Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование фибриллогенеза коллагена типа I in vitro

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование фибриллогенеза коллагена типа I in vitro"

На правах рукописи

НИКОЛАЕВА Тамара Ивановна

ИССЛЕДОВАНИЕ ФИБРИЛЛОГЕНЕЗА КОЛЛАГЕНА ТИПА I IN VITRO

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ПУЩИНО - 2004

Работа выполнена в Институте Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН, г Пущино

Научный руководитель: кандидат физико-математических наук

Рочев Юрий Алексеевич

Научный консультант: доктор физико-математических наук

Хечинашвили Николай Николаевич

Официальные оппоненты: кандидат физико-математических наук

Тиктопуло Елизавета Игнатьевна

на заседании Диссертационного Совета Д 002 093 01 в Институте Теоретической и Эксперимент альной Биофизики РАН по адресу 142290 г Пущино Московской обл , ул Институтская, 3

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу 142290 г Пущино Московской обл , ул Институтская, 3, ИТЭБ РАН

Автореферат разослан " В" " марта 2004 г Ученый секретарь Диссертационного Совета

доктор биологических наук, профессор Подлубная Зоя Александровна

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии РАН

Защита диссертации состоится

кандидат физико-математических наук

2006-4 '¿\%U5f-ТШГ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Фибриллогенез коллагена in vivo представляет собой сложный, многоэтапный процесс Сначала синтезируется предшественник коллагена - проколлаген После отщепления ферментами пропептидов проколлаген превращается в коллаген и секретируется из клеток Самосборка молекул коллагена в фибриллы происходит на поверхности клеток Коллагеновые фибриллы собираются в волокна во внеклеточном пространстве

Коллаген является основным структурным элементом внеклеточного матрикса В настоящее время известно 26 генетически различных типов коллагена Коллаген типа I входит в состав фибрилл и волокон большинства соединительных тканей Нарушения в упаковке молекул коллагена типа I приводят к таким заболеваниям соединительных тканей, как остеопороз, сколиоз, синдром Элерса-Данлоса, синдром Марфана и др Повышенная растяжимость кожи при синдроме Элерса-Данлоса коррелирует с увеличением диаметра фибрилл, что является следствием пониженного синтеза молекул коллагена типа III и протеогликанов, регулирующих упаковку и размеры коллагеновых волокон При мышечной дистрофии степень упорядоченности коллагеновых фибрилл и волокон снижена в два раза по сравнению с нормой

Упорядоченная структура коллагеновых фибрилл типа I формируется в процессе эмбриогенеза на начальных стадиях морфогенеза В процессе тканеобразования клетки передвигаются вдоль коллагеновых фибрилл Коллагеновые фибриллы типа I интенсивно образуются после ожогов и при заживлении ран.

Для фибрилл коллагена типа I установлена высокая степень упорядоченности в продольном направлении и найдено, что характерная периодичность структуры фибрилл по их длине определяется линейным типом упаковки молекул До настоящего времени слабо изучена упаковка коллагеновых молекул в поперечном направлении фибрилл, а следовательно, не установлена структура фибрилл в трехмерном пространстве

Упаковка молекул коллагена в фибриллы m vivo определяется достаточно большим числом участвующих в этом процессе компонентов, а также большим числом регулирующих факторов Поиск условий образования фибрилл, адекватных фибриллогенезу коллагена in vivo, проводится уже в течение ~ 50 лет Одним из подходов к изучению фибриллогенеза коллагена может быть создание систем фибриллогеиаза, .ць vitro в условиях близких к условиям m

ЮС Н A Ii И ./БАЛЬНАЯ БИЕ, Í >TFKA С.Петер6ург »06 PK

vivo Согласно литературным данным систем самосборки in vitro, параметры которых близки к параметрам in vivo, создано мало (Holmes, 2001, Christiansen, 2000) Выявление параметров образования фибрилл, определяющих функциональное состояние и упаковку фибрилл, позволит приблизиться к пониманию процесса фибриллогенеза in vivo.

Нахождение условий фибриллогенеза, влияющих на плотность упаковки фибрилл, дает возможность получать нативные коллагеновые фибриллы in vitro с регулируемыми свойствами При создании биоматериалов требуется высокая степень упорядоченности и стабильности коллагеновых фибрилл, чтобы в течение длительного времени сохранялась их устойчивость к действию протеолитических ферментов Образование коллагеновых фибрилл в комплексе с другими молекулами соединительных тканей представляет важную задачу биотехнологического направления

Цель и задачи исследования. Фибриллогенез коллагена сложно исследовать, так как нативная структура фибрилл формируется при физиологических температурах, близких к температуре денатурации молекул In vitro определен ряд параметров самосборки коллагеновых молекул и найдено небольшое число макромолекул внеклеточного матрикса, влияющих на фибриллогенез коллагена Однако размеры фибрилл in vitro значительно превышают размеры фибрилл in vivo, что вызвано более низкой плотностью упаковки молекул по сравнению с упаковкой молекул in vivo Целью данной работы является исследование фибриллогенеза коллагена типа I в условиях, приближенных к физиологическим условиям Для поиска параметров, характеризующих фибриллогенез коллагена in vitro, использованы принципы построения фазовой диаграммы Решались следующие задачи

1 Выяснить влияние температуры на кинетику образования коллагеновых фибрилл

2 Определить термодинамические характеристики коллагеновых фибрилл при разных значениях температуры и концентрации молекул

3 Установить вклад гликозаминогликанов в формирование термостабильных и устойчивых кпротеолизу фибрилл

4 Оценить возможности метода калориметрии для изучения структуры коллагеновых фибрилл, образованных in vitro.

Научное значение и новизна В работе

- показано влияние температуры образования фибрилл на кинетику и термодинамику процесса фибриллогенеза для коллагена с целыми и удаленными телопептидами,

- получены максимальные величины энтропии и энтальпии перехода фибрилл из нативного состояния в разупорядоченное для коллагена с целыми телопептидами при температуре 30°С;

- определено, что фибриллы, образованные при физиологической температуре, имеют более высокую степень кооперативности и более высокую плотность упаковки молекул по сравнению с фибриллами, образованными при более низких температурах;

- обнаружено, что температура и время образования комплексов коллагена с гликозаминогликанами влияет на формирование трехмерной структуры коллагенового геля,

- установлено, что метод калориметрии позволяет выявить параметры образования фибрилл, существенно влияющие на фибриллогенез коллагена in vitro

Практическая значимость работы. Полученные в данной работе результаты показывают, что варьированием температуры и концентрации коллагена можно регулировать упаковку молекул в фибриллах m vitro. Значения параметров, приближенные к физиологическим величинам, повышают плотность упаковки фибрилл Для образования упорядоченных фибрилл коллагена типа I существенны следующие факторы нативная и целостная структура молекул, нейтральные величины рН и низкой ионной силы буферного раствора, температура 35 - 37°С и концентрации коллагена >1 мг/мл Для повышения устойчивости фибрилл к действию протеаз целесообразно формировать комплексы коллагена с гликозаминогликанами Коллагеновые фибриллы могут быть использованы в качестве субстрата при культивировании клеток, при реконструкции аналога кожи in vitro, а также при получении биоматериалов для лечения ран и ожогов Метод калориметрии можно применять для анализа структурной упаковки коллагеновых фибрилл, создаваемых ш vitro

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на II и III всесоюзнных конференциях "Культивирование клеток животных и человека"

з

(Пущино, 1985, 1990), на рабочем совещании "Разработка новых биомедицинских методов лечения раневых поражений кожи " (Пущино, 1991), на II съезде биофизиков России (Москва, 1999), на конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" (Пущино, 2001), на III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), на научных конференциях и семинарах НЦБИ РАН и ИТЭБ РАН

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ.

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения и глав, включающих обзор литературы, описание материалов и методов, изложение результатов исследования и их обсуждения, а также заключения, выводов, списка печатных работ и списка цитированной литературы из 165 наименований. Диссертация изложена на 105 страницах, содержит 7 таблиц и 13 рисунков.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования В качестве источников получения коллагена типа I были взяты сухожилия хвостов крыс и кожа свиней Для образования комплексов коллагена с одним из компонентов внеклеточного матрикса использовали хондроитин-4-сульфат (Sigma)

Методы исследования. За процессом образования фибрилл следили по изменению мутности растворов коллагена в термостатируемых кварцевых кюветах на спектрофотометре Specord (ГДР) на длине волны 400 нм Термодинамические характеристики коллагеновых молекул и сформированных коллагеновых фибрилл определяли с помощью метода сканирующей калориметрии на микрокалориметре ДАСМ-4 (НПО Биоприбор, Россия) Воспроизводимость базовой линии была не ниже, чем 310"*5 вт Скорость прогрева составляла 0,5 К/мин Точность записи температуры составляла i 0,1°С Сбор данных осуществляли автоматически на IBM-совместимом компьтере с шагом температуры 0,1-0,4 К при помощи программы SCAL (Институт белка РАН, Разгуляев) Калориметрические исследования комплексов коллагена с хондроитин-4-сульфатом проводили на калориметре ДСМ-2М (НПО Биоприбор, Россия) Скорость прогрева составляла 2 К/мин , а точность записи температуры составляла ± 1°С Для исследования трехмерной

структуры комплексов коллагена с хондроитин-4-сульфатом использовали метод сканирующей электронной микроскопии Формирование периодической структуры фибрилл комплекса коллагена с хондроитин-4-сульфатом было исследовано методом негативного контрастирования Образцы просматривали на микроскопах КМ-Ш (Япония) при электронно-оптических увеличениях от 3 до 5 тыс. и 1ЕМ-100В (Япония) при электронно-оптических увеличениях от 15 до ВО тыс Разрушение комплексов под действием коллагеназы исследовали методом поляризационно-оптической микроскопии Для проведения измерений использовали термомикроскоп типа ВОЕТЗШ РНМК-05 (ГДР) Формирование коллагеновых фибрилл Получение нашивных коллагеновых молекул из тканей.

Выделение и очистку коллагена из разных тканей выполняли по методикам (СЬапг1гакаяап е1 а1, 1976, Ое1тап е1 а!., 1979), модифицированных в наших работах (Гаврилюк и др , 1988, Николаева и др, 2001) Коллаген из кожи свиньи был получен после предварительной обработки ткани раствором 2% №ОН в 2,8% N8504 Экстракцию проводили 0,5 М раствором уксусной кислоты, двухкратную очистку - этанолом Коллаген из сухожилий хвостов белых крыс был получен прямой экстракцией 0,5 М раствором уксусной кислоты Была проведена двухкратная очистка №С1 и однократная очистка этанолом Молекулы коллагена находились в растворе 0,1М уксусной кислоты Все процедуры выполняли при Т=4-б°С

Коллаген без концевых телопептидов получали из хвостов крыс после действия пепсина при Т=25°С при соотношении фермент субстрат, равным 1 10 2. Определение физико-химических свойств коллагеновых молекул. Гомогенность коллагеновых молекул после выделения и очистки, а также наличие коллагенов разного типа были проверены методом электрофореза в полиакриламидном геле Электрофоретическим анализом было установлено, что молекулы коллагена из сухожилий хвостов крыс в растворе 0,1М уксусной кислоты содержали 70 % мономеров, 26 % димеров и 4 % тримеров После действия пепсина содержание мономерных молекул коллагена увеличивается до 89 % Для образцов из кожи свиней кроме основного коллагена типа I установлено наличие коллагена типа III.

Нативность коллагеновых молекул и фибрилл была исследована по спектрам поглощения в инфракрасной области на спектрометре Ш-20 (Ьагагеу й а1, 1978) Показано, что ИК-спектры пленок, приготовленные из 0,1М

уксуснокислых растворов коллагена концентрации 2 мг/мл, дают следующие значения полоса амид А, которая соответствует валентным колебаниям пептидных N11-групп, для коллагена типа I из сухожилий хвостов крыс имеет пик при 3331см"1, из кожи свиньи при 3330 см"1 Полоса амид I, которая соответствует валентным колебаниям пептидных СО-групп, имеет основной пик для коллагена типа I из сухожилий хвостов крыс при 1663 см"1, из кожи свиньи при 1660 см'1 Форма полос поглощения, их интенсивности характерны для конформации тройной спирали.

Концентрацию коллагена определяли по сухому весу белка высушиванием при 105°С под вакуумом (Кирке е1 а1, 1978) и модифицированному методу Лоури (БЬБсЬеск, 1990).

Целостность концевых телопептидов после действия пепсина была определена по спектрам поглощения в ультрафиолетовой области на спектрофотометре Яресогс! ГМа, 1988) Коллаген типа I из сухожилий хвостов крыс был исследован на наличие тирозина, который содержится лишь в концевых глобулярных телопептидах На УФ-спектрах поглощения молекул коллагена с целыми телопептидами концентрации 20 мг/мл в растворе 6 М Ои-НС1, 0,03 М Ка2НРС\ рН 6,5 тирозину соответствует основной пик при 276 нм и дополнительный пик при 282 нм Действие пепсина на коллаген типа I в течение 12 час при Т=25°С приводит к снижению интенсивности пика при 276 нм Добавление такого же количества пепсина и инкубирование в течение следующих 12 час вызывает дальнейшее понижение интенсивности пика при 276 нм, однако полностью ею не устраняет, что указывает на неполное удаление телопептидов Термодинамические характеристики коллагеновых молекул (концентрация 1 мг/мл) из разных тканей были рассчитаны из калориметрических кривых Температура денатурации молекул коллагена из сухожилий хвостов крыс Тш= 41.3°С и из кожи свиньи Тт= 40,6°С. Величина полуширины перехода из нативного состояния в разупорядоченное для коллагена из кожи свиньи ДТ=2,5°С, тогда как для коллагена из сухожилий хвостов крыс ДТ ~1,7°С, что указывает на более кооперативную структуру коллагеновых молекул сухожилий Действие пепсина на коллагеновые молекулы типа I хвостов крыс почти не изменяет их термодинамические величины

Таким образом, при изучении физико-химических свойств молекул коллагена из разных источников было показано, что молекулы в растворе 0,1 М

уксусной кислоты сохраняли нативную структуру и состояли преимущественно из мономеров

З.Оптимизация начальных условий фибриллогенеза коллагена: Выбор условий формирования нативных коллагеновых фибрилл.

Реконструкцию фибрилл обычно проводят из коллагеновых молекул, выделенных из соединительных тканей с помощью слабых органических кислот при рН 2,0-3,5 Образование нативных фибрилл из растворимого коллагена требует не только более высоких значений рН, но и получения гомогенных образцов коллагена В данной работе использовали коллаген кожи свиньи. Повышение рН 0,1 М уксуснокислого раствора коллагена от 2,8 до 7,2 проводили двумя методами 1) перемешиванием равных объемов исходного раствора коллагена с фосфатно-буферным раствором удвоенной концентрации ионов 0,04 М Ка2НР04, 0,30 М ЫаС1 рН доводили до 7,2 раствором 1М ЫаОН 2) диализом раствора коллагена против фосфатно-буферного раствора 0,02 М Ыа2НР04, 0,15 М ЫаС1, рН 7,2 Эти процедуры проводили при Т>4°С Затем термостатировали образцы при Т=37°С в течение 1 час

Методом РЖ-спектроскопии установлено, что коллагеновые молекулы в фибриллах после термостатирования не были денатурированы Калориметрическими исследованиями показано повышение термостабильности фибрилл в зависимости от рН Для молекул коллагена в растворе при рН 2,8 характерна симметричная кривая теплопоглощения с Тт = 40,8°С Для фибриллярного коллагена характерна асимметричная форма кривой плавления, которая соответствует упорядоченной упаковке молекул коллагена от Ы- к С-концу Образование фибрилл по первому методу изменения рН от 2,8 до 7.2 приводит к увеличению Тт на 9,0°С Повышение рН от 2,8 до 7,2 по второму методу увеличивает термостабильность коллагеновых фибрилл на 11,2°С Следовательно, последовательное создание гомогенной структуры коллагена методами диализа при низкой температуре и термостатирования образцов при физиологической температуре, приводит к образованию фибрилл с более высокой термостабильностью Такой метод наиболее приемлем для формирования фибрилл из коллагеновых молекул высоких концентраций (Николаева и др, 1995)

Выбор кинетического режима для самосборки молекул при температуре 4°С с изменением температуры до 25°С, 30°С, 35°С.

Нативную структуру фибрилл из коллагеновых молекул более низких концентраций (~1 мг/мл) формировали последовательно после термостатирования образцов при Т=4°С в течение 2 час , 8 час , одной недели, а затем температуру повышали до 25°С, 30°С, 35°С Использовали коллаген сухожилий хвостов крыс Образцы получали быстрым перемешиванием равных объемов раствора коллагена в 0,1М уксусной кислоте рН 2,8 с фосфатно-буферным раствором удвоенной концентрации ионов Если образцы термостатировать 1 час при соответствующих значениях температуры, фибриллогенез протекает быстрее для коллагена после продолжительной инкубации (одна неделя) Скорость образования фибрилл увеличивается по сравнению с фибриллами, образованными после инкубации в течение 2 час (в полтора раза при Т=35°С) Снижается обратимость на 8-10% после охлаждения образцов и повторного термостатирования, что указывает на изменение системы межмолекулярных связей в фибриллах Для фибрилл, образованных при Т=35°С, был выявлен основной пик перехода при Тт = 47,8°С и дополнительный пик перехода при Тт = 50, ГС Для фибрилл, образованных после инкубации в течение 2 час и 8 час, калориметрические кривые показывают один пик теплопоглощения с совпадающими параметрами перехода

Выбор начальных условий образования комплексов коллагена с макромолекулами внеклеточного матрикса.

Для создания комплексов коллагена с макромолекулами внеклеточного матрикса был использован хондроитин-4-сульфат, который относится к классу гликозаминогликанов Образование комплексов проводили при смешивании раствора коллагена в 0,1 М уксусной кислоте концентрации 2 мг/мл рН 2,8 с водным раствором хондроитин-4-сульфата концентрации 0,2-0,5 мг/мл рН 6,0 Для варьирования рН и ионной силы применяли 1М ЫаОН

На первом этапе образование комплексов проводили при рН 4,5 и 6,0, ионной силе 0, 125 М, 0,25 М и температуре 4°С Установлено, что величина ионной силы 0, 125 М более оптимальна по сравнению с величиной ионной силы 0, 25 М, так как термостабильность и степень кооперативное™ комплексов возрастают с понижением ионной силы Снижение рН от 6,0 до 4,5 не изменяет термостабильности комплексов Термостабильность комплексов была выше при соотношении коллаген хондроитин-4-сульфат, равном 80 20%, а не 90 10%

4. Поиск условий образования фибрилл: выбор фиксированных и варьируемых параметров. Формирование системы фибриллогенеза коллагена типа I последовательно, по этапам ее усложнения.

In vitro молекулы коллагена легко собираются в фибриллы большой длины и этим процессом можно управлять Основными параметрами самосборки коллагена являются рН, состав ионов, ионная сила, температура буферного раствора и концентрация молекул Для исследования процесса фибриллогенеза был использован коллаген из сухожилий хвостов крыс, содержащий молекулы типа I Образцы получали быстрым перемешиванием равных объемов раствора коллагена в 0,1М уксусной кислоте рН 2,8 с фосфатно-буферным раствором удвоенной концентрации ионов 0,04 М Na2HP04, 0,30 М NaCl рН доводили до значения 7,2 при добавлении 1М NaOH Условия образования фибрилл создавали при Т=4°С, а затем температуру повышали до Т= 25°С, 30°С, 35°С

4.1. Использовали молекулы коллагена сухожилий хвостов крыс без телопептидов Фиксированные параметры рН - 7,2 ионная сила - 0,17 М, концентрация молекул - 0,8 мг/мл, время фибриллогенеза - 1 час Варьируемый параметр - температура Т= 25°С, 30°С, 35°С Был выбран режим быстрого повышения температуры от 4°С до 25°С, 30°С, 35°С После термостатирования образцов в течение 1 час. при фиксированной температуре были определены термодинамические характеристики перехода фибрилл из нативного состояния в разупорядоченное температура перехода (Тга), полуширина перехода (AT), энтальпия перехода (АН) и энтропия перехода (AS) Величины энтальпии перехода АН определяли по площади под калориметрическими кривыми Температуру перехода Tm определяли на максимуме пика перехода Рассматривая переход коллагеновых молекул из нативного состояния в разупорядоченное как фазовый переход первого рода и считая, что в точке перехода свободная энергия AG = АН - Tm AS = 0, величины энтропии перехода вычисляли по формуле AS = AH/Tm (Lumry et al, 1966) По данным авторов работ (Engel, 1962, Pnvalov et al, 1971) разделение а-цепей происходит на последней стадии плавления Поэтому в первом приближении денатурационный переход коллагеновых молекул может быть отнесен к равновесному (Pnvalov, 1982)

4.2. Использовали молекулы коллагена сухожилий хвостов крыс с целыми телопептидами Фиксированные параметры рН - 12, ионная сила - 0,17 М,

время фибриллогенеза - 1 час Варьируемые параметры Т= 25°С, 30°С, 35°С и концентрация молекул 0,3 мг/мл, 0,6 мг/мл, 1,2 мг/мл Был выбран режим быстрого повышения температуры от 4°С до 25°С, 30°С, 35°С 4.3. Использовали молекулы коллагена сухожилий хвостов крыс и хондроитин-4-сульфата Фиксированные параметры рН - 7,0, ионная сила -

0, 125 М; концентрация коллагена 1 мг/мл, концентрация хондроитин-4-сульфата 0,25 мг/мл Варьируемые параметры температура и время образования комплексов Был выбран разный кинетический режим повышения температуры от 4°С до 20°С и 37°С Были проверены три метода создания комплексов в зависимости от температуры исходных растворов компонентов и конечной температуры коллагеновых структур В контроле образование комплексов проводили при Т=4°С после смешивания исходных растворов коллагена и хондроитин-4-сульфата величину рН, равную 4,5, повышали до 7,0 Первый метод после смешивания исходных растворов образцы инкубировали в течение 2 час Затем рН повышали до 7,0, а температуру до 37°С Второй метод образование комплексов проводили при Т=20°С Третий метод образование комплексов проводили при одновременном смешивании растворов коллагена и хондроитин-4-сульфата при Т=20°С и быстром повышении рН до 7,0, а температуры до 37°С После образования комплексов проводили стабилизацию коллагеновых структур в течение 24 час при разных температурных режимах К комплексам при Т=37°С добавляли коллагеназу (Sigma) в фосфатном буфере, рН 7,2, содержащем 5 мМ СаСЬ Специфическая активность коллагеназы составляла 100 единиц на 1 мг коллагена

Статистическую обработку данных проводили при помощи программы SigmaPlot 2 01 Приведенные величины представляли среднее из 5 независимых измерений Различия считали статистически достоверными при Р<0,05

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние температуры на фибриллогенез коллагена с удаленными телопептидами

Кривые изменения мутности растворов коллагена, изображенные на рис 1, отражают определенный этап фибриллогенеза 1) лаг-фаза - инициацию самосборки молекул и образование микрофибрилл, 2) рост-фаза - рост фибрилл в продольном и поперечном направлении, 3) фаза насыщения - стабилизацию фибрилл Кинетику фибриллогенеза исследовали по изменению параметров tiag

- время лаг-фазы, Ь/г - время образования полумаксимальной мутности раствора коллагена

Время (мин )

Рис. 1. Температурные зависимости кинетики образования фибрилл, сформированных в 0,02 М Na2HP04, 0,15 М NaCt, рН 7 2 из молекул коллагена без телопептидов при следующих значениях температуры 1 - 25°С; 2 - 30°С, 3 - 35"С

Продолжительность лаг-фазы с повышением температуры до 30°С и 35°С снижена соответственно в пять раз и восемь раз по сравнению с продолжительностью лаг-фазы при Т=25°С. Образованию коллагеновых фибрилл при Т=35°С соответствует tiag = 5 мин За время Ь/г образуется гель во всем объеме При Т=35°С значительно возрастает скорость фибриллогенеза параметр t* =8 мин., тогда как при Т=25°С параметр tA = 60 мин Время формирования стабильной стуктуры фибршщ, определенное по времени образования максимальной мутности раствора коллагена в фазе насыщения (параметр tp), также снижается tp=21 мин при Т=35°С, тогда как tp=92 мин при Т=25°С

Значения оптической плотности, которые коррелируют с диаметром фибрилл (McPherson et al, 1985), возрастают с понижением температуры образования фибрилл Из коллагеновых молекул, подвергнутых действию пепсина, формируются фибриллы большого диаметра Самосборка молекул происходит по объемному типу полимеризации Электронно-микроскопическими исследованиями была определена симметричная форма фибрилл, реконструированных из молекул коллагена после обработки пепсином при Т=25°С (Михайлов, 1971) При таких же условиях был получен коллаген в нашей работе По-видимому, полученные калориметрические кривые (рис 2) симметричной формы связаны с антипараллельным способом упаковки молекул Возможность антипараллельной упаковки молекул, обработанных пепсином, рассмотрена в работе (Capaldi, Chapman, 1982)

и

3D 40 SO 60 30 40 50 60

T(°C) T Co

Рис.2. Кривые избыточного теплопоглощения коллагеновых молекул без телопептидов в 0,1 М уксусной кислоте, рН 2,8 (А) - контроль и фибрилл, сформированных в 0, 02 М Na2HP04, 0,15 М NaCl, рН 7,2 под влиянием температуры (Б) 1-температура 25°С, 2-температура 30 °С, 3-температура 35 "С

В изучении природы связей и сил, стабилизирующих нативную структуру коллагеновых молекул, успешно используется метод калориметрии (Pnvalov, 1982, Бурджанадзе, Тиктопуло, 2001) С помощью калориметрии начато исследование механизмов стабилизации коллагеновых фибрилл m vivo (Miles, Ghelashvili 1999), а также образованных m vitro (Tiktopulo, Kayava, 1998) В данной работе увеличение температуры от 25°С до 35°С приводит к повышению термостабильности коллагена без телопептидов ~ на 4°С Увеличение температуры от 25°С до 35°С сдвигает максимум пика перехода на 0,4°С в низкотемпературную область Полуширина перехода фибрилл из нативного состояния в разупорядоченное AT позволяет оценивать степень кооперативности фибрилл При Т= 25°С, Т= 30°С, Т= 35°С величины AT = 1,7 К, AT = 1,8 К, AT = 1,9 К близки к величине AT = 1,7 К для молекул коллагена в водном растворе (таблица 1), что указывает на аналогичный характер кооперативных взаимодействий молекул в фибриллах

Таблица 1. Термодинамические характеристики коллагеновых фибрилл (коллаген без телопептидов)

Температура инкубации, "С Тт> к дг, к АН, Дж/г

Контроль (мономерный коллаген) 314,1 1,7 60,5

25 318,7 1,9 72,4

30 318,5 1,8 73,7

35 318,3 1,7 71,7

Калориметрическими исследованиями выявлена большая величина энтальпии перехода, что обусловлено разрывом большого числа слабых связей электростатических и водородных Водородные связи между полипептидными цепями внутри тройной спирали, между аминокислотными остатками и молекулами воды на поверхности белка вносят основной вклад в энтальпию коллагена (Privalov,1982) Известно также, что при образовании фибрилл преобладают электростатические взаимодействия (Kadler et al, 1996) Различие между величинами энтальпии для фибрилл, сформированных при разных значениях температуры, недостоверно (Р>0,05)

Анализ изучения фибримогенеза коллагена типа 1 без телопептидов показывает, что температурой регулируется кинетика, но не регулируется термодинамика процесса фибриллогенеза Образование фибрилл значительно ускоряется при физиологической температуре 35°С.

2. Влияние температуры и концентрации коллагеновых молекул с телопептидами на кинетику образования фибрилл.

Под влиянием температуры 35°С самосборка молекул коллагена происходит без лаг-фазы (рис 3) При Т=25°С и Т=30°С повышение концентрации коллагена снижает продолжительность лаг-фазы С увеличением температуры и концентрации коллагеновых молекул возрастает скорость образования фибрилл Т= 30°С повышает скорость образования фибрилл в четыре раза, а Т- 35°С - в восемь раз, если сравнивать с Т=25°С При Т= 35°С и концентрации 1,2 мг/мл параметр ty2 имеет минимальное значение и составляет две мин Время формирования коллагенового геля во всем объеме снижается с повышением температуры и концентрации молекул

В фазе насыщения образуются нативные фибриллы с D-периодической упаковкой молекул, как у фибрилл ш vivo (Williams et al, 1978) Время образования стабильной структуры фибрилл с увеличением температуры от 25°С до 35°С снижается в три раза.

Проведенными исследованиями установлено, что температурой и концентрацией коллагеновых молекул регулируется кинетика процесса фибриллогенеза in vitro. Известна корреляция между температурой, скоростью образования коллагеновых фибрилл и диаметром фибрилл Wood et al в 1960 г определили, что повышение температуры от 25°С до 37°С приводит к

увеличению скорости образования фибрилл фибрилл ~ в два раза

в 5-8 раз и к снижению диаметра

Рис. 3. Температурные зависимости кинетики образования коллагеновых фибрилл, сформированных в 0,02 М №2НР04, 0,15 М N40, рН 7,2 из молекул коллагена с телопептидами при различных значениях

температуры

1 - 25°С,

2 - 30°С,

3 -35°С

и концентрации А - 1,2 мг/мл, Б - 0,6 мг/мл, В - 0,3 мг/мл

16 20 30 40

Время (инн.)

В работе (Kadler et al, 1996) было показано, что при Т=20°С диаметр фибрилл равен 200 нм, а при Т= 34°С равен 20-70 нм По нашим данным при Т= 2 5°С фибриллы образуются с низкой скоростью и могут иметь большой диаметр Увеличение скорости образования фибрилл при Т=35°С приводит к снижению диаметра фибрилл Размеры диаметра ранее (Williams et al, 1978) связывали с плотностью упаковки молекул лишь в поперечном направлении фибрилл Коллагеновые молекулы в фибриллах при Т=34°С претерпевают два конформационных перехода в конце лаг-фазы, а также во время фазы насыщения (George et al, 1990) Изменение конформации связано с формированием суперспиральной структуры фибрилл и взаимной подгонкой молекул как в поперечном, так и в продольном направлении фибрилл Из этого следует, что при физиологической Т=35°С возможна более плотная упаковка фибрилл по сравнению с фибриллами, образованными при Т= 25°С и Т= 30°С.

3. Термодинамические характеристики фибрилл при разных значениях температуры и концентрации коллагеновых молекул.

Изменения в структуре фибрилл, образованных при варьировании температуры от 25°С до 35°С и концентрации молекул от 0,3 мг/мл до 1,2 мг/мл, анализировали по калориметрическим данным Для кривых теплопоглощения коллагеновых фибрилл характерны асимметричные пики (рис 4)

Рис. 4. Кривые избыточного теплопоглощения коллагеновых фибрилл, образованных в 0,02 М №2НР04> 0,15 М №С1, рН 7,2 при следующих значениях температуры

1- 25°С,

2- 30 °С,

3- 35°С и концентрации коллагена

А - 1,2 мг/мл, Б - 0,6 мг/мл, В - 0,3 мг/мл

т ГС )

С ростом температуры интенсивность пика перехода и острота пика возрастают, что указывает на увеличение степени кооперативности фибрилл Полуширина перехода возрастает в два раза при относительно низких концентрациях коллагена (0,3-0,6 мг/мл) и в полтора раза при относительно высокой концентрации коллагена (1,2 мг/мл), если сравнивать величины ДТ при Т=25°С и Т=35°С Термостабильность фибрилл снижается на 1,5°С при увеличении температуры от 25°С до 35°С Повышение концентрации от 0,3 мг/мл до 1,2 мг/мл не влияет на термостабильность фибрилл

Таблица 2. Термодинамические характеристики коллагеновых фибрилл

(коллаген с телопептидами)

Температура инкубации, °С Концентрация, мг/мл К ЛТ, к АН, Дж/г А8, кДж/г К ДЯ„ Дж/г

25 322,4 2,5 70,1 217,4 10,0

30 0,3 321,8 2,1 70,6 219,4 10,5

35 320,8 1,2* 68,2* 212,6* 8,1*

25 322,4 2,4 70,1 217,4 9,9

30 0,6 321,5 2,1 70,6 219,6 10,4

35 320,8 1,2* 68,0* 212,0* 7,8*

25 321,9 1,5 69,6 216,2 9,2

30 1,2 321,2 1,5 70,7 220,1 10,3

35 320,4 1,0* 66,1* 206,3* 5,7*

Мономерный 0,3-1,2 314,4 1,7 60,3

коллаген

* Различие между данными для фибрилл, образованных при Т= 35°С и Т= 25°С, 30°С, достоверно (Р<0,05)

Для фибрилл, сформированных при Т=ЗСРС, получены максимальные величины энтропии и энтальпии перехода (таблица 2) При увеличении температуры от 25°С до 30°С повышение энтропии обусловлено образованием разупорядоченной структуры фибрилл Однако, анализ данных таблицы 2 выявил недостоверное различие (Р>0,05) между термодинамическими величинами фибрилл, сформированных при Т=25°С и Т=30°С Увеличение температуры от 30°С до 35°С приводит к образованию упорядоченной структуры фибрилл, о чем свидетельствует снижение энтропии и энтальпии Повышение концентрации от 0,3 мг/мл до 0,6 мг/мл не изменяет термодинамических характеристик фибрилл При концентрации молекул 1,2 мг/мл энтропийный и энтальпийный выигрыш максимален Так как энтальпия перехода представлена положительной составляющей энтальпии

внутримолекулярных водородных связей и отрицательной составляющей энтальпии гидратации неполярных групп (Хечинашвили, 1990), снижение энтальпии при физиологической Т=35°С может быть обусловлено вкладом зависимой от температуры энтальпией гидратации неполярных групп

геле при разных значениях температуры и концентрации коллагена С повышением температуры от 25°С до 35°С увеличивается гибкость молекул и снижается расстояние между молекулами в поперечном направлении фибрилл При Т=35°С молекулы свободной воды () удаляются с поверхности коллагеновых молекул и образуются плотноупакованные гибкие фибриллы

Метод калориметрии позволяет определять не только общую энтальпию но и энтальпию, связанную с образованием фибрилл Зная энтальпию денатурации молекул коллагена, можно вычислить энтальпию образования фибрилл АНг СПИориЬ, Кауауа, 1998) По величине энтальпии возможна оценка относительного содержания нековалентных связей в макромолекулах Энтальпия образования фибрилл АН, позволяет оценить вклад образующихся межмолекулярных связей Поэтому можно предположить, что количество слабых межмолекулярных связей увеличивается с повышением температуры от 25°С до 30°С и уменьшается с повышением температуры от 30°С до 35°С При Т=35°С и концентрации 1,2 мг/мл величина ДН( минимальна В физиологических условиях рН, ионной силы и температуры упорядоченная структура фибрилл формируется за счет снижения количества слабых межмолекулярных связей и более плотной упаковки молекул в фибриллах

Фибриллогенез коллагена - кооперативный процесс Для изучения кооперативное™ определяли число и размеры структурных единиц в коллагеновых молекулах, формирующих единую кооперативную систему в фибриллах Число кооперативных участков в молекулах коллагена, и, которые плавятся независимо, вычисляется по формуле (Ьитгу е1 а1, 1966).

п =АН-М-А Т/4К-Т„ ,

где М - молекулярный вес коллагена, К - газовая постоянная, АН- теплота перехода из нативного состояния в разупорядоченное, рассчитанная на грамм белка, Тт - температура перехода из нативного состояния в разупорядоченное, ДГ- полуширина перехода из нативного состояния в разупорядоченное

Таблица 3. Кооперативность фибрилл при разных значениях температуры и концентрации молекул.

Температура инкубации, "С Концентрация, мг/мл Число кооперативных участков, п Число аминокислот в кооперативном участке

25 30 35 0,3 14 12 7* 225 270 450*

25 30 35 0,6 14 12 7* 225 270 450*

25 30 35 1,2 9 9 5* 360 360 630*

Мономерный коллаген 0,3-1,2 9 360

* Различие между данными для ( фибрилл, образованных при Т= 35°С и Т= 25°С, 30°С,

достоверно (Р<0,05)

Степень кооперативности зависит в сильной степени от условий, в которых происходит образование фибрилл Полученные данные свидетельствуют, что с повышением температуры и концентрации число кооперативных участков в фибриллах уменьшается, а их длина увеличивается Количество аминокислотных остатков, образующих кооперативный участок, изменяется от ~ 220 (75 трипептидов) при Т=25°С и концентрации 0,3 мг/мл до -630 (210 трипептидов) при Т= 35°С и концентрации 1,2 мг/мл Коллагеновые молекулы при Т=25°С состоят из 14 кооперативных участков, а при Т=30°С - из 12 кооперативных участков (концентрации 0,3 и 0,6 мг/мл) Повышение концентрации до 1,2 мг/мл увеличивает степень кооперативности молекул в

фибриллах до кооперативное™ молекул коллагена в растворе (п=9) Образование коллагеновых фибрилл при Т=35°С происходит более кооперативно число кооперативных участков снижается до 7 при концентрациях коллагена 0,3 - 0,6 мг/мл и до 5 при концентрации коллагена 1,2 мг/мл

Изменение длины и числа кооперативных участков связано с влиянием температуры на конформацито молекул коллагена, а также на структуру воды С повышением температуры увеличивается подвижность и гибкость мотекул В работе (Pnvalov et al, 1979) установлено, что изменение подвижности молекул при Т=28-30°С связано с началом кооперативных микроразворачиваний 30 трипептидов) в тройной спирали Образованию фибрилл при физиологических температурах предшествует дегидратация коллагеновых молекул (Есипова и др , 1981), которая обусловлена специфическими свойствами воды при 34-35°С (Kadler et al . 1987) В процессе формирования фибрилл ш vitro вода не полностью вытесняется из межмолекулярного пространства (Tiktopulo, Kayava, 1998) По-видимому, в кооперативную систему фибрилл при Т=25°С и Т=30°С включено большое количество молекул связанной воды, что обусловлено высокой сорбционной способностью коллагеновых молекул При Т--35°С увеличение степени кооперативное™ фибрилл определяется более плотными контактами между аминокислотными остатками коллагеновых молекул, а также упорядочиванием молекул воды внутри фибрилл

Эти результаты свидетельствуют, что при Т=30°С образуются фибриллы с промежуточным типом упаковки молекул Увеличение температуры от 30°С до 35°С повышает плотность упаковки фибрилл В работе (Wilhams et al, 1978), был установлен эффект более плотной упаковки молекул при температурах 26-30°С и неплотной упаковки молекул при физиологических температурах В работе (Cooper, 1970) плотность упаковки повышали высокими концентрациями фосфатов буферного раствора, превышающими физиологические величины ~ в 100 раз В нашей работе создание гомогенной структуры образцов и выбор условий образования фибрилл, более близких к физиологическим условиям, позволяет повышать степень связывания молекул не только при относительно высоких концентрациях молекул (выше 1 мг/мл), но и при относительно низких концентрациях молекул (0,3-0,6 мг/мл)

Таким образом, варьированием температуры и концентрации коллагеновых молекул с телопептидами регулируется термодинамика процесса

фибриллогенеза На основании экспериментальных данных можно предположить, что в зависимости от таких параметров образования фибрилл, как температура и концентрация, формируется разная структура фибрилл

1 При температурах ниже физиологической и при относительно низких концентрациях коллагеновых молекул образуется разупорядоченная структура фибрилл

2 При температурах ниже физиологической и при концентрации молекул выше I мг/мл повышается степень упорядоченности фибрилл

3 При физиочогической температуре образуется упорядоченная структура фибрилл с более плотной упаковкой молекул

Коллагеновые фибриллы соединительных тканей человека расположены в участках тела, различающихся по температуре Температура кожи последовательно повышается от 24°С на нижних частях тела до 36,6°С на верхних частях тела Изучение процесса фибриллогенеза в зависимости от температуры может быть использовано в медицинской практике для регуляции упаковки фибрилл на раневых поверхностях разных участков кожи

4. Образование комплексов коллагена с хондроитин-4-сульфатом в зависимости от разных условий

Полисахариды протеогликаны и гликозаминогликаны являются вторыми по значимости важными структурными компонентами внеклеточного матрикса Протеогликаны стабилизируют пространственную структуру коллагеновых фибрилл в матриксе и препятствуют разрушению коллагена при механических нагрузках Связывание протеогликанов с молекулами коллагена происходит через боковые цепи - гликозаминогликаны, что приводит к ограничению роста фибрилл в поперечном направлении и снижению диаметра фибрилл (Scott, 1988) Кроме того, из-за высокой гидрофильности протеогликанов создается более высокий уровень гидратации коллагеновых фибрилл, а следовательно, их метаболической активности во время морфогенеза и регенерации

Коллагеновые гели представляют собой систему фибриллогенеза ш vitro, удобную для иммобилизации многих клеток Поэтому комплексы коллагена с гликозаминогликанами в трехмерной сети геля могут применяться для создания тканевых форм коллагена и аналогов соединительных тканей

Связывание хондроитин-4-сульфата с коллагеном (контроль) повышает термостабильность коллагена на ~ 6°С Образование комплексов по 1-му и 2-му

методам не отличается от контроля, о чем можно судить по примерно одинаковой термостабильности и степени кооперативное™ коллагеновых структур (таблица 3) Высокие значения полуширины перехода свидетельствуют о низкой степени кооперативности комплекса и неупорядоченной структуре комплекса После инкубации комплексов при Т=4°С и рН 4,5 в течение 2 час повышение рН до 7,0 и температуры до 37°С увеличивает термостабильность комплекса лишь на 1°С по сравнению с контролем Температура образования комплексов 20°С незначительно повышает степень кооперативности комплексов По-видимому, агрегатная структура комплекса формируется на начальных этапах связывания молекул при низких значениях рН Комплексы в контроле и комплексы, образованные по первому и второму методам, имели структуру хлопьевидного осадка

Таблица 4. Образование комплексов из молекул коллагена и хондроитин-4-сульфата.

№ Температурный и временной режим Агрегатное состояние т 1 по "С А Т, "С Время деградации образца коллагеназой, мин.

1 Смешивание при 4°С, термостатирование при 4°С 24час (1 контроль) Осадок 46,8 5,0 14

2 Смешивание при 4°С, термостатирование при 4"С 2час, затем при 37°С 24час Осадок 47,7 4,8 15

3 Смешивание при 20°С, термостатирование при 20"С 24час Осадок 47,0 4,6 15

4 Смешивание при 20°С 10 сек , термостатирование при 37°С 24час Фибриллы в геле 51,3 2,5 15

5 Смешивание при 20°С 10 сек термостатирование при 37°С 24час (2 контроль) Фибриллы в геле 51,8 2,7 5

Состав образцов 1-4 коллаген (1 мг/мл) + хондроигин-4-сульфат (0, 25мг/мл), 5 коллаген (1 мг/мл)

Создание комплексов путем быстрого (10 сек) одновременного повышения рН, ионной силы и температуры приводит к образованию коллагеновых гелей (Рис 6 Б) Коллагеновый гель без хондроитин-4-сульфата (2-ой контроль) был образован по такому же методу (Рис 6 А).

Рис. 6. Электронно-микроскопическая картина поверхности низкотемпературного скола (х5000) А-коллагенового геля контроля, Б-геля комплекса коллагена и хондроитин-4-сульфата

Термостабильность комплекса-геля была на 4°С выше термостабильности комплексов-осадков Гелеобразование повышает в два раза степень кооперативное™ комплексов по сравнению с комплексами, созданными по первому, второму методам и в контроле Термостабильность коллагеновых фибрилл комплекса и контрольного геля оказалась примерно одинаковой Поэтому для анализа стабильности комплексов было проверено действие коллагеназы, которая является необходимым элементом соеденительной ткани Устойчивость к действию коллагеназы всех комплексов была в три раза выше устойчивости коллагенового геля без хондроитин-4-сульфата

При образовании фибрилл in vitro возможны два конкурирующих процесса агрегация и фибриллогенез В облас ги низких значений рН отрицательно заряженные молекулы гликозаминогликанов связываются с положительно заряженными участками молекул коллагена и формируются неупорядоченные агрегаты При нейтральных значениях рН преобладают специфичные взаимодействия между коллагеновыми молекулами, а при Т=37°С самосборка коллагена протекает с высокой скоростью Но параллельно процесс> фибриллогенеза происходит связывание молекул хондроитин-4-сульфата с коллагеновыми молекулами на поверхности фибрилл и со свободными коллагеновыми молекулами в растворе Таким образом образуется трехмерная структура геля Высокая устойчивость фибрилл комплекса к действию коллагеназы обусловлена электростатическими и стерическими взаимодействиями молекул хондроитин-4-сульфата с коллагеновыми фибриллами

Выбранные нами условия образования комплексов, приближенные к физиологическим условиям, позволяют формировать

1 Периодическую упаковку фибрилл, равную 67 нм, в продольном направлении

2 Образование фибрилл и комплексов во всем объеме

3 Повышенную термостабильность и степень кооперативности фибршч

4 Повышенную устойчивость фибрилл к протеолизу

В медицинской практике при лечении ран и ожогов кожи, где высока активность протеолитических ферментов, целесообразно применение комплексов коллагена с гликозаминогликанами в виде коллагеновых гелей

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одним из направлений в изучении фибриллогенеза in vitro может быть поиск условий образования фибрилл, содержащих возможно меньшее число параметров самосборки молекул и в то же время правильно отражающих основные свойства фибриллогенеза ш vivo В настоящей работе показано, что при физиологических значениях температуры, рН и ионной силы формируются фибриллы с плотной упаковкой молекул До нашей работы существовало представление о структуре фибрилл с низкой плотностью упаковки молекул, которые были образованы при физиологических температурах и низких концентрациях коллагена Главным результатом проведенных исследований следует считать то, что температурой и концентрацией колчагеновых молекул можно регулировать как скорость процесса фибриллогенеза, так и плотность упаковки фибрит

Трудность в изучении фибриллогенеза обусловлена быстрым процессом самосборки молекул в условиях, близких к физиологическим С помощью метода калориметрии можно исследовать структурное состояние фибрилл на начальных этапах их образования и можно проводить поиск существенных параметров фибриллогенеза Выбор таких факторов образования фибрилл, как температура, концентрация и время, позволит формировать структуру фибрилл in vitro, более близкой по структуре к биологической

выводы

1 Оптимизация методов получения высокоочищенного коллагена типа I и оптимизация условий фибриллогенеза коллагена позволяет формировать фибриллы с плотной упаковкой молекул

2 Выявлена степень влияния температуры на фибриллогенез коллагена типа I с целыми и удаленными телопептидами Установлено, что при физиологической температуре 35°С значительно увеличивается скорость образования фибрилл Для коллагена с телопептидами величины энтропии, энтальпии перехода фибрилл из нативного состояния в разупорядоченное при температуре 30°С максимальны, а при физиологической температуре 35°С минимальны

3 Определено, что варьированием температуры и концентрации коллагеновых молекул можно регулировать процесс фибриллогенеза m vitro скорость образования фибрилл и плотность упаковки фибрилл В условиях, приближенных к физиологическим, возрастает степень упорядоченной упаковки молекул в фибриллах и увеличивается длина кооперативных участков в фибриллах

4 Подобраны условия для связывания коллагена с хондроитин-4-сульфатом в трехмерную структуру коллагенового геля Установлено, что образование комплексов коллагена с хондроитин-4-сульфатом в геле приводит к повышению термостабильности фибрилл и их устойчивости к действию коллагеназы

5 Показано, что метод калориметрии достаточно адекватен, чтобы следить за формированием структуры фибрилл с повышенной плотностью упаковки молекул в трехмерном геле при создании биоматериалов с целью применения их в практической медицине

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1 Николаева Т. И , Есипова Н Г Связь ростовых свойств коллагенов с их физико-химическими характеристиками Тезисы докладов на II Всесоюзной конференции "Культивирование клеток животных и человека", 1985, Пущино, с.55.

2 Файзутдинова Р Н., Николаева Т.И. Роль коллагенового геля в адгезии и росте клеток Тезисы докладов на II Всесоюзной конференции "Культивирование клеток животных и человека", 1985, Пугцино, с 54

3 Рочев Ю А, Николаева Т.И., Кузьмин С.В Агрегация клеток на коллагеновых подложках Тезисы докладов на II Всесоюзной конференции "Культивирование клеток животных и человека", 1985, Пущино, с 52-53

4 Гаврилюк Б К, Рочев Ю А, Николаева Т.И "Культура клеток и реконструкция ткани (на примере кожи)" 1988, ОНТИ НЦБИ, Пущино, 123с

5 Гаврилюк Б К, Рочев Ю А, Николаева Т.И Культура клеток в реконструкции ткани Материалы III Всесоюзной конференции "Культивирование клеток животных и человека", 1992, Пущино, с 24-31

6 Николаева Т.И., Рочев Ю А, Гаврилюк Б К Термодинамические характеристики коллагеновых фибрилл в процессе их образования Биофизика, 1995, т 40, с 478-479

7 Гаврилюк Б К , Николаева Т.И., Рочев Ю А , Рябоконь П П , Селезнева И И Коллагеновые гели, хондроитин-4-сульфат, устойчивость к протеолизу Биофизика, 1995, т 40, с 1356-1357

8 Селезнева И И , Кузьмин С В , Николаева Т.И., Рочев Ю А Применение поляризационной термомикроскопии для регистрации процессов формирования и деградации коллагеновых фибрилл Биофизика, 1996, т41, с 541-542

9 Николаева Т.И., Писаченко А И, Рочев Ю А, Гаврилюк Б К Анализ самосборки молекул коллагена типа I в фибриллы Тезисы докладов II съезда биофизиков России, 1999, с 66-67

10 Николаева Т.И., Писаченко АИ, Селезнева ИИ, Рочев ЮА, Гаврилюк Б К Изучение самосборки молекул коллагена типа I с удаленными телопептидами Биофизика, 2000, т 45, № 6. с 1146-1149

11 Николаева Т.И., Писаченко А И , Полозов Р В , Рочев Ю А , Гаврилюк Б К Исследование образования фибрилл коллагена типа I in vitro Биофизика, 2001, т 46, №4, с 612-618

12 Николаева Т.И. Изучение упаковки фибрилл коллагена типа I Тезисы докладов на конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям", 2001, Пущино, с 84

13 Николаева Т.И., Полозов РВ, Рочев ЮА Исследование упаковки фибрилл коллагена типа I Тезисы докладов III съезда биохимического общества, 2002, Санкт-Петербург, с 505-506

14 Селезнева И И , Николаева Т.И., Давыдова Г А, Ковалева М.А , Чайлахян Т А, Чайлахян JIМ , Гаврилюк Б К Матрикс на основе коллагена коллагена типа I и хондроитин-4-сульфата устойчивость к протеолизу, взаимодействие с культурами эмбриональных стволовых клеток Тезисы докладов семинара-презентации научно-технических проектов "Биотехнология-2003", Пущино, 24-25 ноября, с 31

Список цитируемой литературы:

1 Бурджанадзе Т В , Тиктопуло Е И Энтальпия денатурации коллагена - незатухающая функция 4-оксипролина Биофизика, 2001, т 46, с 607-611

2 Есипова Н Г , Григолава М В , Щеголева Т Ю , Рогуленкова В Н , Малеев В Я Почему температура денатурации коллагена должна быть близка к температуре развития вида? Биофизика, 1981, т 26, с 355-356

3 Михайлов А Н Коллаген кожного покрова и основы его переработки М, Легкая индустрия, 1971. 528 с

4 Хечинашвили Н Н Термодинамика конформационных превращений глобулярных белков Докторская дисс 1990, Л

5 Capaldi М J, Chapman J A The C-terminal extrahelical peptide type I collagen and its role in fibnllogenesis in vitro Biopolymers, 1982,v 21, p 2291-2313

6 Chandrakasan G, Torchira D A, Piez К A Preparation of intact monomelic collagen from rat tail tendon and skin and the structure of the nonhehcal ends in solution J Biol Chem , 1976, v 2, p 6062-6067

7 Christiansen D L , Huang E К, Silver F H Assembly of type 1 collagen fusion of fibril subunits and the influence of fibril diameter on mechanical properties Matrix Biol, 2000, v 19, p 409-420

8 Cooper A Thermodynamic studies of the assembly in vitro of native collagen fibnls Biochem J , 1970, v 118, p 355-365

9 Engel J , Arch Biochem Biophys , 1962, v 97, p 150-158

10 Gelman R A, Williams В R , Piez К A Collagen fibril formation J Biol Chem 1979, v 254, p 180-186

11 George A, Veis A Molecular conformational transition precedes fibril association during in vitro fibnllogenesis Ann NY Acad Sci, 1990, v 580, p 489-491

12 Holmes DF, Graham HK, Trotter J A, Kadler KE STEM/TEM studies of collagen assembly Micron, 2001, v 32, p 273-285

13 Kadler KE, Prockop D J Protein structure and specific heat of water Nature, 1987,v 325, p 395

14 Kadler К E , Holmes D F , Trotter J A, Chapman A Collagen fibril formation Biochem J , 1996, v 316, p 1-11

15 Kupke D W, Dorrier T E Protein concentration measurement the dry weight Meth Enzym , 1978, v 48, part F, p 155-162

16 Lazarev Yu A, Lazareva A V , Shibnev V A, Esipova N G Infrared spectra and structure of synthetic polytnpeptides Biopolymers, 1978, v 17, p 1197-1214

17 Lumry R, Biltonen R.I., Brandts JF Validity of the "two-state" hypothesis for conformational transitions of protein Biopolymers, 1966, v 4, p 917-944

18 McPherson J M , Wallace D G , Sawamura S J , Conti A , Condell R A , Wade S , Piez K Collagen fibnllogenesis in vitro a characterization of fibril quality as a function of assembly conditions Coll Rel Res, 1985, v 5, p 119-135

19 Miles C A, Ghelashvili M Polymer-in-a-box mechanism for the thermal stabilization of collagen molecules in fibers Biophys J, 1999, v 76, p 3243-3252

20 NaGC UV spectroscopic characterization of type I collagen Coll Rel Res , 1988, v 8, 315330

21 Pnvalov PL, Serdyuk IN .Tiktopulo EI Thermal conformational transformations of tropocollagen II Viscosmetnc and light-scattering studies Biopolymers, 1971, v 10, p 17771794

22 Pnvalov P L , Tiktopulo EI, Tischenko V M Stability and mobility of the collagen structure J Mol Biol, 1979, v 127, p 203-216

23 Pnvalov P L Stability of proteins Prot Chem, 1982, v 35, p 1-104

24 Scott J E Proteoglycan-fibrillar collagen interactions Biochem J , 1988, v 252, p 313-323

25 Stoscheck C M Quantitation of protein Meth Enzym , 1990, v 182, p 50-91

26 Tiktopulo E I, Kajava A V Denaturation of type I collagen fibrills is an endothermic process accompanied by a noticeable change in the partial heat capacity Biochemistry, 1998, v 37, p 8147-8152

27 Williams B R, Gelman R A , Poppke D C , Piez K A Collagen fibril formation I Biol Chem 1978, v 253, p 6578-6585

28 Wood G C , Keech M K The formation of fibnls from collagen solutions 1 1 he effect of expenmental conditions kinetic and electron-microscope studies Biochem J, 1960, v 75, p 588-598

Принято к исполнению 02/03/2004 Исполнено 03/03/2004

Заказ № 66 Тираж ЮОкз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)318-40-68 www autoreferat ru

РНБ Русский фонд

2006-4 17658

1 5 M¿ г 2004

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Николаева, Тамара Ивановна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..

2.1. Особенности строения молекул коллагена и их свойства, определяющие образование упорядоченных макромолекулярных структур

2.2.Структура коллагеновых фибрилл

2.3. Упаковка молекул в фибриллах, существующие модели

2.3.1. Упаковка молекул в продольном направлении фибрилл

2.3.2. Упаковка молекул в поперечном направлении фибрилл

2.4. Образование коллагеновых фибрилл in vivo

2.5. Фибриллогенез коллагена in vitro. Факторы и параметры, влияющие на самосборку молекул in vitro: температура, рН, ионная сила, концентрация молекул, компоненты внеклеточного матрикса

2.5.1. Состав ионов

2.5.2. Ионная сила

2.5.3. РН

2.5.4. Температура

2.5.5. Концентрация

2.5.6. Компоненты внеклеточного матрикса

2.5.6.1. Гликозаминогликаны

2.6. Нарушения в упаковке коллагеновых молекул, приводящие к болезням и дефектам соеденительных тканей

2.7.Методы исследования коллагеновых фибрилл

2.7.1. Метод электронной микроскопии

2.7.2. Метод рентгеновской диффракции

2.7.3. Метод поляризационной микроскопии

2.8. Метод калориметрии

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..

3.1. Материалы и реактивы

3.1.1. Объекты исследования.

3.1.2. Реактивы.

3.2. Выделение коллагена и очистка

3.2.1. Коллаген из кожи свиней

3.2.2. Коллаген из сухожилий хвостов крыс

3.2.2.1. Коллаген с телопептидами

3.2.2.2. Коллаген без телопептидов.

3.3. Методы исследования

3.3.1. Электрофорез коллагеновых образцов

3.3.2. Определение концентрации коллагена

3.3.3.Оитические методы

3.3.3.1.Инфракрасная спектроскопия

3.3.3.2. Спектрофотометрия

3.3.3.3. Поляризационно-оптическая микроскопия

3.3.4. Метод сканирующей калориметрии

3.3.5. Методы электронной микроскопии

3.3.5.1. Метод сканирующей электронной микроскопии

3.3.5.2. Метод негативного контрастирования

3.4. Формирование коллагеновых фибрилл

3.4.1. Определение физико-химических характеристик коллагеновых молекул фибрилл

3.4.2.2. Выбор кинетического режима для самосборки молекул при температуре 4°С с изменением температуры до 25°С, 30°С, 35°С

3.4.2.3. Выбор начальных условий образования комплексов коллагена с молекулами внеклеточного матрикса

3.4.3. Поиск условий образования фибрилл: выбор фиксированных и варьируемых параметров.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Влияние температуры на фибриллогенез коллагена типа I с удаленными телопептидами

4.2. Влияние температуры и концентрации коллагеновых молекул на кинетику образования фибрилл

4.3. Термодинамические характеристики коллагеновых фибрилл, при разных значениях температуры и концентрации коллагеновых молекул.

4.4. Образование комплексов коллагена с компонентом внеклеточного матрикса хондроитин-4-сульфатом в зависимости от ряда условий

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование фибриллогенеза коллагена типа I in vitro"

Фибриллогенез коллагена in vivo представляет собой сложный, многоэтапный процесс. Сначала синтезируется предшественник коллагена -проколлаген. После отщепления ферментами пропептидов проколлаген превращается в коллаген и секретируется из клеток. Самосборка молекул коллагена в фибриллы происходит на поверхности клеток. Коллагеновые фибриллы собираются в волокна во внеклеточном пространстве.

Коллаген является основным структурным элементом внеклеточного матрикса. В настоящее время известно 26 генетически различных типов коллагена. Коллаген типа I входит в состав фибрилл и волокон большинства соединительных тканей. Нарушения в упаковке молекул коллагена типа I приводят к таким заболеваниям соединительных тканей, как остеопороз, сколиоз, синдром Элерса-Данлоса, синдром Марфана и др. Повышенная растяжимость кожи при синдроме Элерса-Данлоса коррелирует с увеличением диаметра фибрилл, что является следствием пониженного синтеза молекул коллагена типа III и протеогликанов, регулирующих упаковку и размеры коллагеновых волокон. При мышечной дистрофии степень упорядоченности коллагеновых фибрилл и волокон снижена в два раза по сравнению с нормой.

Упорядоченная структура коллагеновых фибрилл типа I формируется в процессе эмбриогенеза на начальных стадиях морфогенеза. В процессе тканеобразования клетки передвигаются вдоль коллагеновых фибрилл. Коллагеновые фибриллы типа I интенсивно образуются после ожогов и при заживлении ран.

Для фибрилл коллагена типа I установлена высокая степень упорядоченности в продольном направлении и найдено, что характерная периодичность структуры фибрилл по их длине определяется линейным типом упаковки молекул. До настоящего времени слабо изучена упаковка коллагеновых молекул в поперечном направлении фибрилл, а следовательно, не установлена структура фибрилл в трехмерном пространстве.

Упаковка молекул коллагена в фибриллы in vivo определяется достаточно большим числом участвующих в этом процессе компонентов, а также большим числом регулирующих факторов. Поиск условий образования фибрилл, адекватных фибриллогенезу коллагена in vivo, проводится уже в течение ~ 50 лет. Одним из подходов к изучению фибриллогенеза коллагена может быть создание систем фибриллогенеза in vitro в условиях, близких к условиям in vivo. Согласно литературным данным систем самосборки in vitro, параметры которых близки к параметрам in vivo, создано мало (Holmes, 2001; Christiansen, 2000). Выявление параметров образования фибрилл, определяющих функциональное состояние и упаковку фибрилл, позволит приблизиться к пониманию процесса фибриллогенеза in vivo.

Нахождение условий фибриллогенеза, влияющих на плотность упаковки фибрилл, дает возможность получать нативные коллагеновые фибриллы in vitro с регулируемыми свойствами. При создании биоматериалов требуется высокая степень упорядоченности и стабильности коллагеновых фибрилл, чтобы в течение длительного времени сохранялась их устойчивость к действию протеолитических ферментов. Образование коллагеновых фибрилл в комплексе с другими молекулами соединительных тканей представляет важную задачу биотехнологического направления.

Цель и задачи исследования. Фибриллогенез коллагена сложно исследовать, так как нативная структура фибрилл формируется при физиологических температурах, близких к температуре денатурации молекул. In vitro определен ряд параметров самосборки коллагеновых молекул и найдено небольшое число макромолекул внеклеточного матрикса, влияющих на фибриллогенез коллагена. Однако размеры фибрилл in vitro значительно превышают размеры фибрилл in vivo, что вызвано более низкой плотностью упаковки молекул по сравнению с упаковкой молекул in vivo. Целью данной работы является исследование фибриллогенеза коллагена типа I в условиях, приближенных к физиологическим условиям. Для поиска параметров, характеризующих фибриллогенез коллагена in vitro, использованы принципы построения фазовой диаграммы. Решались следующие задачи:

1. Выяснить влияние температуры на кинетику образования коллагеновых фибрилл.

2. Определить термодинамические характеристики коллагеновых фибрилл при разных значениях температуры и концентрации молекул.

3. Установить вклад гликозаминогликанов в формирование термостабильных и устойчивых к протеолизу фибрилл.

4. Оценить возможности метода калориметрии для изучения структуры коллагеновых фибрилл, образованных in vitro.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Николаева, Тамара Ивановна

выводы

1. Оптимизация методов получения высокоочищенного коллагена типа I и оптимизация условий фибриллогенеза коллагена позволяет формировать фибриллы с плотной упаковкой молекул.

2. Выявлена степень влияния температуры на фибриллогенез коллагена типа I с целыми и удаленными телопептидами. Установлено, что при физиологической температуре 35°С значительно увеличивается скорость образования фибрилл. Для коллагена с телопептидами величины энтропии, энтальпии перехода фибрилл из нативного состояния в разупорядоченное при температуре 30°С максимальны, а при физиологической температуре 35°С минимальны.

3. Определено, что варьированием температуры и концентрации коллагеновых молекул можно регулировать процесс фибриллогенеза in vitro: скорость образования фибрилл и плотность упаковки фибрилл. В условиях, приближенных к физиологическим, возрастает степень упорядоченной упаковки молекул в фибриллах и увеличивается длина кооперативных участков в фибриллах.

4. Подобраны условия для связывания коллагена с хондроитин-4-сульфатом в трехмерную структуру коллагенового геля. Установлено, что образование комплексов коллагена с хондроитин-4-сульфатом в геле приводит к повышению термостабильности фибрилл и их устойчивости к действию коллагеназы.

5. Показано, что метод калориметрии достаточно адекватен, чтобы следить за формированием структуры фибрилл с повышенной плотностью упаковки молекул в трехмерном геле при создании биоматериалов с целью применения их в практической медицине.

Благодарности:

Ю.А. Рочеву - научному руководителю Н.Н. Хечинашвили - научному консультанту Б.К. Гаврилюку - заведующему лабораторией

Е.И. Тиктопуло, Н.Г. Есиповой, Р.В. Полозову, Ю.А. Лазареву - за обсуждение работы и ценные замечания

А.И. Писаченко, И.И. Селезнёвой, С.В. Кузьмину, Ю.Ю. Скарге,

А.Г. Погорелову, М.Д. Шпагиной - сотрудникам лаборатории и института, принимавших участие в проведении экспериментов Л.П. Долгачевой, В.А. Печатникову, Л.Ф. Куньевой, A.M. Аксирову, Ф.Э. Ильясову - за техническую помощь в работе

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Николаева Т.И., Ееипова Н.Г. Связь ростовых свойств коллагенов с их физико-химическими характеристиками. Тезисы докладов на II Всесоюзной конференции "Культивирование клеток животных и человека", 1985, Пущино, с.55.

2. Файзутдинова Р.Н., Николаева Т.И. Роль коллагенового геля в адгезии и росте клеток. Тезисы докладов на II Всесоюзной конференции "Культивирование клеток животных и человека", 1985, Пущино, с.54.

3. Рочев Ю.А., Николаева Т.И., Кузьмин С.В. Агрегация клеток на коллагеновых подложках. Тезисы докладов на II Всесоюзной конференции "Культивирование клеток животных и человека", 1985, Пущино, с.52-53.

4. Гаврилюк Б.К., Рочев Ю.А., Николаева Т.И. "Культура клеток и реконструкция ткани (на примере кожи)". 1988, ОНТИ НЦБИ, Пущино, 123с.

5. Гаврилюк Б.К., Рочев Ю.А., Николаева Т.И. Культура клеток в реконструкции ткани. Материалы III Всесоюзной конференции "Культивирование клеток животных и человека", 1992, Пущино, с.24-31.

6. Николаева Т.И., Рочев Ю.А., Гаврилюк Б.К. Термодинамические характеристики коллагеновых фибрилл в процессе их образования. Биофизика, 1995, т.40, с.478-479.

7. Гаврилюк Б.К., Николаева Т.И., Рочев Ю.А., Рябоконь П.П., Селезнева И.И. Коллагеновые гели, хондроитин-4-сульфат, устойчивость к протеолизу. Биофизика, 1995, т.40, с.1356-1357.

8. Селезнева И.И., Кузьмин С.В., Николаева Т.И., Рочев Ю.А. Применение поляризационной термомикроскопии для регистрации процессов формирования и деградации коллагеновых фибрилл. Биофизика, 1996, т.41, с.541-542.

9. Николаева Т.И., Писаченко А.И., Рочев Ю.А., Гаврилюк Б.К. Анализ самосборки молекул коллагена типа I в фибриллы. Тезисы докладов II съезда биофизиков России, 1999, с.66-67.

10. Николаева Т.И., Писаченко А.И., Селезнева И.И., Рочев Ю.А., Гаврилюк Б.К. Изучение самосборки молекул коллагена типа I с удаленными телопептидами. Биофизика, 2000, т.45, № 6, с. 1146-1149.

11. Николаева Т.И., Писаченко А.И., Полозов Р.В., Рочев Ю.А., Гаврилюк Б.К. Исследование образования фибрилл коллагена типа I in vitro. Биофизика,

2001, т.46, № 4, с.612-618.

12. Николаева Т.И. Изучение упаковки фибрилл коллагена типа I. Тезисы докладов на конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям", 2001, Пущино, с. 84.

13. Николаева Т.И., Полозов Р.В., Рочев Ю.А. Исследование упаковки фибрилл коллагена типа I. Тезисы докладов III съезда биохимического общества,

2002, Санкт- Петербург, с. 505-506.

14. Селезнева И.И., Николаева Т.И., Давыдова Г.А., Ковалева М.А., Чайлахян Т.А., Чайлахян JI.M., Гаврилюк Б.К. Матрикс на основе коллагена типа I и хондроитин-4-сульфата: устойчивость к протеолизу, взаимодействие с культурами эмбриональных стволовых клеток. Тезисы докладов семинара-презентации научно-технических проектов "Биотехнология-2003", Пущино, 24-25 ноября, с. 32.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одним из направлений в изучении фибриллогенеза in vitro может быть поиск условий образования фибрилл, содержащих возможно меньшее число параметров самосборки молекул и в то же время правильно отражающих основные свойства фибриллогенеза in vivo. В настоящей работе показано, что при физиологических значениях температуры, рН и ионной силы формируются фибриллы с плотной упаковкой молекул. До нашей работы существовало представление о структуре фибрилл с низкой плотностью упаковки молекул, которые были образованы при физиологических температурах и низких концентрациях коллагена.

Главным результатом выполненной работы следует считать то, что температурой и концентрацией коллагеновых молекул можно регулировать как скорость процесса фибриллогенеза, так и плотность упаковки фибрилл.

Трудность в исследованиях фибриллогенеза коллагена связана с быстрым процессом самосборки молекул в условиях, близких к физиологическим. С помощью метода калориметрии можно исследовать структурное состояние фибрилл на начальных этапах их образования и можно проводить поиск существенных параметров фибриллогенеза. Выбор таких факторов образования фибрилл, как температура, концентрация и время, позволит формировать структуру фибрилл in vitro более близкой по структуре к биологической.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Николаева, Тамара Ивановна, Пущино

1. Александров В.Я. Клетки, макромолекулы и температура. 1975, Л., Наука.

2. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж, Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки, 1987, т.З, М., Мир, 296 с.

3. Бурджанадзе Т.В., Тиктопуло Е.И., Привалов П.Л. Энтальпия и энтропия денатурации коллагенов, различающихся по термостабильности. ДАН СССР. 1987, т.293, с.720-723.

4. Бурджанадзе Т.В., Ломая М.А., Бежитадзе М.О. Наличие термостабильного домена в спиральной части молекулы. Биофизика, 1989, т.34. с.377-383

5. Бурджанадзе Т.В., Тиктопуло Е.И. Энтальпия денатурации коллагена -незатухающая функция 4-оксипролина. Биофизика, 2001, т.46, с.607-611.

6. Есипова Н.Г., Лазарев Ю.А. Исследование структуры коллагена спектральными и диффракционными методами. В сб. "Конформационные изменения биополимеров в растворах". 1973, М., "Наука", с. 185-191.

7. Есипова Н.Г., Григолава М.В., Щеголева Т.Ю., Рогуленкова В.Н., Малеев В.Я. Почему температура денатурации коллагена должна быть близка к температуре развития вида? Биофизика, 1981, т.26, с.355-356.

8. Лазарев Ю.А. Стуктурообразование спирали коллагенового типа в синтетических олиго- и полипептидах. Докторская дисс., 1988, М.1

9. Михайлов А.Н. Коллаген кожного покрова и основы его переработки. М., Легкая индустрия, 1971,528 с.

10. Никитин В.Н., Перский Е.Э.,Утевская JI.A. Возрастная и эволюционная биохимия коллагеновых структур, Киев, "Наукова думка", 1977.

11. Подлубная З.А. Влияние ионной силы на структуру паракристаллов легкого меромиозина. Биофизика, 1973, т. 18, с.593-599.

12. Привалов П.Л., Мревлишвили Г.М. Биофизика, 1967, т. 12, с.22-29.

13. Привалов П. Л. Исследование тепловой трансконформации проколлагена.1. Энтальпия денатурации проколлагенов с различным содержанием аминокислот. Биофизика, 1968, т. 13, с.955-963.

14. Привалов П.Л., Тиктопуло Е.И. Исследование тепловой трансконформации проколлагена.И. Субденатурационное теплопоглощение в растворе проколлагена в присутствии солей. Биофизика, 1969, т. 14, с.20-27.

15. Привалов П.Л. Калориметрические исследования растворов биополимеров. Итоги науки и техники. Молекулярная биология, 1975, т.6, с.7-33.

16. Сердюк И.Н., Тиктопуло Е.И., Привалов П.Л. Исследования растворов проколлагена методом светорассеяния. Молекулярная биология, 1971, т.5,. с.606-613.

17. Финкельштейн А.В., Птицын О.Б. Физика белка. М. 2002.

18. Хечинашвили Н.Н. Термодинамика конформационных превращений глобулярных белков. Докторская дисс., 1990, Л.

19. Хилькин A.M., Шехтер А.Б., Истранов Л.П., Леменев В.Л. Коллаген и его применение в медицине. М, " Медицина", 1976,256 с.

20. Хромова Т.Б., Лазарев Ю.А. Связанная вода и стабильность трехспиральной структуры коллагенового типа. Биофизика, 1986, т.31, с.208-212.24