Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

ГЛИКОЗИДЫ 1,4-БЕНЗОКСАЗИН-З-ОНА РАСТЕНИИ ПШЕНИЦЫ И ИХ РОЛЬ В УСТОЙЧИВОСТИ К РЖАВЧИННЫМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "ГЛИКОЗИДЫ 1,4-БЕНЗОКСАЗИН-З-ОНА РАСТЕНИИ ПШЕНИЦЫ И ИХ РОЛЬ В УСТОЙЧИВОСТИ К РЖАВЧИННЫМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ"

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФИТОПАТОЛОГИИ

Д ¿УЗ/* ца Правах рукописи

ШАБАНОВА Антонина Михайловна

гликозиды 1,4-б е н 30 ксаз и н-3-0 на растения пшеницы и их роль

в устойчивости к ржавчинным

заболеваниям

(06.01.11 — фитопатология и защита растений)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА — 1980

Работа выполнена в лаборатории Всесоюзного научно-исследовательского института фитопатологии.

Научный руководитель — доктор биологических наук, про- 1 фессор Д. И. Чкаккков.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук \ О. Л. Озерецковская, кандидат биологических наук С. Л. Тю- ' терев.

Ведущее учреждение — Главный Ботанический сад АН :

СССР. й 1/0

Автореферат разослан «»V» . . I 1980 г, ;

Зашита диссертации состоится I980 г. ;

в « /£'» час. на заседании Специализированного совета Все- ! союзного научно-исследовательского института фитопатологии. ;

Отзывы на автореферат (в двух экземплярах, заверенных печатью) просим направлять по адресу: 143050, Московская об- ■ ласть, Одинцовский район, п/о Большие Вяземы, ВНИИФ. ! Ученому секретарю Специализированного совета. !

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке инсти- ' тута.

Ученый секретарь

кандидатлельскохозяйстеенных наук - ■ - ■ . ** *

(Г. В. ПЫЖИКОВА)

Изучение биохимических механизмов процессов, определяющих характер взаимоотношений между растением и специфичным для него паразитом, является одной из актуальных задач современной фитопатологии. Выяснение механизмов патогенеза и фитоиммунитета имеет большое значение для разработки надежных мер предотвращения болезней растений, т, к. эти знания могут быть использованы, и, действительно, используются как при создании новых средств химической защиты растений, так и при выведении устойчивых к заболеваниям сортов.

В последние годы © этой области исследований наметился значительный прогресс, связанный главным образом с открытием фитоалексинов (Müller, 1958; Crincksbank, Perrin, 1961; Akasawa, Wada, 1961). Однако фитоалексины обнаружены далеко не во всех видах растений и, по-видимому, отсутствуют в злаках, что наводят на мысль о существовании в этих растениях других защитных систем. Значительный интерес в этом плане представляют гликозиды 1,4-бензоксазин-З-она, присутствующие во всех растениях семейства Gramineae (Virtanen, Hietala, 1955; Gahagan, Mumma, 1967; Hofman et al., 1969). Эти соединения, не обладая сами по себе биологической активностью, под действием гидролитических ферментов освобождают вещества, сравнимые по фунгитоксичности с большинством фитоалексинов (Cruickshank, 1962; Stoesst, Unwin, 1970; Метлицкий, Озерецковская, 1973). Именно эти соединения, по мнению ряда авторов, обеспечивают устойчивость злаковых растений к поражению ржавчинными грибами (Elnag-hy, Linko, 1962; Knott, Kumar, 1972), корневыми гнилями (Bemiller, Pappeiis, 1965) и даже насекомыми (Klun et al. 1967; Klun, Robinson, 1969). Тщательное изучение роли указанных соединений в защитных реакциях растений вполне может содействовать выяснению одного из механизмов иммунитета злаковых растений.

Актуальность. Исследования, проведенные в последние годы различными лабораториями, показали, что спектр производных 1,4-бензоксазин-З-она в злаках не ограничивается соединениями, открытыми Виртаненом и Хиеталой, а состоит из

tWT?. ИЦШ №rtT£*» 1

Mm. w. Явим мши, вид. м. Я. А. Тшшш

большего числа разнообразных веществ сходной природы; (У^апеп, Н1е1а1а, 1960; НоГгпап, НоГтапоуа, 1969; НоГтап,! Маэо^коуа, 1973; Шабанова, 1980). Физиологическая роль; большинства этих соединений совершенно не изучена, и не; исключено, что, различаясь химически, они могут обладать раз-| личной биологической активностью, средством к гидролитиче-1 ским ферментам и подвижностью в растении, т. е. выполнять ; разные физиологические функции.

Кроме того, совершенно не нзучены ферменты, катализиру-: юшие гидролиз гликозидов 1,4-бензоксазин-З-она. Между тем, если считать, что эти соединения действительно принимают' участие в реакциях фитоиммунитета, то именно ферментам ! должна принадлежать решающая роль как <в проявлении, так | и в специфичности защитной функции указанных веществ, поскольку сами по себе гликозиды фунгицидной активностью ее обладают,

В связи с вышесказанным представлялось актуальным проведение комплексного изучения всех присутствующих в растениях пшеницы гликозидов 1,4-бензоксазин-З-она я ферментов, катализирующих их гидролиз, с одновременным изучением их биологической активности и поведения в инфицированных растениях.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось .выяснение роли присутствующих в растениях пшеницы гликозидов 1,4-бензоксазин-З-она и ферментов, катализирующих их гидролиз, в процессах, определяющих характер взаимоотношений этих растений с возбудителем стеблевой ржавчины пшеницы.

Исходя из намеченной цели, были поставлены следующие задачи:

1. Изучить спектр производных 1,4-бензоксазин-З-она в растениях пшеницы, для чего выделить и идентифицировать присутствующие там соединения данного класса.

2. Определить фунгицидную активность обнаруженных в растениях пшеницы гликозидов 1,4-беизоксазин-З-она и продуктов их ферментативного гидролиза,

3. Выявить в растениях пшеницы ферменты, катализирующие гидролиз изучаемых гликозидов, и изучить их основные свойства.

4. Оценить возможность участия этих соединений в защитных реакциях растения путем сравнения их концентрации и уровня активности гидролитических ферментов в растениях различных сортов пшеницы с фунгитоксичностью изучаемых соединений.

5. Изучить характер воздействия возбудителя стеблевой ржавчины на интенсивность гидролиза гликозидов 1,4-бензок-

сазин-3-она в растениях пшеницы н определить возможные пути регуляции этого процесса.

Научная новизна. В результате предпринятой работы впервые исследовалась роль комплекса гликозидов 1,4-бензоксазо-линона и ферментов, катализирующих их гидролиз, в защитных реакциях растений пшеницы против возбудителя стеблевой ржавчины. Проделанная работа позволила выявить соединение, ранее в растениях пшеницы не обнаруженное, и до недавнего ¡времени неизвестное. Определено, действие ряда бен-зоксазол пионов на прорастающие уредоспоры стеблевой ржавчины и показано, что они обладают заметной фунгитоксично-, стью. Впервые показано присутствие в цитоплазме клеток пшеницы специфичной р-глюкозндазы, обладающей высоким сродством к гликозидам 1,4-бензоксазолинона, Изучены основные свойства обнаруженного фермента. Кроме того, получены новые данные о воздействии возбудителя ржавчинного заболевания на процессы гидролиза изучаемых гликозидов в инфицированном растении, и высказано предположение об участии системы «гликозиды бензоксазолннона—специфичная р-глю-козидаза» в реакциях иммунитета злаковых растений. •

Практическая ценность. Проведенные исследования позволяют рекомендовать определение скорости гидролиза гликозидов 1,4-бензоксазин-З-она в качестве биохимического критерия оценки сортов пшеницы на устойчивость к ржавчинному заболеванию. Анализ указанного процесса может проводиться по разработанной методике количественного определения гликозидов 1,4-бензоксазин-З-она в растениях пшеницы. Результаты изучения фунгитоксичности различных производных бензоксазолннона позволяют рекомендовать это соединение и качестве структурной основы средств химической защиты растений от патогенных микроорганизмов.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на IV Всесоюзном совещании по иммунитету сельскохозяйственных растений (Кишинев, 1966), на I Международном конгрессе по патологии растений (Лондон, 1968), на V Всесоюзном совещании по иммунитету растений (Киев, 1969), на XII Международном ботаническом конгрессе {Ленинград, 1975).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, где рассматриваются вопросы участия различных фенольных соединений в реак-1 циях фитоиммунитета, описания объектов и методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 259 отечественных и иностранных наименований,

Работа изложена на 157 страницах машинописного текста. ■ включает 1 i таблиц и 27 рисунков. -

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основным объектом исследования служили здоровые и инфицированные возбудителем стеблевой ржавчины растения пшеницы видов Triticum dicoccum Schübe, Т. durum Dest, Т. monococcum L„ Т. compactum Host и Т. aestivum L. Растения выращивали в почвенной культуре, в контролируемых условиях камеры искусственного климата. Инфицирование растений проводили в башне осаждения, используя смесь свежесобранных уредоспор рас 21 и 40 стеблевой ржавчины пшеницы (Puccinia graminis Pers. f. sp, tritici Ericles а. H.) с тальком (1:2). !

Фиксацию растительного материала проводили жидким азотом с последующей гомогенизацией. |

Выделение производных 1,4-бензоксазин-З-она проводили Из растительных гомогенатов по методу Гофмана и Гофмано-вой (Hofman, Hofmanova, 1969). Для индивидуализации и очистки гликозидов 1,4-бензоксазин-З-она использовали методы колоночной хроматографии на полиамиде (Woelm), уравновешенном дистиллированной водой, микрокристаллической целлюлозе (Chemapol) в системе растворителей хлороформ-метанол-вода (70 : 22 : 3) и ДЭАЭ-целлюлозе ДЕ-32 (Whatman) в системе растворителей н-бутанол-бензол-метанол-вода (3 : 1 : 1 : 1), а также методы препаративной хроматографии на бумаге Whatman 3 ММ и в тонком слое силикагеля (Merck), используя систему растворителей хлороформ-метанол-вода (70:22:3).

Идентификацию выделенных производных 1,4-бензокса-зин-3-она проводили по УФ-, ИК-, ЯМР- и масс-спектрам (Virtanen, Hietala, I960; Gahagan, Mumma, 1967; Hofman et al., 1970; Klun et al., 1970), а также с помошью хроматогра-фического анализа продуктов энзиматического гидролиза этих соединений (Wahlroos, Virtanen, 1959).

Качественное определение производных 1,4-бензоксазин-З--она на хроматограммах осуществляли с помощью последовав тельной обработки хроматограмм 2%-ным раствором FeCla в ацетоне и 1%-ным водным раствором K3tFe(CN)e] (Wahlroos! Virtanen. 1959). |

Количественный анализ гликозидов бензоксазолинона проводили после их индивидуализации по разработанной нами методике.

Фунгнтокснчность изучаемых соединений определяли по их' действию на уредоспоры стеблевой ржавчины (раса 21), npo-j

р а стающие на предметных стеклах микроскопа (Иванченко 1 и др., 1975).

Субклеточные структуры растений выделяли путем дифференциального центрифугирования растительных гомогена-тов. Ферментные препараты цитоплазмы выделяли нз бесклеточных экстрактов путем осаждения белков сульфатом аммония с последующей гель-фильтрацией в колонке с сефадексом 0-50, уравновешенным 0,01 М фосфатным буфером рН 7,1.

В качестве субстратов при определении активности р-глюкозидазы использовали 4-нптрофенил-р-Д-глюкопнранознд, 2-иафтлл-0-Д-глюкопиранознд, целлобиозу, флорндзин ' и 2/2,4-диокси-7- метокси-1,4/2Н/- бензоксазин-3-он/-0-Д-глюко-пнранозид, . .

Определение концентрации редуцирующих Сахаров проводили арсено-молибдатным методом Нельсона (Паеч, Трэси, 1960), а белок определяли по методу Лоури (Орехович, 1964).

Была проведена математическая обработка результатов экспериментов. Ошибку опыта в процентах и достоверность различий определяли методом дисперсионного анализа с критерием Тьюки на 95%-ном уровне достоверности. Расчет выполнен на машине ЭВМ «Наирн-2». \

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Выделение и идентификация производных.

1,4-бензоксазин-З-она из растений пшеницы

Выделение и очистка гликозидов бензоксазолинона. Хро-матографический анализ ацетоновых экстрактов проростков пшеницы сорта Капли в тонком слое силикагеля позволил выявить по крайней мере пять веществ, сходных по реакции на специфические цветообразующие агенты с описанными в литературе гликозидамп 1,4-бензоксазин-З-она. Основные характеристики указанных веществ, получивших условные номера I—V, представлены в таблице 1.

В целях выяснения природы этих пяти веществ было проведено их разделение и освобождение от примесей. Экспериментальным путем было установлено, что наиболее удачным комплексом методов очистки является процедура, включающая последовательную хроматографию в колонках с полна-' мидом, микрокристаллической целлюлозой и ДЭАЭ-целлюло-зой н последующую очистку каждого из веществ с помощью препаративной хроматографии в тонком слое силнкагеля и в некоторых случаях — перекристаллизации из органических растворителей.

Хроматография растительных экстрактов в колонке с по-

Таблица J

i

Некоторые физико-химические свойства гликозидов

1,4-бензоксазнн-З-она . ,

УФ-спектр в 80%-ном этаноле, А./нм Rf в системе хлороформ --метанол-вода (70:22:3) на ТСХ Реакция с Темпе-

Вещество 2% FeC)3> 2% FeCI3, 1% K3[Fe(CN)6] ратура плавления, "С ",

1* Макс. — 260 Мин. —237 0,66 Не реагирует Синяя окраска " ]

II Макс. — 262 Мнн. —233 Плечо — 282 0,52 » » 142— I —144 |

III Макс. — 260 Мин. —233 0,36 » » 255 ;

IV Макс. — 270 Мин. —237 Плечо — 285 0,20 Синяя окраска » 168— —170 ; ' f

V Макс. — 262 Мин. —233 Плечо — 282 0,10 Не реагирует 270

* 1 — 2У2-окс11-трнметокс!1-1,4-бензоксаз[1н-3-он/-р-Д-глюкоп!фаноз[1д;

И — 2/2-оксн-4-7-диметокси-1,4-бензоксазин-3-он/-р- Д-гкюкопиранозид;

Ш — 2/2-окси-7-метокси-1,4-бенз(жсаз11н-3-он/-р-Д-глюкопиранозид; j ч IV — 2/2,4-диокси-7-метоксн-1,4-бензоксазнн-3-он/-р-Д-глюкопмралозид;

V — 2/2,7-диокси-1,4-бв]13оксазин-3-он/-р-Д-глюкопираиозид. >

!

лиамндом не приводила к разделению изучаемых веществ, но значительно сокращала количество примесей. Фракционирование на колонке с микрокристаллической целлюлозой позволило осуществить не только дополнительную очистку выделяемых соединений, но и разделить их на две группы, одна из которых содержала «ешества I и 11, а другая — III, IV и V. Вещества I и II были в дальнейшем индивидуализированы с помощью хроматографии в тонком слое силикагеля и доведены до гомогенного состояния перекристаллизацией из смеси метанол-хлороформ (95:5). Соединения второй группы были разделены на две фракции при хроматографии на ДЭАЭ-цел-люлозе. Одна из этих фракций содержала смесь веществ III и IV, а вторая — вещество V. Индивидуализация и очистка этих соединений были завершены с помощью хроматографии в тон-6 !

ком слое снликагеля и двукратной перекристаллизации из 80%-гтого этанола. ' ''

Идентификация выделенных соединений. Ультрафиолетовые спектры выделенных соединений'были близки по своим характеристикам к спектрам описанных в литературе гликози-дов 1,4-бензоксазин-З-она (табл. 1). Хроматографический анализ продуктов энзиматического гидролиза исследуемых веществ препаратом р-глюкозндазы показал наличие в их составе по крайней мере одной молекулы глюкозы, связанной с фе-нольным агликоном р-глюкозидной связью. Инфракрасные .спектры всех пяти соединений (рис. 1), имеющие максимумы поглощения при 3350—3400 см-1 (N—Н; N—ОН группы), 2900 см-1 (ОСН3), 1650—J690 см"1 (—С = 0 в шестичленном цикле) и 1500 см-' (фенольное ядро) полностью соответствовали ИК-спектрам производных бензоксазолинона (Tipton et al„ 1967; Gahagan, Mumma, 1967; Hofman et al„ 1970; Klun et al., 1970) и указывали на то, что именно эти соединения были выделены нами нз растений пшеницы. Подобный . вывод подтверждался также присутствием в масс-спектрах всех исследуемых веществ фрагмента с массой 166, соответствующей метокси-бензоксазолинону. Отсутствие в масс-спектрах анализируемых соединений молекулярных ионов с массой более 417 показало, что в их состав входит только одна молекула глюкозы (рис. 2).

Молекула глюкозы, как было определено на основании , данных ЯМР-спектрометрии, расположена при С-2 атоме бен-зоксазолинонового ядра. Положение и природы других заместителей были также выяснены по данным ИК-, масс- и ЯМР-спектрометрии.

Проведенное исследование позволило идентифицировать вещество I как 2/2-окси-триметокси-1,4-бензоксазин-3-он/-р-Д-глюкопнранозид, П — 2/2-окси-4,7-диметокси-1,4-бензоксазин--3-он/-р-Д-глюкопиранозид, III — 2/2-окси-7-метокси-1,4-бен-зоксазин-3-он/-р-Д-глюкопиранозид, IV — 2/2,4-диокси-7-ме-токси-1,4-бензоксазин-3-он/-р-Д—глюкопиранозид и V — 2/2,7-диокси-!,4-бензоксазин-3-он/-р-Д-глюкопиранознд (рис. 3).

Правильность подобной идентификации выделенных соединений была подтверждена сравнением их масс-спектров с предполагаемыми схемами масс-фрагментацин этих веществ. Практически все элементы масс-спектров нашли свое объяснение в схемах фрагментации.

Сравнение полученных нами результатов с литературными данными показывает, что если присутствие гликозидов II, III и IV в растениях пшеницы было показано и ранее (Gahagan, Mumma, 1967; Hofman, Hofmanova, 1969; Hofman et at., 1969), то гликозид V выделяли только нз растений кукурузы

(НоГтап а1„ 1970), а глпкозид I до настоящего времени описан не был. С другой стороны нам не удалось обнаружить1 в исследуемых растениях целого ряда бензоксазолинонов, о присутствии которых в пшенице сообщали другие исследователи (НоГтап, Маэо^ЧсИсоуа, 1973). •

К* |

I

Кг I О

\

\/ \сн-о-свн„о5

I II I I II ' 1

/\ /с=о ■/ \/ '

Кб I N ;

1-1 !

II — К(=1?в-[?в=Н; К4 = К,=ОСН»

III —Б!т=ОСН»

IV — Иг=ОСН3 V — Кт-ОН

Рис. 3. Структура глнкозндов 1 (4-бензоксазин-3-онз, выделенных из растений пшеница (* обозначения те же, что н в табл. 1) I

Подобные вариации набора гликозидов бензоксазолнноиа в растениях одного вида наводят на мысль о существовании серьезных качественных и количественных сортовых различий как в содержании этих веществ, так и в их физиологической роли. Между тем на фунгитоксичность по отношению к возбудителю ржавчинного заболевания, ни физиологическая роль большей части гликозидов 1,4-бензоксазин-З-она, обнаруженных нами в растениях пшеницы, до сих пор не изучались.

В связи с этим следующей задачей нашей работы стало изучение фунгнцидных свойств и роли указанных пяти соединений в защитных реакциях растений пшеницы, инфицированных возбудителем стеблевой ржавчины.

Изучение фунгитоксичностн гликозидов 1,4-бензоксазин-З--она, выделенных из растений пшеницы. Определение фунги-| токсичности гликозидов 1,4-бензоксазин-З-она, выделенных из' растений пшеницы, показало, что сами по себе они не оказывают практически никакого воздействия на прорастание уре-досиор стеблевой ржавчины пшеницы, даже при использовании их в очень высокой концентрации. В связи с этим в дальнейших опытах мы провели определение фунгнцидной актив-, ности аглнконов изучаемых соединений. Результаты проведен-; 8

I-------- l Г, Г Г I i I 1 I i . ^

4000 3000 2000 Id00 1600 1400 1200 fOOO goo 600 cm" РисЛ ИК-спектры гликоэидов 1,4-бензоксазин-З-она

в таблетке КВъ ♦ (Обозначения те что и в табл.1)

m

m

ißfi

-т4Ч44

m

357 м

1Л+1Л:

п г

40 ПО НО 240 300 Ф

i$6

■ M* ¿¿s W 357

so ito m wo 3oo 3so 166

mje

- m

- /5Е>

- t'v'I 11 ' V II l,li, 1 III 1

ТУ

Г

m

m/e

№

Í95

<73

P-1Ô=3S7

M+

90 120 450 (go aft

m

152

US

m llí

m

ш

ît

i

4-

9Ü 1SO 240 tf0 m/e

Рис. 2 Масс-спектры гликозидов 1,4-<5ензоксазин-^-она при£ = 1?п °t эя, иояиз, = ?0 eV»(Обозначения те же, что и в табл.Т)

ного исследования (табл. 2) показали, что продукты ферментативной деградации изучаемых соединений, действительно, обладают высоко» фунпщидной активностью, сравнимой по своему уровню с активностью многих фитоалексинов (СгшскэНапк, 1962; Э^евб!, ип\«п 1970; Метлицкий, Озерец-ковская, 1973). 1

В принципе одно уже- наличие у изучаемых- соединений столь высокой фунгитоксичкости дает основание предполагать их участие в реакциях фитоиммуиитета. Однако нельзя забывать, что для выполнення каким-либо веществом защитной функции важен не столько уровень его токсичности, сколько возможность создания достаточно высокой его кон-, нентрации в зоне развития инфекции.

Поскольку производные 1,4-беизоксазин-З-она присутствуют в растениях .в форме гликозидов, основными параметрами, определяющими возможность накопления токсических концентраций агликонов в инфицированных частях растения, являются концентрация там гликозидов и активность фермента, способного катализировать их гидролиз.

Таблица 2 Фунгитоксичность производных бенэоксаэолинона

Агликоны гликозидов бензоксазолинона ЭДл>, М для прорастающих уредоспор стеблевой ржавчины пшеншш

П* 5,8 -10-'

III 6,8. Ю-4

IV 3,7 • Ю-4

V Не токсичен

* Обозначения те же, что в табл. 1.

Количественный анализ гликозидов 1,4-бензоксазин-З-она в растениях пшеницы. Для решения указанной задачи нами был разработан метод количественного определения изучаемых веществ в листьях пшеницы. Этот метод отличался от известных ранее серьезным упрощением процедуры предварительной очистки анализируемых соединений и требовал зна-, чительно меньших количеств растительного материала. Результаты проведенного с помощью этого метода исследования представлены в таблице 3.

Как видно из таблицы, суммарное содержание производных бензоксазолинона в 17 сортах, относящихся к четырем видам пшеницы, колеблется от 2-10~3 до 4* Ю_4М, причем в большинстве случаев эта величина заметно превышает не только ЭД5о для прорастающих спор воздубителя стеблевой ржавчины, но даже и летальную концентрацию.

Таблица

Содержание гликозидов бензоксазолинона в различных сортах пшеницы

Сорта

Концентрация гликозидов бензоксазолинона • 10~*М

пшеницы 1 ' I* П III - IV : V | 2

Уэлс 0,2 1,2 2,2 ' 12,0 2,3 ' 17,9

Тим га лен 0,7 5,0 3,7 7,9 1,1 " 18,5

Стюарг-63 Следы 1,7 2,2 - 9,2 1,6 '.14,7

К 1562 » 2,0 3,9 7,7 1,6 : 15,2 .

Крис » 3,5 2,8 . 7,5 1,8 " 15,6

Гаммут 1 3,0 3,9 7,5 1.3 ■ 15,7

Селкирк . 0,5 3,0 3,2 6,9 1,6 14,7

Мендое Следы 3,1 3,0 9,6 1,4 ■17,1

Кавказ » 3,0 3,2 6,2 1,6 .14,0

Джастия 1,7 2,2 5,4 1,6 .10,9

Капли » 0,5 2,9 13,0 4,0 - 20,4

Веркал » 0,7 1,0 1,6 0.7 ; 4,о

Норест-66 » 4,0 1,4 2,1 2,0 9,5

Тетчер > 0,7 1.5 4,8 1.4 8,4

Безостая-1 » 1.5 1.4 2,4 1,3 6,6

Литл Клаб 0,2 1.2 1,5 2,1 1,7 6,7

Арнаутка 0,2 1,2 1.5 4,8 1,6 9,3

* Обозначения те же. что в табл. 1.

Низкое содержание производных бензоксазолинона .было обнаружено у двух высокоустойчивых сортов Норест-66 и Вер-нал, ср ед н еу стой ч и в ого сорта Безостая-1 и двух восприимчивых сортов Литл Клаб и Арнаутка. Большинство других изученных сортов пшеницы содержат вполне достаточные для выполнения защитной функции количества гликозидов 1,4-бен-зоксазин-3-она, но тем не менее поражаются теми или иными расами паразита. Таким образом, если пониженное содержание изучаемых соединений, возможно, и является фактором, благоприятствующим развитию болезни, то их высокая концентрация сама по себе иммунитета к заболеванию не обеспечивает. И это не удивительно, поскольку даже очень высокая концентрация предшественников фунгитоксичных бензоксазо-линонов в растении отнюдь не означает, что последние действительно образуются в любой комбинации растения-хозяина и паразита. Вполне возможно, что многие расы возбудителя стеблевой ржавчины обладают способностью предотвращать гидролиз гликозидов бензоксазолинона в зоне своего развития или же детоксицировать его продукты. Для выяснения этого вопроса необходимо изучение ферментов, способных катализировать гидролиз указанных гликозидов.

Изучение специфичной к гликозндам 1,4-бензоксазин-З-она р-глю коз ид азы листьев пшеницы. Большинство авторсив, обсуждая возможность гидролиза гликозидов 1,4-бензоксазнн-З-10 • • • :

-она в клетках растений,, оперировали лишь широко известными фактами о наличии в растениях значительных количеств р-глюкозидазы, обладающей широкой универсальностью (Virtanen, Hietala, I960; Elnaghy, Linko, 1962; KnotI, Kumar, ,]972). Между тем, в отсутствии прямых экспериментальных данных не было никакой уверенности в том, что гликозидазы растений, действительно, способны с достаточно высокой скоростью катализировать гидролиз гликозидов бензоксазол и нона, поскольку эти соединения обладают весьма специфической структурой,

В связи с этим мы решили проверить наличие в листьях > пшеницы ферментов, способных осуществлять быстрый гидролиз изучаемых гликозидов.

Выявление и изучение локализации р-глюкозидазы, специфичной к гликозндам 1,4-бензоксазин-З-она. Для выполнения этой задачи мы провели изучение ферментативных активностей препаратов, выделенных из цитоплазмы и различных субклеточных структур пшеницы, используя в качестве субстрата как выделенный из растений пшеницы 2/2,4-диокси-7--метокси-1,4-бензоксазин-3-он/-р-Д-глюкопиранозид (ДИМ-БОА-глИкозид), так и некоторые из наиболее распространенных природных и синтетических субстратов р-глюкозидазы. Результаты проведенного исследования (табл. 4) показали присутствие гликозидазной активности в препаратах клеточных стенок и цитоплазмы, тогда как во фракции хлоролластов и митохондрий она отсутствовала,

Таблица 4

Сравнительная активность р-глюкозидазы субклеточных структур листьев пшеницы сорта Капли по отношению к различным

jS-Д-г л икоз и да и

Активность р-глюкозидазы (мкМ/г сыр. веса/час) в отношении:

Субклеточные структуры ДИА1БОА- глико- зида Салн-шша ч — О ffl Г а ч |?1 -чг • с 5 2 £ Г* ¿и в-ти о 3 п g Л * 5 gg е %

Клеточные стенки Хлоропласты и митохондрии Цитоплазма 2,6 0 108,9 4,3 0 0,2 6.4 0 .20,4 0,65 0 0,22 3,0 0 0 4,0 . 0 0,4

Сравнение гликозидазной активности клеточных стенок и цитоплазмы показало, что эти фракции содержат различные по субстратной специфичности ферменты. Глюкозидаза кле-

, и

точных стенок хорошо гидролизовала салицин, 4-ннтрофенил--р-Д-глюкопиранозид, целлобиозу и флоридзин, тогда как ци-тоилазматнческнй фермент был значительно более активен в отношении 4-ннтрофенйл-р-Д-глюкопиранозида и, что особенно примечательно, — ДИМБОА-глнкозида, причем скорость гидролиза последнего была во много раз выше, чем любого из изученных субстратов. Активность этого фермента в клетках пшеницы сорта Капли была настолько велика, что могла катализировать гидролиз всех присутствующих в растении гли-козидов 1,4-бензоксазин-З-она менее чем за 1 минуту.

Учитывая специфичность гликозидов бензоксазолинона для злаковых растений, интересно было проверить, специфичен ли для этого семейства и обнаруженный фермент. Определение активности фермента в эпикотилях гороха, листьях свеклы, картофеле, фасоли, яблони, и кукурузы показало его пол-ное отсутствие во всех изученных объектах, кроме кукурузы: Эти данные делают вполне вероятным предположение, что. Р-глюкозидаза, специфичная к глюкозидам бензоксазолинона, является ферментом, характерным исключительно для злаковых растений.

Изучение свойств обнаруженного фермента показало, что он обладает довольно высоким сродством ко -всем присутствующим в растениях пшеницы гликозидам бензоксазолинона (Км от 2- Ю~3 до Ю-2 М для разных гликозидов) и отличается от аналогичного фермента клеточных стенок по рН оптимуму, устойчивости к тепловой денатурации и способности гидролизовать р-галактозиды.

Таким образом, проведенное исследование показало, что , цитоплазма клеток пшеницы содержит р-глюкозидазу, специфичную по отношению к гликозидам 1,4-бензоксазин-З-она и существенно отличающуюся по свойствам от гликозидаз клеточных стенок и аналогичных ферментов других растений.

Определение активности цитоплазматической р-глюкозида-зы в растениях различных сортов пшеницы. Присутствие з растениях пшеницы сорта Капли высокоактивной р-глкжозида-зы, специфичной по отношению к гликозидам 1,4-бензоксазин--3-она, делает вполне вероятным предположение об участии систем «гликозиды бензоксазолинона-р-глюкозидаза» в защитных реакциях растений. Не исключено, что сорта, различающиеся по степени устойчивости к заболеванию, хотя и содер-. жат, как показано выше, вполне достаточные для уничтожения паразита количества гликозидов 1,4-бензоксазин-З-она, Далеко не всегда способны осуществить их быстрый гидролиз из-за отсутствия достаточных количеств соответствующего фермента. Для проверки такой возможности мы провели определение содержания цитоплазматической глюкозидазы в ра-

стениях пшеницы, различающихся по степени устойчивости к возбудителю стеблевой ржавчины.

Результаты проведенного исследования (табл. 5) показали, что все изученные сорта пшеницы, хотя и различаются по содержанию цитоплазматической р-глюкозидазы, все же обладают столь высокой активностью этого фермента, что способны за считанные секунды осуществить полный гидролиз содержащихся в них гликозидов бензоксазолинона. Какой-либо взаимосвязи между активностью фермента и степенью устойчивости растений, определяемой по проценту физиологических рас паразита, способных их поражать, обнаружить не удалось.

На основании этих данных можно считать, что активность р-глюкозидазы не является лимитирующим фактором в процессе гидролиза гликозидов 1,4-бензоксазин-З-она и создания в зоне инфекции летальной для гриба концентрации соответствующих агликонов. Поскольку данные, представленные выше, показывают, что и сами гликознды присутствуют в растениях в количествах, для указанной цели вполне достаточных, напрашивается вопрос: почему защитная функция указанной системы проявляеся далеко не во всех случаях, и большая часть сортов пшеницы поражается многими расами возбудителя ржавчинного заболевания? Для внесения хотя бы некоторой ясности в этот вопрос мы провели изучение изменений отдельных компонентов системы «гликозиды 1,4-бензоксазнн-З--она-р-глюкозидаза» в совместимой и несовместимой комбинациях растений пшеницы и ржавчинного гриба.

Таблица 5

. Активность р-глюкозкдазы в растениях пшеницы различных сортов

Сорта пшеницы

Процент рас, поражающих сорт с типом реакции 3 и 4

Активность р-глюкозидазы мкМ/г сыр. веса/час для субстратов

4-ннтрофенил-р -Д-глюкопиранс

ДИМБОА-

гликознд

Капли . . Вернал . , Релайнс . , Спельмар . Мин дум . Арнаутка , Маркиз , Кубанка . Акые , . Литл Клаб

4,4 26 32 42 48 48 53 55 67 92

58.7

17.8 19,6 19,0

24.0

31.8

24.9

28.1 20,5 13,0

346,4 98,3 115,9 105,8 126,0 141,3

146.6

128.7 65,3 62,3

р • ^ •• - '

Изучениепостннфекционной динамики активности цитоплазм атической (3-глюкозндазы и уровня гликозидов бензокса-золинона в инфицированных растениях. Активность цитоплаз-матической р-глюкозидазы. Анализ общей активности изучаемого фермента'проводилнв здоровых и, инфицированных .расой 21 стеблевой ржавчины растениях пшеницы сортов Капли, Вернал, Кубанка и Литл Клаб. Первые два сорта были к данному: паразиту устойчивы, а два последних'—восприимчивы. Результаты проведенного исследования представлены в таблице 6. ,

Как видно из таблицы, инфицирование растений не оказывало существенного влияния на активность цитоплазматиче-ской р-глюкозидазы, свидетельствуя о том, что процесс гидролиза гликозидов бензоксазолинона ш растении, если и контролируется ржавчинным грибом, то путем, отличающимся от воздействия на биосинтез фермента, катализирующего эту реакцию.'

Таблица 6

Активность р-глюкоз и да зы в здоровых и инфицированных стеблевой ржавчиной (раса 21) растениях пшеницы различных сортов

Сорта Вариант опыта Активность Р-глкжозидазы мкМ субстрата/г сырого веса/час в отношении:

пшеннцы ДИМБОА-гликозида 4-ннтрофеннл-р-Д-- гл юкоп н р а нозн да

3-й день 6-й день 3-й день 6-й день

Капли Здоров. Инфицнров, 227,2 192,0 241,6 235,6 59,7 47,5 , 48,9' 48,9

Веркал Здоров. Инфицнров. 152,0 96,0 116,8 120,0 20,1 17,2 15.1 17.2

Кубанка Здоров. Инфицнров. 192,0 169,6 224,0 166,4 43.2 45.3 37.4 28,0

Лнтл Клаб Здоров. Инфицнров. 33,6 56,0 84,8 48,0 22,3 23,0 12,2 10,0

Концентрация гликозидов 1,4-бензоксазин-З-она. Одновременное присутствие в клетках растений пшеницы гликозидов 1,4-бешоксазин-3-она и ферментов, способных осуществить их быструю деградацию, а также показанное выше отсутствие изменений гликозидазной активности под действием паразита, подвергают определенному сомнению возможность осуществления в инфицированных растениях гидролиза изучаемых гликозидов. •• 14

. Для выяснения вопроса о возможности гидролиза изучаемых гликозидов в инфицированных растениях мы провели сравнительное определение содержания гликозидов 1,4-бензок-сазин-3-она в совместимой и несовместимой комбинациях сортов пшеницы с возбудителем стеблевой ржавчины. Концентрацию трех из пяти обнаруженных в растениях пшеницы гликозидов определяли в здоровых и инфицированных расами 21 и 40 стеблевой ржавчины растениях пшеницы сортов Капли, Безостая 1 и Тетчер. Сорт Капли был устойчив к обеим расам, тогда как сорта Безостая 1 и Тетчер при относительной устойчивости к 21-й расе хорошо поражались 40-й расой. Определение проводили по разработанной нами методике количественного анализа гликозидов бензоксазолинона в растениях пшеницы на 3-й день после инокуляции, так как предварительные опыты показали, что заметные изменения в содержании этих веществ происходят на 2—3-й день после инокуляции. Результаты проведенного исследования представлены в таблице 7.

Таблица 7

Изменение содержания гликозидов 1,4-бензоксазин-З-она в. здоровых н инфицированных возбудителем стеблевой ржавчины растениях пшеницы на 3-й день' после инокуляции

. Сорта пшеницы

Вариант опыта

Содержание гликозидов 1,4-беиз оке а з 11 н • 3-ои а мкг/г сырого веса растений

И*

III

IV

Безостая I

Тетчер

Капли

Контроль

Инфицнров.

% к контр.

Инфицнров.

% к контр.

Контроль

Инфицнров.

% к контр.

Инфициров.

% к контр.

Контроль

Инфициров.

% к контр.

Инфициров.

% к контр.

21-й расой 40-й расой

21-й расой 40-й расой

21-й расой

...» 4

40-й расой

* Обозначения те же, что и в табл. 1.

40 40 100 48 120 28 40 142 28 100 14 12 85 14 100

40 32 80 40 100 36 64 177 64 177 72 72 100 92 127

64 48 75 68 106 148 132 89 88 59 430 300 «9 304 70

Как видно из таблицы, инфицирование растений пшеницы уредоспорами обеих рас приводит к заметному снижению содержания 2/2,4-диокси-7-метокси-1,4-бензоксазин-3-она/-р-Д-глюкопиранозида (IV) почти во всех комбинациях «хозяин—

натогён»; 'кроме совместимой комбинации Ёезостая 1 — 40 раса. " ■

Полученные результаты позволяют сделать ряд выводов и предположений. Во-первых, они показывают, что в растениях пшеницы, инфицированных возбудителем стеблевой ржавчины, действительно происходит достаточно быстрый гидролиз гликозидов. 1,4-бензоксазин-З-оиа. Во вторых, создается впечатление, что этот гидролиз происходит с несколько большей интенсивностью в несовместимой комбинации растения—хозяина и паразита (сорт Капли, инфицированный расами 21 п 40), чем,в совместимой (сорта Тетчер н Безостая 1, инфицированные расой 40) и даже в относительно несовместимой (те же сорта; инфицированные расой 21). Изучаемые сорта пшеницы различаются не только по концентрации в них отдельных гликозидов, но и по степени их гидролиза. Учитывая имеющиеся в литературе данные о вариациях чувствительности различных.рас стеблевой ржавчины к производным бензокса-золинона (Elnaghy, 1964), полученные результаты экспериментов дают основание предполагать участие указанных соединений в процессах расовоспецифической устойчивости.

Анализируя данные таблицы 7, можно сказать, что в процессе патогенеза в растениях пшеницы, помимо четкой выраженной динамики содержания гликозида IV, наблюдаются изменения и в содержании гликозидов II и III. Если в ряде случаев содержание этих соединений изменяется незначительно или остается на уровне контроля, то в большинстве других случаев их содержание заметно увеличивается. Поскольку гликозйды между собой метаболически связаны, и производные одних гликозидов являются предшественниками в биосинтезе других (Tipton et al.,-1973), можно предположить, что в инфицированных растениях наряду с гидролизом одновременно происходит интенсификация процессов бносннтеза этих соединений.

Выводы

1. Из растений пшеницы выделены и очищены до гомогенного состояния пять гликозидов 1,4-бензоксазин-З-она, идентифицированных как: I — 2/2-оксн-триметокси-1,4-бензоксазин-3-он/-р-Д-глюкопнранозид, II— 2/2-окси-4,7-диметокси-1,4-бен-зоксазин-3-он/-р-Д-глюкопиранозид, III — 2/2-окси-7-метокси-1,4-бензоксазин-3-он/-р-Д-глюкопиранозид, IV — 2/2,4-диокси-7-метоксиг1,4-бензоксазин-3-он/-р-Д-глкжопиранозид, V — 2/2,7-диокси-1,4-бензоксазин-3-он/-р-Д-глюкопиранозид,

2. Показано, что продукты ферментативного гидролиза ß-глюкозидазой трех из пяти выделенных гликозидов 1,4-бен-зоксазин-3-она обладают высокой фунгицидной активностью в

отношении прорастающих уредоспор1 стеблевой ржавчины пшеницы; исходные вещества подобной активностью не обладают,

3. Установлено, что концентрация указанных глнкозидов в растениях пшеницы, хотя и варьирует в зависимости от вида и сорта растений, в большинстве случаев превышает уровень, способный обеспечить освобождение в клетках растений летальных для Рисаша graminis количеств 1,4-бензоксазин-З-онов.

4. Показано присутствие в цитоплазме клеток пшеницы специфичной р-глюкозидазы, обладающей высоким сродством к гликозидам 1,4-бензоксазин-З-она, но практически не гидро-лизующей большую часть других р-Д-гликозидов. Обнаруженный фермент отличается от известных ранее р-гликозидаз растений по своим свойствам и локализации в клетке. Из всех изученных растений указанный фермент присутствует только в злаках. На основании полученных данных сделано предположение, что система «глнкозиды 1,4-бензоксазин-З-она — специфичная р-глюкозидаза» является характерным признаком семейства Огаттеае.

5. Установлено, что растения пшеницы всех изученных сортов содержат значительные количества специфичной р-глюко-зидазы, способной катализировать в течение нескольких минут полный гидролиз всех присутствующих в растении глнкозидов 1,4-бензоксазин-З-она.

6. На сортах-дифференциаторах физиологических рас стеблевой ржавчины показано отсутствие прямой корреляции между устойчивостью растений пшеницы к ржавчинному заболеванию и исходным содержанием в них как глнкозидов бензо-ксазолинона, так и специфичной р-глкжозидазы.

7. Обнаружено увеличение скорости гидролиза глнкозидов 1,4-бензоксазин-З-она в растениях пшеницы, инфицированных возбудителем стеблевой ржавчины. В несовместимой комбинации растения-хозяина и паразита гидролиз происходит быстрее и в большей степени, чем в совместимой. Стимуляция гидролиза происходит на фоне неизменной активности специфичной р-глюкозидазы, указывая на то, что регуляция этого процесса осуществляется путями, отличными от индукции катализирующих его ферментов.

8. На основании полученных данных высказано предположение об участии системы «гликозиды бензоксазолинона — р-глюкозидаза» в реакциях иммунитета злаков к фитопатоген-ным микроорганизмам. Подобно фитоалексинам двудольных, данная система может иметь, по-видимому, универсальное значение для злаковых растений.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Чкаников Д. И., Шабанова А. М., Тарабрин Г. А„ Соло-матки Д. А. Биохимические факторы устойчивости пшеницы к стеблевой; ржавчине, В. сб. Итоги работы IV Всесоюзного" совещания/ по иммунитету сельскохозяйственных растений. Кишинев, 1966, 49—53.

2. Чкаников Д. И., Тарабрин Г. А., Шабанова А, М„ Константинов П. Ф. Локализация р-глюкозидазы в клетках высших растений. Физиология растений, 1969, 16, 2, 322—325.

3. Чкаников Д. И„ Тарабрин Г. А., Шабанова А. М., Константинов П. Ф. О значении некоторых эндогенных фунгиток-сичных веществ для устойчивости пшеницы к стеблевой ржавчине. В сб. Труды V Всесоюзного совещания по иммунитету растений. Киев, 1969, в. 3, 6—13.

4. Чкаников Д. И., Тарабрин Г. А., Шабанова А. М., Константинов П. Ф. Внутриклеточная локализация р-глюкозидазы высших растений. Тезисы Второго Всесоюзного биохимического съезда. Ташкент, 1969, с. 41. ~ ч

5. Чкаников, Д. И., Тарабрин Г. А., Шабанова А. М. Дополнительные данные о внутриклеточной локализации р-глюкозидазы растений. Физиология растений, 1971, 18, 4, 731—737.

6. Шабанова А. М., Тарабрин Г. А,, Чкаников Д. И. Производные бензоксазолинона — эндогенные фунгнтоксичиые вещества пшеницы. Тезисы докладов ХИ Международного Ботанического Конгресса. Л., 1975, II, с. 503.

7. Шабанова А. М. Производные 1,4-бензоксазин-З-она, содержащиеся в растениях пшеницы. Физиология и биохимия культурных растений. 1980, 12, I, 29—36.

Л 53098 23/УП—80 г. Объем 1'/4 п. л. Заказ 1647. Тираж 100

Типография Московской с.-х. академии им. К. А. Тимирязева 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 44