаз.

Обе фракции уменьшали желчеотделение при увеличении дозы вводимой фракции трипсиногена. Амилолитическая активность желчи под влиянием 1У фракции практически не изменялась, а после введения У1 фракции увеличивалась при уменьшении дозы препарата.

Эти данные позволяют утверждать, что не только зимо-гены, но и продукты пептидной природы, образующиеся при их активации, обладают стимулирующими или пнгибирутощгади свойствами в отношении секреторной деятельности пищеварительных желез, желчеотделения и оказывает влияние на жизнедеятельность митохондрий печени крыс.

Таким образом, в результате проведенной работы получены новые данные о влиянии продуктов ограниченного протеолиза пепсиногена и трипсиногена на секрецию главных пищеварительных желез, роли факторов, принимающих участие в повышении ферментной атакуемости белков, их значения для повышения энергии активации ферментативных реакций.

Для характеристики желудочного протеолиза изучена и количественно охарактеризована топография внутрижелудочного гидролиза белков. Были применены оригинальные методы выделения материала, разработаны методы определения скорости гидролиза и количественной характеристики факторов, определяющих повышение атакуемости различных пищевых белков желудочным соком непосредственно в желудке и при моделировании соответствующих условий желудочного протеолиза (топография пищевого желудочного содержимого, рН, активность пепсина, время его действия на белки, влияние продуктов гидролиза). Проведет математические расчеты, позволившие сравнить возможные и фактические величины внутрижелудочного протеолиза, что позволило описать желудочный протеолиз и показать его резервные возможности .

Полученные результаты показали, что в желудочном про-теолнзе наибольшее значение тлеет примукозальная зона желудочного содержимого, где создаются оптимальные условия для активации пепсиногена и последующего гидролиза пищевых белков пепсинами.

Предварительное действие на пищевые белки пепсина или натурального желудочного сока в широком диапазоне рН обеспечивает увеличение скорости гидролиза в желудке и повышение атакуемости белка панкреатическими ферментами.

Проведенными исследованиями установлено, что секреция кислоты желудочными железами имеет относительно меньший вклад . в реализацию данных эффектов, наиболее значительный вклад в изменение триптической атакуемости белка имеет секреция" ферментов. Доля вклада этого фактора зависела от вида пищевого белка и топографии пищевого содержимого в желудке.

Важным показателем пщролиза белка является не только его глубина, но и количество энергии, затрачиваемое для его обеспечения, о чем свидетельствует проведенный расчет энергий активаций гидролиза белка пепсином и трипсином при различных рН.

Результаты исследования овойств желудочного сока здоровых и больных лиц, работа с экспериментальными моделями показали существенную роль предварительного действия желудочного сока в дальнейшем повышении пептяческого и триптического гидролиза пищевого белка. Свойство повышать атакуемость белков проявляют протеазы желудочного сока больных с патологическими изменениями желудочной секреции. По полученным результатам дан анализ изменений этих свойств желудочного сока в зависимости от состояния секреторной деятельности желудка.

Полученный материал свидетельствует о том, что в достижении начального гидролиза пищевого белка в желудке и последующего про^еолиаа в тонкой кишке участвуют сложные приспо-ообительные процессы.

Изучение фракций, выделенных из неактивных предшественников и обладающих широким спектром биологической активности в различных условиях, имеет большое теоретическое и практическое значение.

Исследование регуляторных свойств продуктов ограниченного протеолиза вимогенов проводилось методом выделения пептидных фракций из септического безбелкового гидролизата пеп-синогена и тризтического гидролизата трипсиногена. Эти фракции не обладали протеслитической активностью. В острых опытах ва собаках в крысах было изучено юс влияние на секреторную

деятельность главных пищеварительных желез и диурез.

Внутривенное введение этих фракций показало, что они обладают стимулирующими или ингибирующими свойствами в отношении секреции пищеварительных желез, желчеотделения, окислительного фосфорилирования митохондрий печени крыс и диуреза. Обнаруженные эффекты влияния этих продуктов на деятельность желудочных и поджелудочной желез указывают на еще мало изученный способ регуляции секреторной деятельностью пищеварительных желез.

ВЫВОДЫ

1. В опытах la vitro(собаки, крысы) изучена физиологическая роль реакций ограниченного протеолиза в пищеварительном процессе. Исследовано влияние пептадных фракций (П,Ш,1У), выделенных из гидролизатов пепсиногена и трипсиногена (1У п У1 фракции), на секреторную деятельность желудочных и поджелудочной желез, а также на желчеотделение, диурез и функциональную активность митохондрий печени крыс.

Изучено значение предварительного действия пепсина и натурального желудочного сока на пищевые белки при различных значениях рН (3,4,5) для их дальнейшего гидролиза в кишечнике.

2. Предварительное действие пепсина на белки при рН 3,4,5 повышает пептический гидролиз белков в желудке при оптимальном рН и их последующий трштичеокий гидролиз (от 33 до 7452).

3. После инкубации пепсина о казеином при рН 4 о последующим изменением его на 1,8 (оптимальная величина для действия пепсина) достигается Наибольшее увеличение скорости протеолиза, в результате чего изменяется количество аминокиолот

в гидролизате и уменьшается энергия активации реакции (с 43 до 15 кДж/моль). Такой же эффект -наблюдается при гидролизе казеина трипсином (рН 8, оптимальный показатель для действия трипсина) после предварительного действия; пепсина при рН 3, энергия активации при этом снижается с 34 до 2 кДж/моль. 1

4. Установлено, что при нарушениях секреторной деятельности желудка протеолигическая'активность его cora проявляется при другом рН, не характерном для желудочного сока здоровых лиц. Так, повншекке триптотеского гидролиза бэлка у больных

с пониженной кислотность» желудочного сока обеспечивается

начальны:.! гидролизом белка желудочными'протеазами при рН 5 и выше. Нарушения желудочной секреции в отношении преемственного протеолиза могут быть компенсированными и декомпенсирован-ными и зависят от рН, при котором проявляли свою активность пепсины.

5. Внутривенное введение фракций гидролизатов пепсино-гена и трипсиногена вызывает изменения секреторной деятельности желудочных и поджелудочной желез, процессов мочеобра-зования и желчеотделения у собак и крыс.

6. П фракция гидролизата пепсиногена в два раза снижает секрецию и протеолитическую активность желудочного сока; малые дозы этой фракции в 2,7 раза повышают объем панкреатической секреции. Ш фракция на железы желудка не влияет, но в два раза снижает протеолитическую активность.поджелудочного сока. 1У фракция в два раза повышает протеолитическую активность желудочного сока.

7. Фракции гидролизата пепсиногена изменяют дыхание митохондрий печени крыо: введение малых доз П и 1У фракций уменьшают (в среднем на 30$) скорость потребления кислорода в присутствии субстратов окисления и фосфорилирования.

8. Введение 1У и У1 фракций гидролизата трипсиногена собакам и крысам вызывает увеличение активности пепсиногена (в среднем в 2,5 раза), протеиназ и амилазы поджелудочной железы собак (в 1,6 и 2,1 раза соответственно).'Эта фракция увеличивает желчеотделение (в 1,4 раза) и диурез (в 2 раза). Под действием этих фракций у крыо отмечаются такие же изменения.

Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии видовых различий реактивности животных к исследуемым препаратам гидролизатов.

9. В результате ограниченного протеолиза пепсиногена

и трипсиногена образуются биологически активные пептиды,обла-дашие регуяяторными свойствами и оказывающие действие не только на пищеварительную систему, но и на процессы обмена вещеотв (окислительное фосфорилирование).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Коротько Г.Ф..Чалаков А.К..Сухотерин В.Г..Саидбае-ва Л.М. О локализации процесса гидролиза пищевого белка в желудке //Мат.II конф.физиологов Узбекистана. Ташкент -1973,-о.132.

2. Саидбаева Л.М. О значении действия пепсина при различных, рН на белок для дальнейшего триптического гидролиза // Мат. Всесоюзной конф. "Ферментовцделительная деятельность пищеварительных желез и ее регуляция". Андижан - 1974,-0.239.

3. Чалаков А.К.,Сухотерин В.Г.,Саидбаева Л.М..Апраксин В.П., Аметова Л.И. О локализации процесса гидролиза пищевого белка в желудке //Мат.Всесоюзной конф."Фермантовыделительная деятельность пищеварительных желез и ее регуляция". Андижан-1974,-о.301-302.

4. Саидбаева Л.М. Гидролиз белков пепсином при различных рН среды //Сб.научно-исслед.работ ЦНИИ мед.вузов Узбекистана. Самарканд - 1974, т.2,_с«55 .

5. Коротько Г.Ф.,Чалаков А.К.,Сухотерин В.Г.,Саидбаева Л.М. О гидролизе пищевого белка в желудке //Физиологический журнал СССР - 1975, т.61е ЖЗ,-с.415-422„

6. Аблязов А.А.,Апраксин В.П.,Арипов А.Н.„Саидбаева Л.М. Функциональная организация гидролитической деятельности желудка //Тезисы 12 съезда Бсесоюзн.физиол.общества игл.И.П.Павлова. Тбилиси - 1975, т.2(_0о136о

7« Саидбаева Л.М., Нуритдинов Б.Н0 Гидролитические свойства желудочного сока больных в зависимости от величины его рН //Сб.трудов ЦНИИ мед.вузов Узбекистана. Андижан - 1975, т.3,"с.87-89 .

8. Л.М.Савдбаева. О возможности иоследования протеолити-ческой активности пищевого содержимого желудка и двенадцатиперстной кишки //Сб.трудов ЦНШ мед.вузов Узбекистана. Андизай 1976, т.3,-сЛ16-П7.

9. Саидбаева Л.М. Гидролиз балка пепсином и трипсинам при различном рН среды //Вопрооы питания - 1976, М,-о.45-48.

10. Саидбаева Л.М. Изменение.пептической п триптпческой атакуемостя белка под влиянием желудочного сока //Твз.У1 конф.физиологов республик Средней Азии и Казахстана. Ташкент-

1976,- с.102.

11. Саидбаева Л.М. Влияние желудочного сока здоровых и больных лвдей на атакуемость белка протеслитичесгсими ферментами //Мед.журнал Узбекистана - 1977, йЗ,-с.15-18.

12. Саидбаева Л.М. Аминокислотный оостав пептических гидролизатов различных белков в зависимости от рН среды // Тез.1У респ.конф.ШИЯ мед.вузов Узбекистана "Актуальные вопросы иммунологии, гастроэнтерологии, токсикологии". Ташкент-1978, т.4,-с.38-40.

13. Коротько Г.Ф.,Сухотерин В.Г.,Чалаков А.К., Саидбаева Л.М. Повышение триптической атакуемости пищевых белков в келудке//Вопросы питания - 1978, №1,-с.30-34.

14. Апраксин В.П.,Саидбаева Л.М.,Салахиддинов З.С., Су-хотеркна Л.А. Анализ процессов в гастродуоденальном комалек-. се (построение математической модели)/Дез. 13 съезда Всесоюзного физиол.общеотва им.И.П.Павлова. Алма-Ата - 1979,т.2, -

с.199. -

15. Саидбаева Л.М, .Апраксин В.П. Влияние конформацион-ных изменений на пептический гидролиз белка //Тез.У ресцубл. конф.ЩШ мед. вузов Узбекистана "Актуальные вопросы иммунологии,гастроэнтерологии и токсикологии". Самарканд - 1981, -

с.159-160.

16. Коротько Г.О,,Саидбаева Л.М. Продукты гидролиза пепсиногена как регуляторы секреторной деятельности пищеварительных желез //Физиол.журнал СССР - 1982, т.68, М , -0.463-468 .

17. Саидбаева Л.М. Влияние фракции гидролизата трипсиногена на секреторную деятельность пищеварительных желез // Мед.журнал Узбекистана - 1983, К 6 ,_с.24-26.

18. Саидбаева Л.М., Саттыев Р. Получение фракций гидролизата пепсиногена г трипсиногена //Теэ.Ш съезда физиологов Узбекистана. Ташкент - 1983,-о.147 .

19. Коротько Г.Ф..Сухотерин В.Г.,Саидбаева Л.М.,Алей -ник 9.А. я др. Роль ферментов пищеварительных желез в регуляции и саморегуляции их оекрешаууТез.14 съезда Всесоюзн.

■ общества им.И.П.Павлова. Баку - 1983, т. 1,-0.296-298 .

20. Саидбаева Л.М, Повышение атакуемости белков протео-«итическиш ферментами //Деп. ВИНИТИ "Депонированные научные работы" - 1984, *2,-с.836.