Синтез ДНК через повреждение, катализируемый ДНК-полимеразами β и λ

Белоусова, Екатерина Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Синтез ДНК через повреждение, катализируемый ДНК-полимеразами β и λ
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Синтез ДНК через повреждение, катализируемый ДНК-полимеразами β и λ"

На правах рукописи □0343^

БЕЛОУСОВА ЕКАТЕРИНА АНАТОЛЬЕВНА

СИНТЕЗ ДНК ЧЕРЕЗ ПОВРЕЖДЕНИЕ, КАТАЛИЗИРУЕМЫЙ ДНК-ПОЛИМЕРАЗАМИ 0И1

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Новосибирск - 2010

2 5 МАР 2010

003494162

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной

медицины СО РАН

Научный руководитель:

д.х.н., профессор, член-корр. РАН Лаврик Ольга Ивановна

Официальные оппоненты:

д.х.н., профессор, член-корр. РАН Габибов Александр Габибович д.б.н. Жарков Дмитрий Олегович

Ведущая организация:

Новосибирский государственный университет

Защита состоится « 7-Х-у> 2010 г. в часов

на заседании диссертационного Совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

С авторефератом можно знакомиться на сайте www.niboch.nsc.ru

Автореферат разослан «» ФсЬ/и2 ¿-и С.2010 г.

Учёный секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент ^-г, Коваль В.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Система синтеза ДНК через повреждение (£гаш1е5юп гй^з, ТЬБ) - одна из основных систем, используемых клеткой при репликации врежденной геномной ДНК. Несмотря на существующий большой массив иных, объясняющий детали этого процесса, тем не менее, остается ряд разрешенных вопросов, например, какие ДНК-полимеразы и белковые факторы инимают участие в синтезе ДНК через тот или иной тип повреждения; каковы обенности процесса ТЬБ при синтезе лидирующей и отстающей цепей геномной ПС. Синтез ДНК через повреждение осуществляется специализированными ДНК-лимеразами. Исследования последних лет показали, что к их числу можно нести и ДНК-полимеразы р и Я. (пол р и пол X.) структурного семейства X. На годняшний день основная часть исследований сосредоточена на реконструкции мплекса белков, осуществляющего ТЬБ в процессе репликации лидирующей пи геномной ДНК, то есть с участием прайм ированных ДНК-дуплексов с отяженными 5'-оц-участками с повреждением в определенном положении тричной цепи. В то же время, например, в условиях окислительного стресса жет возникнуть необходимость синтеза ДНК по поврежденной матрице при пликации отстающей цепи геномной ДНК, то есть по ДНК-субстрату, в котором вреждение находится непосредственно напротив бреши внутри ДНК-дуплекса. Целью работы являлось исследование ТЬБ-процесса, катализируемого пол р и л X, на ДНК-субстратах, имитирующих интермедиа-™ репликации ДНК на дирующей и отстающей цепях, и влиянию на этот процесс таких репликативных кторов, как ЬЛРА и ЬРСЫА. В ходе работы решались следующие задачи: 1) следование ТЪБ-активности пол р и пол X на частичных ДНК-дуплексах, держащих тетрагидрофуран, 8-оксогуанин или тимингликоль в качестве вреждения матричной цепи, а также протяженные 5'-оц-участки матрицы или 1ИО-, ди-, пентануклеотидные бреши с З'-ОН и 5'-фосфатной группами; влияние этот процесс ионов М§2+ и Мп2+; 2) изучение влияния ЬЯРА на ТЬБ-активность л X при использовании 8-оксогуанин-содержащих ДНК с протяженными 5'-оц-астками; 3) анализ влияния Ы1РА и ЬРСКА на синтез ДНК через тимингликоль, гализируемый пол р и пол X, в частичных ДНК-дуплексах, содержащих бреши зной длины; 4) изучение характера взаимодействия белков фракционированного ерного экстракта клеток НеЬа с частичными 5'-оц-ДНК-дуплексам и, держащими тетрагидрофуран или 8-оксогуанин; 5) идентификация белков ерного экстракта семенников крупного рогатого скота и белков ¡акционированного ядерного экстракта клеток НеЬа, взаимодействующих с анин-, 8-оксогуанин- и тетрагидрофуран-содержащими ДНК-субстратами, с именением метода фотоаффинной модификации.

Научная новизна и практическая значимость. Проведено систематическое следование ТЬБ-активности пол р и пол X через тетрагидрофуран, 8-оксогуанин и

тимингликоль на частичных ДНК-дуплексах, имитирующих интермеди репликации ДНК на лидирующей и отстающей цепях. Обнаружено, что фермента способны катализировать синтез ДНК, независимо от типа поврежде! Впервые показано, что hRPA стимулирует TLS-активность пол X на 8-оксогуан содержащих ДНК с протяженными 5'-оц-участки, находясь в глобулярной, но вытянутой конформации; показано, что этот эффект обусловлен белок-белков! взаимодействиями между ДНК-полимеразой и репликативным фактором А. 1 изучении влияния hRPA и hPCNA на TLS через тимингликоль в составе Д1 дуплексов, имитирующих интермедиаты репликации ДНК на отстающей ц< впервые показано, что: (i) hPCNA оказывает стимулирующее действие на Т активность пол Я, в то время как hRPA не проявляет специфического влияния работу этого фермента; (¡i) синтез ДНК, катализируемый пол ß, как поврежденной, так и на интактной матрице не зависит от присутствия hPCN hRPA. С помощью метода фотоаффинной модификации и иммуноферметт анализа поли(АВР-рибозо)полимераза 1 идентифицирована в качестве одного белков ядерного экстракта Bovine testis, взаимодействующих с ДНК-дуплекс; содержащими протяженные 5'-оц-участки или бреши и повреждение в матрич цепи (8-оксогуанин или тетрагидрофуран). Аналогичным образом б продемонстрировано, что пол \ - один из белков фракционированного ядер! экстракта клеток HeLa, взаимодействующих с теми же ДНК-дуплекс; Основываясь на результатах представленной работы, можно сказать, что уча< пол ß в процессе TLS через различные типы повреждений, вызывав! окислительным стрессом, требует дополнительного изучения, поскольку : фермент не обладает отчетливой специфичностью при синтезе, например, через а также не демонстрирует функционального взаимодействия с репликативн факторами, такими как hRPA и hPCNA. Сопоставляя полученные результат данными, опубликованными другими авторами, можно предположить, что пол сочетании с hPCNA и hRPA играет важную роль в TLS через поврежде возникающие в результате окислительного стресса (АП-сайт, 8-оксогуа тимингликоль), при репликации отстающей цепи геномной ДНК.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опублико) 4 статьи. Результаты работы были представлены на международных конференц "International Conference on Chemical Biology", Новосибирск, 2005; "Internat' Conference on Physico-Chemical Biology", Новосибирск, 2006; "Conference for y< scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics", К Украина, 2007; "IV congress of Russian Society of biochemists and mole« biologists", Новосибирск, 2008; "DNA repair and epigenetic regulation of gen stability", Санкт-Петербург, 2008; "10th International Conference on Environmi Mutagens", Флоренция, Италия, 2009.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, [водов, списка литературы. Работа изложена на 146 страницах, содержит 35 сунков, 31 таблицу и список цитируемой литературы из 301 наименования.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Синтез ДНК, катализируемый пол р и пол X, на ДНК-субстратах, держащих различные типы повреждений: влияние ионов Mg*+ и Мп2+.

1.1. Синтез ДНК, катализируемый пол Д на THF-содержащих матрицах. АП-нты являются часто встречающимся повреждением ДНК и появляются в клетках к спонтанно, так и в результате действия специфических ДНК-гликозилаз, пример, урацил-ДНК-гликозилазы, которая выщепляет из ДНК-дуплекса урацил, шбочно встроенный при репликации (Barnes et al., Curr Opin Cell Biol, 1993, 5, 4). АП-сайты представляют достаточную опасность с точки зрения целостности юма клетки, поскольку не содержат кодирующего основания.

ДНК-субстраты обозначение

. ' -GACTACATTTCATCTGGCTTGGGCTTCATCGTTGTCXCAGACCTGGTGGATACCG 3'-GTCTGGACCACCTATGGC* DNAext37

5' -GGCTTCATCGTTGTCXCAGACCTGGTGGATACCG 3'-GTCTGGACCACCTATGGC* DNAextl6

5' 3" -GGCTTCATCGTTGTCXCAGACCTGGTGGATACCG -CCGAAGTAGCAp GTCTGGACCACCTATGGC* DNAgap5

5' 3' -GGCTTCATCGTTGTCXCAGACCTGGTGGATACCG -CCGAAGTAGCAACAp "GTCTGGACCACCTATGGC* DNAgap2

5' 3' -GGCTTCATCGTTGTCXCAGACCTGGTGGATACCG -CCGAAGTAGCAACAGp GTCTGGACCACCTATGGC* DNAgapl

- A, G, Т, THF, 8oxoG, Tg

- фосфатная группа

■ [32Р]-радиоакгивная метка

На первом этапе работы были определены кинетические параметры реакции граивания dNMP пол р в модельные ДНК-структуры DNAextl6, DNAgap2 и JAgapl, содержащие THF-фрагмент (З-гидрокси-2-

фоксиметилтетрагидрофуран, синтетический аналог АП-сайта) в матричной пи. Синтез вели с использованием природных dNTP, а также их фотоактивных злогов AL-FAB-dCTP, FAP-dCTP и FAP-dUTP в качестве субстратов (рис. 1, В), азалось, что ни в одном из исследованных случаев пол (} не была способна гализировать синтез ДНК через THF-фрагмент в присутствии ионов Mg2+, то есть условиях, оптимальных для синтеза ДНК (рис. 1, А). Известно, что замена ионов Mg2+ на ионы Мп2+ в активном центре ДНК-пимераз приводит к нарушениям в механизме дискриминации комплементарного клеотида, что снижает точность синтеза, но увеличивает каталитическую

активность фермента (Pelletier et al., Biochemistry, 1996, 35, 12762). В присутстт ионов Мп2+ пол Р была способна осуществлять синтез ДНК через THF-фрагмент всех ДНК-субстратах DNAextl6, DNAgap2 и DNAgapl (рис. 1, Б, правая naHej Во всех случаях наблюдалось удлинение ДНК-праймера на один шаг, и лишь i использовании структуры DNAgap2 происходил синтез ДНК с вытеснением Ц1 (рис. 1, Б, дор. 5, левая панель). Из всех четырех дезоксинуклеозидтрифосфа dTTP не являлся субстратом данной реакции ни в одном из рассмотрен! вариантов (рис. I, Б, дор. 3, левая панель). Следует также отметить, что синтез Д был более эффективным на ДНК-субстратах, содержащих бреши. Таким образ при синтезе ДНК через THF-фрагмент пол р выполняет "А-правило", то е избирательное встраивание dAMP напротив АП-сайта. Кроме того, ферм способен синтезировать ДНК, согласно механизму "template slippage", то е: встраивание нуклеотида, комплементарного следующему за поврежденн матричным основанием.

DNAext16

К 1 2345

19h.Q__J

18 и.о. >|w»i>ii#i

DNAgap2

1 23456 К 1 2345 К1 23456

• II—ill

34 н.о,

В (Т) FAP-dCTP

NIÎ^ fi

«V R'-K

pppnRib

(2) AL-FAB-dC

R = H

DNAgapl

AGTCN 1Д2?3?

? ? 8

AGTCN

Ч2П ??8

(3) FAP-dUTP JL jCI

о ^^ HlsrV^^^NH HN

PP^B

Рисунок 1. Встраивание dNMP и их фотоактивных аналогов (1, 2 или 3) пол р в ДНК-субстр DNAext 16, DNAgap2 и DNAgapl, содержащие THF-фрагмент, в присутствии ионов Mg2+ (А) и Мп2+ На рисунке представлен радиоавтограф геля после разделения продуктов реакции: 50 мМ Tris-HCl 7.5, 0.5 мМ DTT, 0.25 мг/мл BSA (lx TDB), 1 мМ MgCl2 или МпС12, 0.01 мкМ пол р инкубирова течение 20 мин с 0.01 мкМ ДНК-субстратом и 50 мкМ одного dNTP (дор. 1-4) или четырех dNTP ( 5). Дорожка К - смесь без фермента (В) Структуры фотоактивных аналогов dNTP.

Все исследуемые фотоактивные аналоги оказались субстратами для пол однако FAP-dCMP встраивался с наибольшей эффективностью в DNAextlô DNAgap2 (рис. 1, Б, правая панель). Интересно, что значения Км при встраива] FAP-dCMP в DNAextlô и AL-FAB-dCMP в DNAgap оказались меньше, v значения Км при встраивании природного субстрата dCMP (например, Км (F,

:TP/DNAextl6) 0.93 мкМ; KH (dCTP/DNAextl6) 1.69 мкМ). Охшраясь на эти иные, можно предположить, что фотоактивные аналоги FAP-dCTP и AL-FAB-ГГР могут быть весьма перспективными при изучении первой стадии TLS при нтезе лидирующей и отстающей цепей ДНК в реконструированных системах и в еточных/ядерных экстрактах эукариот.

1.2. Синтез ДНК, катализируемый пол Д на 8охоС-содержащих матрицах. здим из типичных представителей ряда окисленных пуринов является 8-:согуанин (8oxoG). Помимо канонической пары с цитозином, это дафицированное основание может образовывать неканоническую тстиновскую пару 8oxoG:A (Collins, Bioessays, 1999, 21, 238), что приводит к ансверсии G->T.

При изучении реакции синтеза ДНК, катализируемой пол р, на 8oxoG-держащих субстратах DNAextl6, DNAgap2 и DNAgapl в присутствии ионов g2+ были получены следующие результаты. Оказалось, что пол р, способна траивать все четыре нуклеотида напротив 8oxoG, однако эффективность синтеза НК в присутствии корректного dCTP была в ~2 раза выше, чем в присутствии ¡корректного dATP (WKU (dCTP/DNAextl6) 11 нМ"''с"'; Wl^ ATP/DNAextl6) 6 hM'^c'1). Следует также отметить, что в присутствии смеси :тырех dNTP наблюдался синтез полноразмерного продукта при использовании ех 8охоО-содержащих ДНК-субстратов.

Пол р бьша не способна использовать фотоактивный аналог FAP-dUTP, эдифицированный по С5 положению уридина, в качестве субстрата при синтезе NAextl6 через 8oxoG, в то время как AL-FAB-dCTP, содержащий заместитель в iM же положении гетероцикла, оказался наиболее предпочтительным субстратом 1нной реакции среди всех исследуемых фотоанапогов. Интересно, что )фективность встраивания AL-FAB-dCMP напротив 8oxoG была в 1.7 раза выше, :м немодифицированного нуклеотида dCMP в DNAextl6 (ко/Км (AL-FAB-:TP/DNAextl6) 19 hM'V; kcal/KM (dCTP/DNAextl6) 11 нМ ^с1).

При замене ионов Mg2+ на ионы Мп2+ в реакции синтеза ДНК на 8oxoG-держащих субстратах DNAextl6, DNAgap2 и DNAgapl пол р также была юсобна встраивать все природные dNTP, но с большей эффективностью. Однако данном случае эффективность синтеза ДНК в присутствии некорректного dATP .ига в ~3.9 раза выше, чем в присутствии корректного dCTP (км/К,, CTP/DNAextl6) 0.14 mkM'V; WK,, (dATP/DNAextl6) 0.55 мкМ"'«с

Из всех исследуемых фотоаналогов AL-FAB-dCTP оказался наиболее >едпочтительным субстратом данной реакщ<и. Интересно, что эффективность ¡траивания AL-FAB-dCMP напротив 8oxoG была в 7.9 раза выше, чем ¡модифицированного нуклеотида dCMP в DNAextl6 (kca/K,, (AL-FAB-:TP/DNAextl6) 1.13 мкМ''-c"1; к«Д, (dCTP/DNAextl6) 0.14 mkM'^c1).

1.3. Синтез ДНК, катализируемый пол /?, на Tg-содержащих матрицах. Одн из наиболее опасных повреждений, вызванных действием активных фс кислорода на ДНК, является тимингликоль (Tg). Его мутагенный потенц) сравнительно невысок, большинство ДНК-полимераз способны встраив корректный dAMP напротив Tg (Hayes et al., J Mol Biol, 1988, 201, 239). Однако, отличие от нативных гетероциклических оснований, Tg не является планарн основанием и вызывает серьезные искажения регулярной вторичной структу ДНК. При встрече репликативной ДНК-полимеразы с парой Tg:dNMP происхо; остановка синтеза ДНК, коллапс репликативной вилки и гибель клетки (Ide et Nucleic Acids Res, 1985, 13, 8035; Kow et al., Radiat Res, 1985,126, 357).

При использовании Tg-содержащих матриц DNAgapl, DNAgap2, DNAgs было показано, что в присутствии ионов Mg2+ пол р способна как встраив dAMP, комплементарный матричному основанию Tg, так и катализировать син ДНК в присутствии dGTP, dTTP или dCTP. В данной работе исследовали ли встраивание dAMP (как комплементарного Tg) и dGMP (встраивающег согласно механизму "template slippage"). Независимо от типа используемого ДО субстрата, синтез ДНК в присутствии dATP был более эффективным (наприм кси/К,, (dATP/DNAgap1) 244 нМ'^с1; к„,/Кн (dGTP/DNAgapl) 1 нМ^с1). След также отметить, что при использовании неповрежденных ДНК-субстра-наблюдалось встраивание только dAMP и dGMP (данные не представлены).

При изучении реакции синтеза через Tg, катализируемой пол р, в присутсп ионов Мп наблюдалось встраивание всех четырех dNMP, независимо от ti ДНК-субстрата, однако dATP по-прежнему являлся предпочтительным субстрат (например, k«ÁM (dATP/DNAgap 1) 15.3 мкМ '-с"1; k^/K* (dGTP/DNAgapl) 0.: mkM'W). Более того, пол Р способна катализировать синтез ДНК с вытеснен! цепи и образованием полноразмерного продукта на DNAgap2 и DNAgap5.

1.4. Синтез ДНК, катализируемый пол X, на THF-содержащих матриц Синтез ДНК, катализируемый пол X, с использованием THF-содержащих ДО субстратов DNAextló, DNAgap2 и DNAgapl проводили аналогично описаннс выше (рис. 2). В присутствии ионов Mg2+ удлинения исходного 18 н.о.-праймера наблюдалось ни в одном из исследованных случаев.

В присутствии ионов Мп2+ при использовании природных dNTP в качес субстратов пол X была способна удлинять ДНК-праймер на один шаг в сост DNAgap2 и DNAgapl (рис. 2, А). Единственным субстратом данной реаю оказался dGTP (например, WK,, (dGTP/DNAgap2) 11 нМ'Ч"1; к«,, (dGTP/DNAgapl) 2 нМ'1*с'1). Синтеза полноразмерного продукта не наблюдаж Основываясь на литературных данных, можно предположить, что пол X ве синтез ДНК через THF-фрагмент согласно механизму "template slippage" (Blanca et al., Biochemistry, 2004,43,11605). Кроме того, присутствие фосфатной группы 5'-конце бреши ограничивает способность пол X вести синтез ДНК с вытеснен) цепи (Garcia-Diaz et al., J Mol Biol, 2000,301, 851).

Д ОЫАехНб йЫАдар2 0ЫАдар1 1ZDNAext16 йЫАдар2 йЫАдар1

' * V 4 44 4 С I/ 4 4« < С I/ 4 4*11! V 4 4 4 К А VI 4 4 4 К А

к 12345 к 12345

19Н.0— 18н.ог

асгсы

АвТСМ

к 12345

1?345

к133456

АвТСМ

Ш Т?1 Т?1

Рисунок 2. Встраивание (ШМР (А) и их фотоактивных аналогов (Б) (1, 2, 3) пол X в ДНК-

субстраты ОЫАехИб, ОЫА§ар2 и ОЫАеар1, содержащие ЮТ-фрагмент, в присутствии Мп2+.

Реакцию проводили, как описано в подписи к "рис. 1".

Из всех исследованных фотоактивных аналогов только РАР-ёСТР являлся бстратом для пол % при синтезе с использованием О^ехИб, ОКА£ар2 и МА§ар1 (рис. 2, Б, дор. 1 и 2).

1.5. Синтез ДНК, катализируемый пол X, на 8ахоС-содержащих матрицах. Пол была способна встраивать ¿СМР и 4АМР напротив вохов в различные ДНК-бстраты в присутствии ионов М)*2+, однако эффективность встраивания рректного (1СМР была несколько выше по сравнению с некорректным <1АМР ^/К» (сЮТРЯЖАехиб) 20 нМЧ"1; ксм/Ки (ёАТРЛЖАхеиб) 15 нМ''*с 1').

Из всех исследуемых фотоаналогов при синтезе с использованием 8охоО-держащих ДНК-дуплексов БЫАехМб наиболее предпочтительным субстратом азался БАР-ёСТР; при этом эффективности встраивания РАР-с1СМР и 1иродного (1СМР оказались сравнимыми (кса/Км (ёСТРЛЖ Аех116) 0.020 мкМ^-с'1; ,/Км (РАР-ёСТРЛЖАхеИб) 0.023 мкМ"Ч"1). В присутствии фотоактивного ало га РАР-сШТР синтеза ДНК не наблюдалось.

При замене ионов М§ на ионы Мп в реакции синтеза ДНК на 8охоО-держащих субстратах ВИАехИб, DNAgap2 и ВИА§ар1 пол также была особна встраивать с1СМР и ¿АМР, но с большей эффективностью (например, ,/Км (dCTP/DNAextl6) 0.16 мкИ'1'^1; к^« (бАТРДЖАхеПб) 0.07 шЛГ'«с"). гедует отметить, что в данном случае эффективность синтеза ДНК в присутствии рректного ёСТР была в -2.3 раза выше, чем в присутствии некорректного ¿АТР.

Из всех исследуемых фотоаналогов ЕАР^СТР оказался наиболее 1едпочтительным субстратом данной реакции. Тот факт, что эффективность траивания РАР-ёСМР оказалась в ~1.9 раза выше, чем природного ¿СМР (к^/Ки СТР/ОИАехПб) 0.16 мкМЧ"1; к^/К,, (РАР-ёСТРЯЖАхеПб) 0.31 мЛГ'-с*1), лает этот аналог достаточно перспективным при изучении реакции синтеза ДНК рез повреждение в экстрактах клеток эукариот.

1.6. Синтез ДНК, катализируемый пол Я, на Tg-coдepжaщux матрицах. При следовании реакции синтеза ДНК, катализируемой пол X, с использованием Tg-держащих матриц не наблюдалось удлинения исходного 18-звенного прайм ера в юсутствии ионов М£2+, за исключением синтеза ОНА§ар2-субстрата. В данном

случае наблюдался синтез ДНК в присутствии dATP и dGTP, однако встраива dAMP было более эффективным и характеризовалось меньшим значением OwTC« (dGTP/DNAgap2) 0.008 mrMV; k^^/K« (dATP/DNAgap2) 0.069 мкМ"'«с

Пол X проявляет TLS-активность на Tg-содержащих субстратах DNAex DNAgap5, DNAgap2n DNAgapl в присутствии ионов Мп2+. Фермент спосо катализировать синтез ДНК в присутствии dATP, как комплементар* матричному Т, и встраивать dGMP, то есть катализировать синтез ДНК механизму "template slippage". Однако, независимо от типа ДНК-субстрата, сш ДНК с использованием комплементарного dATP был более эффектом (например, k^/K,, (dGTP/DNAgap2) 0.52 mkM'V1; WK,, (dATP/DNAgap2) : мкМ'^с"1) и характеризовался меньшим значением константы Михаэлиса. Во ï случаях наблюдалось удлинение исходного 18-звенного ДНК-праймера на о шаг, за исключением структуры DNAgap5, на которой пол X способна вести сш ДНК непосредственно после встраивания корректного dA напротив Tg (данные приведены).

2. Влияние hRPA и hPCNA на синтез ДНК, катализируемый пол ß и пол Я ДНК-субстратах, имитирующих интермедиаты TLS при репликах лидирующей и отстающей цепей ДНК.

Крайне интересным и важным является вопрос о роли ключе] репликативных факторов в процессе TLS. Репликативный белок A, RPA, сомнения, относится к важнейшим белкам репликации эукариот. RPA представ! собой стабильный гетеротример, состоящий из полипептидов с молекулярнь массами 14, 32 и 70 кДа (р14, р32 и р70, соответственно) (Wold, Annu Rev Bioch 1997, 66, 61). В его функции входят стабилизация ДНК в одноцепочеч] состоянии и защита ее от действия ДНК-модифицирующих факторов, а та] позиционирование белков при сборке многокомпонентных белок-нуклеино] комплексов и стимуляция работы других белковых факторов (Singh, Samson, I Natl Acad Sei USA, 1995, 92, 4907; de Laat et al., Genes Dev, 1998, 12, 25' Считается, что RPA может связывать оцДНК с образованием двух ти комплексов, различающихся между собой размером участка связывания (10 и и.о.), а также стабильностью и архитектурой (Iftode, Crit Rev Biochem Mol Б 1999, 34, 141). В первом типе комплексов RPA принимает глобуляр* конформацию. Если размер оставшегося свободным оц-участка достаточен и избытка концентрации RPA по отношению к ДНК, то белок вытягивается вд ДНК с образованием дополнительных контактов и переходом в более стабилы комплекс второго типа.

Еще одним ключевым компонентом системы репликации ДНК является РС1 В первую очередь PCNA выступает в качестве фактора процессивности , репликативных пол 5 и е. Дополнительно он задействован в координации дру белок-белковых взаимодействий в репликативном комплексе (Maga, Hubscher,

ill Sei, 2003, 116, 3051). Что касается TLS, то в настоящее время PCNA

осматривается в качестве основного переключателя между процессами синтеза Ж, осуществляемого репликативными и специализированными ДНК-

лимеразами (Budzowska, Kanaar, Cell Biochem Biophys, 2009, 53,17).

2.1. Влияние ИКРА на синтез ДНК, катализируемый пол л, на 8охоО-держащих матрицах, имитирующих интермедиаты ТЬБ при репликации дирующей цепи ДНК. В данной работе исследовали влияние ЯРА человека ИРА) и его мутантной формы ЬАВСБ, лишенной доменов, ответственных за лок-белковые взаимодействия, на способность пол X вести синтез на 8охов-держащих матрицах в присутствии ионов Мп2+. В качестве модельной ДНК-руктуры была использована праймер-матричная система с различными длинами оц-участков: 16 н.о. - БКАехиб и 37 н.о. - ОИАехг37. Размеры оц-участков и ловия реакции были выбраны в соответствии с возможностью реализации зличных типов комплексов ЯРА с оцДНК. Это регулируется соотношением нцентраций ЯРА и оцДНК. Эффективность синтеза ДНК в присутствии ЬЯРА и о мутантной формы оценивали по изменению кинетических параметров реакции

траивания корректного ёСМР (рис. 3). Как видно из представленных данных, бавление ЬЯРА приводит к увеличению выхода продукта реакции синтеза ДНК ЭКАехИб; в данном случае при связывании с оц-участком ДНК ИКРА щнимает глобулярную конформацию. В то же время, присутствие ЬЯРА не ияет на ТЬБ по ЭЫАех137; в данном случае ЬЯРА принимает вытянутую «формацию при связывании с оц-участком ДНК-дуплекса. Поскольку типы язывания ЬЯРА с выбранньши ДНК-субстратами различаются, вероятно, для имуляции синтеза ДНК через повреждение, катализируемого пол X, ЬКРА должен снимать глобулярную, но не вытянутую конформацию.

DNAextl 6

DNAext37

Рисунок 3. Влияние ЬЯРА (ИЯ), его мутантной формы ЬАВСО (Н), а также дрожжевого зсЯРА (Ш) на встраивание <1СМР пол X в 8охоС-ДНК-субстраты 8охоС-ОКАехИб (А) и вохоСИЖАехШ (Б). (□) -выход продукта реакции в отсутствие И ИР А, %. Условия реакции: 1х ТОВ, 0.5 мМ МпС12, 0.15 мкМ пол А, 5 мкМ аСТР, 0.01 мкМ ДНК-субстрат, 0.01 мкМ ЯРА; время реакции 15 мин.

Взаимное влияние белков может быть реализовано через белок-белковые (нтакты; поэтому резонно было оценить вклад некоторых доменов ¡пликативного белка А, принимающих участие во взаимодействиях такого рода, га этой цели было исследовано влияние мутантной формы ЬАВСБ, состоящей из лырех ДНК-связывающих доменов А, В, С и Б и субъединицы р14, на ТЪБ через (хов-фрагмент. Несмотря на делецию отдельных доменов, ЬАВСБ

взаимодействует с оцДНК так же, как и полноразмерный белок hRPA (Bochkare et al., EMBO J, 2002, 21, 1855). Как видно из рис. 3, присутствие hABCD реакционной смеси не привело к стимуляции реакции синтеза Щ катализируемой пол X, ни в одном из исследованных случаев. На основан полученных данных можно сказать, что стимуляция синтеза ДНК репликативм фактором А опосредована белок-белковыми взаимодействиями RPA с пол Отсутствие стимулирующего эффекта при замене hRPA на его дрожжевой анаг scRPA также косвенно указывает на специфическую роль таких взаимодействий.

2.2. Влияние hRPA на синтез ДНК, катализируемый пол /? и пол I, на THF-SoxoG-содержащих матрицах, имитирующих интермедиаты TLS при репликаZj отстающей цепи ДНК, оценивали по изменению скорости накопления продуг реакции (рис. 4). При исследовании TLS-активности через THF-фрагмент качестве субстрата для пол р использовали dATP, для пол X - dGTP; реакцию вели; присутствии ионов Мп2т. При исследовании синтеза ДНК через 8oxoG- и фрагменты в качестве субстрата использовали dCTP; реакцию вели: в присутств ионов Mg2+ - в случае пол р, в присутствии ионов Мп2+- в случае пол X. представленных данных видно, что hRPA ингибирует синтез ДНК, катализируем] пол р и пол X, как через THF-фрагмент, так и через 8oxoG, однако не влияет выход продукта реакции при использовании неповрежденных ДНК-матрг Возможно, характер влияния репликативного белка А на TLS определяел

Рисунок 4. Влияние hRPA на реаки встраивания dNMP пол р (А) и пол X (Б) примере DNAgap2, содержащих THF, 8о>

или G. (О) - выход продукта реакцш отсутствие репликативного фактора, %; (f - выход продукта реакции в присутст репликативного фактора, %. Уело: реакции: lx TDB, 1 мМ MgCI2 или Mni

0.05 мкМ пол р или 0.15 мкМ пол X, 5 м dNTP, 0.01 мкМ ДНК-субстрат, 0.01 м RPA; время реакции 10 мин.

2.3. Влияние hRPA на синтез ДНК, катализируемый пол Д на Tg-содержащ матрицах, имитирующих интермедиаты TLS при репликации отстающей це ДНК, оценивали по изменению кинетических параметров при добавлении hRPA реакционную смесь. Реакции вели в присутствии ионов Mg24 или Мп2+. Оказало что hRPA значительно снижает эффективность и уровень встраивай комплементарного dAMP (WKH (-/+hRPA) 0.0034 и 0.0016 mkM'V, Vm (-/+hRP 381 и 105 nM'c"1) и полностью ингибирует встраивание некомплементарного dGÍ напротив Tg в DNAgap5 в присутствии ионов Mg2+. В тоже время hRPA оказывает существенного влияния на синтез ДНК при использовании dATP (KJ

наличием и типом повреждения ДНК.

|то

»50 I 30

Iм

I 10

THF 8oxoG G

Нл

dA dC dC

THF 8oxoG ,-8« -

I7"

|50

I40

g20

51C

rfi

/+hRPA) 1.19 и 1.15 micM'^c"1, V^ (-/+hRPA) 836 и 781 пМ-с"1) или dGTP (V^ '+ hRPA) 637 и 716 пМ'С"1) в качестве субстрата реакции в присутствии ионов \п2+. Таким образом, можно говорить о том, что hRPA не проявляет юцифического эффекта в реакции синтеза ДНК через Tg, катализируемой пол р, с ¡пользованием DNAgap5.

Присутствие hRPA в реакции синтеза неповрежденных ДНК DNAgap5(T) эиводило к ингибированию ДНК-полимеризующей активности пол р при ¡пользовании dATP или dGTP, независимо от условий реакции (например, V^, V (-/+hRPA, Mn2+) 778 и 607 пМ»с'\ У™», dG (-/+hRPA, Mn2+) 585 и 298 пМ-с"1). а основании этих результатов можно заключить, что hRPA не имеет юцифического влияния на синтез ДНК, катализируемый пол р, на ¡поврежденных ДНК-субстратах DNAgap5.

При исследовании влияния hRPA на синтез DNAgap2 через Tg, катализируемый >л Р, оказалось, что hRPA существенно подавляет встраивание как »мплементарного dAMP, так и некомплементарного dGMP, независимо от шовий реакции (например, V^« (-/+hRPA, dA, Mn2+) 934 и 219 nM'c'1, V^ (-hRPA, dG, Mn2+) 827 и 204 nM'c1).

Аналогичный эффект hRPA наблюдали при изучении TLS и нормального щтеза ДНК, катализируемого пол Р, на ДНК-субстратах DNAgapl. Добавление 1РА приводило к уменьшению эффективности встраивания некомплементарного ЗМР напротив Tg (WK,, (-/+hRPA, dG, Мп2+) 0.22 и 0.04 mkM'V) и к «еньшению эффективности встраивания dTMP и dGMP напротив матричного А cat/K„ (-/+hRPA, dT, Mn2+) 32.2 и 8.45 mkM'V).

2.4. Влияние hRPA на синтез ДНК, катализируемый пол Я, на Tg-содержащих шрицах, имитирующих интермедиаты TLS при репликации отстающей цепи ЧК, изучали аналогичным образом. Присутствие hRPA приводит к увеличению 1>фективности немутагенного TLS на ДНК-субстратах DNAgap5 за счет ¡гативного влияния на реакцию встраивания некомплементарного dGMP (Vm„ '+hRPA) 283 и 70 пМ-с'1; WK* (-/+hRPA) 0.128 и 0.055 mkM'V). В то же время, 1РА увеличивает точность синтеза с использованием неповрежденных ДНК-'бстратов, катализируемого пол Я., в присутствии ионов Мп2+ (кса/Км (-/+hRPA, К) 0.42 и 1.32 mkM'V).

При использовании в качестве субстрата ДНК-структуры DNAgap2 синтез ДНК присутствии hRPA полностью подавляется, независимо от условий реакции.

При синтезе с использованием ДНК, содержащих минимальный размер бреши в и.о., hRPA ингибирует встраивание как корректного dAMP, так и некорректного ЗМР напротив Tg (WK„ (-/+hRPA, dA) 0.39 и 0.06 mkM'V; WKm (-/+hRPA, 3) 0.031 и 0.008 mkM'V). Следует также отметить, что присутствие hRPA в ¡акционной смеси приводит к уменьшению точности работы пол X и при синтезе i неповрежденных ДНК-субстратах (кс/К„ (-/+hRPA, dT} 10.3 и 1.68 mkM'V; ц/Ки (-/+hRPA, dG) 0.06 и 0.75 mkM'V).

2.5. Влияние hPCNA на синтез ДНК, катализируемый пол Д на Tg-содержащ матрицах, имитирующих интермедиаты TLS при репликации отстающей це ДНК, изучали аналогичным образом. При использовании ДНК-дуплексов DNAga: были получены следующие результаты. Оказалось, что hPCNA увеличива точность синтеза ДНК через Tg как за счет увеличения эффективности встраивай комплементарного dAMP (независимо от типа кофактора; например, к^/К,, /+hPCNA, dA, Mg24) 0.003 и 0.006 mkM'V), так и за счет уменьшен эффективности реакции синтеза ДНК при встраивании некомплементарного dGN в присутствии ионов Mg2+ (k^/Кн (-/+hPCNA, dG) 0.5 и 0.06 mIvT'-c1). Однако условиях низкой точности работы фермента hPCNA приводит к увеличен! эффективности встраивания некомплементарного dGMP пол р (кс^/Кц (-/+hPCN dG) 18 и 31 мМ"'*с''). Таким образом, присутствие hPCNA увеличивает точное синтеза ДНК, катализируемого пол р, в условиях, оптимальных для реакц полимеризации, и приводит к обратному эффекту при замене ионов Mg2+ на ио] Мп2+.

Следует отметить, что hPCNA ингибирует синтез ДНК на неповрежденм ДНК-дуплексах в случае DNAgap5 при использовании как dATP, так и dGTP качестве субстрата, независимо от условий реакции (например, кс^/К* (-/+hPCN dA, Mg2+) 4.4 и 0.8 мкМ-'-с1; кс/Ки (-/+hPCNA, dA, Mg2+) 0.92 и 0.01 мкМ"'»с Основываясь на этих результатах, можно заключить, что hPCNA не проявлю специфического влияния на синтез ДНК, катализируемый пол р, неповрежденным ДНК-матрицам.

hPCNA не оказывает существенного влияния на встраивание dAMP или dGMl DNAgap2 напротив Tg в присутствии Mg2+ или Мп2+ (например, V^ (-/+hPCN dA, Mnî+) 934 и 913 пМ-с1; Vm„ (-/+hPCNA, dG, Mn2+) 827 и 775 nM'c1).

Аналогичный эффект был получен при исследовании синтеза ДН катализируемого пол р, в случае DNAgapl: присутствие hPCNA не оказывг существенного влияния на мутагенный или немутагенный TLS и на синтез неповрежденным ДНК-матрицам, независимо от условий реакции (наприм kc/K,, (-/+hPCNA, dA, Tg, Mn2+) 15.3 и 17.9 мкМ''-c"1; k^/K,, (-/+hPCNA, dG, ' Mn2+) 0.23 и 0.22 mkMV1; WKm (-/+hPCNA, dT, A, Mn2+) 32.2 и 32.4 мкМ'Ч WKH (-/+hPCNA, dG, A, Mn2+) 0.22 и 0.27 MtcM^'c1).

2.6. Влияние hPCNA на синтез ДНК, катализируемый пол X, на Tg-содержаи матрицах, имитирующих интермедиаты TLS при репликации отстающей щ ДНК. Наличие hPCNA при синтезе ДНК через Tg в составе DNAgapS присутствии ионов Мп2+ приводит к уменьшению эффективности встраивав некорректного dGMP (kce/KM (-/+hPCNA) 128 и 63 мМ"1^"1). В тоже время №С1 практически не влияет на выход продукта реакции при использовании dATP качестве субстрата как при синтезе на Tg-содержащих матрицах (V^a (-/+hPCft 155 и 154 пМ'с"1), так и при синтезе ДНК на неповрежденных субстратах (V

/+ЬРСЫА, М§2+) 263 и 245 пМ'с"1; У^ (-/+ЬРСИА, Мп2+) 600 и 641 пМ-с1). На сновании этих данных можно сказать, что ИРСИА увеличивает точность ТЪБ, атализируемого пол X, через Т§ в ОКА§ар5.

ЬРСИА увеличивает точность ТЬБ, катализируемого пол X, на субстратах >МА§ар2 в присутствии ионов М£2+ или Мп2+: добавление ЬРСЫА приводит к величению уровня встраивания комплементарного (1АМР (Ущ^ (-/+ЬРСЫА, ёА, 18й) 63 и 138 пМ«с ; (-/+ ЬРСЫА, ёА, Мп2+) 274 и 363 пМ'с"1) и к меньшению уровня встраивания некомплементарного ёвМР в присутствии ионов (Ут» (-/+ЬРСЫА, ёв, Mg24) 113 и 57 пМ'с"1).

При прохождении Т§ в структурах БЫА£ар1 пол X ИРСИА увеличивает эчность ТЬБ за счет уменьшения уровня встраивания некомплементарного <ЮМР /щзх (-/+ЬРСЫА, ёБ) 159 и 51 пМ*с"). В тоже время, ЬРСИА не оказывает заметного гсияния на выход продукта реакции в присутствии комплементарного <1АТР (У,^ /+ЬРОГА, ёА) 189 и 159 пМ«с"'). При использовании неповрежденных ДНК-матриц РСЫА не оказывает существенного влияния на синтез на 01^А£ар1 (Утах (--ЬРСЫА, ёТ, Мп2+) 822 и 797 пМ-с"1; У^ (-/+hPCNA, <Ю, Мп2+) 95 и 88 пМ-с1).

2.7. Влияние ИЯРА и ИРСЫА на синтез ДНК, катализируемый пол Д на эдержащих матрицах, имитирующих интермедиаты ТЛ8 при репликации тстающей цепи ДНК. Совместное влияние ИКРА и ЬРСИА на ТЬБ, атализируемый пол р, через в DNAgap5 зависело от концентрации ЬЛРА в гакционной смеси. Низкие концентрации Ы1РА (Ы1РА:ВКА=1:2 или 1:1) риводили к ингибированию реакции встраивания как корректного ёАМР тпример, к«/Км (-/+[ЬРСНА/Ы1РА], Мп24) 1.19 и 0.72 мкМ'Ч'1), так и екорректного ёйМР (например, к^ц/К* (-/+[ЬРСМА/Ы1РА], Мп21) 0.018 и 0.014 кМ"'*с"!). При более высоких концентрациях ЬИРА (ЬКРА:1ЖА=2:1) наблюдалось зелимение уровня встраивания ёАМР (У™* (-/+|ЪРСКА/Ы1РА]) 381 и 571 пМ*с'1) полное подавление реакции синтеза ДНК с ёСТР в присутствии ионов Mg2+. днако при смене кофактора на Мп2+ наблюдался обратный эффект (К^/К,, (ёА) ,19 и 0.60 мкМ"''С"'; и к^К« (ёй) 0.018 и 0.031 мкМ'Ч"1). Совместное рисутствие ЬЯРА и ЬРСЫА в реакции с неповрежденными ДНК-матрицами NAgap5 неизменно приводило к подавлению синтеза ДНК, независимо от типа ЧТР-субстрата, кофактора и концентрации ЬЯРА (например, к^ц/К,, (--[ИРСКА/макс.ЬКРА], ёА, Мп2+) 0.92 и 0.06 ■мкМ",*с'; к^/К* (-[ЪРСЫА/максЖРА], ёв, Мп2+) 9.8 и 0.2 мМ'^с"1). Таким образом, в данном 1учае можно говорить об отсутствии специфического эффекта ЬКРА и ЪРСЫА.

Совместное присутствие ЬЯРА и ИРСИА подавляет синтез ДНК через Tg на ИА§ар2 (например, (-/+[ЬРСМА/Ы1РА], ёА, М§2+) 679 и 280 пМ'с'1; /+[ЬРС№А/Ы1РА], ёв, Ме2^ 73 и 39 пМ-с1).

При использовании ДНК-субстратов DNAgapl ЬЛРА и ЬРСИА действуют более тецифично: в данном случае наблюдалось уменьшение эффективности лраивания некомплементарного ёвМР напротив Tg (кс^/К,, (-/+[ЬРСЫА/ЬЯРА],

dG, Mn2+) 0.23 и 0.03 мкМ"1#с'). При исследовании синтеза ДНК, катализируем! пол р, на неповрежденных ДНК-субстратах DNAgapl оказалось, что совмесп присутствие hRPA и hPCNA приводит к ингибированию синтеза ДНК, независи от dNTP субстрата (IwK, (-/+[hPCNA/hRPA], dT, Mn2+) 32.2 и 2.75 мкМ^с WK» (-/+[hPCNA/hRPA], dG, Mn2+) 0.22 и 0.02 mkMV1).

2.8. Влияние hRPA и hPCNA на синтез ДНК, катализируемый пол X, на содержащих матрицах, имитирующих интермедиаты TLS при реппикаг отстающей цепи ДНК. При исследовании совокупного эффекта hRPA и hPCNA TLS, катализируемый пол X, через Tg в DNAgap5 оказалось, что в присутсп двух белков увеличивается точность этого процесса как за счет ингибирова! реакции встраивания некомплементарного dGMP (к^/К,, (-/+[hPCNA/MaKc.hRP. 0.128 и 0.007 икМ'^с'1), так и за счет увеличения эффективности встраива! комплементарного dAMP (kca/Ku (-/+[hPCNA/MaKC.hRPA]) 0.23 и 1.26 мкМ"'«с Противоположный эффект hRPA и hPCNA проявлялся при синтезе пол X неповрежденным ДНК-субстратам DNAgap5 (k^/K^ (-/+[hPCNA/MaKC.hRPA], < Мп2+) 0.42 и 0.15 мкМ"'»с"').

Совместное присутствие hRPA и hPCNA приводило к полному ингибирован реакции (в присутствии ионов Mg24) или существенному снижению эффективно« и выхода продуктов реакции (в присутствии ионов Мп2+) при синтезе DNAg! через Tg (WKM (-/+[hPCNA/MaKc.hRPA], dA) 2.28 и 0.05 mkM'V; k.at/ (-/+[hPCNA/MaKC.hRPA], dG) 0.52 и 0.05 мкМ-'чГ1).

При уменьшении размера бреши до 1 н.о. опять наблюдался стимулируюи эффект hRPA в комбинации с hPCNA на TLS через Tg, катализируемый пол (кой/К* (-/+thPCNA/MaKc.hRPA], dG) 0.031 и 0.014 мкМ-'-с'1). При этом точно синтеза DNAgapl по неповрежденной матрице в присутствии hRPA и hPCl существенно снижалась (k^/K.. (-/+[hPCNA/MaKC.hRPA], dT, Mn2+) 10.3 и 0 мкМ'^с'1; киЛСы (-/+[hPCNA/MaKc.hRPA], dG, Mn2+) 0.06 и 0.26 мкМ"''с').

Таким образом, несмотря на то, что пол р способна проходить Tg в сост ДНК, содержащих бреши различной дайны, более эффективно, чем пол А, тем менее, последний фермент выглядит более предпочтительным кандидатом j катализа TLS через данный тип повреждений, поскольку в сочетании с hPCl обеспечивает точный синтез ДНК.

3. Взаимодействие белков фракционированного ядерного экстракта клеп HeLa (RC) с ДНК-субстратами, содержащими 8oxoG- и THF-фрагменты имитирующими интермедиаты TLS при репликации лидирующей цепи ДНК.

3.1. Синтез ДНК, катализируемый белками RC, на THF-, 8oxoG- и содержащих матрицах. Расположение репликативных факторов на поврежден! молекуле ДНК, которое потенциально может быть реализовано при переключе! работы репликативного комплекса в режим TLS, можно изучать как реконструированной системе, так и в обогащенных клеточных/ядерных экстрак

кариот. На первом этапе была исследована возможность синтеза ДНК ОМАехЙ7, держащей 5'-оц-участки и в или 8охоО, бежами ЯС при использовании с1СТР и ЛР в качестве субстратов в присутствии ионов (рис. 5, А). Синтез ДНК рез 8охоО-фрагмент, катализируемый белками экстракта, в присутствии рректного ёСТР был в ~3.7 раза более эффективным, чем в присутствии корректного (1АТР (Х^/К« ^СГРЛШАехШ) 8.6 нМ"'>с"' и кс/К,, АТРЛЖАех137) 2.3 нМ'^с"1). Более того, продукты синтеза ДНК на поврежденных ДНК-матрицах в присутствии ¿АТР полностью отсутствовали.

8oxoG

THF

19H.cl_ 18H.CC-

бспок---.

нукп. комплекс

дн*-С

К 1 2 i. ir» ЩгмкЛФ К 1 2 еь i ЩгТ*

** V м — ы w Wh M * ■ *

Рисунок 5. Встраивание dCMP (дор. 1) и dAMP (дор. 2) белками RC в ДНК-субстраты DNAext37 (А), содержащие G, 8охоО или THF, и связывание ДНК-субстратов белками RC после реакции синтеза ДНК (Б). Условия реакции: lx TDB, 1 мМ MgCb, 0.12 мкг/мкл белков RC, 0.01 мкМ ДНК-субстрат, 0,01 - 50 мкМ dNTP, время реакции 1 час.

При использовании THF-содержащих ДНК-субстратов синтеза ДНК, тализируемого белками RC, не наблюдалось (рис. 5, А).

3.2. Связывание ДНК-субстратов, содержащих G-, 8oxoG- и THF-фрагменты, яками RC после синтеза ДНК в экстракте. Сродство белков RC к ДНК-бстратам, содержащим различные типы повреждений, оценивали методом держки в геле (рис. 5, Б). После синтеза ДНК белками экстракта в присутствии Л"Р или dATP (см. выше) состав реакционных смесей исследовали методом гель-ектрофореза в нативных условиях. Как видно из представленных данных, во всех следуемых случаях наблюдалось образование одного белок-нуклеинового мплекса, причем количество этого комплекса зависело не столько от типа »вреждения, сколько от типа dNTP-субстрата реакции синтеза ДНК: в акционных смесях, исходно содержащих dCTP, большая часть ДНК оказывалась связанной форме.

3.3. Связывание предсинтезированых ДНК-субстратов, содержащих G-, >xoG- и THF-фрагменты, белками RC. Сродство белков экстракта к ДНК-бстратам, содержащим dNMP напротив различных типов матричных »вреждений, оценивали методом задержки в геле (рис. 6). Для этой цели были пользованы предсинтезированные ДНК-субстраты DNAext37, содержащие THF, >xoG или G в 0 положении матричной цепи по отношению к З'-концу праймера. а З'-конце праймер содержал нативные dCMP или dAMP или их зтоактивируемые аналоги FAP-dCMP или AL-FAB-dCMP. Как видно из вставленных данных, связывание ДНК-субстратов белками RC в большей епени зависит от типа повреждения ДНК, нежели от dNMP: количество белок-аслеинового комплекса убывает в ряду THF>oxoG>G. Если же сравнивать между

собой кривые комплексообразования для ДНК-субстратов, содержащих один и же тип повреждений и "комплементарный" либо "некомплементарный" dNMP З'-конце праймера, то большее количество белок-нуклеинового компле образуется при связывании ДНК-субстратов с "некомплементарной" парой на конце: THF/dOTHF/dA; 8oxoG/dA>8oxoG/dC.

Рисунок б. Кривые связывай! предсютгезированных ДНК-субстрат

DNAext37, содержащих G, 8oxoG или THF матричной и dCMP или dAMP на З'-кош праймерной цепи, белками RC. Даннь представлены как среднее 3 независимь экспериментов. Ошибка не превышала 10° Условия реакции: lx TDB, 1 мМ MgCI2> 0.06 0.8 мкг/мкл белков RC, 0.01 мкМ ДНК-субстра время реакции 10 мин.

В аналогичных экспериментах использованием фотоактивируек предсинтезированных ДНК-субстратов было показано, что общее количес белков экстракта, связывающихся с такими ДНК, близко к общему количес белков экстракта, связывающихся с ДНК-субстратами, содержащими натив! dCMP или dAMP на З'-конце.

4. Исследование состава TLS-комплексов в ядерных экстрактах семенник крупного рогатого скота Bovine testis и клеток HeLa методом фотоаффиш модификации.

На сегодняшний день композиция TLS-комплексов, помогаюа репликативному комплексу проходить тот или иной тип повреждения, остае неизвестной. Для выявления взаимодействия специализированных ДНК-полиме и других белков TLS с ДНК был использован метод фотоаффинной модификац Данный подход предполагает применение ДНК-субстратов, содержап фотоактивируемую группу в определенном положении ДНК по отношению повреждению матричной цепи. Введение фотогруппы в состав ДНК мои осуществить различными способами, в том числе с помощью активности да полимераз. В этом случае фотореакционноспособные аналоги dNTP, содержав фотоактивируемую арилазидогруппу в гетероциклическом основании нуклеоти используются в качестве субстрата ДНК-полимераз для введе1 модифицированного dNMP-фрагмента в З'-конец праймера (Khodyreva, Lavrik, С Med Chem, 2005, 12, 641). Поскольку собственная TLS-активность ядери экстрактов Bovine testis и клеток HeLa была достаточно низкой для получе1 необходимого количества фотоактивируемого ДНК-субстрата in situ, в даш работе были использованы предсинтезированные ДНК-дуплексы. После инкуба! исследуемых белков с фотоактивными ДНК и последующей УФ-индуцироваш

M о,« [RCI.MK1

1ивки ДНК-белковые аддукты были разделены с помощью электрофореза в натурирующих условиях.

4.1. Мечение белков ядерных экстрактов Bovine testis и клеток HeLa шоактивными ДНК-субстратами, содержащими в своем составе 8oxoG- и {¥-фрагменты и имитирующими интермедиаты TLS при репликации дирующей цепи ДНК. На первом этапе были получены фотоактивируемые ДНК-бстраты, имитирующие интермедиаты TLS при синтезе лидирующей цепи ДНК NAextlö) и содержащие повреждение (THF-фрагмент или 8oxoG) и тгоактивируемую группу. Были использованы два типа фотоаналогов dCMP, ходящихся на З'-конце праймера, напротив матричного повреждения - FAP-;МР и AL-FAB-dCMP (рис. 1, В). Контрольные эксперименты проводили с поврежденными ДНК-субстратами.

В результате проведенных экспериментов было показано (рис. 7, А), что энструированные фотоактивные ДНК-субстраты способны эффективно дифицировать рекомбинантные пол ß (дор. 1) и пол X (дор. 2). Следует отметить, тэ молекулярный вес белок-нуклеиновых адцуктов, определяемый по диоавтографу, выше истинного значения молекулярного веса исходного белка на

16 кДа за счет ковалентного присоединения олигонуклеотидного фрагмента.

JS/

<fs

<? <f rf £ *

Ч?7 -С

ж ж £ £

«Да 160-

0Ш Ш: jlggi Iffjgl И тш шШ

ч» 4 ■ • • it

160-► I—1 м (—|

105—«• <* щ ш ** #

ф а Ц Ф —

80-^ Лф II 1# т —

35—*

ДНК ,

гсунок 7. Фотоаффинная модификация белков ядерного экстракта Bovine testis (А) и RC (Б) этоактивными ДНК-субстратами DNAextlö, содержащими G, 8oxoG или THF-фрагмент и L этоактивные остатки FAP-dCMP или AL-FAB-dCMP. Реакционные смеси содержали lx TDB, 0.01 (М ДНК-субстрат и (А) 1 - 0.05 мкМ пол ß; 2 - 0.15 мкМ пол X; 3 - 2.8 мкг/мкл ядерного экстракта _ Dvine testis; 4 - 2.8 мкг/мкл ядерного экстракта Bovine testis, 5 мкМ dNTP, 1 мМ MgCl2; (Б) 1 - 0.05 мкМ м ß; 2 - 0.4 мкг/мкл RC. Время реакции 10 мин в отсутствие dNTP и 30 мин в присутствии dNTP.

УФ-облучение смесей (Х=312 нм), содержащих ядерный экстракт Bovine testis и гоакгивную ДНК, выявило три основных продукта модификации с пекулярными массами ~80, 105 и 160 к Да (рис. 7, А, дор. 3, 4). Выход продуктов дификации с использованием фотоактивной ДНК, содержащей повреждение, л выше. Различия в наборе продуктов модификации при использовании разных Ж-проб говорят о том, что характер мечения зависит от типа повреждения и, по-

видимому, определяется разной аффинностью белков экстракта к специфичесю типу повреждения ДНК.

УФ-облучение экстракта клеток HeLa в комплексе с ДНК также привело появлению трех ковалентных белок-нуклеиновых адцуктов с молекулярнь массами -50, 75 и 105 кДа (рис. 7, Б, дор. 2). В данном случае общий вы: продуктов модификации и степень модификации отдельных белков изменялис ряду G>oxoG>THF. Кроме того, степень модификации ДНК-структура содержащими 8oxoG и THF-фрагмент, для всех трех ковалентных аддуктов 6i примерно одинаковой (по FAP-dCMP-аддуктам); однако в случае использования содержащих ДНК-субстратов степень модификации падала в ряду 50>105>75 кД

4.2. Меченые белков экстракта Bovine testis фотоактивными Д1 субстратами, содержащими в своем составе 8oxoG- и THF-фрагменты имитирующими интермедиаты TLS при репликации отстающей цепи ДНК. данных экспериментах в качестве ДНК-субстратов были использовг фотоактивируемые ДНК, имитирующие интермедиаты TLS при синтезе отстаюп цепи ДНК (DNAgapl, DNAgap2) и содержащие в своем составе повреждег матричной цепи (THF-фрагмент или 8oxoG) и фотогруппу в З'-конце прайм (FAP-dCMP) (рис. 8).

«Да 105-►

G SoxoG THF 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

50--

JÜÜ щит

■ ui й

кДа

250-►

рЗ 105—» —р2 -—р1 50-►

SoxoG THF

Рисунок 8. Фотоаффинная модификация белков ядерного экстракта Bovine testis фотоактивными ДНК-субстратами DNAgapl (А) и DNAgap2 (Б), содержащими G, 8oxoG или THF-фрагмент и фотоактивный остаток FAP-dCMP. Реакционные смеси содержали lx TDB, 0.01 мкМ ДНК-субстрат и 1 - 0.05 мкМ пол ß; 2 - 0.15 мкМ пол X; 3 - 0.1 мкМ РАЯР1; 4 - 2.8 мкг/мкл ядерного экстракта Bovine testis; 5 - 2.8 мкг/мкл ядерного экстракта Bovine testis, 5 мкМ dNTP, 1 мМ. Время реакции 10 мин в отсутствие dNTP и 30 мин в присутствии dNTP.

При УФ-облучении смесей, содержащих ядерный экстракт Bovine testis фотоактивную ДНК, независимо от типа используемого ДНК-субстра наблюдалось образование трех основных продуктов модификации pi, р2 и рЗ молекулярными массами 50, 75 и более 105 кДа, соответственно (рис. 8, дор. 4 и Степень модификации продукта рЗ была максимальной и не зависела ни от т* повреждения, ни от типа используемой ДНК-структуры. При эт эдектрофоретические подвижности продукта рЗ и меченой PARP1 практичес совпадали (рис. 8, дор. 3 и 4, 5). Максимальная степень модификации белков составе ДНК-белковых аддуктов pi и р2 достигалась при использовании 8ох ДНК-субстратов. Что касается предпочтений в типе структур ДНК, то стете

дификации продукта pi была выше при использовании ДНК-структур, : держащих разрыв, в то время как степень модификации продукта р2 была выше и использовании ДНК-структур, содержащих брешь в 1 н.о. Следует отметить, электрофоретическая подвижность pi и р2 очень близка к ;ктрофоретическим подвижностям продуктов модификации рекомбинантных я ß и пол X, соответственно (рис. 8, дор. 1 и 2). I 4.3. Идентификация продуктов мечения белков ядерных экстрактов Bovine tis и клеток HeLa. Методом иммунопреципитации с использованием гцифических антител было показано, что PARP1 является белком экстракта ivine testis, образующим белок-нуклеиновый коньюгат с молекулярной массой

Рисунок 9. (А) Анализ продуктов модификации PARP1 (I) и белков ядерного экстракта Bovine testis (II, III, IV) фотоактавными ДНК-субстратами, содержащими остаток FAP-dCMP, методом иммунопреципитации с использованием антител к PARP1 человека. На рисунке представлен радиоавтограф геля после разделения смесей в денатурирующих условиях: I - реакционные смеси до инкубации с сорбентом; 2 - реакционные смеси после инкубации с сорбентом. Исходная реакционная смесь содержала: Ix TDB, 1 мМ MgClj, 0.01 мкМ DNAgap2, 0.1 мкМ PARP1 или 2.8 мкг/мкл белков экстракта Bovine testis. (Б) Анализ продуктов модификации белков RC фотоактивными ДНК-субстратами DNAextlö, содержащими THF-фрагмент и остаток FAP-dCMP, методом иммуноблотгинга с использованием антител к пол X человека. Реакционные смеси содержали lx TDB, 1 мМ MgCI2, 0.01 мкМ DNAextló и I ~ 0.15 мкМ пол X; 2 - 0.15 мкМ пол X после фотоаффинной модификации; 3-5 мкМ dNTP, 0.15 мкМ пол X после фотоаффинной модификации; 4 - 0.4 мкг/мкл белков RС; 5 - 0.4 мкг/мкл белков RC после фотоаффинной модификации; 6-5 мкМ dNTP, 0.4 мкг/мкл белков RC после фотоаффинной модификации.

Методом иммуноблотгинга продукт модификации в ядерном экстракте клеток eLa с молекулярной массой -75 кДа был идентифицирован как пол X (рис. 9, Б).

Таким образом, основываясь на результатах представленной работы, можно «опочить, что пол ß и пол X являются кандидатами на роль TLS-полимераз при яггезе ДНК через повреждения, возникающие при окислительном стрессе, в роцессе репликации как лидирующей, так и отстающей цепей геномной ДНК. роме того, пол ß и пол X в сочетании с hPCNA и hRPA могут принимать участие в i LS не только на первой стадии процесса (т.е. при встраивании dNMP напротив овреждения), но и на последующих стадиях (т.е. при процессинге некомплементарного" З'-конца праймера).

лее 105 кДа (рис. 9, А).

«Да 250-

105—►

G G 80X0GTHF

12 12 12 12

кДа

105—► 75—►

1 II III IV

м 1 2 3 4 5 6

Ultimi

ЛШ • * f

выводы

1. При изучении TLS-активности пол р и пол X на частичных ДНК-дуплекс содержащих протяженные 5-оц-участки матрицы и имитирующих интермеди: синтеза лидирующей цепи ДНК, и ДНК-дуплексах, содержащих moho-, ди- i пентануклеотидные бреши с З'-ОН и 5-фосфатной группами и имитируюп интермедиаты синтеза отстающей цепи ДНК, показано, что:

а) оба фермента проявляют TLS-активность на различных ДНК-дуплекс независимо от типа повреждения, однако более эффективно синтез ДНК иде присутствии ионов Мп2+;

б) оба фермента способны катализировать синтез ДНК на тетрагидрофур содержащих матрицах только в присутствии ионов Мп2+;

в) встраивание корректного dCMP напротив 8-оксогуанина пол р в присутеп ионов Mg2+ и пол X в присутствии ионов Мп2+ происходит в 2 раза бо эффективно по сравнению со встраиванием некорректного dAMP;

г) dATP и dGTP являются предпочтительными субстратами при синтезе че тимингликоль, катализируемый пол X, в то время как пол Р не облад определенной специфичностью при прохождении этого типа повреждений. Кр< того, пол X способна вести синтез ДНК непосредственно после встраива корректного dAMP напротив тимингликоля в ДНК-субстраты, содержа! протяженные 5'-оц-участки матрицы или пентануклеотидные бреши.

2. Впервые показано, что hRPA стимулирует TLS-активность пол X на оксогуанин-содержащих ДНК с протяженными 5'-оц-участками, находясь глобулярной, но не вытянутой конформации. Этот эффект обусловлен бел белковыми взаимодействиями между ДНК-полимеразой и репликативг фактором А.

3. При исследовании влияния hRPA и hPCNA на синтез ДНК ч£ тимингликоль, катализируемый пол р и пол X, в ДНК-дуплексах, содержа! бреши, впервые показано, что:

а) hPCNA оказывает стимулирующее действие на TLS-активность пол X, в время как hRPA не проявляет специфического влияния на работу этого фермент

б) синтез ДНК, катализируемый пол р, как на поврежденной, так и на интакт матрице не зависит от присутствия hPCNA; hRPA не проявляет специфичес* влияния на работу фермента.

4. Исследована способность белков фракционированного ядерного экстрг клеток HeLa использовать в качестве субстратов синтеза ДНК ДНК-дупле! содержащие тетрагидрофуран и 8-оксогуанин и имитирующие интермеди синтеза лидирующей цепи ДНК. Показано, что:

а) dCTP, но не dATP является предпочтительным субстратом при синте: использованием 8-оксогуанин и гуанин-содержащих ДНК белками экстракта;

б) связывание белков экстракта с предсинтезированными ДНК-субстратг содержащими на З'-конце праймера dNMP напротив матричного "звена", в болы

ени зависит от типа "звена", чем от типа dNMP (где dNMP - dCMP или dAMP, то" - G, 8oxoG или THF).

. С помощью сочетания методов фотоаффинной модификации и уноферментного анализа в экстрактах клеток найдены белки, модействующие со всеми исследованными ДНК-структурами: в ядерном ракте семенников крупного рогатого скота таким белком оказалась поли(АОР->зо)полимераза 1; в ядерном экстракте клеток HeLa - пол X.

Работа выполнена в рамках проектов:

INTAS YSF№ 06-1000014-6307,

программа РАН "Молекулярная и клеточная биология",

РФФИ No 09-04-00899-а

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Belousova Е.А.. Rechkunova N.I., Lavrik O.I. Thermostable DNA polymerases can perform translesion synthesis using 8-oxoguanine and tetrahydrofuran-containing DNA templates // Biochimica and Biophysica Acta. -2006. -V. 1764.-P. 97-104.

2. Belousova E.A.. Crespan E., Lebedeva N.A., Rechkunova N.I., Httbscher U., Maga G. and Lavrik O.I. Photoreactive DNA probes as a tool for studying the translesion synthesis system in Mammalian cell extracts // Medicinal Chemistry. -2008.-V. 4.-P. 155-162.

3. Красикова Ю.С., Белоусова E.A.. Лебедева H.A., Пестряков П.Е., Лаврик О.И. Взаимодействие ДНК-полимеразы X и репликативного белка А в процессе синтеза ДНК через повреждение // Биохимия. -2008. -Т. 73. -С. 1294-1299.

4. Штыгашева А.А., Белоусова Е.А.. Речкунова Н.И., Лебедева Н.А., Лаврик О.И. ДНК-полимеразы р и X как потенциальные участники системы синтеза через повреждение в процессе репликации отстающей цепи геномной ДНК // Биохимия. -2008. -Т. 73. -С. 1504-1512.

Изд. лиц. ИД №04060 от 20.02.2001 Подписано к печати и в свет 27.01.2010 Формат бумаги 60x84. Печ. л. 1.1.Уч.-изд. л. 1. Тираж 130 экз. Заказ №218 Институт неорганической химии им. А.В. Николаева СО РАН Просп. акад. Лаврентьева, 3, Новосибирск, 630090

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Белоусова, Екатерина Анатольевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРА ТУРЫ.

1.1. Номенклатура ДНК-полимераз.

1.2. Особенности строения ДНК-полнмераз.

1.2.1. ДНК-полимеразы Х-семейства: структурные характеристики (доменная организация).

1.2.2. Механизм работы полимеразного центра.

1.3. ДНК-полимераза ¡1.

1.3.1. Структурная организация ДНК-полимеразы ft.

1.3.2. Биохимические свойства ДНК-полимеразы ft.

1.3.3. Биологическая роль ДНК-полимеразы /?.

1.3.4. ДНК-полимераза /?: канцерогенез и старение.

1.4. ДНК-полимераза Л.

1.4.1. Структурная организация ДНК-полимеразы Я.

1.4.2. Биохимические свойства ДНК-полимеразы X.

1.4.3. Биологическая роль ДНК-полимеразы X.

1.5. Синтез ДНК через повреждение.

1.5.1. Общие сведения.

1.5.2. Участие ДНК-полимераз Puke синтезе ДНК через повреждение.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Выделение рекомбинантной ДНК-полимеразы Я человека.

2.2. Выделение рекомбинантной ДНК-полимеразы /? человека.

2.3. Выделение ядерного экстракта из клеток семенников крупного рогатого скота

2.4. Выделение ядерного экстракта из клеток HeLa.

2.5. Анализ белковых препаратов методом dot-blotting.

2. б. Получение 5'-[32Р]-радиоактивно меченых праймеров.

2.7. Определение констант диссоциации K<j комплексов ДНК •ДНК-полимераза /? и. 57 ДНК »ДНК-полимераза X методом задержки в геле.

2.8. Синтез 5'-[32Р]-радиоактивно меченых олигонуклеотидов.

ДНК-полимеразами ß и X.

2.9. Определение кинетических параметров реакции полимеризации, катализируемой ДНК-полимеразами ßuX.

2.10. Синтез ДНК через Tg, катализируемый ДНК-полгшеразой X, на ДНК-субстратах DNAgap5.

2.11. Влияние hRPA и его мутантной формы hABCD на TLS-активность ДНК-полимеразы X при синтезе ДНК-субстратов, содержащих протяженные 5'-оц-участки.

2.12. Влияние hRPA и hPCNA на TLS-активность ДНК-полимераз ß и X при синтезе ДНК-субстратов, содержащих бреши.:.

2.13. Синтез ДНК, катализируемый белками ядерного экстракта клеток HeLa, на THF-, 8oxoG- и G-содержащих матрицах.

2.14. Связывание ДНК-субстратов, содерэюащих G-, 8oxoG- и THF-фрагменты, белками ядерного экстракта клеток HeLa после синтеза ДНК в экстракте.

2.15. Синтез фотореакционноспособных 5'-[32Р]-радиоактивно меченых.

ДНК-праймеров с помощью ДНК-полимеразы ß.

2.16. Связывание предсинтезированых ДНК-субстратов, содержащих G-, 8oxoG-u THF-фрагменты, белками ядерного экстракта клеток HeLa.

2.17. Фотоаффинная модификация ДНК-полимераз ßuu Л, PARP1 и белков ядерных экстрактов Bovine testis и клеток HeLa.

2.18. Идентификация продуктов модификации белков ядерного экстракта Bovine testis методом иммунопреципитации.

2.19. Идентификация продуктов модификации белков ядерного экстракта клеток HeLa методом иммуноблотинга.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Определение констант диссоциации Kd комплексов ДНК•ДНК-полимераза ß и ДНК'ДНК-полимераза Л.

3.2. Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразами ß и X, на ДНК-субстратах, содержащих различные типы повреждений: влияние ионов Mg2+ и Мп2+.

3.2.1. Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой Д на THF-содержащих матрицах: влияние ионов Mg2+.

3.2.2. Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой ß, на THF-содержащих матрицах: влияние ионов Мп2+.

3.2.3. Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полгшеразой Д на 8охоС-содержащих матрицах: влияние ионов Mg2+.

3.2.4. Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой Д на 8охоС-содержащих матрицах: влияние ионов Мп2+.

3.2.5. Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой Д на Tg-содержащих матрицах: влияние ионов Mg2+.

3.2.6. Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой Д на Tg-содержащих матрицах: влияние ионов Мп2+.

3.2.7. Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой X, на THF-содержащих матрицах: влияние ионов Mg2+.:.

3.2.8. Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой X, на THF-содержащих матрицах: влияние ионов Мп2+.

3.2.9. Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой X, на 8охоС-содержащих матрицах: влияние ионов Mg*+.

3.2.10. Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой X, на 8охоО-содержащих матрицах: влияние ионов Мп2+.

3.2.11. Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой X, на Tg-содержащих матрицах: влияние ионов Mg2+.

3.2.12. Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой X, на Tg-содержащих матрицах: влияние ионов Мп2+.

3.3. Влияние IiRPA и hPCNA на синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразами р и X, на ДНК-субстратах, имитирующих интермедиаты TLS при репликации лидирующей и отстающей цепей ДНК.

3.3.1. Влияние hRPA на синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой X, на 8oxoG-содержащих матрицах, имитирующих интермедиаты TLS при репликации лидирующей цепи ДНК.

3.3.2. Влияние hRPA на синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой Д на THF- и 8охоС-содержащих матрицах, имитирующих интермедиаты TLS при репликации отстающей цепи ДНК.

3.3.3. Влияние hRPA на синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой Д на Tg-содержащих матрицах, имитирующих интермедиаты TLS при репликации отстающей цепи ДНК.

3.3.4. Влияние hRPA на синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой X, на THF- и 8охо0-содержащих матрицах, имитирующих интермедиаты TLS при репликации отстающей цепи ДНК.

3.3.5. Влияние hRPA на синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой X, на Tg-содержащих матрицах, имитирующих интермедиаты TLS при репликации отстающей цепи ДНК.

3.3.6. Влияние hPCNA на синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой ß, на Tg-содержащих матрицах, имитирующих интермедиаты TLS при репликации отстающей цепи ДНК.

3.3.7. Влияние hPCNA на синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой X, на Tg-содержащих матрицах, имитирующих интермедиаты TLS при репликации отстающей цепи ДНК.

3.3.8. Влияние hRPA и hPCNA на синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой ß, на Tg-содержащих матрицах, имитирующих интермедиаты TLS при репликации отстающей цепи ДНК.

3.3.9. Влияние hRPA и hPCNA на синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой X, на Tg-содержащих матрицах, имитирующих интермедиаты TLS при репликации отстающей цепи ДНК.

3.4. Взаимодействие белков ядерного экстракта клеток HeLa с ДНК-субстратами, содержащими 8oxoG- и THF-фрагменты и имитирующими интермедиаты TLS при репликации лидирующей цепи ДНК.

3.4.1. Синтез ДНК, катализируемый белками ядерного экстракта клеток HeLa, на THF-, 80X0G- и G-содержащих матрицах.

3.4.2. Связывание ДНК-субстратов, содержащих G-, 8oxoG-и THF-фрагменты, белками ядерного экстракта клеток HeLa после синтеза ДНК в экстракте.

3.4.3. Связывание предсинтезированых ДНК-субстратов, содержащих G-, 8oxoG- и THF-фрагменты, белками ядерного экстракта клеток HeLa.

3.5. Исследование состава TLS-комплексов в ядерных экстрактах семенников крупного рогатого скота Bovine testis и клеток HeLa методом фотоаффинной модификации.

3.5.1. Мечение белков ядерных экстрактов Bovine testis и клеток HeLa фотоактивными ДНК-субстратами, содержащими в своем составе 8oxoG- и THF-фрагменты и имитирующими интермедиаты TLS при репликации лидирующей цепи ДНК.

3.5.2. Меченые белков экстракта Bovine testis фотоактивными ДНК-субстратами, содержащими в своем составе 8oxoG- и THF-фрагменты и имитирующими интермедиаты TLS при репликации отстающей цепи ДНК.

3.5.3. Идентификация продуктов мечения белков ядерных экстрактов Bovine testis и клеток HeLa.Ill

3.6. Обсуждение результатов.ИЗ

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Синтез ДНК через повреждение, катализируемый ДНК-полимеразами β и λ"

Одной из ключевых стадий жизни любой делящейся клетки является процесс удвоения генетической информации. В основе этого процесса лежит копирование родительской ДНК с образованием двух дочерних молекул. Этот механизм, называемый репликацией ДНК, осуществляется в клетке комплексом белков, но только ДНК-полимеразы непосредственно обладают каталитической нуклеотидилтрансферазной активностью. По-видимому, именно способность точно реплицировать геном была наиболее значимой на ранних этапах эволюции, поэтому механизм работы всех ДНК-полимераз должен быть универсальным. На основании биохимических данных и анализа большого количества известных кристаллических структур полимераз различных структурных семейств можно выдвинуть предположение, что все ферменты данного типа используют идентичный механизм полимеризации, но имеют свои структурные и функциональные особенности.

Исходя из выполняемых функций, все нуклеотидилтрансферазы (ЕС 2.7.7), использющие dNTP или rNTP в качестве субстрата, можно разделить на пять классов: ДНК-зависимые ДНК-полимеразы (например, ДНК-полимеразы I, II и III Е. coli, ДНК-полимеразы а, ß, у млекопитающих), ДНК-зависимые РНК-полимеразы (например, РНК-полимераза I Е. coli, РНК-полимеразы I, II и III человека), РНК-зависимые ДНК-полимеразы (к ним относятся обратные транскриптазы и теломеразы), РНК-зависимые РНК-полимеразы (РНК-полимераза вируса гепатита С) и матрично-независимые полимеразы (терминальная трансфераза, поли(АДФ-рибозо)полимераза). Из сравнения аминокислотных последовательностей [1-3] и кристаллических структур [4] все ДНК-полимеразы можно разделить, по крайней мере, на семь различных семейств: семейства А, В, С, D, X, Y и семейство обратных транскриптаз [5-8]. Следует отметить, что ДНК-зависимые ДНК-полимеразы эукариот включают в себя представителей только четырех семейств - А, В, X и Y.

Основная функция ДНК-полимераз - точная репликация миллиардов нуклеотидных звеньев, кодирующих генетическую информацию организмов. Подобная непростая задача осложняется еще и тем, что геном постоянно подвергается действию различных эндогенных и экзогенных факторов, повреждающих геномную ДНК. За сутки в клетке образуется около 100000 повреждений различной природы [9]. Эти повреждения могут явиться причиной возникновения тяжелых заболеваний организма (например, рака) или даже привести к смерти. Повреждения в ДНК могут полностью блокировать репликацию или приводить к замене матричного основания, внося мутации. Кроме того, накопление повреждений в нереплицируемой ДНК может приводить к подавлению экспрессии генов, вызывая нарушение многих клеточных процессов.

Основным эндогенным источником спонтанных повреждений ДНК являются активные формы кислорода, возникающие при аэробном метаболизме. Их действие приводит к модификации гетероциклических оснований или к апуринизации ДНК, то есть к потере азотистого основания [9]. Кроме того, клетка постоянно подвергается действиям экзогенных агентов, присутствующих в окружающей среде, например, в выхлопах двигателей внутреннего сгорания или табачном дыме. Дополнительным источником повреждения ДНК являются ионизирующая радиация и УФ-спектр солнечного спектра. Эти факторы также приводят к модификациям азотистых оснований или к разрыву сахарофосфатного остова ДНК. Для репарации повреждений ДНК в клетке работает большое количество различных репарирующих систем, во многих из которых ключевыми ферментами оказываются ДНК-полимеразы. На сегодняшний момент в клетках высших эукариот насчитывают 19 ДНК-полимераз с поразительно отличающимися свойствами [10]. Функция большей части этих ферментов, открытых за последние несколько лет, сводится к участию в специальных формах репарации поврежденной ДНК. Однако среди этих ферментов есть белки, принимающие участие и в репликации поврежденной матричной ДНК. Этот процесс носит название "синтеза ДНК через повреждение" или TLS (от англ. translesion synthesis). Более того, ДНК-полимеразы могут принимать участие в контроле различных клеточных процессов, таких как прохождение клеточного цикла или переключение путей репарации.

Данная работа посвящена исследованию TLS-процесса, катализируемого ДНК-полимеразами р и 1 человека, на ДНК-субстратах, имитирующих интермедиаты репликации ДНК на лидирующей и отстающей цепях, и влиянию на этот процесс таких репликативных факторов, как hRPA (human replication protein А) и hPCNA (human proliferating cell nuclear antigen). В качестве повреждений, возникающих в результате окислительного стресса, были использованы синтетический аналог АП-сайта (тетрагидрофуран), а также широко распространенные окисленные формы оснований пуринового (8-оксогуанин) и пиримидинового (тимингликоль) ряда. В работе была опробована идея по введению фотореакционноспособной метки в ходе синтеза ДНК через повреждение с использование фотоаналогов dNTP, содержащих фотореакционно способную арилазидогруппу в гетероциклическом основании. Введение фотореакционноспособной группы напротив повреждения матричной цепи в процессе

ТЬ8 может позволить локализовать взаимодействующие с повреждением ДНК-полимеразы и другие белки, принимающие участие в этом процессе.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Белоусова, Екатерина Анатольевна

выводы

1. При изучении TLS-активноети ДНК-полимераз ß и X на частичных ДНК-дуплексах, содержащих протяженные 5'-оц-участки матрицы и имитирующих интермедиаты синтеза лидирующей цепи ДНК, и ДНК-дуплексах, содержащих моно-, ди-или пентануклеотидные бреши с З'-ОН и 5'-фосфатной группами и имитирующих интермедиаты синтеза отстающей цепи ДНК, показано, что: а) оба фермента проявляют TLS-активность на различных ДНК-дуплексах, независимо от типа повреждения, однако более эффективно синтез ДНК идет в присутствии ионов Мп2+; б) оба фермента способны катализировать синтез ДНК на тетрагидрофуран-содержащих матрицах только в присутствии ионов Мп2+; в) встраивание корректного dCMP напротив 8-оксогуанина ДНК-полимеразой ß в присутствии ионов Mg2+ и ДНК-полимеразой X в присутствии ионов Мп2+ происходит в 2 раза более эффективно по сравнению со встраиванием некорректного dAMP; г) dATP и dGTP являются предпочтительными субстратами при синтезе через тимингликоль, катализируемый ДНК-полимеразой X, в то время как ДНК-полимераза ß не обладает определенной специфичностью при прохождении этого типа повреждений. Кроме того, ДНК-полимераза X способна вести синтез ДНК непосредственно после встраивания корректного dAMP напротив тимингликоля в ДНК-субстраты, содержащие протяженные 5-оц-участки матрицы или пентануклеотидные бреши.

2. Впервые показано, что hRPA стимулирует TLS-активность ДНК-полимеразы X на 8-оксо1уанин-содержащих ДНК с протяженными 5-оц-участками, находясь в глобулярной, но не вытянутой конформации. Этот эффект обусловлен белок-белковыми взаимодействиями между ДНК-полимеразой и репликативным фактором А.

3. При исследовании влияния hRPA и hPCNA на синтез ДНК через тимингликоль, катализируемый ДНК-полимеразами ß и X, в ДНК-дуплексах, содержащих бреши, впервые показано, что: а) hPCNA оказывает стимулирующее действие на TLS-активность ДНК-полимеразы X, в то время как hRPA не проявляет специфического влияния на работу этого фермента; б) синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой ß, как на поврежденной, так и на интактной матрице не зависит от присутствия hPCNA; hRPA не проявляет специфического влияния на работу фермента.

4. Исследована способность белков фракционированного ядерного экстракта клеток HeLa использовать в качестве субстратов синтеза ДНК ДНК-дуплексы, содержащие тетрагидрофуран и 8-оксогуанин и имитирующие интермедиаты синтеза лидирующей цепи ДНК. Показано, что: а) dCTP, но не dATP является предпочтительным субстратом при синтезе с использованием 8-оксогуанин и гуанин-содержащих ДНК белками экстракта; б) связывание белков экстракта с предсинтезированными ДНК-субстратами, содержащими на З'-конце праймера dNMP напротив матричного "звена", в большей степени зависит от типа "звена", чем от типа dNMP (где dNMP - dCMP или dAMP, "звено" - G, 8oxoG или THF).

5. С помощью сочетания методов фотоаффинной модификации и иммуноферментного анализа в экстрактах клеток найдены белки, взаимодействующие со всеми исследованными ДНК-структурами: в ядерном экстракте семенников крупного рогатого скота таким белком оказалась поли(АБР-рибозо)полимераза 1; в ядерном экстракте клеток HeLa - пол X.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Белоусова, Екатерина Анатольевна, Новосибирск

1. Delarue M., Poch 0., Tordo N., Moras D., Argos P. An attempt to unify the structure of polymerases // Protein Eng. 1990. V. 3. P. 461-467.

2. Braithwaite D.K., Ito J. Compilation, alignment, and phylogenetic relationships of DNA polymerases //Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 787-802.

3. Ito J„ Braithwaite D.K. Compilation and alignment of DNA polymerase sequences // Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. P. 4045-4057.

4. Joyce C.M., Steitz T.A. Function and structure relationships in DNA polymerases // Annu. Rev. Biochem. 1994. V. 63. P. 777-822.

5. Cann I.K., Ishino Y. Archaeal DNA replication: identifying the pieces to solve a puzzle // Genetics. 1999. V. 152. P. 1249-1267.

6. Huang H., Chopra R., Verdine G.L., Harrison S.C. Structure of a covalently trapped catalytic complex of HIV-1 reverse transcriptase: implications for drug resistance // Science.1998. V. 282. P. 1669-1675.

7. Ramadan K., Shevelev I., Hubscher U. The DNA-polymerase-X family: controllers of DNA quality? // Nature. 2004. V. 5. P. 1038-1043.

8. Friedberg E.C., Wagner R., Radman M. Specialized DNA polymerases, cellular survival, and the genesis of mutations // Science. 2002. V. 296. P. 1627-1630.

9. Hübscher U., Maga G., Spadari S. Eukaryotic DNA polymerases // Annu. Rev. Biochem. 2002. V. 71. P. 133-163.

10. Bessman M.J., Kornberg A., Lehman I.R., Simms E.S. Enzymic synthesis of deoxyribonucleic acid// Biochim. Biophys. Acta. 1956. V. 21. P. 197-198.

11. Weissbach A., Baltimore D., Bollum F., Gallo R., Korn D. Nomenclature of eukaryotic DNA polymerases // Science. 1975. V.190. P. 401-402.

12. Burgers P.M., Bambara R.A., Campbell J.L., Chang L.M., Downey K.M., Hübscher U., Lee M.Y., Linn S.M., So A.G., Spadari S. Revised nomenclature for eukaryotic DNA polymerases // Eur. J. Biochem. 1990. V. 191. P. 617-618.

13. Sharief F.S., Vojta P.J., Ropp P.A., Copeland W.C. Cloning and chromosomal mapping of the human DNA polymerase theta (POLQ), the eighth human DNA polymerase // Genomics.1999. V. 59. P. 90-96.

14. Aoufouchi S., Flatter E., Dahan A., Faili A., Bertocci B., Storck S., Delbos F., Cocea L., Gupta N., Weill J.C., Reynaud C.A. Two novel human and mouse DNA polymerases of the polX family //Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. P. 3684-3693.

15. Tang M., Shen X., Frank E.G., O'Donnell M., Woodgate R., Goodman M.F. UmuD'(2)C is an error-prone DNA polymerase, Escherichia coli pol V // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 1999. V. 96. P. 8919-8924.

16. Wagner J., Graz P., Kim S.R., Yamada M., Matsui K., Fuchs R.P., Nohmi T. The dinB gene encodes a novel E. coli DNA polymerase, DNA pol IV, involved in mutagenesis // Mol. Cell. 1999. V. 4. P. 281-286.

17. Johnson R.E., Prakash S., Prakash L. Efficient bypass of a thymine-thymine dimer by yeast DNA polymerase, Poleta// Science. 1999. V. 283. P. 1001-1004.

18. Masutani C., Kusumoto R., Yamada A., Dohmae N., Yokoi M., Yuasa M., Araki M., Iwai S., Takio K., Hanaoka F. The XPV (xeroderma pigmentosum variant) gene encodes human DNA polymerase eta //Nature. 1999. V. 399. P. 700-704.

19. Aravind L., Koonin E.V. Phosphoesterase domains associated with DNA polymerases of diverse origins // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 3746-3752.

20. Aravind L., Koonin E.V. DNA polymerase beta-like nucleotidyltransferase superfamily: identification of three new families, classification and evolutionary history // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 1609-1618.

21. Wang Z., Castaño I.B., De Las Peñas A., Adams C., Christman M.F. Pol kappa: A DNA polymerase required for sister chromatid cohesion // Science. 2000. V. 289. P. 774-779.

22. Nagasawa K., Kitamura K., Yasui A., Nimura Y., Ikeda K., Hirai M., Matsukage A., Nakanishi M. Identification and characterization of human DNA polymerase beta 2, a DNA polymerase beta-related enzyme // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 31233-31238.

23. Burtis K.C., Harris P.V. A possible functional role for a new class of eukaryotic DNA polymerases // Curr. Biol. 1997. V. 7. P. R743-R744.

24. Johnson R.E., Prakash S., Prakash L. The human DINB1 gene encodes the DNA polymerase Poltheta// Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 2000. V. 97. P. 3838-3843.

25. Ohashi E., Ogi T, Kusumoto R., Iwai S., Masutani C., Hanaoka F., Ohmori H. Error-prone bypass of certain DNA lesions by the human DNA polymerase kappa // Genes Dev. 2000. V. 14. P. 1589-1594.

26. Zhang Y., Yuan F., Wu X., Wang M., Rechkoblit O., Taylor J.S., Geacintov N.E., Wang Z. Error-free and error-prone lesion bypass by human DNA polymerase kappa in vitro // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. P. 4138-4146.

27. Wang J., Sattar A.K., Wang C.C., Karam J.D., Königsberg W.H., Steitz T.A. Crystal structure of a pol alpha family replication DNA polymerase from bacteriophage RB69 // Cell. 1997. V. 89. P. 1087-1099.

28. Brautigam C.A., Steitz T.A. Structural and functional insights provided by crystal structures of DNA polymerases and their substrate complexes // Curr. Opin. Struct. Biol. 1998. V. 8. P. 54-63.

29. Steitz T.A., Smerdon S.J., Jäger J., Joyce C.M. A unified polymerase mechanism for nonhomologous DNA and RNA polymerases // Science. 1994. V. 266. P. 2022-2025.

30. Eom S.H., Wang J., Steitz T.A. Structure of Taq polymerase with DNA at the polymerase active site//Nature. 1996. V. 382. P. 278-281.

31. Pelletier H., Sawaya M.R., Kumar A., Wilson S.H., Kraut J. Structures of ternary complexes of rat DNA polymerase beta, a DNA template-primer, and ddCTP // Science. 1994. V. 264. P. 1891-1903.

32. Sawaya M.R., Prasad R., Wilson S.H., Kraut J., Pelletier H.Crystal structures of human DNA polymerase beta complexed with gapped and nicked DNA: evidence for an induced fit mechanism//Biochemistry. 1997. V. 36. P. 11205-11215.

33. Garcia-Diaz M., Bebenek K., Krahn J.M., Kunkel T.A., Pedersen L.C. A closed conformation for the Pol lambda catalytic cycle // Nat. Struct. Mol. Biol. 2005. V. 12. P. 97-98.

34. Moon A.F., Garcia-Diaz M., Bebenek K., Davis B.J., Zhong X., Ramsden D.A., Kunkel T.A., Pedersen L.C. Structural insight into the substrate specificity of DNA Polymerase mu // Nat. Struct. Mol. Biol. 2007. V. 14. P. 45-53.

35. Delarue M., Boule J.B., Lescar J., Expert-Bezancon N., Jourdan N., Sukumar N., Rougeon F., Papanicolaou C. Crystal structures of a template-independent DNA polymerase: murine terminal deoxynucleotidyltransferase // EMBO J. 2002. V. 21. P. 427-439.

36. Beard W.A., Wilson S.H. Structural insights into the origins of DNA polymerase fidelity // Structure. 2003. V. 11. P. 489-496.

37. Srivastava D.K., Berg B.J., Prasad R., Molina J.T., Beard W.A., Tomkinson A.E., Wilson S.H. Mammalian abasic site base excision repair. Identification of the reaction sequence and rate-determining steps // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 21203-21209.

38. Sobol R.W., Prasad R., Evenski A., Baker A., Yang X.P., Horton J.K., Wilson S.H. The lyase activity of the DNA repair protein beta-polymerase protects from DNA-damage-induced cytotoxicity //Nature. 2000. V. 405. P. 807-810.

39. Batra V.K., Beard W.A., Shock D.D., Krahn J.M., Pedersen L.C., Wilson S.H. Magnesium-induced assembly of a complete DNA polymerase catalytic complex // Structure. 2006io V. 14. P. 757-766.

40. Nick McElhinny S.A., Ramsden D.A. Sibling rivalry: competition between Pol X family members in V(D)J recombination and general double strand break repair // Immunol. Rev. 2004. V. 200. P. 156-164.

41. Ma Y., Lu H., Schwarz K., Lieber M.R. Repair of double-strand DNA breaks by the human nonhomologous DNA end joining pathway: the iterative processing model // Cell Cycle. 2005. V. 4. P. 1193-1200.

42. Mahajan K.N., Nick McElhinny S.A., Mitchell B.S., Ramsden D.A. Association of DNA polymerase mu (pol mu) with Ku and ligase IV: role for pol mu in end-joining double-strand break repair // Mol. Cell Biol. 2002. V. 22. P. 5194-5202.

43. Fan W., Wu X. DNA polymerase lambda can elongate on DNA substrates mimicking non-homologous end joining and interact with XRCC4-ligase IV complex // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. V. 323. P. 1328-1333.

44. Bork P., Hofmann K., Bucher P., Neuwald A.F., Altschul S.F., Koonin E.V. A superfamily of conserved domains in DNA damage-responsive cell cycle checkpoint proteins // FASEB J. 1997. V. 11. P. 68-76.

45. Bryant F.R., Johnson K.A., Benkovic S.J. Elementary steps in the DNA polymerase I reaction pathway//Biochemistry. 1983. V. 22. P. 3537-3546.

46. Steitz T.A. DNA- and RNA-dependent DNA polymerases // Curr. Opin. Struct. Biol. 1993. V. 3. P. 31-38.

47. Steitz T.A. DNA Polymerases: Structural Diversity and Common Mechanisms // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 17395-17398.

48. Sawaya M.R., Pelletier H., Kumar A., Wilson S.H., Kraut J. Crystal structure of rat DNA polymerase beta: evidence for a common polymerase mechanism // Science. 1994. V. 264. P. 1930-1935.

49. Steitz T.A. A mechanism for all polymerases // Nature. 1998. V. 391. P. 231-232.

50. Osheroff W.P., Beard W.A., Wilson S.H., Kunkel T.A. Base substitution specificity of DNA polymerase beta depends on interactions in the DNA minor groove // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 20749-20752.

51. Osheroff W.P., Beard W.A., Yin S., Wilson S.H., Kunkel T.A. Minor groove interactions at the DNA polymerase beta active site modulate single-base deletion error rates // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 28033-28038.

52. Garcia-Diaz M., Bebenek K., Krahn J.M., Blanco L., Kunkel T.A., Pedersen L.C. A structural solution for the DNA polymerase lambda-dependent repair of DNA gaps with minimal homology // Mol. Cell. 2004. V. 13. P. 561-572.

53. Boule J.B., Rougeon F., Papanicolaou C. Terminal deoxynucleotidyl transferase indiscriminately incorporates ribonucleotides and deoxyribonucleotides // J. Biol. Chem. 2001. V.276. P. 31388-31393.

54. Nick McElhinny S.A., Ramsden D.A. Polymerase mu is a DNA-directed DNA/RNA polymerase // Mol. Cell. Biol. 2003. V. 23. P. 2309-2315.

55. Yang W. Damage repair DNA polymerases Y // Curr. Opin. Struct. Biol. 2003. V. 13. P. 23-30.

56. Zhang Y., Wu X., Guo D., Rechkoblit O., Taylor J.S., Geacintov N.E., Wang Z. Lesion bypass activities of human DNA polymerase mu // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 4458244587.

57. Doublie S., Tabor S., Long A.M., Richardson C.C., Ellenberger T. Crystal structure of a bacteriophage T7 DNA replication complex at 2.2 A resolution //Nature. 1998. V. 391. P. 251258.

58. Freemont P.S., Friedman J.M., Beese L.S., Sanderson M.R., Steitz T.A. Cocrystal structure of an editing complex of Klenow fragment with DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1988. V. 85. P. 8924-8928.

59. Beese L.S., Derbyshire V., Steitz T.A. Structure of DNA polymerase I Klenow fragment bound to duplex DNA// Science. 1993. V. 260. P. 352-355.

60. Yang W. Portraits of a Y-family DNA polymerase // FEBS Lett. 2005. V. 579. P. 868872.

61. Prakash S.3 Johnson R.E., Prakash L. Eukaryotic translesion synthesis DNA polymerases: specificity of structure and function // Annu. Rev. Biochem. 2005. V. 74. P. 317353.

62. Chang L.M., Bollum F.J. Low molecular weight deoxyribonucleic acid polymerase in mammalian cells //J. Biol. Chem. 1971. V. 246. P. 5835-5837.

63. Weissbach A., Schlabach A., Fridlender B., Bolden A. DNA polymerases from human cells //Nat. New Biol. 1971. V. 231. P. 167-170.

64. Baril E.F., Brown O.E., Jenkins M.D., Laszlo J. Deoxyribonucleic acid polymerase with rat liver ribosomes and smooth membranes. Purification and properties of the enzymes // Biochemistry. 1971. V. 10. P. 1981-1992.

65. Kumar A., Abbotts J., Karawya E.M., Wilson S.H. Identification and properties of the catalytic domain of mammalian DNA polymerase beta // Biochemistry. 1990. V. 29. P. 71567159.

66. Matsumoto Y., Kim K. Excision of deoxyribose phosphate residues by DNA polymerase beta during DNA repair// Science. 1995. V. 269. P. 699-702.

67. Casas-Finet J.R., Kumar A., Morris G., Wilson S.H., Karpel R.L. Spectroscopic studies of the structural domains of mammalian DNA beta-polymerase // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 19618-19625.

68. Casas-Finet J.R., Kumar A., Karpel R.L., Wilson S.H. Mammalian DNA polymerase beta: characterization of a 16-kDa transdomain fragment containing the nucleic acid-binding activities of the native enzyme // Biochemistry. 1992. V. 31. P. 10272-10280.

69. Prasad R., Kumar A., Widen S.G., Casas-Finet J.R., Wilson S.H. Identification of residues in the single-stranded DNA-binding site of the 8-kDa domain of rat DNA polymerase beta by UV cross-linking // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 22746-22755.

70. Beard W.A., Shock D.D., Vande Berg B.J., Wilson S.H. Efficiency of correct nucleotide insertion governs DNA polymerase fidelity // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 47393-47398.

71. Beard W.A., Wilson S.H. Structural insights into DNA polymerase beta fidelity: hold tight if you want it right // Chem. Biol. 1998. V. 5. P. R7-R13.

72. Jezewska M.J., Rajendran S., Bujalowski W. Transition between different binding modes in rat DNA polymerase beta-ssDNA complexes // J. Mol. Biol. 1998. V. 284. P. 11131131.

73. Rajendran S., Jezewska M.J., Bujalowski W. Human DNA polymerase b recognizes single-stranded DNA using two different binding modes // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 31021-31031.

74. Jezewska M.J., Rajendran S., Bujalowski W. Interactions of the 8-kDa domain of rat DNA polymerase b with DNA // Biochemistry. 2001. V. 40. P. 3295-3307.

75. Rajendran S., Jezewska M.J., Bujalowski W. Recognition of template-primer and gapped DNA substrates by the human DNA polymerase beta // J. Mol. Biol. 2001. V. 308. P. 477-500.

76. Bujalowski W. Thermodynamic and kinetic methods of analyses of protein-nucleic acid interactions. From simpler to more complex systems // Chem. Rev. 2006. V. 106. P. 556-606.

77. Tang K.H., Niebuhr M., Aulabaugh A., Tsai M.D. Solution structures of 2:1 and 1:1 DNA polymerase-DNA complexes probed by ultracentrifugation and small-angle X-ray scattering//Nucleic Acids Res. 2008. V. 36. P. 849-860.

78. Werneburg B.G., Ahn J, Zhong X., Hondal R.J., Kraynov V.S., Tsai M.D. DNA polymerase beta: pre-steady-state kinetic analysis and roles of arginine-283 in catalysis and fidelity // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 7041-7050.

79. Dunlap C.A., Tsai M.D. Use of 2-aminopurine and tryptophan fluorescence as probes in kinetic analyses of DNA polymerase beta // Biochemistry. 2002. V. 41. P. 11226-11235.

80. Abbotts J., SenGupta D.N., Zmudzka B., Widen S.G., Notario V., Wilson S.H. Expression of human DNA polymerase beta in Escherichia coli and characterization of the recombinant enzyme//Biochemistry. 1988. V. 27. P. 901-909.

81. Date T., Yamaguchi M., Hirose F., Nishimoto Y., Tanihara K., Matsukage A. Expression of active rat DNA polymerase beta in Escherichia coli // Biochemistry. 1988. V. 27. P. 2983-2990.

82. Kim S.J., Lewis M.S., Knutson J.R., Porter D.K., Kumar A., Wilson S.H. Characterization of the tryptophan fluorescence and hydrodynamic properties of rat DNA polymerase beta // J. Mol. Biol. 1994. V. 244. P. 224-235.

83. Davies J.F. 2nd, Almassy R.J., Hostomska Z., Ferre R.A., Hostomsky Z. 2.3 A crystal structure of the catalytic domain of DNA polymerase beta // Cell. 1994. V. 76. P. 1123-1133.

84. Bergoglio V., Ferrari E., Hübscher U., Cazaux C., Hoffmann J.S. DNA polymerase beta can incorporate ribonucleotides during DNA synthesis of undamaged and CPD-damaged DNA // J. Mol. Biol. 2003. V. 331. P. 1017-1023.

85. Singhai R.K., Wilson S.H. Short gap-filling synthesis by DNA polymerase beta is processive//J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 15906-15911.

86. Ahn J., Kraynov V.S., Zhong X., Werneburg B.G., Tsai M.D. DNA polymerase beta: effects of gapped DNA substrates on dNTP specificity, fidelity, processivity and conformational changes // Biochem. J. 1998. V. 331. P. 79-87.

87. Podust V.N., Hübscher U. Lagging strand DNA synthesis by calf thymus DNA polymerases alpha, beta, delta and epsilon in the presence of auxiliary proteins // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 841-846.

88. Dianov G.L., Prasad R, Wilson S.H., Bohr V.A. Role of DNA polymerase beta in the excision step of long patch mammalian base excision repair // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P.13741-13743.

89. Kunkel T.A. The mutational specificity of DNA polymerase-beta during in vitro DNA synthesis. Production of frameshifit, base substitution, and deletion mutations // J. Biol. Chem. 1985. V. 260. P. 5787-5796.

90. Eckert K.A., Hile S.E., Vargo P.L. Development and use of an in vitro HSV-tk forward mutation assay to study eukaryotic DNA polymerase processing of DNA alkyl lesions // Nucleic Acids Res.1997. V. 25. P. 1450-1457.

91. Chagovetz A.M., Sweasy J.B., Preston B.D. Increased activity and fidelity of DNA polymerase beta on single-nucleotide gapped DNA // J. Biol. Chem. 1997.V. 272, P. 2750127504.

92. Osheroff W.P., Jung H.K., Beard W.A., Wilson S.H., Kunkel T.A. The fidelity of DNA polymerase beta during distributive and processive DNA synthesis // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 3642-3650.

93. Streisinger G., Owen J. Mechanisms of spontaneous and induced frameshift mutation in bacteriophage T4 // Genetics. 1985. V. 109. P. 633-659.

94. Bennett S.E., Sung J.S., Mosbaugh D.W. Fidelity of uracil-initiated base excision DNA repair in DNA polymerase beta-proficient and -deficient mouse embryonic fibroblast cell extracts //J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 42588-42600.

95. Zhang Q.M., Dianov G.L. DNA repair fidelity of base excision repair pathways in human cell extracts // DNA Repair (Amst.). 2005. V. 4. P. 263-270.

96. Nowak R., Woszczynski M., Siedlecki J.A. Changes in the DNA polymerase beta gene expression during development of lung, brain, and testis suggest an involvement of the enzyme in DNA recombination // Exp. Cell Res. 1990. V. 191. P. 51-56.

97. Alcivar A.A., Hake L.E., Hecht N.B. DNA polymerase-beta and poly(ADP)ribose polymerase mRNAs are differentially expressed during the development of male germinal cells // Biol. Reprod. 1992. V. 46. P. 201-207.

98. Gu H., Marth J.D., Orban P.C., Mossmann H., Rajewsky K. Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targeting // Science. 1994. V. 265 P. 103-106.

99. Sugo N., Aratani Y., Nagashima Y., Kubota Y., Koyama H. Neonatal lethality with abnormal neurogenesis in mice deficient in DNA polymerase beta // EMBO J. 2000. V. 19. P. 1397-1404.

100. Plug A.W., Clairmont C.A., Sapi E., Ashley T., Sweasy J.B. Evidence for a role for DNA polymerase beta in mammalian meiosis // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997. V. 4. P. 1327-1331.

101. Sobol R.W., Horton J.K., Kiihn R., Gu H., Singhal R.K., Prasad R., Rajewsky K., Wilson S.H. Requirement of mammalian DNA polymerase-beta in base-excision repair // Nature. 1996. V. 379. P. 183-186.

102. Horton J.K., Watson M., Stefanick D.F., Shaughnessy D.T., Taylor J.A., Wilson S.H. XRCC1 and DNA polymerase beta in cellular protection against cytotoxic DNA single-strand breaks // Cell Res. 2008. V. 18. P. 48-63.

103. Fortini P., Pascucci B., Belisario F., Dogliotti E. DNA polymerase P is required for efficient DNA strand break repair induced by methyl methanesulfonate but not by hydrogen peroxide //Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. P. 3040-3046.

104. Horton J.K., Baker A., Vande Berg B.J., Sobol R.W., Wilson S.H. Involvement of DNA polymerase p in protection against the cytotoxicity of oxidative damage // DNA Repair (Amst.). 2002. V. 1. P. 317-333. r

105. Parikh S.S., Mol C.D., Tainer J.A. Base excision repair enzyme family portrait: integrating the structure and chemistry of an entire DNA repair pathway // Structure. 1997. V. 5. P. 1543-1550.

106. Weissman, L., de Souza-Pinto, N.C., Stevnsner, T., Bohr, V.A. DNA repair, mitochondria, and neurodegeneration//Neuroscience. 2007. V. 145. P. 1318-1329.

107. Wilson 3rdD.M., Sofinowski T.M., McNeill D.R. Repair mechanisms for oxidative DNA damage // Front. Biosci. 2003. V. 8. P. d963-d981.

108. Barnes D.E., Lindahl T., Sedgwick B. DNA repair // Curr. Opin. Cell Biol. 1993.V. 5. P. 424-433.

109. Lindahl T., Nyberg B. Rate of depurination of native deoxyribonucleic acid // Biochemistry. 1972. V. 11. P. 3610-3618.

110. Atamna H., Cheung I., Ames B. N. A method for detecting abasic sites in living cells: age-dependent changes in base excision repair // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000. V. 97. P. 686-691.

111. Dianov G.L, Sleeth K.M., Dianova I.I., Allinson S.L. Repair of abasic sites in DNA // Mutat. Res. 2003. V. 531. P. 157-163.

112. Demple B., Harrison L. Repair of oxidative damage to DNA: enzymology and biology //Annu. Rev. Biochem. 1994. V. 63. P. 915-948.

113. Barzilay G., Hickson I.D. Structure and function of apurinic/apyrimidinic endonucleases//Bioessays. 1995. V. 17. P. 713-719.

114. Klungland A., Lindahl T. Second pathway for completion of human DNA base excision-repair: reconstitution with purified proteins and requirement for DNase TV (FEN1) // EMBO J. 1997. V. 16. P. 3341-3348.

115. Podlutsky A.J., Dianova I.I., Podust V.N., Bohr V.A., Dianov G.L. Human DNA polymerase beta initiates DNA synthesis during long-patch repair of reduced AP sites in DNA // EMBO J. 2001. V. 20. P. 1477-1482.

116. Cappelli E,, Taylor R., Cevasco M., Abbondandolo A., Caldecott K., Frosina G. Involvement of XRCC1 and DNA ligase III gene products in DNA base excision repair // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 23970-23975.

117. Prasad R., Dianov G.L., Bohr V.A., Wilson S.H. FEN1 stimulation of DNA polymerase beta mediates an excision step in mammalian long patch base excision repair // J. Biol. Chem. 2000. V. 275, P. 4460-4465.

118. Kim K., Biade S., Matsumoto Y. Involvement of flap endonuclease 1 in base excision DNA repair// J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 8842-8848.

119. Levin D.S., McKenna A.E., Motycka T.A., Matsumoto Y., Tomkinson A.E. Interaction between PCNA and DNA ligase I is critical for joining of Okazaki fragments and long-patch base-excision repair // Curr. Biol. 2000. V. 10. P. 919-922.

120. Tom S., Henricksen L.A., Bambara R.A. Mechanism whereby proliferating cell nuclear antigen stimulates flap endonucleasel // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 10498-10505.

121. Liu Y., Beard W.A., Shock D.D., Prasad R., Hou E.W., Wilson S.H. DNA polymerase beta and flap endonuclease 1 enzymatic specificities sustain DNA synthesis for long patch base excision repair // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 3665-3674.

122. Sukhanova M., Khodyreva S., Lavrik O. Suppression of base excision repair reactions by apoptotic 24kDa-fragment of poly(ADP-ribose) polymerase 1 in bovine testis nuclear extract // DNA Repair (Amst). 2007. V. 6. P. 615-625.

123. Bennett R.A., Wilson D.M. 3rd, Wong D., Demple B. Interaction of human apurinic endonuclease and DNA polymerase beta in the base excision repair pathway // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 1997. V. 94. P. 7166-7169.

124. Wilson S.H., Kunkel T.A. Passing the baton in base excision repair //Nat. Struct. Biol. 2000. V. 7. P. 176-178.

125. Chou K.M., Cheng Y.C. An exonucleolytic activity of human apurinic/apyrimidinic endonuclease on 3' mispaired DNA //Nature. 2002. V. 415. P. 655-659.

126. Kedar P.S., Kim S.J., Robertson A., Hou E., Prasad R., Horton J.K., Wilson S.H. Direct interaction between mammalian DNA polymerase beta and proliferating cell nuclear antigen // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 31115-311123.

127. Dantzer F., de La Rubia G., Menissier-De Murcia J., Hostomsky Z., de Murcia G., Schreiber V. Base excision repair is impaired in mammalian cells lacking Poly(ADP-ribose) polymerase-1 // Biochemistry. 2000. V. 39. P.7559-7569.

128. Sukhanova M.V., Khodyreva S.N., Lavrik O.I. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 inhibits strand-displacement synthesis of DNA catalyzed by DNA polymerase beta // Biochemistry (Mose). 2004. V. 69. P. 558-568.

129. Sukhanova M., Khodyreva S., Lavrik O. Poly(ADP-ribose) polymerase 1 regulates activity of DNA polymerase beta in long patch base excision repair // Mutat. Res. 2009. Aug 22. электронная публикация.

130. Kubota Y., Nash R.A., Klungland A., Schär P., Barnes D.E., Lindahl T. Reconstitution of DNA base excision-repair with purified human proteins: interaction between DNA polymerase beta and the XRCC1 protein // EMBO J. 1996. V. 15. P. 6662-6670.

131. Dianova I.I., Sleeth K.M., Allinson S.L., Parsons J.L., Breslin C., Caldecott K.W., Dianov G.L. XRCC1-DNA polymerase beta interaction is required for efficient base excision repair // Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. P. 2550-2555.

132. Harrigan J.A., Opresko P.L., von Kobbe C., Kedar P.S., Prasad R., Wilson S.H., Bohr V.A. The Werner syndrome protein stimulates DNA polymerase beta strand displacement synthesis via its helicase activity // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 22686-22695.

133. Zhou J., Ahn J., Wilson S.H., Prives C. A role for p53 in base excision repair // EMBO J. 2001. V. 20. P. 914-923.

134. Melo J., Toczyski D. A unified view of the DNA-damage checkpoint // Curr. Opin. Cell Biol. 2002. V. 14. P. 237-245.

135. Wang Y., Reddy S., Beard W.A., Wilson S.H., Schlick Т. Differing conformational pathways before and after chemistry for insertion of dATP versus dCTP opposite 8-oxoG in DNA polymerase beta// Biophys. J. 2007. V. 92. P. 3063-3070.

136. Crespan E., Hübscher U., Maga G. Error-free bypass of 2-hydroxyadenine by human DNA polymerase lambda with Proliferating Cell Nuclear Antigen and Replication Protein A in different sequence contexts // Nucleic Acids Res. 2007. V. 35. P. 5173-5181.

137. Batra V.K., Beard W.A., Shock D.D., Pedersen L.C., Wilson S.H. Structures of DNA polymerase beta with active-site mismatches suggest a transient abasic site intermediate during misincorporation // Mol. Cell. 2008. V. 30. P. 315-324.

138. Servant L., Cazaux C., Bieth A., Iwai S., Hanaoka F., Hoffmann J.S. A role for DNA polymerase beta in mutagenic UV lesion bypass // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 50046-50053.

139. Hoffmann J.S., Pillaire M.J., Maga G., Podust V., Hubscher U., Villani G. DNA polymerase beta bypasses in vitro a single d(GpG)-cisplatin adduct placed on codon 13 of the HRAS gene // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995. V. 92. P. 5356-5360.

140. Vaisman A., Chaney S.G. The efficiency and fidelity of translesion synthesis past cisplatin and oxaliplatin GpG adducts by human DNA polymerase beta // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 13017-13025.

141. Srivastava D.K., Husain I., Arteaga C.L., Wilson S.H. DNA polymerase beta expression differences in selected human tumors and cell lines // Carcinogenesis. 1999. V. 20. P. 1049-1054.

142. Tan X.H., Zhao M., Pan K.F., Dong Y., Dong B., Feng G.J., Jia G., Lu Y.Y. Frequent mutation related with overexpression of DNA polymerase beta in primary tumors and precancerous lesions of human stomach // Cancer Lett. 2005. V. 220. P. 101-114.

143. Albertella M.R., Lau A., O'Connor M.J. The overexpression of specialized DNA polymerases in cancer// DNA Repair (Amst.). V. 4. P. 583-593.

144. Niimi N., Sugo N., Aratani Y., Gondo Y., Katsuki M. and Koyama H. Decreased mutant frequency in embryonic brain of DNA polymerase beta null mice // Mutagenesis. 2006. V.21.P. 55-59.

145. Tomicic M.T., Thust R., Sobol R.W., Kaina B. DNA polymerase beta mediates protection of mammalian cells against ganciclovir-induced cytotoxicity and DNA breakage // Cancer Res. V. 61. P. 7399-7403.

146. Starcevic D., Dalai S., Sweasy J.B. Is there a link between DNA polymerase beta and cancer? // Cell Cycle. 2004. V. 3. P. 998-1001.

147. Dalai S., Hile S., Eckert K.A., Sun K.W., Starcevic D., Sweasy J.B. Prostate-cancer-associated I260M variant of DNA polymerase beta is a sequence-specific mutator // Biochemistry. 2005. V. 44. P. 15664-15673.

148. Pelletier H., Sawaya M.R., Wolfle W., Wilson S.H., Kraut J. A structural basis for metal ion mutagenicity and nucleotide selectivity in human DNA polymerase beta // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 12762-12777.

149. Sweasy J.B., Lang T., Starcevic D., Sun K.W., Lai C.C., Dimaio D., Dalai S. Expression of DNA polymerase beta cancer-associated variants in mouse cells results in cellular transformation// Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005. V. 102. P. 14350-14355.

150. Neijenhuis S., Begg A.C., Vens C. Radiosensitization by a dominant negative to DNA polymerase beta is DNA polymerase beta-independent and XRCC1-dependent // Radiother. Oncol. 2005. V. 76. P. 123-128.

151. Cabelof D.C., Raffoul J.J., Yanamadala S., Gañir C., Guo Z., Heydari A.R. Attenuation of DNA polymerase beta-dependent base excision repair and increased DMS-induced mutagenicity in aged mice // Mutat. Res. 2002. V. 500. P. 135-145.

152. Intano G.W., Cho E.J., McMahan C.A.,WalterC.A. Age-related base excision repair activity in mouse brain and liver nuclear extracts // J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 2003. V. 58. P. 205-211.

153. Cabelof D.C., Yanamadala S., Raffoul J.J., Guo Z., Soofi A., Heydari A.R. Caloric restriction promotes genomic stability by induction of base excision repair and reversal of its age-related decline // DNA Repair (Amst.). 2003. V. 2. P. 295-307.

154. Stuart J.A., Karahalil B., Hogue B.A., Souza-Pinto N.C., Bohr V.A. Mitochondrial and nuclear DNA base excision repair are affected differently by caloric restriction // FASEB J. 2004. V. 18. P. 595-597.

155. Krishna T.H., Mahipal S., Sudhakar A., Sugimoto H., Kalluri R., Rao K.S. Reduced DNA gap repair in aging rat neuronal extracts and its restoration by DNA polymerase beta and DNA-ligase // J. Neurochem. 2005. V. 92. P. 818-823.

156. Uchiyama Y., Kimura S., Yamamoto T., Ishibashi T., Sakaguchi K. Plant DNA polymerase lambda, a DNA repair enzyme that functions in plant meristematic and meiotic tissues // Eur. J. Biochem. 2004. V. 271. P. 2799-2807.

157. Fiala K.A., Duym W.W., Zhang J., Suo Z. Up-regulation of the fidelity of human DNA polymerase lambda by its non-enzymatic proline-rich domain // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. P. 19038-19044.

158. Duym W.W., Fiala K.A., Bhatt N., Suo Z. Kinetic effect of a downstream strand and its 5'-terminal moieties on single nucleotide gap-filling synthesis catalyzed by human DNA polymerase lambda // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. P. 35649-35655.

159. Ramadan K., Shevelev I.V., Maga G., Hübscher U. DNA polymerase lambda from calf thymus preferentially replicates damaged DNA // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 18454-18458.

160. Maga G., Shevelev I., Villani G., Spadari S., Hübscher U. Human replication protein A can suppress the intrinsic in vitro mutator phenotype of human DNA polymerase lambda // Nucleic Acids Res. 2006. V. 34. P. 1405-1415.

161. Ramadan K., Shevelev I.V., Maga G., Hubscher U. De novo DNA synthesis by human DNA polymerase lambda, DNA polymerase mu and terminal deoxyribonucleotidyl transferase // J. Mol. Biol. 2004. V. 339. P. 395-404.

162. Garcia-Diaz M., Bebenek K., Kunkel T.A., Blanco L. Identification of an intrinsic 5-deoxyribose-5-phosphate lyase activity in human DNA polymerase lambda: a possible role in base excision repair // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 34659-34663.

163. De Rose E.F., Kirby T.W., Mueller G.A., Bebenek K., Garcia-Diaz M., Blanco L., Kunkel T.A., London R.E. Solution structure of the lyase domain of human DNA polymerase lambda // Biochemistry. 2003. V. 42. P. 9564-9574.

164. Bebenek K., Garcia-Diaz M., Blanco L., Kunkel T.A. The frameshift infidelity of human DNA polymerase lambda: implications for function // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 34685-34690.

165. Villani G., Tanguy Le Gac N., Wasungu L., Burnouf D., Fuchs R.P., Boehmer P.E. Effect of manganese on in vitro replication of damaged DNA catalyzed by the herpes simplex virus type-1 DNA polymerase //Nucleic Acids Res. 2002.V. 30. P. 3323-3332.

166. Wimmer U., Ferrari E., Hunziker P., Hübscher U. Control of DNA polymerase lambda stability by phosphorylation and ubiquitination during the cell cycle // EMBO Rep. 2008. V. 9. P. 1027-1033.

167. Bertocci B., De Smet A., Flatter E., Dahan A., Bories J.C., Landreau C., Weill J.C., Reynaud C.A. Cutting edge: DNA polymerases mu and lambda are dispensable for Ig gene hypermutation // J. Immunol. 2002. V. 168.P. 3702-3706.

168. Fiala K.A., Abdel-Gawad W., Suo Z. Pre-steady-state kinetic studies of the fidelity and mechanism of polymerization catalyzed by truncated human DNA polymerase lambda. Biochemistry. 2004. V. 43. P. 6751-6762.

169. Braithwaite E.K., Prasad R., Shock D.D., Hou E.W., Beard W.A., Wilson S.H. DNA polymerase lambda mediates a back-up base excision repair activity in extracts of mouse embryonic fibroblasts //J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 18469-18475.

170. Vermeulen C., Bertocci B., Begg A.C., Vens C. Ionizing radiation sensitivity of DNA polymerase lambda-deficient cells // Radiat. Res. 2007. V. 168. P. 683-688.

171. Valerie K., Povirk L.F. Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair // Oncogene. 2003. V. 22. P. 5792-5812.

172. Lieber M.R., Ma Y., Pannicke U., Schwarz K. Mechanism and regulation of human non-homologous DNA end-joining//Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2003. V. 4. P. 712-720.

173. Maga G., Villani G., Crespan E., Wimmer U., Ferrari E., Bertocci B, Hiibscher U. 8-oxo-guanine bypass by human DNA polymerases in the presence of auxiliary proteins // Nature.2007. V. 447. P. 606-608.

174. Picher A.J., Blanco L. Human DNA polymerase lambda is a proficient extender of primer ends paired to 7,8-dihydro-8-oxoguanine // DNA Repair (Amst.). 2007. V. 6. P. 17491756.

175. Bresson A., Fuchs R.P. Lesion bypass in yeast cells: Pol eta participates in a multi-DNA polymerase process // EMBO J. 2002. V. 21. P. 3881-3887.

176. McCulloch S.D., Kokoska R.J., Masutani C., Iwai S., Hanaoka F., Kunkel T.A. Preferential cis-syn thymine dimer bypass by DNA polymerase eta occurs with biased fidelity // Nature. 2004. V. 428. P. 97-100.

177. Zhu F., Zhang M. DNA polymerase zeta: new insight into eukaryotic mutagenesis and mammalian embryonic development // World J. Gastroenterol. 2003. V. 9. P. 1165-1169.

178. Seki M., Masutani C., Yang L.W., Schuffert A., Iwai S., Bahar I., Wood R.D. High-efficiency bypass of DNA damage by human DNA polymerase Q // EMBO J. 2004. V. 23. P. 4484-4494.

179. Takata K., Shimizu T., Iwai S., Wood R.D. Human DNA polymerase N (POLN) is a low fidelity enzyme capable of error-free bypass of 5S-thymine glycol // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. P. 23445-23455.

180. Lawrence C.W., Maher V.M. Mutagenesis in eukaryotes dependent on DNA polymerase zeta and Revlp // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 2001. V. 356. P. 41-46.

181. Tissier A., Frank E.G., McDonald J.P., Iwai S., Hanaoka F., Woodgate R. Misinsertion and bypass of thymine-thymine dimers by human DNA polymerase iota // EMBO J. 2000.V. 19. P. 5259-5266.

182. Prakash S., Prakash L. Translesion DNA synthesis in eukaryotes: a one- or two-polymerase affair // Genes Dev. 2002. V. 16. P. 1872-1883.

183. Kannouche P., Broughton B.C., Volker M., Hanaoka F., Mullenders L.H., Lehmann A.R. Domain structure, localization, and function of DNA polymerase eta, defective in xeroderma pigmentosum variant cells // Genes Dev. 2001. V. 15. P. 158-172.

184. Bi X., Slater D.M., Ohmori H., Vaziri C. DNA polymerase kappa is specifically required for recovery from the benzoa.pyrene-dihydrodiol epoxide (BPDE)-induced S-phase checkpoint // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 22343-22355.

185. Sale J.E., Batters C., Edmunds C.E., Phillips L.G., Simpson L.J., Sztlts D. Timing matters: error-prone gap filling and translesion synthesis in immunoglobulin gene hypermutation // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sei. 2009. V. 364. P. 595-603.

186. Lopes M., Foiani M., Sogo J.M. Multiple mechanisms control chromosome integrity after replication fork uncoupling and restart at irreparable UV lesions // Mol. Cell. 2006. V. 21. P. 15-27.

187. Hoege C., Pfander B., Moldovan G.L., Pyrowolakis G., Jentsch S. RAD6-dependent DNA repair is linked to modification of PCNA by ubiquitin and SUMO // Nature. 2002. V. 419. P. 135-141.

188. Stelter P., Ulrich H.D. Control of spontaneous and damage-induced mutagenesis by SUMO and ubiquitin conjugation//Nature. 2003. V. 425. P. 188-191.

189. Lehmann A.R. Clubbing together on clamps: The key to translesion synthesis // DNA Repair (Amst.). 2006. V. 5. P. 404-407.

190. Nelson J.R., Lawrence C.W., Hinkle D.C. Deoxycytidyl transferase activity of yeast REVI protein//Nature. 1996. V. 382. P. 729-731.

191. Zhang Y., Wu X., Rechkoblit 0., Geacintov N.E., Taylor J.S., Wang Z. Response of human REV1 to different DNA damage: preferential dCMP insertion opposite the lesion // Nucleic Acids Res. 2002. V. 30. P. 1630-1608.

192. Ross A.L., Simpson L.J., Sale J.E. Vertebrate DNA damage tolerance requires the C-terminus but not BRCT or transferase domains of REV1 // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33. P. 1280-1289.

193. Tissier A., Kannouche P., Reck M.P., Lehmann A.R., Fuchs R.P., Cordonnier A. Co-localization in replication foci and interaction of human Y-family members, DNA polymerase pol eta and REV1 protein // DNA Repair (Amst.). 2004. V. 3. P. 1503-1514.

194. Nair D.T., Johnson R.E., Prakash L., Prakash S., Aggarwal A.K. Revl employs a novel mechanism of DNA synthesis using a protein template // Science. 2005. V. 309. P. 2219-2222.

195. Edmunds C.E., Simpson L.J., Sale J.E. PCNA ubiquitination and REV1 define temporally distinct mechanisms for controlling translesion synthesis in the avian cell line DT40 // Mol. Cell. 2008. V. 30. P. 519-529.

196. Lindahl T., Wood R.D. Quality control by DNA repair // Science. 1999. V. 286. P. 1897-1905.

197. Taylor J.S. New structural and mechanistic insight into the A-rule and the instructional and non-instructional behavior of DNA photoproducts and other lesions // Mutat. Res. 2002. V. 510. P. 55-70.

198. Ling H., Boudsocq F., Woodgate R., Yang W. Snapshots of replication through an abasic lesion; structural basis for base substitutions and frameshifts // Mol. Cell. 2004. V. 13. P. 751-762.

199. Collins A.R. Oxidative DNA damage, antioxidants, and cancer // Bioessays. 1999. V. 21. P. 238-246.

200. Moriya M. Single-stranded shuttle phagemid for mutagenesis studies in mammalian cells: 8-oxoguanine in DNA induces targeted GC~>TA transversions in simian kidney cells // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993. V. 90. P. 1122-1126.

201. Shibutani S., Takeshita M., Grollman A.P. Insertion of specific bases during DNA synthesis past the oxidation-damaged base 8-oxodG //Nature. 1991. V. 349. P. 431-434.

202. Avkin S., Livneh Z. Efficiency, specificity and DNA polymerase-dependence of translesion replication across the oxidative DNA lesion 8-oxoguanine in human cells // Mutat. Res. 2002. V. 510. P. 81-90.

203. Kamiya H. Mutagenic potentials of damaged nucleic acids produced by reactive oxygen/nitrogen species: approaches using synthetic oligonucleotides and nucleotides: survey and summary//Nucleic Acids Res. 2003. Y. 31. P. 517-531.

204. Shimazaki N., Yazaki T., Kubota T., Sato A., Nakamura A., Kurei S., Toji S., Tamai K., Koiwai O. DNA polymerase lambda directly binds to proliferating cell nuclear antigen through its confined C-terminal region // Genes Cells. 2005. V. 10. P. 705-715.

205. Fanning E., Klimovich V., Nager A.R. A dynamic model for replication protein A (RPA) function in DNA processing pathways //Nucleic Acids Res. 2006. V. 34. P. 4126-4137.

206. Khlimankov D.Iu., Rechkunova N.I., Kolpashchikov D.M., Petruseva I.O., khodyreva S.N., Favr A., Lavrik O.I. Interaction of human replication protein A with DNA-duplexes, containing gaps of varying sizes. // Mol Biol (Mosk.). 2001. V. 35. P. 827-835.

207. Fedotova E.A., Yang F., Kubareva E.A., Romanova E.A., Protsenko A.S., Viriasov M.B., Hianik T., Oretskaia T.S. Synthesis and characteristics of modified DNA fragments containing thymidine glycol residues. // Bioorg. Khim. 2008. V. 34. P. 236-244.

208. Ямщиков В. Ф. Методы молекулярной генетики и генной инженерии (под ред. Салганика Р.И.). Наука. Новосибирск. 1990. с. 145-154.

209. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

210. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

211. Widen S.G., Wilson S.H. Mammalian beta-polymerase promoter: large-scale purification and properties of ATF/CREB palindrome binding protein from bovine testes // Biochemistry. 1991. V. 30. P. 6296-6305.

212. Frouin I., Montecucco A., Biamonti G., Htibscher U., Spadari S., Maga G. Cell cycle-dependent dynamic association of cyclin/Cdk complexes with human DNA replication proteins // EMBO J. 2002. V. 21. P. 2485-2495.

213. Leskovac V. Comprehensive Enzyme Kinetics. Kluwer Academic Publishers (2nd ed.). New York. Boston. Dordrecht. London. Moscow. P. 31-49.

214. Lusetti S.L., Cox M.M. The bacterial RecA protein and the recombinational DNA repair of stalled replication forks // Annu. Rev. Biochem. 2002. V. 71. P. 71-100.

215. Mozzherin D.J., Tan C.K., Downey K.M., Fisher P.A. Architecture of the active DNA polymerase delta.proliferating cell nuclear antigen.template-primer complex // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 19862-19867.

216. Kolpashchikov D.M., Hughes P., Favre A., Baldacci G., Lavrik O.I. Localization of the large subunit of replication factor C near the 5' end of DNA primers // J. Mol. Recognit. 2001. V. 14. P. 239-244.

217. Nazarkina J.K., Petrousseva I.O., Safronov I.V., Lavrik O.I., Khodyreva S.N. Interaction of flap endonuclease-1 and replication protein A with photoreactive intermediates of DNA repair // Biochemistry (Mose.). 2003. V. 68. P. 934-942.

218. Lebedeva N.A., Rechkunova N.I., Khodyreva S.N., Favre A., Lavrik O.I. Photoaffinity labeling of proteins in bovine testis nuclear extract // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. . V. 297. P. 714-721.

219. Demeunynck M., Bailly C., Wilson (Eds) W.D. Small Molecule DNA and RNA Binders from Synthesis to Nucleic Acid Complexes // Wiley-VCH. Verlag GmbH and Co. KCaA. Weinheim. 2003. V. 1. P. 247-277.

220. Boiteux S., Guillet M. Abasie sites in DNA: repair and biological consequences in Saccharomyces cerevisiae // DNA Repair (Amst.). 2004. V. 3. P. 1-12.

221. Hayes R.C., Petrullo L.A., Huang H.M., Wallace S.S., LeClerc J.E. Oxidative damage in DNA. Lack of mutagenicity by thymine glycol lesions // J. Mol. Biol. 1988. V. 201. P. 239246.

222. Clark J.M., Beardsley G.P. Thymine glycol lesions terminate chain elongation by DNA polymerase I in vitro // Nucleic Acids Res. 1986. V. 14. P. 737-749.

223. Ide H., Kow Y.W., Wallace S.S. Thymine glycols and urea residues in M13 DNA constitute replicative blocks in vitro // Nucleic Acids Res. 1985. V. 13. P. 8035-8052.

224. Kow Y.W., Faundez G., Melamede R.J., Wallace S.S. Processing of model singlestrand breaks in phi X-174 RF transfecting DNA by Escherichia coli // Radiat. Res. 1985. V. 126. P. 357-366.

225. Moran E., Wallace S.S. The role of specific DNA base damages in the X-ray-induced inactivation of bacteriophage PM2 // Mutat. Res. 1985. V. 146. P. 229-241.

226. Singh K.K. Samson L. Replication protein A binds to regulatory elements in yeast DNA repair and DNA metabolism genes // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995. V. 92. P. 49074911.

227. Iftode C., Daniely Y., Borowiec J.A. Replication protein A (RPA): the eukaryotic SSB // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1999. V. 34. P. 141-180.

228. Walther A.P., Gomes X.V., Lao Ye., Lee C.G., Wold M.S. Replication Protein A Interactions with DNA. 1. Functions of the DNA-Binding and Zinc-Finger Domains of the 70-kDa Subunit // Biochemistry. 1999. V. 38. P. 3963-3973.

229. Gomes X.V., Wold M.S. Structural Analysis of Human Replication Protein A. Mapping Functional Domains of the 70-kDa Subunit // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 45344543.

230. Gomes X.V., Wold M.S. Functional Domains of the 70-kilodalton Subunit of Human

231. Replication Protein A//Biochemistry. 1996. V. 35. P. 10558-10568.i

232. Bochkareva E., Frappier L., Edwards A.M., Bochkarev A. The RPA32 Subunit of Human Replication Protein A Contains a Single-Stranded DNA-Binding Domain // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 3932-3936.1.I

233. Brill S.J., Bastin-Shanower S. Identification and Characterization of the Fourth Single-Stranded-DNA Binding Domain of Replication Protein A // Mol. Cell. Biol. 1998. V. 18. P. 7225-7234.

234. Bochkarev A., Bochkareva E., Frappier L., Edwards A.M. The Crystal Structure of the Complex of Replication Protein A Subunits RPA32 and RPA14 Reveals a Mechanism for Single-Stranded DNA Binding // EMBO J. 1999. V. 18. P. 4498-4504.

235. Pestryakov P.E., Krasikova Y.S., Petruseva I.O., Khodyreva S.N., Lavrik O.I. The role of pl4 subunit of replication protein A in binding to single-stranded DNA // Dokl. Biochem. Biophys. 2007. V. 412. P. 4-7.

236. Salas T.R., Petruseva I., Lavrik O., Saintome C. Evidence for direct contact between the RPA3 subunit of the human replication protein A and single-stranded DNA // Nucleic Acids Res. 2009. V. 37. P. 38-46.

237. Krishna T.S.R., Kong X.-P., Gary S., Burgers P.M., Kuriyan J. Crystal Structure of the Eukaryotic DNA Polymerase Processivity Factor PCNA // Cell. 1994. V. 79. P. 1233-1243.

238. Maga G., Hubscher U. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA): a dancer with many partners//J. Cell Sci. 2003. V. 116. P. 3051-3060.

239. Budzowska M., Kanaar R. Mechanisms of dealing with DNA damage-induced replication problems // Cell Biochem. Biophys. 2009. V. 53. P. 17-31.

240. Bochkareva E., Korolev S., Lees-Miller S.P., Bochkarev A. Structure of the RPA trimerization core and its role in the multistep DNA-binding mechanism of RPA // EMBO J. 2002. V.21.P. 1855-1863.

241. Pestryakov P.E., Khlimankov D.Y., Bochkareva E., Bochkarev A., Lavrik O.I. Human replication protein A (RPA) binds a primer-template junction in the absence of its major ssDNA-binding domains //Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. P. 1894-18903.

242. Khodyreva S.N., Lavrik O.I. Photoaffinity labeling technique for studying DNA replication and DNA repair// Curr. Med. Chem. 2005. V. 12. P. 641-655.

243. Biirkle A., Beneke S., Muiras M.L. Poly(ADP-ribosyl)ation and aging // Exp. Gerontol. 2004. V. 39. P. 1599-1601.

244. Furukawa T., Imamura T., Kitamoto H.K., Shimada H. Rice exonuclease-1 homologue, OsEXOl, that interacts with DNA polymerase lambda and RPA subunit proteins, is involved in cell proliferation // Plant Mol. Biol. 2008. V. 66. P. 519-531.

245. Plosky B.S., Woodgate R. Switching from high-fidelity replicases to low-fidelity lesion-bypass polymerases // Curr. Opin. Genet. Dev. 2004. V. 14. P. 113-119.

Информация о работе

Белоусова, Екатерина Анатольевна
кандидата химических наук
Новосибирск, 2010
ВАК 03.01.04

Диссертация

Синтез ДНК через повреждение, катализируемый ДНК-полимеразами β и λ - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы