Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синтез B-D-глюкозидов 6-N-ациламино-4-метилумбеллиферона и их использование для изучения субстратной специфичности В-глюкозидаз человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Синтез B-D-глюкозидов 6-N-ациламино-4-метилумбеллиферона и их использование для изучения субстратной специфичности В-глюкозидаз человека"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ БИОМЕДИЦИНСКОЙ ХИМИИ

На правах рукописи УДК 577.152:547.918

Михайлова Маргарита Александровна

СИНТЕЗ (З-О-ГЛЮКОЗИДОВ 6-Ы-АЦИЛАМИНО-4-МЕТИЛУМБЕЛЛИФЕРОНА И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ СУБСТРАТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ Р-ГЛЮКОЗИДАЗ ЧЕЛОВЕКА

Специальность 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1998

Работа выполнена в лаборатории лиганд-рецепторных взаимодействий Научно-исследовательского института биомедицинской химии РАМН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Видершайн Г.Я.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Возный Я.В.

доктор биологических наук Медведев А.Е.

Ведущая организация: Научно-производственное объединение «Витамины» МЗ РФ

Защита диссертации состоится " /Р " илОМлЯ^ 1998 г. в ^^ час. мин. на заседании Специализированного Ученого Совета Д 001.10.01 при НИИ биомедицинской химии РАМН по адресу: 119832, Москва, ул. Погодинская, д. 10 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ биомедицинской химии РАМН

Автореферат разослан л.Ц^&иЯу 1998 г.

Ученый секретарь

Специализированного Ученого Совета, кандидат биологических наук

Былинкина

ВС.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. р-Глюкозидазы относятся к группе катаболичес-ких ферментов углеводного обмена - гликозидаз, специфически расщепляющих гликозидные связи в различных углеводсодержащих биополимерах. Особый интерес к этим ферментам вызван тем, что их генетическая недостаточность в организме человека приводит к развитию тяжелых наследственных заболеваний,

В настоящее время в тканях человека обнаружено три фермента, способных отщеплять остатки р-Р-глюкозы от различных природных и синтетических субстратов. Это лизосомная и нелизосомная глкжоцереброзидазы, а также цитозоль-ная р-глюкозидаза. Наиболее широко изученным из этих ферментов является лизосомная глюкоцереброзидаза, катализирующая отщепление остатка глюкозы от глюкозилцерамида - промежуточного продукта деградации большинства комплексных гликосфинголипидов клеточных мембран. Недостаточность этого фермента в организме человека приводит к развитию одной из наиболее распространенных лизосомных болезней накопления - болезни Гоше.

В последние годы достигнут значительный прогресс в области изучения гпюкоцереброзидазы. Это касается таких аспектов как очистка и анализ кинетических свойств этого фермента, установление его аминокислотной последовательности и олигосахаридного состава, выделение и экспрессия кДНК клонов, кодирующих глюкоцереброзидазу, описание процессов биосинтеза и созревания фермента. Однако это не позволило решить ряд проблем, и, прежде всего, установить причины чрезвычайно высокой клинической гетерогенности болезни Гоше, проявления которой варьируют от тяжелой формы болезни со смертельным исходом, сопровождающейся серьезными нарушениями со стороны нервной системы, до появления первых признаков заболевания у людей, возраст которых достигает 60 - 70 лет. До сих пор не удалось установить корреляции между остаточной активностью лизосомной глкжоцереброзидазы и тяжестью течения заболевания. Кроме того, до сих пор не установлена физиологическая функция двух других р-глюкози-цаз человека, также как и их роль в проявлении симптомов болезни Гоше. Для решения этих проблем представляется необходимым детальное изучение свойств а, прежде всего, субстратной специфичности различных р-глюкозидаз человека.

Для проведения таких исследований широко применяются различные приходные и синтетические субстраты. Однако использование природных субстратов

в значительной степени ограничено сложностью их выделения, введения в них радиоактивной метки и ее тестирования. Использование в качестве субстратов различных синтетических гликозидов, содержащих в агликоновой части молекулы хромогенные или флуорогенные группировки, среди которых наибольшее применение нашел 4-метилумбеллиферил-р-0-глюкозид (МС1с), значительно упрощает определение активности гликозидаз, однако не всегда сохраняет специфичность реакции. В связи с этим представляется актуальным синтез таких флуорогенных субстратов, структура агликоновой части которых частично моделировала бы строение агликоновой части природного глюкозилцерамида.

Наличие таких субстратов может позволить более детально разобраться в механизмах наследственных нарушений, связанных с развитием болезни Гоше, а также будет способствовать дальнейшему развитию теоретических представлений о механизме действия р-глюкозидаз человека и о их роли в обмене углеводсодер-жащих соединений. Кроме того, такие исследования актуальны еще и потому, что позволяют создавать новые методы диагностики лизосомных болезней накопления.

Цель и задачи исследования. Синтез новых флуорогенных р-О-гпюкози-дов, структура которых частично моделирует структуру природного глюкозилцерамида, и изучение субстратной специфичности различных р-глюкозидаз человека по отношению к синтезированным субстратам, для выявления взаимосвязи между строением агликоновой части молекулы субстрата и каталитической активностью ферментов.

В соответствии с основной целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Синтез ряда р-0-глюкозидов на основе умбеллиферона, содержащих е агликоновой части молекулы ациламидные и алкильные заместители различной длины.

2. Исследование способности синтезированных р-Р-глюкозидов расщеп ляться под действием ферментных препаратов из различных тканей и клеток че ловека.

3. Сравнительное изучение уровня ферментативной активности в норме при болезни Гоше по отношению к различным субстратам.

4. Изучение влияния природы заместителя на скорость гидролиза синтез!/

рованных субстратов под действием очищенных препаратов различных [5-глю-козидаз человека.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые осуществлен синтез ряда p-D-глкжозидов 4-метилумбеллиферона, содержащих в агликоно-вой части N-ациламидные заместители различной длины. Проведено сравнительное изучение ферментативного гидролиза синтезированных субстратов под действием препаратов из различных тканевых источников в норме и при различных типах болезни Гоше, а также очищенными препаратами известных р-глюкозидаз человека (лизосомной и нелизосомной глюкоцереброзидазами и цитозольной р-глю-козидазой). Показано, что модификация структуры агликоновой части молекулы субстрата оказывает значительное влияние на каталитическую активность ферментов. На основании полученных данных, установлено существование новой формы р-глюкозидазы человека, предложена схема частичной очистки этого фермента из ткани почки человека, изучены его основные свойства, субстратная специфичность и субклеточная локализация.

Синтезированные p-D-глюкозиды 6-Ы-ациламино-4-метилумбеллиферона могут быть использованы для дальнейшего изучения свойств новой формы р-глю-козидазы человека, с целью выяснения его физиологической роли, в том числе и как эпигенетического фактора в проявлении фенотипических особенностей болезни Гоше.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 8 печатных работ.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на Первом Всесоюзном съезде медицинских генетиков'(Киев, 1984), IV Международном симпозиуме по медицинской генетике (Германия, Айзенах, 1986), V Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), VIII Всесоюзной конференции по химии и биохимии углеводов (Пущино, 1987) и Восьмом рабочем совещании европейской научной группы по лизосомным болезням (Франция, Аннеси, 1991). Апробация диссертации состоялась на совместной научной конференции лабораторий НИИ биомедицинской химии РАМН.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, содержит 4 схемы, 18 рисунков и 10 таблиц, и состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы»,

«Результаты исследований», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список литературы».

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Спектры ПМР снимали на приборе Bruker WM-250 (Германия), рабочая частота 250 МГц в дейтеродиметилсульфоксиде, внутренний стандарт - тетраметил-силан, УФ-спектры - на спектрофотометре Ultrospec II (Швеция) в этаноле; спектры флуоресценции - на спектрофлуориметре Shimadzu RH-5000 (Япония) в этаноле; значения углов оптического вращения получены на спектрополяриметре Perkin-Elmer 241-МС (Великобритания) при 20°С в ДМСО; ТСХ проводили на пластинах Silufol UV-254 в системах растворителей хлороформ:этилацетат (2:1) (А); хлоро-форм:бутилацетат (2:1) (Б); хлороформ:ацетон:изопропанол (10:0,5:0,5) (В); хлоро-форм:ацетон (1:3) (Г), (1:1) (Д)- Температуры плавления измеряли на приборе Во-etius (Германия).

Фибробласты кожи здоровых людей и пациентов с 1 типом болезни Гоше получены из клеточного банка Института медицинской генетики РАМН, фибробласты пациентов со 2 типом болезни Гоше были предоставлены доктором V.Suzuki (Tokio Metropolitan Institute of Medical Sciences, Япония). Препараты селезенки больных Гоше, полученные в результате спленектомии, предоставлены доктором J.Aerts (Amsterdam University, Нидерланды). Фенопип пациентов с болезнью Гоше был установлен с помощью клинических исследований.

Поли- и моноклонапьные антитела к лизосомной глюкоцереброзидазе человека были предоставлены доктором J.Aerts (Amsterdam University, Нидерланды).

Хлорангидриды карбоновых кислот получали взаимодействием соответствующей кислоты с хлористым тионилом (Бюлер К. и Пирсон Д., 1973).

Ферментные препараты из печени и почек человека, а также из селезенки здоровых людей и пациентов с болезнью Гоше получали из материалов аутопсии. Ткань отмывали от крови холодной дистиллированной водой, высушивали не фильтровальной бумаге, измельчали и гомогенизировали с двумя объемами 0,01 М фосфатно-цитратного буфера (рН 6,0) содержащего 0,5% Тритона Х-100 и 0,1 bJ NaCI в течении 1-2 мин в гомогенизаторе Поттера. Обрывки ткани удалял!-центрифугированием при 600 g в течение 10 мин. Супернатант использовали дл; определения ферментативной активности.

Лейкоциты выделяли из 50 мл цельной венозной крови, используя 3% раствор декстрана, как описано Skoog W.A. и Beck W.S. (1956).

Количество белка в ферментных препаратах определяли по методу Лоури (Lowry О.Н. et at., 1951), используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.

Лизосомная глюкоцереброзидаза была очищена до гомогенного состояния иммуноаффинной хроматографией (Aerts J.M. et al„ 1986) из препарата селезенки здорового человека. Цитозольная (3-глюкозидаза была выделена из препарата селезенки пациента с 1 типом болезни Гоше в частично очищенном виде (Shafit-Zagardo В. et al„ 1980). Частично очищенный препарат мембранной нелизосомной Р-глкжозидазы получали из селезенки больного Гоше 1 типа (Van Welly S. et al., 1993).

При определении ферментативной активности стандартная инкубационная проба (конечный объем 200 мкл) содержала 50 мкл ферментного препарата (50200 мкг белка) и 150 мкл соответствующей субстратной смеси, приготовленной на 0,2 М ацетатном буфере, рН 5,0, содержащем 0,6% таурохолат натрия (TChNa). Конечная концентрация субстрата в инкубационной пробе составляла 2 мМ в случае MGIc и 1 мМ в случае остальных субстратов. После инкубации при 37°С в течение 30-180 мин реакцию останавливали добавлением 2 мл 0,4 М глицинового буфера, рН 10,4 (в случае MGIc, NGIc и HGIc), либо 2 мл смеси этанол-0,4 М глициновый буфер, рН 10,4, 1:1 (в случае остальных субстратов). Флуоресценцию в пробах определяли с помощью спектрофпуориметра Shimadsu RF-5000. Количество расщепленных субстратов определяли по флуоресценции образующихся агликонов относительно их стандартов. Флуоресценцию 4-алкилумбеллиферонов измеряли при Хвозб. 365 нм и ЯИСп. 455 нм, а флуоресценцию 6-ациламино-4-метилумбеллиферонов при АВ03б. 385 нм и Х„СГ1. 455 нм, В качестве контроля использовали пробы не содержащие ферментных препаратов. За единицу ферментативной активности принимали количество фермента, которое расщепляло 1 нмоль субстрата за 1 ч в стандартных условиях. Удельную активность выражали количеством единиц ферментативной активности, отнесенных к 1 мг белка.

Активность очищенной лизосомной глюкоцереброзидазы определяли в присутствии 0,6% TChNa. Активность цитозольной р-глюкозидазы и мембранной глюкоцереброзидазы определяли в отсутствие детергентов при рН 5,5 и 6,0 соот-

ветственно.

Активность р-гексозаминидазы определяли используя в качестве субстрата 4-метилумбеллиферил-2-ацетамидо-2-деокси-р-0-глюкозид (МС1с1ЧАс) в конечной концентрации 1,6 мМ в 0,1 М ацетатном буфере {рН 4,5). Реакцию останавливали добавлением 2,0 мл 0,4 М глицинового буфера (рН 10,4) и образующийся в результате реакции 4-метилумбеллиферон определяли флуориметрически.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Анализ имеющихся литературных данных по специфичности известных р-глюкозидаз человека относительно различных природных и синтетических субстратов показал, что они способны в равной степени отщеплять остаток глюкозы от синтетических р-Э-глюкозидов на основе р-нитрофенола и 4-метилумбеллиферо-на. В тоже время только два из этих ферментов - лизосомная и нелизосомная глю-коцереброзидазы - способны гидролизовать природный глюкозилцерамид. Таким образом, субстратная специфичность р-0-глгакозидаз человека определяется не только топом связи углеводного остатка в молекуле субстрата, но и структурой его агликоновой части.

Молекула природного субстрата лизосомной глюкоцереброзидазы - глюко-зилцерамида состоит из глюкозы, ковапентно связанной с липидной частью, которая представляет собой сфингозин, аминогруппа которого ацилирована высшей жирной кислотой. Поэтому, для исследования субстратной специфичности различных р-глюкозидаз человека, с целью изучения влияния структурных модификаций агликоновой части молекулы субстрата на каталитические свойства ферментов, нами синтезирован ряд р-Р-глюкозидов на основе умбеллиферона, частично моделирующих структуру природного гпкжозипцерамида и содержащих в агликоновой части молекулы различные апкильные и 1М-ациламидные заместители.

Для синтеза предложены следующие соединения:

6-этаноиламино-4-метилумбеллиферил-р-0-глюкозид (ЕМОс, 1), 6-бутано-иламино-4-метилумбеллиферил-р-0-глюкозид (ВМ61с, 2), 6-октаноиламино-4-ме-тилумбеллиферил-Р-О-глюкозид (ОМв1с, 3), б-гексадеканоиламино-4-метипумбел-лиферил-р-О-глюкозид (НМФс, 4), 4-гептилумбеллиферил-р-0-глюкозид (НФс, 5), 4-нонилумбеллиферил-р-О-глюкозид (ЫИс, 6).

о и сн3-с-ы.

СН2ОН

он

ЕМв1с (1)

о н с3н7-с-м

вмас (2)

о н

С7н15-С-Ь1.

сн2он

„О^

он

о н

С15Н31-С-Н СН2ОН

^—ох 9

сн2он

ОН НОс (5)

Соединения (1) - (4) синтезированы впервые.

1. Синтез субстратов.

1.1. Синтез 6-ациламинопроизводных 4-метилумбеллиферона.

Исходным соединением в синтезе служил 4-метилумбеллиферон (7). Нитрованием (7) борфторидом нитрония в ацетонитриле получали 6-нитропроизводное 4-метилумбеллиферона (8) с выходом 66% (схема 1). Затем нитрогруппу восстанавливали действием раствора дитионита натрия в водном аммиаке и ацилирова-ли полученный 6-амино-4-метилумбеплиферон (9) хлорангидридами соответствующих карбоновых кислот по методу, обычно применяемому для избирательного ацилирования аминогруппы в о-аминофенолах. Выходы 6-ациламинопроизводных 4-метилумбеллиферона составляют 68-90 %. Строение полученных соединений (12 а-д) подтверяедено данными ИК- и ПМР-спектров и элементного анализа.

1.2. Синтез 4-алкилумбеллиферонов.

Синтез 4-алкилумбеллиферонов (14 б,в) осуществляли конденсацией резорцина с этил-3-оксодеканоатом или с этил-3-оксододеканоатом (13 а,б) соответственно (схема 2), которые, в свою очередь были синтезированы из ацетоуксусно-

Схема 1

СН3

Ыа2Э204

НО'

И = -СНЭ (а); -С3Н7 (б); -С7НП5 (в); -С15Н31 (г)

го эфира (11) ацилированием хлорангидридом соответствующей карбоновой кислоты и последующим сложноэфирным расщеплением образующихся ацилацето-уксусных эфиров (12 а,б) по реакции Хунсдикера. Выходы 4-апкилумбеллиферо-нов составляют 60-63 %. Строение полученных соединений подтверждено данными элементного анализа.

СН3 О сн2 с

о ОС2Н5

(11)

ЯчСОС!

СНз-С-СН—сч

О С=0 ОС2Н5 Я, (12 а,б)

Схема 2

1. №ОН _

2. Н2304*

НО

к-с-сн2-сч

О 0С2Н5

(13 а,б)

Оси

гл

(14 а,б)

= "^7^15 (а)

-С9Н19 (б)

1.3. Синтез-В-Р-глюкозидов.

р-О-Глюкозиды (1) - (6) получали по методу Кенигса-Кнорра (схема 3), одна из модификаций которого заключается во взаимодействии фенолят-аниона с а-бромпроизводным ацетата моносахарида. Агликоны (10 а-г) и (14 а,б) превращали

в соответствующие натриевые соли (15 а-е) действием эквимолярных количеств этилата натрия в этаноле. Затем соединения (15 а-е) гликозилировали действием ацетобромглюкозы (16).Выходы ацетатов глюкозидов (17 а-е) составляют 57-62%. Использование в синтезе соединений (17 д,е) в качестве растворителя смеси ТГФ:ДМСО, вместо смеси ацетон:вода позволило в полтора раза увеличить выход реакции на стадии гликозилирования.

Схема 3

СН2ОАс )-О.

АсО

АсО

ОАс

R = -NHCOCH3; R, = -СН3 -NHCOCH3;

-NHCOC3H7; -NHCOC7H15; -Н; -Н;

(а)

-СНз (б) -СНз (в) -СНз (г) -С7Н15 (д) -С9Н18 (е)

Глюкозиды (1) - (6) получали дезацетилированием соответствующих щетатов (17 а-е) обработкой раствором метилата натрия в метаноле. Выходы юлученных соединений составляют 70-80%. Снятие защитных групп подтверж-1ено данными ПМР-спектроскопии по исчезновению сигналов протонов ацетиль-

ных остатков (52,0 мд.).

Строение соединений (1) - (6) подтверждено данными элементного анализа и определением углов оптического вращения. Конфигурацию 1,2-транс-гликозид-ной связи подтверждает присутствие в ПМР-спектрах глюкозидов (1) - (6) дублета при 4,9-5,0 м.д. 7,5 гц).

2. Сравнительное изучение специфичности В-глюкозидаз человека по отношению к различным Флуорогенным субстратам.

2.1. Общая р-глюкозидазная активность в различных тканях и клетках человека.

Для изучения способности синтезированных р-О-глюкозидов б-Ы-ацил-амино- и 4-апкилумбеллиферонов расщепляться под действием р-глюкозидаз в качестве ферментных препаратов были использованы гомогенаты печени, почек, селезенки, лейкоцитов и фибробластов человека. Результаты по расщеплению синтезированных р-О-глюкозидов ферментными препаратами из различных источников представлены в таблице 1. Полученные данные показывают, что увеличение длины алкильного заместителя в 4-положении умбеллиферильной части молекулы субстрата с 1 до 7;9 атомов углерода приводит к незначительному увеличению скорости ферментативного гидролиза этих субстратов под действием всех изученных препаратов. Введение же ациламидного заместителя в 6-положе-ние умбеллиферильной части приводит к существенному снижению скорости гидролиза. Причем, следует отметить, что скорость гидролиза 6-ациламино-4-метил-умбеллиферил-р-О-глюкозидов обратно пропорциональна длине ациламидного заместителя.

Сравнение отношения удельных скоростей гидролиза синтезированных соединений к скорости гидролиза М61с под действием различных ферментных препаратов показывает, что для 4-гептил- и 4-нонилумбеллиферил-р-0-глюкози-дов эта величина находится в интервале 0,8 - 0,9, независимо от источника фермента, в то время, как для р-О-глюкозидов 6-ациламино-4-метилумбеллифе-рона это отношение варьирует почти в 6 раз при переходе от фибробластов и лейкоцитам. Так как соотношение различных форм р-глюкозидаз человека в значительной степени зависит от источника, полученные данные могут свидетельствовать о том, что введение ациламидного заместителя в 6-положение умбелли ферильной части молекулы субстрата приводит к заметному изменению каталити

ческой активности различных р-глюкозидаз человека по отношению к этим соединениям, в то время, как увеличение длины алкильного заместителя в 4-положении оказывает одинаковое влияние на активность этих ферментов.

Таблица 1

Общая р-глюкозидазная активность в тканях и клетках человека по отношению к

различным субстратам (нмоль/ч на мг белка).

Субстрат Источник фермента

Фибробласты Лейкоциты Печень Почка Селезенка

М61с 130 7,0 47 46 10,5

нас 157 7,7 55 53 11,6

N010 160 7,9 58 57 12,0

ЕМвЮ 12,3 3,9 8,0 7.3 1,9

ВМОс 4,6 1,6 3,8 3,5 0,9

омас 2,5 0,6 1,7 1,5 0,4

нмас 0,7 0,2 0,6 0,6 0,1

2.2. р-Глюкозидазная активность при болезни Гоше.

Так как известно, что при болезни Гоше в тканях и клетках человека наблюдается снижение активности только одной из форм р-глюкозидаз - лизосомной глюкоцереброзидазы - представлялось интересным сравнить изменение уровня р-глюкозидазной активности в препаратах от пациентов с болезнью Гоше по сравнению с контрольными препаратами при использовании различных субстратов. Данные по расщеплению различных субстратов ферментными препаратами из фибробластов и селезенки здоровых людей и пациентов с различными формами болезни Гоше представлены в таблице 2. Показано, что во всех ферментных препаратах, полученных от пациентов с болезнью Гоше активность относительно 4-алкилумбеллиферил-р-О-глюкозидов значительно снижена и составляет менее 20 % от контрольных величин. Скорость гидролиза 6-ациламино-4-метилумбеллифе-рил-р-О-глюкозидов под действием ферментных препаратов, полученных от пациентов с болезнью Гоше практически не снижалась вне зависимости от клинического фенотипа болезни. Эти данные позволяют заключить, что 6-ациламино-4-ме-типумбеллиферил-р-О-глюкоэиды не являются субстратами лизосомной глюкоцереброзидазы, а расщепляются другой (или другими) формой фермента.

Таблица 2

р-Глюкозидазная активность в норме и при болезни Гоше (нмоль/ч на мг белка).

Источник фермента Удельная активность

1\/Ю1с ЬЮ1с №1с Е1\/Ю1с В1\Ю1с ОМИс НМФс

Фибробласты

контроль 124,6 154,1 156,7 12,0 4,3 2,1 0,6

(п=5) 94,5-143,8 129,4-172,7 130,1-175,9 9,3-14,1 3,4-4,8 1,3-2,5 0,4-0,7

Пациенты

1 тип 10,5 12,2 12,4 11,9 4,3 1,9 0,5

2 тип 5,6 7,3 7,4 9,1 3,4 1,4 0,6

Селезенка

контроль 10,5 11,3 11,4 1.8 0,6 0,4 0,2

(п=3) 9,8-11,3 10,1-12,4 10,0-12,6 1,4-2,2 0,4-0,9 0,3-0,6 0,1-0,3

Пациенты

1 тип 2,0 2,1 2,1 1,5 0,8 0,6 0,3

2 тип 1,3 1,5 1,6 1,7 0,7 0,4 0,2

Это подтверждается и тем фактом, что предварительная инкубация ферментных препаратов почки человека с кондуритол В зпоксидом (СБЕ) - сильным необратимым ингибитором лизосомной глюкоцереброзидазы, также не вызывает снижения ферментативной активности при использовании в качестве субстратов б-Ы-ациламинозамещенных р-й-глюкозидов. Кроме того, снижения ферментативной активности по отношению к этим субстратам не наблюдалось и при иммуно-титровании препарата почки человека поликлональными антителами к лизосомной глкжоцереброзидазе, иммобилизованными на протеин А-сефарозе.

2.3. Гидролиз различных флуорогенных субстратов под действием очищенных препаратов В-глюкозидаз человека.

Изучен ферментативный гидролиз различных синтетических флуорогенных субстратов очищенными препаратами глюкоцереброзидазы, цитозольной р-глюко-зидазы и мембранной нелизосомной глюкоцереброзидазы. Данные по расщеплению синтезированных субстратов различными формами р-глюкозидазы человека представлены в таблице 3. Полученные результаты показывают, что увеличение длины апкильного заместителя в 4-положении 4-алкилумбеллиферил-р-0-

глюкозида с 1 до 7;9 атомов углерода приводит к незначительному увеличению скорости гидролиза субстратов не только под действием лизосомной глюкоце-реброзидазы, но и под действием двух других р-глюкозидаз человека, т.е. наличие апкильного заместителя в молекуле субстрата не оказывает влияния на субстратную специфичность этих ферментов. Введение ациламидного заместителя в 6-положение умбеллиферильной части молекулы субстрата приводит к резкому снижению скорости гидролиза этих соединений всеми известными формами р-глюкозидаз человека. Скорость гидролиза лучшего из субстратов этой серии - ЕМС1с -под действием лизосомной глюкоцереброзидазы и цитозольной р-глкжозидазы была приблизительно в 50 раз ниже, а под действием мембранной нелизосомной глюкоцереброзидазы - в 20 раз ниже скорости гидролиза МС1с. Следует отметить, что 6-ациламино-4-метилумбеллиферил-р-0-глюкозиды гидролизуются всеми очищенными препаратами р-глюкозидаз человека в значительно меньшей степени, чем следовало было ожидать на основании данных по ферментативному расщеплению этих субстратов грубыми ферментными препаратами из различных источников.

Таблица 3

Активность очищенных р-глюкозидаз человека по отношению к различным субстратам (нмоль/ч на мг белка).

Субстрат лизосомная глюкоцереброзидаза цитозольная р-глюкозидаза мембранная глюкоцереброзидаза

МФс 2300000 77,8 4,9

НС1с 2750000 87,6 5,0

ЫФс 2990000 90,8 5,4

ЕМв1с 48300 0,46 0,25

В1\/Ю1с 22800 0,30 0,17

0М31с 13200 0,22 0,10

нмас 2200 0,05 0

Полученные данные позволяют предположить, что в тканях и клетках человека присутствует еще один фермент, обладающий р-О-глюкозидазной активностью. Этот фермент был назван нами ЕМС1с-аза, по названию гидролизуемого им субстрата.

С целью подтверждения этого предположения нами было предприняты дополнительные исследования.

2.4. Сравнение распределения МС!с-азной и ЕМО!с-аэной активностей в процессе ультрацентрифугирования.

Изучено распределение Е1\/ГС1с-азной и №Ю1с-азной" активностей между мембранной и растворимой фракциями в процессе центрифугирования гомогената почки человека при 80000 д (табл. 4). Полученные данные показывают, что Е1\/Ю1с-азная активность сосредоточена преимущественно в растворимой белковой фракции, в то время как около 60% Мв!с-азной активности находится в осадочной фракции.

Таблица 4

Распределение активностей МФс- и ЕМ61с-азы из почки человека в процессе

ультрацентрифугирования.

Активность (%)

Фракция мае ЕМИс

Супернатант 39 92

Осадок 58 7

2.5. ГельФильтрация.

Супернатант почки человека (80000 х 1 ч) был подвергнут фракционированию на сефадексе в-200. Элюционные профили р-глюкозидазных активностей представлены на рис. 1. Из приведенных данных видно, что распределение активности ЕМФс-азы при гельфильтрации отличается от распределения активности цитозольной р-глкжозидазы (М.в. 51-52 кДа), но совпадает с распределением активности лизосомной глкжоцереброзидазы (оба фермента имеют кажущуюся молекулярную массу порядка 120-140 кДа).

2.6. Изоэлектрофокусирование.

Супернатант, полученный после ультрацентрифугирования гомогената почки человека при 80000 д в течение 1 часа был подвергнут изоэлектрофокусирова-

_В дальнейших экспериментах использовали по одному субстрату из каждой серии. Суммарная р-глкжозидазная активность по отношению к Мв1с.

Рис. 1. Элюционные профили р-глюкозидазных активностей при гельфильтрации на Сефадексе С-200. Активность лизосомной глюкоцереброзидазы (■) определяли как СВЕ зависимый гидролиз ГиЮ1с в присутствии 0,6% ТСИЫа; цитозольной р-глюкози-дазы (□) - как гидролиз МИс в отсутствие ТСЬЫа; ЕМС1с-азы

(•) - как гидролиз ЕМ01с в 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

присутствии 0,6% ТСп№.

Номер фракции

нию (рис. 2). Показано, что ЕМФс-аза имеет дискретную изоэлектрическую точку с р1 5,0, в то время как профиль МС1с-азной активности, отражающий в данном случае распределение цитозольной р-глкжозидазы (р1 4,6) и лизосомной глюкоцереброзидазы (р! 4,0-7,6) очень гетерогенен.

Рис. 2. Изоэлектрофокусирование Р-глкжозидаз из почки человека. Активность измеряли с MGIc (■) и EMGIc (□) в присутствии 0,6% TChNa.

2.7. Хроматография на Con А-Сефарозе.

На рис. 3 представлен элюционный профиль различных р-глюкозидаз из почки человека при хроматографии на Con А-Сефарозе. Супернатант, полученный после ультрацентрифугирования гомогената почки человека при 80000 g в те-

чение 1 часа, был помещен на колонку с Con А-Сефарозой. Цитозольная р-глюко-зидаза не связывается с Con А-Сефарозой и полностью элюируется при промывании колонки 50 мМ ацетатным буфером, рН 5,3, содержащим 0,9% NaCI (буфер А). Показано, что фракции 3-6 практически не содержат лизосомной глюкоцереб-розидазы, так как их активность не снижается в присутствии СВЕ. Основная часть лизосомной глюкоцереброзиды элюировалась при добавлении к буферу А 0,1 М а-D-метилманнозида. EMGIc-аза более прочно связывалась с Con А-Сефарозой и элюировалась лишь при увеличении концентрации a-D-метилманнозида до 0,4 М.

300

К

§. 250 ■

то о.

:§■ 200 ■ |

§ 150

£ 100

0

1

0

1 50 <

IXc^-

Рис. 3. Хроматография р-глюкозидаз из почки человека на Con А-Сефаро-зе 4В. Активности р-глюкозидаз измеряли с MGIc в отсутствие (■) и в присутствии (□) 0,6% TChNa и с EMGlc в присутствии 0,6% TChNa (•). В точках, указанных стрелками 1 и 2 элюцию начинали стартовым буфером, содержащим 0,1 М и 0,4 М а-D-метилманнозид соответственно.

0

5

30

10 15 20 25 Номер фракции

Полученные данные показывают, что с помощью хроматографии на Con А-Сефарозе EMGIc-аза может быть быть практически полностью отделена от лизосомной глкжоцереброзидазы и цитозольной р-глюкозидазы.

2.8. Субклеточная локализация.

Субклеточная локализация EMGIc-азы была исследована с помощью фракционирования в градиенте плотности перколла. Как видно из рис. 4, распределение EMGIc-азной активности соответствует распределению лизосомной глкжоцереброзидазы и гексозаминидазы - маркерного фермента лизосом, в то время как нелизосомная глюкоцереброзидаза локализована в области со значительно более низкой плотностью.

Рис. 4. Распределение активностей мембранной глкжоцереброзидазы (А); лизосомной глкжоцереброзидазы (□); ЕМв1с-азы (■) и гексозаминидазы (•) при субклеточном фракционировании.

О 5 10 15 20 25 30 35 Номер фракции

3. Выделение и частичная очистка EMGIc-азы.

Для выделения ферментного препарата EMGIc-азы с целью дальнейшего изучения его свойств были использованы почки человека. Объясняется это тем, что почки, наряду с печенью являются органами наиболее богатыми EMGIc-азной активностью.

Ткань почки человека (325 г) гомогенизировали в четырех объемах 50 мМ ацетатного буфера, рН 5,3, содержащего 0,9% NaCl (буфер А) в течение 5 минут в гомогенизаторе Поттера. Гомогенат подвергали ультрацентрифугированию при 80000д в течение 1 часа с целью удаления мембранной нелизосомной глкжоцереброзидазы и значительной части лизосомной глюкоцереброзидазы.

Супернатант помещали на колонку с Con А-Сефарозой (1,6 х14,0). Колонку промывали буфером А, содержащим 0,1 М a-D-метилманнозид до полного отсутствия р-глюкозидазной активности по MGIc. EMGIc-азную активность элюировали с колонки буфером А, содержащим 0,4 М a-D-метилманнозид. Фракции, обладающие EMGIc-азной активностью объединяли, сгущали на мембране ХМ-50 и использовали в дальнейших экспериментах для изучения свойств EMGIc-азы. Контрольные эксперименты показали, что a-D-метилманнозид не оказывает влияния на EMGIc-азную активность. Полученный ферментный препарат EMGIc-азы был очищен в 250 раз по сравнению с исходным гомогенатом и практически не содержит примесей других р-глюкозидаз.

4. Изучение свойств ЕМ01с-азы,

Изучено влияние рН на активность ЕМС1с-азы. Показано, что в отсутствие детергентов фермент проявляет максимальную активность при рН 4,5; в присутствии 0,6% ТСЬЫа максимум ферментативной активности смещается на 0,5 единицы в более щелочную область.

Изучено влияние ТСИЫа и Тритона Х-100 на активность ЕМФс-азы. Показано, что как и активность лизосомной глюкоцереброзидазы, активность ЕМ61с-азы в значительной степени стимулируется ТСИМа. Максимальная активация, соответствующая трехкратному увеличению активности, наблюдается при концентрации детергента 0,6-0,7%. Тритон Х-100 не оказывает заметного влияния на активность ЕМС1с-азы в интервале концентраций 0-1%.

Исследована способность ЕМОс-азы гидролизовать различные флуороген-ные субстраты (табл. 5).

Таблица 5

Гидролиз различных флуорогенных р-Р-глюкозидов ЕМв!с-азой из почки

человека.

Субстрат Удельная активность (нмоль/ч на мг белка)

мае 81

нас 66

ыас 62

ЕМ&с 1980

вмвю 824

омас 297

;■:■, НМФС 108

Показано, что активность частично очищенного фермента относительно ЕМ&с примерно в 25 раз превышает его активность относительно №Ю1с. Увеличение длины апкильного заместителя в 4-положении умбеллиферильной части молекулы субстрата приводит к дальнейшему снижению скорости гидролиза. С увеличением длины жирнокислотного остатка в молекуле 6-ациламино-4-метил-умбеллиферил-р-О-глюкозида с 2 до 16 атомов углерода скорость гидролиза также заметно снижается, пропорционально увеличению длины заместителя. Согласно предварительным данным, фермент не способен гидролизовать глюко-

зилцерамид - природный субстрат лизосомной глюкоцереброзидазы.

Изучено влияние на активность ЕМИс-азы различных ингибиторов р-глюко-зидаз. Как видно из таблицы 6, кастаноспермин и деоксинойримицин, которые, как известно, являются мощными конкурентными ингибиторами лизосомной глюкоцереброзидазы, в значительно меньшей спепени ингибируют активность ЕМИс-азы. Такие известные ингибиторы р-глюкозидаз, как метил-р-О-глюкозид, метил-р-О-ксилозид и 0-(1,5)-глюконолактон не оказывают влияния на ЕМИс-азную активность. Кроме того, активность ЕМС1с-азы не ингибируется СБЕ, сильным необратимым ингибитором лизосомной глюкоцереброзидазы.

Таблица 6

Влияние различных ингибиторов на активность ЕМФс-азы из почки человека.

Ингибитор Конечная концентрация Удельная активность

(мМ) (% от контроля)

СВЕ 5 99,8

Метил-р-О-ксилозид 5 97,9

Метил-р-Р-глкжозид 50 108,5

0-(1,5)-глюконолактон 50 114,9

Кастаноспермин 5 56,7

Деоксинойримицин 5 66,0

Таким образом, изучение свойств ЕМв1оазы показало, что этот фермент в значительной степени отличается от всех известных в настоящее время р-глюко-зидаз человека. Это растворимый лизосомный фермент, имеющий дискретную изоэлектрическую точку - 5,0 и рН-оптимум - 4,5. Активность его не снижается при болезни Гоше, не ингибируется под действием СВЕ и й-(1,5)-глюконолактона, и активируется под действием ТСГМа. Фермент присутствует во всех исследованных типах тканей и клеток, причем его количество в значительной степени варьирует, в зависимости от источника. Высокое сродство фермента к Конканавалину А позволяет заключить, что он является гликолротеином. Дальнейшее изучение свойств этого фермента, его очистка до гомогенного состояния и получение специфических антител позволит установить его состав и даст ключ к пониманию его физиологической роли, а также его возможной роли в проявлении фенотипичес-ких особенностей болезни Гоше.

ВЫВОДЫ

1. Осуществлен синтез ряда р-й-глюкозидов на основе умбеллиферона, структура которых частично моделирует структуру природного глюкозилцерамида, и содержащих в агликоновой части молекулы Ы-ациламидные и алкильные заместители различной длины.

2. Показано, что увеличение длины апкильного заместителя в 4-положении умбел-лиферильной части молекулы субстрата с 1 до 7;9 атомов углерода приводит к незначительному увеличению скорости гидролиза этих соединений не только под действием лизосомной глюкоцереброзидазы, но и под действием остальных, известных в настоящее время р-глюкозидаз человека.

3. Введение в молекулу 4-метилумбеллиферил-р-0-глкжозида И-ациламидных заместителей в р-положение к гликозидной связи приводит к значительному снижению скорости ферментативного гидролиза этих соединений под действием различных р-глюкозидаз человека, причем с увеличением длины жирно-кислотного остатка с 2 до 16 атомов углерода скорость гидролиза 6-Ы-ацил-амино-4-метилумбеллиферил-Р-0-глюкозидов уменьшается обратнопропорцио-нально увеличению длины цепи заместителя.

4. Установлено, что скорость гидролиза 6-К1-ациламино-4-метилумбеллиферил-р-О-глюкозидов не снижается при болезни Гоше, т. е. при генетической недостаточности лизосомной глюкоцереброзидазы, в то время, как активность относительно 4-алкилумбеллиферил-р-0-глкжозидов в тканях и клетках пациентов с болезнью Гоше резко снижена.

5. Показано, что во всех исследованных типах тканей и клеток человека присутствует новая, неизвестная ранее форма р-глюкозидазы, необходимым условием для гидролитического действия которой является наличие в молекуле 4-метил-умбеллиферил-р-О-глкжозида М-ациламидного заместителя, расположенного в р-положении к гликозидной связи.

6. Разработан метод выделения новой формы р-глюкозидазы из почки человека, позволяющий получить ферментный препарат, не содержащий примесей других известных р-глюкозидаз и изучены основные свойства этого фермента (оптимум рН, влияние различных ингибиторов и детергентов на ферментативную активность, субстратная специфичность и др.).

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Козлова И.К., Камеронова (Михайлова) М.А., Ильина Г.С., Семенюк Е.П. Новые флуорогенные субстраты для биохимической диагностики некоторых наследственных гликолилидозов. Тезисы Первого Всесоюзного съезда медицинских генетиков, Киев, 1984, с. 153.

2. Видершайн Г.Я., Бейер Е.М., Беляева И.Д., Дворкин В.М., Ивлева Т.С., Ильина Г.С., Козлова И.К., Камеронова (Михайлова) М.А., Михайлов В.И. Некоторые аспекты энзимодиагностики и энзимотерапии наследственных гликолилидозов человека, Тезисы V Всесоюзного биохимического съезда, Киев, 1986, с. 258.

3. Wiederschain G.Ya., Beyer Е.М., Kozlova I.К., Mikhaylova M.A. The study of specificity of some human lysosomal glycolipid hydrolases in normal state and in glycosi-doses, Abstracts of IV Tagung der Gesellshaft fur Humangenetic DDR mit Intern Be-teiling, Eisenach, 1986, p. 28-29.

4. Козлова И.К., Михайлова M.A. Синтез гликозидов о-ациламинопроизводных 4-метилумбеллиферона. Тезисы докладов VII Всесоюзной конференции по химии и биохимии углеводов. Пущино, 1987, с. 86-87.

5. Видершайн Г.Я., Козлова И.К., Ильина Г.С., Михайлова М.А. Исследование специфичности лизосомных гликолипидгидролаз человека с помощью синтетических флуорогенных субстратов. Биоорганическая химия, 1988, т. 14, № 8, с. 10141026.

6. Wiederschain G.Ya., Kozlova I.К., Mikhaylova M.A., Beyer E.M., Raghavan S., Kolodny E., Study the specificity of human lysosomal glycolipid hydrolases with glycosides of acy!amino-4-methylumbelliferone as substrates and biochemical diagnosis of some glycolipidoses (Krabbe's disease), Abstracts of 8th ESGLD Workshop European Study Group on Lysosomal Diseases, Annecy, France, 1991, p. 87.

7. Wiederschain G.Ya., Kozlova I.K., Mikhaylova M.A., Beyer E.M., lljina G.S. The use of glycosides of 6- and 8-acylamino-4-methylumbelliferone in studies of the specificity and properties of human lysosomal glycolipid hydrolases. Carbohydrate Research, 1992, 224, p. 255-272.

8. Mikhaylova M.A., Wiederschain G.Ya., Mikhaylov V.I,, Aerts J.M.F.G. The enzymatic hydrolysis of 6-acylamino-4-methylumbelliferyl-P-D-glucosides: identification of a novel human acid p-glucosidase. Biochim. Biophys. Acta, 1996, 1317, p. 71-79.

Типография - ИБМХ РАМН. Отпечатано на Ризографе "Gestetner Сору Printer 5325"

Институт Бномеднцинской химии Российской Академии Медицинских Наук

119832 Москва, Россия, ул. Погодинская 10

Телефон: (095) 246-8465,

Факс: (095)245-0857

Эл. почта: inst@ibmh. msk. su