Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурные предпосылки амилоидогенности модельных белков
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Структурные предпосылки амилоидогенности модельных белков"
На правах рукописи
ЕГОРОВ Владимир Валерьевич
СТРУКТУРНЫЕ ПРЕДПОСЫЛКИ АМИЛОИДОГЕННОСТИ МОДЕЛЬНЫХ БЕЛКОВ
03 00 04-Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Санкт-Петербург - 2007
003061376
Работа выполнена в Отделе молекулярной генетики ГУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН», Санкт-Петербург
Научный руководитель
доктор медицинских наук Михаил Михайлович Шавловский
Официальные оппоненты руководитель лаборатории общей патологии Отдела общей патологии и патологической физиологии ГУ НИИЭМ РАМН
доктор биологических наук, профессор Владимир Николаевич Кокряков
доцент кафедры биофизики Санкт-Петербургского Государственного Политехнического Университета
кандидат биологических наук Андрей Николаевич Савельев
Ведущее научное учреждение Санкт-Петербургский Государственный
Университет, кафедра биохимии
Защита состоится «29» САамТ^^У^ 2007 г в часов на заседании
Диссертационного совета Д 001 022 03 п|\и ГУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН» по адресу 197376 Санкт-Петербург, Каменноостровский пр , д 69/71
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН» по адресу 197376 Санкт-Петербург, ул Академика Павлова, д 12
Автореферат разослан <<$» ла__2007 г
Ученый секретарь
диссертационного совета Д 001 022 03
______ _„
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Конформационные заболевания - это группа заболеваний, при которых нарушение нормальных физиологических и появление аномальных свойств белков связаны с изменением их пространственной структуры (Merlini, Beloíti, 2003) Значительная часть конформационных болезней представляет собой различные типы амилоидозов Возникновение амилоидозов связано с накоплением в различных органах и тканях нерастворимых фибриллярных форм белков К амилоидозам относятся такие известные заболевания как болезнь Альнгеймера, болезнь Паркинсона, прионные заболевания При диабете типа 2 образование амилоида также является одним из звеньев патогенеза (Покровский и др, 2004) Амилоидозы являются довольно распространенной группой заболеваний Так, например, в настоящее время, болезнь Альцгеймера обнаружена у 12 млн людей по всему миру (Merlmi, Belotti, 2003) По различным данным, амилоидоз мозга гистохимически выявляется у 30-46% психически здоровых людей в возрасте старше 60 лет и у 80-100% людей старше 85 лет (Ойфа, 1987, Merhm, Belotti, 2003) Несмотря на существенный прогресс в понимании механизмов формирования амилоидных отложений, до сих пор не существует эффективных средств для лечения амилоидозов (Jakobson, 2004) Широкая распространенность этой группы заболеваний позволяет рассматривать проблему поиска ингибиторов фибриллогенеза как достаточно актуальную Изучение аномального фибриллогенеза является важным также и для разработки новых наноматериалов на основе аномальных фибрилл (Mitraki et al, 2005, Velikov, 2005)
Цели исследования Основной целью данной работы являлось изучение молекулярных механизмов аномального фибриллогенеза и разработка подходов для подавления амилоидогенности модельных белков Задачи исследования
1 Провести анализ первичной структуры известных фибриллогенных пептидов m ?¡lico Выявить закономерности первичной структуры, характерные для этой группы полипептидов
2 Определить структуру потенциальных фибриллогенных детерминант модельных белков альфа-лактальбумина и лизоцима
3 Рассчитать строение и синтезировать пептиды, содержащие потенциальную фибриллогенную детерминанту альфа-лактальбумина человека Изучить фпбриллогенные свойства такого пептида m sihco и in vitro Изучить влияние такого пептида на фибриллогенез альфа-лактальбумина
4 Установить возможный механизм участия потенциальных амилоидогенных детерминант в фибриллогенезе
5 Рассчитать строение и синтезировать пептид, потенциально способный влиять на фибриллогенез лизоцима куриного яйца Экспериментально изучить его влияние на фибриллогенез этого белка
Научная новизна полученных результатов. При анализе первичной структуры фибриллогенных пептидов впервые обнаружено наличие зеркально-симметричных мотивов Впервые предложен и синтезирован способный к фибриллогенезу пептид, гомологичный фрагменту альфа-лактальбуминов С помощью компьютерного моделирования и изучения свойств фибрилл такого пептида охарактеризован механизм его фибриллогенеза Показано влияние такого пептида на фибриллогенез альфа-лактальбумина Установлена роль участка последовательности 35-51 а о в фибриллогенезе этого белка Предложена стратегия для ингибирования образования префибриллярных форм белков Установлен потенциальный механизм участия зеркально-симметричных мотивов в фибриллогенезе На основании такого механизма рассчитан и синтезирован пептид, идентичный участку последовательности лизоцима и способный оказывать влияние на фибриллогенез этого белка Научная и практическая значимость работы. Полученные результаты позволяют расширить представления о мотивах, участвующих в белок-белковых взаимодействиях и предложить стратегию для создания пептидов, способных влиять на аномальный фибриллогенез белков Синтетические пептиды могут послужить основой для создания терапевтических средств для борьбы с амилоидозами Кроме того, полученные данные и разработанные методы моделирования in silico могут быть использованы для создания наноматериалов на основе фибриллогенных пептидов Основные положения, выносимые на защиту:
1 В последовательностях модельных белков альфа-лактальбумина и лизоцима существуют зеркально-симметричные мотивы
2 Пептид GYDTQAIVENNESTEYG, содержащий зеркально-симметричный мотив и совпадающий по первичной структуре с участком 35-51 а о бета-домена альфа-лактальбумина, содержит фибриллогенную детерминанту этого белка
3 Пептид GYDTQTVVNNNGHTDYG, гомологичный зеркально-симметричному мотиву альфа-лактальбумина, также содержит фибриллогенную детерминанту этого белка и способен связываться с ним в соотношении 2 1
4 Результаты компьютерного моделирования фибриллогенеза пептида GYDTQTVVNNNGHTDYG, подтверждены в экспериментах т vitro
5 Постулирован механизм участия зеркально-симметричных мотивов в фибриллогенезе белков На основании такого механизма разработан пептид, способный влиять на аномальный фибриллогенез лизоцима
Апробация результатов работы Основные положения работы были представлены на 9-й и 10-й Путинских международных школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2005, 2006), на международных конференциях European Society of Human Genetics (Prague, Czech Republic, 2005, Amsterdam, The Netherlands, 2006), на 8- и 9-й Всероссийских медико-биологических конференциях молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2005, 2006) на научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2005), на межвузовской научной конференции "XXXIV неделя науки СПбГТУ" (Санкт-Петербург, 2005), а также на конференции, посвященной 115-летию ГУ НИИЭМ РАМН (Санкт-Петербург, 2005) и на конференции молодых ученых ОМРБ ПИЯФ РАН (Гатчина, 2007)
Публикации По теме диссертации опубликованы 4 статьи и 8 тезисов докладов на Всероссийских и Международных конференциях
Личный вклад соискателя Соискателем были проведены анализ литературы по теме исследования, планирование экспериментов, получение основной части результатов, написание статей и подготовка докладов на конференциях Выделение и очистка белка, используемого в работе, получение фибрилл, подготовка образцов для электронной микроскопии, модификация существующих методов для атомной силовой микроскопии образцов, оптимизация условий для флуоресцентного анализа, электрофоретическое и хроматографическое разделение олигомерных форм белков Также соискателем была осуществлена разработка алгоритмов оригинальных компьютерных программ, использованных в работе Отработка алгоритмов и написание программ осуществлялись студентом Кафедры биофизики СПбГПУ Гармаем Ю П Электронная микроскопия проводилась в Лаборатории патоморфологии вирусных инфекций ГУ НИИ гриппа РАМН под руководством к б н Сироткина А К и в Ботаническом институте РАН Атомная силовая микроскопия осуществлялась в Лаборатории биофизики макромолекул ОМРБ ПИЯФ РАН под руководством к ф-м н Лебедева Д В Измерение спектров флуоресценции осуществлялось в ИВС РАН под руководством д ф-м н Паутова В Д , в Отделе биохимии НИИЭМ РАМН под руководством Лозовского В Т, а также в ИНЦ РАН под руководством д ф-м н Туроверова К К Измерение ферментативной активности лизоцима проводилось в Отделе общей патологии и патологической физиологии НИИЭМ РАМН под руководством к б н Берлова М 11
Структура диссертации Диссертация построена по традиционной схеме и содержит разделы «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список цитируемой литературы», включающий 120
иностранных и 18 отечественных источников Диссертация изложена на 107 страницах Результаты представлены в 1 таблице и иллюстрированы 45 рисунками
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалы. При выполнении работы использовали реактивы фирм «SIGMA» (Тиофлавин Т, NaN3, EDTA, фенил-сефароза, маркеры молекулярного веса, лизоцим куриного яйца, препарат клеточной стенки M Intens), «SERVA» (реактивы для электрофореза и буферные растворы), «TOYOSODA» (смолы для гель-фильтрации), «MERCK» (неорганические соли) Пептиды GYDTQTVVNNNG11TDYG (далее - ID), GYDTQAIVENNESTEYGfemce - WT) и NTQATNRNTD (далее - HALF) были синтезированы в ООО «НПФ «Верта», чистота препаратов более 90% Для фильтрации образцов перед выполнением сканирующей зондовой микроскопии использовали фильтры фирмы «Orange scientific» Для сканирующей зондовой микроскопии использовали пластинки слюды фирмы «Structure Probe Inc » и кантиливеры фирмы «NT-MDT» Также использовали стеклянные пластинки, покрытые HydroGel фирмы «Perkm-Elmer» Аминокислотные последовательности фибриллогенных пептидов и белков получены из баз данных GenBank, SWISS-PROT, а также из статей (Azriel, Gazit, 2001, Liu et al, 2004, Tagliavini et al, 1993, Sedman et al, 2005, Jams et al, 1993, Krebs et al, 2000, Lopez de la Paz, 2002, Legman et al, 2004, Nelson et al, 2005) Выделение альфа-лактальбумина человека из молока. Альфа-лактальбумин (AJ1) выделяли из молока человека по методу, описанному в работе (Svensson et al, 2000) Контроль чистоты препарата проводили с помощью денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ)
Электрофорез белков в ПААГ А. Эчектрофорез в денатурирующих условиях (Laemmli, 1970) Пробы для электрофореза готовили следующим образом к 5 мкл белка с концентрацией около 1 мг/мл добавляли 5 мкл раствора, содержавшего 2% SDS, 2 5% бета-меркаптоэтанол и 0,01% бромфеноловый синий, затем инкубировали на кипящей водяной бане в течение 3 минут Электрофорез белка в 8% ПААГ осуществляли в пластинах с размерами 10*10 см при градиенте напряжения 20 В/см в геле следующего состава 8% акриламид (акриламид/метиленбисакриламид=29 1), 37мМ Tris-HCl, pH 9 4, 0 01% SDS, 0 01% персульфат аммония, 0 001% тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД) с использованием электродного буфера, содержащего 0 125 M Tris-HCl, pH 6 8 и 0 1% SDS Б Диск-электрофорез в кислой системе (Маурер, 1971) К 3 мкл образца (15 мкг белка) добавляли 1 мкл буфера (бОмМ КОН-СН3СООН буфер, pH 6 7, 50% глицерин, 0 001% метиловый зеленый, 10% насыщенный спиртовой р-р пиронина G) Электрофорез лизоцима, инкубировавшегося с пептидом и без пептида проводили с использованием 7 5% разделяющего ПААГ, содержащего КОН-СН3СООН буфер, pH 4 3 (70мМ КОН, 2 5%
СНзСООН, 7 5% акриламид (акриламид/метиленбисакриламид=29 1), 0 01% персульфат аммония, 0 001% ТЕМЕД) и 5% концентрирующего ПЛАГ содержащего Tris-HCl буфер, pH 6 7 (40мМ КОН, 0 2% СНзСООН, 5% акриламид (акриламид/метиленбисакриламид=29 1), 0 01%) персульфат аммония, 0 001% ТЕМЕД) В качестве электродного использовали ß-аланин-ацетатный буфер, pH 4 5 (ß-аланин - 31 2 г, СН3СООН - 8 01 мл, IЬО - до 1 л) Непосредственно перед употреблением исходный электродный буфер разводили в 10 раз дистиллированной водой Электрофорез проводили в течение 3 часов при градиенте потенциала 15-20 В/см в аппарате для вертикального ЭФ
Окрашивание белков в ПААГ с помощью нитрата серебра После проведения электрофореза гель помещали на 1 час в 50 мл раствора для отмывки от SDS (50 мл 96% этанола, 10 мл ледяной уксусной кислоты, 40 мл дистиллированной воды) При изучении электрофоретического разделения олигомеров пептида в 50 мл раствора добавляли также формальдегид до конечной концентрации 1% для фиксации мономеров пептида в геле Затем помещали гель на 30 минут в 10% раствор (v/v) уксусной кислоты, после чего промывали гель дистиллированной водой 3 раза по 2 минуты Помещали гель в 0 1 % раствор AgNÛ3 на 30 минут Промывали гель дистиллированной водой в течение 20 секунд и помещали в проявитель (3% соды безводной, 0 1% формальдегида, 0 0001% тиосульфата Na) После проявления зон фиксировали гель в 10% растворе уксусной кислоты Сканирующая зондовая (атомная силовая) микроскопия Атомную силовую микроскопию (АСМ) проводили на микроскопе «Solver-bio» (NT-MDT, Зеленоград), смонтированном на флуоресцентном микроскопе «Olympus» Сканирование проводили в полуконтактном режиме с использованием кантиливера NSG 01-03 Для сорбции образцов использовали поверхности только что отщепленной от блока слюды, поверхность слюды, покрытой углеродной пленкой и поверхность гидрогеля Для изучения структуры протофиламентов использовали предварительную фильтрацию образцов через фильтр с размерами пор 0 2-0 4 мкм Измерения параметров фибрилл проводили с помощью пакета программ NT-MDT Nova
Гель-фильтрация Гель-фильтрацию олигомеров пептида ID осуществляли на колонке 1,5x15 см с TOYOPEARL HW-50, уравновешенной буфером 0 1 M Tns-HCl pH 7 5, 0 1 NaCl Для предотвращения фиксации на колонке высокомолекулярных агрегатов пробу предварительно центрифугировали в течение 10 минут на центрифуге «Eppendorf» при 11000 g Супернатант наносили на колонку при скорости элюирования 1 мл/мин Регистрацию проводили с помощью системы Uvicord фирмы LKB Колонка калибровалась с помощью стандартного набора белков известной молекулярной массы Калибровочный график строили с использованием метода линейной регрессии, реализованного в пакете программ SigmaPlot
Поиск мотивов в аминокислотных последовательностях Для поиска симметричных участков в протяженных последовательностях использовали оригинальную программу, написанную на языке С С помощью этой программы осуществлялся поиск соответствия между всеми возможными участками в последовательности, записанной в направлении N-конец - С-конец и участками той же последовательности, записанными в обратном направлении Для поиска симметрии все аминокислотные остатки разбивали на 4 группы -заряженные положительно (H, R, К), заряженные отрицательно (Е, D), полярные (Q, N, Т, Н, R, К, Е, D ), гидрофобные (Y,A,L,W,G,I,V) Считали, что последовательность симметрична в случае, когда позиции аминокислотных остатков из одной группы в последовательности, записанной в направлении C-N, совпадали с позициями аминокислотных остатков той же группы в последовательности, записанной в противоположном направлении Отбор наиболее симметричных участков производили по максимуму отношения «количество симметричных остатков в участке»/«длина участка»
Моделирование пространственной структуры пептидов m silico Моделирование пространственной структуры пептидов осуществляли с помощью оригинальной программы, написанной на языке С с использованием программных пакетов GROMACS и SMMP В основу программы положена концепция оптимизации по энергии с использованием генетических алгоритмов (ГА) (Damsbo et al, 2004) Программа написана на языке С и выполняется под операционной системой LINUX Все использованные программы являются бесплатными для академических пользователей и находятся в свободном доступе в сети Интернет
Докинг пептида ID Компьютерное моделирование образования олигомерных комплексов пептида ID проводили с помощью программы Hex 4 5 (Ritchie, Kemp, 2000), осуществляющей докинг При расчетах учитывали электростатические взаимодействия между атомами Докинг осуществляли по следующей схеме моделировали взаимодействие двух объектов (моно- или олигомеров пептида), затем полученную структуру оптимизировали по энергии с использованием коммерческого пакета программ Hyper Chem 7 01 Оптимизированную структуру использовали на следующем шаге моделирования только в том случае, когда суммарная энергия составляющих его частей была выше, чем энергия оптимизированного образовавшегося олигомера (с учетом энергии гидратации) Таким образом, избегали появления энергетически невыгодных структур и выбирали только пути олигомеризации, проходящие через энергетически выгодные стадии Приготовление препаратов фибрилл пептидов. 5 мг пептида WT или ID растворяли в 1 мл дистиллированной воды в пробирке типа «Эппендорф» объемом 1 5 мл и инкубировали 24 часа при температуре 55°С при постоянном перемешивании
Приготовление проб для измерения флуоресценции комплексов образцов с тиофлавином Т. Измерение флуоресценции комплексов тиофлавина Т (ThT) с фибриллами проводили по методу, описанному (Le Vine, 1993) Регистрацию спектров флуоресценции проводили с помощью спектрофлуориметра AvaSpec-2048 или спектрофлуориметра PTI Электронная микроскопия фибрилл Подготовку препаратов для электронной микроскопии осуществляли по стандартной методике негативного контрастирования Исследования проводили на электронном микроскопе JEOL JEM 100S или TESLA BS100 при ускоряющем напряжении 80 кВ
Измерение ферментативной активности лизоцнма Активность лизоцима определяли по стандартному методу (Parry et al, 1965) В качестве субстрата использовали препараты клеточной стенки М htteus
Получение фибрилл лизоцима и альфа-лактальбумина Фибриллы лизоцима получали следующим образом 10-28 мг лизоцима растворяли в 0 5 мл дистиллированной воды, добавляли 2М раствор NaCl и 1 М Gly-HCl буфер рН 2 0 до концентраций 0 1 М и 0 5 М соответственно Конечная концентрация лизоцима составляла 5-14 мг/мл Пробу инкубировали при 55°С при постоянном перемешивании в течение 5 суток Фибриллы АЛ получали по методу, описанному (Goers et al, 2002)
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Зеркально-симметричные мотивы в последовательностях фибриллогенных пептидов Одной из задач исследования являлось определение амилоидогенных детерминант АЛ человека и лизоцима куриного яйца Информация о расположении таких участков в последовательности белков может послужить основой для создания пептидных ингибиторов образования токсичных префибриллярных форм и фибриллогенеза этих белков Мы провели поиск особенностей первичной структуры известных фибриллогенных пептидов с целью выявления сходных особенностей в последовательностях АЛ и лизоцима Зеркально-симметричный мотив в последовательности транстиретина (TTR) В экспериментах по изучению фибриллогенеза TTR, выполненных ранее в нашей лаборатории было показано, что ограниченный протеолиз, ведущий к утрате С-концевого фрагмента 111127 а о приводит к потере данным белком способности к фибриллогенезу Гидролиз пептидной связи после 110 а о также приводит к утрате целостности участка TTR 105-115 Искусственный пептид, соответствующий этому участку, способен к фибриллогенезу т vitro (Jaiomec et а!, 2002) Последовательность пептида 105-115 TTR приведена на рис 1А Положение сайта, по которому происходит отщепление, показано звездочкой Место расщепления пептидной связи располагается близко к центру фибриллогенного пептида,
поэтому мы сделали предположение о том, что для фибриллогенеза важно наличие его С-концевого (111-115) участка Обнаруженной нами особенностью первичной структуры пептида 105-115 TTR является то, что участок 105-114 является зеркально-симметричным мотивом (ЗСМ) (рис 1В) ЗСМ представляет собой фрагмент аминокислотной последовательности, содержащий центр симметрии, на равном расстоянии от которого по направлению к N- и С- концу находятся идентичные или близкие по гидрофобности а о
а
I05_YTIAAL*LSPYS_I15
в
TTR_105-115_N-C 105_YTIAA+LLSPYS_115
TTR_105-115_C-N 115_SYPSLL+AAITY_105
Рисунок 1 А. Положение сайта гидролиза в последовательности фибриллогенного пептида 105115 В Мотив зеркальной симметрии в пептиде 105-115 TTR (*) - обозначены совпадающие остатки, () - одинаковые по заряду/гидрофобности, () — совпадающие по полярности Знаком + обозначен центр симметрии
Гидролиз пептидной связи после lilao приводит к утрате симметрии в этом фрагменте Мы сделали предположение, что именно наличие симметрии во фрагменте 105-115 является критичным для фибриллогенеза TTR
Зеркалыю-симметричпый мотив в последовательности фибриллогенного пептида из лизоцима фага Т4 Наличие ЗСМ обнаружено нами также и в некоторых других естественных и синтезированных фибриллогенных пептидах Так, ЗСМ присутствуют в последовательности фибриллогенного пептида (11-36) из лизоцима фага Т4 (Lui et al, 2004) На рис 2 представлен ЗСМ (11-31), присутствующий в этом пептиде
T4LYZ_N-C 11_EGLRLKIYKDTEGYYIIGIGH_31
T4LYZ C-N 31 HGIGIIYYGETDKYIKLRLGE11
Рисунок 2 Расположение мотива зеркальной симметрии в последовательности фибриллогенного пептида из лизоцима фага Т4
Пептид KFFEAAAKKFFE я-я-стэкииг и ионные взаимодействия На рис 3 представлена последовательность неприродного фибриллогенного пептида KFFEAAAKKFFE, описанного в работе (Mahn et al, 2005) Мы обнаружили, что он также содержит ЗСМ
AB1_N-C_ KFFEAA+AKKFFE
AB1_C-N_ EFFKKA+AAEFFK
Рисунок 3 ЗСМ в последовательности фибриллогенного пептида, описанного в работе (Makm et al, 2005)
В работе (Mahn et al, 2005) было показано, что основными взаимодействиями, стабилизирующими структуру фибриллы, являются водородные связи между антипараллельными бета-тяжами, ориентированными перпендикулярно оси фибриллы Отдельные пачки бета-тяжей взаимодействуют между собой за счет п-л взаимодействий между фенилаланинами на концах пептида Предполагается, что взаимодействия между боковыми цепями а о приводят к сближению азотов и кислородов пептидных связей мономеров и таким образом способствуют образованию водородных связей между отдельными бета-тяжами
Гидрофобные аминокислотные остатки в ЗСМ В работе (Sedman et al, 2005) описан минимальный фибриллогенный фрагмент амилина (SNNFGAILSS) Мы обнаружили, что он также содержит ЗСМ, однако не содержит заряженных остатков (рис 4) По-видимому, в фибриллогенезе такого пептида играет роль взаимодействие между гидрофобными остатками Роль периодического расположения гидрофобных остатков и симметрии их расположения в фибриллогенезе фрагментов бета-амилоидного пептида обсуждается в работах (Tjernberg et al, 2002, Wang, Hecht, 2002)
Iappmin C-N Iappmin_N-C
Рисунок 4 Зеркально-симметричный мотив в последовательности фнбрнллогенного пептида из амилина.
Другим примером участия гидрофобных остатков в формировании фибрилл является искусственный амилоидогенный пептид, соответствующий консервативному участку прионных белков млекопитающих AGAAAAGA (Gasset et al, 1992) Такой пептид состоит только из гидрофобных остатков и является полностью зеркально-симметричным (рис 5)
ргР_Ы-С AGAA+AAGA
prP_C-N AGAA+AAGA
Рисунок 5 Зеркально-симметричный фибриллогенный пептид, соответствующий консервативному участку прпоиов млекопитающих
Позднее было показано (Notstrom, Mastrianm, 2005), что наличие такого симметричного гидрофобного участка в прионном белке является необходимым для индукции фибриллогенеза при заражении хомячка прионным белком
Почярпые аминокислоты в ЗСМ С другой стороны, известна пространственная структура гидрофильного фибриллогенного пептида, гомологичного фрагменту прионного белка дрожжей (рис 6) (Nelson et al, 2005) В центре такого пептида располагаются полярные аминокислотные остатки Взаимодействия между аминокислотными остатками,
53_SNN~G+AILSS_62 62 SSLIA+GFNNS 53
обусловливающие фибриллогенез этого пептида, схематически представлены на рисунке 7 Пептид также содержит ЗСМ
prYeast_N-C_ GNNQQNY
prYeast_C-N_ YNQQNNG
Рисунок 6 Симметрия в фибриллогенном пептиде, гомологичном участку приониого белка дрожжей
GNNQQNY GNNQQNY
GNNQQNY GNNQQNY
GNNQQNY GNNQQNY
Рисунок 7 Схема обусловливающих фибриллогенез взаимодействий между аминокислотными остатками пептида GNNQQNY Молекулы пептида в составе фибрилл располагаются параллельно - и происходит взаимодействие между боковыми радикалами остатков (на левой части рисунка) Такие стопки параллельно расположенных молекул способны взаимодействовать также (со сдвигом на 1 аминокислотный остаток) между собой Звездочками (*) обозначены связи между боковыми цепями аминокислотных остатков (по Nelson et al 2005)
Полиамшшкислоты Существуют, по крайней мере, два заболевания, патогенез которых связан с аномальным фибриллогенезом гомоаминокислотных участков в последовательностях белков - это болезнь Хантингтона (возникновение полиглутаминового участка) и окулофарингеальная миодистрофия (возникновение полиаланинового участка) Кроме того, способность образовывать фибриллы in vitro показана для полилейцина, полиглутаминовой кислоты и полилизина (Fandrich, Dobson, 2002)
Заключение Роль зеркально-симметричных участков во взаимодействии белков была впервые показана в работе Шпакова (Шпаков, 1998) Приведенные выше данные позволили нам сформулировать гипотезу о роли зеркально-симметричных мотивов в фибриллогенезе некоторых белков и пептидов Поэтому для выполнения задачи поиска амилоидогенных детерминант альфа-лактальбумина и лизоцима мы провели поиск зеркальной симметрии в аминокислотных последовательностях этих белков
Предсказание фибриллогенной детерминанты инсулина. Мы создали компьютерную программу для поиска мотивов зеркальной симметрии в протяженных аминокислотных последовательностях и провели такой поиск в последовательностях белков и пептидов с неизвестными фибриллогенными детерминантами При анализе первичной структуры инсулина нами был обнаружен наиболее симметричный пептид (10-16) в цепи В этого белка Структура такого мотива представлена на рис 8
INS_N-C 10_HLVEALY_16
IHS_C~N 16_VLAEVLH_10
Рисунок 8. Структура ЗСМ (10-16 n,o.) n цепи fi инсулина.
Позднее в работе (Gibson, Murphy. 2006) было показано, что данный фрагмент является фибриллогенноЙ детерминантов инсулина. Па основании этих данных авторами был создан пептидный ингибитор фибрилл огенеза, представляющий собой такой пептид с добавлением 5 арги ни новых остатков с N- кон на.
Определение потенциальных амилоиде сенных детерминант н послед овател ьностн ал е> ф а-.1 г а ЕСт я л ь fi у м ti и .
ЗСМ в последовательности АЛ. Мы провели покск ЗСМ в последовательности АЛ
человека. I (а рис. 9 приведен наиболее симметричный участок в последовательности АЛ.
j
LALB(C-M) 35_GYDTOMVENNF.STEYC_SI
LALB(N-CI S1 _GY ET SE1JNEVIAQT DYG_3 5
Рисунок 9, Наиболее симметричный участок в ШШмтительиости ЛЛ человека.
Для изучения ф нбрнллогенных свойств участка 35-51 AJI человека такой пептид был синтезирован, и были г пучены его фибрилле генные свойства.
Фибриллогенез пептида 35-51 АЛ. При электронной микроскопии пептида, идентичного участку $5-5! ЛЛ человека (пептид WTj, инкубировавшегося а условиях ячя фибрнллогенеза АЛ, наблюдали сорбировавшиеся на подложке фила мен ты толщинок около (О НМ (рис. ¡0).
Рисунок 1(1. Результаты электронной микроскопии фибрилл пептида \\Т. Длима йрямоугольника и левом углу соответствует 1 икм. Наблюдаются пак отделы¡ие фибриллы, так и пучки фибрилл.
Опыты по измерению флюоресценции ТЬТ показали, что такие фибриллы способны увеличивать квантовый выход флуоресценции этого красителя, что является свойством,
характерным именно для аномальных фибрилл Наличие фибрилл также было подтверждено с помощью АСМ
Индукция фибриллогенеза Было показано, что фибриллы пептида \УТ способны индуцировать фибриллогенез АЛ, что свидетельствует о присутствии в его последовательности фибриллогенной детерминанты этого белка
Создание пептида на основе первичной структуры симметричного участка бета-домена альфа-лактальбумина
Для изучения роли симметричных фрагментов в фибриллогенезе пептида \УТ и АЛ был синтезирован пептид, ОУОТОТУУЫЫЫОНТОУО, обладающий зеркальной симметрией и гомологичный пептиду \УТ (рисунок 11) А
1С1 ОУОТОТУУЫЫЫСНЮУО
1а1Ъ ОТОТОМУЕЫЫЕЗТЕУС
в
+
1с1_С-Ы СУОТОТУУШЫСНТОТС
1с1_Ы-С СУОТНСИШУУТОТОУО
***+ * * ***
Рисунок 11 (А) Выравнивание последовательностей участка 35-51 ЛА и пептида Ш (В) ЗСМ в пептиде ГО
Последовательность пептида Ш отличается шестью аминокислотными заменами от соответствующего участка последовательности альфа-лактальбумина человека, причем замены а о с существенно отличающимися свойствами локализованы в центральной его части
В качестве первого этапа проверки наличия потенциальной способности такого пептида к фибриллогенезу мы провели компьютерное моделирование его пространственной структуры Моделирование пространственной структуры пептида Ю т .•¡¡¡/со Для моделирования пространственной структуры пептида Ш т ягЬсо мы использовали оригинальную программу, использующую методы молекулярной механики и концепцию генетических алгоритмов Такой выбор был обусловлен несколькими причинами (0 Использование метода генетических алгоритмов позволяет решить проблему «нулевого приближения», то есть при использовании нашей программы конформация, получающаяся после оптимизации, не зависит от конформации, заданной в качестве начальной, (и) Созданная нами программа позволяла оптимизировать пространственную структуру пептида с учетом энергии гидратации, (ш) Сравнение значения энергий, вычисленных для структур, оптимизированных с помощью нашей программы и с помощью нескольких коммерческих
пакетов программ показали, что полученная с помощью нашей программы конформацня имеет минимальную энергию. В результате моделирования мы получили структуру пептида, обладающую минимальной энергией и минимальной гидрофобной поверхностью. Моделирование образования фибрилл пептида ID in silico. При взаимодействии белков существует большое количество факторов, влияющих на этот процесс, причем некоторые факторы, остающиеся за рамками используемой модели, могут и греть определяющую роль. Поэтому важно отмстить, что, несмотря на достоинства методов моделирования взаимодействий in silico, данные, полученные при проведении таких экспериментов, всегда следует использовать только в качестве исходных предположении при планировании экспериментов in vitro (VilloutreiX, 2001).
Некоторые информации пептида ID, полученные в процессе моделирования, in silico были способны к образованию фибриллопшюбных агрегатов. При этом энергетически выгодным являлось взаимодействие между димерами пептидов приводящее к образованию тетрамеров. При дальнейшей шшгомерюации структурами, участвующими в формировании фибриллы, являлись окта- и 16-мсры пептида. 16 меры были способны к взаимодействию между собой за счет гидрофобных контактов между остатками V7 и VK, боковые цепи которых оказываются снаружи 16-мера (рисунок 12), Таким образом 1б-меры были способны объединяться с образованием линейной структуры толщиной около 7 нм.
Рисунок 12. Результаты компьютерного моделирования образования 16-л ера пептида.
Сравнение энергий взаимодействия олигомеров, полученных в результате докинга, показало, что наиболее стабильными являются тетра- и октамеры пептида. Таким образом, в результате компьютерного моделирования фибриллогенеза пептида ИЗ мы получили следующие результаты: (¡) Пептид способен образовывать фибриллярные структуры толщиной около 7 нм; (¡¡) Взаимодействия между С-концевыми участками молекул пептида являются критичными для образования димеров; (ш) Взаимодействия между симметричными М- и С- концевыми участками молекул пептида являются критичными для образования тетрамеров; (¡у) Наиболее стабильными олигомерами являются тетрамеры пептида; (V) Наиболее энергетически выгодной последовательностью событий при фибриллогенезе пептида является последовательное образование ди-, тетра-, окта- и 16
мер о в. 16- меры пептида способны взаимодействовать, в основном, за счет гидрофобных Взаимодействий,
Фибриллогенез пептида Ю .При электронной микроскопии пептида, инкубировавшегося в течение суток в условиях для фибриллогенеза, было выявлено, что на углеродной подложке сорбировались притофиламенты толщиной около 10 им (рисунок 13).
Рисунок Е 3. Результаты элеюронной микроскопии образцов, содержащих пептид ГО. Дайна белого прямоугольника п левом углу соответствует 200eim.
Также наличие фибрилл было подтверждено с помощью АСМ. Наблюдаемая толщина протофиламентов совпала с толщиной фибриллярных струпур, образование которых было предсказано в экспериментах in si/ico.
Устойчивый к SDS влагомеры в составе фиприлл пептида IÜ. Для выявления олигомеров, являющихся элементарными структурными единицами фибрилл, был проведен денатурирующий электрофорез проб, содержащих фибриллы пептида. Наблюдались мажорные зоны, соответствующие по электрофоре™ чес кой подвижности 7-7.5 кДа (рисунок 14). Кроме того, наблюдались минорные зоны, соответствующие большему молекулярном« весу. 11оложение минорных зон варьировало в зависимости от срока фибриллогенеза.
Рисунок 14, Электрофоретичсское разделение компонентов фиГфилл пептнди ID I, присутствии SRkS. Mil дорожке 1 - коммерческий маркер SIGMA,. Молекулярные массы, соответствующие зонам на дорожке 3, вычислены с помощью программы Total Labi20. Они соответствуют тетрамерам, 32, 40- и 47-мерам пептида.
2 3
Интересен тот факт, что в случае, когда предварительного кипячения пробы в SDS не производилось, наблюдалось уменьшение интенсивности зоны, соответствующей тетрамерам Это свидетельствует в пользу того, что SDS способствует диссоциации фибрилл, образованных пептидом, на низкомолекулярные составляющие, способные входить в ПААГ При кипячении пробы с формамидом не выявлялись зоны, соответствующие молекулярной массе порядка 7 кДа, но наблюдалось появление зоны, соответствующей молекулярной массе 2 кДа, что соответствует молекулярной массе мономера пептида (данные не показаны) Устойчивость компонентов амилоидных фибрилл к кипячению с SDS обсуждается в работе (Ventura, 2005) как свойство, характерное именно для аномальных фибриллярных агрегатов В работе (Крындушкии и др, 2002) при изучении прионного белка дрожжей было показано, что под воздействием SDS агрегаты, образующихся при его фибриллогенезе, распадаются на олигомеры, состоящие в среднем из 4-20 молекул Sup35 Наличие устойчивых к SDS тетрамеров свидетельствует о различии энергии взаимодействий, обусловливающих существование тетрамеров и олигомерных форм более высокого порядка Важно отметить, что в компьютерной модели в формировании тетрамеров пептида определяющим является взаимодействие между N- и С-концевыми зеркально-симметричными участками пептида, что косвенно свидетельствует в пользу роли ЗСМ на начальных этапах фибриллогенеза Влияние пептида 1D па фибриллогепез АЛ Для проверки соответствия амилоидогенных детерминант альфа-лактальбумина и пептида ID были проведены эксперименты по индукции фибриллогенеза альфа-лактальбумина фибриллами этого пептида
В предварительных экспериментах было показано, что инкубация альфа-лактальбумина в концентрации 7 мг/мл в PBS-буфере при 55°С не приводила ни к фибриллогенезу, ни к агрегации белка (данные не показаны) При добавлении 10 мкл водного раствора пептида ID в концентрации 3 мг/мл к 1 мл такого раствора через два часа инкубации при 55°С наблюдали возникновение опалесценции, что свидетельствовало об агрегации альфа-лактальбумина Такие агрегаты были способны увеличивать флюоресценцию тиофлавина Т, что указывало на способность пептида индуцировать фибриллогенез и, следовательно, на наличие в его структуре фибриллогенных детерминант альфа-лактальбумина Однако наблюдаемая величина флюоресценции была в 30 раз ниже, чем величина флюоресценции, вызываемой фибриллами, образовавшимися из альфа-лактальбумина в той же концентрации в условиях для фибриллогенеза Это отличие могло быть связано как с разницей в количестве фибрилл, так и с разницей в их структуре Для изучения структуры агрегатов мы провели атомную силовую микроскопию образцов лактальбумина, подвергшегося инкубации при 55°С в присутствие пептида ID Наблюдали как протяженные фибриллярные
агрегаты, так и сеть коротких фибриллярных агрегатов (рисунок 15), напоминающих центры роста фибрилл.
Рисунок ¡5. Сеть коротких фибриллярных агрегатов, наблюдавшаяся н пробе лактапъбумниа, подвергшегося инкубации при 55"С в присутствие пептида ГО.
Для изучения обусловливающих агрегацйК) взаимодействий пептиды Ш и альфа-лактальбумина мы провели гель-фильтрацию супернатанта, полученного после центрифугирования раствора лактальбумина, подвергшегося инкубации при 55°С в присутствие пептида в течение суток. Положение пика при гель-фильтрации образца совпадало с положением пика миоглобина лошади (18 к Да), испол ьзова вше гося для калибровки колонки. При этом полностью исчезал пик, соответствующий мономеру альфа-лактальбумина (14.2 к Да) (рисунок 16). Молекулярная масса 18 кДа соответствует комплексу молекулы альфа-лактальбуминас двумя молекулами пептида.
Рисунок 16. ХромаТограммя гель-фил ьтрашш ал ьфа-лактальбумина (прерыпнетая .мшнп) н ял ьфа-лактальбумина, инкубировавшегося с пептидом ГО (сплошная линия).
По литературным данным (Хп е! а!., 2005), димер альфа-лактальбумина быка является минимальной префибриллярной формой этого белка. Обладающей цитотоксическим действием. Способность двух молекул пептида Ш образовывать комплекс с молекулой альфа-лактальбумина позволяет предположить возможность создания ингибитора токсичности префибриллярных форм альфа-лактальбумина на основе пептида Ш.
■ И
Механизм участия зеркально-симметричного пептида в фибриллогенезе лизоцима. Мотив зеркальной симметрии в последовательности лизоцима Поиск мотивов зеркальной симметрии в последовательности лизоцима куриного яйца привел нас к обнаружению такого мотива в бета-домене этого белка (рисунок 17)
1.У?._(1-С_ 39_ЫТаАТЫКНТОСБТОУС1Ь01И_5 8
ЪУ2_С-И_ 58_ЫЮ1ЛСУОТ5СОТШНТАОТЫ_3 9
Рисунок 17 Располо<ксние зеркалыю-снмметрнчного мотива в бета-домене лизоцима
Гипотеза о роли симметрии в фибриллогенезе протяженных пептидов В настоящее время единственным протяженным (более 15 ао) пептидом, для которого известна пространственная структура в составе фибрилл, является бета-амилоидный пептид На рисунке 18 представлены структуры протяженных фибриллогенных пептидов в составе лизоцима фага Т4 и лизоцима куриного яйца, а также структура симметричного фрагмента 35-51 из лактальбумина Интересно, что и эти фрагменты в составе белка, и бета-амилоидный пептид в составе фибрилл представляют собой структуру типа шпильки, причем между половинами зеркально-симметричных мотивов располагается бета-изгиб А В С
I О
Рисунок 18 Структура фибриллогенных пептидов в составе лизоцима куриного яйца (А) и фага Т4 (В) и структура симметричного фрагмента 35-51 в составе альфа-лактальбумина (С)
Темным обозначены бета-изгибы
Мы предложили гипотезу о роли протяженных зеркально-симметричных мотивов, образующих структуры типа шпильки, в фибриллогенезе На рисунке 19 представлена предполагаемая схема такого участия Данные, полученные ЬиЬгв и соавторами (¿»/¡га е/ аI, 2005) относительно структуры бета-амилоидного пептида в составе фибрилл, согласуются с этой гипотезой
На основании этой гипотезы мы предложили структуру пептида, потенциально способного влиять на фибриллогенез лизоцима куриного яйца Пептид представляет собой половину симметричного мотива и, согласно нашей гипотезе, способен конкурировать с молекулой лизоцима за место присоединения следующего мономера при образовании олигомерных предшественников фибрилл (рис 20)
1 .Общая структура зеркалыго-снмметрнчиых мотивов.
I..............."............."
'бель ^лю'
определенное число йм1И10кисл0Тных остатков
I »'^»сУн'Лс^КчяиЦщ»
♦Ам( «А*
п,т.кЛ -число аминокислотных остатков, способное обеенечикать необходимую взаимную ориентацию боковых ценен аминокислотных остатков; а составе участка I - последовательность аминокислотных остатков, склонная к образованию бега-изгиба; А,13 -произвольные аминокислотные остатки; А",В1- аминокислотные остатки, боковые цени которых способны взаимодействовать с боковыми пенями остатков А и В соответственно. Обозначенные серым шрифтом аминокислотные остатки мот>т быть идентичными или сходными но свойствам с остатками слева от центра симметрии.
2. Внутри молекулярные взаимодействия, обусловливающие структуру мотива.
черным - внутримолекулярные.
В случае участия зеркально-симмеричных мотивов в фибриллогенезе такое взаимодействие может препятствовать образованию обычных прсфибриллярных форм, обладающих цитотоксичсским действием. Нашей задачей являлось исследовать влияние пептида, являющегося половиной зеркально-симметричного мотива, на фибриллогенез лизоцима. Изучение влиянии пептида NTQATNRNII) (HALF) на фибриллогенез лизоцима куриного ийиа. Для исследования роли зеркально-симметричного мотива лизоцима на начальных этапах фибриллогенеза, мы провели инкубацию лизоцима в минимальной фибриллоген ной концентрации совместно с десятикратным мольным избытком пептида HALF Являющимся половиной зеркально-симметричной структуры в последовательности этого белка. Инкубацию проводили в течение времени, недостаточного для образования фибрилл (около 2 часов). В качестве контроля использовали такую же пробу без добавления пептида. Результаты электрофореза в кислых условиях представлены на рисунке 23. Различие электрофоретичёской подвижности образцов свидетельствует в пользу образования комплекса между ли зоц им ом и пептидом.
I 2 3
■ .
■■ -ЧЫ:.
Рисунок 21. Результаты электрофореза в кислых условиях лизоцима, инкубировавшегося в условиях для фибри.1.1 огенеза в присутствие (дорожка Н >■ в отсутствие (дорожка 3) пептида MALF. На дорожку 2 был нанесен пептид в концентрации, присутствующей в пробе.
Допинг пептида и молекулы лизоцима. Для определения сайта присоединения пептида HALF к молекуле лизоцима, мы провели компьютерное моделирования взаимодействия лизоцима и пептида. Результаты моделирования свидетельствовали о том, что наиболее энергетически выгодным расположением молекулы пептида является расположение вблизи зеркально-симметричного мотива. Присоединение молекулы пептида приводило к возникновению стерн чес кого препятствия вблизи ферментативного центра белка (Филяипс, 1968). Мы сделали предположение, что в случае соответствия экспериментов in vitro и in sHico в присутствие пептида должно наблюдаться снижение ферментативной активности белка.
Влияние пептида HALF на ферментативную активность лизоцима. При проведении эксперимента по изучению влияния пептида на ферментативную активность лизоцима мы
наблюдали, что в присутствии десятикратною мольного избытка пептида снижается скорость гидролиза препарата стснок М.!шеих.. Результаты эксперимента представлены на рисунке 22, Факт снижения ферментативной активности лизоцима косвенно свидетельствует в пользу наличия способности такого пептида присоединяться к зеркально-симмстричнему участку молекулы лизоцима.
Рисунок 22. Влияние ПСПТИДВ HALF lia фгрмсн т 81 икну m активность липшими.
Изучение влияния пептида па фибриллогепез лизоцима В предварительных эксперимент« с использованием методов атомной силовой микроскопии и изучения флюоресценции тиофлавина Т мы установили, что пептид HALF не способен образовывать фибриллы. Па рисунке 25 (А) представлены результаты электронной микроскопии фибрилл лизоцима. Па рисунке 25 (В) представлены результаты электронной микроскопии фибрилл лизоцима, образовавшихся в присутствие 10 кратного мольного избытка (5 мг/мл) пептида. Пептид HALF в концентрации 5 мг/мл, инкубировавшийся в условиях для фибриллогенеза лизоцима, не был способен к образованию фибрилл (данные не представлены).
А В
Рисунок 23. Фибриллы, образовавшиеся в отсутствие (А) и в присутствие (В) пептида. Длина серого прямоугольника соответствует 0.7 мкм.
Диаметр фибрилл, образовавшихся в присутствии пептида (около 10 нм), не отличался от диаметра фибрилл контрольного образца. Это свидетельствует о сходстве олигомерных
структур, образующих фибриллы в присутствие и отсутствие пептида Однако наблюдались отличия в плотности расположения фибрилл на подложке (10±5 мкм2 в контрольном образце и 30±10 мкм2 в присутствие пептида) и в средней длине фибрилл (700±100 им в контрольном образце, 300±50 нм в присутствие пептида) Важно отметить, что при электронной микроскопии фибрилл лизоцима, образовавшихся в отсутствие пептида, не наблюдали структур, сходных с представленными на рис 25 (В) Это свидетельствует о том, что наблюдаемые морфологические отличия не связаны с неравномерностью сорбции образцов на поверхность подложки Фибриллогенез лизоцима в исследованных образцах происходил в условиях, отличающихся только наличием или отсутствием пептида Образцы для микроскопии готовились одновременно идентичным способом Наблюдаемые отличия сохранялись при повторном проведении эксперимента, поэтому, исходя из полученных результатов, можно сделать вывод о наличии влияния пептида NTQATNRNTD на образование фибрилл лизоцима Такой пептид может быть использован в качестве основы для разработки эффективного ингибитора фибриллогенеза этого белка
Заключение Поиск ЗСМ в последовательностях модельных белков альфа-лактальбумина человека и лизоцима куриного яйца позволил определить участки, являющиеся потенциальными фибриллогенными детерминантами этих белков Пептид GYDTQAIVENNESTEYG (WT), содержащий ЗСМ АЛ человека и GYDTQTVVNNNGHTDYG (ID), содержащий основные элементы ЗСМ этого белка, способны к фибриллогенезу Пептиде WT и ID способны индуцировать фибриллогенез АЛ При индукции фибриллогенеза АЛ пептидом ID комплексы АЛ с пептидом отличаются от описанных в литературе токсичных префибриллярных олигомеров альфа-лактальбумина Пептид NTQATNRNTD (HALF), являющийся половиной ЗСМ лизоцима, способен связываться с этим белком и влияет на его фибриллогенез Таким образом, ЗСМ в последовательностях альфа-лактальбумина и лизоцима играют роль в фибриллогенезе этих белков Воздействие на ЗСМ с помощью пептидов является перспективной стратегией борьбы с образованием токсичных олигомеров белков, возникающих в процессе фибриллогенеза
ВЫВОДЫ
1 При компьютерном анализе первичной структуры семи известных фибриллогенных пептидов обнаружены зеркально-симметричные мотивы
2 Зеркально-симметричный мотив в последовательности альфа-лактальбумина человека (GYDTQAIVENNESTEYG) содержит фибриллогенную детерминанту этого белка
3 Зеркально-симметричный пептид ID (GYDTQTVVNNNGHTDYG), гомологичный зеркально-симметричному мотиву в последовательности альфа-лактальбумина человека, способен к фибриллогенезу Фибриллогенные свойства пептида ID охарактеризованы в экспериментах in vitro и т silico
4 Пептид ID способен индуцировать фибриллогенез альфа-лактальбумина человека Он связывается с альфа-лактальбумином в соотношении 2 1
5 Постулирован механизм участия зеркально-симметричных мотивов в фибриллогенезе В соответствии с этим рассчитан и синтезирован пептид, идентичный фрагменту бета-домена лизоцима Показано влияние такого пептида на морфологию фибрилл лизоцима
ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1 Егоров В.В , Гармай Ю П , Соловьев К В , Грудинина Н А , Алейникова Т Д , Сироткин А К, Киселев О И , Шавловский М М Амилоидогенный пептид, гомологичный участку бета-домена альфа-лактальбуминов// ДАН 414(6) 828-830, 2007,
2 Egorov V V , Solovyov К V , Grudinina N А , Lebedev D V , Isaev-Ivanov V V , Kiselev О I, Shawlovsky M M Atomic force microscopy study of peptides homologous to beta-domain of alpha-Iactalbumins // Protein and peptide letters 14(5) 411-414, 2007 ,
3 Соловьев К В , Гастева А А , Егоров В В, Алейникова Т Д , Сироткин А К , Шварцман A JI, Шавловский М М Роль С-концевого фрагмента трантиретина человека в аномальном фибриллогенезе // Биохимия 71(5) 672 - 680, 2006,
4. Егоров В В, Грудинина Н А, Соловьев К В Влияние пептида NTQATNRNTD на аномальный фибриллогенез лизоцима // Исследовано в России, 9 2475-2481, http //zhurnal аре relarn ru/articles/2006/256 pdf, 2006,
5 Egorov V.V. Possible influence of oleic acid on fibnllogenesis of lysozyme // ESIIG Amsterdam, The Netherlands, May 6-9, 2006, European Journal of Human Genetics vol 14, suppl 1, p 236, 2006,
6 Egorov V.V, Solovyov К V Peculiarities of fibrillogenic proteins primary structure // ESHG Prague, Czech Republic, May 7-10, 2005, p 278, 2005,
7 Егоров В В, Брилинская Е С , Гармай Ю П , Моделирование m silico начальных стадий фибриллогенеза зеркально-симметричного пептида // тезисы доклада, Человек и его здоровье, Девятая Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей, СПб, с 107, 2006,
8 Егоров В.В Самокомплементарные мотивы в амилоидогенных белках // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины, Сборник тезисов научно-практической конференции молодых ученых, СПб, Издательский дом МАПО, с 391, 2005,
9 Егоров В В Симметричные аминокислотные последовательности и фибриллогенез // Вестник молодых ученых, Всероссийская конференция молодых исследователей 14-16 апреля 2005 года, Сборник материалов, СПб, с 37,2005,
10 Егоров В.В. Особенности первичной структуры амилоидогенных белков // тезисы доклада, 9-я пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века" 18-22 апреля
2005, с 18,2005,
11 Егоров В В Моделирование фибриллогенеза белков И тезисы доклада, 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века" 17-21 апреля 2006, с 17,
2006,
12 Гармай ЮП, Егоров В В Поиск симметричных мотивов в амилоидогенных белках // Материалы межвузовской научной конференции "XXXIV неделя науки СПбГТУ", СПб, изд-воСПбГТУ, с 5,2005
Лицензия ЛР №020593 от 07 08 97
Подписано в печать 08 06 2007 Формат 60x84/16 Печать цифровая Уел печ л 1,0 Тираж 100 Заказ 1701Ь
Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул , 29 Тел 550-40-14 Тел /факс 297-57-76
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Егоров, Владимир Валерьевич
ВВЕДЕНИЕ.
1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Амилоидозы
1.2. Распространенные формы амилоидозов
1.2.1. Амилоидозы, связанные с фибриллогенезом бета- амилоидного пептида (АЕНа).
1.2.2. Амилоидозы, связанные с фибриллогенезом транстиретина (АТТЯ).
1.2.3. Прионные заболевания (АРгР).
1.2.4. Амилоидоз, связанный с фибриллогенезом амилина (А1АРР)
1.2.5. Амилоидоз при болезни Паркинсона (АБуп).
1.3. Молекулярные механизмы дегенеративных процессов при амилоидозах.
1.3.1. Роль префибриллярных форм белков в патогенезе амилоидозов.
1.3.2. Роль фибрилл в патогенезе амилоидозов.
1.4. Морфология фибрилл.
1.4.1. Протофиламенты и фибриллы.
1.4.2.Сферулиты.
1.5. Связывание с красителями.
1.5.1. Конго красный.
1.5.2. Тиофлавин Т.
1.6. Образование фибрилл. 26 1.6.1 .Основные этапы фибриллогенеза. 26 1.6.2. Факторы, влияющие на фибриллогенез.
1.7. Фолдинг и фибриллогенез. 32 1.7.1. Аминокислотные замены, вызывающие изменения конформации белка.
1.7.2. Расплавленная глобула и фибриллогенез.
1.8.Ингибиторы фибриллогенеза.
1.8.1. Химические шапероны
1.8.2.Химические ингибиторы.
1.8.3.Пептидные ингибиторы.
1.9. Альфа-лактальбумин и лизоцим как модельные белки.
1.9.1. Лизоцим.
1.9.2. Альфа-лактальбумин.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурные предпосылки амилоидогенности модельных белков"
Актуальность проблемы. Конформационные заболевания - это группа заболеваний, при которых нарушение нормальных физиологических и появление аномальных свойств белков связаны с изменением их пространственной структуры (Merlini, Belotti, 2003). Значительная часть конформационных болезней представляет собой различные типы амилоидозов. Возникновение амилоидозов связано с накоплением в различных органах и тканях нерастворимых фибриллярных форм белков. К амилоидозам относятся такие известные заболевания как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, прионные заболевания. При диабете типа 2 образование амилоида также является одним из звеньев патогенеза (Покровский и др., 2004).
Амилоидозы являются довольно распространенной группой заболеваний. Так, например, в настоящее время, болезнь Альцгеймера обнаружена у 12 млн. людей по всему миру (Merlini, Belotti, 2003). По различным данным, амилоидоз мозга гистохимически выявляется у 30-46% психически здоровых людей в возрасте старше 60 лет и у 80-100% людей старше 85 лет (Ойфа, 1987; Merlini, Belotti, 2003).
Несмотря на существенный прогресс в понимании механизмов формирования амилоидных отложений, до сих пор не существует эффективных средств для лечения амилоидозов. (Jakobson, 2004). Широкая распространенность этой группы заболеваний позволяет рассматривать проблему поиска ингибиторов фибриллогенеза как достаточно актуальную.
Кроме того, изучение аномального фибриллогенеза является важным для разработки новых наноматериалов на основе аномальных фибрилл (Mitraki et al., 2005; Velikov, 2005).
Цели исследования. Основной целью данной работы являлось изучение молекулярных механизмов аномального фибриллогенеза и разработка подходов для подавления амилоидогенности модельных белков.
Задачи исследования.
1. Провести анализ первичной структуры известных фибриллогенных пептидов in silico. Выявить закономерности первичной структуры, характерные для этой группы полипептидов.
2. Определить структуру потенциальных фибриллогенных детерминант модельных белков альфа-лактальбумина и лизоцима.
3. Рассчитать строение и синтезировать пептиды, содержащие потенциальную фибриллогенную детерминанту альфа-лактальбумина человека. Изучить фибриллогенные свойства такого пептида in silico и in vitro. Изучить влияние такого пептида на фибриллогенез альфа-лактальбумина.
4. Установить возможный механизм участия потенциальных амилоидогенных детерминант в фибриллогенезе.
5. Рассчитать строение и синтезировать пептид, потенциально способный влиять на фибриллогенез лизоцима куриного яйца. Экспериментально изучить его влияние на фибриллогенез этого белка.
Научная новизна полученных результатов. При анализе первичной структуры фибриллогенных пептидов впервые обнаружено наличие зеркально-симметричных мотивов. Предложен и синтезирован способный к фибриллогенезу пептид, гомологичный фрагменту альфа-лактальбуминов. С помощью компьютерного моделирования и изучения свойств фибрилл такого пептида охарактеризован механизм его фибриллогенеза. Показано влияние такого пептида на фибриллогенез альфа-лактальбумина. Установлена роль последовательности 35-51 а.о. в фибриллогенезе этого белка. Предложена стратегия для ингибирования образования префибриллярных форм белков. Установлен потенциальный механизм участия зеркально-симметричных мотивов в фибриллогенезе. На основании такого механизма рассчитан и синтезирован пептид, идентичный участку последовательности лизоцима и способный оказывать влияние на фибриллогенез этого белка.
Научная и практическая значимость работы. Полученные результаты позволяют расширить представления о мотивах, участвующих в белок-белковых взаимодействиях, и предложить стратегию для создания пептидов, способных влиять на аномальный фибриллогенез белков. Такие пептиды могут послужить основой для создания терапевтических средств для борьбы с амилоидозами. Кроме того, полученные данные и разработанные методы моделирования in silico могут быть использованы для создания наноматериалов на основе фибриллогенных пептидов.
Основные положения, выносимые на защиту:
1.В последовательностях модельных белков альфа-лактальбумина и лизоцима существуют зеркально-симметричные мотивы.
2.Пептид GYDTQAIVENNESTEYG, содержащий зеркально-симметричный мотив и совпадающий по первичной структуре с участком 35-51 а.о. бета-домена альфа-лактальбумина, содержит фибриллогенную детерминанту этого белка.
3.Пептид GYDTQTVVNNNGHTDYG, гомологичный зеркально-симметричному мотиву альфа-лактальбумина, также содержит фибриллогенную детерминанту этого белка и способен связываться с ним в соотношении 2:1.
4.Результаты компьютерного моделирования фибриллогенеза пептида GYDTQTVVNNNGHTDYG, подтверждены в экспериментах in vitro.
5.Постулирован механизм участия зеркально-симметричных мотивов в фибриллогенезе белков. На основании такого механизма рассчитан пептид, способный влиять на аномальный фибриллогенез лизоцима.
Апробация результатов работы. Основные положения работы были представлены на 9-й и 10-й Пущинских международных школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2005, 2006), на международных конференциях European Society of Human Genetics (Prague, Czech Republic, 2005, Amsterdam, The Netherlands, 2006), на 8- и 9-й Всероссийских медико-биологических конференциях молодых исследователей
Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2005, 2006) на научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2005), на межвузовской научной конференции "XXXIV неделя науки СПбГТУ" (Санкт-Петербург, 2005), а также на конференции, посвященной 115-летию ГУ НИИЭМ РАМН (Санкт-Петербург, 2005).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 2 статьи и 7 тезисов докладов на Всероссийских и Международных конференциях.
Личный вклад соискателя. Соискателем были проведены: анализ литературы по теме исследования, планирование экспериментов, получение основной части результатов, написание статей и подготовка докладов на конференциях. Выделение и очистка белка, используемого в работе, получение фибрилл, подготовка образцов для электронной микроскопии, модификация существующих методов для атомной силовой микроскопии образцов, оптимизация условий для флуоресцентного анализа, электрофоретическое и хроматографическое разделение олигомерных форм белков. Также соискателем была осуществлена разработка алгоритмов оригинальных компьютерных программ, использованных в работе. Отработка алгоритмов и написание программ осуществлялись студентом Кафедры биофизики СПбГПУ Гармаем Ю.П. Электронная микроскопия проводилась в Лаборатории патоморфологии вирусных инфекций ГУ НИИ гриппа РАМН под руководством к.б.н. Сироткина А.К. и в Ботаническом институте РАН. Атомная силовая микроскопия осуществлялась в Лаборатории биофизики макромолекул ОМРБ ПИЯФ РАН под руководством к.ф-м.н. Лебедева Д.В. Измерение спектров флуоресценции осуществлялось в ИВС РАН под руководством д.ф-м.н Паутова В.Д., в Отделе биохимии НИИЭМ РАМН под руководством Лозовского В.Т., а также в ИНЦ РАН под руководством д.ф-м.н. Туроверова К. К. Измерение ферментативной активности лизоцима проводилось в Отделе общей патологии ГУ НИИЭМ РАМН под руководством к.б.н. Берлова М.Н.
Структура диссертации. Диссертация построена по традиционной схеме и содержит разделы «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список цитируемой литературы», включающий 120 иностранных и 18 отечественных источников. Диссертация изложена на 106 стр. Результаты представлены в 1 таблице и иллюстрированы 45 рисунками.
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Егоров, Владимир Валерьевич
выводы
1. При компьютерном анализе первичной структуры семи известных фибриллогенных пептидов обнаружены зеркально-симметричные мотивы.
2. Зеркально-симметричный мотив в последовательности альфа-лактальбумина человека (GYDTQAIVENNESTEYG) содержит фибриллогенную детерминанту этого белка.
3. Зеркально-симметричный пептид ID (GYDTQTVVNNNGHTDYG), гомологичный зеркально-симметричному мотиву в последовательности альфа-лактальбумина человека, способен к фибриллогенезу. Фибриллогенные свойства пептида ID охарактеризованы в экспериментах in vitro и in silico.
4. Пептид ID способен индуцировать фибриллогенез альфа-лактальбумина человека. Он связывается с альфа-лактальбумином в соотношении 2:1.
5. Постулирован механизм участия зеркально-симметричных мотивов в фибриллогенезе. В соответствии с этим рассчитан и синтезирован пептид, идентичный фрагменту бета-домена лизоцима. Показано влияние такого пептида на морфологию фибрилл лизоцима.
3.7. Заключение.
Поиск ЗСМ в последовательностях модельных белков альфа-лактальбумина человека и лизоцима куриного яйца позволил определить участки, являющиеся потенциальными фибриллогенными детерминантами этих белков. Пептид GYDTQAIVENNESTEYG (WT), содержащий ЗСМ АЛ человека и GYDTQTVVNNNGHTDYG (ID), содержащий основные элементы ЗСМ этого белка, способны к фибриллогенезу. ПептидБ WT и ID способны индуцировать фибриллогенез АЛ. При индукции фибриллогенеза АЛ пептидом ID комплексы АЛ с пептидом отличаются от описанных в литературе токсичных префибриллярных олигомеров альфа-лактальбумина. Пептид NTQATNRNTD (HALF), являющийся половиной ЗСМ лизоцима, способен связываться с этим белком и влияет на его фибриллогенез. Таким образом, ЗСМ в последовательностях альфа-лактальбумина и лизоцима играют роль в фибриллогенезе этих белков. Воздействие на ЗСМ с помощью пептидов является перспективной стратегией борьбы с образованием токсичных олигомеров белков, возникающих в процессе фибриллогенеза.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Егоров, Владимир Валерьевич, Санкт-Петербург
1. Гармай Ю.П., Егоров В.В. Поиск симметричных мотивов в амилоидогенных белках // Материалы межвузовской научной конференции "XXXIV неделя науки СПбГТУ", СПб, изд-во СПбГТУ, с. 5, 2005;
2. Гилъманшин Р.И., Долгих Д.А., Птицын О.Б., Финкельштейн A.B., Шахнович Е.И. Белковые глобулы без уникальной пространственной структуры: экспериментальные данные для а-лактальбуминов и общая модель // Биофизика, 27(6): 1005-1015,1982;
3. Егоров В.В. Особенности первичной структуры амилоидогенных белков // тезисы доклада, 9-я пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология наука XXI века" 18-22 апреля 2005, с. 18,20056;
4. Егоров В.В. Симметричные аминокислотные последовательности и фибриллогенез // Вестник молодых ученых, Всероссийская конференция молодых исследователей 14-16 апреля 2005 года, Сборник материалов, СПб, с. 37,2005в;
5. Егоров В.В. Самокомплементарные мотивы в амилоидогенных белках // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины, Сборник тезисов к научно-практической конференции молодых ученых, СПб, Издательский дом МАПО, с. 391,2005г;
6. Егоров В.В. Моделирование фибриллогенеза белков // тезисы доклада, 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология наука XXI века" 17-21 апреля 2006, с. 17,2006а;
7. Егоров В.В., Грудинина H.A., Соловьев К.В. Влияние пептида NTQATNRNTD на аномальный фибриллогенез лизоцима // Исследовано в России, 9:2475-2481, http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2006/256.pdfZ006. 2006в;
8. Инге-Вечтомов С.Г. Прионы дрожжей и центральная догма молекулярной биологии // Вестник Российской Академии наук, 70(4), 2000;
9. И. Крындушкин Д. ,Александров И ,Тер-Аванесян М., Кушниров В. Новый метод анализа структуры прионных агрегатов в дрожжах Saccaromyces cerevisiae // тезисы доклада, III Конгресс Российского Биохимического Общества, Симпозиум XI, СПб., с. 496, 2002;
10. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия // М.: Мир, 481 с., 1969;
11. Маскевич A.A., Легеда М.В., Туроверов К.К., Кузнецова И.М. Флуоресцентные свойства тиофлавина Т при его встраивании в у-циклодекстрин // Сборник: Молекулярные мембранные и клеточные основы функционирования биоситем, 2:30-32, 2004;
12. Маурер, Г. Диск-электрофорез // М.: Мир. с. 60-61,1971;
13. Ойфа A.M. Сенильный церебральный амилоидоз // М.: Медицина, 192 е., 1987;
14. Покровский В.И., Киселев О.И., Черкасский Б.Л. Прионы и прионные болезни // М.¡Издательство РАМН, 384 е., 2004;
15. Соловьев К.В., Гастева A.A., Егоров В.В.Алейникова Т.Д., Сироткин А.К., Шварщан А.Л., Шавловский М.М. Роль С-концевого фрагмента трантиретина человека в аномальном фибриллогенезе // Биохимия 71(5): 672 680, 2006;
16. Туроверов К.К, Бушмарина H.A., Малова Л.Н., Кузнецова И.М. Собственная УФ-флуоресценция лизоцима и особенности микроокружения его триптофановых остатков // Биофизика 46(6):978-987, 2001;
17. Филлипс, Д. Трехмерная структура молекулы фермента // Молекулы и клетки, 3:9-28,1968;
18. Фижелыитейн А.В., Птицын О.Б. Физика белка (курс лекций) // М.: Книжный дом "Университет", 480 е., 2002;
19. Шпаков А. О. Внутренняя симметрия и повторяющиеся последовательности в первичной структуре IRS-белков, эндогенных субстратов рецептора инсулина//Цитология, 40(2/3):210-220, 1998.22.
20. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer А.А., Zhang J., Zhang Z, Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Res., 25:3389-3402,1997;
21. Arnaudov L.N., de Vries R. Thermally induced fibrillar aggregation of hen egg white lysozyme // Biophysical J., 88:515-526, 2005;
22. Azriel R., Gazii E. Analysis of the minimal amyloid-forming fragment of the islet" amyloid polypeptide // The J. Of Biological Chemistry, 276(36):34156-34161, 2001;
23. Bernier V., Lagace M., Bichet D.G., Bouvier M. Pharmacological chaperones: potential treatment for conformational diseases// TRENDS In Endocrinology and Metabolism// 15(5):222-227, 2004;
24. Bitan G., Vollers S., Teplow D.B. Elucidation of primary structure elements controlling early amyloid р-protein oligomerization // The J. Of Biological Chemistry, 278(37):34882-34889, 2003;
25. Bromley E.H.C., Krebs M.R.H., Donald A.M. Aggregation across the length-scales in p-lactoglobulin // Faraday Discuss, 128:13-27, 2005;
26. Bucciantini M., Galloni G., Chiti F., Formigli L., Nosi D., Dobson C.M., Stefani M. Prefibrillar amyloid protein aggregates share common features of cytotoxicity //The J. Of Biological Chemistry, 279(3 0) :313 74-31382, 2004;
27. Cao A., Hu D., Lai L. Formation of amyloid fibrils from fully reduced hen egg white lysozyme //Protein Science, 13:319-324,2004;
28. Carulla N. Caddy G.L., Hall D.R., Zurdo J., Gairi M., Feliz M, Giralt E„ Robinson C.V., Dobson C.M. Molecular recycling within amyloid fibrils // Nature, 436:554-558, 2005;
29. Cawthern K.M., Narayan M., Chaudhuri D., Permyakov E.A., Berliner L.J. Interactions of a-lactalbumin with fatty acids and spin label analogs // The J. Of Biological Chemistry, 272(49):30812-30816,1997;
30. Chamberlain A.K., MacPhee C.E., Zurdo J., Morozova-Roche L.A., Hill H.A.O., Dobson C.M., Davis J.J. Ultrastructural organization of amyloid fibrils by atomic force microscopy // Biophysical J., 79:3282-3293, 2000;
31. Chang M.H.Y., Hua C.T., Isaac E.L., Litjens T., Hodge G., Karageorgos L.E., Meikle P.J. Transthyretin interacts with lysosome-assosiated membrane protein (LAMP-1) in circulation // Biochem. J., 382:481-489, 2004;
32. Demuro A., Mina E., Kayed R., Milton S.C., Parker /., Glabe C.G. Calcium dysregulation and membrane disruption as a ubiquitous neurotoxic mechanism of soluble amyloid oligomers // The J. Of Biological Chemistry, 280(17): 1729417300, 2005;
33. Desnick R.J. Enzyme replacement and enhancement therapies for lysosomal diseases // J. Inherit. Metab. Dis., 27:385-410,2004;
34. Dobson C.M. Protein misfolding, evolution and disease // TIBS, 24:329-332, 1999;
35. Duringer С., Hamiche A., Gustafsson L„ Kimura H„ Svanborg C. HAMLET interacts with histones and chromatin in tumor cell nuclei // The J. Of Biological Chemistry, 278(43):42131-42135, 2003;
36. Egorov V.V., Solovyov K.V. Peculiarities of fibrillogenic proteins primary structure // ESHG Prague, Czech Republic, May 7-10, 2005, p.278, 2005a;
37. ERMM. Expert rewievs in molecular medicine, Features of amyloid fibrils. http://www.expertrewievs.com;
38. Gaeta A., Hider R.C. The crucial role of metal ions in neurodegeneration: the basis for a promising therapeutic strategy // British J. of Pharmacology, 146:1041-1059, 2005;
39. Gasset M., Baldwin M., Lloyd D., Gabriel J., Holtzman D., Cohen F., Fletterick R., Prusiner S. Predicted a-helical regions of the prion protein when synthesized as peptides form amyloid // PNAS, 89:10940-10944, 1992;
40. Ghanta J., Shen C.-L., Kiessling L.L., Murphy R.M. A strategy for designing inhibitors of p-amyloid toxicity // The J. of Biological Chemistry, 271(47):29525-29528, 1996;
41. Gibson T.J., Murphy R.M. Inhibition of insulin fibrillogenesis with targeted peptides // Protein Sci., 15(5): 1133-41,2006;
42. Goers J., Permyakov S.E., Uversky V.N., FinkA.L. Conformational prerequisites for a-lactalbumin fibrillation // Biochemistry, 41:12546-12551,2002;
43. Grobler J.A., Rao K.R., Brew K. Sequences of two highly divergent canine type с lysozymes: implications the evolutionary origins of the lysozyme/a-lactalbumin superfamily//Arch. Biochem. Biophys., 313(2):360-366, 1994;
44. GROMACS. Программа: http://www.gromacs.org/;
45. Hakansson A., Svensson M., Mossberg A.-K., Sabharwal H., Linse S., Lazou /., Lonnerdal В., Svanborg C. A folding variant of a-lactalbumin with bactericidal activity against Streptococcus pneumoniae II Molecular Microbiology, 35(3):589-600, 2000;
46. Hall D., Hirota N., Dobson CM. A toy model for predicting the rate of amyloid formation from unfolded protein // J. Mol. Biol., 195:195-205, 2005;
47. Hamada D., Dobson CM. A kinetic study of (3-lactoglobulin amyloid fibril formation promoted by urea // Protein Science, 11:2417-2426,2002;
48. Hammarstorm P., Persson M, Freskgard P.-O., Martensson L.-G., Andersson D., Jonsson B.-H., Carlsson U. Structural mapping of an aggregation nucleation site in a molten globe intermediate // The J. of Biological Chemistry, 274(46): 32897-32903,1999;
49. Hamodrakas S.J., Hoenger A., Iconomidou V.A. Amyloid fibrillogenesis of silkmoth chorion protein peptide-analogues via a liquid-crystalline intermediate phase // J. Of Structural Biology, 145:226-235, 2004;
50. HEX http://www.csd.abdn.ac.uk/hex/;
51. Horwich A. Protein aggregation in disease: role for folding intermediates forming specific multimeric interactions // The J. of Clinical Investigations, 110(9): 1221-1232,2002;
52. Jakobson D.R. Amyloidosis, Overview // http://www.emedicine.com;
53. Jaroniec C.P., MacPhee C.E., Astrof N.S., Dobson CM., Griffin R.G. Molecular conformation of a peptide fragment of trasthyretin in an amoloid fibril // PNAS, 99(26): 16748-16753,2002;
54. Jarvis J.A., Craik D.J., Wilce M.C. X-ray diffraction studies of fibrils formed from peptide fragments of transthyretin // Biochem. Biophys Res. Commun., 192:991-998, 1993;
55. Jimenez J.L., Nettleton E.J., Bouchard M., Robinson C. V., Dobson C.M., Saibil H.R. The protofilament structure of insulin amyloid fibrils // PNAS, 99(14):9196-9201, 2002;
56. Kamatari Y., Yamada H., Akasaka K., Jones J., Dobson C., Smith L. Response of native and denatured hen lysozyme to high pressure studied by 15N/1H NMR spectroscopy // Eur. J. Biochem. 268:1782-1793, 2001;
57. Kim T.D., PaikS.R., Yang C.-H., Kim J. Structural changes in a-Synuclein affect its chaperone-like activity in vitro II Protein Science, 9:2489-2496,2000;
58. Kohler C, Gogvadze A., Hakansson A., Svanborg C., Orrenius S., Zhivotovsky B. A folding variant of human a-lactalbumin induces mitochondrial permeability transition in isolated mitochondria // Eur. J. Biochem., 268:186-191, 2001;
59. Koo E.H., Lansbury P.T., Kelly J.W. Amyloid diseases: Abnormal protein aggregation in neurodegeneration // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 96:9989-9990, 1999;
60. Krebs M.R.H., MacPhee C.E., Miller A.F., Dunlop I.E., Dobson C.M., Donald A.M. The formation of spherulites by amyloid fibrils of bovine insulin // PNAS, 101 (40): 14420-14424,2004a;
61. Krebs M.R.H., Morozova-Roche L.A., Daniel K, Robinson C. V., Dobson C.M. Observation of sequence specificity in the seeding of protein amyloid fibrils // Protein Science, 13:1933-1938,20046;
62. Krebs M.R.H., Bromley E.H.C., Donald AM The binding of thioflavin-T to amyloid fibrils: localization and implications // J. of Structural Biology, 149:30-37,2005a;
63. Krebs M.R.H., Bromley E.H.C., Rogers S.S., Donald A.M. The mechanism of amyloid speherulite formation by bovine insulin // Biophysical J., 88:2013-2021, 20056;
64. Kumagai /., Kuwajima K. Effects of amino acid substitutions in the hydrophobic core of a-lactalbumin on the stability of the molten globe state // Protein Eng., 8(11):1153-1161,1995;
65. Kuroki R., Taniyama Y., Seko C., Nakamura H., Kikuchi M., Ikehara M. Design• 2+ • •and creation of a Ca binding site in human lysozyme to enhance structural stability // Proc. Natl. Acad. Sci. USA Biochemistry, 86:6903-6907,1989;
66. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4// Nature, 227:680-685, 1970;
67. Lansbury P.T., Jr. Evolution of amyloid: What normal protein folding may tell us more about fibrillogenesis and disease // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:33423344, 1999;
68. Laureto P.P. de., Frare E., Battaglia F., Mossuto M.F., Uversky V.N., Fontana A. Protein dissection enhances the amyloidogenic properties of a-lactalbumin // FEBSJ., 272(9):2176,2005;
69. Legman G., Baskalov I. V., Nguyen H.-O. B., Riesner D., Cohen F.E., DeArmond S.J., Prusiner S.B. Synthetic Mammalian Prions // Science, 305:673-676, 2004;
70. LeVine H, III Thioflavine T interaction with synthetic Alzheimer's disease (3-amyloid peptides: detection of Amyloid aggregation in solution // Protein Science, 2:404-410,1993;
71. LeVine H., III. Thioflavin T interaction with amyloid (3-sheet structures // Amyloid: Int. J. Exp. Clin. Invest., 2:1-6, 1995;
72. Liu W., Prausnitz J.M., Blanch H. W. Amyloid fibril formation by peptide LYS (11-36) in aqueous trifluoroethanol // Biomacromolecules, 5:1818-1823, 2004;
73. Lomakin A., Teplow D.B., Kirschner D.A., Benedek G.B. Kinetic theory of fibrillogenesis of amyloid p-protein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:7942-7947, 1997;
74. Lopez de la Paz M., Goldie K., Zurdo J., Lacroix E., Dobson C.M., Hoenger A., Serrano L. De novo designed peptide-based amyloid fibrils // PNAS, 99(25): 16052-16057, 2002;
75. Luhrs T., Ritter C„ Adrian M, Riek-Loher D., Bohrmann B., Dobeli H., Schubert D., Riek R. 3D structure of Alzheimer's amyloid-beta(l- 42) fibrils // PNAS, 102(48): 17342-17347, 2005;
76. Makin O.S., Atkins E., Johanson J., Serpell L.C. Molecular basis for amyloid fibril formation and stability I I PNAS, 102(2):315-320, 2005;
77. MacPhee C.E., Dobson C.M. Chemical dissection and reassembly of amyloid fibrils formed by a peptide fragment of transtherytin I I J. Mol.Biol. 297:12031215,2000;
78. Massi F., Klimov D., Thirumalai D., Straub J.E. Charge states rather than propensity for (3-structure determine enhanced fibrillogenesis in wild-type Alzheimer's J3-amyloid peptide compared to E22Q Dutch mutant // Protein Science 11:1639-1647,2002;
79. McAllister C., Karymov M.A., Kawano Y., Lushnicov A.Y., Mikheikin A., Uversky V.N., Lyubchenko Y.L. Protein interactions and misfolding analyzed by AFM force spectroscopy I I J. Mol. Biol., 354(5): 1028-1042,2005;
80. Merlini G., Bellotti V. Molecular mechanisms of Amyloidosis // N. Engl. J. Med., 349:583-596,2003;
81. Merlini G., Belloti V. Lysozyme: a paradigmatic molecule for the investigation of protein structure, function and misfolding // Clin. Chim. Acta, 357(2): 168-172, 2005;
82. Mitraki A., van Raaij M.J. Folding of (3-structured fibrious proteins and self-assembling peptides // Proteins Nanotechnology, 300:125-140, 2005;
83. NCBI. База данных: http://www.ncbi.nih.gov/genbank;
84. Nelson R., Sawaya M, Balbimie M, Madsen O., Riekel C., Grothe R., Eisenberg D. Structure of the cross-b spine of amyloid-like fibrils // Nature, 435:doi:10.1038, 2005;
85. Nitta K., Sugai S. The evolution of lysozyme and a-lactalbumin // Eur. J. Biochem, 182(1): 111-118,1989;
86. Norstrom E.M., and Mastrianni J.A. The AGAAAAGA palindrome in PrP is required to generate a productive PrP Sc -PrP С complex that leads to prion propagation // The J. Of Biological Chemistry, 280(29):27236-27243,2005;
87. OMIMLYZ (Online Mendelian Inheritance in Men) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=l 53450;
88. OMIMTTR (Online Mendelian Inheritance in Men) http://www.ncbi.nlm.nih. gov/entrez/dispomim.cgi?id=l 76300;
89. Parry R. M., Jr, Chandan R. C., Shahani К. M. A rapid and sensitive assay of muramidase // Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 119:384-386,1965;
90. Permyakov E.A., Berliner L.J. a-lactalbumin: structure and function // FEBS Letters, 473:269-274,2000;
91. Prager E.M., Wilson A.C. Ancient origin of lactalbumin from lysozyme: analysis of DNA and amino acid sequences //J. Mol. Evol., 27(4):326-335,1988;
92. Quintas A., Vaz D.C., Cardoso I., Saraiva M.J.M., Brito R.M.M. Tetramer dissociation and monomer partial unfolding precedes protofibril formation in amyloidogenic transthyretin variants // The J. of Biological Chemistry, 276(29):27207-27213,2001;
93. Reixach N., Deechongkit S., Jiang X., Kelly J. W., Buxbaum J.N. Tissue damage in the amyloidoses: Transthyretin monomers and normative oligomers are the major cytotoxic species in tissue culture // PNAS, 101 (9):2817-2822,2004;
94. Ritchie D.W., Kemp G.J.L. Protein docking using spherical polar fourier correlations // PROTEINS: Struct. Funct. Genet., 9:178-194, 2000;
95. Ryadnov M.G., Woolfson D.N. Engeneering the morphology of a self-assembling protein fibre //Nature materials, 2:329, 2003;
96. Sakurai K, Oobatake M., Goto Y. Salt-dependent monomer-dimer equilibrium of bovine P-lactoglobulin at pH 3 // Protein Science, 10:2325-2335,2001;
97. Sedman V.L., Allen S., Chan W.C., Davies M.C., Roberts C.J., Tendier S.J.B., Williams P.M. Atomic Force microscopy of human amylin (20-29) fibrils // Protein and Peptide Letters, 12:79-83, 2005;
98. Selkoe D.J. Folding proteins in fatal ways // Nature, 426:900-904,2003;
99. Serpell L.C., Sunde M., Benson M.D., Tennent G.A., Pepys M.B., Fraser P.E. The protofilament substructure of amyloid fibrils // J. Mol. Biol. 300:1033-1039, 2000;
100. Shewale J.G., Sinha S.K., Brew К Evolution of a-lactalbumins // The J. Of Biological Chemistry, 259(8):4947-4956,1984;
101. Shucla U.J., Marino H., Huang P.-S., Mayo S.L., Love J.J. A designed protein interface that blocks fibril formation // J. Am. Chem. Soc., 126:13914-13915, 2004;
102. SMMP. Программа: http://www.phy.mtu.edufoiophys/smmpform.htm;
103. Sous a M.M., Cardoso I., Fernandes R., Guimaraes A., Saraiva M.J. Deposition of transthyretin in early stages of familial amyloidotic polyneuropathy. Evidence for toxicity of nonfibrillar aggregates // American J. of Pathology, 159(6): 19932000,2001;
104. Srisailam S., Kumar T.K.S., Rajalingam D., Kathir K.M., Sheu H.-S., Jan F.-J., Chao P.-C., Yu C. Amyloid-like fibril formation in an all ß-barrel protein // The J. of Biological Chemistry, 278(20):17701-17709, 2003;
105. Stopa В., Piekarska В., Konieczny L., Rybarska J., Spolnic P., Zemanec G., Roterman I., Krol M. The structure and protein binding of amyloid-specific dye reagents // Acta Biochimica Polonica, 50(4):1213-1227, 2003;
106. Sunde M., Serpell L.C., Bartlam M., Fraser P.E., Pepys M.B., Blake C.C.F. Common core structure of amyloid fibrils by synchroptron x-ray diffraction // J. Mol. Biol., 273:729-739,1997;
107. Svensson M., Hakansson A., Mossberg A.K., Linse S., Svanborg C. Conversion of a-lactalbumin to a protein inducting apoptosis // PNAS, 97(8):4221-4226, 2000;
108. SWISSPROT. База данных: http://au.expasy.org/;
109. Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D.G. The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools // Nucleic Acids Res., 25:4876-4882, 1997;
110. TINKER. Программа: http://dasher.wustl.edu/tinker;
111. Velikov P.G. Kinetics and mechanisms of protein crystallization at the molecular level // Proteins Nanotechnology, 300:15-52, 2005;
112. Ventura S. Sequence determinants of protein aggregation: tools to increase protein solubility // Microbial cell factories, http://www.micr0bialcellfact0ries.c0m/c0ntent/4/l/l 1,2005;
113. Villoutreix B.O. Structural Bioinformatics: methods, concepts and applications to blood coagulation proteins // Current Medicinal Chemistry, www.bentham.org, 2001;
114. Wang W., Hecht M.H. Rationally designed mutations convert de novo amyloidlike fibrils into monomeric |3-sheet proteins // PNAS, 99(5):2760-2765,2002;
115. Woo P. AA Amyloidosis // Arthritis Research Campaign, No. 8 www.arc.org.uk, 1996;
116. Xu M., Ermolenkov V.V., He W., Uversky V.N., Fredriksen L., Lednev I.K. Lysozyme fibrillation: deep UV raman spectroscopic characterization of protein structural transformation // Biopolymers, 79:58-61, 2005a;
117. Xu M., Sugiura Y., Nagaoka S., Kanamaru Y. Involvement of SDS-stable higher Mr forms of bovine normal milk a-lactalbumin in inducing intestinal IES-6 cell death // Boisci. Biotechnol. Biochem., 69(6): 1189-1192, 20056;
118. YagiH., Kusaka E., Hongo K., Mizobata T., Kawata Y. Amyloid fibril formation of a-synuclein is accelerated by preformed amyloid seeds of other proteins // The J. Of Biological Chemistry, 280(46):38609-38616, 2005;
119. Zandomeneghi G., Krebs M.R.H., Mccammon M.G., Fandrich M. FTIR reveals structural differences between native (3-sheet proteins and amyloid fibrils // Protein Science, 13:3314-3321, 2004;
120. Zekanowski C., Religa D., GraffC., Filipek S., Kuznicki J. Genetic aspects of Alzheimer's disease//Acta Neurobiol Exp., 64:19-31, 2004;
121. Zhang S., Holmes T., Lockshin C., Rich A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:3334-3338,1993;
-
Егоров, Владимир Валерьевич
-
кандидата биологических наук
-
Санкт-Петербург, 2007
-
ВАК 03.00.04
- Изучение пути фолдинга фибритина бактериофага Т4
- Влияние структурных свойств глобулярных белков на их механическую стабильность и термостабильность
- Разработка теоретических методов анализа функциональных элементов в белках по инвариантным структурным характеристикам
- Роль воды в термодинамике денатурации глобулярных белков
- Динамика структурной самоорганизации модельных биополимеров
