Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синтетические пятитяжевые α-суперспиральные фибриллы: конструирование и свойства

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Синтетические пятитяжевые α-суперспиральные фибриллы: конструирование и свойства"

на правах рукописи

МЕЛЬНИК ТАТЬЯНА НИКОЛАЕВНА

СИНТЕТИЧЕСКИЕ ПЯТИТЯЖЕВЫЕ а-СУПЕРСПИРАЛЬНЫЕ ФИБРИЛЛЫ: КОНСТРУИРОВАНИЕ И СВОЙСТВА

03 00 02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

ПУЩИНО - 2005

Работа выполнена в Институте белка РАН

Научные руководителя:

доктор физико-математических наук Потехин Сергей Александрович

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук Семисотнов Геннадий Васильевич, доктор физико-математических наук Харакоз Дмитрий Петрович

Ведущая организация'

Институт биохимии имени А Н Баха РАН

Защита состоится 16.02 2005 г в 13 час 30 мин на заседании диссертационного совета Д002 093 01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу 142290, г Пущино, Московской области, Институтская ул , 3

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке Путинского НЦБИ РАН

Автореферат разослан « Ш» 2005 г

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат физико-математических наук

НФ .Панина

Z7 &5

I. Общая характеристика работы.

Актуальность темы. а-Суперспиральные мотивы - это широко распространенные элементы структуры в белках. Для этих структур характерным является то, что их аминокислотная последовательность квазипериодична и может быть представлена в виде повторяющихся семичленников (a b с d е f g)„, причем в (а) и (d) положениях, как правило, находятся неполярные аминокислотный остатки, формирующие внутреннее гидрофобное ядро, а в положениях (Ь)у (с), (е), (f) и (g) - полярные аминокислотные остатки, участвующие в меж- и внутриспиральных взаимодействиях. Многочисленные исследования показали, что пептиды, имеющие характерный семичленный повтор аминокислотной последовательности образуют как двух-, трех- , так и четырех- и пятитяжевые а-суперстшрали. Однако вопрос о том, какие взаимодействия ответственны за избирательность образования а-суперспиралей с той или иной стехиометрией до сих пор остается открытым. На сегодняшний день более или менее понятно по каким правилам олигомеризуются двух- и трехтяжевые а-суперспирали. Считается, что стехиометрия в этом случае определяется комбинацией эффектов упаковки гидрофобных аминокислотных остатков в межспиральной зоне (остатки в положениях (а) и (d)) и электростатических взаимодействий между аминокислотными остатками, примыкающими к гидрофобному ядру (остатки в положениях (е) и (g)). По каким правилам олигомеризуются многотяжевые а-суперспирали практически ничего неизвестно. Поэтому изучение факторов, приводящих к образованию пятитяжевых а-суперспиралей, являются актуальными, поскольку позволяют приблизиться к пониманию общих принципов олигомеризации многотяжевых а-суперспиралей.

Цель работы. Целью данной работы было сконструировать короткий полипептид, который способен образовывать длинные растворимые пятитяжевые а-суперспиральные фибриллы, поскольку конструирование полипетидов de novo с заранее заданной ;

РШММЙ>»«Я81да j хорошим КИБЛИОТЕКА j С-ПетерАдо [г^ J

о» MO^W/JQ I

способом проверить правильность понимания нами принципов олигомеризации пятитяжевых а-суперспиральных комплексов.

Научная новизна работы. Впервые сконструирован de novo короткий полипептид, который в растворе образует длинные пятитяжевые а-суперспиральные фибриллы. Показано, что заряженные остатки, находящиеся в ф и (g) положениях а-суперспирали влияют как на стабильность пятитяжевых а-суперспиралей, так и на диапазон рН в которых они образуются.

Практическая значимость работы. Сконструированные в работе короткие полипептиды, способные собираться в а-суперспиральные фибриллы в широком диапазоне изменений рН, открывают новые возможности для многочисленных применений таких структур в биотехнологии и медицине в качестве носителей коротких биологически активных лигандов.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации докладывались на ежегодных научных конференциях Института белка РАН, 1998 и 2002 год, Пущино (Московская обл., Россия), на международном семинаре "Прогресс в биотехнологии и нейробиологии - интегративная медицина", 2004 год, Хургада (Египет) Стендовые сообщения были представлены на международном симпозиуме по структуре, стабильности и сворачиванию белков, 1998 год, Москва (Россия), на II Съезде Биофизиков России, 1999 год, Москва (Россия); на 7 международной летней школе по биофизике надмолекулярных структур, 2000 год, Ровини (Хорватия), на III Съезде биохимического общества, 2002 год, Санкт-Петербург (Россия), на 5 международной конференции по новым тенденциям в нанотехнологии, 2004 год, Сеговия (Испания). По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 2 статьи в иностранных журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 103 страницах печатного текста и состоит из Введения, Литературного обзора, Материалов и методов, 2 глав, посвященных описанию и обсуждению полученных экспериментальных данных, Выводов и Списка цитируемои

литературы (из 122 работ). Работу иллюстрируют 30 рисунков и 5 таблиц.

2

II. Результаты и их обсуждение.

Постановка задачи. Мы провели сравнительный анализ аминокислотных последовательностей пятитяжевых а-суперспиральных фрагментов олигомерных матричных белков сухожилий (СОМР) из разных источников и их ближайших гомологов тромбоспондинов IV и П1 классов (ТБР4 и ТБРЗ), которые также образуют пентамерные комплексы. Анализ последовательностей не выявил каких-либо закономерностей в распределении гидрофобных аминокислотных остатков по положениям (а) и (с1) а-суперспирали. Это указывает на то, что, в противоположность двухтяжевым а-суперспиралям, геометрические свойства внутренних неполярных боковых групп не могут существенно влиять на пентамеризацию фрагментов. Дальнейший анализ последовательностей выявил в структуре несколько консервативных заряженных остатков. Проведенный стереохимический анализ, показал, что все эти консервативные заряженные остатки могут участвовать в формировании межспиральных ионных связей в структуре пентамера. (Ка]ауа, А., 1995).

Проанализировав структуры известных четырех- и пятитяжевых а-суперспиралей, мы предположили, что число спиралей в многотяжевых а-суперспиралях определяется не только эффектом упаковки внутренних гидрофобных остатков, но и дополнительными электростатическими взаимодействиями между аминокислотными остатками боковых цепей, находящихся в положениях (Ь), (с), ф и (ф а-суперспирали. Так же из проведенного анализа следовало, что пептиды, склонные к образованию многотяжевых а-суперспиралей и имеющие строгий семичленный повтор последовательности способны образовывать регулярные фибриллярные структуры Это было интересно проверить экспериментально, поскольку из литературы известно, что попытки ряда авторов сконструировать а-суперспиральные полипептиды с возможным сдвигом отдельных а-спиралей вдоль оси суперспирали приводили к образованию фибриллярных агрегатов с неожиданно большой и нерегулярной толщиной.

1. Конструирование короткого полипептида, способного образовывать пятитяжевые а-суперспиральные фибриллы.

А А

А

А| А

А

А

А

Д

А

А

А

а. о.

Иь

}Д1

а) Выбор длины полипептида.

Мы предположили, что важным фактором в образовании фибрилл наряду с повтором идентичных семичленников является длина пептида (Ь). Также в фибрилле отдельные а-спирали должны находится в параллельной ориентации (в терминах N-0 концов) и сдвинуты относительно друг друга (рис. 1). Сдвиг одной а-спирали относительно другой (Д1) должен А быть кратен длине семичленника. К тому же, для упаковки предыдущей и последующей а-спирали в фибрилле по принципу "голова к хвосту" необходим зазор в один аминокислотный остаток. Таким образом, исходя из стехиометрии п-тяжевой а-суперспиральной

фибриллы, а-спирали, расположенные со сдвигом,

Рис 1 Схематическое должны завершать один поворот вокруг оси предСТавление

суперспирали без перекрывания ¡-той и (¡+п)-ой пятитяжевой

а-суперстшральнои

а-спиралей, если А1 = (Ь+1)/п. Сдвиг на величину фибриллы а-Спирали

представлены в виде

большую, чем (Ь+1)/п может привести к образованию стрел с поперечными

линиями, указывающими бреши в области "голова-хвост" и оголению семичленные повторы

гидрофобных остатков во внутренних положениях (а) и (ф Таким образом,

минимальная длина а-спирали в л-тяжевой а-суперспиральной фибрилле (при

А1 = 7) должна быть равна п*7-1 аминокислотных остатков, т е. 20, 27 и 34

остатка для трех-, четырех- и пятитяжевой а-суперспирали, соответственно.

Следовательно, полипептид, образующий пятитяжевую а-суперспираль,

должен иметь высокую вероятность формировать фибриллу, если его длина

составит 34 аминокислотных остатка

б) Дизайн аминокислотной последовательности пятитяжевой а-суперспирали.

При конструировании аминокислотной последовательности семичленного повтора полипептида, способного образовывать пятитяжевую а-суперспираль, мы руководствовались следующими соображениями.

1) Хорошо известно, что во внутренних положениях а-суперспиралей (а) и (d) должны быть расположены достаточно большие гидрофобные аминокислотные остатки (лейцин (L), изолейцин (I), валин (V)), позволяющие добиться максимальной стабильности а-суперспиралей. Однако, поскольку проведенный сравнительный анализ последовательностей известных пятитяжевых а-суперспиралей, не выявил каких-либо закономерностей в распределении гидрофобных аминокислотных остатков по положениям (а) и (d), мы поместили в эти положения аминокислотные остатки лейцина (L), как наиболее часто встречающегося в этих положениях в коротких а-суперспиралях.

2) Принимая во внимание факт, что неполярные остатки в положении (е), как правило, благоприятствуют образованию многотяжевых а-суперспиралей вследствие расширения внутреннего гидрофобного кластера, мы поместили в это положение остаток аланина (А)

3) В положения ф и (g) а-суперспирали мы поместили противоположно заряженные остатки аргинина (R) и глутаминовой кислоты (Е). Этот выбор был сделан, поскольку ранее А. Каявой был проведен стереохимический анализ структуры пятитяжевой а-суперспирали COMP в воде, который выявил наличие специфических электростатических взаимодействий между аминокислотными остатками, находящимися в положениях ф и (g'J соседних спиралей Взаимодействия типа (f-g') в принципе невозможны в двух- и трехтяжевых а-суперспиралях. К тому же, при таком дизайне а-спирали содержат положительно заряженные остатки аргинина (R) на одной стороне боковой поверхности и отрицательно заряженные остатки глутаминовой кислоты (Е) с другой стороны, что должно приводить к образованию а-суперспирали с параллельной ориентацией отдельных а-спиралей.

4) В положения (Ъ) и (с) а-суперспирали мы поместили остатки глутамина (Q), руководствуясь тем, что в пятитяжевых а-суперспиралях эти

остатки оказываются достаточно близкими и способны образовывать межспиральные водородные связи.

Исходя из всего выше указанного, была составлена последовательность, и методом твердофазного химического синтеза был получен полипептид

Q.L^R/EsMQiQcLA-RjEirL^ В последствии, исходный пептид был назван aFFP (a-helical fibril-forming peptide)

2. Экспериментальное исследование структуры полипептида aFFP.

а) Исследование вторичной структуры полипептида aFFP методом спектроскопии кругового дихроизма (КД).

На рис. 2 представлены спектры КД пептида aFFP в дальней УФ области при комнатной температуре и при разных значениях рН среды. Как видно из рисунка при кислых значениях рН (от 2.5 до 5 0) спектр пептида имеет максимум при 198 нм и два минимума при 208 нм и 220 нм, характерных для а-спиральной конформации. Значение эллиптичности при 208 нм равно 38* 10"3 град*см2*дцмоль"1, что говорит о высоком содержании в исследуемых препаратах вторичной структуры (более 95 %). Отношение эллиптичностей при 220 нм и 208 нм типичным для взаимодействующих a-спиралей в а-суперспиральных комплексах. При увеличении рН полипептид aFFP претерпевает конформационные изменения, сопровождающиеся изменением спектра КД. Два характерных минимума в спектрах разрушаются, и в нейтральных и щелочных рН полипептид имеет конформацию, отличную от a-спиральной, однако при этом наблюдается и некоторое помутнение растворов пептида, связанное, по-видимому, с агрегацией препарата. На вставке в рисунке 2 изображена кривая титрования полипептида aFFP. Следует отметить, что переход полипептида

v 80

8 "г

е-

40

Г\ ^ г

/ \ I2' /

1 \ $<В-

\ & 36-

3 4 5 6 7В

рн

V4 рН 6 2 - 8 0

""]ЯН27-54

180

240

200 220 Длина волны ( им) Рис. 2. Спектры КД пептида аНФ в дальней УФ области при комнатной температуре и при рН 2 7, 3 2, 4 5, 5 4, 6 2, 8 0 На вставке изображена зависимость значений эллиптичности [©]220нМ от рН среды

равно (1.00 ±0.03), что является

аПФ из а-спиральной в неспиральную конформацию является полностью обратимым, высоко кооперативными и лежит в узком интервале значений рН от 5.5 до 6 0. В этих условиях, наиболее вероятной группой, которая может быть подвержена депротонированию, является глутаминовая кислота. Значения рК для свободной глутаминовой кислоты лежат в диапазоне 4.2 - 4.5 единиц рН. Сдвиг рК глутаминовой кислоты до 5.5 единиц рН возможен лишь в случае, если в структуре этот остаток находится в специфическом окружении и вовлечен в электростатические взаимодействия отталкивания.

Спектры пептида в нейтральной области приобретают необычный вид связанный, вероятно, с агрегацией препарата. Тем не менее, можно сказать, что даже в этих условиях в спектрах остаются заметными минимумы и максимум характерные для а-спиралей, что говорит, вероятно, о присутствии заметной доли а-спиральной конформации и в этой агрегированной форме.

б) Определение формы и характерных размеров а-суперспиральных комплексов, формируемых полипептидом сДОТ.

Были проведены исследования полипептида аЬТР методом седиментации

- диффузии. Из экспериментов следует, что профиль седиментации пептида

аИФ при кислых значениях рН среды имеет один симметричный пик. В

таблице 1 приведены значения коэффициентов седиментации и диффузии

полипептида аРТР, полученные при разных концентрациях образца. Из

таблицы видно, что у полипептида аРБР наблюдается сильная зависимость

гидродинамических параметров от концентрации образца. Подобная

концентрационная зависимость характерна для молекул, имеющих в растворе

форму палочек Используя полученные данные, мы рассчитали факторы формы

Перрена для исследуемых образцов Они равны 6.01 и 4 77 для полипеитида

аИФ с концентрацией 0.7 мг/мл и 1.5 мг/мл, соответственно. Из рассчитанных

Таблица 1

Гидродинамические параметры пептида аРКР

аРКР 5*10'и,(8) О * 10"',(см^сек) И т

0 7 мг/мл 70 0 42 6 01 >200

1 5 мг/мл 5 1 0 70 4 77 150

Б, О - константа седиментации и коэффициент диффузии в условиях эксперимента, соответственно, Р - форм-фактор Перрена, - аксиальное отношение Эксперименты проводились в фосфатном буфере 10 тМ, содержащим 0 1 М №С1, рН 2 8 при 20°С

Рнс. 3. Электронные микрофотографии полипептида аРРР, полученные при (А) негативном контрастировании уранил ацетатом, рН 2 8, (В) при круговом напылении платины, рН 2 8 и (С) при круговом напылении платины, рН 7 2 Реперная метка равна 10 нм

значений факторов формы следует, что полипептид в исследуемых образцах собирается в достаточно вытянутые структуры, с соотношениями продольного размера к поперечному больше 150.

Что бы оценить характерные размеры полученных а-суперспиралей, мы использовали метод электронной микроскопии. На рис. ЗА представлена электронная микрофотография полипептида аИФ при кислых значениях рН среды, полученная при негативном контрастировании уранил ацетатом Из рисунка видно, что полипептид аРИ* в этих условиях образует однородные нитевидные структуры - фибриллы - разной длины, и отдельные фибриллы достигают длины около 700 А. При этом наблюдаемые фибриллы имеют одинаковый диаметр, равный (3 0 ± 0.5) нм. Фибриллы также хорошо видны и на электронных микрофотографиях, полученных при напылении платины под малыми углами (рис. ЗВ).

При переходе из кислых условий среды в нейтральные по данным метода спектроскопии КД пептид претерпевает конформационный переход. На рис. ЗС представлена электронная микрофотография полипептида с^ТР при нейтральных значениях рН среды, полученная при напылении платины под малыми углами. Видно, что в этом случае полипептид формирует сферические частички с диаметром 10-15 нм.

в) Исследование стабильности а-суперспиральных фибрилл, формируемых полипептидом аРРР.

а-Суперспиральные фибриллы, формируемые полипептидом оСТР в кислых рН, обладают чрезвычайно высокой термостабильностью. В водном буфере нам не удалось наблюдать их плавление вплоть до I = 130°С. Для того, чтобы оценить стабильность и степень кооперативности плавления фибрилл, мы использовали денатурант диметилсульфоксид (ДМСО) для дестабилизации аТ-ТР и сдвига денатурационного перехода в область рабочих температур используемых приборов. На рис. 4, представлены зависимости молярной теплоемкости полипептида ой-ТР от температуры в 60 % и 75 % ДМСО Из рис 4 видно, что даже при высоких концентрациях денатуранта а-суперспиральные фибриллы продолжают сохранять чрезвычайно высокую термостабильность (для примера, лизоцим в 60 % ДМСО при комнатной температуре уже полностью денатурирован). Фибриллы кооперативно плавятся при температурах 99°С (372 К) и 120°С (393 К) в 75% и 60% ДМСО, соответственно.

Как видно из рис 4, форма кривых плавления фибрилл в ДМСО имеет асимметричный вид. Подобная асимметрия пика может быть следствием того, что процесс денатурации протекает в неравновесных условиях. И это подтверждает факт наличия зависимости положения пика плавления от скорости прогрева препаратов. При повторном прогреве препаратов основной пик плавления полностью воспроизводится, что

свидетельствует о

восстановлении фибриллярных структур при охлаждении. Наличие на кривых плавления низкотемпературных пиков (в

300 320 340 360

области 330 К-350 К) при температура ( К)

первом прогреве может быть Рис. 4. Зависимость парциальной молярной

теплоемкости пептида аКРР при разных связано с плавлением концентрациях ДМСО, рН 2 5 60% ДМСО (--нефибриллярных олигомеров, первый прогрев, 75 % ДМСО (-)- первый

прогрев, (—• — «—)- второй прогрев

которые при охлаждении

встраиваются в структуру основной фибриллы.

г) Исследование фибриллярной структуры, формируемой полипептидом аРРР, методом малоугловой дифракции рентгеновских лучей.

Кооперативное плавление фибрилл и их единая форма, наблюдаемая при помощи метода электронной микроскопии, предполагает наличие одинаковой молекулярной структуры. И это подтверждают эксперименты по дифракции рентгеновских лучей образца полипептида аРКР. В таблице 2 представлены наблюдаемые рефлексы и их интенсивности, а также теоретически рассчитанные рефлексы от модели фибрилл определенного диаметра, имеющих гексагональную упаковку. Согласно полученным данным, фибриллы, формируемые полипептидом оСТР, имеют гексагональную упаковку с расстоянием между соседними фибриллами (2 82 ± 0.05) нм Эта величина хорошо согласуется с наименьшим расстоянием между пятитяжевыми а-суперспиральными комплексами, наблюдаемыми в кристаллах фрагмента олигомерного матричного белка сухожилий крысы. Также на рентгенограмме имеется рефлекс 1/0 51 нм"1, характерный для а-суперспиральной конформации

На рис 5 представлена дифракционная картина образца пептида аРБР, подсушенного в течение нескольких месяцев в узком капилляре. Подсушивание образца привело к частичной ориентации мениска. Это отразилось в появлении на рентгенограмме дополнительных как кольцевых, так и нескольких экваториальных рефлексов и одного меридионального (набор П, таблица 2). Доля ориентированных фибрилл дает меридиональный рефлекс, соответствующий 1/0.51 нм"1 Появление этого рефлекса на меридиане свидетельствует о том, что отдельные а-спирали пептида аРРР ориентированы вдоль оси фибриллы.

Расстояние между соседними фибриллами, определенное в подсушенном

фибрилл в области капиллярного

Рис. 5. Рентгенограмма образца полипептида аЬТР, подсушенного в течение четырех месяцев в узком капилляре

Таблица 2.

Наблюдаемые рефлексы и их интенсивности от образца пептида аИФ

Наблюдаемые Рассчитанные для

гексагональной упаковки

Рефлекс Интенсивность Форма рефлекса" Рефлекс Индекс

(<3, нм) ((1, нм)

2 45±0 05 средняя кольцо 2 44" 10

набор1 1 42+0 03 средняя кольцо 1 41ь И

1 22±0 02 средняя кольцо 1 22" 20

0 52*0 01 очень слабая дуга, т диффузная а-спираль, т

2 32±0 05 очень сильная кольцо 2 30' 10

213±0 05 очень сильная дуга, е 2 14' 10

1 33±0 03 средняя кольцо 1 33е 11

набор!! 1 24+0 02 сильная дуга, е 1 24" 11

1 14±0 02 средняя кольцо 1 15е 20

1 07±0 02 средняя дуга, е 1 07* 20

0 87+0 02 слабая диффузное кольцо 0 83е (0 87е) 21

0 83±0 02 средняя диффузная дуга, п-е 0 77" (0 81е) 21

0 51+0 01 очень слабая дуга, т а-спираль, т

набор I и П - рефлексы от концентрированного раствора пептида и подсушенного в течение четырех месяцев в узком капилляре, соответственно,

* т - меридиональный; е - экваториальный, п-е - близко экваториальный Экватор совпадает с осью капилляра

ъа=2 82 нм, са=2 652 нм, ||а=2.470 нм

'рассчитан с учетом ограниченного числа (здесь 19) фибрилл в рассеивающем пучке

образце из экваториальных рефлексов, которые возникают от части ориентированных фибрилл, составило (2 47 + О 05) нм, и последующее длительное подсушивание образца не приводило к изменению этой величины Этот факт позволяет нам предположить, что это наименьшее расстояние является Вандерваальсовым диаметром фибрилл Проведенные в последствии расчеты энергии упаковкимежду модельными пятитяжевыми а-суперспиралями подтверждают, что такие а-суперспирали могут укладываться друг с другом без возникновения стерических напряжений на расстоянии 2 6 нм

3. Конструирование и экспериментальное исследование структуры полипептида, несущего на 14-конце последовательность, нарушающую характерную для а-суперспиралей квазипериодичность.

Чтобы получить еще одно доказательство, что фибрилла, формируемая полипептидом аПФ, в сечении является пятитяжевой, мы сконструировали пептид, в котором отдельные а-спирали ассоциируют без сдвига друг относительно друга, и, как следствие, не образуют фибриллярные структуры. С этой целью мы присоединили на Ы-конец исходного пептида аРРР последовательность из 9 массивных заряженных аминокислотных остатков с низкой спиралеобразующей способностью и нарушающих характерную для

а-суперспиралей квазипериодичность первичной структуры.

Методом твердофазного химического синтеза был получен пептид

Исследование вторичной структуры пептида аНФ-^с! методом спектроскопии КД показало, что при кислых значениях рН пептид аРРР-^с1, также как и исходный пептид аРРР в растворе образует а-суперспиральные комплексы (рис 6) При изменении рН среды пептид аРРР-гйс! претерпевает конформационные изменения, происходящие в том же диапазоне изменений рН, что и для пептида аРРР, что указывает на то, что специфическое окружение титруемых в этих условиях остатков глутаминовой кислоты, находящихся в положениях (%) а-суперспиралей пептидов аРРР и аРРР-^с1, является аналогичным. Для определения молекулярной массы и выяснения стехиометрии а-суперспирального комплекса, формируемого пептидом аРРР-^с! при кислых значениях рН, нами были выполнены эксперименты по седиментации и равновесному ультрацентрифугированию. Определенный из этих экспериментов молекулярный вес а-суперспирального комплекса составляет (25 ± 1) кДа.

Молекулярная масса пептида аРРР-^с!, вычисленная из аминокислотной

последовательности составляет 4.9 кДа.

Чтобы убедиться в том, что

Длина волны ( нм) Рис.6. Спектры КД пептида айФ-^ё в дальней УФ области при комнатной температуре и при рН 2 7, 3 3, 4.3, 5 0, 5.4, 5 8, 6 5, 9 0 На вставке изображена зависимость значений эллиптичности [©Ъмнм от рН среды

пептид отч^ё не образует в растворе . | ^

подобно исходному пептиду гаКГ'Р Щ4

фибриллярные структуры, мы Ш |||

использовали метод электронной Ш ^^

микроскопии Данные гидродинамических Щ!

методов подтвердились - нам не удалось Цз

наблюдав фибриллярные структуры в Жй

электронном микроскопе Таким образом, пептид aFFP-rgd собирается в пятитяжевые а-суперспиральные комплексы, и этот факт может служить еще одним

доказательством того, что исходная р„с. 7. (А) Модель пятитяжевой а-

фибриллярная структура, формируемая суперспиральной фибриллы,

формируемой пептидом, состоящим из 34 полипептидом аРБР, в сечении является остатков

шпитяжевой а-суперспиралью (В>Модель Фибриллы- фоРмируемой

г пептидом, с дополнительными пятью

остатками, присоединенными на М-конец На рисунке 7 А представлена модель фибриллы, которая наилучшим образом согласуется с полученным набором экспериментальных данных -диаметр фибриллы, а-спиральная конформация пептида, ориентация а-спиралей вдоль оси фибриллы и то, что в сечении а-суперспиральная фибрилла является пятитяжевой. а-Спирали полипептида аРБР, состоящие из 34 аминокислотных остатков отлично укладываются в параллельную пятитяжевую а-суперспиральную фибриллу, в которой соседние а-спирали сдвинуты относительно друг друга на один семичленный повтор. Диаметр модельной фибриллы хорошо согласуется с диаметром в 24 7 А, полученным из анализа данных по дифракции рентгеновских лучей (таблица 2).

Создание короткого пептида, способного собираться в пятитяжевые а-суперспиральные фибриллы, является первым шагом для будущих разработок а-суперспиральных структур с новыми заданными свойствами. Мы синтезировали пептид с добавленными на вконец полипептида аРРР пятью аминокислотными остатками (<ЗС(2АС) с низкой спиралеобразующей способностью (пептид аРРРсс). Исследование этого пептида методами спектроскопии КД и электронной микроскопии показали, что полипептид аРТРсс обладает свойствами, аналогичными исходному полипептиду аРГР. На

13

рисунке 7В изображена предполагаемая укладка полипептида aFFPcc в фибриллу Тот факт, что полипептид aFFPcc с добавленным нерегулярным фрагментом все еще способен образовывать фибриллы предполагает, что добавление на N-конец полипептида aFFP определенных биологически активных лигандов не изменят его свойство образовывать а-суперспиральные фибриллы Данный факт открывает новые возможности для многочисленных применений таких структур в биотехнологии и медицине в качестве носителя коротких биологически активных лигандов, присоединенных на N-конец каждого пептида. Это свойство пептида может быть широко использовано в медицинских технологиях и биотехнологических процессах, где высокая эффективность может быть достигнута ассоциацией большого числа функциональных субъединиц в одном комплексе.

Свойство сконструированного пептида aFFP образовывать a-суперспиральные фибриллы в зависимости от внешних условий среды также может быть использовано при создании новых структур - так называемых гелей, чувствительных к внешним воздействиям (stimulus-sensitive hydro gels) Полимерные гели с такими свойствами имеют большой потенциал для биотехнологических приложений, требующих инкапсулирования и контролируемого высвобождения нужных молекул, а также в разработке систем направленной доставки лекарств.

4. Конструирование и экспериментальное исследование структур полипептидов, способных образовывать a-суперспиральные фибриллы в широком диапазоне значений рН.

Для решения ряда прикладных задач требуется получать универсальные конструкции, работающие в широком диапазоне изменений внешних условий Поэтому целью этой части работы было сконструировать полипептид, способный образовывать фибриллы в широком диапазоне значений рН

Исходный полипептид aFFP образует a-суперспиральные фибриллы при кислых рН среды и сферические частицы при нейтральных рН. Переход между этими двумя состояниями полностью обратимый, высоко кооперативный и происходит при рН 5.5 - 6.0. В этих условиях, наиболее вероятной группой, которая может быть подвержена депротонированию, является глутаминовая

кислота. Поэтому, мы предположили, что электростатическое отталкивание между отрицательно заряженными остатками глутаминовой кислоты, находящимися в положении (%) а-суперспирали пептида аРРР, мешает образованию фибрилл при нейтральных рН. Чтобы получить пептиды, способные образовывать фибриллы при нейтральных значениях рН, мы заменили все остатки глутаминовой кислоты (Е) на гидрофильные, но незаряженные остатки глутамина (С)) или серина (Б).

Методом твердофазного химического синтеза были получены следующие пептиды.

пептид аРРР-1: 0сЦАД(О8Ьа(дьдсЬйАеК(О6Ьа)4 пептид аРРР-2: ОсЬйАД^Ь^дьОсЬаАеЯ^Ц),,

Мы также синтезировали пептид о.РРР-3, в котором все заряженные фуппы аргинина (Я) и глутаминовой кислоты (Е) были заменены гидрофильными остатками глутамина (0).

пептид аРРР-З: ОД^М^ЦСОъО^лАДМЫ^

На рис. 8 представлены спектры КД исследуемых пептидов в дальней УФ области при комнатной температуре и при разных значениях рН среды Спектры пептидов имеют вид, характерный для а-спиральной конформации Отношение эллиптичностей при 220 нм и 208 нм равно (1.00 ± 0 03) для всех пептидов, что является типичным для взаимодействующих а-спиралей в а-суперспиральных комплексах Как видно из рисунка, пептиды аРРР-1, аРРР-2 и аББР-З, в отличие от исходного пептида о^-ТР, имеют высокое содержание а-спиральной конформации (более 95 %) не только при кислых, но и при нейтральных рН среды. Причем вторичная структура пептидов аРРР-1 и аББР-З не изменяется вплоть до рН 11.0.

Пептид аРРР-2 при рН > 9 0 начинает претерпевать конформационные

изменения, сопровождающиеся изменением спектра КД. В щелочных рН

пептид имеет конформацию, отличную от а-спиральной, при этом, также как и

для исходного пептида аРРР, наблюдается некоторое помутнение раствора

пептида, связанное, по-видимому, с агрегацией препарата На вставке рис 8

изображена кривая титрования пептида аРРР-2, из которой видно, что переход

из а-спиральной в неспиральную конформацию лежит в широком интервале рН

от 9.0 до 12 0, и может отражать аномальное титрование остатков аргинина или

15

Длина волны ( нм) Рис. 8. Спектры КД в дальней УФ области пептидов aFFP при рН 2 7, 3 2, 4 5, 5 4, 6 2, и 8 О, aFFP-1 при рН 2 9, 3 1, 4 1, 6 0, 7 2, 9 3, 11 0 и 12 3, cxFFP-2 при рН 2 9, 3 9, 5 5, 7 6, 8 7, 10 5, 11 2 и 12 8, aFFP-З при рН 2 9, 6 1 и 8 5 Спектры записаны при концентрации пептидов 0 1-0 5 мг/мл в 10 мМ натрий фосфатном буфере при 20°С На вставках изображены зависимости значений [вигони от рН среды

концевых NH2 групп Последнее кажется маловероятным, поскольку на кривых титрования пептидов aFFP-1 и aFFP-З, также имеющих концевые NH2 группы, во всем исследуемом диапазоне значений рН никаких конформационных переходов не наблюдается.

Исследования вновь синтезированных пептидов методом электронной микроскопии показали, что пептиды aFFP-1, aFFP-2 и aFFP-З образуют фибриллярные структуры как при кислых рН среды, так и при нейтральных. В качестве примера, на рис. 9 представлена электронная микрофотография пептида aFFP-2 при кислых рН, полученная при негативном контрастировании уранил ацетатом. Из рисунка видно, что пептид aFFP-2 в этих условиях образует два вида нитевидных структур - тонкие нити с диаметром 3 0 ± 0.5 нм, которые, по всей вероятности, являются пятитяжевыми а-суперспиральными фибриллами, и нити вдвое большего диаметра. Более подробное исследование

изображений фибрилл

показало, что толстые фибриллы формируются ассоциацией двух тонких

На вставке в рис 9 представлена электронная микрофотография пептида аРРР-1 при рН 7 3 Видно, что в этих условиях

фибриллы сориентировались Ркс- 9- Электронная микрофотография пептида аРРР-2

при рН 2 8 полученная при негативном и образовали вполне контрастировании уранил ацетатом На вставке показана

паракристаллическая структура, наблюдаемая в упорядоченную препаратах (здесь а!ТР-1 при рН 7 3)

паракристаллическую

структуру Это дало возможность измерить диаметр фибриллы с большей точностью, и он оказался равным 2.7 ± 0 2 нм Способность фибрилл образовывать паракристаллы предполагает, что образующиеся фибриллы - это достаточно жесткие и негнущиеся структуры.

Исходный пептид аРРР при нейтральных значениях рН среды образует сферические частички Несмотря на то, что по данным метода спектроскопии КД пептид аРРР-2 претерпевает подобные конформационные изменения при переходе в щелочные условия, его состояние в этих условиях представляет собой агрегированный материал

Для выяснения стехиометрии вновь полученных фибрилл, методами спектроскопии КД и равновесного ультрацентрифугирования были исследованы пептиды аРРР-1 г$й, а¥¥?-2т%А и аРРР-З^с! с присоединенной на Ы-консц последовательностью 01ЮВ5Р50С Исследования пептидов показали, что все они образуют пятитяжевые а-суперспиральные комплексы, чго указывает на то, что фибриллы, формируемые пептидами аРРР-1, аРРР-2 и аРТР-З, в сечении также являются пятитяжевыми

Калориметрические исследования показали, что фибриллярные структуры, формируемые пептидами аРРР-1, аР№-2 и аРБР-З, в водных растворах остаются стабильными вплоть до 130°С как при кислых, так и при нейтральных рН среды. На рис. 10 представлены зависимости молярной

теплоемкости пептидов оБЕР, аРРР-1, аРРР-2 и аПФ-З от температуры в 60 % и 75 % ДМСО. Вновь полученные фибриллы сохраняют необычно высокую стабильность в высоких концентрациях ДМСО. Как видно из рис 10, на кривых плавления имеются пики поглощения тепла при температурах выше 92°С (365 К), что может отражать кооперативное разрушение фибриллярных структур. Процесс плавления является обратимым, что подтверждается при повторном прогреве препаратов

Фибриллярная структура,

формируемая пептидом аРБР-З, имеет наибольшую стабильность и превосходит стабильность исходной фибриллы пептида аРБР на 23.5°С в 75 % ДМСО. Пептиды аРРР-2 и аРТР-1 формируют структуры с меньшей, по сравнению с исходной, стабильностью В 60 % ДМСО стабильность фибрилл аРТР-1 и аРРР-2 меньше, чем стабильность фибриллы пептида аББР на 15°С и 26°С, соответственно. Таким образом, можно сказать, что изменения, внесенные в аминокислотную последовательность исходного пептида аРРР, нарушили общую картину электростатических взаимодействий на поверхности фибриллы, что привело к изменению стабильности образующихся фибрилл При рН 2.5 на поверхности исходной фибриллы полипептида о^Р имеется протяженная сеть положительных зарядов, образованная остатками аргининов, находящихся в положениях ф а-суперспирали. Однако электростатические отталкивания одноименно заряженных остатков аргинина, по-видимому, частично скомпенсированы близким окружением больших остатков глутаминовой кислоты, которые хоть и незаряжены в этих условиях, но способны образовывать водородные связи. Замена остатков глутаминовой кислоты несколько меньшими остатками глутамина (пептид аРРР-1) и серина (пептид аРРР-2) приводит к усилению электростатического отталкивания

Температура ( К) Рис. 10. Зависимости парциальной молярной теплоемкости пептидов, рН 2 5

60 % ДМСО: (-) - о!ТР, (---) -

аРРР-1, (---)-а!ТР-2 и (••••)- аГТР-З,

75 % ДМСО: (-) - сОТР и (---) -

аРКР-З

остатков аргинина, что проявляется в дестабилизации исходной фибриллы. Замена же положительно заряженных остатков аргинина на глутамин (пептид aFFP-З) ослабляет это отталкивание и приводит к увеличению стабильности фибриллы.

Выводы.

1 Впервые сконструирован de novo и синтезирован короткий полипептид aFFP, состоящий из 34 аминокислотных остатков, который при кислых рН среды спонтанно собирается в длинные a-суперспиральные фибриллы с фиксированным диаметром Исследование структуры фибриллы методами спектроскопии КД, седиментации - диффузии, электронной микроскопии, сканирующей микрокалориметрии и малоугловой дифракции рентгеновских лучей подтверждает предсказанную пятитяжевую упаковку отдельных a-спиралей полипептида в a-суперспиральной фибрилле. 2. При переходе из кислых условий среды в нейтральные полипептид aFFP обратимым образом формирует сферические частицы с диаметром 1015 нм.

3 Показано, что электростатические взаимодействия между поверхностными аминокислотными остатками важны для образования пятитяжевых а суперспиралей В частности, показано, что заряженные остатки в ф и (g) положениях влияют как на стабильность пятитяжевых a-суперспиралей, так и на диапазон рН в которых они образуются

4 Показано, что измененные последовательности пептидов aFFP 1, aFFP-2 и aFFP-З способны образовывать пятитяжевые а-суперспиральные фибриллы в широком диапазоне изменений значений рН, что позволит использовать такие структуры в биотехнологии и медицине в качестве носителей коротких биологически активных лигандов.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах.

1) Т Н Мельник, А.В Каява, Ж Коррадин, В И. Попов, С А Потехин Роль электростатических взаимодействий в стехиометрии a-суперспиралей III Пущинская конференция молодых ученых, Пущино, 27 -30 апреля 1998 Сборник тезисов, стр 86

2) Т Н Мельник, А В Каява, В Броссард, Ж Коррадин, В И Попов, С А Потехин Влияние длины полипептидной цепи и межспиральных электростатических взаимодействий на стехиометрию а-суперспиралей II Съезд биофизиков России, Москва, 23 - 27 августа 1999 Сборник тезисов, том I, стр 59

3) Т Н Мельник, А В Каява, В И Попов, Н Ф Ланина, А А Вазина, Ж Коррадин, С А Потехин Конструирование а-суперспиральных фибрилл из коротких синтетических пептидов III Съезд биохимического общества, Санкт-Петербург, 26 июня - 1 июля 2002 Сборник тезисов, сгр 502

4) Т N Melnik, А V Kajava, G Corradin, VI Popov, S A Potekhin Construction of self-assembling a-fibrils design, synthesis and properties International Symposium Protein Structure, Stability and Folding Fundamental and Medical Aspects, Moscow, Russia, June 22 -26,1998 Book of abstracts p 115

5) T N Melnik,_A V Kajava, VI Popov, G Corradin, A A Vazina, S A Potekhin Self-assembly of de novo design peptides into long a-helical coiled coil fibrils Seventh International Summer School on Biophysics Supramolecular Structure and Function, Rovinj, Croatia, September 1426,2000. Book of abstracts p 110

6) S A Potekhin, T N Melnik, V Popov, N F Lanina, A A Vazina, P Rjgler, A S Verdmi, G Corradin, A V Kajava, De novo design of fibrils made of short a-helical coiled coil peptides, Chemistry. & Biology 8, (2001), 1025-1032

7) TN Melnik, V Villard, V Vasiliev, G Corradin, AV Kajava and SA Potekhin Shift of fibril-forming ability of the designed a-helical coiled coil peptides into the physiological pH region Protein Engineering 16 (2003), 1125-1130

8) T N Melnik, V Villard, V Vasiliev, G Corradin, A V Kajava and S A Potekhin Design, study and possible biomedical applications of coiled coil nanofibrils International Workshop "Progress in Biotechnology and Neurobiology - Integrative Medicine", Hurgada (Egypt), February 14-24, 2004

9) T N Melnik, V Villard, V Vasiliev, G Corradin, A V Kajava and S A Potekhin Design, study and biomedical applications of coiled coil nanofibrils Fifth "Trends in Nanotechnology" (TNT2004) international conference, Segovia (Spain) September 13 - 17 2004 Abstracts on http //www phantomsnet com/TNT04

Работа удостоена премии фонда Naturwissenschaftler-Initiative "Verantwortung for den Frieden"

(Германия) за 2001 год

Принято к исполнению 12/01/2005 Исполнено 13/01/2005

Заказ № 545 Тираж 100 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095) 318-40-68 www autoreferat ru

РНБ Русский фонд

2006-4 2783

135

i i

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Мельник, Татьяна Николаевна

I. Введение. 5 П. Литературный обзор.

2.1. а-Суперспиральные белки.

2.2. Что такое а-суперспиральный мотив?

2.3. Принципы олигомеризации а-спиралей в а-суперспиральные комплексы.

2.3.1. Стехиометрия а-суперспиралей.

2.3.2. Ориентация а-суперспиралей.

2.3.3. Гомо- или гетероолигомеризация а-суперспиралей.

2.4. Принципы олигомеризации многотяжевых а-суперспиралей.

2.5. Правые а-суперспирали.

2.6. Структурная организация олигомерного матриксного белка сухожилий крысы.

2.7. Конструирование а-суперспиральных фибриллярных структур.

2.8. Медицинские и биотехнологические аспекты применения а-суперспиральных комплексов.

Ш. Материалы и методы.

3.1. Синтез пептидов.

3.2. Исследование содержания вторичной структуры методом спектроскопии кругового дихроизма (КД).

3.3. Исследование синтетических пептидов гидродинамическими методами.

3.3.1. Измерение коэффициентов седиментации.

3.3.2. Измерение коэффициентов диффузии.

3.3.3. Определение молекулярной массы препаратов.

3.3.4. Расчеты факторов формы Перрена.

3.4. Определение коэффициентов диффузии пептидов методом динамического светорассеяния.

3.5. Электронная микроскопия.

3.6. Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия.

3.7. Метод малоугловой дифракции рентгеновских лучей. 42 IV. Результаты и обсуждения I.

4.1. Конструирование коротких полипептидов, способных образовывать пятитяжевые а-суперспиральные фибриллы.

4.1.1. Выбор длины полипептида.

4.1.2. Дизайн аминокислотной последовательности пятитяжевой а-суперспирали.

4.2. Экспериментальное исследование структур, образованных полипептидами aFFP и aFFPcc.

4.2.1. Исследование вторичной структуры aFFP и aFFPcc методом спектроскопии кругового дихроизма (К Д).

4.2.2. Определение формы и характерных размеров а-суперспиральных комплексов, формируемых пептидами aFFP и aFFPcc.

4.2.3. Исследование стабильности a-суперспиральных фибрилл, формируемых пептидом aFFP.

4.2.4. Исследование фибриллярной структуры, формируемой пептидом aFFP, методом малоугловой дифракции рентгеновских лучей.

4.3. Конструирование и экспериментальное исследование структуры полипептида, несущего на N-конце последовательность, нарушающую характерную для a-суперспиралей квазипериодичность.

4.3.1. Исследование вторичной структуры пептида aFFP-rgd методом спектроскопии кругового дихроизма (КД).

4.3.2. Определение стехиометрии комплекса, формируемого пептидом aFFP-rgd.

4.4. Обсуждение результатов I.

V. Результаты и обсуждения П.

5.1. Конструирование пептидов, способных образовывать а-суперспиральные фибриллы в широком диапазоне значений рН.

5.2. Экспериментальное исследование структур, образованных пептидами aFFP-1, aFFP-2 и aFFP-3.

5.2.1. Исследование вторичной структуры aFFP-1, aFFP-2 и aFFP-3 методом спектроскопии кругового дихроизма (КД).

5.2.2. Определение характерных размеров и формы a-суперспиральных комплексов, формируемых пептидами aFFP-1, aFFP-2 и aFFP-3.

5.2.2.1. Исследования методом электронной микроскопии.

5.2.2.2. Исследования гидродинамическими методами. 83 5.2.3. Исследование стабильности a-суперспиральных фибрилл, формируемых пептидами aFFP-1, aFFP-2 и aFFP-3.

5.3. Экспериментальное исследование структур полипептидов aFFP-1 rgd, aFFP-2rgd и aFFP-3rgd.

5.4. Обсуждение результатов II.

VI. Выводы. 94 VH. Список литературы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Синтетические пятитяжевые α-суперспиральные фибриллы: конструирование и свойства"

а-Суперспирали - это широко распространенные элементы структуры белков. Для этих структур характерным является то, что их аминокислотная последовательность квазипериодична и может быть представлена в виде повторяющихся семичленников (аЪ с def g)n, причем в (а) и (d) положениях, как правило, находятся неполярные аминокислотные остатки, формирующие внутреннее гидрофобное ядро, а в положениях (Ь), (с), (е), ф и (g) -полярные аминокислотные остатки, участвующие в меж- и внутриспиральных взаимодействиях (Cohen & Parry, 1990; Lupas, 1996; Hodges, 1996). Многочисленные исследования показали, что пептиды, имеющие характерный семичленный повтор аминокислотной последовательности образуют как двух-, трех- , так и четырех- и пятитяжевые а-суперспирали (Adamson, et al., 1993; Lovejoy, et al., 1993; Banner, et al., 1987; Malashkevich, et al., 1996). Однако вопрос о том, какие взаимодействия ответственны за избирательность образования а-суперспиралей с той или иной стехиометрией до сих пор остается открытым. Данная работа посвящена изучению факторов, приводящих к образованию пятитяжевых а-суперспиральных комплексов.

Проанализировав структуры известных четырех- и пятитяжевых а-суперспиралей, мы предположили, что число спиралей в многотяжевых а-суперспиралях определяется не только эффектом упаковки внутренних гидрофобных остатков, находящихся в положениях (а) и (d), но и дополнительными электростатическими взаимодействиями между аминокислотными остатками боковых цепей, находящихся в положениях (Ь), (с), ф и (g) а-суперспирали. Так же из проведенного анализа следовало, что пептиды, склонные к образованию пятитяжевых а-суперспиралей и имеющие строгий семичленный повтор аминокислотной последовательности способны образовывать регулярные фибриллярные структуры. Это было интересно проверить экспериментально, поскольку из литературы известно, что попытки ряда авторов сконструировать а-суперспиральные полипептиды с возможным сдвигом отдельных а-спиралей вдоль оси суперспирали приводили к образованию фибриллярных агрегатов с неожиданно большой и нерегулярной толщиной (Pandya, et al. 2000; Ogihara, et al., 2001; Yeates & Padilla, 2002; Ryadnov & Woolfson, 2003).

Конструирование полипетидов de novo с заранее заданной архитектурой - это хороший способ проверить правильность понимания нами принципов структурной организации а-суперспиральных комплексов. С этой целью в работе был сконструирован короткий полипептид aFFP, который способен образовывать в растворе длинные пятитяжевые a-суперспиральные фибриллы. Исследование структуры полипетида методами спектроскопии КД, седиментации - диффузии, электронной микроскопии, сканирующей микрокалориметрии и малоугловой дифракции рентгеновских лучей подтвердили предсказанную пятитяжевую упаковку отдельных a-спиралей полипептида в a-суперспиральной фибрилле. Кроме того, внесение изменений в последовательность исходного полипетида aFFP позволило прояснить роль заряженных аминокислотных остатков, находящися в положениях ф и (g), в структуре пятитяжевой а-суперспирали.

Также в работе обсуждается возможность использования полученных фибриллярных структур для решения ряда прикладных задач в биотехнологии и медицине.

II. Литературный обзор

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Мельник, Татьяна Николаевна

VI. Выводы.

1. Впервые сконструирован de novo и синтезирован короткий полипептид aFFP, состоящий из 34 аминокислотных остатков, который при кислых рН среды спонтанно собирается в длинные a-суперспиральные фибриллы с фиксированным диаметром. Исследование структуры фибриллы методами спектроскопии КД, седиментации - диффузии, электронной микроскопии, сканирующей микрокалориметрии и малоугловой дифракции рентгеновских лучей подтверждает предсказанную пятитяжевую упаковку отдельных а-спиралей полипептида в a-суперспиральной фибрилле.

2. При переходе из кислых условий среды в нейтральные полипептид aFFP обратимым образом формирует сферические частицы с диаметром 10-15 нм.

3. Показано, что взаимодействия между поверхностными аминокислотными остатками важны для образования пятитяжевых a-суперспиралей. В частности, показано, что заряженные остатки в (f) и (g) положениях влияют как на стабильность пятитяжевых a-суперспиралей, так и на диапазон рН в которых они образуются.

4. Показано, что измененные последовательности пептидов aFFP-1, aFFP-2 и aFFP-З способны образовывать пятитяжевые a-суперспиральные фибриллы в широком диапазоне изменений значений рН, что позволит использовать такие структуры в биотехнологии и медицине в качестве носителей коротких биологически активных лигандов.

В заключении я хочу выразить глубокую и искреннюю признательность

Сергею Александровичу Потехину, своему научному руководителю, за внимание и доброжелательность, которые сопровождали мою работу, всем сотрудникам группы термодинамики белка Института белка РАН за помощь в процессе работы над диссертацией и теплую дружественную атмосферу, способствовавшую плодотворной работе, всем сотрудникам Института белка, с кем мне пришлось сотрудничать и просто работать рядом, за доброе отношение и поддержку.

Я очень благодарна Андрею Вилховичу Каяве, Виктору Дмитриевичу Васильеву, Виктору Ивановичу Попову, Альвине Андреевне Вазиной, Надежде Федоровне Ланиной за плодотворное сотрудничество и активный интерес к моей работе.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Мельник, Татьяна Николаевна, Пущино

1. Т.Н. Мельник, А.В. Каява, Ж. Коррадин, В.И. Попов, С.А. Потехин. Роль электростатических взаимодействий в стехиометрии а-суперспиралей. III Пущинская конференция молодых ученых, Пущино, 27 30 апреля 1998. Сборник тезисов, стр. 86.

2. S A. Potekhin, T.N. Melnik, V. Popov, N.F. Lanina, A.A. Vazina, P. Rigler, A.S. Verdini, G. Corradin, A.V.Kajava, De novo design of fibrils made of short a-helical coiled coil peptides, Chemistry. & Biology 8, (2001), 1025-1032.

3. T.N. Melnik, V. Villard, V. Vasiliev, G. Corradin, A.V. Kajava and S.A. Potekhin. Shift of fibril-forming ability of the designed a-helical coiled coil peptides into the physiological pH region Protein Engineering 16 (2003), 1125-1130.

4. Боуэн Т., 1973. Введение в ультрацентрифугирование. Москва, "Мир", 248 с.

5. Кантор Ч. и Шиммел П., 1984. Биофизическая химия, том 2. Москва, "Мир", 493 с.

6. Ковригин Е.Л., Потехин С.А., 1996. Микрокалориметрическое исследование влияния диметилсульфоксида на тепловую денатурацию лизоцима, Биофизика 41 (6): 1201-1206.

7. Потехин С.А., Ковригин Е.Л., 1998. Влияние кинетических факторов на тепловую денатурацию и ренатурацию биополимеров. Биофизика, 43 (2): 223-232.

8. Adamson J.G., Zhou N.E., Hodges R.S., 1993. Structure, function and application of the coiled-coil protein folding motif. Curr Opin Biotechnol., 4(4):428-37;

9. Akey D.L., Malashkevich V.N., and Kim P.S., 2001. Buried polar residues in coiled-coil interfaces. Biochemistry, 40: 6352-6360.

10. Alber Т., 1992. Structure of the leucine zipper. Curr. Opin. Genet. Dey., 2:205-210.

11. Alberti S., Oehler .S, von Wilcken-Bergmann В., Muller-ffill В., 1993. Genetic analysis of the leucine heptad repeats of Lac repressor: evidence for a 4-helical bundle. EMBOJ12(8):3227-36.

12. Arndt K.M., Muller K.M., Pluckthun A., 2001. Helix-stabilized Fv (hsFv) antibody fragments: substituting the constant domains of a Fab fragment for a heterodimeric coiled-coil domain. J Mol Biol., 312(l):221-8.

13. Banner D.W., Kokkinidis M., Tsernoglou D., 1987. Structure of the ColEl гор protein at 1.7 A resolution. J Mol Biol., 196(3):657-75.

14. Baxevanis A.D., Vinson C.R., 1993. Interactions of coiled coils in transcription factors: where is the specificity? Curr Opin Genet Dev., 3(2):278-85.

15. Bradford M.M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem., 72:248-54.

16. Boice J.A., Dieckmann G.R., DeGrado W.F., Fairman R., 1996. Thermodynamic analysis of a designed three-stranded coiled coil. Biochemistry, 35(46): 14480-5.

17. Bryson J.W., Betz S.F., Lu H.S., Suich D.J., Zhou H.X., CWeil K.T., DeGrado W.F., 1995. Protein design: a hierarchic approach. Science. 270(5238):935-41.

18. Bullough P.A., Hughson F.M., Skehel J.J., Wiley D.C., 1994. Structure of influenza haemagglutinin at the pH of membrane fusion. Nature. 371(6492):37-43.

19. Burge R.E., 1959. X-ray scattering by bundles of cylinders. Acta Cryst., 12:285-289.

20. Burge R.E., 1963. Equatorial X-ray diffraction by fibrous proteins: short-range order in collagen, feather keratin and F-actin. J. Mol. Biol., 16:213-24.

21. Burkhard P., Ivaninskii S., Lustig A., 2002. Improving coiled-coil stability by optimizing ionic interactions. J Mol Biol. 318(3):901-10.

22. Campbell K.M., Lumb К J., 2002. Complementation of buried lysine and surface polar residues in a designed heterodimeric coiled coil. Biochemistry. 41(22):7169-75.

23. Carroll S.F., Barbieri J.T., Collier R.J., 1988. Diphtheria toxin: purification and properties. Methods Enzymol., 165:68-76.

24. Chen Y.H., Yang J.T., Chau K.H., 1974. Determination of the helix and beta form of proteins in aqueous solution by circular dichroism. Biochemistry, 13(16):3350-9.

25. Cohen C. & Parry D.A.D., 1990. a-Helical coiled-coils and bundles: how to design an a-helical protein. Proteins Struct. Funct. Genet. 7: 1-15.

26. Cohen F.E., Prusiner S.B., 1998. Pathologic conformations of prion proteins. Annu Rev Biochem., 67:793-819.

27. Conejero-Lara F., Mateo P.L., Aviles F.X., Sanchez-Ruiz J.M., 1991. Effect ofл .

28. Zn on the thermal denaturation of carboxypeptidase B. Biochemistry. 30(8):2067-72.

29. Crick, F. H. C., 1953. The packing of a-helices: simple coiled coils. Acta. Cry St., 6: 689-697.

30. Cusack S., Berthet-Colominas C., Hartlein M., Nassar N., Leberman R., 1990. A second class of synthetase structure revealed by X-ray analysis of Escherichia coli seryl-tRNA synthetase at 2.5 A. Nature. 347(6290):249-55.

31. Danovich R.D. & Serdyuk I.N., 1983. Proton Correlation Techniques in Fluid Mechanics. In Shulz-DuBois, E.O. (ed.), Springer, Berlin, New York, pp. 315-321.

32. Dayring H.E., Tramonato A., Sprang S.R., Fletterick R.J., 1986. Interactive program for visualization and modeling of proteins, nucleic acids and small molecules. J. Mol. Graph. 4:82-87.

33. DeGrado W.F., Wasserman Z.R., Lear J.D., 1989. Protein design, a minimalist approach. Science, 243(4891):622-8.

34. Dill K.A., 1990. Dominant forces in protein folding. Biochemistry. 29(31):7133-55.

35. DiCesare P., Hauser N., Lehman D., Pasumarti S., and Paulsson M., 1994. Cartilage oligomeric matrix protein (COMP) is an abundant component of tendon. FEBSLett., 354: 237-240.

36. Durr E., Jelesarov I., Bosshard H.R., 1999. Extremely fast folding of a very stable leucine zipper with a strengthened hydrophobic core and lacking electrostatic interactions between helices. Biochemistry, 38(3):870-80.

37. Efimov V.P., Lustig A. & Engel J. 1994. The thrombospondin-like chains of cartilage oligomeric matrix protein are assembled by a five-stranded a-helical bundle between residues 20 and 83. FEBSLett. 341: 54-58.

38. Efimov V.P., Engel J., Malashkevich V.N., 1996. Crystallization and preliminary crystallographic study of the pentamerizing domain from cartilage oligomeric matrix protein: a five-stranded alpha-helical bundle. Proteins. 24(2):259-62.

39. Ekman S., Reinholt F. P., Hultenby K. and Heinegard D., 1997. Ultrastructural immunolocalization of cartilage oligomeric matrix protein (COMP) in porcine growth cartilage. Calcif. Tissue Int.,, 60:547-553.

40. Ellenberger Т., 1994. Getting a grip in DNA recognition: structures of the basic region, leucine zipper, and the basic region helix-loop- helix DNA-binding domains. Curr. Opin. Struct. Biol. 4: 12-21.

41. Fairman R., Chao H.-G., Mueller L., Lavoie Т. В., Shen L., Novothy J., and Matsueda G. R., 1995. Characterization of a new four-chain coiled-coil: influence of chain length on stability. Protein Sci. 4,1457-1469.

42. Fairman R., Chao H.G., Lavoie T.B., Villafranca J.J., Matsueda G.R., Novotny J., 1996. Design of heterotetrameric coiled coils: evidence for increased stabilization by Glu(")-Lys(+) ion pair interactions. Biochemistry, 35(9):2824-9.

43. Frere V., Sourgen F., Monnot M., Troalen F. and Fermandijian S., 1995. A peptide fragment of human DNA topoisomerase П a forms a stable coiled coil structure in solution. J. Biol. Chem., 270:17502-17507.

44. Glover J.N.M. & Harrison S.C., 1995. Crystal structure of the heterodimeric bZIP transcription factor c-Fos-c-Jun bound to DNA. Nature, 373: 257-261.

45. Graddis T.J., Myszka D.G., Chaiken I.M., 1993. Controlled formation of model homo- and heterodimer coiled coil polypeptides. Biochemistry. 32(47): 12664-71.

46. Griebenow K., Klibanov A.M. 1996. On protein denaturation in aqueous-organic mixtures but note in pure organic solvents. J. Am. Chem. Soc., 118:1170-1175.

47. Gonzalez L., Woolfson D.N., Alber Т., 1996a. Buried polar residues and structural specificity in the GCN4 leucine zipper. Nat Struct Biol. 3(12): 1011-8.

48. Gonzalez L., Brown R.A., Richardson D., Alber Т., 1996b. Crystal structures of a single coiled-coil peptide in two oligomeric states reveal the basis for structural polymorphism. Nat Struct Biol. 3(12): 1002-9.

49. Gotte G., Testolin L., Costanzo C., Sorrentino S., Armato U., Libonati M., 1997. Cross-linked trimers of bovine ribonuclease A: activity on double-stranded RNA and antitumor action. FEBSLett., 415(3):308-12.

50. Harbury P.B., Zhang Т., Kim P.S. & Alber T. 1993. A switch between two-, three-, and four-stranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants. Science 262:1401-1407.

51. Harbury P.B., Kim P.S. & Alber T. 1994. Crystal structure of an isoleucine-zipper trimmer. Nature 371: 80-83.

52. Harbury P.B., Plecs J.J., Tidor В., Alber Т., Kim P.S., 1998. High-resolution protein design with backbone freedom. Science. 282(5393): 1462-7.

53. Hedbom E., Antonsson P., Hjerpe A., Aeschlimann D., Paulsson M., Rosa-Pimentel E., Sommarin Y., Wendel M., Oldberg A., and Heinegard D., 1992. Cartilage matrix proteins. J. Biol. Chem., 267: 6132-6136.

54. Hedbom E., Antonsson P., Hjerpe A., Aeschlimann D., Paulson M., Rosa-Pimentel E., Sommarin Y., Wendel M., Oldberg A., Heinegard D., 1995. An acidic oligomeric protein (COMP) detected only in cartilage. J. Biol. Chem., 267: 6132-6136.

55. Hodges R.S., 1992. Unzipping the secrets of coiled-coils. Curr. Biol., 2:122-124.

56. Hodges R.S., 1996. De novo design of a-helical proteins: basic research to medical applications. Biochem. Cell Biol., 74: 133-154.

57. Hoppe H.J. & Reid K.B., 1994. Trimeric C-type lectin domains in host defence. Structure, 2: 1129-1133.

58. Hu J.C., O'Shea E.K., Kim P.S., Sauer R.T., 1990. Sequence requirements for coiled-coils: analysis with lambda repressor-GCN4 leucine zipper fusions. Science, 250(4986): 1400-3.

59. Junius F.K., Mackay J.P., Bubb W.A., Jensen S.A., Weiss A.S., King G.F., 1995. Nuclear magnetic resonance characterization of the Jun leucine zipper domain: unusual properties of coiled-coil interfacial polar residues. Biochemistry. 34(18):6164-74.

60. Kajava A.V., 1996. Modeling of a five-stranded coiled coil structure for the assembly domain of the cartilage oligomeric matrix protein. Proteins, 24:218-226.

61. Knappenberger J.A., Smith J.E., Thorpe S.H., Zitzewits J.A. & Matthews C.R., 2002. A buried polar residue in the hydrophobic interface of the coiled-coil peptide, GCN4-pl, plays a thermodynamic, not a kinetic role in folding. J. Mol. Biol., 321: 1-6.

62. Karin M., Liu Z., Zandi E., 1997. AP-1 function and regulation. Curr Opin Cell Biol., 9(2):240-6.

63. Kohn W.D., Kay C.M., Hodges R.S., 1995. Protein destabilization by electrostatic repulsions in the two-stranded alpha-helical coiled-coil/leucine zipper. Protein Sci. 4(2):237-50.

64. Kohn W.D., Kay C.M. and Hodges R.S., 1998. Orientation, positional, additivity, and oligomerization-state effects of interhelical ion pairs in a-helical coiled coils. J. Mol. Biol., 283: 993-1012.

65. Kostelny S.A., Cole M.S., Tso J.Y., 1992. Formation of a bispecific antibody by the use of leucine zippers. J Immunol., 148(5):1547-53.

66. Krylov D., Mikhailenko I., Vinson C., 1994. A thermodynamic scale for leucine zipper stability and dimerization specificity: e and g interhelical interactions. EMBOJ., 13(12):2849-61.

67. Malashkevich V.N., Kammerer R.A., Efimov V.P., Schultness Т., Engel J., 1996. The crystal structure of a five-stranded coiled coil in COMP: a prototype ion chanel? Science 274:761-765.

68. McLachlan & Karn, 1983. Periodic features in the amino acid sequence of nematode myosin rod. J Mol Biol., 164(4):605-26.

69. McWhirter J.R., Galasso D.L. & Wang J.Y.J., 1993. A coiled coil oligomerization domain of Bcr is essential for the transforming function of Bcr-Abl oncoproteins. Mol. Cell. Biol., 13: 7587-7595

70. Moitra J., Mason M.M., Olive M., Krylov D., Gavrilova O., Marcus-Samuels В., Feigenbaum L., Lee E., Aoyama Т., Eckhaus M., Reitman M.L., Vinson C., 1998. Life without white fat: a transgenic mouse. Genes Dev., 12(20):3168-81.

71. Monera O.D., Zhou N.E., Kay C.M., Hodges R.S., 1993. Comparison of antiparallel and parallel two-stranded alpha-helical coiled-coils. Design, synthesis, and characterization. J Biol Chem., 268(26): 19218-27.

72. Monera O.D., Kay C.M., Hodges R.S., 1994. Electrostatic interactions control the parallel and antiparallel orientation of alpha-helical chains in two-stranded alpha-helical coiled-coils. Biochemistry, 33(13):3862-71.

73. Monera O. D., Zhou N. E., Lavigne P., Kay С. M., and Hodges R., 1996a. Formation of parallel and antiparallel coiled-coils controlled by the relative positions of alanine residues in the hydrophobic core. J. Biol. Chem., 271: 3995-4001.

74. Monera O.D., Sonnichsen F.D., Hicks L., Kay C.M., Hodges R.S., 1996b. The ^ relative positions of alanine residues in the hydrophobic core control theformation of two-stranded or four-stranded alpha-helical coiled-coils. Protein Eng., 9(4):353-63.

75. Morgelin M., Heinegaed D., Engel J., and Paulsson M., 1992. Electron microscopy of native oligomeric matrix protein purified prom the swarm rat chondrosarcoma reveals a five-armed strucrture. J. Biol. Chem., 267:6137-6141.

76. Morris A.E., Remmele R.L.Jr., Klinke R., Macduff B.M., Fanslow W.C., Armitage R.J., 1999. Incorporation of an isoleucine zipper motif enhances the biological activity of soluble CD40L (CD154). J Biol Chem., 274(l):418-23;

77. Muller G., Michel A., & Altenburg E., 1998. COMP (cartilage oligomeric matrix protein) is synthesized- in ligament, tendon, meniscus, and articular cartilage. Connect Tissue Res., 39: 233-344.

78. Myszka D.G. and Chaiken I.M., 1994. Design and characterization of an intramolecular antiparallel coiled coil peptide. Biochemistry, 33: 2368-2372.

79. Nautiyal S., Woolfson D.N., King D.S., & Aiber Т., 1995. A designed heterotrimeric coiled coil. Biochemistry, 34: 11645-11651.

80. Oakley M.G., Kim P.S., 1998. A buried polar interaction can direct the relative orientation of helices in a coiled coil. Biochemistry. 37(36):12603-10.

81. Ogihara N.L., Ghirlanda G., Bryson J.W., Gingery M., DeGrado W.F., Eis.enberg D., 2001. Design of three-dimensional domain-swapped dimers and fibrous oligomers. Proc Natl Acad Sci.,98(4): 1404-9.

82. Oldberg A., Antonsson P., Lindblom K., and Heinegard D., 1992. COMP (Cartilage oligomeric matrix protein) is structurally related to the thrombospondins. J. Biol. Chem., 267: 22346-22350.

83. O'Shea E.K., Rutkowski R., Stafford W.F. & Kim P.S., 1989. Preferential heterodimer formation by isolated leucine zippers from fos and jun. Science, 245(4918) .646-8.

84. O'Shea E.K., Klemm J.D., Kim P.S & Alber Т., 1991. X-ray structure of the GCN4 leucine zipper, a two-stranded, parallel coiled coil. Science, 254:539-544.

85. O'Shea E.K., Rutkowski R., Kim P.S., 1992. Mechanism of specificity in the Fos-Jun oncoprotein heterodimer. Cell, 68(4):699-708.

86. O'Shea E.K., Lumb K.J., Kim P.S., 1993. Peptide 'Velcro': Design of a heterodimeric coiled coil. Curr Biol., 3(10):658-67.

87. Ozbek S., Engel J., and Stetefeld J., 2002. Storage function of cartilage oligomeric matrix protein: the crystal structure of the coiled-coil domain in complex with vitamin D3. The EMBO Journal, 21: 5960-5968.

88. Pack P. & Pluckthum A., 1992. Miniantibodies use of amphipatic helices to produce functional, flexibility linked dimeric Fv fragments with high avidity in. Escherichia coli. Biochemistry 31: 1579-1584.

89. Pack P., Muller K., Zahn R. & Pluckthum A., 1995. Tetravalent miniantibodies with high avidity assembling in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 246: 28-34.

90. Pandya M.J., Spooner G.M., Sunde M., Thorpe J.R., Rodger A., Woolfson D.N., 2000. Sticky-end assembly of a designed peptide fiber provides insight into protein fibrillogenesis. Biochemistry. 39(30):8728-34.

91. Pauling L. & Corey R.B., 1953. Compound helical configurations of polypeptide chains: structure of proteins of the alpha-keratin type. Nature, 171(4341):59-61.

92. Pelletier J.N., Campbell-Valois F.X., Michnick S.W., 1998. Oligomerization domain-directed reassembly of active dihydrofolate reductase from rationally designed fragments. Proc Natl Acad Sci, 95(21): 12141-6.

93. Petka W.A., Harden J.L., McGrath K.P., Wirtz D., Tirrell D.A., 1998. Reversible hydrogels from self-assembling artificial proteins. Science. 281(5375):389-92.

94. Phillips G.N. Jr., Fillers J.P., Cohen C., 1986. Tropomyosin crystal structure and muscle regulation. J Mol Biol.,192(1):! 11-31.

95. Popov V.I., Nikonov A.A., Agafonova N.K., Fesenko E.E., 1994.Surface ultrastructure of olfactory receptor sense hairs in the silkmoth, Antheraea pernyi. J. Microscopy (Oxford), 174(1): 39-46.

96. Potekhin S.A., Medvedkin V.N., Kashparov I.A. & Venyaminov S.Yu. 1994. Synthesis and properties of the peptide corresponding to the mutant form ofthe leucine zipper of the transcriptional activator GCN4 from yeast. Protein Eng. 7: 1097-1101.

97. Privalov P.L. & Potekhin S.A., 1986. Scanning microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins. Methods in Enzymology, 131:1-51.

98. Provencher S.W., Glockner J., 1981. Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism. Biochemistry, 20(l):33-7.

99. Qabar A., Derick L., Lawler J., and Dixit V., 1995. Trombospondin 3 is a pentameric molecule held together by interchain disulfide linkage involving two cysteine residues. J. Biol. Chem., 270: 12725-12729.

100. Ryadnov M.G., Woolfson D.N., 2003. Engineering the morphology of a self-assembling protein fibre. Nat Mater., 2(5):329-32.

101. Sanchez-Ruiz J.M., Lopez-Lacomba J.L., Cortijo M., Mateo P.L., 1988. Differential scanning calorimetry of the irreversible thermal denaturation of thermolysin. Biochemistry. 27(5): 1648-52.

102. Schaffher W., Weissmann C., 1973. A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution. Anal Biochem., 56(2):502-14.

103. Schlunegger M.P., Bennett M.J., Eisenberg D., 1997. Oligomer formation by 3D domain swapping: a model for protein assembly and misassembly. Adv Protein Chem., 50:61-122.

104. Schuermann M., Hunter J.B., Hennig G., Muller R., 1991. Non-leucine residues in the leucine repeats of Fos and Jun contribute to the stability and determine the specificity of dimerization. Nucleic Acids Res., 19(4):739-46.

105. Senin A.A., Potekhin S.A., Tiktopulo E.I. & Filimonov V.V., 2000. Differential scanning microcalorimeter SCAL-1.,/. Therm. Anal. Cal., 62:153-160.

106. Seo J. & Cohen C., 1993. Pitch diversity in alpha-helical coiled coils. Proteins, 15:223-234.

107. Shen Z., Heinegard D., & Sommarin Y., 1995. Distribution and expression of cartilage oligomeric matrix protein and bone sialoprotein show marked changes during femoral head development. Matrix Biol., 14:773-781.

108. Smith R.K., W., Zunino L., Webbon P.M., & Heinegard D., 1997. The distribution of cartilage oligomeric matrix protein (COMP) in tendom and its variation with tendon site, age and load. Matrix Biol., 16: 255-271.

109. Sorger P.K. & Nelson C.M., 1989. Trimerization of a yeast transcriptional activator via a coiled coil motif. Cell, 59: 807-813.

110. Spek E.J., Bui A.H., Lu M., Kallenbach N.R., 1998. Surface salt bridges stabilize the GCN4 leucine zipper. Protein Sci. 7(ll):2431-7.

111. Steinmetz M.O., Stoffler D., Hoenger A., Bremer A., Aebi U., 1997. Actin: from cell biology to atomic detail .J Struct Biol., 119(3):295-320.

112. Stetefeld J., Jenny M., Schulthess Т., Landwehr R., Engel J., & Kammerer R.A., 2000. Crystal structure of a naturally occurring parallel right-handed coiled coil tetramer. Nature Structural Biology, 7: 772-776.

113. Su J.Y., Hodges R.S., Kay C.M., 1994. Effect of chain length on the formation and stability of synthetic alpha-helical coiled coils. Biochemistry, 33(51): 15501-10.

114. Suzuki K., Doi Т., Imanishi Т., Kodama Т., Tanaka Т., 1997. The conformation of the alpha-helical coiled coil domain of macrophage scavenger receptor is pH dependent. Biochemistry. 36(49): 15140-6.

115. Suzuki K., Yamada Т., Tanaka Т., 1999. Role of the buried glutamate in the alpha-helical coiled coil domain of the macrophage scavenger receptor. Biochemistry. 38(6): 1751-6.

116. Taylor K.L., Cheng N., Williams R.W., Steven A.C., Wickner R.B., 1999. Prion domain initiation of amyloid formation in vitro from native Ure2p. Science, 283(5406): 1339-43.

117. Terskikh A.V., Le Doussal J-M., Crameri R.,. Fisch I., Mach J-P., Kajava A.V., 19976. "Peptabody": a new type of high avidity binding protein. Proc. Natl. Acad. Sci., 94: 1663-1664.

118. Timchenko A.A., Griko N.B., Serdyuk I.N., 1990. Resolution power of regularization algorithm for linary systems in dynamic light scattering. Biopolymers, 29:303-309.

119. Valentine R.C., Shapiro B.M., Stadtman E.R., 1968. Regulation of glutamine synthetase. ХП. Electron microscopy of the enzyme from Escherichia coli. Biochemistry, 7(6):2143-52.

120. Vasiliev V.D., Koteliansky V.E., 1979. Freeze-drying and high-resolution shadowing in electron microscopy of Escherichia coli ribosomes. Methods Enzymol. 59:612-29.

121. Vinson C.R., Hai Т., Boyd S.M., 1993. Dimerization specificity of the leucine zipper-containing bZIP motif on DNA binding: prediction and rational design. Genes Dev., 7(6): 1047-58.

122. Wang C., Stewart R.J., Kopecek J., 1999. Hybrid hydrogels assembled from synthetic polymers and coiled coil protein domains. Nature 397, 417-420.

123. Weissenhorn W., Dessen A., Harrison S.C., Skehel J.J., Wiley D.C., 1997. Atomic structure of the ectodomain from HIV-l gp41. Nature. 387(6631):426-30.

124. Weissenhorn W., Carfi A., Lee K.H., Skehel J.J., Wiley D.C., 1998. Crystal structure of the Ebola virus membrane fusion subunit, GP2, from the envelope glycoprotein ectodomain. Mol Cell, 2(5):605-16.

125. Wendt H., Leder L., Harma H., Jelesarov I., Baici A., Bosshard H.R., 1997. Very rapid, ionic strength-dependent association and folding of a heterodimeric leucine zipper. Biochemistry. 36(1):204-13.1. Tf

126. Williams R.W., 1994. Experimental determination of membrane protein secondary structure using vibrational and CD spectroscopies. In Membrane protein Structure, Experimental Approaches (White, S.H., Ed), pp.181-205, Oxford University Press, N.Y.

127. Wilson H.R., 1963. The molecular arrangement in alpha-keratin. J. Mol. Biol., 6:474-82.

128. Wolf P., 1983. A critical reappraisal of Wadell's technigue for ultraviolet spectrophotometric protein estimation. Anal. Biochem. 129:145-155.

129. Woolfson D.N., Alber Т., 1995. Predicting oligomerization states of coiled coils. Protein Sci., 4(8): 1596-607.

130. Ф Wu Z., Eaton S.F., Laue T.M., Johnson K.W., Sana T.R., Ciardelli T.L., 1994.

131. Coiled-coil molecular recognition: directed solution assembly of receptor ectodomains. Protein Eng. 7(9): 1137-44.

132. Wu Z., Johnson K.W., Goldstein В., Choi Y., Eaton S.F., Laue T.M. & Ciardelli T.L., 1995. Solution assembly of a soluble, heteromeric, high affinity interleukin-2 receptor complex. J. Biol Chem. 270: 16039-16044.

133. Yeates Т.О., Padilla J.E., 2002. Designing supramolecular protein assemblies. CurrOpin Struct Biol., 12(4):464-70.

134. Yiphantis D.A., 1964. Equilibrium ultracentrifugation of dilute solutions. Biochemistry, 47:297-317.

135. Zeng X., Zhu H., Lashuel H. A., and Hu J. C., 1997. Oligomerization properties of GCN4 leucine zipper e and g position mutants. Protein Science, 6: 2218-2226.

136. Zhou N.E., Zhu B.Y., Kay C.M., Hodges R.S., 1992a. The two-stranded alpha-helical coiled-coil is an ideal model for studying protein stability and subunit interactions. Biopolymers, 32(4):419-26.

137. Zhou N.E., Kay C.M., Hodges R.S., 1992b. Synthetic model proteins. Positional effects of interchain hydrophobic interactions on stability of two-stranded alpha-helical coiled-coils. J Biol Chem., 267(4):2664-70.tl

138. Zhou N.E., Kay C.M., Hodges R.S., 1994. The role of interhelical ionic interactions in controlling protein folding and stability. De novo designed synthetic two-stranded alpha-helical coiled-coils. J Mol Biol., 237(4):500-12.

139. Zitzewitz J.A., Bilsel O., Luo J., Jones B.E., Matthews C.R., 1995. Probing the folding mechanism of a leucine zipper peptide by stopped-flow circular dichroism spectroscopy. Biochemistry, 34(39): 12812-9.fill