Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Семейство генов полидоменных лектинов С-типа планарии Dugesia tigrina

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шагин, Дмитрий Алексеевич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Классификация лектинов животных

1.2. Структурные особенности УСД лектинов С-типа

1.3. Организация генов лектинов С-типа у животных

1.4. Структура УСД и углеводсвязывающая активность

1.5. Лектин-подобные домены С-типа

ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Разработка методов

2.2. Идентификация генов, кодирующих лектины С-типа у планарии

2.3. Анализ структуры клонированных последовательностей ДНК

2.4. Сравнительный аминокислотный анализ ЛПД планарии с УСД

С-типа животных

2.5. Анализ экспрессии выявленных генов в теле интактной планарии

2.6. Анализ распределения ПДСЛ в тканях планарии

Введение Диссертация по биологии, на тему "Семейство генов полидоменных лектинов С-типа планарии Dugesia tigrina"

Одной из важных проблем, стоящих перед современной биологией и медициной, является выяснение механизма передачи информации между клетками. Успехи в разрешении этого вопроса позволяют по-иному взглянуть на механизмы, лежащие в основе эмбрионального развития, тканевой совместимости, защиты и т. д. в многоклеточных организмах. На сегодняшний день не вызывает сомнения, что лектины- белки, способные узнавать и специфически связывать углеводы, а также подобные лектинам структуры, но связывающие иные лиганды, являются важными составляющими в сложной цепи процессов передачи информации в биологических системах. Выявление и идентификация генов, кодирующих лектины и подобные лектинам белки, является первой ступенью на пути понимания принципов их функционирования.

Большинство лектиновых генов животных клонировано из позвоночных, в частности, из млекопитающих. Для беспозвоночных организмов информация в этой области, к сожалению, достаточно скудная. Несомненным информационным прорывом стал завершенный недавно геномный сиквенс Caenorhabditis elegans, в результате которого было выявлено 183 генетические последовательности, предположительно кодирующие домены, подобные углеводсвязывающим доменам кальций-зависимых лектинов (лектины С-типа). Анализ строения лектиновых или подобных лектиновым генов из разных организмов дает ценную информацию об их возможной эволюции. Кроме того, существенные различия в доменной архитектуре лектинов беспозвоночных животных и позвоночных могут свидетельствовать о том, что важные классы этих белков еще не открыты.

Целью представляемой работы была идентификация генов нового семейства полидоменных свободных лектинов С-типа у пресноводной планарии Girardia (Dugesia) tigrina, их клонирование, анализ структуры и экспрессии.

В процессе работы были клонированы десять новых генов планарии. Было обнаружено, что выявленные гены кодируют белки подобные лектинам С-типа, но обладающие не описанной ранее ни для позвоночных, ни для беспозвоночных животных особой доменной организацией. Анализ структуры предсказанных белков показал, что они образуют отдельную группу внутри семейства кальций-зависимых лектинов. Был продемонстрирован дифференциальный характер экспрессии этих генов в теле интактной планарии, а также экскреция белковых продуктов генов железистыми клетками во внешнюю среду. В процессе работы были разработаны два новых метода, основанных на эффекте селективной супрессии ПЦР: step-out RACE и метод регулирования средней длины сложного продукта ПЦР, которые позволяют существенно облегчить работу по получению и клонированию полноразмерных кДНК.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Шагин, Дмитрий Алексеевич

выводы.

1. На основе эффекта селективной супрессии полимеразной цепной реакции разработан метод, позволяющий регулировать среднюю длину сложного продукта ПЦР.

2. На основе step-out PCR и эффекта смены матрицы разработан высокоэффективный метод быстрой амплификации концов кДНК (step-out RACE).

3. Идентифицировано новое семейство генов полидоменных свободных лектинов С-типа у планарии Girardia (Dugesia) tigrina. Определены последовательности полноразмерных кДНК и геномные последовательности. Проведен анализ экзон-интронной структуры генов.

4. Методами whole mount in situ гибридизации и ОТ-ПЦР продемонстрирован дифференциальный характер экспрессии выявленных генов в интактных планариях.

5. Методами иммуногистохимии и электронной микроскопии показано, что продукты генов scarf2 и gtlecl выводятся во внешнюю среду по длинным отросткам специализированных железистых клеток планарии.

2.7. Заключение.

В результате проведенной нами работы у планарии Girardia (Dugesia) tigrina было идентифицировано новое семейство генов полидоменных свободных лектинов С-типа. Данные гены имеют сходную экзон-интронную организацию и кодируют белки, состоящие из лидерного пептида и набора лектин-подобных доменов С-типа, разделенных короткими линкерными последовательностями. Анализ экзон-интронной организации генов, анализ структуры предсказанных белков, сравнение аминокислотных последовательностей с лектинами С-типа животных, а также анализ филогенетического древа, построенного с использованием последовательностей известных УСД С-типа, указывает на обособленность ПДСЛ планарии от описанных лектинов С-типа животных и позволяет выделить их в отдельную группу внутри кальций-зависимых лектинов.

Из всех ПДСЛ только Scarfl белок демонстрирует сходство строения с так называемыми свободными лектинами С-типа. Однако экзон-интронная организация scarfl существенно отличалается от геномной организации свободных лектинов. Кроме того, анализ кодирующих и не кодирующих последовательностей ясаг^подобных генов указывает на то, что scarfl и scarfS могли возникнуть в результате уникальной гомологичной рекомбинации из гена scarfl. Поскольку изначальная форма scarf {scarfl) сохранена в геноме планарии, мы предполагаем, что дупликация гена scarfl предшествовала процессу гомологичной рекомбинации. Присутствие, по крайней мере, двух 5са//-подобных геномных сиквенсов у планарии половой расы подтверждает эту идею.

Анализ участков, ответственных за координированное связывания кальция и углеводов в полидоменных свободных лектинах планарии, позволяет предположить, что многие из лектиновых доменов обладают углевод связывающей активностью. В отличае от лектинов группы D1 С. elegans, содержащих два ЛПД С-типа, только один из которых вероятно связывает сахар (Drickamer К. & Dodd R. 1999), предсказанные белки полидоменных свободных лектинов С-типа обычно содержат более одного ЛПД, которые могут связывать углеводы кальций-зависимо.

Анализ экспрессии ПДСЛ, осуществленный на уровне мРНК и на уровне белка, привел нас к выводу, что ПДСЛ экспрессируются специализированными железистыми клетками. Эти клетки, тела которых лежат в паренхиме, имеют длинные отростки, по которым происходит транспорт секреторных гранул во внешнюю среду. При сравнении полученных результатов с литературными данными обнаруживается существенное сходство выявленных нами железистых клеток с клетками адгезионных желез некоторых плоских червей. Мы предполагаем, что ПДСЛ-экспрессирующие клетки являются клетками дуо-типа и принадлежат к адгезионной системе планарии.

Нами было продемонстрировано, что белковые продукты генов ПДСЛ синтезируются в телах железистых клеток, транспортируются по отросткам в составе электронно-плотных гранул к краю тела и выделяются во внешнюю среду в составе слизистого секрета планарии.

Хотя исследования роли полидоменных свободных лектинов еще далеки от завершения, можно предположить три гипотезы о возможной функции этих белков у планарии: участие в процессах прикрепления к субстрату, защита от бактериальной инфекции, как описано для ряда других лектинов С-типа, а также вовлечение в систему «общения» или опознавания «свой-чужой». В пользу последней гипотезы говорит тот факт, что гены ПДСЛ имеют сложный паттерн экспрессии в теле планарии, а их продукты выводятся во внешнюю среду в различных частях тела.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шагин, Дмитрий Алексеевич, Москва

1. Ashwell G., Harford J. 1982. Annu. Rev. Biochem. 51:531-554. Barnes W. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 2216-20.

2. Bertrand J, Pignol D, Bernard J, Verdier J, Dagorn J, Fontecilla-Camps J. 1996. EMBO J. 15: 2678-84.

3. Bogdanova E, Matz M, Tarabykin V, Usman N, Shagin D, Zaraisky A, Lukyanov S. 1998. Dev. Biol. 194: 287-93.

4. Chomczynski P. & Sacchi N. 1987. Anal. Biochem. 162: 156-9.

5. Christa L, Felin M, Morali O, Simon M, Lasserre C, Brechot C. & Seve A. 1994. FEBS1.tt. 337: 114-18.

6. Curtis B, Scharnowske S, Watson A. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 8356-60.

7. Doege K, Sasaki M, Kimura T, Yamada Y. 1991. J. Biol. Chem. 266: 894-902.

8. Dowbenko D, Diep A, Taylor B, Lusis A, Lasky L. 1991. Genomics 9: 270-7.

9. Drickamer K. & Dodd R. 1999. Glycobiology 9: 1357-69.

10. Drickamer K. & Taylor M. 1993. Annu. Rev. Cell Biol. 9: 237-64.

11. Drickamer K. 1981. J. Biol. Chem. 256: 5827-39.

12. Drickamer K. 1992. Nature 360: 183-6.

13. Drickamer K. 1993a. Annu. Rev. Cell Biol. 9: 237-64.

14. Drickamer K. 1993b. Current Opin. Struct. Biol. 3: 393-400.

15. Drickamer К. 1994. Glycobiology 4(3):245-8. Drickamer К. 1996. Annu. Rev. Biochem. 65: 441-73. Drickamer K. 1999. Cur. Opin. Struct. Biol. 9: 585-90. Ehlich P. Proc. Roy, Soc. B, London, 66,4246 (1900).

16. Epstein J, Eichbaum Q, Sheriff S, Ezekowitz RAB. 1996. Curr. Opin. Immunol. 8: 29-35.

17. Erbe D, Wolitzky B, Presta L, Norton C, Ramos R, Burns D, Rumberger J, Rao N,

18. Foxall C, Brandley B. & Lasky L. 1992. J. Cell Biol. 119: 215-27.

19. Feizi T. 1991. Curr. Opin. Struct. Biol. 1: 766-72

20. Fucuda M, Hiraoka N. & Yen J. 1999. J. Cell Biol. 147: 467-70.

21. Garcia-Fernandez J, Baguna J & Salo E. 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7338-42.

22. Garcia-Fernandez J, Baguna J & Salo E. 1993. Development 118: 241-253.

23. Gabius H. 1997. EurJ.Biochem. 243:543-576.

24. Giga Y, Ikai A, Takahashi K. 1987. J. Biol. Chem. 262: 6197-203.

25. Gilbert W, Marchionni M, McKnight G. 1986. Cell 46: 151-3.

26. Haq S, Kubo T, Kurata S, Kobayashi A. & Natori S. 1996. J. Biol. Chem. 271: 20213-18. Harland R. 1991. Methods Cell Biol. 36: 685-95.

27. Harris N, Peters L, Eicher E, Rits M, Raspberry D, Eichbaum Q, Super M. & Ezekowitz RAB. 1994. Biochem. Biophys. Research Communic. 198: 682-92. Herzig M, Weigel P. 1990. Biochemistry 29: 64437-47. Higgins D, Sharp P. 1988. Gene 73: 237-44.

28. Hirabayashi J, Kusunoki T, Kasai K. 1991. J. Biol. Chem. 266: 2320-6. Hohenester E, Sasaki T, Olsen B, Timpl R. 1998. EMBO J. 17(6): 1656-64. Hoyle G, Hill R. 1988. J. Biol. Chem. 263: 7487-92. Hoyle G, Hill R. 1991. J. Biol. Chem. 266:1850-7.

29. M, Kurata H, Itoh N, Yamashina I, Kawasaki T. 1990. J. Biol. Chem. 265: 11295-8. Iobst S. & Drickamer K. 1994. J. Biol. Chem. 269: 15512-19. Iozzo R. 1998. Annu. Rev. Biochem. 67: 609-52. Jiang W. et al. 1995. Nature 375: 151-55.

30. Johnston G, Bliss G, Newman P, McEver R. 1990. J. Biol. Chem. 265: 21381-5. Kaltner H, Stierstorfer B. 1998. Acta Anat. 161: 162-79.

31. Kellog D, Rybalkin I, Chen S, Mukhamedova N, Vlasik T, Siebert P, Chenchik A. 1994. BioTechniq. 16:1134-37.

32. Kelly G, Prasannan S, Daniell S, Fleming K, Frankel G, Dougan G, Connerton I, Matthews S. 1999. Nat. Struct. Biol. 6: 313-8.

33. Kim S, Ruiz N, Bezouska K, Drickamer K. 1992. Genomics 14: 721-7.

34. Kohda D, Morton C, Parkar A, Hatanaka H, Inagaki F, Campbell I, Day A. 1996. Cell. 86:767.75.

35. Kolatkar A. & Weis W. 1996. J. Biol. Chem. 271: 6679-85.

36. Kornfeld R, Komfeld S. 1985. Annu. Rev. Biochem. 1985. 54: 631-64.

37. Malhotra R, Bird M. 1997. BioEssays 19: 919-22.

38. Mats M, Usman N, Shagin D, Bogdanova E, Lukyanov S. 1997. Nucleic Acids Res. 25: 2541-2.

39. Matz M, Shagin D, Bogdanova E, Britanova O, Lukyanov S, Diatchenko L, Chenchik A. 1999. Nucleic. Acids. Res. 27: 1558-60.

40. Matz M, Shagin D, Usman N, Bogdanova E, Fradkov A, Soboleva T, Luk'ianov S. 1998. Bioorg. Khim. 24: 910-5.

41. Mio H, Kagami N, Yokokawa S, Kawai H, Nakagawa S, Takeuchi K, Sekine S, Hiraoka A. 1998. Biochem. Biophys. Res. Commun. 249: 124-30.

42. Miura R, Aspberg A, Ethell I, Hagihara K, Schnaar R, Ruoslahti E, Yamaguchi Y. 1999. J. Biol. Chem. 274: 11431-8.

43. Mizuno H, Fujimoto Z, Koizumi M, Капо H, Atoda H, Morita T. 1997. Nat. Struct. Biol. 4: 438-41.

44. Muramoto K, Kamiya H. 1990. Biochim. Biophys. Acta. 1990.1039: 52-60.

45. Muta T, Miyata T, Misumi Y, Tokunaga F, Nakamura T, Toh Y, Ikehara Y, Iwanaga S.1991. J. Biol. Chem. 266: 6554-61.

46. Ng K, Drickamer К & Weis W. 1996. J. Biol. Chem. 271: 663-674

47. Nielsen B, Kastrup J, Rasmussen H, Holtet T, Graversen J, Etzerodt M, Thogersen H,1.rsen I. 1997. FEBS Lett. 412: 388-96.

48. Nielsen H, Brunak S, von Heijne G. 1999. Protein Eng. 12: 3-9.

49. Otter M, Barrett-Bergshoeff M, RijkenD. 1991. J. Biol. Chem. 266: 13931-5.

50. Paietta E, Stockert R, Racevskis J. 1992. J. Biol. Chem. 267: 11078-84.

51. Palmer J, Logsdon J. 1991. Curr. Opin. Genet. Dev. 1: 470-7.

52. Patthy L. 1999. Gene 238: 103-14.

53. Persson A, Chang D, Crouch E. 1990. J. Biol. Chem. 265: 5755-60.

54. Piskarev V, Navratil J, Karaskova H, Bezouska K, Kocourek J. 1990. Biochem. J. 270:755.60.

55. Quesenberry M. & Drickamer K. 1992. J. Biol. Chem. 267: 10831-41. Quesenberry M. & Drickamer K. 1991. Glycobiology 1: 615-21.

56. Rauch U, Karthikeyan L, Maurel P, Margolis RU, Margolis RK. 1992. J. Biol. Chem. 267: 19536-47.

57. Reidling J, Miller M. & Steele R. 2000. J. Biol. Chem. 275: 10323-30.

58. Rice K, Weisz O, Barthel T, Lee R, Lee Y. 1990. J. Biol. Chem. 265: 18429-34.

59. Rieger R, Tyler S, Smith J, Rieger G. 1991. Wiley Press. Inc.

60. RiegerR. 1971.1. Zool. Jb. Syst. 98: 236-314.

61. Rini J. 1995. Annu. Rev. Biophis. Biomol. Struct. 24: 551-77.

62. Ruoslahti E. 1996. Glycobiology 6: 489-92.

63. Short Protocols in Molecular Biology./ Eds Ausubel F.M. et al. 1992. N.Y.Harvard Medical Scool.

64. Schultz J, Copley R, Doerks T, Ponting C, Bork P. 2000. Nucleic Acids Res. 28: 231-4.

65. Shagin D, Lukyanov K, Vagner L, Matz M. 1999. Nucleic. Acids. Res. 27: e23.

66. Sibert P, Chenchik A, Kellog D, Lukyanov K. & Lukyanov S. 1995. Nucleic Acids Res. 23:1087-88.

67. SpiessM. 1990. Biochemistry 29: 10009-18.

68. Suter U, Bastos R, Hofstetter H. 1987. Nucleic Acids Res. 15: 7295-308.

69. Tanaka T, Har-El R, Tanzer M. 1988. J. Biol. Chem. 263: 15831-5.

70. Taylor M & Drickamer K. 1993. J. Biol. Chem. 268: 399-404.

71. Taylor M, Bezouska K, Drickamer K. 1992. J. Biol. Chem. 267: 1719-26.

72. Taylor M, Brickell P, Craig R, Summerfield J. Biochem. J. 1989.262: 763-71.

73. Taylor M, Conary J, Lennartz M, Stahl P, Drickamer K. 1990. J. Biol. Chem 265: 12156-62.

74. Taylor M. 1993. In: Horton MA, ed. Blood cell biochemistry 5: 347-70.

75. Taylor M. 1997. Glycobiology 7: R5-R8.

76. Tedder T, Steeber D, Chen A, Engel P. 1995. FASEB J. 9: 866-73.

77. Tenner A, Robinson S, Ezekowitz R. 1995. Immunity 3: 485-93.

78. The C.elegans sequencing consortium. 1998. Science 282: 2012-18.

79. Thiel S, Vorup-Jensen T, Stover CM, Schwaeble W, Laursen SB, Poulsen K, Willis AC,

80. Eggleton P, Hansen S, Holmskov U, Reid KB, Jensenius JC. 1997. Nature 386: 506-10.

81. Tyler S. 1988. Fortschr. Zool. 36: 331-47.

82. Verrey F, Drickamer K. 1993. Biochem. J. 292: 149-55.

83. Weis W, Crichlow G, Murthy H, Hendrickson W, Drickamer K. 1991a. J. Biol. Chem. 266: 20678-86.

84. Weis W, Kahn R, Fourme R, Drickamer K, Hendrickson W. 1991b. Science 254: 1608-15. Weis W, Drickamer K, Hendrickson W. 1992. Nature 360: 127-34; Ng K, Drickamer K, Weis W. 1996. J. Biol. Chem. 27: 663-74.

85. Weis W, Taylor, Drickamer K. 1998. Immunol. Reviews 163: 19-34.

86. Weis W. & Drickamer K. 1996. Annu. Rev. Biochem. 65: 441-73.

87. Weis W, Drickamer K. & Hendrickson W. 1992 Nature 360: 127-34

88. White R, Damm D, Miller J, Spratt K, Schilling J, Hawgood S, Benson B, Cordell B. 1985.1. Nature 317: 361-3.

89. Yamada H, Watanabe K, Shimonaka M, Yamaguchi Y. 1994. J. Biol. Chem. 269: 10119-26. Yamamoto F, Hakomori S. 1990. J. Biol. Chem. 265: 19257-62. Zimmermann DR, Ruoslahti E. 1989. EMBO J. 8: 2975-81.