Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Селективное моделирование эффектов быстрого вращательного движения нитроксила в спектрах ЭПР спин-меченых биомакромолекул

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Селективное моделирование эффектов быстрого вращательного движения нитроксила в спектрах ЭПР спин-меченых биомакромолекул"

Ткачев Ярослав Владимирович

Селективное моделирование эффектов быстрого вращательного

движения нитроксила в спектрах ЭПР спин-меченых биомакромолекул

03.01.03 — молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

- 9 ДЕК 2010

Москва - 2010

004616944

Работа выполнена в лаборатории конформационной стабильности белков и физических методов анализа Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН. Научные руководители:

доктор физико-математических наук, профессор Тимофеев Владимир Петрович

доктор биологических наук, профессор, академик Макаров Александр Александрович

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор Шайтан Константин Вольдемарович

доктор физико-математических наук, профессор Туманян Владимир Гайевич

Ведущая организация:

Институт химической физики им. H.H. Семенова РАН

Защита диссертации состоится «ß » ШО^Р-Я 2010 г. в ^ часов на заседании диссертационного совета Д 002.235.01 по присуждению ученой степени кандидата и доктора наук при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, 32. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИМБ РАН.

Автореферат разослан «, /i> » НСХ^рЯ 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

А.М. Крицын

Список использованных сокращений

БСА Сывороточный альбумин быка

КШП Крайние широкие пики (в спектре ЭПР)

МД Молекулярная динамика (метод)

СТС Сверхтонкая структура

ФПР Функция плотности распределения

ХФ Характеристическая функция (распределения)

ЭПР Электронный парамагнитный резонанс

ЯМР Ядерный магнитный резонанс

Bs Белок барстар

Вп Барназа (рибонуклеаза)

Fab Антиген-связывающий фрагмент иммуноглобулина

IgM Иммуноглобулин M

IgG Иммуноглобулин G

RF Rheumatoid Factor, ревматоидный фактор

SLE Stochastic Liouville Equation, стохастическое уравнение Лиувилля

SRLS Slowly Relaxing Local Structure (модель)

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Динамика биологических макромолекул, наряду с их структурой, является определяющим фактором их функционирования как составляющих частей живого организма. Исследование функций белков и нуклеиновых кислот па молекулярном уровне, а также их роли в процессах жизнедеятельности, напрямую связано с определением их структурных и динамических характеристик, т.е. характера движений и информационных переходов в этих молекулах. В связи с этим, применение в молекулярной биологии метода электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), в частности, метода спиновых меток, представляет значительный интерес. Данный метод позволяет исследовать структурные и динамические свойства макромолекул в интервале температур, соответствующему физиологическим нормам. Метод является чувствительным к молекулярным движениям в диапазоне времен корреляции Ю-11 - Ю-7 с, и поэтому позволяет исследовать более быстрые процессы, чем родственный метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР).

В настоящее время существует значительное число подходов к расчету спектров ЭПР нитроксильпых радикалов, используемых в качестве спиновых меток, в растворе, включая методы стохастической динамики, методы, основанные на модели SRLS (Slowly Relaxing Local Structure: Liang Z., J. Phys. Chem. 1999, 103, 6384), а также расчеты по методу молекулярной динамики (МД, например, Sezer D., J. Phys. Chem. В 2008, 112, 5755). Несмотря на это, проблема решения обратной задачи — надежного определения динамических и структурных характеристик исследуемого объекта (ансамбля спин-меченых макромолекул), исходя из данных ЭПР, остается открытой. Недостатком наиболее распространенных методов многомерной параметрической оптимизации (например, сопряженных градиентных методов: Budil D.E., J. Magn. Reson. 1996, 120, 155), за исключением простейших случаев, является неоднозначность полученных результатов, вызванная зависимостью от выбора начального приближения. В системах со сложной динамикой, каковыми являются биологические макромолекулы, различные компоненты молекулярного движения могут иметь сходное влияние па форму спектров ЭПР, что также создает затруднения при интерпретации таких спектров. Возможное решение этой проблемы состоит в комбинации теоретических моделей и экспериментальных техник, обладающих селективностью по отношению к движениям разного типа. Следовательно, развитие уже существующих и разработка новых способов моделирования эффектов динамики спин-меченых макромолекул

в спектрах ЭПР, с учетом описанных особенностей, является весьма актуальной задачей.

Таким образом, разработка методов решения обратной задачи ЭПР для спнп-меченых макромолекул, основанных на селективном моделировании различных по природе динамических эффектов, позволит расширить круг решаемых практических задач. Это определяет актуальность темы диссертационной работы.

Цели и задачи работы. Целью работы являлась разработка комбинированного метода, позволяющего проводить однозначную интерпретацию спектров ЭПР растворов спин-меченых биологических макромолекул, базирующегося на моделировании быстрой компоненты движения метки путем усреднения спинового гамильтониана. В ходе работы были решены следующие задачи:

1. Обобщение модели быстрых ограниченных осцилляций, расширяющее область ее применимости на более широкий класс движений. Вывод частных случаев, соответствующих известным моделям, основанным на частичном усреднении спинового гамильтониана.

2. Модификация процедуры обработки результатов эксперимента по темпе-ратурно-вязкостной зависимости спектров ЭПР с учетом ее совместного использования с обобщенной моделью быстрых осцилляций.

3. Разработка метода для решения обратной задачи ЭПР для спин-меченых биомакромолекул в растворе, позволяющая определять параметры упорядоченности и величины времени корреляции, и моделировать спектры ЭПР. Схема такого метода предполагает использование данных по температурно-вязкостной зависимости, что обеспечивает селективность по отношению к разным типам движения (быстрых анизотропных осцилляций и медленного вращательного броуновского движения), и, соответственно, однозначную интерпретацию спектров ЭПР.

4. Исследование с помощью разработанных подходов характера белок-белковых взаимодействий в системе барстар-барназа, а также различий в РаЬ-фрагмен-тах нормального и ревматоидного (ИР) иммуноглобулинов М человека.

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе впервые рассматривается обобщенная модель быстрых осцилляций и построенная на ее базе схема решения обратной спектроскопической задачи для спектров ЭПР биологических систем со сложной динамикой. Сводимость сложных процессов к сравнительно небольшому набору параметров, а также использование дополнительных экспериментальных данных, таких, как температурно-вязкостная зависимость спектров, позволяет в рамках этой схемы производить однозначную интерпретацию спектров ЭПР и надежно определять динамические и структурные характеристики (времена корреляции и параметры порядка) с помощью метода спиновых меток. Это открывает новые перспективные пути использования метода спиновых меток применительно к биологическим системам и процессам, в частности, к проблеме белок-белкового узнавания, как в случае с взаимодействием барстар-барназа. Применение разработанного подхода для изучения динамики фрагмента Fab человеческого иммуноглобулина М привело к обнаружению внутренней гибкости фрагмента Fab ревматоидного IgM (RF). Это является существенным шагом в исследовании молекулярных механизмов патогенеза ряда автоиммунных болезней, таких как болезнь Вальденштрема и ревматоидный артрит, и сужает возможные направления поиска новых методов молекулярной диагностики и терапии подобных заболеваний.

Апробация работы. Основные материалы и результаты работы докладывались на международных конференциях «4th International Conference on Nitroxide Radicals: Synthesis, Properties and Implications of Nitroxides» (Новосибирск, 2005 г.), «Modern Development of Magnetic Resonance»(Казань, 2007 г.), «EUROMAR-2008 Magnetic Resonance Conference»(Санкт-Петербург, 2008 г.), «5th International Conference on Nitroxide Radicals»(Ancona, Italy, 2008), «EUROMAR-2009 Magnetic Resonance Conference»(Gothenburg, Sweden, 2009), XXI симпозиуме «Современная химическая физика» (Туапсе, 2009 г.) и молодежной школе «XI International Young Scientific School «Actual Problems of Magnetic Resonance and its Applications» (Казань, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы в ведущих отечественных и зарубежных журналах, и представлено 10 докладов на международных конференциях и симпозиумах.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 9 разделов, включая литературный обзор и экспериментальную часть, выводов, приложения и списка литературы. Материал изложен на 116 страницах, содержит 10 таблиц и 42 рисунка. Список литературы содержит 137 наименований.

Использованные в работе образцы белков были предоставлены В.А. Лапуком (ИОХ РАН), С.М. Деевым и Т.Г. Баландиным (ИБХ РАН). В работе использованы спиновые метки, синтезированные A.B. Шапиро и А.Ю. Мишариным.

Содержание работы

Во введении сформулированы основные цели и задачи, а также обоснована актуальность и научная новизна работы.

1. Обзор литературы

В обзоре литературы приведены основы метода спектроскопии ЭПР и метода спиновых меток применительно к исследованию биологических объектов. Рассмотрена теория расчета спектров поглощения неподвижных радикалов и базовая теория магнитной релаксации как основа для моделирования формы линии с учетом динамических процессов (молекулярного движения). Рассмотрена шкала времени ЭПР и соответствующая ей классификация случайных процессов по величине времени корреляции. Приведены способы моделирования соответствующих релаксационных процессов и наиболее распространенные методы моделирования формы линии спектра ЭПР с учетом эффектов молекулярных движений, таких как вращательная броуновская диффузия. Рассматриваются модели, основанные на частичном усреднении спинового гамильтониана для описания быстрых (по шкале времени метода) движений.

2. Обратная задача ЭПР для спин-меченых макромолекул

Решение обратной задачи производится с помощью моделирования спектров (прямая задача), и использовании степени сходства теоретических спектров с экспериментальными в качестве критерия правильности значений исходных параметров, т.е. путем оптимизации. Исследования биологических систем и процессов производится, как правило, в достаточно узком температурном диапазоне (273— 313 К) в водном растворе.

Для учета эффектов молекулярного движения (вращательной динамики) спиновой метки, присоединенной к макромолекуле, в указанном диапазоне температур, целесообразно разделить все движения на два основных типа, различающиеся по величине времени корреляции т. Пограничным критерием является обратная величина к анизотропии спинового гамильтониана, Ды-1. Значения т порядка Да;-1 и более отвечают движениям, определяемым как медленные. Таковым является броуновская диффузия макромолекул в растворе, и для моделирования ее применяется полуклассический метод (Schneider D.J., Advance in Chemical Physics 1989, 73, 387), основанный на стохастическом уравнении Лиувилля (метод SLE), который использовался в данной работе для расчета спектров ЭПР.

Быстрыми считаются процессы, времена корреляции которых r^t Дш-1, и в рассматриваемом диапазоне температур под это определение подпадает быстрая анизотропная переориентация спиновой метки относительно макромолекулы. В этом случае весьма хорошее приближение дают модели, основанные на частичном усреднении спинового гамильтониана. В следующем разделе приведена построенная в ходе работы одна из наиболее универсальных моделей такого типа — обобщенная модель быстрых осцилляций.

Оба указанных типа движений сходно влияют на форму спектра. Поскольку оба процесса сосуществуют и дают принципиально различную информацию об объекте (быстрый — локальную конфигурацию окружения места присоединения метки, медленный — время вращательной корреляции макромолекулы), возникает проблема селективного моделирования их эффектов в спектрах.

3. Обобщенная модель быстрых осцилляций

Моделирование быстрой компоненты движения нитроксилыюй спин-метки, прикрепленной к макромолекуле, в общем случае представляет сложную задачу. Это связано с тем, что это движение обладает значительной анизотропией, на которую оказывает влияние структура и динамика участков макромолекулы, образующих непосредственное окружение метки. Одновременно это означает, что именно быстрая компонента содержит информацию о локальной структуре и динамике макромолекулы. Учитывая, что детальное описание всех особенностей быстрого движения (при отсутствии данных, полученных альтернативными методами, например, МД) представляется невозможным, наиболее целесообразным является его описание с помощью усредненного спинового гамильтониана.

В этом случае эффективный спин-гамильтониан нитроксила

Û = /3H5S + -yhÏAS

заменяется на усредненный по времени (H)t на интервале времени At, что является физически оправданным в случае At <С Aw-1 (критерий быстрого движения), где Aoj — величина анизотропии (1). В Х-диапазоис (9.1 ГГц) Au'1 и 4 не, что определяется анизотропией тензора А сверхтонкой структуры (СТС). Расчет {H)t обычно производится путем замены усреднения по времени пространственным средним с некоторой функцией распределения. Вид функции распределения в этом случае эквивалентен выбору модели движения, поэтому в дальнейшем эти понятия применительно к рассматриваемому подходу отождествляются.

Наиболее универсальной моделью движения для расчета частично усредненного спинового гамильтониана является модель быстрых ограниченных осцилляций (Timofeev V.P., J. Chem. Soc. (Perkin Trans.) 1995, 2, 2175). При ее использовании предполагается, что нитроксил совершает колебания вокруг некоторой фиксированной оси, ограниченные углом осцилляции а, и что все ориентации в пределах от —а до а равновероятны. В данной работе показано, что этот подход может быть в значительной мере расширен и обобщен на более широкий класс моделей движения.

Угловая зависимость гамильтониана (1) полностью определяется анизотропией магнитных тензоров g и А. Поэтому для вычисления среднего гамильтониана достаточно рассчитать усредненные компоненты тензоров. В дальнейшем рассматривается только тензор СТС А, все выражения для g аналогичны. Определим две системы координат (рис. 1): неподвижную (лабораторную) и молекулярную (главные оси тензора g), которая осциллирует вокруг некоторой оси п. Усредненный гамильтониан при этом имеет вид

At ж

(M)t = Jn{t)dt -> (П)т = Jn(S)p(S)dS, (2)

О -7Г

где p(S) — функция плотности распределения (ФПР) по углу поворота. Соответствующее выражение для усредненного тензора будет Л = А> А — (Т*(5)АТ(5))рф,

Рис. 1: Системы координат, используемые в модели быстрых осцилляций. Лабораторная система (х',у',г') фиксирована, молекулярная (х, у, г) совершает вращательные движения вокруг оси п.

где Т(5) = Т{п, 5) есть представление оператора вращения (матрица) в подходящем базисе, и здесь п — орт оси вращения, а <5 — угол поворота. Подстановка в это выражение интерполяционного многочлена Лагранжа-Сильвестра для Т(п, <5) и последующее интегрирование позволяет получить выражения (3-5) для оператора усреднения А>\

А = Л(п,р)А = А-(п, Х(1), х(2))А = %

1 + Ё(х(А:)-1)Л

к=1

Л, (3)

-гии

Х(ш)= I сйе^р(<5). (4)

Здесь х(ш) — характеристическая функция (ХФ) распределения, заданного плотностью р(6). Операторы Лк выражаются через оператор поворота на угол % : А М- Т*(п, |)АТ(п, |), и определяются как Лк ■ А ь-> Ак = Ак1 - гАк2, где матрицы Ау имеют вид:

Аи = \{1-1^)А

Л12 = 1 (К2 - П~2) Л

а21 = 1(1 + пА - тг2 - 7г-2) л ^

А22 = А (ч/27г~2 - \/27г2 + 27г - 271-1) А,

Таким образом, выражения (3-5) сводят выбор модели движения (в указанном выше смысле) к выбору ХФ х, а, точнее, класса ХФ, принимающих определенные значения в точках 1 и 2. Область значений х(1) и х(2) определяется общими свойствами ХФ, поэтому, в общем случае использование их в качестве абстрактных параметров (не задавая модели движения, т. е. ФПР) может не иметь физического смысла. Однако при условии их вещественности (четная ФПР) и 1 > > х(2) > 0 эти величины всегда определяют некоторую ХФ (критерий Пойа), и в этом случае их можно использовать как абстрактные параметры порядка (поскольку нулевые значения соответствуют полностью разупорядоченному движению, а значения 1 — неподвижному нитроксилу).

Применение Л> согласно (3-5), вообще говоря, приводит к недиагональным усредненным тензорам. Более того, А» также не сохраняет соотношения между главными осями Аид, которые для нитроксильных радикалов обычно полагают совпадающими. Это приводит к необходимости производить диагонализацию после усреднения, и учитывать «наклон» главных осей тензора СТС относительно молекулярной системы координат. Аналитическая диагонализация также возмож-

на в некоторых случаях, однако все они относятся к уже описанным в литературе моделям.

Многие известные из литературы модели усреднения можно вывести из приведенных выше выражений как частные случаи. Таковы, в частности, модель быстрого вращения, модель колебаний относительно молекулярной оси (также называемая моделью квазилибраций: Chernova D.A., J. Polymer Sei. В 2009, 47, 107), и модель ограниченных случайных блужданий (Л. Берлинер (ред.), Метод спиновых меток, 1979, изд. «Мир»), Относительно последней нужно заметить, что характер движения метки, предполагаемый в ней, отличается от осцилляцн-онного, но, как было показано, приводит к тем же выражениям, что и модель быстрых осцилляций, и, таким образом, является лишь другой ее параметризацией. Этот пример демонстрирует, что абстрактные параметры порядка должны использоваться с осторожностью, поскольку, как было сказано выше, имеется целый класс ФПР, сводящийся к одинаковым их значениям.

Обычная модель ограниченных осцилляций получается, если положить ФПР р(6) постоянной на интервале [—q,q], и равной нулю вне его, в этом случае ХФ в (3) будет х(ш) = sinc(aw) = a~lu~l sin(aaj). Параметры S3 = 3c°s^~1, х = 1 — 2 cos2 ip определяют ось осцилляции п, заданную в полярных координатах парой (в,1р). Здесь существенно то, что величина S3 оказывается равной параметру упорядоченности модели ограниченных случайных блужданий S, который легко определяется из экспериментального спектра (при отсутствии прочих факторов, таких как медленная диффузия). Это позволяет использовать его значения в качестве начального приближения при моделировании спектров.

4. Модифицированный метод температурно-вязкостной зависимости спектров ЭПР

Методика температурно-вязкостной зависимости в своей оригинальной формулировке (Timofeev V.P., J. Chem. Soc. (Perkin Trans.) 1995 , 2, 2175) позволяет определять время корреляции т медленной изотропной диффузии макромолекулы, и параметр упорядоченности S модели ограниченных случайных блужданий, которая, как было показано, является частным случаем обобщенной модели быстрых осцилляций. Это позволяет избежать неоднозначностей интерпретации, на которые было указано в разделе 2. В данной работе эта методика была модифицирована с учетом ее включения в общую схему решения обратной задачи для спин-меченых макромолекул совместно с обобщенной моделью быстрых осцилляций.

Экспериментально измеряемым параметром в методике температурно-вязкос-тной зависимости является расстояние между крайними экстремумами (крайними широкими пиками, КШП) производной спектра поглощения в Х-диапазоне. Релаксационные эффекты, связанные с движением нитроксила, приводят к уменьшению этого расстояния (сужение линии), поэтому, измеряя его, можно исследовать природу этого движения. Предполагая независимость медленной броуновской диффузии макромолекулы как целого и быстрых анизотропных переориентации спиновой метки, эффективное изменение положения КШП можно представить как сумму сдвигов, происходящих от этих двух компонент движения.

Обменное сужение линии (Сликтер Ч., Основы теории магнитного резонанса, 1981, изд. «Мир»), обусловленное медленным вращением макромолекулы, можно оценить по формуле (6):

АН' « ДЯ

1 - (-2-У

\7тД# )

(6)

Если эффект быстрого движения учитывается с помощью выражений для усред-неного тензора СТС Л согласно выражениям (3-5), то целесообразно использовать приближение аксиальной симметрии тензора Л. Модель ограниченных случайных блужданий, являясь частным случаем (3), характеризует движение единственным параметром порядка 5:

5=-^- (7)

Агг - а0

В модели обмена между двумя состояниями (6) примем величины АН и АН' равными

АН = 2(Лц - А±) = 3(Лц - ао) = 3Я(Л2г - а0) (8)

АН' = 2(А[~А'±) = Щ-а0). (9)

В этих выражениях Л|| — половина расстояния между КШП в экспериментальном спектре (производной поглощения), Ац — частично усредненная быстрым движением гг-компонента тензора СТС (Агг), и ао = ^гА определяется из спектра раствора свободной метки. Обозначим через Дг = 2(Лц — Л|) величину сдвига КШП к центру спектра, возникающую в результате медленного изотропного вращения макромолекулы. Тогда

АН' = 2(А'| - А'±) = АН - ¡А2 (10)

Комбинируя выражения (8), (10) и (6), получим

До = 2 (Azz - а0)

(И)

Если ввести эмпирические параметры а и Ь, то зависимость между временем корреляции макромолекулы, параметром упорядоченности и сдвиг-ом КШП необходимо искать в виде

Параметры а и b можно найти, рассчитывая набор спектров при различных значениях Sut, при этом надо иметь в виду, что они зависят как от исходных тензоров, так и от ширины индивидуальной линии (при использовании метода SLE). Поэтому, вообще говоря, обработка каждого эксперимента требует моделирования спектров и расчета параметров а и Ь, для чего в ходе работы были написаны соответствующие программы. Далее па примере БСА показано, что можно использовать некоторые упрощающие предположения относительно этих параметров, и оценивать их значения без необходимости пересчета большого количества спектров. Выражение для S (12) здесь выведено в безразмерной форме, в отличие от оригинальной формулировки, и параметр а имеет размерность времени (в наносекундах). Кроме того, отличие модифицированного метода состоит в том, что параметры а и & не считаются фиксированными, и участвуют в процессе оптимизации при расчете спектров согласно схеме, представленной в следующем разделе.

Для того, чтобы перейти к непосредственно измеряемым величинам — температуре Т и вязкости раствора ту, воспользуемся простейшей моделью Стокса-Эйнштейпа (вращательное движение сферы в жидкости), в которой

В таком случае выражение (12) приобретает вид

и, определяя экспериментально зависимость этого расстояния от температуры и вязкости, можно найти 2Лц и параметр упорядоченности, и, следовательно, по формуле (12), время вращательной корреляции макромолекулы при различных температурах и значениях вязкости раствора.

(12)

5. Общая схема решения обратной задачи ЭПР

Комбинируя описанные выше модели и экспериментальные подходы, и используя метод БЬЕ для моделирования медленной компоненты движения метки, была получена схема интерпретации спектров, позволяющая однозначно трактовать форму линии, модулируемую различными по природе динамическими эффектами. В целом предлагаемая схема интерпретации спектров ЭПР спин-меченых макромолекул выглядит следующим образом:

1. Начальные магнитные параметры для моделирования спектров определяются из спектра раствора свободной метки и спектра спин-меченого образца при 77 К.

2. Полученные магнитные параметры используются для расчета параметров а и Ь зависимости вида (12).

3. Исходя из экспериментальных данных по температурно-вязкостной зависимости, с использованием полученных значений а и Ь находятся значения ги5в соответствии с выражением (14).

4. С помощью обобщенной модели быстрых осцилляций рассчитывают усредненные значения магнитных тензоров, которые используются для расчета спектра методом БЬЕ. В качестве времени корреляции и параметра 5з (см. раздел 3) подставляют найденные на предыдущем этапе значения т и 5. С помощью дополнительных параметров (^(1), х(2)), а также ширины линии добиваются наилучшего совпадения теоретического спектра с экспериментальным. При необходимости изменения магнитных параметров и ширины линии процедуру повторяют с пункта 2.

Достижение самосогласования в этой схеме является критерием правильной интерпретации спектров ЭПР. В этой схеме существенно, что модель ограниченных случайных блужданий, используемая в методике температурно-вязкостной зависимости (выражение 7) является частным случаем обобщенной модели быстрых осцилляций. Поэтому использование данной схемы позволяет моделировать спектры, не ограничиваясь аксиально-симметричным приближением, которое, как правило, не дает хорошего согласования с экспериментом в центральной области спектра.

6. Применение общей схемы к исследованию БСА

Сывороточный альбумин быка (БСА) является классическим объектом для апробации различных моделей в биофизике. На примере БСА была показана практическая применимость и высокая информативность предложенного в работе подхода, определены значения времени вращательной корреляции и параметров упорядоченности при различных температурах, и рассчитаны соответствующие спектры ЭПР. В БСА была введена спнн-метка SL1 (рис. 2) по остатку С34 путем добавления недостатка (в молярном отношении) SL1, растворенной в смеси этанол-диоксаи (20:1 по объему) к раствору белка в фосфатном буфере (0.025 М, рН 7.0). В этих условиях метка полностью прореагировала, что следовало из отсутствия узких сигналов в спектрах.

Величина 2Azz была определена как расстояние между крайними широкими пиками спектра замороженного раствора спин-меченого БСА при 77К, и принята равной 70.7 Гс. Путем анализа спектра раствора свободной SL1 была определена изотропная компонента СТС 2ао = |(Дта + Ауу + Azz), которая оказалась равной 31.4 Гс. Магнитные параметры, использовавшиеся при моделировании спектров, собраны в таблице 1. Рис. 2: Метка SL1.

В ходе эксперимента было записано 28 спектров ЭПР при температурах от 274 до 313 К. Вязкость раствора в образце варьировали добавлением сахарозы (от 0 до 40% по массе), концентрацию которой определяли рефрактометрически. Расчет вязкости Таблица 1: Магнитные пара-производили бикубической интерполяцией по экс- метры SL1. периментальной таблице (Otlimer D. F., Silvis S. J., Sugar 1948, 43, 32). Для обработки результатов было произведено предварительное моделирование спектров в аксиалыю-симметричпом приближении (модель ограниченных случайных блужданий), и найдены параметры а и Ь в формулах (12) и (14). Их значения определялись путем измерения расстояния между КШП в теоретических спектрах, полученных при различных значениях т и параметра упорядоченности S, и построения зависимости вида (12) в логарифмической шкале. Пример такой зависимости, полученной для ширины лоренцовой линии, равной 1.1 Гс, приведен на рисунке 3. Прямая на этом рисунке соответствует аппроксимации полученной зависимости линейной функцией согласно (12). Для ширины линии 1.1 Гс

Зх:с 2.0088 А ■ J vo: 6.0 Гс

9уу 2.0058 А 6.0 Гс

9zz 2.0023 Azz 35.3 Гс

были получены а = 0.852 и Ь = 1.62, которые и были использованы при расчете времен корреляции и параметров упорядоченности. Поскольку параметры а и Ь в формулах (12) и (14) зависят от ширины индивидуальной линии т (в Гс), такая зависимость была рассчитана и оказалось, что она хорошо аппроксимируется линейными функциями а = (0.168 ± 0.004)ад + (0.677 ± 0.006) и Ь = (—0.153 ± 0.004)и> + (1.779 ± 0.007). Это значительно упрощает всю процедуру, поскольку отпадает необходимость пересчета большого числа спектров при выборе оптимального значения ги.

Результаты обработки эксперимента по '. температурпо-вязкостной зависимости для БСА представлены на рисунке 4. Пять пря- ^^

мых линий соответствуют температурам от ад'1.?"1 274 до 313 К. Экстраполяцией этих пря- 0 |' ^ч.

мых к нулю были найдеиы величины 2Лц

для различных температур, и, соответствен- __

по, параметры упорядоченности по формуле 1 10 Т5/нс 100

лы (14) были найдены значения времен корреляции БСА при различных температурах. Эти результаты представлены в таблице 2. Полученные таким образом величины г и 5 были использованы в качестве исходных параметров для моделирования спектров в рамках обобщенной модели ограниченных осцилляций в соответствии со схемой, описанной в предыдущем разделе; оптимальные значения этих параметров представлены в таблице 3. В результате было получено хорошее согласование теоретических спектров с экспериментальными во всем диапазоне температур (рис. 5).

(7). Полученные значения для 2Лц и 5 собраны в таблице 2.

С использованием этих данных и форму-

Рис. 3: К определению параметров а и b температурно-вязкостной зависимости спин-меченого БСА. Дг = 2(Лц — Ау), До = 2(Агг — ао).

Рис. 4: Темиературно-вязкостные зависимости для БСА, меченого ЭЫ, при различных температурах.

О 10 20 30 40 50

(T/ti)" / (К/сП/

274 К

Эксперимент Теория

3200 3220 3240 3260 3280 3300 3200 3220 3240 3260 3280 3300 Магнитное поле / Гс Магнитное поле / Гс

3200 3220 3240 3260 3280 3300 3200 3220 3240 3260 3280 3300

Магнитное поле / Гс

Магнитное поле / Гс

Рис. 5: Сравнение рассчитанных спектров ЭПР спин-меченого БСА с экспериментальными.

Температура, К 274 283 293 303 313

2Лц, Гс Параметр упорядоченности 5 70.3 0.99 69.9 0.98 69.6 0.97 69.1 0.95 68.2 0.93

Таблица 2: Значения параметра упорядоченности 3 движения метки, присоединенной к БСА

Температура, К Х(1) Х(2) & время корреляции т, не

274 0.878 0.564 0.96 79

283 0.853 0.489 0.93 58

293 0.838 0.444 0.88 43

303 0.832 0.429 0.86 33

313 0.827 0.413 0.84 25

Таблица 3: Параметры обобщенной модели быстрых осцилляцлй, использованные при моделировании спектров спин-меченого БСА.

Гибкость Fab-фрагмента иммуноглобулина М человека

Фрагмент Fab иммуноглобулина М (IgM) человека отвечает за связывание различных антигенов. Существуют, однако, разновидности IgM, называемые ревматоидными факторами (RF), способные связывать собственные иммуноглобулины G (IgG). При некоторых автоиммунных заболеваниях, таких, как ревматоидный артрит, их концентрация в крови резко повыша-Рис. 6: Метка SL2. ется, что приводит к образованию агрегатов с собственными IgG человека. Ряд исследований указывает, что биологические свойства IgM-RF обусловлены его различиями с нормальным IgM в области Fab-фрагмента. В частности, известно, что Fab-RF характеризуется наличием альтернативного сайта связывания антигена, наличием изгиба в области соединения V и С доменов, а также отличиями в характере взаимодействия легкой и тяжелой цепей между доменами — Сй и Vl — Cl.

Для исследования динамики Fab-фрагментов моноклональных IgM и IgM-RF (болезнь Вальденштрема) в них вводилась метка SL2 (2,2,6,6-тетраметил-4-(2,4-дихлортриазиниламин)-пиперидин-1-оксил, рис. 6).

Наличие крайних широких пиков на фоне сигнала свободной метки при большом значении усиления указывало на ковалентное связывание метки с белком. После отделения свободной метки путем диализа против 0.01М буфера Tris-HCl (рН 8.3), содержащего 0.1М NaCl и 0.02% NaN3 и последующей гель-фильтрации на колонке (Sephadex G-25), была измерена температурно-вязкостиая зависимость спектров ЭПР. Было записано 18 спектров при температурах 274 и

9x1 2.0071 Ахх 8.0 Гс

9уу 2.0059 Ауу 6.0 Гс

9zz 2.0017 Azz 37.25 Гс

Таблица 4: Магнитные параметры SL2, использованные при моделировании спектров Fab и Fab-RF.

Fab Fab-RF

Рис. 7: Температурно-вязкостные зависимости расстояния между КШП спектров ЭПР спин-меченых РаЬ-фрагментов ^М и ^М-ИР с параметрами а = 1.41 не и Ь = —1.39.

293 К и концентрациях сахарозы от 0 до 40% по массе. Полученные зависимости расстояния между КШП (в Гс) 2А' для спин-меченых фрагментов Fab от величины Т/г) показаны па рисунке 7. Отклонение от линейности, наблюдаемое при ~ 40% сахарозы объясняется, по-видимому, нарушением условия независимости движения спин-метки относительно макромолекулы и более медленных компонент при высоких значениях вязкости раствора. И сходя из линейных участков зависимостей, в соответствии с формулами (12) и (14), были определены параметры упорядоченности S быстрого движения и времена корреляции вращательной диффузии молекулы Fab (таблица 5). Значения параметра S, как видно

Таблица 5: Параметры упорядоченности S и времена корреляции Fab и Fab-RF

из таблицы, были приблизительно одинаковыми для IgM и IgM-RF, что говорит о незначительных локальных различиях в структуре последних в области присоединения метки. Однако найденные значения времени корреляции г ревматоидного Fab (11 не) оказались практически в 2 раза меньше, чем для нормального (21 пс). Учитывая то, что молекулярная масса в обоих случаях практически одинакова (50 кДа), такое резкое уменьшение времени корреляции может быть объяснено только тем, что ревматоидный Fab не является копформационио жесткой единицей, и обладает внутренней гибкостью. В то же время, величина т = 21 не для нормального Fab соответствует его молекулярной массе в предположении, что он является копформационио жестким. Косвенно на гибкость Fab-RF указывает н тот факт, что время его удержания на колонке при отделении от избытка свободной метки было заметно больше, чем нормального Fab. Такое влияние гибкости макромолекул на их поведение при гель-фильтрации па сефадексе было описано в литературе (Livshitz М.А., et al, J. Biomol. Struct. Dyn. 1990, 7, 1237).

Упомянутый изгиб междоменных V — С участков ревматоидного Fab (структура 1ADQ в банке данных PDB) позволяет предполагать, что именно они ответственны за гибкость молекулы. Схематически Fab и Fab-RF фрагменты показаны па рисунке 8, где стрелками отмечены петли, соединяющие V и С домены. В случае Fab-RF известно также, что эти петли содержат несколько остатков пролина и глицина, что характерно для шарнирных участков (hinge regions), соединяющих фрагменты Fab и Fe в иммуноглобулине. В то же время в нормальном Fab

Образец Температура, К 2Л,|, Гс S Т, НС

Fab 274 60.2 0.65 38

293 58.6 0.61 21

Fab-RF 274 59.8 0.64 20

293 57.9 0.59 И

V — С участки содержат лишь один остаток Gly. Таким образом, предположение о локализации гибкости в области между V и С доменами Fab-фрагмента IgM-RF (стрелки на рисунке 8) является вполне оправданным.

Таблица 6: Параметры обобщенной модели быстрых осцилляции, использованные при моделировании спектров Fab и Fab-RF.

Fab Fab-RF

Температура, К x(i) Х(2) & х(1) Х(2) S3

274 0.78 0 0.2 0.75 0.2 0.2

293 0.74 0 0.2 0.72 0.2 0.2

Моделирование спектров производилось путем подстановки компонент магнитных тензоров, усредненных с помощью обобщенной модели (3-5), в процедуру расчета спектров, основанную на методе SLE. Параметры, использованные при моделировании, приведены в таблицах 4 и 6. Сравнение рассчитанных спектров с экспериментальными, полученное в данном иследовании, представлены на рисунке 9. Из спектра Fab-RF видно, что он также содержит слабо иммобилизованную компоненту со сравнительно узкими линиями, которая была добавлена при моделировании в соотношении 0.2:0.8. Появление ее указывает на связывание метки в наиболее лабильных учасках макромолекулы, и также говорит в пользу большей гибкости ревматоидного Fab по сравнению с нормальным.

Таким образом, селективность представленного в работе метода по отношению к быстрому движению играет существенную роль в исследовании фрагментов Fab. Разделение эффектов локальной подвижности метки и медленной диффузии, базирующееся на температурно-вязкостной зависимости, позволило однозначно утверждать, что различия в спектрах Fab и Fab-RF обусловлены не локальными коиформационными различиями, а изменением вращательной динамики молекулы как целого, что привело к обнаружению междоменной гибкости ревматоидного Fab.

Рис. 9: Спектры ЭПР спин-меченого РаЬ-фрагмента ^М (а-<1) и ^М-Ш? (а'-сГ) при различных температурах и значениях вязкости: (а, а') г) = 1.723 сП; (Ь, Ь') г) = 7.834 сП; (с, с') т] = 1.004 сП; (<!, сГ) г) = 3.800 сП.

8. Образование комплекса барстар-барназа

Взаимодействия белок-белок образуют основу механизмов распознавания биологических структур, и поэтому привлекают внимание многих исследователей. Для иследования подобных взаимодействий очень удобным объектом является белок барстар (Bs), являющийся ингибитором рибонуклеазы бариазы (Вп), и обладающий к ней очень высокой аффинностью. В данной работе было проведено исследование мутанта С40А белка Bs методом селективного спин-мечения по остатку цистеина С82. Этот остаток содержит единственную сульфгидрильную группу, которая экспонирована на поверхность молекулы, и, таким образом, доступна для мечения. При этом замена С40А не влияет существенно на аффинность мутанта к Вп (Wong К.В., et al, J. Mol. Biol. 1997, 268, 494). Для исследования были использованы две различные метки (SL3 — 3-(2-малеимидоэтилкарбамоил)-2,2,5,5-тетраметилпирролидин-1-оксил, рис. 10 и SL1, рис. 2), обладающие различной жесткостью и длиной линкера, и, таким образом, чувствительные к несколько различным микроокружениям при присоединении к белку. Величины изотропной СТС ао и Azz для метки SL3 равнялись, соответственно, 35.8 и 31.8 Гс.

ниями в спектрах, выражавшееся, прежде всего, в изменении положения КШП, что отражено в температурно-вязкостных зависимостях (рис. 11). Полученные значения параметров упорядоченности и времен корреляции приведены в таблице 7. Как видно, значения т для комплексов Вп • Вв—ЯЫ и Вп • Вб—БЬЗ приблизительно одинаковы, поскольку тип метки практически не влияет на диффузию макромолекулы как целого. Различие в параметрах ¿> связано с тем, что из-за различий в геометрии меток ЯЬЗ и ЭЫ они чувствительны к несколько разным микроокружениям. Из увеличения значения 5 при связывании с барназой следует, что остаток С82 находится поблизости от интерфейса присоединения молекулы Вп, и в составе комплекса она создает дополнительные стерические ограничения для метки. Схема взаимодействия спин-меченого Вз с барназой показана на

Рис. 10: Метка SL3.

о

Исходный образец барстара был обработан 50 мМ ди-тиотриэтолом, и избыток которого удален на колонке КАР-5. Отделение избытка метки БЬЗ также производилось на колонке. Метка БЫ вводилась, как описано в разделе 6. В ходе эксперимента по температурно-вязкостной зависимости были записаны спектры свободного барстара с присоединенными ЯЫ и 8ЬЗ(Вз—БЫ, Вэ—ЯЬЗ), и спектры их комплексов с Вп(Вп • Вб—БЫ, Вп • В.ч—БЬЗ). Добавление к образцу бариазы сопровождалось значительными измене-

рис. 12(а). Эта схема также находится в соответствии с известной кристаллической структурой комплекса 1АУ7, имеющейся в банке данных РБВ.

Рис. 11: Температурно-вязкостные зависимости для барстара: (а) В&-БЬЗ и Вп • Вэ—ЭЬЗ, а = 1.14 не в выражении (14); (Ь) Вэ-ЭЫ, Вп-Вз-ЭЫ и (Вп-ЗЬ1)2, а = 1.26 не. Величина /3 = (Г1 = 0.74.

(а)

Спектры Вэ—БЫ при 274 К показаны на рисунке 13(а), где четко видны дополнительные КШП, более удаленные от центра спектра. Предположение, что эти пики относятся к димеру (Вп—8Ы)2 подтверждалось исследованием температурпо-вязкостной зависимости и моделированием спектров (рис. 13(Ь)). Времена корреляции и параметры упорядоченности для двух компонент спектра приве-Рис. 12: Схематичное представление дены в таблице 7. Из нее видно, что величина комплекса спин-меченого барстара с т при нормальных условиях, т.е. Т = 293 К барназой и димера барстара. оп, /7<1 ^

и вязкости т] = 1.004 для (Вп—ЫЛ)2 (7.2 не)

приблизительно в 2 раза превышает таковую для Вв—8Ь1(3.2 не). Поскольку молекула Вэ весьма компактна, факт появления второй компоненты с удвоенным временем г в спектре однозначно указывает па димеризацию Вэ. Структурные особенности димера, выявляемые методом спин-метки в нашей интерпретации, показаны на рисунке 12(Ь). В частности, видно, что остаток С82 расположен в пограничной области между интерфейсом присоединения молекулы барназы и участком поверхности, ответственным за димеризацию Вэ, что следует из увеличения параметра упорядоченности при димеризации (таблица 7). Отсутствие спин-спшювого взаимодействия в димере (Вп—8Ы)2 может быть объяснено тем,

Белок 5(274 К) г(293 К), не

Вз-ЭЬЗ 0.76 4.0

Вп • Вз-ЯЬЗ 0.96 9.0

Вз-БЫ 0.70 3.2

Вп • Вэ-БЫ 0.86 8.5

(ВП-81Л)2 0.89 7.2

Таблица 7: Параметры упорядоченности 5 и времена корреляции Вэ, комплекса с Вп, и димера Вэ.

что остатки С82 расположены в диаметрально противоположных точках поверхности димера, и расстояние между ними превышает 4 нм. Это находится в хорошем соответствии как с 2Б 15К — ЯМР (Когс1п^апоу Б. Э., еЛ а1, Л. Ат. СЬет. Бос. 2001, 123, 2068), так и рентгеноструктурными данными (структура 1В2Б). Таким образом, методы, позволяющие селективно моделировать эффекты быстрой переориентации спин-метки, основанные на модели быстрых осцилляций и методе температурно-вязкостной зависимости, позволяют исследовать явления белок-белковых взаимодействий и выявлять основные структурные и динамические особенности исследуемых объектов, как было показано в случае с взаимодействием барстар-барназа. Помимо этого было показано, что выбор спиновой метки также важен с точки зрения характера получаемых результатов. В рассмотренном случае использование метки с более жестким линкером позволило идентифицировать дополнительные КШП в спектрах, указывающие на образование димера Вб.

Рис. 13: (а) Экспериментальные спектры Вз-БЬЗ при температуре 274 К и различной вязкости; (Ь) Рассчитанные спектры Вэ—БЬЗ при раличных значениях времени корреляции.

9. Экспериментальная часть

В экспериментальной части приведены параметры записи спектров ЭПР, процедуры приготовления образцов сиип-мечепых белков и некоторые технические детали обработки экспериментальных данных.

Выводы

1. Построено обобщение модели быстрых ограниченных осцилляций иптрок-сила, расширяющее область ее применимости па более широкий класс движений, и позволяющее лучше воспроизводить особенности экспериментальных спектров. Это обобщение включает в качестве частных случаев многие используемые в настоящее время модели, основанные на частичном усреднении спинового гамильтониана.

2. Разработана комбинированная схема для моделирования спектров ЭПР, включающая в себя экспериментальную методику измерения температур-но-вязкостпой зависимости, и обладающая селективностью по отношению к эффектам быстрого анизотропного движения питроксила. С ее помощью возможна четкая и однозначная интерпретация спектров ЭПР спии-меченых макромолекул в растворе.

3. Показана применимость дайной схемы на примере БСА, и в результате моделирования получено хорошее согласование рассчитанных спектров с экспериментальными.

4. С использованием предложенных подходов проведено исследование белок-белкового взаимодействия в системе барстар-барназа, методом ЭПР показана способность барстара к димеризации. Проведено исследование РаЬ-фрагментов моноклонального иммуноглобулина М человека, и показано, что РаЬ-фрагмент ревматоидного фактора ^М-ИР обладает внутренней гибкостью. Показано, что селективность по отношению к быстрому движению играет важную роль для выявления структурных и динамических особенностей макромолекул методом спиновых меток.

Список литературы

Статьи

[1] Timofeev V. P., Novikov V. V., Tkachev Y. V., Balandin Т. G., Makarov A. A., Deyev S. M. Spin label method reveals barnase-barstar interaction: a temperature and viscosity dependence approach //J. Biomol. Struct. Dyn. — 2008. — Vol. 25. - Pp. 525-534.

[2] Тимофеев В. П., Баландин Т. Г., Ткачев Я. В., Новиков В. В., Лапук В. А., Деев С. М. Использование динамического метода спин-метки для изучения комплекса барстар-барназа // Биохимия. — 2007. — Т. 72. — С. 994-1002.

[3] Тимофеев В. П., Ткачев Я. В., Новиков В. В., Варламова Е. Ю., Лапук В. А. Сравнительное изучение глобулярной структуры Fab-фрагментов мо-ноклональных ревматоидного и неревматоидного иммуноглобулинов М // Биофизика. - 2005. - Т. 50. - С. 787-792.

[4] Timofeev V. P., Tkachev Ya. V., Novikov V. V., Alyoshkin V. A., Lapuk V. A. Is the Fab-fragment from monoclonal rheumatoid IgM flexible? A spin label dynamics study // J. Biomol. Struct. Dyn. - 2005. - Vol. 23. - Pp. 175-181.

Тезисы докладов

[5] Tkachev Ya. V. The general form of fast oscillation model and its consequences for nitroxide EPR spectra interpretation in biological systems // EUROMAR Magnetic Resonance Conference, Gothenburg, Sweden, July 5-9. — 2009.

[6] Tkachev Ya. V. Spin-labeled macromolecules EPR spectra interpretation with modified temperature and viscosity dcpendcnce technique combined with fast motion models // XXI Symposium "Modern Chemical Physics", Tuapse, Russia, September 25 - October 6. - 2009.

[7] Tkachev Ya. V., Timofeev V. P. Fast Motion Models Help Separating Dynamic Effects on EPR Spectra of Spin-Labeled Macromolecules // 5th International Conference on Nitroxide Radicals, Ancona, Italy, September 7-11. — 2008.

[8] Timofeev V. P., Novikov V. V., Tkachev Ya. V. Is the Motion of TEMPO in the Membrane Isotropic? McConnel's Paradigm // 5th International Conference on Nitroxide Radicals, Ancona, Italy, September 7-11. — 2008.

[9] Tkachev Ya. V., Timofeev V. P. Two-Motion Effect on EPR Spectra of SpinLabeled Macro molecules: Unambiguous Interpretation // EUROMAR Magnetic Resonance Confcrenco, St. Petersburg, Russia, July 6-11. — 2008.

[10] Timofeev V. P., Tkachev Ya. V., Novikov V. V. Protein-Protein Interaction of Barnase-Barstar and Barstar-Barstar: EPR Simulation Approach // EUROMAR Magnetic Resonance Conference, St. Petersburg, Russia, July 6-11. — 2008.

[11] Tkachev Ya. V., Timofeev V. P. Interpretation of EPR Spectra of Spin-Labeled Macromolecule using Two-Motion Models: Approaces to Spectra Simulation using MD Trajcctorics // The International Conference "Modern Development of Magnetic Resonance", Kazan, Russia, September 24-29. — 2007.

[12] Timofeev V. P., Tkachev Ya. V., Novikov V. V. Covalently Bound Spin Labels Elucidate Protein-Protein Interaction of Barnase-Barstar and Barstar-Barstar: Simulation Approach // The International Conference "Modern Development of Magnetic Resonance", Kazan, Russia, September 24-29. — 2007.

[13] Novikov V. V., Tkachev Ya. V., Timofeev V. P. Describing spin label motion: ordering potential or partial averaging? // XI International Young Scientific School "Actual Problems of Magnetic Resonance and its Applications", Kazan, Russia, September 23-28. - 2007.

[14] Novikov V. V., Tkachev Ya. V., Lapuk V. A., Timofeev V. P. A Spin-Label Dynamics Study of Flexibility of IgM Rheumatoid Monoclonal Fab Fragment // 4th International Conference on Nitroxide Radicals: Synthesis, Properties and Implications of Nitroxides, Novosibirsk, Russia, September 20-24. — 2005.

Работа выполнена при поддержке государственного контракта от 12 апреля 2010 г. №02.740.11.0776 «Определение патогенных форм бета-амилоида и их взаимодействий с молекулярными партнерами для выявления лекарственных мишеней болезни Альцгеймера»

Заказ № 94-аЛ1/2010 Подписано в печать 12.11.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

;!йг::\\ ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

И. ^у/ www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Ткачев, Ярослав Владимирович

Список сокращений, использованных в работе

Введение

1 Обзор литературы

1.1 Особенности применения метода ЭПР к биологическим объектам. Метод спиновых меток.

1.2 Спектры ЭПР ориентированных нитроксильных радикалов

1.3 Эффекты магнитной релаксации.

1.4 Влияние молекулярного движения на спектры ЭПР.

1.5 Спектры спин-меченых макромолекул и роль быстрого движения нитроксила.

1.6 Модели быстрого движения.

1.7 Моделирование спектров ЭПР нитроксильных радикалов.

2 Обратная задача ЭПР для спин-меченых макромолекул

3 Обобщенная модель быстрых осцилляций

3.1 Спиновый гамильтониан.

3.2 Модель быстрых осцилляций.

3.3 Обобщение модели быстрых осцилляций

3.4 Свойства оператора усреднения тензоров.

3.5 Частные случаи.

4 Модифицированный метод температурновязкостной зависимости спектров ЭПР

5 Общая схема решения обратной задачи ЭПР

6 Применение общей схемы к исследованию БСА

7 Гибкость ЕаЬ-фрагмента иммуноглобулина М человека

8 Образование комплекса барстар-барназа

9 Экспериментальная часть

9.1 Материалы и методы исследования

9.2 Спин-мечение БСА.

9.3 Введение спин-метки в препарат ЕаЬ-фрагмента.

9.4 Мечение белка барстар.

9.5 Эксперимент по температурно-вязкостной зависимости.

Выводы

А Матричные выражения для вычисления усредненных компонент тензоров

В Преобразования между различными параметризациями моделей быстрых осцилляций

Введение Диссертация по биологии, на тему "Селективное моделирование эффектов быстрого вращательного движения нитроксила в спектрах ЭПР спин-меченых биомакромолекул"

В настоящее время использование метода электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), и, в часности метода спиновых меток, в молекулярной биологии представляет значительный интерес. Это связано, в первую очередь с тем, что данный метод предоставляет возможность получения информации о структуре и динамике сложных биологических объектов, в первую очередь, макромолекул белков и нуклеиновых кислот [1, 2]. Кроме того, имеется возможность исследования и более сложных надмолекулярных образований, таких как биологические мембраны [3, 4, 5, 6], а также биохимических процессов, происходящих на надмолекулярном уровне, в частности, механизмов белок-белкового взаимодействия, связывания лигандов с рецептором, фоторецепции [7], механизмов двигательной активности [8, 9, 10]. Данный метод позволяет исследовать структурные и динамические свойства макромолекул в интервале температур, соответствующему физиологическим нормам. Метод является чувствительным к молекулярным движениям в диапазоне времен корреляции Ю-11 - 10~7 с, и поэтому позволяет исследовать более быстрые процессы, чем родственный метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР).

В настоящее время существует значительное число подходов к расчету спектров ЭПР нитроксильных радикалов, используемых в качестве спиновых меток, в растворе, включая методы стохастической динамики, методы, основанные на модели БШ^ [11], а также расчеты по методу молекулярной динамики (МД, например [12]). Несмотря на это, проблема решения обратной задачи — надежного определения динамических и структурных характеристик исследуемого объекта (ансамбля спин-меченых макромолекул), исходя из данных ЭПР, остается открытой. Недостатком наиболее распространенных методов многомерной параметрической оптимизации (например, сопряженных градиентных методов [13]), за исключением простейших случаев, является неоднозначность полученных результатов, вызванная зависимостью от выбора начального приближения. В системах со сложной динамикой, каковыми являются биологические макромолекулы, различные компоненты молекулярного движения могут иметь сходное влияние на форму спектров ЭПР, что также создает затруднения при интерпретации таких спектров. Возможное решение этой проблемы состоит в комбинации теоретических моделей и экспериментальных техник, обладающих селективностью по отношению к движениям разного типа. Следовательно, развитие уже существующих и разработка новых способов моделирования эффектов динамики спип-меченых макромолекул в спектрах ЭПР, с учетом описанных особенностей, является весьма актуальной задачей.

1 Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Ткачев, Ярослав Владимирович

Выводы

1. Построено обобщение модели быстрых ограниченных осцилляций нит-роксила, расширяющее область ее применимости на более широкий класс движений, и позволяющее лучше воспроизводить особенности экспериментальных спектров. Это обобщение включает в качестве частных случаев многие используемые в настоящее время модели, основанные на частичном усреднении спинового гамильтониана.

2. Разработана комбинированная схема для моделирования спектров ЭПР, включающая в себя экспериментальную методику измерения темпе-ратурно-вязкостной зависимости, и обладающая селсктивностью по отношению к эффектам быстрого анизотропного движения нитроксила. С ее помощью возможна четкая и однозначная интерпретация спектров ЭПР спин-меченых макромолекул в растворе.

3. Показана применимость дайной схемы на примере БСА, и в результате моделирования получено хорошее согласование рассчитанных спектров с экспериментальными.

4. С использованием предложенных подходов проведено исследование белок-белкового взаимодействия в системе барстар-барназа, методом ЭПР показана способность барстара к димеризации. Проведено исследование РаЬ-фрагментов моноклонального иммуноглобулина М человека, и показано, что ЕаЬ-фрагмент ревматоидного фактора ¡¿М-ИР обладает внутренней гибкостью. Показано, что селективность по отношению к быстрому движению играет важную роль для выявления структурных и динамических особенностей макромолекул методом спиновых меток.

А Матричные выражения для вычисления усредненных компонент тензоров

Матрица оператора Ь (63):

0 Пз -П2

Ц п) = -п3 0 щ п2 -П1 0

Матрица оператора Ь2:

Ь\„) = щ — 1 ть\т12 —пхщ

П2П1 п\-1 п2щ ПзЩ -щп2 тг| — 1

115)

Матрицы вращения на углы и тг:

Ц = Т(п, = 1 + ^ ¿(п) + (1 - ^ )£2(п) Г|=Т(п,|) = 1 + Ь(п) + Ь2(п)

116)

Т, = Г(п>7г) = 1 + 2Ь2(п) Матрицы Ац, используемые для вычисления усредненного тензора в (71):

Ли = \{А- Тж*АТп) А12 = | - ЦАЦ*)

117)

А21 = КЛ + Г/АТ^-Т.М^-^АГ^)

А22 = 2 (лДТ«АТк* - Тк*АТ* + Тж*АТк - ТьАТт:*)

4 у 2 2 2 2 4 4 44/

Т* обозначает транспонированную матрицу вращения Т*(п, 6) = Т(—п, 5). Действительная и мнимая части характеристической функции х в точках 1 и 2:

Xu = к* x(i)

Х21 = TU х(2) Х22 = Ъп х(2)

Усредненный тензор, выраженный через через матрицы А^ (117) и значения характеристической функции (118): = Л + (Хп - 1)^11 + Xi2A12 + (X2i - 1)А21 + Х22А22 (119)

После вычисления этого выражения, тензор в общем случае должен быть приведен к главным осям. Наклон осей тензора А относительно д также изменяется после усреднения, что также должно быть учтено.

Реализация процедуры усреднения тензоров с использованием приведенных здесь выражений на языке Python, также разработанная в ходе работы, с сопутствующей документацией, доступна с ресурса нашей лаборатории ftp://nmr.eimb.relarn.ru/pub/avg.

В Преобразования между различными параметризациями моделей быстрых осцилляций

Ось осцилляции определена в полярных координатах в, ср:

Величины Si (см. [67]): щ = sin 0 cos (р

TL<i — sin 6 sin Lp (120)

Пз = cos в

Я 77? — 1 $ = —V-, ¿ = 1,2,3 (121)

Параметр w, использованный Гриффитом (в оригинальной работе обозначен как W), дополненный параметром v при построении обобщенной модели: w = cos2 0

122) v = cos2 ip

Величины Ss (в оригинале обозначена SR), и х, использованные В.П. Тимофеевым [67]:

С 3 cos2 0-1

Ь3 --2

123) х = 1 — 2 cos <р

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Ткачев, Ярослав Владимирович, Москва

1. Hustedt E. J., Spaltenstein A., Kirchner J. J., Hopkins P. B., Robinson B. H. Motions of short DNA duplexes: An analysis of DNA dynamics using an EPR-active probe // Biochemistry. 1993. - Vol. 32. - Pp. 1774-1787.

2. Key es R. S, Bobst M. A. Detection of internal and overall dynamics of a two-atom-tethered spin-labeled DNA // Biochemistry. — 1995. — Vol. 34. — Pp. 9265-9276.

3. Earle K. A., Moscicki J. K., Ge M., Budil D. E., Freed J. H. 250-GHz electron spin resonance studies of polarity gradients along the aliphatic chains in phospholipid membranes // Biophysical Journal. — 1994.— Vol. 66. Pp. 1213-1221.

4. Ge M., Freed J. H. Polarity Profiles in Oriented and Dispersed Phosphatidylcholine Bilayers Are Different: An Electron Spin Resonance Study // Biophysical Journal. — 1998. Vol. 74. - Pp. 910-917.

5. Ge M., Freed J. H. Electron-Spin Resonance Study of Aggregation of Gramicidin in Dipalmitoylphosphatidylcholine Bilayers and Hydrophobic Mismatch // Biophysical Journal. — 1999. — Vol. 76. — Pp. 264-280.

6. Steinhoff H-J., Savitsky A., Wegener C., Pfeiffer M., Plato M., Möbius K. High-field EPR studies of the structure and conformational changes of site-directed spin labeled bacteriorhodopsin // Biochim. Biophys. Acta. — 2000. Vol. 1457. - Pp. 253-262.

7. Agafonov R. VNegrashov I. V., Tkachev Ya. V., Blakely S. E., Titus M. A., Thomas D. D., Nesmelov Yu. E. Structural dynamics of the myosin relay-helix by time-resolved EPR and FRET // Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. -2009. Vol. 106. - Pp. 21625-21630.

8. Nesmelov Yu. E., Agafonov R. V., Burr A. R., Weber R. T., Thomas, D. D. Structure and dynamics of the force-generating domain of myosin probed by multifrequency electron paramagnetic resonance // Biophysical Journal. — 2008. Vol. 95. - Pp. 247-256.

9. Baker J. E., Brust-Mascher I. A large and distinct rotation of the myosin light chain domain occurs upon muscle contraction // Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 1998. - Vol. 95. - Pp. 2944-2949.

10. Liang Z., Freed J. H. An assessment of the applicability of multifrequency ESR to study the complex dynamics of biomolecules // J. Phys. Chem. — 1999. Vol. 103. - Pp. 6384-6396.

11. Sezer D., Freed J. H., Roux B. Parametrization, molecular dynamics simulation, and calculation of electron spin resonance spectra of a nitroxide spin label on a polyalanine alpha-helix // J. Phys. Chem. B. — 2008. — Vol. 112.-Pp. 5755-5767.

12. Khairy K., Budil D., Fajer P. Nonlinear-least-squares analysis of slow motional regime EPR spectra // Journal of Magnetic Resonance. — 2006. — Vol. 183. Pp. 152-159.

13. Swartz H., Bolton J.R., Borg D. (eds). Biological Application of Electron Spin Resonance Spectroscopy. — New York, Wiley (Interscience), 1972.

14. Лихтенштейн Г. И. Метод спиновых меток в молекулярной биологии. — Москва, «Наука», 1974.

15. Berliner L. J. (ed). Spin Labeling: Theory and Applications. — New York, Academic Press, 1976.

16. Burr M., Koshland D.E., Jr. Use Of "Reporter Groups"in Structure-Function Studies of Proteins // Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.— 1964,— Vol. 52. Pp. 1017-1024.

17. Бучаченко A. JJ., Вассермаи A. M. Стабильные радикалы. — Москва, «Химия», 1973.

18. Розанцев Э. Г. Свободные иминоксильные радикалы. — Москва, «Химия», 1970.

19. Hull H. H., Chang R., Kaplan L. J. On the location of the sulfhydryl group in bovine plasma albumin // Biochim. Biophys. Acta. — 1975. — Vol. 400. — Pp. 132-136.

20. Fajer P. G. In Encyclopedia of Analythical Chemistry. — John Wiley & Sons Ltd, Chichester, 2000. Pp. 5725-5761.

21. Altenbach C., Flitsch S. L. Structural studies on transmembrane proteins.

22. Spin labeling of bacteriorhodopsin mutants at unique cysteines // Biochemistry. 1989. - Vol. 28. — Pp. 7806 7812.

23. Абрагам А. Ядерный магнетизм. — ИЛ, 1963.

24. Сликтер Ч. Основы теории магнитного резонанса. — Москва, «Мир», 1981.

25. Эрнст Р., Боденхаузен Док., Вокаун А. ЯМР в одном и двух измерениях. — Москва, «Мир», 1990.

26. Жидомиров Г.М., Счастнев П.В., Чувылкин Н.Д. Квантово-химические расчеты магнитно-резонансных параметров. — Наука, Новосибирск, 1977.

27. Memory J. D. Quantum theory of magnetic resonance parameters. — McGraw-Hill, New York, 1968.

28. Ando I., Webb G. A. Theory of NMR parameters. — Academic Press, New York, 1983.

29. Пейк Дж. Парамагнитный резонанс. — Москва, «Мир», 1965.

30. Nordio P. L. In Spin Labeling: Theory and Applications. — New York, Academic Press, 1976. — Pp. 5-52.

31. Goldman S. A., Bruno G. V., Polnazek C. F., Freed J. H. An ESR Study of Anisotropic Rotational Reorientation and Slow Tumbling in Liquid and Frozen Media //J. Chem. Phys. 1972. - Vol. 56. - Pp. 716-735.

32. Hustedt E. J., Beth A. H. NITROXIDE SPIN-SPIN INTERACTIONS: Applications to Protein Structure and Dynamics // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1999. - Vol. 28. - Pp. 129-153.

33. Griffith О. H., Jost, Р. С. In Spin Labeling: Theory and Applications.— New York, Academic Press, 1976. Pp. 453-523.

34. Ohnishi S., Boeyens J. C. A., McConnell H. M. Spin-labeled hemoglobin crystals // Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. — 1966. —Vol. 56, — Pp. 809-813.

35. Дудич И. В. — Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук, Москва. — 1979.

36. Александров И. В. Теория магнитной релаксации. Релаксация в жидких и твердых неметаллических парамагнетиках. — Москва, «Наука», 1975.

37. Abragam A., Pryce М. Theory of the Nuclear Hyperfine Structure of Paramagnetic Resonance Spectra in Crystals // Proc. Roy. Soc. — 1951. — Vol. 205.-Pp. 135-153.

38. Block F. Nuclear Induction // Phys. Rev. 1946. - Vol. 70. — Pp. 460-474.

39. Torrey H. C. Bloch Equations with Diffusion Terms // Phys. Rev. — 1956. — Vol. 104. Pp. 563-565.

40. McCalley R. C., Shimshick E., J., McConnell H. M. The effect of slow rotational motion on paramagnetic resonance spectra // Chem. Phys. Lett. — 1972. Vol. 13. - Pp. 115-119.

41. Kubo R. Stochastic Liouville Equations // J. Math. Phys1963.— Vol. 4. Pp. 174-183.

42. Tanim,ura Y. Stochastic Liouville, Langevin, Fokker-Planck, and Master Equation Approaches to Quantum Dissipative Systems //J. Phys. Soc. Jpn. 2006. - Vol. 75. - Pp. 082001-1-39.

43. Block F. Dynamical Theory of Nuclear Induction. II // Phys. Rev. — 1956. — Vol. 102. Pp. 104-135.

44. Block F: Generalized Theory of Relaxation // Phys. Rev.~ 1957.- Vol. 105. Pp. 1206-1222.

45. Weiss U. Quantum Dissipative Systems. — World Scientific Publishing Co., 1999.

46. McConnell, H. M., McFarland B. J. Physics and chemistry of spin labels // Quarterly Rev. Of Bioph. 1970. - Vol. 3. - Pp. 91-136.

47. Liang Z. C., Lou Y. A Multifrequency Electron Spin Resonance Study of T4 Lysozyme Dynamics Using the Slowly Relaxing Local Structure Model // J. Phys. Chem. B.

48. Waugh J. S. (ed.). Advances in Magnetic Resonance, Vol. 1.— Academic Press, New York and London, 1965.

49. Kivelson D. Electron spin relaxation in liquids. — New York, Plenum, 1972.

50. Freed J. H., Fraenkel G. K. Theory of Linewidths in Electron Spin Resonance Spectra // J. Chem. Phys. 1963. - Vol. 39. - Pp. 326-348.

51. Freed J. H. In Spin Labeling: Theory and Applications. — New York, Academic Press, 1976. Pp. 53-132.54| Кузнецов A. H. Метод спинового зонда. — Москва, «Наука», 1976.

52. Валиев, К. А., Иванов Е. Н. Вращательное броуновское движение // УФН. 1973. - Т. 109. - С. 31-64.

53. Fajer P. J., Bennett B., Polnazek C., Fajer E. A., Thomas D. General method for multiparameter fitting of high-resolution EPR spectra using a simplex algorithm //J. Magn. Res. 1990. - Vol. 88. — Pp. 111-125.

54. Budil D. E., Lee S., Saxena S., Freed J. H. Nonlinear-least-squares analysis of slow-motion EPR spectra in one and two dimensions using a modified Levenberg-Marquardt algorithm // J. Magn. Res. — 1996. — Vol. 120. — Pp. 155-189.

55. Goldman S. A., Bruno G. V.; Freed J. H. Estimating slow-motional rotational correlation times for nitroxides by electron spin resonance / / J. Phys. Chem. 1972. - Vol. 76. - Pp. 1858-1860.

56. Goldman S. A., Bruno G. V., Freed J. H. ESR studies of anisotropic rotational reorientation and slow tumbling in liquid and frozen media. II. Saturation and nonsecular effects // J. Chem. Phys. — 1973. — Vol. 59. — Pp. 3071-3091.

57. Kay L. E. Protein dynamics from NMR // Nature, Structural Biology, NMR Supplement. 1998. - Pp. 513-517.

58. Peng J. W. Investigation of protein motions via relaxation measurements // Methods Enzymol. 1994. - Vol. 239. - Pp. 563-596.

59. Hartmann B., Lavery R. DNA Structural Forms // Q. Rev. Byophys.— 1996. Vol. 29. - Pp. 309-368.

60. Saupe A. Recent Results in the Field of Liquid Crystals // Angew. Chem. Int. Ed. 1968. - Vol. 7. - Pp. 97-112.

61. McConnel H. M. In Spin Labeling: Theory and Applications. — New York, Academic Press, 1976. Pp. 525-560.

62. Van S. P., Birrell G. B., Griffith O. H. Rapid anisotropic motion of spin labels. Models for motion averaging of the ESR parameters // J. Magn. Res. 1974. - Vol. 15. - Pp. 444-459.

63. Timofeev V. P., Samarianov B. A. About new universal approach to the EPR spectra simulation of the spin-labeled macromolecules // Appl. Magn. Res. 1993. - Vol. 4. - Pp. 523-539.

64. Timofeev V. P., Samarianov B. A. Dynamics of macromolecule spin-labeled side chain groups by electron spin resonance spectra simulation // J. Chem. Soc. (Perkin Trans.).- 1995. Vol. 2.-Pp. 2175-2181.

65. Timofeev V. P., Nikolsky D. O. The role of the fast motion of the spin label in the interpretation of EPR spectra for spin-labeled macromolecules // J. Biomol. Struct. Dyn. 2003. - Vol. 21. - Pp. 367-378.

66. Hubbel W. L., McConnell H. M. Motion of steroid spin labels in membranes // Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 1969. - Vol. 63.- Pp. 16-22.

67. Hubbel W. L., McConnell H. M. Orientation and motion of of amphiphilic spin labels in membranes // Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.— 1969.— Vol. 64. Pp. 20-27.

68. Hubbel W. L., McConnell H. M. Molecular motions in spin-labeled phospholipids and membranes // J. Am. Chem. Soc.— 1971.— Vol. 93.— Pp. 314-326.

69. Schindler H.; Seelig J. EPR spectra of spin labels in lipid bilayers II. Rotation of steroid spin probes //J. Chem. Phys.— 1974.— Vol. 61.— Pp. 2946-2949.

70. Seelig J. Spin label studies of oriented liquid crystals (a model system for bilayer membranes) // J. Am. Chem. Soc.— 1970. — Vol. 92, — Pp. 38813887.

71. Chernova D. A., Vorobiev A. K. Molecular mobility of nitroxide spin probes in glassy polymers. Quasi-libration model // Journal of Polymer Science Part B. 2009. - Vol. 47. - Pp. 107-120.

72. Chernova D. A., Vorobiev A. K. Temperature dependence of ESR spectra of nitroxide spin probe in glassy polymers // Journal of Polymer Science Part B. 2009. - Vol. 47. - Pp. 563-575.

73. Dzuba, S. A., Tsvetkov Y. D., Maryasov A. G. Echo-induced EPR spectra of nitroxides in organic glasses: model of orientational molecular motions near equilibrium // Chem. Phys. Lett. 1992. — Vol. 188. - Pp. 217-222.

74. Корн Г., Корн Т. Справочник по математике для научных работников и инженеров. — Москва, «Наука», 1978.

75. Schneider D. J., Freed, J. H. Spin Relaxation and Motional Dynamics // Adv. Chem. Phys. 1989. - Vol. 73. - Pp. 387-527.

76. Dammers A. J., Levine Y. K., Tjon J. A. Computation of magnetic resonance spectra from the stochastic liouville equation with Pade approx-imants // Chem. Phys. Lett- 1982. Vol. 88. - Pp. 198-201.

77. Dammers A. J., Levine Y. K., Tjon J. A. The Stochastic Liouville Equation and Pade Approximants //J. Stat. Phys. — 1988. — Vol. 53. — Pp. 109-123.

78. Mori H. Transport, Collective Motion, and Brownian Motion // Progr. The-or. Phys. 1965. - Vol. 33. - Pp. 423-455.

79. Giordano M., Grigolini P., Marin P. A generalization of Mori's approach to the non-hermitean case: a new versatile theoretical tool for computational purposes // Chem. Phys. Lett. 1981. - Vol. 83.- Pp. 554-558.

80. Sen S. Solving the Liouville equation for conservative systems: Continued fraction formalism and a simple application // Physica A. — 2006. — Vol. 360. Pp. 304-324.

81. Hay dock R., Kim D. B. Recursive solution of Liouville's equation / / Сотр. Phys. Comm. 1995. - Vol. 87. - Pp. 396-408.

82. Schneider D. J., Freed J. H. Calculating Slow Motional Magnetic Resonance Spectra: A User's Guide // In: Biological Magnetic Resonance (Plenum Publishing Corporation). — 1989. — Vol. 8. — Pp. 1-67.

83. Stillman A. E, Freed J. H. Stochastic modeling of generalized Fokker-Planck equations. I // J. Chem. Phys. 1980. - Vol. 72. - Pp. 550-566.

84. Polimeno A., Freed J. H. A Many-Body Stochastic Approach to Rotational Motions in Liquids // Adv. Chem. Phys. 1993. - Vol. 83. - Pp. 89-206.

85. Керрингтон А., Мак-Лечлан Э. Магнитный резонанс и его применение в химии. — Москва, «Мир», 1970.

86. Meirovitch Е., Nayeem М., Freed J. Н. Analysis of protein-lipid interactions based on model simulations of electron spin resonance spectra // J. Phys. Chem. 1984. - Vol. 88. - Pp. 3454-3465.

87. Шайтан К. В., Михайлюк М. Г., Леонтьев К. М., Сарайкин С. С., Беляков А. А. Молекулярная динамика изгибных флуктуаций элементов вторичной структуры белков // Биофизика. — 2002. — Vol. 47, — Pp. 411-419.

88. Stoica I. Using Molecular Dynamics To Simulate Electronic Spin Resonance Spectra of T4 Lysozyme //J. Phys. Chem. B. — 2004. — Vol. 108. — Pp. 1771-1782.

89. Stoica I. Force field impact and spin-probe modeling in molecular dynamics simulations of spin-labeled T4 lysozyme // J. Mol. Model. (Online).—2005.-Vol. 11.-Pp. 210-225.

90. Budil D. E., Sale K. L., Khairy K. A., Fajer P. G. Calculating Slow-Motional Electron Paramagnetic Resonance Spectra from Molecular Dynamics Using a Diffusion Operator Approach // J. Phys. Chem. A.—2006. Vol. 110. - Pp. 3703-3713.

91. Никольский Д. О., Тимофеев В.П. Роль быстрого движения спин-метки при интерпретации спектров ЭПР спин-меченых макромолекул // Биофизика. 2003. - Т. 48. - С. 606-617.

92. Sezer D., Freed J. Н., Roux В. Simulating electron spin resonance spectra of nitroxide spin labels from molecular dynamics and stochastic trajectories // J. Chem. Phys. 2008. - Vol. 128. - Pp. 165106-1-16.

93. Misra S. К. Simulation of slow-motion CW EPR spectrum using stochastic Liouville equation for an electron spin coupled to two nuclei with arbitrary spins: Matrix elements of the Liouville superoperator // J. Magn. Res. — 2007. Vol. 189. - Pp. 59-77.

94. Timofeev V. P., Tsetlin V. I. Analysis of Mobility of Protein Side Chains by Spin Label Technique // Eur. Biophys. J. Vol. 10. — Pp. 93-108.

95. Артюх P. К, Качалова Г. С., Самарянов Б. А., Тимофеев В. П. Динамическая подвижность гистидинсодержащего домена спин-меченого лизоцима // Молекулярная Биология. — 1995. — Т. 29. — С. 149-158.

96. Гантмахер Ф. Р. Теория матриц. — Москва, «Наука», 1966.

97. Athreya К.В., Lahiri S.N. Measure Theory and Probability Theory. — Springer, 2006.

98. Тимофеев В. П. Сегментальная подвижность поли(и) и метод спин-метки // Молекулярная Биология. — 1986. — Т. 20. — С. 697-711.

99. Арутюнян А. Е., Дудич И. В., Тимофеев В. П. Измерение времени вращательной корреляции молекулы бычьего сывороточного альбумина с помощью йод и ртуть содержащих спин-меток // Молекулярная Биология. 1988. - Т. 22. - С. 1045-1061.

100. Sutton В., Corper A., Bonagura V., Taussig М. The structure and origin of rheumatoid factors // Immunology Today. — 2000. — Vol. 21. — Pp. 177183.

101. Soltys A. J., Axford J. S., Sutton B. J. Rheumatoid factors: where are we now? // Ann. Rheum. Dis. 1997. - Vol. 56. - Pp. 285-286.

102. Sutton В. J., Corper A. L., Sohi M. K., Jefferis R., Beale D.; Taussig M. J. The structure of a human rheumatoid factor bound to IgG Fc // Adv. Exp. Med. Biol. 1998. — Vol. 435. — Pp. 41-50.

103. Тимофеев В. П., Ткачев Я. В., Новиков В. В., Варламова Е. Ю., Лапук В. А. Сравнительное изучение глобулярной структуры Fab-фрагментов моноклональных ревматоидного и неревматоидного иммуноглобулинов М // Биофизика. 2005. - Т. 50. - С. 787-792.

104. Timofeev V. P., Tkachev Ya. V., Novikov V. V., Alyoshkin V. A., Lapuk V. A. Is the Fab-fragment from monoclonal rheumatoid IgM flexible? A spin label dynamics study //J. Biomol. Struct. Dyn. — 2005. — Vol. 23. — Pp. 175-181.

105. Lapuk V. A., Timofeev V. P., Tchukhrova A. I. Some Pecularities of the Dynamics of the Immunoglobulin M Structure // J. Biomol. Struct. Dyn. — 1984. Vol. 2. - Pp. 63-76.

106. Тимофеев В. П., Лапук В. А. Исследование необратимого конформационного перехода в иммуноглобулине М методом спин-метки, введенной в углеводную и пептидную части его молекулы // Молекулярная Биология. 1982. - Т. 16. - С. 403-410.

107. Livshitz М. A., Amosova О. А, Lyubchenko Yu. L. Flexibility difference between double-stranded RNA and DNA as revealed by gel electrophoresis // J. Biomol. Struct. Dyn. 1990. - Vol. 7. - Pp. 1237-1249.

108. Файнстайн А., Бил Д. Структура и функции антител. Под ред. Л.Глинна, М.Стьюарда. — Москва, «Мир», 1983.

109. Финкелъштейн А. В., Птицын О. В. Физика белка. Курс лекций.— Москва, Книжный дом Университет, 2002.

110. Hartley R. W. In: Ribonucleases. Structure and functions. Eds D'Alessio G. and Riordan J. F. — Academic Press: San Diego, 1997. — Pp. 51-100.

111. Zhuravleva A., Korzhnev D. M., Nolde S. В., Kay L. E., Arseniev A. S., Billeter M., Orekhov V. Y. Propagation of dynamic changes in barnase upon binding of barstar: an NMR and computational study //J. Mol. Biol. — 2007. Vol. 367. - Pp. 1079-1092.

112. Gaponenko V., Howarth J. W., Gasmi-Seabrook G., Yuan J., Columbus L., Hubbell W. L., Rosevear P. R. Protein global fold determination using site-directed spin and isotope labeling Authors // Protein Sei. — 2000. — Vol. 9,- Pp. 302-309.

113. Wang Т., Tomic S., Gabdoulline R. R., Wade R. C. How Optimal Are the Binding Energetics of Barnase and Barstar? // Biophysical Journal. — 2004. Vol. 87. - Pp. 1618-1630.

114. Alsallaq R., Zhou H. X. Energy Landscape and Transition State of ProteinProtein Association // Biophysical Journal. — 2007. — Vol. 92. — Pp. 14861502.

115. Ababou A., Van der Vaart A., Gogonea V., Merz К. M. Jr. Interaction energy decomposition in protein-protein association: A quantum mechanical study of barnase-barstar complex // Biophys. Chem. — Vol. 125. — Pp. 221— 236.

116. Тимофеев В. П., Баландин Т. Г., Ткачев Я. В., Новиков В. В., Лапук В. А., Деев С. М. Использование динамического метода спин-метки для изучения комплекса барстар-барназа // Биохимия. — 2007. — Т. 72. — С. 994-1002.

117. Timofeev V P., Novikov V. V, Tkachev Y. V., Balandin Т. G., Makarov A. A., Deyev S. M. Spin label method reveals barnase-barstar interaction:a temperature and viscosity dependence approach //J. Biomol. Struct. Dyn. 2008. - Vol. 25. - Pp. 525-534.

118. Wong K. B., Fersht A. R., Freund S. M. V. NMR 15N relaxation and structural studies reveal slow conformational exchange in barstar C40/82A //J. Mol. Biol. 1997. Vol. 268. - Pp. 494-511.

119. Sevcik J., Urbanikova L., Dauter Z., Wilson K. S. Recognition of RNase Sa by the inhibitor barstar: structure of the complex at 1.7 A resolution // Acta Crystallogr., Sect.D. 1998. - Vol. 54. — Pp. 954 963.

120. DeLano W. L. — The PyMol Molecular Graphics System. San Carlos, CA: DeLano Scientific. 2002.

121. SahuS. C., Bhuyan A. K., Udgaonkar J. B., Hosur R. V. Backbone dynamics of free barnase and its complex with barstar determined by 15N NMR relaxation study //J. Biomol. NMR. 2000. - Vol. 18. - Pp. 107-118.

122. Korchuganov D. S., Nolde S. B., Reibarkh M. Ya., Orekhov V. Yu., Schulga A. A. Ermolyuk Ya. S., Kirpichnikov M. P., Arseniev A. S. NMR study of Monomer-Dimer equilibrium of barstar in solution // J. Am. Chem. Soc. — 2001. Vol. 123. - Pp. 2068-2069.

123. Vaughan C. K., Buckle A. M., Fersht A. R. Structural response to mutation at a protein-protein interface // J. Mol. Biol. — 1999. — Vol. 286. — Pp. 1487-1506.

124. Шапиро А. Б., Володарский Л. Б., Красочка О. Н., Атовмян Л. О., Розанцев Э. Г. Синтез и строение ртутьорганического имидазолинового нитроксильного радикала // ДАН, химия. — 1979. — Т. 248. — С. 1135— 1139.

125. Othmer D. F., Silvis S. J. // Sugar. 1948. - Vol. 43. - P. 32.1137. Oliphant, T. E. Python for Scientific Computing // Computing in Science & Engineering. — 2007. Vol. 9. - Pp. 10-20.