Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синтез и сравнительный анализ генов рецепторных серин-треониновых киназ, определяющих устойчивость злаков и пасленовых к патогенам и вредителям

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Синтез и сравнительный анализ генов рецепторных серин-треониновых киназ, определяющих устойчивость злаков и пасленовых к патогенам и вредителям"

/ - ВМАЗ

Па правах рукописи

ЗАЙЦЕВ Иалсрин Сергеевич

СИНТЕЗ II СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ГКПОВ РЕЦЕ11ТОРНЫХ СЕРИН-ТРЕ01П1Н0ВЫХ КППАЗ,

ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ УСТОЙЧНВОСТЬ ЗЛАКОВ И ПАСЛЕНОВЫХ К ПАТОГЕНАМ II ВРЕДИТЕЛЯМ

Специальность: 03.00.03— молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2002

Работа выполнена в лаборатории ДНК-маркеров растений ВНИИ сельскохозяиствеиной биотехнологии РАСХН.

Научные руководители: профессор, доктор биологических паук

Э.П. Хавкин профессор, доктор биологических наук Б,С. Пародицкий

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

A.C. К а ря rv на-Жу л и на доктор биологических наук A.B. Носов

Ведущая организация: Московская сельскохозяйственная академия им, К,А. Тимирязева

Зашита диссертации состоится " "_2003 г.

в_часов на заседании диссертационного совета Д.ООб.027,01

при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии но адресу: 127550, г. Москва,

ул. Тимирязевская, д.42, факс 977-09-47

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РЛСХН,

Автореферат разослан " "_200 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

O.A. Меликова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Для борьбы с болезнями и вредителями растения выработали широкий арсенал механизмов устойчивости. Одним из них является распознавание патогена и передача сигнала для запуска защитного ответа. За специфическое распознавание многих патогенов отвечают серии-треониновые кинаэы, которые взаимодействуют с белками патогена но механизму рецептор-лиганд. Такое распознавание приводит к акта ваши факторов транскрипции к синтезу белков, уничтожающих патоген.

Ре цеп торные сери н-треон и новые киназы (PK) растений изучены достаточно подробно (Ellis et а)., 2000; Hammond-Kosack, Jones, 1997; Michel more, 2000; Tom, 2000; Young, 2000). Структура PK растений и животных обнаруживает высокую консервативность. В составе этих белков выделяют несколько функциональных доменов, наличие которых является основой для структурной классификации PK (рис, 1).

ESS—Ш

□ 1»

ШШк—^—ШШШШШ 16

Г ' г

1 I' ■""

Ну клеста д-

Сбй'!Ываюший

домен

g£S?Sfl T[R-домен

У777Л 1-^-до««'

Е

□

LRR-домеп

Протеи н-киназа

Тр;шсмсм бранный домен

Рис. 1. Основные структурные классы РК., участвующих в устойчивости растений к болезням и вредителям. Гены-прототипы: 1а - í/ген устойчивости табака к вирусу табачной мозаики, L6 - ген лчна устойчивости к листовой ржаачнне (Aíelampsora Uní), 15 - Rx ген устойчивости кэргси[«.1Я к вирусу X, СгеЗ - ген устойчивости пше(!Иць> к корневой нематоде (Hcterodera avenae), Frf - ген устойчивости томатов к бактериальной пятнистости томатов (Р, syringaae pv. tomato)', 2 - Cf - ген устойчивости томатов к бурой пятнистости листьев (Cladosporium fb¡vuni}\ 5 - Xa 2! - ген устойчивости риса к бакгериалыюй пе.юсатости {Xútiihomonas огу-ае pv, oryzae)\ 4 - Pto - ген устойчивости томагов к fifi 111 и щ.нпП тттщцтппи JP

^ ЦНБ MCXA

Фонднау^ой литературы)

з №

« • г«рпип лк

¿-35038

r-i.

TIR домен, названный так вследствие гомологии с белками Toll дрозофилы и imerIeukin-1 человека, предположительно, отвечает за связывание с факторами транскрипции защитных белков (Cohn et al., 2001) и специфическое распознавание патогена (Luck, 2000). В нуклеотид-связывзющем участке (nucleot ¡de-binding site, NBS) происходит присоединение трифосфата, с помощью которого киназа фосфорилируст молекулу следующего участника сигнального каскада, в результате чего активируется транскрипция защитных белков (Li et al., Ï997). LRR домен (Jeucine-rich repeat, участок*, богатый лейциновыми повторами) отвечает за специфическое распознавание патогенов (Fluhr, 2001), В пределах каждого нз эгих доменов можно выделить несколько участков, консервативных для большинства РК устойчивости. С помощью прайм еров, соответствующих этим участкам в составе ДНК, были амплифицированы и клонированы многочисленные фрагменты и полиоразмерные гомологи уже известных генов устойчивости (РК, или NBS-LRR гомологи), что позволило получить принципиально новые данные о структуре этих генов, их д и версификации путем дупликации и дивергенции, роли внутримолекулярной рекомбинации и ретротранспозонов в эволюции РК генов устойчивости и механизмах коэволюции патоген - растение-хозяин (Berge 1 son, 2001; Ellis, 2000; Michelmore, Meyers, 1998; Richter, Ronald, 2000). В настоящее время изучение структуры существенно опережает функциональные исследования РК устойчивости и кодирующих их генов: анализ аллельного полиморфизма и выявление последовательностей РК, распознающих индивидуальные формы (расы, штаммы) патогена, а также установление связи тех или иных аллелей РК генов с фенотипическими признаками устойчивости или чувствительности к болезням и вредителям. Функциональный анализ РК генов устойчивости открывает путь для их использования в молекулярной селекции растений в качестве ДНК зондов, маркирующих признак устойчивости, или хозяйственно ценных аллелей, пригодных ддя генетической трансформации растений,

С практической точки зрения, изучение РК генов и кх РПК гомологов открывает новые возможности для создания новых форм сельскохозяйственных растений, устойчивых к болезням и вредителям. ДНК маркеры признаков устойчивости на основе фрагментов РК генов устойчивости можно использовать для поиска новых селекционных источников в генетических коллекциях и ускорения селекционного процесса. Полноразмерные последовательности РК генов, выделенные прямой амплификацией геномной ДНК или из геномных библиотек, могут стать целевыми генами для генетической модификации растений.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось получение фрагментов генома злаковых и пасленовых растений, представляющих основные классы РК генов устойчивости растений к бактериальным, вирусным и грибным патогенам, и их сравнительный анализ, а также изучение возможности использовать эти фрагменты

генома в качестве ДНК маркеров генов и признаков устойчивости у различных видов сельскохозяйственных растений. В процессе работы предстояло решить следующие задачи:

1. Синтезировать гомологи РК генов устойчивости путем амплификации геномной Д>1К растений методом полпмеразной цепной реакции (ПЦР) со специфическими праймерами и клонировать полученные фрагменты генома.

2. Идентифицировать синтезированные РПК гомологи генов путем анализа их нуклеотидных и производных аминокислотных последо вате л ьностек,

3. Сравнить полученные РПК гомологи г-енов с уже известными генами устойчивости путем компьютерного анализа с использованием генетических баз данных,

4. Изучить возможность использовать РПК гомологи генов устойчивости в качестве гибридизационных зондов в КР1_Р анализе.

5. Провести сравнительный анализ полиморфизма РПК гомологов и кодирующих их генов в пределах семейств злаковых и пасленовых растений, используя нуклеотндные и производные аминокислотные последовательности и результаты рестрикциокно] о анализа.

6. Провести анализ косегрегацни полученных гомологов с фенотн п ичес к и ми проявлениями устойчивости растений.

Научная потопа. Клонированы к охарактеризованы 23 новых РПК гомолога генов устойчивости, к том числе 4 нолноразмерных последовательности. Получены новые данные о структурном полиморфизме четырех классов РПК генов устойчивости в семействах злаковых и пасленовых растений.

Практическая значимость. Показана принципиальная возможность использовать гомологи РК генов устойчивости в качестве ДНК маркеров для селекции растений па устойчивость к болезням и вредителям. РПК гомологи генов устойчивости, выделенные нами из дикорастущих сородичей картофеля, пшеницы, ржи и томатов, могут оказаться перспективными для трансформации этих культурных растений.

Структура н объем диссертации. Диссертацийнпая работа состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", "Заключение", выводов и списка литературы, включающего 134 библиографических ссылки. Работа изложена на 139 машинописных страницах, содержит 30 рисунков и 9 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РЛВОТЫ

Матери ил 1.1 и методы исследования

Растительный материал. В работе использовали растения многолетней ржи Seeale montan um Guss. sap. kuprijanovii (k9584, k9585, k9669 по каталогу ВИР) и однолетней ржи S. cerealе L., сорт Россиянка (kl0838), и Саратовская б, а также многолетний гибрид двух видов ржи -рожь Державина (S. cereak 1.,, сорт Державинская 29, k95S¡ ). Кроме тою, исследовали формы Иммунная 4 и 5 (соответственно, к]0962 и кЮ%3), отобранные из сортов Державинская 29 и Россиянка на повышенную устойчивость к грибным болезням. Семена всех этих форм ржи, за исключением сорта Саратовская б (НИИСХ ЦРНЗ, Немчиноака, Московская обл.), были предоставлены Отделом серых хлебов ВИР (С, Петербург). Семена пшеницы ( Thtwtim acstivum L.), сорт Саратовская 29, устойчивой и чувствительной к листовой ржавчине (ген 1^21), были предоставлены ШШСХ ТОго-Востока, Семена пшеницы Thatcher, несущие гены устойчивости Lr2, LríO и Lr¡6, были получены из НИИСХ ЦРНЗ. Семена пшеницы сорта Chinese Spring, Аврора, Кавказ; пырея {A grору ton elongatum L.), сорт Ставропольский 10, и пшенично-ржано-пырейного гибрида, клон 199, были получены из Ставропольского НИИСХ. Пробирочные растения картофеля Solanum tuberosum ssp, tuberosum L,, сорта Клинский, Удача, Никулинский, Скороплодный, Россиянка, 971, Лорх, 1672, а также дикорастущих форм Solanum: S. berthauSui Haivkes (CÏP, Лима, Перу, Pi 218215), S. chacoense Bitt.(PH33708) и S. verriet BUt. et Wittm. (Pi 230468) были получены от JI.M. Хромовой (НИИ картофельного хозяйства, Коренево, Московская обл.), семена S. nigrum L. предоставлены О.О. Дзюба (ВИР, С. Петербург), а растения dulcamara L, были собраны в Ботаническом саду Московской сельскохозяйственной академии.

Геномную ДНК выделяли из зеленых листьев проростков с помощью модифицированного метода Sagai Maroof (Sagai Maroof et al., 1984). Все генноинженерные манипуляции проводились по стандартным методикам (Sambrook and Rüssel, 2001). Для клонирования фрагментов ДНК использовали лабораторный штамм Е, coli DH5. Саузерн-бдоттинг и гибридизацию фрагментов ДНК проводил я по лротоколу фирмы Amersham.

Для идентификации клонированных последовательностей, нахождения ближайших гомологов фрагментов генов, множественного выравнивания последовательностей и построения дендро грамм использовали базы данных и программы NCBI ( ww%v. ncbi, n)m.n th. go v/Gen Dank/Gen Bank О vervicw.html), HMBL

(www.ebi.ac.uk/embl/) и DDBJ (www.ddbj.nig.ac.jp), а также резидентные программы DNAstar и Oligo (Molecular Biology Insights, США), Последовательности охарактеризованных гомологов депонировали в

Ге г ¡банке N081, В таблицах и на рисунках указаны номера регистрации этих последовательностей.

Результаты

Выбор прайм еров для амплификации геномной ДИК. По

литературным данным и на основе множественного выравнивания последовательностей были сконструированы олнгопуклеотиды, распознающие консервативные участки в четырех классах уже известных РК генов устойчивости (табл. I, рис. 2).

Ь

тт

КВЗ-кшнпа

кн

п пи

L,RR

16

1Р

М ВЯ-книа1я

ВП

АР С

хк

ви гкс нг с СР с

э ли

ькк

□ РК

ЛШ

3 ск

<ж

Киназа

СУ

□ СИ

ЕГ

Кпна?а

Е11

Рис. 2. Схема амгишфикаини гомологов генов устойчивости. См. таблицу 1.

Таблица 1, Праймеры, использованные для амплификации МВЗ-ЬКК гомологов РК генов устойчивости у различных видов растений.

Геп- црОТОТИ!! Домен Консенсус Праймер | У-З' Последовательность 1 прямого (?) и обратного (К) ираймера (см, рис. 2) | Темпер, отжига, V Источник а!-, 1993

СгеЗ пшеницы N»3-кннаэа АПСРШ АР ! (£а1а««£а!еа181с1ей ЛЯ ( у £сис на! даасссис 45

Нч11гг1 ячменя ЫВ8-киназа СУОКПЪ ВР 1Ж за ё«(> ассшаееагс 45 РеНкч е<а1., 19ЧУ

Хо21 риса Киназа СР Сй сеассаа«1&и^&пс1 ее 55 *

N табака. 1.6 льна, ¡(¡'$2 ара-бкдопенеа ЫВЗ-кнназа GGVGK.1T ОД-ЛЬ БР ЕВ | ЁВК^'й)1 ¡ЕЙ130' 45 а а!., 1996

Гш томата Кнназа МвЙКУЯ ЬР ЕЕ аиса(ёееаа£саа^1а«с tgaaacaaggatt'cacag 45 МдПш 1 !993

Кх2 картофеля ЦЧ^ЕМ РР РК "геё'е^еааееахие aaauttcaaggtlggцcag 5. *

Тот же | ЬЯЯ Е1ЛУЛУК(] аг-ся е« еаач 1ЁСК зесёйааИс 55 9

Тот же LRR • ЬХ'А'АУШ 08)Р!Ф НР нк gagtшgggctgtagagggg аа(е(сеа$ееа(!йаа1сс 50 * \ :

Тот же 51,МКТ1 рр 1е^сисссна1£апаасса1ас 52 | - ! 1

"Данная работа.

В

Выделение и идентификация гомологов генов устойчивости к патогенам из растений семейства злаковых (Роассае) Гомологи гена устойчивости пшеницы к нематоде СгеЗ. Геп СгеЗ определяет устойчивость пшеницы к корневой эндоплазм этической нематоде Heterodera avenae (Lagudah et al,, 1997). Кроме того, фрагменты этого гена оказались маркерами нескольких генов устойчивости пшеницы к листовой и стеблевой ржавчине (Scah et al,, I99S, 2001). Анализ производной аминокислотной последовательности гена СгеЗ показал, что в его составе можно выделить несколько высококонсервативных участков, сходных с белковыми продуктами других генов: генов RPM¡ и RPS2 устойчивости араб i (до псиса к* Pseudomonas syringae pv, (ornato и pv, maculicola (Bent et al., 1994; Grant et al., 1995; Min dr mos et al., 1994), гепаЛг

Рис. 3. [>.. i, i: !,i ачнянфнкании геномной ДНК с мраймС]Томн, распознающими кочссриатнвныс г: о с Д сч1. at v. ■ ь ч о с г ; г NBS-кипалнОГО участка PK генов такой. (а) Ген у Стой1 го воет и пшеницы к нематоде ('re i, 1 - Маркер молекулярного веса. Gene Ruler Ikb DNA Ladder; 2 - Trhicttm ¿lesrivum, сорт Chinese Spring; 3-7* aesiivum, сорт Аврора; 4 - Т. í/ev/ívuwf, сорт Кавказ; 5 - Aí-ropyran elongatum, сорт Ставропольский 10; 6 - Пшеиично-ржано-пырейный гибрид, клок 199, 7 - Secale cérea! е^ сорт Саратовская 6; Я - S. mortianum ssp. kup>ijuno\:ü\ 9 -положится 1>ный контроль, S. es>reale, форма Иммунная 4 (AF2S12S4); 10 -отрицательный контроль (без ДНК}, (б) Ген устойчивости ячменя к л иеговой ржзочшге HvLrrl. ],2- Т. aesiivum сорт Саратовская 29 (формы чувстпительиая и устойчивая к листовок ржавчине, Lr2i); J - Т. aesiivum сорт Аврора, 4 — Т. aesuvuni сорт Кавказ; 5 -Т. uestitum сорт Chinese Spring 6 - ПРПГ, клоп 199; 7 - Agropyron ehn^uium, сорт Ставропольский 10; S -S. ntoníanum ssp. kuprijanovii; 9 -S. cercóle. сорт Саратовская б; 10 - отрицательны» контроль.

устойчивости табака к вирусу табачной мозаики (Whitham et а!., 1994) и гена L6 устойчивости льна к ржавчине льна (Lawrence et al., 1995).

Чтобы получить ДНК зонды к генам листовой и стеблевой ржавчины пшеницы и ржи, мы использовали пранмеры AF и AR, распознающие консервативные последовательности гена СгеЗ, для амплификации геномной ДНК нескольких видов злаков (табл. 2). Во всех

случаях был обнаружен фрагмент длиной приблизительно 500 п.н. (рис За), что соответствует расстоянию между положениями прайм еров в исходной последовательности гена СгеЗ. Амшшфтшрованныс нами участки генома пшеницы, ржи и пырея соответствуют ХТЗЗ-киназпой последовательности белка, в которой присутствуют характерные консервативные участки ЫЛ/ЬО, Т(Т/5Ж, 0(Ь/8)РЬ\(А/!/Ь), СГ(АД-)УС(5/Л). Все полученные нами фрагменты генома оказались в разной степспи гомологичны гену-прототипу СгеЗ (табл. 2). Гомология между клонами, выделенными изо ржи, составляла 97-98%, клоны выделенные из пырея и пшеницы обладали гомологией 88% и на 80% были сходны с клонами ржи, кроме того, при амплификации генома подсолнечника с указанными выше праймерами мы также получили фрагмент, равный 500 пар нуклеотидов. Интересно отметить, что этот клон оказался близок к гену-прототипу и обнаружил 98% гомологию с фрагментами, выделенными из 5. тошапит.

Таблица 2. Характеристика гомологов гена СгеЗ, выделенных из растений

*% гомологии поел едо вательности

ну к л еотид н о и/произ вод н ои

Гея Сходство с геном- Источник гомолога Genbank

прототип прототипом * accession

СгеЗ 88/ïl $, сегеа!е AF2S Ï2S4

(AFÛ52641)

Тот же 89/82 £ сегеЫе AF2812H5

Тот же 88/82 S сегеа'.е AK281236

Тот же 8S/82 A. donnât um AF320288

Гот же 77/59 T. aeslivum AV?20:S9

амннокислотнои

NBS-LRR гомологи гена IfvLrrI устойчивости ячменя к листовой ржавчине. Ген LrlO определяет устойчивость пшеницы к листовой ржавчине {РиссШа recondita). При изучении этого локуса у разных видов злаков Feuillet и соавт, (1999) обнаружили, что в нем находится несколько генов, относящихся к разным классам, в том числе LZ-NBS-LRR ген HvLrr} ячменя. С праймерами BF и BR мы получили несколько фрагментов, из которых нас интересовали ампликоны длиной 550 п.н, (рис. 36, табл. 3), что соответствует расстоянию между праймерами в гене-прототипе. Производные ам и i го кислотные последовательности этих фрагментов содержали характерные

консервативные участки GVGKTTL, VLDDVW и TSR. Гомология между синтезированными последовательностями составляла 84-87%.

Таблица 3. Характеристика гомологов гена ячменя HVJLRR1,

выделенных из растений ржи, пшеницы и пырея

Ген- Сходство с геном- Источник гомолога Gcnbarik

прототи п прототи пом* accession

HvLrr) 89/91 S. томата» AFS20290

ячменя

(AFI 0800$)

Tor же 86/36 A. e/onpatum АКЗ20291

Тот же S4/S2 Т. aestivum AF320292

*% гомологии нуклеотидной/пронзводиой аминокислотной поел едовател ьности

Гомолог гена Ха21 устойчивости риса к XantUomonas oryzae. Белок гена Ха2! (U37133) обеспечивает расоспецнфическую устойчивость риса к патогену Xantho monas oryzae pv. oryzae, и принадлежит к классу PK генов, кодирующих LRR домен, транс мембранный домен и киназный домен,

С прайм ерам и, распознающими консервативные

последовательности гена Ха2}> мы ам п л н фи ци ро вали и клонировали из геномной ДНК пшеницы один единственный фрагмент размером 500 п.н. (AY072046). Анализ этого фрагмента показал, что он является Слизким гомологом гена Ха21 и кодирует серни-треонпновцн кнназный домен. Гомология с reí юм-протон том составляет 84%. Кроме того, выделенный нами фрагмент генома пшеницы обнаруживал существенное сходство (30% гомологии) с двумя другими структурными гомологами X'а21\ генами развития арабидопснса CLAVaTAI (U37133) и ERECTA (I147029).

Выделение н идентификация гомологов генов устойчивости из растении семейства пасленовых (Sola па оса с)

Гомолог Л BS — киназного домена генов устойчивости. Из числа гомологов генов RPS2, .V и L6, полученных путем амплификации ДНК нескольких видов Solarium с п рай мера ми DF и DR (рис 4 а), мы клонировали и секвенировали три ампликона картофеля (450, 500 и 750 п.н„ AF2812S1, AF2SI2S2 и AF2S1283), сходных с фрагментами генома картофеля, описанными ранее Leister el al. (1996). Только один из этих ампликонов (AF281282) был сходен с геном-прототип ом N табака (ААА50763) (52/64 % гомологии с пуклеотидной и про;« подпой аминокислотной последовательностями).

Рис. 4. Результаты амплификации геномной Д! ьидои Sotar шт с прайм ерами, распознающими консервативные последана: елъностн PK reno« устойчивости, (a) NBS-киназный участок гена табака Л'. Праймсры DF-DR 1 - Маркер молекулярного веса ДНК (Gene Ruler 1 kb DNA Ladder); 2-6 - геномная ДНК (2 • Solanum tuberosum (сорт Никулинский); 3 - Ä. bertaultlt; 4 - S. vermi; 5 • S rfwcoense; 6 ~ S. dulcamara); 7-1) -положительные контроли: 7 - AF2S12SI; S - AF2SÍ282; 9 - AF2S1283; !0 -отрицательный контроль, (б-г) I.RR последовательность гена Rx. Праймеры (6) FP-FR; (в) HF-HR; (г) GF-GR. 1 - Маркер молекулярного веса ДИК {Gene Ruler I kb DNA Ladder); 2-7 - геномная ДНК (2 - S. tuberosum (сорт Клипс кий); 3 - S. wriieí; 4 - Ж chacoeme; 5-5 bertauItU, 6 и 7 - S. nigrum); 8 (в) - положительный контроль, клон AF362366; S (б и г) и 9 (в) - отрицательные контроль, (д) Кнназная последовательность гена Гш, П рай меры EF-ER. 1 - Маркер молекулярного веса ДШС (Gene lítiler ] kb DNA Ladder); 2-7 - геномная ДНК (2 - Solanum tuberosum (сорт Клинскнй); 3 - S vmie:; 4 - 5 c/uicoense, 5 - 5. bertauhii; 6 и 7 - S. nigrum); 3 - отрицательный контроль.

Гомологи гена Rx устойчивости картофеля к вирусу X. Последовательность LRR является наиболее специфичным участком PK, поскольку обычно именно он отвечает за распознавание патогена. Амплификация с тремя парами лраймеров (EP-ER, IT-FR и GF-GR), фланкирующих LRR- последовательность, позволила получить фрагменты ДНК длиной 1100, J 200 и 1400n.it. (рис 4 б-г).

Анализ полученных последовательностей и сравнение их с уже известными генами позволили идентифицировать несколько гомологов (табл. 4). Фрагмент, выделенный из S. nigrum (AY055116), обладает гомологией с геном томата Мг-1, который отвечает за устойчивость к корневой нематоде томата и тле картофеля (AF091048, Milligan et а!., 1998) и геном Prf устойчивости томата к бактериальной пятнистости (U65391; Salmeron et al., 1996), Другие LRR последовательности, выделенные из генома различных видов Solatium, были сопоставлены с их прототипами - белками Gpa2/Rx] генов устойчивости S. tuberosum к вирусу картофеля X к нематоде картофеля, описанными Bendahmane et al., 1999, Gebhardt and Valkoncn, 2001 и van der Vossen et al., 2000, и гена Rx2 устойчивости S. acauii к вирусу картофеля X (Bendahmane et al., 2000), a также с белком близкого по строению гена Bs2, который определяет устойчивость сладкого перца к бактериальной пятнистости томатов (AF202179; Tai et al., 1999)). Гомология с этими последовательностями составляет 70-90%. Все вышеперечисленные последовательности относятся к LZ-содержащим NDS-LRR генам. Мы также выделили из генома S. chacoertse почти полноразмерную последовательность, гомологачную на 82 % гену-прототипу Rx.

Таблица 4. Характеристика гомологов гена картофеля Rx, выделенных из _растений трех дикорастущих видов Solaaum.

Ген-прототип \ Сходство с I Источник гена | Gen ban к

; геном: прототипом* accession

Ш-1 (AF04104S) ! R6/79 Solarium nigrum [ AY055116

Rx2 (AJ21944S1 92/78 ■S' chticotmc | AF362365

Гот же 96/75 X berthauUii 1 AF362166

Тот же 89/77 S. nigrum 1 AF421S98

Тог же 94/Я2 .4. chucoensi' \ AY090566

*% гомологии ну клеотидной/про из водной аминокислотной поел едо вател ьности

Гомологи гена устойчивости томатов к бактериальной пятнистости Pto.

Ген Pío сообщает томатам устойчивость к бактерии Pseadrtrr.onas syn'ngae pv. tomato, которая несет ген а вирулентности avrPto (Marti n et al., 1993a). Pío входит в мул ьти генный локус размером около 40Ö kb на хромосоме 5 томатов (Martin et al„ 1993b). Другой член этого семейства ген Fen, на 80% идентичный Pío, определяет устойчивость томатов к инсектициду фентиону (Martin et а!., 1994). Оба гена относятся к одному классу PK генов, кодирующих сери н-трео ни новые киназы, и они тесно сцеплены в одном локусе (Loh and Martin 1995, Martin et al., 1994).

На основе праймероа EF и ER, распознающих последовательность гена Pto, мы а модифицировал и (рис. 5 д) и клонировали несколько фрагментов ДНК длиной приблизительно 1200 п.н. и получили полноразмерные копии пена, на 84% гомологичные гену-прототип у (табл. 5). Клонированный из S nigrum фрагмент ДНК - это, по всей видимости, полноразмерный ортолог Pío гена Lycopersicon, однако мы не знаем, какую физиологическую функцию выполняет этот ген у Solanum. Другие структурные гомологи Pto - это псевдогены, содержащие несколько стоп-кодонов. Помимо непосредственных ортологов генов Pto я Fen культурных и дикорастущих форм Lycopersicon и гомологов Pto из Solanum (Vleeshouwers et al., 200J ), охарактеризованные нами клоны обнаруживают сходство с предполагаемым PK-геном Oryza ja»'va (AL035679), функция которого пока неизвестна.

Таблица 5. Характеристика гомологов гена томатов Pto, выделенных из

растений трех дикорастущих видов Solanum,

Гек-прототип Сходство с геном-прототипом* Источник геиа Genbank j accesión

Рю (U02271) Я9/77 Л', chámense AF3Î2SS9

Тот же 90/90 S. nigrum AF42IK97

Тот же 81/73 S. dulcamara AF332m !

*% гомологии нуклеотндпой/произ водной аминокислотной последовател ы! ости

ДНК зонды н ДНК маркеры на основе NBS-LRR гомологов РК генов устойчивости

Для проверки возможности использования полученных последовательностей в качестве зондов для RFLP анализа мы провели гибридизацию геномной ДНК пшеницы, ячменя и картофеля с мечеными фрагментами гомологов РК генов (рис 5). Мы провели

гибридизацию с одним или несколькими гомологами каждого из генов.

1 2 3 4 , 5 6 7 8 9 10

1. 2 3 4 5 6 Т

•Voí

,s iré, Su*

';■■,'■}• :'■•-. ifr -v.-.

: пт^^ж ¿■ni ■ - ■ ' ,¡ ■ "..: y;, ■ •••

'4Ï

*T

Ч'У ■üt

i

i" .i*. ■' ■.'I

¿T~2 .'3' ;:*4;' 'S - в

* ' ... ■

б'.

■ ■

*-Ч! Г Tí"- ¿ • ч " '■ -"-¿.К

1 Í 5 4 Ï в 7 S

Ii;

ft 10 11 12 13 1411 16 17 ÍB 19 l'a 11

I . м « tí La Ú. . Tí ■< j£. ft v: .

Рис, 5 a. RI-LP полиморфизм геномной ДНК сортов Trili'cum aûsiivum, различающихся по устойчивости к листовой ржавчина. В качестве гибр и дтаин одаого зон;и использовгин NlíS-содсржащий фрагмент пшеницы AF320292. Рсстриктдаы: (15) IИтЛí]-EcoRI-i'foRV; (6-Ю) №WlIW\c-oRI-/VI. В треках 1,6 сорт чувствительный к листовой ржавчине, остальные сорта содержат ц:ны устойчивости к разным расам патогена: !,б - сорт Саратовская 29 (Lr2!, чувствительная форма), 2,7 - сорт Саратовская 29 (Lr21, устойчивая форма); 3,ï - сорт T hatcher Lr2\ 4,9 - сорт Thatcher irlO-, 5,10 - сорт Thatcher Lrl6.

Гнс. S б-д. RÎ-'LP полиморфизм геномной ДНК сор rou Solanum tuberosum. В качестве зоила использовали последовательности: б - NBS- кнндаш.то фрагмент ÍAF2SI2S2); в и г - LRR фрагменты AF362365 и AF421S95. Рестриктазы: 5 - Mspl-Fstl; в, л - Bind Ш./fcoRI; г - HinM\-FcoRV. ! - Удача; 2 - Никулинский; 3 -Скороплодный; 4 - Россиянка; S -971; 6 -Лорх; 7 - 1672,

Рис. 5 е. R-FLP полиморфизм ]"сном ной ДНК сортов Sn/^nuni tuberosum. В качестве поила испольчовали н одноразмерный гомолог гена Рю hü S. dulcamara (AF3328SS). Рестриктазы: 1-7 Msp\-Pstl; 8-М ВвтЧ 1-Dra I-A-ftpI; 15-21 //«х/Ш-ЛсеЮ 1 - Улача; 2 - Никл-дннский; 3 - Скороплоди^С; 4 - Россиянка; 5 - 971; 6 - Лорх, 7 -1672,

В результате этого анализа мы обнаружили, что в сравнении с LRR последовательностями NBS-киназные и киназные фрагменты выявляют наибольший полиморфизм. Однако при этом NBS-киназные гомологи гена Cri'3 и киназные гомологи гена Ха2! не обладали способностью к гибридизации.

Результаты RFLP анализа показали, что наибольший полиморфизм выявляется при гибридизации с NBS-киназными фрагментами генома злаков и пасленовых. Так, при гибридизации геномной Д11К пшеницы с гомологами HvLrri (AF320290) в каждом из треков наблюдалось от 4 до 6 фрагментов, спектр которых в основном был везде идентичен. Две формы пшеницы: Саратовская 29 и Thatcher - отчетливо различались между собой (соответствующие полосы указаны стрелкой). Гибридизация с геномной ДНК сортов картофеля, различающихся по устойчивости к раку, с NBS-содержащим фрагментом (AF2S12S2) выявила RFLP спектр, который был представлен 7-12 фрагментами ДНК (рис 5 б). При гибридизации геномной ДНК картофеля с LRR последовательностями (AY0S5116, AF362365, AF42IS9S) RFLP спектр был представлен 2-5 фрагментами (pite 5 в-д). RFLP анализ картофеля с использованием в качестве зонда гомолога гена Pío (AF421897) выявил значительный полиморфизм у всех представленных сортов картофеля (рис 5 е): спектр рестриктных фрагментов включал от 9 до 12 полос.

Для ответа на вопрос, пригодны ли полученные нами гомологи в качестве ДНК маркеров признака устойчивости к болезни, мы

16

исследовали косегрегацию зонда АР281282 с проявлениями признака устойчивости к раку картофеля. При атом мы обнаружили отчетливую косегрегацию с признаком устойчивости картофеля к раку. У всех устойчивых сортов картофеля был обнаружен фрагмент (отмечен стрелкой), который отсутствует у чувствительных и наоборот (рис. 6).

т . л..

Е* ^ Я Я ^ . 8

■г-'

'АтМ»? 4 •• -

Г..- '.'.:■

Рис. 6. Косегрегацни с признаком устойчивости к раку геномной ДНК сортов $о!апит шЬегоыт. В качестве зонда испо.пюонзли поел ело ватспьп ость киназного фрагмента (ЛР251282). Рестриктазы .\hp\-Psi\: 1-4 сорта, устойчивые к раку картофеля. 5-7 - сорта, чувствительные к раку картофеля, 1 - Удача; 2 - Никулинский; 5- СкороплоднмЙ; 4 - Россиянка; 5 - 971; 6 - Лорк; 7- 1672.

К - устойчивые сорта; й - чувствительные сорта.

ОБСУЖДЕНИЕ

Наличие в структуре РК генов консервативных участков позволяет использовать прямую ПЦ!1 амплификацию геномной ДНК для получения гомологов генов устойчивости. В последние годы этот подход широко используется во многих лабораториях, и к настоящему времени общее число охарактеризованных МВЗ-ЬКЛ гомологов генов устойчивости приближается к тысяче, В большинстве случаев функции этих гомологов до сих пор остаются неизвестными. Вместе с тем, этот подход позволил получить много новых фактов, объясняющих происхождение и диверсификацию РК генов устойчивости и важных для понимания вертикальной устойчивости растений к болезням и коэволюции патогенов и растений-хозяев.

На основе предшествующих исследований и анализа генетических баз данных мы синтезировали специфические праймеры, распознающие консервативные участки, характеризующие четыре из пяти структурных классов РК генов устойчивости. С помощью этих и рай мерен мы амплифицировали фрагменты генома, соответствующие КВЗ-киназному и ЬИК доменам рецепторных белков, а также четыре полноразмерных последовательности. Анализ производных аминокислотных последовательностей полученных фрагментов генома показал, что они являются близкими гомологами белков, кодируемых генами-прототипами,

и а них присутствуют характерные консенсусы. Сравнительный анализ позволяет выявить более широкий круг гомологов выделенных нами фрагментов генома среди генов устойчивости к болезням и вредителям у различных в систематическом отношении видов растений (табл. 6).

Среди последовательностей, гомологичных гену СгеЗ, мы находим несколько гомологов гена СгеЗ у пшеницы н эгилопса, а также большинство генов устойчивости или их КВ5-киназпыс гомологи, подробно охарактеризованные у пшеницы, ячменя, кукурузы и риса, а также у арабндопсиса, латука, картофеля, томатов и фасоли (степень гомологии 30-40 %), Подученные последовательности содержат характерные аминокислотные последовательности, которые характеризуют данный класс РК генов: ЫЛЪО, Т(Т/$)К. С{Ь/5)Р1.Л(ЛЛ/Ь), СР(А/Ь)УА) (рис. 7).

gvsg5gkstl gmggsgkttl gecgvgkttl gmggigkttl gmfglgxttl g^ípgsgkttl

7 g'-'ggvgktt i

8 gkggigkttt 3 gmc-g l gxttt

f-rfllvbddvwi KK'.'IVVXDDVwj KRPLLLXX)DVW P.RYLVVIDDI}¿

kp.yli vlddvw

KKVLIVtDDip ГКILVVLDDVp SKILWLDDVg

GSKII.VTTRSK GSRVMtíTTRDM KCKVMFTTRSI GSRILLTTRNV RSRIILTTRLN-

gsriilttrek

GSRTIIÍTRDK QSRFIITSRSM GTRFII^SRNQ

kgs piaa д t v'gg cglpiaiaslgs gglpialit7.gg gglpxaitviag Rglplsvvlvag kglplvagl:ag

KGLPLALKVk'CS AGIPLTLKVIGS GGLPLTLKVTG5

RRCFAÍCS KRCFLYCS RSCFLYCA KPCFLYFA Ki^CF^YFG VICFNEIG

IACFLRGS TDCKFYPA SICKFYFK

RLWMAEGF;RNT

RMVMAÍKFVEPI EY'A'VGEGFLTSS ELWPVEGFLK'BE KLWVAEGFVQAN VILGAEGFVEXT

7 chigtveygl.ril

8 RIWSAEiGrütX

9 klyakesgvkye

Рис. 7. Сравнение консервативных участков М118-кнназного домена производных аминокислотных последовательностей генов-прототипов устойчивости. 1-6 - гены; 7-9 - гены. ! - С г 1-3 пшеницы; 2 - ft^*ЛÍ^

аркбидопснса; 3 - арабидонсиса; 4 - Лт картофеля; 5 - Рг/ томатов; 6 - Л!7 томатов; 7 - Л? табгка; 8 - ¡А льна; 9 - М льна.

Анализ последовательностей, гомологичных NBS-киназному участку гена MvLrrJ ячменя выявил гомологию с генами двудольных

растений: RPM1 арабидопсиса и 12 и Prf томатов (соответственно 54%, 52% и 48%).

■ S.C.-(AF281284)

s.o. • Сгез (AF;ai2ee)

Н.». - Creí

S.C. - СгеЗ (AF2812S5) Т а. • С/вЗ (АГС5264)) Tv - У6(АГ1ЬвСЭЬ! L.e.-Cfíí (AF3202fl8) Т.*. - Cre3(AF3202B9) Zm -ф; (АМ66Э31) A!. -ftpsí(AF3«e305)

B.п. -Rpi2 (AF410476) L e - I2(AF118127)

H.V .Mjt(AycMaea)

я H ». - HvLrrt (AF10301t) j-p1 Hí. - HvLrr 1 (AF10aai2)

L s.m. - HvLm (АРзгогао)

--т.«.-HvLrr-f (AF320292)

U.V. -HvlTt (AFIOSCtS) L.e.. HvLrrt <AF320291) 2.m. - РЮ12 (AF056T52) AL-RPJWf(AF-! 22382} A t. - RPM1 (NM„111564)

C.i. . HPM1 (AF4S7SK) S.t-Z2(AF281282) S.1 (T077SS) Ng.-N :A;48IU) Lu -1.6(T18M7) Gm - LtM (AACCOTSI) C.» - Í?PF5(AFJS623S) A.t. - RPPÍ (АУ0Э1ШЗ)

j-1 si,-W)!(Ajoiieoi)

1-1 s.b. - Rx (AYf)90S6í|

Le.-ММ(АРСда&81) L.e. - Prf (AAF76312)

1-1-1-1

Рис. 8. Сравнение юшазных доменен белковых продуктов PK генол устойчивости и их гомологов, 1-5 - гея СгеЗ устойчивости к корневой неметоде и его гомологи: 1, 2, 4 - Sécele cereal?; 3 - flehantu ч annus; 5 — ген Creí Т. aes/iviim; 6 -гомолог V6 HS Т. ve/Uricosimi; 7 - Lophopyrum (Agropyron) c¡o/igalum', 8 - T aesttvunj; 9

- reu устойчивости к ржавчине rpl из Zen mays, 10 - Ген RPS2 hí Arabidopsis thaiiatur.

I ] - гомолог гена RPS2 in Brassica пера-, \ 1 - геи 12 устойчивости томатов к Fusarium oxysporum; 12 - ген M!a¡ устойчивости ячменя к ложной мучнистой росе, выделенный из Hordeum vutgarum\ 13-18 ген HvLrr! устойчичости ячменя к листовой ржавчине: 13

- ген HvLrr} из Л., \ulgarum; 14 - гомолог гена IhLrr! из Я. vui^arum; 15 - гомолог гена HvLrrI из 5. montanum; 16 - гомолог гена IlvLrrl из 7'. aestn-um; П - гомолог гена HvLrr1 ИЗ Н. vutgaram; 18 - гомолог гена HvLrrl из L. elongatum; 19 - гомолог PK i снов из Zea mays-, 20 - ген устойчивости RPM1 из A. lyraUr, 10 - ген устойчивое™ ftPAfl и i A. ¡Italiana, 21 - гомолог Гена RPM1 ИЗ Camelina saliva, 22-23 - гомологи гена N из Solanum tuberosum-, 24 - ген Л' из Nicotiana glutinosa-, 25 - ген L6 уетойчивоетн льна ржавчине из Linum tisitatissimum, 26 - гомолог l'K генов LM6 из Glycine maxi 27 -гомолог гена JtPPí из Cornelina sativa-, 2S - ген RPPS из A. thai lana; 29 - reit Rx из S tuberosum; 30 — Гомолог гена Rx Hi S. bertauilii; 31 - ген Mi-1 из Lyeopersicim esculenlum; 32 - геи Prf из L. escvlenturn.

Транслируемы» гомолог AF2S1282, выделенный из растений картофеля, является NBS-кинаэным фрагментом. На дендрограмме он располагается достаточно близко к генам-прототипам N табака и L6. сходен с фрагментом генома из S. tuberosum ssp. andigena (СЛВ46349), а также обладает существенной гомологией с последовательностями из подсолнечника (U96642) « сои (TOSS 19). Два других фрагаента ДНК (AF281281 tiAF2812S3), синтезированные при помощи тех же прайм еров, - это фрагменты ich ома картофеля неизвестной природы, обнаруживающие значительное сходство с описанными ранее последовательностями (Leister et al., 1996) (рис. 8),

Сравнение всех полученных нами аминокислотных последовательностей по строению NBS-киназного домена позволяет разделить их на несколько групп: гомологи гена СгсЗ, гомологи генов RPM1 и RPS2, гомологи генов Л'и L6 и гомологи гена Rx (рис. 8).

Хотя праймеры для амплификации I-RR домена были сконструированы на основе гена Rx устойчивости, ми гюлучили с их помощью более широкий набор гомологов генов устойчивости. Анализ производных аминокислотных последовательностей позволяет разделить эти последовательности на две группы: гомологи генов Mi-1 и Pf г и гомологи генов Rx и Opa.

Недавно опубликованные исследования гомологов Pto из S. tuberosum и шести дикорастущих видов Solanum позволили выделить несколько классов Pte-подобиых белковых последовательностей (Vleeshouwers et al., 2001). По этой классификации, описанные нами псевдогены из S,' chacoense и 5, dulcamara относятся к классам Ш и IX гомологов Pto, а полноразмерный орто.юг из S. nigrum ближе всего к генам PtOy выделенным из культурных и дикорастущих форм I.ycoperskon. К сожалению, функция этого ортолога у растений Solanum остается невыясненной,

В нашем случае KB S-содержащие гомологи генов СгсЗ и Ха2! при RFLP анализе геномной ДНК злаков не обладали способностью к гибридизации. Напротив, при RFLP анализе геномных ДИК NBS-киназный гомолог гена IfvLrrl (ДНК злаков) и гена N (ДНК картофеля) проявляли достаточный полиморфизм. LRR-содержащис последовательности также обладали способностью к гибридизации, однако, выявляемый полиморфизм был несколько ниже.

20

Использование полученных последовательностей в качестве гибридизационных зондов в RPLP анализе показало, что по сравнению с LRR фрагментами наибольший полиморфизм обеспечивают зонды на основе киназных и NBS-киназных последовательностей. Это можно объяснить тем, что последние более консервативны, так что соответствующий фрагмент ДНК может связываться с множеством гомологов. Напротив, LRR домен отвечает за специфическое распознавание патогена и является строго специфичным для определенных генов. Интересно отметить, что при гибридизации геномной ДНК картофеля с двумя разными, но близкородственными последовательностями (идентичность между ними составляет 92%) мы получили абсолютно одинаковый спектр фрагментов (рис. 4 я, г).

Полиморфизм при использовании в качестве зонда гомолога Рго, скорее всего, вызван присутствием в геноме множества различных киназ, сходных по строению, однако выполняющих разные функции,

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мы выделили и охарактеризовали свыше двадцати новых NBS-I.RR гомологов из геномной ДНК различных видов злаков и пасленовых, сходных по строению с уже известными генами устойчивости и их гомологами, функции которых пока не установлены. Охарактеризованные последовательности гомологов генов устойчивости представляют четыре из пяти обычно выделяемых классов этих структур. Многие из выделенных нами гомологов оказались псевдогенами, которые, вероятно, возникают в результате ошибок при дупликации генов или вследствие активности ретро фане позо но в (Bancroft, 2001; Ellis et al„ 2000; Michelmore, 2000; Young, 2000).

Мы проверили потенциальную возможность использования полученных последовательностей в качестве гибридизационных зондов для RI-'LP анализа и показали, что с их помощью можно охарактеризовать полиморфизм РПК участков генома и выявить косегрегациго полученных фрагментов с Признаками устойчивости к болезни, что позволяет использовать охарактеризованные фрагменты в качестве ДНК-маркеров генов и признаков устойчивости. Кроме того, эти зонды могут быть использованы для картирования локусов устойчивости. В табл. Ь представлены основные признаки и болезни, которые могут быть выявлены с помощью полученных нами зондов.

Таблица 6. Потенциальные ДНК-маркеры генов устойчивости растений к

! Маркируемый признак устойчивости Г'спы-прототипы Зоилы, полученные в данной j работе 1

Болезнь 1 Патогены i 1 Источник ДМ 1С Genbank J accession numbers

Корневая ] HeteroJera avenae нематода зерновых | культур ' СгеЗ пшеницы A. ehmgülum. 1 / i .'i/i.'fí'-' S. Ci'ri'üle. e т&нгипит. T. ansa mm AF2SI284 AF281286 AF32Ü2S8 AP320292 Ar 349940 ¡ i

Листовая, стеоленаи к желтая ржавчина пшем инь;, рЖН, ячменя и кукуруты í'ueciniá rubigo- vera, P. gr¡)minis triüci, P. g'timnrum LriÜ К!I]спины ¡Ivlrr! ячменя.

Puccinia sorghi Hpкукурузы

Бактериальная пятнистость тома га Pseudomonas syringele pv tomato Pto н /-^томата : v" j S. dttlciH'iiint i ^ nigrum } AF332SS8 i AF332SS9 AF421897 i AY055116 !

Другие [ Xanihomrjna.s campestris бактериозы пасленовых 1 B%2 сладкого S. сvreaíe, S. I АП20292 ] перца 1 niijnlanum, T, \ AF32029! i üeíím.m ! AF?202'XJ

Поражение картофеля вирусами X, Y и А Rxl и Rx2 картофеля; Л' табака S. dulcamara. S nigrum. X tuberosum AF42I89K AF3Ó23M AF362Í6G AF42H96 AF4218<Í5 i

Рак картофеля Synckylriitm emlobioricutn .V табака S tuberosum AF28!2¡Í2

i leva гола картофеля Clobodtra pallida j Gpa2 картофеля j ¿'. chacoense, ! 5. dttfcamarti, j , ,5. nigrum \ A F 362365, ' AF36236S, : AF421895. : AFH2 1 S%, , AF421S98

I [ем это; и томата Тля картофеля Macrosiphum I j enphorbioc j Mi! томата [ S nigrum Myzu.\ pcrsicae i ЛУ055П6

ФузарнозннЯ вилт юматов Fusarium oxysporum ■: !2 томата L S. cereale j AF2S12Í6 i

Фнтофтороз картофеля Phytophlhora \ Ri картофеля infcstans ! S ; AV05Í11 b

выводы

1. Методом прямой амплификации геномной ДНК ржи [Sccale cereaJe, S montanum), пшеницы (Tri¡¡cum aestivum) и пырея {Agropyron elongMum) получены NBS-киназные гомологи tenon СгсЗ пшеницы и HvLrr! ячменя, определяющих устойчивость к нематоде и листовой ржавчине злаков,

2. Методом прямой амплификации геномной ДНК картофеля {Solanum tuberosum) и его дикорастущих сородичей (S. сЬасосжс, S, dulcamara, S. nigrum) получены N BS-LRR гомологи генов устойчивости к нескольким бактериальным, вирусным и грибным болезням (RPS2 арабидопсиса, iV табака и Rx картофеля, L6 льна),

3. Из геномной ДНК дикорастущих сородичей картофеля выделены и охарактеризованы полноразмерные гомологи i-енэ Pto устойчивости к бактериальной пятнистости томатов.

4. Сравнительный анализ полученных NBS-LRR гомологов показал, что они сходны с генами-прототипам и (S5-9S% гомологии) и многими другими генами устойчивости, часть полученных последовательностей содержит стоп-кодоны и, вероятно, является пссвдогенами.

5. Способность полученных гомологов к Саузерн-гибридизации позволяет использовать их в качестве зондов при изучении рестрикцийиного полиморфизма и картирования PK генов устойчивости. На примере устойчивости картофеля к раку (возбудитель - Synchytrium endohioticum) показана принципиальная возможность использовать такие гибридизационные зонды в качестве ДНК!-маркеров генов и признаков устойчивости к болезням и вредителям.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ермишев В.Ю., Зайцев B.C., Народицкий Б.С., Хавкин Э, Ц. Гомологи генов рецептор-подобных киназ, определяющих устойчивость растений к патогенам. Сравнительный анализ гомологов гена пшетшы Creí у Tri ti cea е // Физиология растений, 2001. Т. 43, с. 573—578.

2. B.C. Заинек, Б.С. Народицкий, Э. П. Хавкин. Гомологи те но я рецептор-подобных кинзз, определяющих устойчивость растений к патогенам. Гомологи генов устойчивости у Solamim L. // Физиология растений, 2002. Т. 49. с. 91 i -917.

3. B.C. Зайцев. NBS-LRR гомологи генов устойчивости к болезням у пщеницы, ржи, картофеля и подсолнечника, /У Материалы научной конференции памяти Грегора Менделя. Тсзисы. Москва, МСХА, 200!, стр.

4. B.C. Зайцев, Э.Е. Хавкин, ДНК-маркеры устойчивости к болезням растении на основе генов рецептор-подобных киназ. Н Материалы научной генетической конференции, Москва, МСХА. 2002, стр. 119-120.

5. Э.Е. Хавкин, B.C. Зайцев, И,Л. Цветков. Структурные гомологи NBS-LRR генов устойчивости растений к бактериальным, вирусным и грибным болезням. И Материалы конгресса «Биотехнология — состояние и перспективы развития». Москва 14-18 октября 2002, сгр. 104.

6. Khavkin Е.Е., Naroditsky B.S., Tsvctkov I.L., Zaitsev V.S. Genes for receptor-like kinases conferring plant resistance to pathogens. И International Symposium "Signalling Systems of Plant Cells." Moscow. 2001, p. 76.

177

f

Ооъсм 1,5 п,л.

Зак. 545

Тираж 100 экз.

Л1Ю «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул. Тимирязсвская, 44

У/ , fZcyu^A

, аг/,^ ^Vf ^A^ ;

Л^У^Н ^ <1г/с:. -, /с. > .С;-.

- > ftííj lu?/, г/

- - ^ ' / /

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зайцев, Валерий Сергеевич

Список сокращений.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ (ВВЕДЕНИЕ).

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ (ВВЕДЕНИЕ).

1.2. Гены устойчивости растений.

1.2.1. Строение генов устойчивости

1.2.2. Классификация NBS-LRR генов.

1.2.3. Механизм действия генов устойчивости.

1.3. Эволюция генов устойчивости растений

1.3.1. Сравнительное картирование: доказательство колинеарности геномов злаков.

1.3.2. Кластеризация генов устойчивости

1.3.3. Адаптивная селекция патоген-распознающих доменов

1.3.4. Транспозирующиеся элементы (транспозоны).

1.4. Клонирование РК генов устойчивости растений

1.5. Полиморфизм по длине рестрикционных фрагментов.

1.6. Практическое использование РК генов устойчивости

Введение Диссертация по биологии, на тему "Синтез и сравнительный анализ генов рецепторных серин-треониновых киназ, определяющих устойчивость злаков и пасленовых к патогенам и вредителям"

Для борьбы с болезнями и вредителями растения выработали широкий арсенал механизмов устойчивости. Одним из них является распознавание патогена и передача сигнала для запуска защитного ответа. За специфическое распознавание многих патогенов отвечают серин-треониновые киназы, которые взаимодействуют с белками патогена по механизму рецептор - лиганд. Такое распознавание приводит к активации факторов транскрипции и синтезу белков, уничтожающих патоген.

Рецепторные серин-треониновые киназы (РК) растений изучены достаточно подробно (Ellis et al., 2000; Hammond-Kosack and Jones, 1997; Michelmore, 2000; Torii, 2000; Young, 2000). Структура РК растений и животных обнаруживает высокую консервативность. В составе этих белков выделяют несколько функциональных доменов, наличие которых является основой для структурной классификации РК. Ниже эти домены рассмотрены на примерах РК, участвующих в процессах устойчивости.

Toll дрозофилы и interleukin-1 человека предположительно отвечают за связывание с факторами транскрипции защитных белков (Cohn et al., 2001) и специфическое распознавание патогена (Luck, 2000). В нуклеотид-связывающем участке этих белков (nucleotide-binding site, NBS-киназа) происходит присоединение трифосфата, с помощью которого входящая в этот домен киназа фосфорилирует молекулу следующего участника сигнального каскада, в результате чего происходит активация транскрипции защитных белков (Li et al., 1997). LRR домен (leucine-rich repeat, участок, богатый лейциновыми повторами) отвечает за специфическое распознавание патогенов (Fluhr, 2001). В пределах каждого из этих доменов можно выделить несколько участков, консервативных для большинства РК устойчивости. С помощью праймеров, соответствующих этим участкам в составе ДНК, в последние годы были амплифицированы и клонированы многочисленные фрагменты и полноразмерные гомологи уже известных генов устойчивости (РК, или NBS-LRR гомологи), что позволило получить принципиально новые данные о структуре этих генов, их диверсификации путем дупликации и дивергенции, роли внутримолекулярной рекомбинации и ретротранспозонов в эволюции РК генов устойчивости и механизмах коэволюции патоген - растение-хозяин (Bergelson, 2001; Ellis, 2000; Michelmore and Meyers, 1998; Richter and Ronald, 2000). В настоящее время изучение структуры существенно опережает функциональные исследования РК устойчивости и кодирующих их генов: анализ аллельного полиморфизма и выявление последовательностей РК, распознающих индивидуальные формы (расы, штаммы) патогена, а также установление связи тех или иных аллелей РК генов с фенотипическими признаками устойчивости или чувствительности к болезням и вредителям. Функциональный анализ РК генов устойчивости открывает путь для их использования в молекулярной селекции растений в качестве ДНК зондов, маркирующих признак устойчивости, или хозяйственно ценных аллелей, пригодных для генетической трансформации растений.

С практической точки зрения, изучение РК генов и их гомологов открывает новые возможности для создания новых форм сельскохозяйственных растений, устойчивых к болезням и вредителям. ДНК маркеры признаков устойчивости на основе фрагментов РК генов устойчивости можно использовать для поиска новых селекционных источников в генетических коллекциях и ускорения селекционного процесса. Полноразмерные последовательности РК генов, полученные прямой амплификацией геномной ДНК или выделенные из геномных библиотек, могут стать целевыми генами для генетической модификации растений.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось получение фрагментов генома злаковых и пасленовых растений, представляющих основные классы РК генов устойчивости растений к бактериальным, вирусным и грибным патогенам, и их сравнительный анализ, а также изучение возможности использовать эти фрагменты генома в качестве ДНК маркеров генов и признаков устойчивости у различных видов сельскохозяйственных растений. В процессе работы предстояло решить следующие задачи:

1. Синтезировать гомологи РК генов устойчивости путем амплификации геномной ДНК растений методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специфическими праймерами и клонировать полученные фрагменты генома.

2. Идентифицировать синтезированные гомологи РК генов устойчивости путем анализа их нуклеотидных и производных аминокислотных последовательностей.

3. Сравнить полученные гомологи генов с уже известными генами устойчивости путем компьютерного анализа с использованием генетических баз данных.

4. Изучить возможность использовать гомологи РК генов устойчивости в качестве гибридизационных зондов в RFLP анализе.

5. Провести сравнительный анализ полиморфизма гомологов рецептор-подобных киназ и кодирующих их генов в пределах семейств злаковых и пасленовых растений, используя нуклеотидные и производные аминокислотные последовательности, и результаты рестрикционного анализа.

6. Провести анализ косегрегации полученных гомологов с фенотипическими проявлениями устойчивости растений.

Научная новизна. Клонированы и охарактеризованы 23 новых гомолога РК генов устойчивости, в том числе 4 полноразмерных последовательности. Получены новые данные о структурном полиморфизме трех классов РК генов устойчивости в семействах злаковых и пасленовых растений.

Практическая значимость. Показана принципиальная возможность использования гомологов РК генов устойчивости в качестве ДНК маркеров для селекции растений на устойчивость к болезням и вредителям. Гомологи РК генов устойчивости, выделенные нами из дикорастущих сородичей картофеля, пшеницы, ржи и томатов, могут оказаться перспективными для трансформации этих культурных растений.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Зайцев, Валерий Сергеевич

5. ВЫВОДЫ

1. Методом прямой амплификации геномной ДНК ржи {Secale cereale, S. montanum), пшеницы (Т. aestivum) и пырея {Agropyron elongatum) получены NBS-киназные гомологи генов СгеЗ пшеницы и HvLrrl ячменя, определяющих устойчивость к нематоде и листовой ржавчине злаков.

2. Методом прямой амплификации геномной ДНК картофеля (Solanum tuberosum) и его дикорастущих сородичей (S. chacoense, S. dulcamara, S. nigrum) получены NBS-LRR гомологи генов устойчивости к нескольким бактериальным, вирусным и грибным болезням (RPS2 арабидопсиса, N табака и Rx картофеля, L6 льна).

3. Из геномной ДНК дикорастущих сородичей картофеля выделены и охарактеризованы полноразмерные гомологи гена Pto устойчивости к бактериальной пятнистости томатов.

4. Сравнительный анализ полученных NBS-LRR гомологов показал, что они сходны с генами-прототипами (85-98% гомологии) и многими другими генами устойчивости, часть полученных последовательностей содержит стоп-кодоны и, вероятно, является псевдогенами.

5. Способность полученных гомологов к Саузерн-гибридизации позволяет использовать их в качестве зондов при изучении рестрикционного полиморфизма и картирования РК генов устойчивости. На примере устойчивости картофеля к раку (возбудитель - Synchytrium endobioticum) показана принципиальная возможность использовать такие гибридизационные зонды в качестве ДНК-маркеров генов и признаков устойчивости к болезням и вредителям.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Методом полимеразной цепной реакции со специфическими и вырожденными праймерами мы выделили и охарактеризовали свыше двадцати новых фрагментов генома культурных и дикорастущих видов злаков и пасленовых, которые сходны по строению с уже известными NBS-LRR генами устойчивости. Функции этих гомологов пока не установлены. Охарактеризованные последовательности гомологов генов устойчивости представляют три из четырех обычно выделяемых классов этих структур. Многие из выделенных нами гомологов оказались псевдогенами, которые, вероятно, возникают в результате ошибок при дупликации генов или вследствие активности ретротранспозонов (Bancroft, 2001; Ellis et al., 2000; Michelmore, 2000; Young, 2000). Мы подтвердили показанную другими исследователями возможность получения фрагментов и полноразмерных гомологов генов устойчивости методом ПЦР геномномной ДНК. Однако при этом основную массу полученных последовательностей представляла псевдогены, так как они составляют большую часть генома растений.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зайцев, Валерий Сергеевич, Москва

1. Тарчевский И.А., 2000. Элистор индуцируемые сигнальные системы и их взаимодействие. Физиология растений, т.47, №2, 321-331.

2. Холл М.А., Новикова Г.В., Мошков И.Е., Дж. Мур Л.А. и Смит А.Р., 2002. Протеинкиназы растений в трансдукции абиотических и биотических сигналов. Физиология растений, том 49, №1, стр. 121-135.

3. Alfano J.R. and Collmer A, 1997. The type III (Hrp) secretion pathway of plant pathogenic bacteria: trafficking harpins, Avr proteins, and death. J. Bacterid., vol. 179, pp. 5655-5662.

4. Bendahmane M., Fitchen J.H., Zhang G. and Beachy R.N., 1997. Studies of coat protein-mediated resistance to tobacco mosaic tobamovirus: correlation between assembly of mutant coat proteins and resistance. J. Virol, vol. 71, pp. 7942-7950.

5. Bendahmane A, Kanyuka K. and Baulcombe D.C, 1999. The Rx gene from potato controls separate virus resistance and cell death responses. Plant Cell, vol. 11, pp.781-792.

6. Bent A.F, Kunkel B.N, Dahlbeck D, Brown K.L, Schmidt R, Giraudat J, Leung J. and Staskawicz B.J, 1994. RPS2 of Arabidopsis thaliana: a leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes. Science, vol. 265, pp. 1856-1860.

7. Bennetzen J.L., 2000. Comparative sequence analysis of plant nuclear genomes:m microcolinearity and its many exceptions. Plant Cell, vol. 12, pp 1021-1029.

8. Bennetzen J.L. and Freeling M., 1993. Grasses as a single genetic system genome composition, collinearity and compatibility. Trends. Genet., vol. 9, pp. 259-261.

9. Bergelson J., Kreitman M., Stahl E.A. and Tian D., 2001. Evolutionary dynamics of plant R-genes. Science, vol 292, pp. 2281-2285.

10. Bogdanove A.J. and Martin G.B., 2000. ^vrPto-dependent Pto-interacting proteins and AvrPto-interacting proteins in tomato. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 97, pp. 8836-8840.

11. Bonas U. and Lahaye Т., 2002. Plant disease resistance triggered by pathogen-derived molecules: refined models of specific recognition. Curr. Opin. Microbiol., vol 5, pp. 44-50.

12. Bonas U. and Van den Ackerveken G., 1999. Gene-for-gene interactions: bacterial avirulence proteins specify plant disease resistance. Curr. Opin. Microbiol., vol. 2, pp. 94-98.

13. Bonierbale M.D., Plaisted R.L. and Tanksley S.D., 1988. RFLP maps on a common set of clones reveal modes of chromosomal evolution in potato and tomato. Genetics, vol. 120, pp. 1095-1103.

14. Botstein D., White R.L., Skolnick M. and Davis R.W., 1980. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am. J. Hum. Genet., vol. 32, pp. 314-331.

15. Bourne H.R., Sanders D.A. and McCormick F., 1991. The GTPase superfamily: conserved structure and molecular mechanism. Nature, vol. 349, pp. 117-127.

16. Chang C. and Meyerowitz E.M., 1995. The ethylene hormone response in Arabidopsis: a eukaryotic two-component signaling system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 92, pp. 4129-4133.

17. Chang C. and Stewart R.C., 1998. The two-component system. Regulation of diverse signaling pathways in prokaryotes and eukaryotes. Plant Physiol., vol. 117, pp. 723-731.

18. Chasan R., 1995. Arabidopsis in Madison: genes and phenotypes spread like weeds.

19. Plant Cell, vol. 7, pp. 1737-1748.

20. Chen M., SanMiguel P. and Bennetzen J.L., 1998. Sequence organization and conservation in sh2/al-homologous regions of sorghum and rice. Genetics, vol. 148, pp. 435-443.

21. Clark S.E., 2001. Cell signalling at the shoot meristem. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., vol. 2, 276-284.

22. Cohn J., Sessa G. and Martin G.B., 2001. Innate immunity in plants. Curr. Opin. Immunol., vol. 13, pp. 55-62.

23. Collins N.C., Webb C.A, Seah S., Ellis J.G, Hulbert S.H. and Pryor A., 1998. The isolation and mapping of disease resistance gene analogs in maize. Mol. Plant. Microbe. Interact., vol. 11, 968-978.

24. Dixon M.S., Hatzixanthis K., Jones D.A., Harrison K. and Jones J.D., 1998. The tomato Cf-5 disease resistance gene and six homologs show pronounced allelic variation in leucine-rich repeat copy number. Plant Cell, vol. 10, pp. 1915-1925.

25. Dixon M.S., Jones D.A., Keddie J.S., Thomas C.M., Harrison K. and Jones J.D., 1996. The tomato Cf-2 disease resistance locus comprises two functional genes encoding leucine-rich repeat proteins. Cell, vol. 84, pp. 451-459.

26. Ellis J., Dodds P. and Pryor Т., 2000. Structure, function and evolution of plant disease resistance genes. Curr. Opin. Plant. Biol., vol. 3, 278-284.

27. Ellis J.G., Lawrence G.J., Finnegan E.J., 1995. Anderson P.A., Contrasting complexity of two rust resistance loci in flax. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 92, pp. 4185-4188.

28. Endo Т., Ikeo K. and Gojobori Т., 1996. Large-scale search for genes on which positive selection may operate. Mol. Biol. Evol., vol. 13, pp. 685-690.

29. Feuillet C. and Keller В., 2002. Comparative genomics in the grass family: molecular characterization of grass genome structure and evolution. Ann. Bot. (Lond), vol. 89, pp. 3-10.

30. Feuillet С. and Keller В, 1999. High gene density is conserved at syntenic loci of small and large grass genomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 96, pp. 8265-8270.

31. Fletcher J.C. and Meyerowitz E.M, 2000. Cell signaling within the shoot meristem. Curr. Opin. Plant Biol, vol. 3, 23-30.

32. Flor H.H, 1971. Current status of the Gene-for-Gene Concept. Annual Review of Phytopathology, vol. 28, pp. 275-296.

33. Fluhr R, 2001. Sentinels of disease. Plant resistance genes. Plant Physiol, vol. 127, pp. 1367-1374.

34. Grant M.R, Godiard L, Straube E, Ashfield T, Lewald J, Sattler A, Innes R.W. and Dangl J.L, 1995. Structure of the Arabidopsis RPM1 gene enabling dual specificity disease resistance. Science, vol. 269, pp. 843-846.

35. Grube R.C, Radwanski E.R. and Jahn M, 2000. Comparative genetics of disease resistance within the solanaceae. Genetics, vol. 155, pp. 873-887.

36. Hammond-Kosack K.E. and Jones J.D, 1997. Resistance gene-dependent plant defense responses. Plant Cell, vol. 8, pp. 1773-1791.

37. Hatada E.N, Krappmann D. and Scheidereit C, 2000. NF-kappaB and the innate immune response. Curr. Opin. Immunol, vol. 12, pp. 52-58.

38. He Z, Wang Z.Y, Li J, Zhu Q, Lamb C, Ronald P. and Chory J, 2000. Perception of brassinosteroids by the extracellular domain of the receptor kinase BRI1. Science, vol. 288, pp. 2360-2363.

39. Hughes A.L., 1998. Phylogenetic tests of the hypothesis of block duplication of homologous genes on human chromosomes 6, 9, and 1. Mol. Biol. Evol., vol. 15, pp. 854-870.

40. Hulbert S.H. and Bennetzen J.L., 1991. Recombination at the Rpl locus of maize. Mol. Gen. Genet.,, vol. 226, pp. 377-382.

41. Hunter Т., 1995. When is a lipid kinase not a lipid kinase? When it is a protein kinase. Cell, vol.83, pp. 1-4.

42. Janssens S. and Beyaert R., 2002. A universal role for MyD88 in TLR/IL-lR-mediated signaling. Trends Biochem. Sci., vol. 27, p. 474.

43. Jeong S., Trotochaud A.E. and Clark S.E., 1999. The Arabidopsis CLAVATA2 gene encodes a receptor-like protein required for the stability of the CLAVATA1 receptor-like kinase. Plant Cell, vol. 11, pp. 1925-1934.

44. Jia Y., Loh Y.T., Zhou J. and Martin G.B., 1997. Alleles of Pto and Fen occur in bacterial speck-susceptible and fenthion-insensitive tomato cultivars and encode active protein kinases. Plant Cell,, vol. 9, pp. 61-73.

45. Jia Y., McAdams S.A., Bryan G.T., Hershey H.P. and Valent В., 2000. Direct interaction of resistance gene and avirulence gene products confers rice blast resistance. EMBO J., vol. 19, pp. 4004-4014.

46. Johal G.S. and Briggs S.P., 1992.Reductase activity encoded by the HM1 disease resistance gene in maize. Science, vol. 258, pp. 985-987.

47. Jones D.A., Thomas C.M., Hammond-Kosack K.E., Balint-Kurti P.J. and Jones J.D., 1994. Isolation of the tomato Cf-9 gene for resistance to Cladosporium fulvum by transposon tagging. Science, vol. 266, pp. 789-793.

48. Kanazin V., Marek L.F. and Shoemaker R.C., 1996. Resistance gene analogs are conserved and clustered in soybean. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, vol. 93, pp. 11746-11750.

49. Kayes J.M. and Clark S.E., 1998. CLA VATA2, a regulator of meristem and organ development in Arabidopsis. Development, vol. 125, pp. 3843

50. Kilian A., Chen J., Han F., Steffenson B. and Kleinhofs A., 1997. Towards map-based cloning of the barley stem rust resistance genes Rpgl and rpg4 using rice as an intergenomic cloning vehicle. Plant Mol. Biol., vol. 35, pp. 187-195.

51. Kimbrell D.A. and Beutler В., 2001. The evolution and genetics of innate immunity. Nat. Rev. Genet., vol. 2, pp. 256-267.

52. Kobe B. and Deisenhofer J., 1994. The leucine-rich repeat: a versatile binding motif.

53. Trends Biochem. Sci., vol. 19, pp. 415-421.

54. Kobe B. and Deisenhofer J., 1995. A structural basis of the interactions between leucine-rich repeats and protein ligands. Nature, vol. 374, pp. 183186.

55. Kobe B. and Deisenhofer J., 1995. Proteins with leucine-rich repeats. Curr. Opin. Struct. Biol., vol. 5, pp. 409-416.

56. Krutzik S.R., Sieling P.A. and Modlin R.L., 2001. The role of Toll-like receptors in host defense against microbial infection. Curr. Opin. Immunol., vol. 13, pp.104-108.

57. Lagudah E.S., Moullet O. and Appels R., 1997. Map-based cloning of a gene sequence encoding a nucleotide-binding domain and a leucine-rich region at the СгеЗ nematode resistance locus of wheat. Genome, vol. 40, pp. 659-665.

58. Lawrence G.J., Finnegan E.J., Ayliffe M.A. and Ellis J.G., 1995. The L6 gene for flax rust resistance is related to the Arabidopsis bacterial resistance gene RPS2 and the tobacco viral resistance gene N. Plant Cell, vol. 7, pp. 1195-1206.

59. Leister D., Kurth J., Laurie D.A., Yano M., Sasaki Т., Devos K., Graner A. and Schulze-Lefert P., 1998. Rapid reorganization of resistance gene homologues in cereal genomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 95, pp. 370-375.

60. Li J. and Chory J., 1997. A putative leucine-rich repeat receptor kinase involved in brassinosteroid signal transduction. Cell, vol. 90, pp. 929-938.

61. Li P., Nijhawan D., Budihardjo I., Srinivasula S.M., Ahmad M., Alnemri E.S. and Wang X., 1997. Cytochrome с and dATP-dependent formation of Apaf-l/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell, vol. 91, pp. 479-489.

62. Loh Y.T., Zhou J. and Martin G.B., 1998. The myristylation motif of Pto is not required for disease resistance. Mol. Plant. Microbe. Interact., vol. 11, pp. 572-576.

63. Luck J.E., Lawrence G.J., Dodds P.N., Shepherd K.W. and Ellis J.G., 2000. Regions outside of the leucine-rich repeats of flax rust resistance proteins play a role in specificity determination. Plant Cell, vol. 12, pp. 1367-1377.

64. Mathern J. and Hake S., 1997. Mu element-generated gene conversions in maize attenuate the dominant knotted phenotype. Genetics, vol. 147, pp. 305-314.

65. Martin G.B., Brommonschenkel S.H., Chunwongse J., Frary A., Ganal M.W., Spivey R., Wu Т., Earle E.D. and Tanksley S.D., 1993. Map-based cloning of a protein kinase gene conferring disease resistance in tomato. Science, vol. 262, pp. 1432-1436.

66. Meyer C., Pouteau S., Rouze P. and Caboche M., 1994. Isolation and molecular characterization of dTnpl, a mobile and defective transposable element ofNicotiana plumbaginifolia. Mol. Gen. Genet., vol. 242, pp. 194200.

67. Meyerowitz E.M., 1989. Arabidopsis, a useful weed. Cell, vol. 56, pp. 263-269.

68. Meyers B.C., Shen K.A., Rohani P., Gaut B.S. and Michelmore R.W., 1998. Receptor-like genes in the major resistance locus of lettuce are subject to divergent selection. Plant Cell, vol. 10, pp. 1833-1846.

69. Michelmore R.W. and Meyers B.C., 1998. Clusters of resistance genes in plants evolve by divergent selection and a birth-and-death process. Genome Res., vol. 8, pp. 1113-1130.

70. Michelmore R., 2000. Genomic approaches to plant disease resistance. Curr. Opin. Plant Biol., vol. 3, pp. 125-131.

71. Mindrinos M., Katagiri F., Yu G.L. and Ausubel F.M., 1994. The A. thaliana disease resistance gene RPS2 encodes a protein containing a nucleotide-binding site and leucine-rich repeats. Cell, vol. 78, pp. 10891099.

72. Multani D.S., Meeley R.B., Paterson A.H., Gray J., Briggs S.P. and Johal G.S., 1998. Plant-pathogen microevolution: molecular basis for the origin of a fungal disease in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 95, pp. 16861691.

73. Mysore K.S., Crasta O.R., Tuori R.P., Folkerts O., Swirsky P.B. and Martin GB., 2002. Comprehensive transcript profiling of Pto- and Prf-mediated host defense responses to infection by Pseudomonas syringae pv. tomato. Plant J., vol. 32, pp. 299-315.

74. Nurnberger Т., Wirtz W., Nennstiel D., Hahlbrock K., Jabs Т., Zimmermann S. and Scheel D. J., 1997. Signal perception and intracellular signal transduction in plant pathogen defense. J. Recept. Signal. Transduct. Res., vol. 17, pp. 127-136.

75. Ohno S., 1999. Gene duplication and the uniqueness of vertebrate genomes circa 1970-1999. Semin. Cell. Dev. Biol., vol. 10, pp. 517-522.

76. Pan Q., Wendel J. and Fluhr R, 2000. Divergent evolution of plant NBS-LRR resistance gene homologues in dicot and cereal genomes. J. Mol. Evol., vol. 50, pp. 203-213.

77. Panstruga R, Buschges R, Piffanelli P. and Schulze-Lefert P., 1998. A contiguous 60 kb genomic stretch from barley reveals molecular evidence for gene islands in a monocot genome. Nucleic Acids. Res., vol. 26, pp. 1056-1062.

78. Parker J.E., Aarts N., Austin M.A., Feys B.J., Moisan L.J., Muskett P. and Rusterucci C., 2001. Genetic analysis of plant disease resistance pathways. Novartis Found Symp., pp. 153-61.

79. Parniske M. and Jones J.D, 1999. Recombination between diverged clusters of the tomato Cf-9 plant disease resistance gene family. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 96, pp. 5850-5855.

80. Pflieger S, Lefebvre V, Caranta C, Blattes A, Goffmet B. and Palloix A, 1999. Disease resistance gene analogs as candidates for QTLs involved in pepper-pathogen interactions. Genome, vol. 42, pp. 1100-1110.

81. Pitblado, R. E, and Kerr, E. A. 1980. Resistance to bacterial speck (Pseudomonas tomato) in tomato. Acta Hortic, vol. 100, pp. 379-382.

82. Rao M.V, Lee H, Creelman R.A, Mullet J.E. and Davis K.R, 2000. Jasmonic acid signaling modulates ozone-induced hypersensitive cell death. Plant Cell, vol. 12, pp. 1633-1646.

83. Richter Т.Е., Pry or T.J, Bennetzen J.L. and Hulbert S.H, 1995. New rust resistance specificities associated with recombination in the Rpl complex in maize. Genetics, vol. 141, pp. 373-381.

84. Richter Т.Е. and Ronald P.C, 2000. The evolution of disease resistance genes. Plant Mol. Biol, vol. 42, pp. 195-204.

85. Saghai-Maroof M.A, Soliman K.M, Jorgensen R.A. and Allard R.W, 1984. Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 81, pp. 8014-8018.

86. Sambrook and Russel. 2001. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

87. Saraste M., Sibbald P.R. and Wittinghofer A., 1990. The P-loop-a common motif in ATP- and GTP-binding proteins. Trends Biochem. Sci., vol. 15, pp. 430-434.

88. Scofield S.R., Tobias C.M., Rathjen J.P., Chang J.H., Lavelle D.T., Michelmore R.W. and Staskawicz В .J., 1996. Molecular Basis of Gene-for-Gene Specificity in Bacterial Speck Disease of Tomato. Science, vol. 274, pp. 2063-2065.

89. Seah S., Sivasithamparam K., Karakousis A. and Lagudah E.S., 1998. Cloning and characterisation of a family of disease resistance gene analogs from wheat and barley. Theor. Appl. Genet., vol. 97, pp. 937-945.

90. Shalev G. and Levy A. A., 1997. The maize transposable element Ac induces recombination between the donor site and an homologous ectopic sequence. Genetics, vol. 146, pp. 1143-1151.

91. Shirasu K., Schulman A.H., Lahaye T. and Schulze-Lefert P., 2000. A contiguous 66-kb barley DNA sequence provides evidence for reversible genome expansion. Genome Res., vol. 10, pp. 908-915.

92. Shiu S.H. and Bleecker A.B., 2001. Plant receptor-like kinase gene family: diversity, function, and signaling. Sci. STKE, vol. 2001.

93. Song W.Y., Pi L.Y., Wang G.L., Gardner J., Holsten T. and Ronald P.C., 1997. Evolution of the ticqXci21 disease resistance gene family. Plant Cell, vol.9, pp. 1279-1287.

94. Song W.Y., Wang G.L., Chen L.L., Kim H.S., Pi L.Y., Holsten Т., Gardner J., Wang В., Zhai W.X. and Zhu L.H., 1995. A receptor kinase-likeprotein encoded by the rice disease resistance gene, Xa21. Science, vol. 270, pp. 1804-1806.

95. Spielmeyer W., Huang L., Bariana H., Laroche A., Gill B.S. and Lagudah E.S., 2000.

96. NBS-LRR sequence family is associated with leaf and stripe rust resistance on the end of homoeologous chromosome group IS of wheat. Theoretical and Applied Genetics, vol. 101, pp. 1139-1144.

97. Stone J.M., Trotochaud A.E., Walker J.C. and Clark S.E., 1998. Control of meristem development by CLAVATA 1 receptor kinase and kinase-associated protein phosphatase interactions. Plant Physiol., vol. 117, pp. 1217-1225.

98. Staskawicz B.J., Ausubel F.M., Baker B.J., Ellis J.G. and Jones J.D., 1995. Molecular genetics of plant disease resistance. Science, vol. 268, pp. 661-667.

99. Staskawicz B.J., Mudgett M.B., Dangl J.L. and Galan J.E., 2001. Common and contrasting themes of plant and animal diseases. Science, vol. 292, pp. 2285-2289.

100. Sudupak M.A., Bennetzen J.L. and Hulbert S.H., 1993. Unequal exchange and meiotic instability of disease-resistance genes in the Rpl region of maize. Genetics, vol. 133, pp. 119-125.

101. Tarchini R., Biddle P., Wineland R., Tingey S. and Rafalski A., 2000. The complete sequence of 340 kb of DNA around the rice Adhl-adh2 region reveals interrupted colinearity with maize chromosome 4. Plant Cell, vol. 12, pp. 381-391.

102. Tikhonov A.P., Bennetzen J.L. and Avramova Z.V., 2000. Structural domains and matrix attachment regions along colinear chromosomal segments of maize and sorghum. Plant Cell, vol. 12, pp. 249-264.

103. Torii K.U., 2000. Receptor kinase activation and signal transduction in plants: an emerging picture. Curr. Opin .Plant Biol., vol. 3, pp. 361-367.

104. Trotochaud A.E., Jeong S. and Clark S.E., 2000. CLAVATA3, a multimeric ligand for the CLAVATA1 receptor-kinase. Science, vol. 289, pp. 613-617.

105. Vicient C.M., Suoniemi A., Anamthawat-Jonsson K., Tanskanen J., Beharav A., Nevo E. and Schulman A.H., 1999. Retrotransposon BARE-1 and Its Role in Genome Evolution in the Genus Hordeum. Plant Cell, vol. 11, pp. 1769-1784.

106. Whitham S., Dinesh-Kumar S.P., Choi D., Hehl R., Corr C. and Baker В., 1994. The product of the tobacco mosaic virus resistance gene N: similarity to toll and the interleukin-1 receptor. Cell, vol. 78, pp. 1101-1115.

107. Wicker Т., Stein N., Albar L., Feuillet C., Schlagenhauf E. and Keller В., 2001. Analysis of a contiguous 211 kb sequence in diploid wheat (Triticum monococcum L.) reveals multiple mechanisms of genome evolution. Plant J., vol. 26, pp. 307-316.

108. Williamson V.M., 1999. Plant nematode resistance genes. Curr. Opin. Plant Biol., vol. 2, pp. 327-331.

109. Young N.D., 2000. The genetic architecture of resistance. Curr. Opin. Plant Biol., vol. 3, pp. 285-290.

110. Xiao S., Ellwood S., Calis O., Patrick E., Li Т., Coleman M. and Turner J.G., 2001. Broad-spectrum mildew resistance in Arabidopsis thaliana mediated by RPW8. Science, vol. 291, pp. 118-120.

111. Xu Y., Tao X., Shen В., Horng Т., Medzhitov R., Manley J.L. and Tong L., 2000. Structural basis for signal transduction by the Toll/interleukin-1 receptor domains. Nature, vol. 408, pp. 111-115.

112. Zhou J., Loh Y.T., Bressan R.A. and Martin G.B., 1995. The tomato gene Ptil encodes a serine/threonine kinase that is phosphorylated by Pto and is involved in the hypersensitive response. Cell, vol. 83, pp. 925-935.

113. Zhou J., Tang X. and Martin G.B., 1997. The Pto kinase conferring resistance to tomato bacterial speck disease interacts with proteins that bind a c/'s-element of pathogenesis-related genes. The EMBO Journal, vol. 16, pp. 3207-3218.