Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Секреция хемотактически активной D203 формы растворимого урокиназного рецептора активированного нейтрофилами человека
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Секреция хемотактически активной D203 формы растворимого урокиназного рецептора активированного нейтрофилами человека"

На правах рукописи

■ ""¿Г ^

ПЛИЕВ БОРИС КОНСТАНТИНОВИЧ

СЕКРЕЦИЯ ХЕМОТАКТИЧЕСКИ АКТИВНОЙ 0203 ФОРМЫ РАСТВОРИМОГО УРОКИНАЗНОГО РЕЦЕПТОРА АКТИВИРОВАННЫМИ НЕЙТРОФИЛАМИ ЧЕЛОВЕКА

03 00 04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 0:ст 2008

Москва-2008 г

003448823

Работа выполнена на Кафедре биологической и медицинской химии Факультета фундаментальной медицины ГУНУ МГУ имени М В Ломоносова

Научный руководитель академик РАН и РАМН Ткачук Всеволод

Арсениевич

Официальные оппоненты доктор биологических наук,

профессор Добровольский Анатолий Борисович

доктор химических наук, профессор Румш Лев Давидович

Ведущая организация ГУ Институт ревматологии РАМН

Защита диссертации состоится 12 ноября 2008 г в 13 час 30 мин на заседании диссертационного совета Д 208 073 01 по присуждению ученой степени доктора и кандидата биологических наук в ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Росмедтехнологий (121552 Москва, ул 3-я Черепковская, д 15а)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ РКНПК Росмедтехнологий

Автореферат разослан 3 октября 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

В Е Синицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Псйтрофилы являются основными эффекторными клетками неспецифичсского иммунитета и представляют первую линию защиты организма от патогенных микроорганизмов Эти клетки узнают и убивают микроорганизмы посредством их фагоцитоза и последующей секреции активных форм кислорода и цитотоксических компонентов гранул в фагосомы (Ыа^ееГ, 2007) Помимо элиминирования патогенных микроорганизмов, нейтрофилы, аккумулирующиеся в воспаленной ткани, секретируют хемоаттрактанты, привлекающие другие типы лейкоцитов в очаг воспаления К настоящему времени показано, что аккумуляция нейтрофилов в очагах проникновения инфекции и поврежденных 1канях сопровождается индукцией экспрессии генов многочисленных хемокинов (8сарш1 а а1, 2000) Кроме того, помимо классических хемокинов, активированные нейтрофилы секретируют другие белки, способные оказывать хемотактический эффект на отдельные типы лейкоцитов (Плисв, 2008) Эти белки являются компонентами гранул нейтрофилов и быстро секретируются при дегрануляции активированных клеток

Урокиназный рецептор (иРАЯ) - мультилигандный рецептор, играющий важную роль в околоклеточном протеолизе мигрирующих клеток, клеточной адгезии и хемотаксисе (Я^по, 2006) В структуре иРАК выделяют три гомологичных домена 01, 02 и 03 Линкерный участок, связывающий домены 01 и 02, может расщепляться многими сериновыми протеазами, что приводит к образованию 0203 формы рецептора (\lontuori а а1, 2005) Мембраносвязанный иРАЯ может отщепляться СРЬспецифичной фосфолипазой О с образованием растворимой формы рецептора - виРАЯ Как и мембраносвязанный рецептор на плазматической мембране, бчРАЯ в биологических жидкостях присутствует как в полноразмерной, так и в 0203 формах Расщепление линкерного участка между доменами 01 и 02 может происходить в разных сайтах 0203 форма эиРАЛ с экспонированным фрагментом ЗЯБЛ У (остатки 88-92) линкерного участка является хемоагграктантом для базофилов, моноцитов и С034+ гематопоэтических стволовых клеток (НБСв) Хемотактический эффект этой формы эиРАИ опосредован формилпептидными рецепторами РРЯЫ и РРЯЬ2 на базофилах, РРЯЫ - на моноцитах и РРЯ - на НЗСэ

Нейтрофилы человека содержат значительный внутриклеточный пул иРАЯ, локализованный в первичных и третичных гранулах и секреторных везикулах (Р1еБпег е1 а1, 1994, Pedeгsen й а1, 2000) Активация нейтрофилов приводит к быстрой транслокации иРАЯ из внутриклеточных компартментов на плазматическую мембрану (РкБпег ег а1, 1994) Поскольку активированные нейтрофилы секретируют также сериновые протеазы (нейтрофильную эластазу и урокиназу), способные расщеплять линкерный участок между доменами 01 и

D2, мы предположили, что если активация нейтрофилов приводит к секреции suPAR (шеддингу uPAR), образующаяся форма, возможно, является хемотактически активной D2D3 формой рецептора Таким образом, целью настоящей работы было выяснить возможность секреции растворимой формы урокиназного рецептора (suPAR) нейтрофилами человека в их различных функциональных состояниях и исследовать ее возможное участие в воспалительных процессах Для этого мы поставили перед собой следующие задачи.

1 Показать возможность секреции suPAR при активации нейтрофилов,

2 Охарактеризовать доменную структуру и возможные хемотактические свойства секретируемого нейтрофилами suPAR,

3 Исследовать механизм образования suPAR при активации нейтрофилов,

4 Оценить секрецию suPAR активированными in vivo нейтрофилами очагов

острого воспаления Научная новизна и практическая значимость работы. В представленной работе впервые показана возможность секреции хемотактически активной D2D3 формы растворимого урокиназного рецептора клетками на примере активированных нейтрофилов человека Хемотактически активная D2D3 форма растворимого урокиназного рецептора идентифицирована как новый хемоаттрактант, секретируемый активированными нейтрофилами человека Обнаружен новый механизм образования хемотактически активных белков при активации нейтрофилов (шеддинг и протеолитический процессинг мембранного белка) Обнаружен новый механизм образования растворимого урокиназного рецептора - катализируемый катепсином G шеддинг мембранного урокиназного рецептора Результаты работы существенно дополняют современные представления о роли нейтрофилов в привлечении других типов лейкоцитов в формирующийся очаг воспаления

Апробация работы Результаты работы были представлены на межлабораторном семинаре Факультета Фундаментальной Медицины МГУ им М В Ломоносова (Москва, 2008), на научных конференциях Xlth International Workshop on Molecular and Cellular Biology of Plasminogen Activation (Saltsobaden, 2007) и Gene Expression and Signaling in the Immune System (Cold Spring Harbor, 2008)

Публикации. Результаты работы представлены в 2 статьях и в 2 тезисах докладов

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов и материалов исследования, изложения результатов, обсуждения, выводов, заключения и списка цитируемой литературы Работа содержит 125 страниц машинописного текста, 3 таблицы и 24 рисунка. Список литературы включает 281 источник

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение нейтрофилов периферической крови. Нейтрофилы выделяли из периферической крови здоровых доноров согласно методу Boyum (Boyum, 1968) Образцы крови (с 13 шМ цитратом натрия в качестве антикоагулянта) смешивали с 6% раствором декстрана Т-500 в фосфатно-солевом буфере (PBS) в соотношении 5 1 и инкубировали при комнатной температуре в течении 45 мин Верхний слой лишенной эритроцитов плазмы наслаивали на Histopaque-1077 в соотношении 2 1 и центрифугировали при 400 g в течении 30 мин при комнатной температуре После центрифугирования осадок ресуспендировали в 1 мл PBS Для удаления эритроцитов к ресуспендированному осадку добавляли охлажденную на льду стерильную воду в соотношении 1 5 и инкубировали суспензию в течении 1 мин при постоянном пипетировании Затем к суспензии добавляли 10-кратный избыток охлажденного на льду PBS и центрифугировали при 250 g в течении 10 мин при 4°С Осадок промывали 2 раза охлажденным на льду PBS при тех же условиях центрифугирования Осадок нейтрофилов ресуспендировали в PBS и инкубировали во льду до использования Выделение нейтрофилов синовиальных жидкостей. Синовиальные жидкости из коленных суставов больных ревматоидным артритом и образцы венозной крови этих больных собирались одновременно методом пункции В качестве антикоагулянта использовали 130 тМ раствор цитрата натрия в соотношении синовиальная жидкость (кровь) • антикоагулянт — 9 1 Нейтрофилы синовиальных жидкостей выделяли согласно методике выделения нейтрофилов периферической крови

Культивирование клеток FPRL1/293. Клетки линии human embryonic kidney (НЕК)293, трансфицированные формилпептидным рецептором FPRL1 (обозначаемые далее FPRL1/293), были любезно предоставлены доктором J M Wang (National Cancer Institute at Frederick, Frederick, США) и доктором P M Murphy (National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Bethesda, США) Клетки FPRL1/293 культивировали в среде DMEM, содержащей 10% FBS, пенициллин и стрептомицин (100 Ед/мл и 100 мкг/мл, соответственно), 1 мМ L-глутамин и 0 8 мг/мл генетицин (G418)

Активация нейтрофилов Непосредственно перед экспериментами по активации нейтрофилы ресуспендировали в солевом растворе Хэнкса (HBSS) в концентрации 106 клеток/мл (для анализа экспрессии uPAR методом проточной цитофлуориметрии), 2x107 клеток/мл (для ферментного иммуносорбентного анализа) или 108 клеток/мл (для иммуноблотгинга), инкубировали в течении 10 мин при 37°С и 5% С02 и активировали как описано в разделе «Результаты» Эксперименты по активации проводили при 37°С и 5% С02 Активацию нейтрофилов останавливали помещая образцы в лед

Ферментный иммуносорбентный анализ Количественный анализ suPAR проводили с помощью набора Human uPAR Quantikine ELISA Kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, США) в соответствии с указаниями производителя Анализ поверхностной и общей клеточной экспрессии антигенов методом проточной цитометрии Для анализа поверхностной экспрессии антигенов клетки ресуспендировали в растворе для мечения (PBS, 1% BSA) в концентрации 10 млн/мл К аликвотам (100 мкл) полученной клеточной суспензии добавляли антиген-специфичные антитела, коньюгированными с флуорохромом (FITC, РЕ или Alexa Fluor 488), в концентрации, указанной в инструкции производителя Образцы инкубировали в течение 30 мин при 4°С в темноте Затем клетки промывали 2 раза ледяным PBS и фиксировали в 400 мкл раствора PBS, содержащего 1% параформальдегид Для цитофлуориметрического анализа общей клеточной экспрессии антигенов клетки фиксировали в 0 5 мл фиксирующего раствора (PBS, 4% параформальдегид) в течении 20 мин при 4°С Затем клетки промывали 2 раза ледяным PBS, ресуспендировали в 0 5 мл пермеабилизующего раствора (PBS, 0 1% сапонин) и инкубировали 20 мин при 4°С После пермеабилизации клетки промывали 2 раза ледяным PB S и ресуспендировали в растворе для мечения, содержащем 0 1% сапонин в концентрации 10 млн/мл К аликвотам (100 мкл) полученной клеточной суспензии добавляли антиген-специфичные антитела, коньюгированными с флуорохромом, в концентрации, указанной в инструкции производителя Образцы инкубировали в течение 30 мин при 4°С в темноте Затем клетки промывали 2 раза ледяным PBS, содержащем сапонин (0 1%) и фиксировали в 400 мкл раствора PBS, содержащего 1% параформальдегид Полученные образцы анализировали методом проточной цитометрии на приборе FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, США) Экспрессию антигенов выражали в относительных единицах (MFI - mean fluorescent intensity), представляющих среднюю интенсивность флуоресценции в линейной шкале после вычитания неспецифической флуоресценции

Иммуноблоттинг. Белки разделяли с помощью SDS-электрофореза в 12% полиакриламидном геле (Laemmli, 1970) После электрофореза гель уравновешивали в буфере для электропереноса (48 мМ трис, 39 мМ глицин, pH « 9,5, 20% метанол, 0,0375% SDS) в течение 10 мин Электроперенос осуществляли на PVDF-мембрану, предварительно уравновешенную этим же буфером, в приборе Semi-dry transfer cell Trans-blot® (Bio-Rad Laboratories, Inc ) при постоянном напряжении 25 В в течении 30 мин Эта, а также все последующие процедуры, проводились при комнатной температуре После переноса мембрану инкубировали в блокирующем буфере (2% ECL Advance Blocking Reagent (Amersham Biosciences) в TBST (20 mM Tns-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20)) в течение 1 ч После блокирования мембрану инкубировали с первыми антителами, разведенными в блокирующем буфере, в течение 1 ч при перемешивании От несвязывшихся антител мембрану

отмывали в TBST в течение 45 мин, меняя раствор 5 раз Затем мембрану инкубировали со вторыми антителами (антитела козы к иммуноглобулинам мыши или кролика, коньюгированные с пероксодазой хрена), разведенными в блокирующем буфере, в течение 1 ч при перемешивании От несвязывшихся антител мембрану отмывали в TBST течение 45 мин, меняя раствор 5 раз Детекцию белков осуществляли с помощью набора ECL Advance Western Blottmg detection Kit (Amersham Biosciences) в соответствии с указаниями производителя

Дегликозилирование suPAR. Для дегликозилирования suPAR использовали N-гликозидазу Г Chryseobacterium menmgosepticum Анализируемые супернатанты смешивали с раствором 1% SDS/10% p-меркаптоэтанол в соотношении 9 1 и прогревали в термостате при 96 °С в течении 10 мин Затем образцы смешивали с 10х буфером для дегликозилирования (0 2 M ацетат натрия, рН 7 5, 0 1 M EDTA, 8% Triton Х-100) в соотношении 9 1 и инкубировали с N-гликозидазой F (50 Ед/мл) в течении 20 ч при 37 °С Далее белки разделяли с помощью 12% SDS электрофореза в полиакриламидном геле и анализировали методом иммуноблоттинга

Анализ дегрануляции нейтрофилов. Влияние используемых в работе ингибиторов на дегрануляцию активированных иономицином нейтрофилов исследовали цитофлуориметрически, анализируя поверхностную экспрессию гранул-специфичных мембранных маркеров CD63 (маркер азурофильных гранул) (Cham and Bainton, 1994) и CDllb (маркер всех других типов гранул) (Lacal et al, 1988)

Хемотаксис Хемотаксис клеток FPRL1/293 к супернатантам нейтрофилов исследовали, используя камеру Бойдена (Neuroprobe, Cabin John, MD, США) Для получения супернатантов неактивированных нейтрофилов клетки (107 клеток/мл в HBSS) инкубировали при 37 °С и 5% С02 в течении 65 мин Для получения супернатантов активированных нейтрофилов клетки примировали TNF-a (10 нг/мл) в течении 5 мин и стимулировали IL-8 (10'8 М) в течении 60 мин при тех же условиях культивирования Затем клеточные суспензии центрифугировали при 250 g в течении 10 мин при 4 °С Супернатанты центрифугировали повторно при 15 000 g в течении 5 мин при 4 °С Затем супернатанты концентрировали в 25 раз, используя микроконцентратор Centricon YM-10 (Millipore, Bedford, MA, США) Для удаления из супернатантов suPAR, супернатанты инкубировали с протеин G-агарозой с иммобилизованными моноклопальными антителами, специфичными к D1 или D2 доменам suPAR или контрольными неспецифичными мышиными антителами в течении 1 часа при 4 °С при постоянном перемешивании Далее сорбент удаляли центрифугированием (250 g в течении 3 мин при 4 °С)

Клетки FPRL1/293 ресуспендировали в среде для хемотаксиса (DMEM, 1% BSA) в концентрации 106 клеток/мл Этой суспензией заполняли верхние

лунки камеры Бойдена (50 мкл суспензии на лунку) В нижние лунки добавляли обработанные, как описано выше, супернатанты, смешанные с 2х средой для хемотаксиса в соотношении 1 1 (27 мкл на лунку) Клеточная суспензия и супернатант в камере Бойдена разделялись поликарбонатным пористым фильтром с диаметром пор 10 мкм (Neuroprobe, Cabin John, MD, США), покрытым коллагеном I типа (100 нг/мл) Клетки инкубировали в С02-инкубаторе при 37 "С в течении 5 часов Затем непромигрировавшие клетки очищали с верхней поверхности фильтра, а клетки на нижней поверхности фиксировали в метаноле и окрашивали красителем Diff-Quik Используя световой микроскоп (х 400), в каждой лунке подсчитывалось количество клеток в шести случайно выбранных секторах Результаты представлены в виде хемотактических индексов, показывающих во сколько раз количество мигрирующих клеток в ответ на супернатанты превышает количество мигрирующих клеток при их спонтанной миграции (в ответ на среду для хемотаксиса)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1 Секреция suPAR нейтрофилами. активированными иономицином

На первом этапе работы нашей целью было показать принципиальную возможность образования suPAR при активации нейтрофилов Для этого мы исследовали секрецию suPAR нейтрофилами человека, активированными кальциевым ионофором иономицином, являющимся одним из самых сильных известных активаторов эффекторных функций нейтрофилов (Dahlgren et al, 1992, Sengelov et al, 1993) Неактивированные нейтрофилы спонтанно секретировали suPAR в культуральную среду (рис 1А) Активация клеток иономицином (10"6 М) быстро (в течение нескольких минут) потенцировала секрецию suPAR и через 30 мин после начала стимуляции содержание антигена в культуральных средах активированных нейтрофилов превышало таковое в нестимулированном контроле в 24 ± 4 3 (среднее ± SEM, п = 4) раз Накопление suPAR в культуральных средах было подтверждено методом иммуноблота с использованием поликлон&тьных анти-uPAR антител (рис 1Б)

Экспрессия uPAR на нейтрофилах оценивалась методом проточной цитофлуориметрии Иономицин вызывал быстрое 15-кратное увеличение поверхностной экспрессии uPAR, которое достигало пика через 10 мин после начала активации (рис 2А,В) Более продолжительная активация клеток иономицином (от 10 до 60 мин) приводила к существенному снижению экспрессии uPAR на плазматической мембране нейтрофилов, поверхностная экспрессия uPAR на активированных клетках, однако, оставалась существенно выше по сравнению с контролем Поскольку нейтрофилы содержат мобилизуемые внутриклеточные депо uPAR, общая клеточная экспрессия uPAR измерялась в клетках, пермеабилизованных сапонином При активации

нейтрофилов иономицином наблюдалось зависимое от времени снижение общей клеточной экспрессии иРАЯ (рис. 2Б,Г). Общая клеточная экспрессия иРАЯ снижалась примерно в 2 раза после 30 мин стимуляции и падала еще сильнее к 60 мин.

Суммируя эти данные, можно заключить, что помимо описанной ранее транслокации внутриклеточного иРАИ на плазматическую мембрану (Р1еБпег й а]., 1994), активация нейтрофилов иономицином приводит также к быстрой секреции эиРАЯ, что сопровождается снижением общей клеточной экспрессии иРАЯ.

Б

1 2 II - л ^зиРАК

37 - ■}<- 0203 2520- ф <-01

Рис. 1. Влияние иономицина на секрецию suPAR нейтрофилами человека.

А. Нейтрофилы (10 клеток/мл) инкубировали в отсутствие (О) и в присутствии (□) иономицина (10^ М) в течении различных промежутков времени. Супернатанты затем анализировали методом ферментного иммуносорбентного анализа. Представлены средние данные четырех независимых экспериментов (среднее ± SEM); *, р < 0.01 в сравнении с неактивированным контролем.

Б. Нейтрофилы (10s клеток/мл) инкубировали в отсутствии (дорожка 1) и в присутствии (дорожка 2) иономицина (Ю"6 М) в течении 30 мин. Супернатанты затем анализировали методом иммуноблота. В качестве антигенспецифичных антител использовали кроличьи поликлонапьные антитела к uPAR человека. Представлены данные одного из четырех независимых экспериментов.

2. Секреция suPAR нейтрофилами. активированными провоспалительными медиаторами

Для того, чтобы показать, секретируется ли suPAR нейтрофилами человека в ответ на их активацию физиологическими агонистами, клетки стимулировали бактериальным формилированным трипептидом fMLP или провоспалительными цитокинами TNF-a и IL-8. Мы обнаружили, что fMLP, TNF-a и IL-8 per se являются слабыми активаторами секреции suPAR нейтрофилами человека (рис. 3). Небольшое (примерно 1.5-2 раза) увеличение продукции suPAR наблюдалось только при стимуляции клеток

20 40 Время (мин)

А

"3 400

I 350

§ 300

S 250

Î 200 сэ

о 150 £ 100

« 50

fc,

S о

В

О 20 40 60 Время (мин)

3 700

| 600

1 500

3 400

I 300

I 200

юо -

20 40 Время (мин)

IgG контроль контроль иономицин 1

Log интенсивности флуоресценции

10" 10' 10' 10" ю4

Log интенсивности флуоресценции

IgG контроль контроль /

Рис. 2. Влияние иономицина на поверхностную и общую клеточную экспрессию uPAR нейтрофилами человека.

A,Б. Нейтрофилы (106 клеток/мл) инкубировали в отсутствие (<>) и в присутствии (□) иономицина (Ю-6 М) в течении различных промежутков времени. Клетки затем анализировали цитофлуориметрически и определяли поверхностную (А) и общую клеточную (Б) экспрессию uPAR. Результаты представлены как средние интенсивности флуоресценции (MFI) 10000 клеток, полученные в четырех независимых экспериментах (MFI ± SEM); *, р < 0.01 в сравнении с неактивированным контролем.

B,Г- Нейтрофилы (10б клеток/мл) инкубировали в отсутствии и в присутствии иономицина (10"6 М) в течении 30 мин. Клетки затем анализировали цитофлуориметрически и определяли поверхностную (В) и общую клеточную (Г) экспрессию uPAR. Результаты представлены в виде распределения 10000 клеток по поверхностной (В) и общей клеточной (Г) экспрессии uPAR. Представлены данные одного из четырех независимых экспериментов.

А

_ 250

1?

Ö 200 ц

ü

Ъ 150

& 100 Di

£ 50

00

о

TNF-a (нг/мл) fMLP (М)

Б

180

| 150

U

§ 120

о

0

1 90

t 60 <

^ 30

С/2

о

TNF-a (нг/мл) IL-8 (М)

гЬ

пППП

- - - 10 1 10 100 1 ю 100

- ю~7 ю~6 - ю"7 ю-7 ю-7 ю"6 ю"6 ю"6

fil

ъ

гЕ-

п

гЗп

- - 10 1 10 100 1 10 100 ю"8 ю"7 - 10"8 10"8 ю"8 ю'7 ю-7 ю-7

Рис. 3. Влияние хемоатграктантов fMLP (А) и IL-8 (Б) на секрецию suPAR TNF-a-примированными нейтрофилами человека.

А. Нейтрофилы (107 клеток/мл) инкубировали в отсутствие и в присутствии указанных концентраций TNF-a в течении 5 мин (этап прайминга), затем клетки инкубировали при тех же условиях в отсутствии и в присутствии указанных концентраций fMLP в течении последующих 25 мин (этап стимуляции хемоаттрактантом). Супернатанты анализировали методом ферментного иммуносорбентного анализа. Представлены средние данные пяти независимых экспериментов (среднее ± SEM); *, р < 0.01 в сравнении с неактивированным контролем.

Б. Эксперименты проводили как описано выше, но вместо fMLP использовали указанные концентрации IL-8.

максимальными концентрациями указанных агонистов (106 М - fMLP, 100 нг/мл - TNF-a и 10"7 М - IL-8) Однако при примировании клеток TNF-a и последующей их стимуляции fMLP или IL-8 мы наблюдали существенный потенцирующий эффект TNF-a на fMLP- или IL-8-индуцированную секрецию suPAR (рис ЗА,Б) Существенное синергичное увеличение продукции suPAR наблюдалось, когда клетки примировались в течение 5 мин TNF-a и затем активировались в течение 25 мин fMLP или IL-8 В то время как активация нейтрофилов fMLP, TNF-a или IL-8 потенцировала продукцию suPAR не более чем в 2 раза, примирование клеток TNF-a и их последующая стимуляция fMLP или IL-8 приводили к вплоть до 8-кратному увеличению продукции suPAR в сравнении с нестимулированным контролем (рис ЗА,Б)

Активация нейтрофилов fMLP, TNF-a или IL-8 не приводила к статистически значимому изменению обшей клеточной экспрессии uPAR (данные не приведены) Однако примирование нейтрофилов TNF-a и их последующая fMLP- или IL-8-индуцированная активация приводили к небольшому (до 20% через 30 мин после начала активации нейтрофилов), но статистически значимому (р < 0 05) снижению обшей клеточной экспрессии uPAR (данные не приведены)

Таким образом, секреция suPAR происходит не только в ответ на фармакологические активаторы, такие как иономицин, но индуцируется также физиологическими агонистами, что свидетельствует о возможной физиологической значимости исследуемого феномена

3 Доменная организация секретируемого нейтрофилами suPAR

Для анализа доменной структуры секретируемого suPAR, супернатанты

неактивированных и активированных клеток анализировались методом иммуноблота uPAR, являющийся N-гликопротеином, сильно и гетерогенно

гликозилирован (Behrendt et al, 1990) и точная идентификация отдельных форм рецептора методом иммуноблота оказывается затруднительной (рис 1Б и 4А) Поэтому образцы дегликозилировались N-гликозилазой F перед электрофоретическим разделением белков для иммуноблота Такая обработка

приводит к расщеплению N-гликозидных связей в гликопротеинах и, следовательно, получению дегликозилированных форм N-гликопротеинов Процедура дегликозилирования образцов перед иммуноблотом приводит к аккуратному разделению полноразмерной и D2D3 форм suPAR (рис 4Б) Поскольку дегликозилирование белков приводит к снижению их молекулярной массы, дегликозилированные полноразмерная и D2D3 формы suPAR обнаруживают большую электрофоретическую подвижность (кажущиеся молекулярные массы 40 и 30 Ша, соответственно), чем негликозилированные формы Рис 4Б показывает, что активация нейтрофилов потенцирует секрецию

обеих форм биРАЯ. при этом Э203 форма эиРАЯ является основной формой растворимого рецептора, секретируемого нейтрофилами.

Рис. 4. Доменная организация секретируемого нейтрофилами «иРАИ.

А. Нейтрофилы (108 клеток/мл) инкубировали в отсутствие (дорожка 1) и в присутствии (дорожка 2) иономицина (10'6 М) в течении 30 мин. Нейтрофилы также примировали в течении 5 мин Т№-а (10 нг/мл) и стимулировали в течении 25 мин МЬР (10"7 М) (дорожка 3) или 1Ь-8 (10"8 М) (дорожка 4) при тех же условиях культивирования. Супернатанты анализировали методом иммуноблота. В качестве первых антигенспецифичных антител использовали мышиные моноклональные антитела к домену И2 иРАЯ человека. Представлены данные одного из четырех независимых экспериментов.

Б. Эксперимент проводили как описано выше, но белки супернатантов перед анализом методом иммуноблота подвергали дегликозилированию ГЧ-гликозидазой Р. Представлены данные одного из четырех независимых экспериментов.

4. Хемотактические свойства секретируемого нейтрофилами бцРАЯ

02ВЗ форма эиРАЯ, содержащая эпитоп БЯЗЯУ (аминокислотные остатки 88-92) является хемоаттрактантом и взаимодействует с формилпептидными рецепторами, тогда как 02БЗ форма эиРАЯ, лишенная этого эпитопа, свойств хемоаттрактанта не обнаруживает. Для того, чтобы выяснить, является ли секретируемая нейтрофилами Б2ВЗ форма эиРАЯ хемоаттрактантом, мы исследовали возможный вклад этого белка в способность супернатантов активированных нейтрофилов индуцировать хемотактический ответ клеток НЕК293, трансфицированных формилпептидным рецептором РРКЫ (клеток РРЯЫ/293). Идея этого эксперимента заключается в том, что если нейтрофилы секретируют хемотактически активную Э203 форму виРАЯ, взаимодействующую с РРЫЛ, то удаление этой формы из супернатантов с помощью домен-специфичных антител, коныогированных с протеин в-агарозой, будет приводить к снижению прохемотактических свойств супернатантов к клеткам РРЯИ/293.

В качестве анализируемых супернатантов использовались супернатанты TNF-a-примированных и IL-8-активированных нейтрофилов человека. Клетки НЕК293 не экспрессируют рецепторы IL-8 CXCR1 и CXCR2 (Matityahu et al., 2002), но некоторые клоны этих клеток экспрессируют рецепторы TNF-a — TNFRI и TNFRII (McFarlane et al., 2002; Todd et al., 2004). Для того, чтобы исключить возможный эффект TNF-a, который присутствует в супернатантах TNF-a-примированных и IL-8-стимулированных нейтрофилов, на хемотактический ответ клеток FPRL1/293, в отдельных экспериментах мы использовали нейтрализующие анти-TNF-a моноклональные антитела в

«

к а

WRW - +

анти-В2 - -

анти-Dl - -

IgG - -

в-

£ р

;

еа н о S

ID

X

1.5

0.5

0

WRW4 - +

анти-02 - -

анти-Dl - -

IgG - -

+ -

Рис. 5. Влияние супернатантов TNF-a-примированных и IL-8-активированных (А) и неактивированных (Б) нейтрофилов человека на хемотаксис клеток FPRL1/293.

А. Нейтрофилы (107 клеток/мл) инкубировали в присутствии TNF-a (10 нг/мл) в течении 5 мин (этап прайминга), затем клетки инкубировали при тех же условиях в присутствии IL-8 (10"8 М) в течении последующих 60 мин (этап стимуляции хемоаттрактантом). Прохемотактические свойства супернатанта анализировали в камере Бойдена, используя клетки FPRL1/293 в качестве тестируемых клеток. Эксперименты проводили в отсутствие и в присутствии гексапептида WRW4 (10 мкМ). В отдельных экспериментах из супернатантов удаляли suPAR с использованием моноклональных антител, специфичных к доменам D2 (aHTii-D2) или D1 (анти-Dl) uPAR, а также использовали неспецифичные мышиные антитела (IgG) в качестве контроля. Представлены средние данные шести независимых экспериментов (среднее ± SEM); *,р < 0.01.

Б. Эксперименты проводили как описано выше, но вместо супернатантов активированных нейтрофилов использовали супернатанты неактивированных клеток.

концентрациях, блокирующих биологическую активность этого цитокина, но не обнаружили статистически значимого эффекта этих антител на хемотактический ответ клеток FPRL1/293 (данные не приведены)

Удаление D2D3 формы suPAR с использованием антител, специфичных к D2 домену uPAR, приводило к существенному (35 ± 78 %, р < 0 01, п = 6) ингибированию хемотаксиса клеток FPRL1/293 (рис 5А) Напротив, использование антител, специфичных к D1 домену uPAR, или контрольных неспецифических мышиных антител не приводило к заметному изменению хемотактического ответа клеток FPRL1/293 (рис 5А) Специфический антагонист рецептора FPRL1 гексапептид WRW4 практически полностью бтокировал хемотаксис клеток FPRL1/293 к тестируемым супернатантам (рис 5А) Суммируя все эти данные, можно сделать вывод, что TNF-a-примированные и IL-8-стимулированные нейтрофилы секретируют хемотактически активную D2D3 форму suPAR, при этом хемотактический эффект этого белка опосредован его взаимодействием с формилпептидным рецептором FPRL1 Супернатанты неактивированных нейтрофилов вызывали слабый хемотактический ответ FPRL1/293 клеток (хемотактический индекс 1 35 ± 0 11, п = 6) и удаление D2D3 формы suPAR из этих супернатантов не приводило к статистически значимым изменениям в хемотаксисе клеток FPRL1/293 (рис 5Б)

5 Механизм образования suPAR при активации нейтрофилов

К настоящему времени показано, что образование suPAR из мембраносвязанной формы белка может катализироваться двумя ферментами GPI-специфичной фосфолипазой D (GPI-PLD) (Wilhelm et al, 1999) и катепсином G (Beaufort et al, 2004) Возможность шеддинга uPAR катепсином G продемонстрирована только при добавлении рекомбинантного белка к uPAR-экспрессирующим клеткам (моноцитам и моноцитарным клеточным линиям) (Beaufort et al, 2004) Поскольку катепсин G локализован в первичных гранулах нейтрофилов и секретируется при активации клеток, мы предположили, что этот фермент может участвовать в шеддинге uPAR при активации нейтрофилов Для проверки этого предположения секреция uPAR неактивиронными и активированными нейтрофилами анализировалась в присутствии физиологического ингибитора катепсина G - арантихимотрипсина. Этот белок существенно (примерно на 60%) подавлял продукцию suPAR нейтрофилами, активированными иономицином и в меньшей степени (примерно на 25% - 30%) ингибировал секрецию suPAR TNF-a-примированными и fMLP- или IL-8-стимулированными нейтрофилами (Таблица I) Интересно, что а,-антихимотрипсин не влиял на спонтанную секрецию suPAR неактивированными нейтрофилами

Таблица I Влияние ai-антихимотрипсина, TAPI-l, GM6001, 1,10-фенантролнна, TPEN and DTPA на секрецию suPAR неактивированными и активированными нейтрофилами человека

Нейтрофилы (107 клеток/мл) инкубировали в отсутствие (контроль) и в присутствии иономицина (Ю-6 М) в течении 30 мин Нейтрофилы также примировали TNF-a (10 нг/мл) в течении 5 мин и стимулировали fMLP (10'7 М) или IL-8 (108 М) в течении последующих 25 мин при тех же условиях культивирования Указанные инкубации проводились в отсутствие (-) и в присутствии ai-антихимотрипсина (arACT) (1 мкМ), TAPI-l (100 мкМ), GM6001 (25 мкМ), 1,10-фенантролина (1,10-Phth) (4 мМ), TPEN (100 мкМ) и DTPA (50 мкМ) Супернатанты анализировали методом ферментного иммуносорбентного анализа Представлены средние данные четырех независимых экспериментов (среднее ± SEM), *, р < 0 01 в сравнении с пробами без ингибитора

ингибитор suPAR (пг/106 клеток)

контроль иономицин TNF-a + fMLP TNF-a + IL-8

- 26 7 ± 3 1 445 + 51 7 128 3 ±10 1 93 3 ± 7 2

«,-АСТ 25 2 + 43 (267 + 65 6)* (89 8+ 12 2)* (69 87 ±9 7)*

ТАРЫ 26 94 ± 6 1 471 7 + 51 6 125 73 + 9 8 96 23 ± 10 1

GM6001 2614 + 39 431 65 + 53 1 130 87 ±10 3 91 05 ± 8 2

1,10-Phth (19 7 + 6 8)* (146 8121 3)* (55 2+ 127)* (34 5 ± 11 9)*

TPEN 26 14 + 43 427 2 + 49 3 126 72 ± 8 4 90 5 ± 6 9

DTPA 26 40 + 3 5 458 35 + 44 9 124 16± 11 2 95 17 + 7 5

Поскольку нейтрофилы человека содержат значительный пул внутриклеточного иРА11, подавление образования suPAR при активации нейтрофилов арантихимотрипсином может быть результатом ингибирования дегрануляции клеток и, как следствие, транслокации uPAR на клеточную поверхность Для исследования влияния ингибиторов на дегрануляцию нейтрофилов мы использовали метод оценки экзоцитоза гранул, основанный на цитофлуориметрическом анализе поверхностной экспрессии гранул-специфичных мембранных маркеров СЭ63 (маркер азурофильных гранул) и СОНЬ (маркер всех остальных типов гранул) ссрАнтихимотрипсин не влиял на индуцированную иономицином транслокацию СЭ63 и СЭ11Ь из гранул на плазматическую мембрану нейтрофилов и, следовательно, не является ингибитором дегрануляции (Таблица II) Таким образом, подавление аг антихимотрипсином секреции suPAR активированными нейтрофилами является следствием ингибирования шеддинга \jPAR, а не подавления экзоцитоза uPAR-coдepжащиx гранул

Таб iJiiia II Влияние с^-антихимотрипсина, TAPI-1, GM6001, 1,10-фспантро.шна, ТРЕХ and DTPA на индуцированную нономицнном дегрануляцшо нсйтрофнлов человека

Нентрофилы (106 клеток/мл) инкубировали в отсутствии и в присутствии иономицина (ион) (10'6 М) в течении различных (5, 10 и 15 мин) временных интервалов Инкубации с иономицином проводились в отсутствие и в присутствии cti-антихимотрипсина (а,-АСТ) (2 мкМ), TAPI-1 (100 мкМ), GM6001 (25 мкМ), 1,10-фенантролина (1,10-Phth) (4 mM), TPEN (100 мкМ) и DTPA (50 мкМ) Клетки затем анализировали цитофлуориметрически и определяли поверхностную экспрессию CDllb и CD63 Результаты представлены как средние интенсивности флуоресценции (MFI) 10000 клеток, полученные в четырех независимых экспериментах (MFI ± SEM), *,р < 0 01 в сравнении с неактивированным контролем

поверхностная экспрессия CDllb поверхностная экспрессия CD63

5' 15' 30' 5' 15' 30'

- ион 310 ± 10 5 319 ±84 332 + 11 5 42 ±3 1 41 ±2 7 45 ±3 4

+ ион 1887 ± 156 1915 ± 22 1 1823 ± 19 6 580 ±98 540 ± 12 4 446 ± 112

+ ион + а,-АСТ 1937 + 31 5 1954 ± 42 8 1936 + 16 1 587 ±7 9 534 ± 9 1 460 ± 9 5

+ ион + ТАРЫ 2054 + 51 2 2123 ± 39 3 2017 ± 42 8 601 ± 113 585 ± 10 7 469 ± 126

+ ион + GM6001 1768 + 38 5 1821 + 514 1728 ± 43 9 571 ± 10 8 545 ± 9 3 431 ± 15 1

+ ион + 1,10-Phth (954 ± 49 6)* (984 ± 64 9)* (1054 + 39 5)* (195 ± 16 1)* (215 ± 21 7)* (170 ± 19 4)*

+ ион + TPEN 1894 ± 19 8 1828 + 46 5 1897 + 32 1 567 ± 8 6 559 + 13 3 437 ± 12 9

+ ион + DTPA 1956 ± 12 3 1885 ± 34 0 1823 ± 192 595 ± 11 4 580 ± 101 470 ±95

Поскольку шеддинг многочисленных мембранных белков обусловлен металлопротеиназами TACE (TNF-a-converting епгушс)-семейства, мы исследовали влияние ингибиторов металлопротеиназ широкого спектра действия - TAPI-l (TNF-a Protease Inhibitor-1) и GM6001 на секрецию suPAR неактивированными и активированными нейтрофилами Эти ингибиторы не

оказывали статистически значимого эффекта на дегрануляцию активированных нейтрофилов (Таблица II), но также не влияли на продукцию suPAR даже при их максимальных концентрациях, используемых при работе с клетками (Таблица I) Следовательно, металлопротеиназы не участвуют в секреции suPAR нейтрофилами человека

Как было отмечено выше, GPI-PLD катализирует шеддинг uPAR в раковых клетках К настоящему времени не обнаружено специфического ингибитора GPI-PLD и для того, чтобы показать участие этого цинк-зависимого фермента в изучаемых процессах используются различные хелаторы цинка (Metz et al, 1994, Mann et al, 2004) В нашей работе мы использовали проникающие в клетку (1,10-фенантролин и TPEN) и непроникающие (DTPA) хелаторы цинка Секреция suPAR нейтрофилами существенно подавлялась в присутствии 1,10-фенантролина, но не в присутствии TP EN и DTPA (Таблица I) Однако в отличие от TPEN и DTPA, 1,10-фенантролин ингибировал дегрануляцию нейтрофилов (Таблица II) Таким образом, влияние 1,10-фенантролина на продукцию suPAR объясняется, по-видимому, его способностью подавлять дегрануляцию, а не шеддинг uPAR Отсутствие эффекта TPEN и DTPA на образование suPAR нейтрофилами указывает на то, что секреция suPAR этими клетками является GPI-PLD-независимой

6 Секреция suPAR нейтрофилами очагов острого воспаления

В предшествующей части работы мы показали, что культивируемые in vitro нейтрофилы человека в ответ на определенные активирующие воздействия секретируют хемотактически активную D2D3 форму suPAR Известно, что активация нейтрофилов in vivo происходит в очагах острого воспаления Для того, чтобы охарактеризовать секрецию suPAR активированными нейтрофилами очагов воспаления, мы провели сравнительный анализ парных образцов синовиальной жидкости (СЖ) и периферической крови (ПК) больных ревматоидным артритом Нейтрофилы СЖ и ПК, выделенные в идентичных условиях, культивировались in vitro в течении 30 мин, после чего концентрация suPAR в супернатантах анализировалась ферментным иммуносорбентным анализом Как видно на рис 6А, нейтрофилы СЖ продуцировали существенно большее количество suPAR, чем нейтрофилы ПК (83.3 ±10 5 пг/30 мин/106 клеток и 26 3 ± 2 7 пг/30 мин/106 клеток suPAR, соответственно) Анализ супернатантов методом иммуноблота показал, что нейтрофилы из двух сравниваемых источников секретируют преимущественно D2D3 форму suPAR (рис 6В,С)

Для того, чтобы продемонстрировать хемотактические свойства suPAR, секретируемого нейтрофилами СЖ, мы использовали экспериментальный подход, подробно описанный выше Сначала мы проанализировали способность супернатантов культивируемых m vitro нейтрофилов СЖ индуцировать хемотаксис клеток FPRL1/293 Рис 9А показывает, что эти супернатанты

вызывали существенный хемотактический ответ клеток РРЯЬ1/293 (хемотактический индекс 4.1 ± 0.2, п = 6). который был полностью подавлен в присутствии ингибитора рецептора РРЯЫ гексапептида \VRVV4. Затем мы анализировали прохемотактические свойства супернатантов с удаленным методом иммунопреципитации зиРАЯ. Удаление эиРАЯ из исследуемых супернатантов с использованием моноклональных антител, специфичных к

А

? 100

н

1 80

0 60

1 40

< 20

Си

3 0

В

ПК сж

75" 50 -

suPAR

37-

<*» Щ$0 <- D2D3

2520- IIkIBJ.

Рис. 6. Спонтанная секреция suPAR нейтрофилами периферической крови и синовиальной жидкости коленных суставов пациентов с ревматоидным артритом.

Нейтрофилы выделяли из парных образцов периферической крови (ПК) и синовиальной жидкости (СЖ) пациентов с ревматоидным артритом. Нейтрофилы (108 клеток/мл) инкубировали при 37 °С и 5% СОг в течении 30 мин. Супернатанты затем анализировали методом ферментного иммуносорбентного анализа (А), методом иммуноблота без дегликозилирования белков (Б) и методом иммуноблота с предшествующим дегликозилированием белков N-гликозидазой F (В). Представлены средние данные шести независимых экспериментов (среднее + SEM); *,р < 0.05 (А) и одного из трех независимых экспериментов (Б и В).

Б

ПК СЖ

1 f 75-

1 <r- suPAR

LI

I ШШ__20 -

ПК СЖ

ПК СЖ

ж к а о

V ? °

Н (1)

S я о s 2 и

X

О

WRW4 анти-02 анти-Dl IgG

-in

IK

к

X

1.5

0.5

+

0

WRW4 анти-02 анти-Dl IgG

гЦ -ь

-in

...... ft .

nE"i

Рис. 7. Нейтрофилы синовиальной жидкости коленных суставов пациентов с ревматоидным артритом секретируют хемотактически активную D2D3 форму suPAR.

Нейтрофилы выделяли из парных образцов синовиальной жидкости (А) и периферической крови (Б) пациентов с ревматоидным артритом. Нейтрофилы (107 клеток/мл) инкубировали при 37 °С и 5% С02 в течении 60 мин. Прохемотактические свойства супернатантов анализировали в камере Бойдена, используя клетки FPRL1/293 в качестве тестируемых клеток. Эксперименты проводили в отсутствии и в присутствии гексапептида WRW4 (10 мкМ). В отдельных экспериментах из супернатантов удаляли suPAR с использованием моноклональных антител, специфичных к доменам D2 или D1 uPAR, а также использовали неспецифичные мышиные антитела (IgG) в качестве контроля. Представлены средние данные шести независимых экспериментов (среднее ± SEM); *,р < 0.01.

домену D2 uPAR, приводило к статистически значимому снижению хемотаксиса клеток FPRL1/293 (на 41 ± 6.3 %, р < 0.01, п = 6). Использование моноклональных антител, специфичных к домену D1 uPAR, а также контрольных неспецифичных антител мыши, не вызывало статистически значимого изменения в хемотаксисе клеток FPRL1/293 (рис. 7А). Суммируя все эти данные, можно заключить, что нейтрофилы СЖ секретируют хемотактически активную D2D3 форму suPAR, являющуюся лигандом рецептора FPRL1.

В отличие от супернатантов культивируемых in vitro нейтрофилов СЖ, супернатанты культивируемых нейтрофилов ПК вызывали слабый хемотактический ответ клеток FPRL1/293 (хемотактический индекс 1.29 ± 0.09,

п = 6) и удаление 0203 формы быРАЯ из этих супернатантов не приводило к статистически значимым изменениям в хемотаксисе клеток РРЯЬ1/293 (рис. 7Б). Последнее свидетельствует о том, что даже если хемотактически активная 0203 форма эиРАЯ и секретируется нейтрофилами ПК (и мы не можем показать это из-за недостаточной чувствительности метода), то в значительно меньших количествах, чем нейтрофилами СЖ. Поскольку концентрация эиРАЯ в СЖ существенно выше, чем в ПК (5.8 ± 0.3 нг/мл и 1.4 + 0.2 нг/мл эиРАЯ, соответственно), мы предполагаем, что возможно существование концентрационного градиента хемотактически активной 0203 формы эиРАЯ между очагом воспаления и невоспаленной тканью, в создании которого участвуют активированные нейтрофилы очага воспаления, представляющие основную (80-90%) клеточную популяцию СЖ. Этот концентрационный градиент хемотактически активной 0203 формы виРАЯ может участвовать в рекрутировании экспрессирующих формилпептидные рецепторы лейкоцитов в формирующиеся очаги острого воспаления (рис. 8).

воспаленная ткань

©

нейтрофилы

мононуклеарные лейкоциты

хемоаттрактанты

Рис. 8. Гипотетическая роль хемотактически активной формы виРАИ в

иммунном ответе.

Нейтрофилы являются первыми клетками, мигрирующими в области повреждения тканей и проникновения инфекции (1). В формирующемся очаге воспаления нейтрофилы активируются и секретируют многочисленные хемоаттрактанты (2), рекрутирующие другие типы лейкоцитов в воспаленную ткань (3). Согласно этому сценарию, хемотактически активная 0203 форма виРАК, образуемая активированными нейтрофилами в очаге воспаления, может участвовать в рекрутировании экспрессирующих формилпептидные рецепторы лейкоцитов в воспаленную ткань.

выводы

1 Впервые показано, что хемотактически активная D2D3 форма suPAR может секретареваться культивируемыми in vitro клетками (активированными нейтрофилами человека),

2 Обнаружен новый хемоаттрактант, секретируемый активированными нейтрофилами, и новый путь образования хемотактически активных белков (шеддинг и сопутствующий протеолитический процессинг мембранного белка) при активации нейтрофилов,

3 Катепсин G-зависимый шеддинг uPAR идентифицирован как механизм, частично опосредующий образование suPAR при активации нейтрофилов Участие GPI-специфичной фосфолипазы D (GPI-PLD), а также металлопротеиназ, в образовании suPAR нейтрофилами человека не выявлено,

4 Показано, что активированные нейтрофилы очагов воспаления (синовиальных жидкостей больных ревматоидным артритом) секретируют большие количества хемотактически активной D2D3 формы suPAR, чем циркулирующие нейтрофилы периферической крови

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Pliyev В К. Tkachuk VA "Activated human neutrophils rapidly release the chemotactically active D2D3 form of the urokinase-type plasminogen activator receptor (uPAR/CD87)" Abstracts of Xlth International Workshop on Molecular and Cellular Biology of Plasminogen Activation, Saltsobaden, 2007, p 26

2 Pliyev В К, Tkachuk V A "Activated human neutrophils shed the chemotactically active D2D3 form of the urokmase-type plasminogen activator receptor (uPAR/CD87)" Abstracts of the meeting Gene Expression and Signaling in the Immune System, Cold Spring Harbor, 2008, p 39

3 Плиев Б К "Хемотактически активные белки нейтрофилов", Биохимия, 2008, 73(9), 1206-1223

4 Pliyev В К "Activated human neutrophils rapidly release the chemotactically active D2D3 form of the urokmase-type plasminogen activator receptor (uPAR/CD87)", Mol Cell Biochem , in press - http//dx doi org/10 1007/sl 1010-008-9925-z

Подписано в печать 07 10 2008 г

Печать трафаретная

Заказ № 929 Тираж ЮОэкз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Плиев, Борис Константинович

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Хемотактически активные белки нейтрофилов.

1.1. Классические хемокины, секретируемые нейтрофилами.

1.1.1. ELR+CXC хемокины.

1.1.2. ELR-CXC хемокины.

1.1.3. СС хемокины.

1.2. Хемотактически активные белки гранул нейтрофилов.

1.2.1. Кателицидины.

1.2.2. Дефенсины.

1.2.3. Катепсин G.

1.2.4. Азуроцидин/САРЗ7.

1.2.5. Урокиназа.

1.3. Участие нейтрофилов в образовании хемоаттрактантов из белков плазмы крови и интерстициалышй жидкости тканей.

1.3.1. Хемерин.

1.3.2. CCL15.

1.3.3. NAP-2.

1.4. Хемоаттрактанты нейтрофилов и формирование очага воспаления.

2. Урокиназный рецептор.

2.1. Мембраносвязанный урокиназный рецептор (uPAR).

2.2. Растворимый урокиназный рецептор (suPAR).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Химические реактивы.

Культуральные среды и пластик.

Антитела.

Мечение антител флуорохромом Alexa Fluor 488.

Выделение нейтрофилов периферической крови.

Культивирование клеток FPRL1/293.

Активация нейтрофилов.

Ферментный иммуносорбентный анализ.

Анализ экспрессии антигенов методом проточной цитометрии.

Сепарация фаз в Тритоне Х-114.

Иммуноблоттинг.

Дегликозилирование suPAR.

Анализ дегрануляции нейтрофилов.

Хемотаксис.

Анализ синовиальных жидкостей.

Статистический анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Секреция suPAR нейтрофилами, активированными иономицином.

2. Секреция suPAR нейтрофилами, активированными провоспалительными медиаторами.

3. Доменная организация секретируемого нейтрофилами suPAR.

4. Хемотактические свойства секретируемого нейтрофилами suPAR.

5. Механизм образования suPAR при активации нейтрофилов.

6. Секреция suPAR нейтрофилами очагов острого воспаления.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

1. Активированные нейтрофилы человека секретируют хемотактически активную D2D3 форму suPAR.

2. Секреция хемотактически активной D2D3 формы suPAR активированными нейтрофилами человека частично опосредована катепсин G-зависимым шеддингом uPAR.

3. Секреция хемотактически активной D2D3 формы suPAR активированными нейтрофилами в очагах острого воспаления.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Секреция хемотактически активной D203 формы растворимого урокиназного рецептора активированного нейтрофилами человека"

Нейтрофилы являются основными эффекторными клетками неспецифического иммунитета и представляют первую линию защиты организма от патогенных микроорганизмов. Эти клетки узнают и убивают микроорганизмы посредством их фагоцитоза и последующей секреции активных форм кислорода и цитотоксических компонентов гранул в фагосомы (Segal, 2005; Nauseef, 2007). Помимо элиминирования патогенных микроорганизмов в очагах воспаления, нейтрофилы играют важнейшую роль в рекрутировании других типов лейкоцитов в воспаленную ткань, организуя, таким образом, клеточную составляющую неспецифического иммунного ответа и обеспечивая сопряжение неспецифического и адаптивного иммунного ответов (рис. 1). В ранних работах была продемонстрирована бифазность неспецифического иммунного ответа и показано, что инфильтрация очагов воспаления нейтрофилами предшествует появлению в этих очагах мононуклеарных лейкоцитов (моноцитов и лимфоцитов) (Page et al., 1958; Antony et al., 1985; Doherty et al., 1988; Zhou et al., 2003). При вызванной экспериментально нейтропении, рекрутирование мононуклеарных лейкоцитов в очаги воспаления существенно подавлено и происходит с гораздо большей временной задержкой, чем в контроле. Эти данные позволили предположить, что нейтрофилы, аккумулирующиеся в воспаленной ткани, секретируют хемоаттрактанты, привлекающие моноциты и лимфоциты в очаг воспаления.

Действительно, в последующих работах использование методов полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией, иммуногистохимии, иммуноферментного анализа и гибридизации in situ показало, что аккумуляция нейтрофилов в очагах проникновения инфекции и поврежденных тканях сопровождается индукцией экспрессии многочисленных хемокинов (Scapini et al., 2000; Cassatella et al., 1999). Совсем недавно Theilgaard-Monch с соавт., используя микрочип Affymetrix Hu95A, позволяющий проанализировать экспрессию 12500 генов и выявить дифференциально экспрессирующиеся гены, провели сравнительный анализ профилей генной экспрессии зрелых нейтрофилов из костного мозга, нейтрофилов, циркулирующих в крови, и нейтрофилов из воспаленных тканей (Theilgaard-Monch et al., 2004). Такой анализ показал, что выход зрелых нейтрофилов из костного мозга в кровоток не сопровождается существенными изменениями в экспрессии генов. Напротив, значительные изменения в профиле генной экспрессии происходят при миграции нейтрофилов из кровотока в воспаленную ткань. В частности, индуцируется экспрессия генов многочисленных хемокинов, мишенями которых являются нейтрофилы, моноциты, лимфоциты и другие типы лейкоцитов. Аналогичные данные были получены другой группой авторов, исследовавших трансальвеолярную миграцию нейтрофилов в экспериментальной модели легочного воспаления (Coldren et al., 2006). Из 14131 гена, проанализированного с использованием микрочипа Affymetrix HG-U133A, 15% оказались дифференциально экспрессирующимися в нейтрофилах периферической крови и бронхоальвеолярной жидкости. Среди генов, экспрессия которых индуцировалась в процессе трансальвеолярной миграции, существенную часть составляли гены хемокинов (Coldren et al., 2006).

Рис. 1. Бифазность неспецифического иммунного ответа. Нейтрофилы являются первыми клетками, аккумулирующимися в очаге воспаления (1). В воспаленной ткани они активируются и секретируют многочисленные хемоаттрактанты (2), которые рекрутируют другие типы лейкоцитов (в частности, моноциты и лимфоциты) в очаг воспаления (3).

К настоящему моменту показано, что помимо классических хемокинов, экспрессия генов которых индуцируется при активации нейтрофилов, активированные нейтрофилы секретируют другие белки, способные оказывать хемотактический эффект на отдельные типы лейкоцитов

Таблица 1). Эти белки являются компонентами гранул нейтрофилов и быстро секретируются при дегрануляции активированных клеток.

Урокиназный рецептор (urokinase-type plasminogen activator receptor, uPAR) -мультилигандный рецептор, играющий важную роль в околоклеточном протеолизе мигрирующих клеток, клеточной адгезии и хемотаксисе (Blasi and Carmeliet, 2002; Ragno, 2006). uPAR экспрессируется миелоидными клетками (моноцитами, макрофагами и гранулоцитами), эндотелиальными и гладкомышечными клетками сосудов и эпителиальными клетками, а также многими типами раковых клеток. Зрелый рецептор, встроенный в плазматическую мембрану, состоит из 283 аминокислотных остатков, не имеет трансмембранных участков и заякорен на мембране через гликозилфосфатидилинозитол (GPI). В структуре uPAR выделяют три гомологичных домена: Dl, D2 и D3. Линкерный участок, связывающий домены D1 и D2, может расщепляться многими сериновыми протеазами, такими как нейтрофильная эластаза, плазмин и урокиназа, а также некоторыми металлопротеиназами (Montuori et al., 2005). Таким образом, на плазматической мембране присутствует как полноразмерный uPAR, связывающий урокиназу, так и D2D3 форма рецептора, не взаимодействующая с урокиназой.

Мембраносвязанный uPAR может отщепляться GPI-специфичной фосфолипазой D с образованием растворимой формы рецептора - suPAR (рис. 3). Как и мембраносвязанный рецептор на плазматической мембране, suPAR в биологических жидкостях присутствует как в полноразмерной, так и в D2D3 формах. Расщепление линкерного участка между доменами D1 и D2 может происходить в разных сайтах. D2D3 форма suPAR с экспонированным фрагментом SRSRY (остатки 88-92) линкерного участка является хемоаттрактантом для базофилов, моноцитов и CD34+ гематопоэтических стволовых клеток. Хемотактический эффект этой формы suPAR опосредован формилпептидными рецепторами FPRL1 и FPRL2 на базофилах, FPRL1 - на моноцитах и FPR- на CD34+ гематопоэтических стволовых клетках.

Нейтрофилы человека содержат значительный внутриклеточный пул uPAR, локализованный в первичных и третичных гранулах и секреторных везикулах (Plesner et al., 1994; Pedersen et al., 2000). Активация нейтрофилов приводит к быстрой транслокации uPAR из внутриклеточных компартментов на плазматическую мембрану (Plesner et al., 1994). Поскольку активированные нейтрофилы секретируют также сериновые протеазы (нейтрофильную эластазу и урокиназу), способные расщеплять линкерный участок между доменами D1 и D2, мы предположили, что если активация нейтрофилов приводит к секреции suPAR (шеддингу uPAR), образующаяся форма, возможно, является хемотактически активной D2D3 формой рецептора. В таком случае, хемотактически активная D2D3 форма suPAR могла бы представлять собой ещё один хемоатграктант, секретируемый активированными нейтрофилами.

Таким образом, целью настоящей работы было выяснить возможность секреции растворимой формы уроки назного рецептора (suPAR) нейтрофилами человека в их различных функциональных состояниях и исследовать ее возможное участие в воспалительных процессах.

Для этого мы поставили перед собой следующие задачи:

1. Показать возможность секреции suPAR при активации нейтрофилов;

2. Охарактеризовать доменную структуру и возможные хемотактические свойства секретируемого нейтрофилами suPAR;

3. Исследовать механизм образования suPAR при активации нейтрофилов;

4. Оценить секрецию suPAR активированными in vivo нейтрофилами очагов острого воспаления.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Плиев, Борис Константинович

выводы

1). Впервые показано, что хемотактически активная D2D3 форма suPAR может секретироваться культивируемыми in vitro клетками (активированными нейтрофилами человека);

2). Обнаружен новый хемоаттрактант, секретируемый активированными нейтрофилами, и новый путь образования хемотактически активных белков (шеддинг и сопутствующий протеолитический процессинг мембранного белка) при активации нейтрофилов;

3). Катепсин G-зависимый шеддинг uPAR идентифицирован как механизм, частично опосредующий образование suPAR при активации нейтрофилов. Участие GPI-специфичной фосфолипазы D (GPI-PLD), а также металлопротеиназ, в образовании suPAR нейтрофилами человека не выявлено;

4). Показано, что активированные нейтрофилы очагов воспаления (синовиальных жидкостей больных ревматоидным артритом) секретируют большие количества хемотактически активной D2D3 формы suPAR, чем циркулирующие нейтрофилы периферической крови.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В нашей работе мы впервые продемонстрировали способность культивируемых in vitro клеток (активированных нейтрофилов человека) секретировать хемотактически активную D2D3 форму suPAR. Кроме того, мы обнаружили ещё один хемоаттрактант, секретируемый активированными нейтрофилами, который, как и другие хемотактически активные белки нейтрофилов, может участвовать в рекрутировании различных типов лейкоцитов в формирующийся очаг воспаления (рис. 24). Как доказательство последнего предположения, нам удалось показать, что активированные нейтрофилы из очагов воспаления (синовиальных жидкостей больных ревматоидным артритом) продуцируют значительно большие количества

Рис, 24. Гипотетическая роль хемотактически активной D2D3 формы suPAR в иммунном ответе.

Нейтрофилы являются первыми клетками, .мигрирующими в области повреждения тканей и проникновения инфекции (1). В формирующемся очаге воспаления нейтрофилы активируются и секретируют многочисленные хемоаттрактанты (2), рекрутирующие другие типы лейкоцитов в воспаленную ткань (3). Согласно этому сценарию, хемотактически активная D2D3 форма suPAR, образуемая активированными нейтрофилами в очаге воспаления, может участвовать в рекрутировании экспрессирующих формилпептидные рецепторы лейкоцитов в воспаленную ткань. воспаленная ткань мононуклеарн ые лейкоциты хемоаттрактанты нейтрофилы suPAR, чем циркулирующие нейтрофилы периферической крови тех же индивидов. Мы также обнаружили новый путь образования хемотактически активных белков при активации нейтрофилов — шеддинг и сопутствующий протеолитический процессинг мембранного белка с образованием хемотактически активной растворимой формы. Катепсин G-зависимый шеддинг мембраносвязанного uPAR идентифицирован как механизм, частично опосредующий образование хемотактически активной D2D3 формы suPAR при активации нейтрофилов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Плиев, Борис Константинович, Москва

1. Abraham Е., Gyetko M.R., Kuhn К., Arcaroli J., Strassheim D., Park J.S., Shetty S., and Idell S. (2003) Urokinase-type plasminogen activator potentiates lipopolysaccharide-induced neutrophil activation. J. Immunol. 170:5644-5651.

2. Aguirre Ghiso J.A., Kovalski K., and Ossowski L. (1999) Tumor dormancy induced by downregulation of urokinase receptor in human carcinoma involves integrin and МАРК signaling. J. Cell Biol. 147:89-104.

3. Allen S.J., Crown S.E., and Handel T.M. (2007) Chemokine: receptor structure, interactions, and antagonism. Annu. Rev. Immunol. 25:787-820.

4. Almeida R.P., Melchior M., Campanelli D., Nathan C., and Gabay J.E. (1991) Complementary DNA sequence of human neutrophil azurocidin, an antibiotic with extensive homology to serine proteases. Biochem. Biophys. Res. Commun. 177:688-695.

5. Andreasen P.A., Kjoller L., Christensen L., and Duffy M.J. (1997) The urokinase-type plasminogen activator system in cancer metastasis: a review. Int. J. Cancer. 72:1-22.

6. Antony V.B., Sahn S.A., Antony A.C., and Repine J.E. (1985) Bacillus Calmette-Guerin-stimulated neutrophils release chemotaxins for monocytes in rabbit pleural spaces and in vitro. J. Clin. Invest. 76:1514-1521.

7. Arita M., Bianchini F., Aliberti J., Sher A., Chiang N., Hong S., Yang R., Petasis N.A., and Serhan C.N. (2005) Stereochemical assignment, antiinflammatory properties, and receptor for the omega-3 lipid mediator resolvin El. J. Exp. Med. 201:713-722.

8. Arita M., Ohira Т., Sun Y.P., Elangovan S., Chiang N., and Serhan C.N. (2007) Resolvin El selectively interacts with leukotriene B4 receptor BLT1 and ChemR23 to regulate inflammation. J. Immunol. 178:3912-3917.

9. Armstrong D.A., Major J.A., Chudyk A., and Hamilton T.A. (2004) Neutrophil chemoattractant genes КС and MIP-2 are expressed in different cell populations at sites of surgical injury. J. Leukoc. Biol. 75:641-648.

10. Baker C., Belbin O., Kalsheker N., and Morgan K. (2007) SERPINA3 (aka alpha-1-antichymotrypsin). Front Biosci. 12:2821-2835.

11. Banda M.J., Rice A.G., Griffin G.L., and Senior R.M. (1998) The inhibitory complex of human alpha 1-proteinase inhibitor and human leukocyte elastase is a neutrophil chemoattractant. J. Exp. Med. 167:1608-1615.

12. Bazzoni F., Cassatella M.A., Rossi F., Ceska M., Dewald В., and Baggiolini M. (1991) Phagocytosing neutrophils produce and release high amounts of the neutrophil-activating peptide 1/interleukin 8. J. Exp. Med. 173:771-774.

13. Beaufort N., Leduc D., Rousselle J.C., Magdolen V., Luther Т., Namane A., Chignard M., and Pidard D. (2004) Proteolytic regulation of the urokinase receptor/CD87 on monocytic cells by neutrophil elastase and cathepsin G. J. Immunol. 172:540-549.

14. Beaufort N., Leduc D., Rousselle J.C., Namane A., Chignard M., and Pidard D. (2004) Plasmin cleaves the juxtamembrane domain and releases truncated species of the urokinase receptor (CD87) from human bronchial epithelial cells. FEBS Lett. 574:89-94.

15. Behrendt N., and Dan0 K. (1996) Effect of purified, soluble urokinase receptor on the plasminogen-prourokinase activation system. FEBS Lett. 393:31-36.

16. Behrendt N., Ploug M., Patthy L., Houen G., Blasi F., and Dano K. (1991) The ligand-binding domain of the cell surface receptor for urokinase-type plasminogen activator. J. Biol. Chem. 266:78427847.

17. Berahovich R.D., Miao Z., Wang Y., Premack В., Howard M.C., and Schall T.J. (2005) Proteolytic activation of alternative CCR1 ligands in inflammation. J. Immunol. 174:7341-7351.

18. Blasi F., and Carmeliet P. (2002) uPAR: a versatile signalling orchestrator. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 3:932-943.

19. Bordier C. (1981) Phase separation of integral membrane proteins in Triton X-l 14 solution. J. Biol. Chem. 256:1604-1607.

20. Borregaard N., Sorensen O.E., and Theilgaard-Monch K. (2007) Neutrophil granules: a library of innate immunity proteins. Trends. Immunol. 28:340-345.

21. Brandt E., Van Damme J., and Flad H.D. (1991) Neutrophils can generate their activator neutrophil-activating peptide 2 by proteolytic cleavage of platelet-derived connective tissue-activating peptide III. Cytokine 3:311-321.

22. Burn T.C., Petrovick M.S., Hohaus S., Rollins B.J., and Tenen D.G. (1994) Monocyte chemoattractant protein-1 gene is expressed in activated neutrophils and retinoic acid-induced human myeloid cell lines. Blood 84:2776-2783.

23. Cacalano G., Lee J., Kikly K., Ryan A.M., Pitts-Meek S., Hultgren В., Wood W.I., and Moore M.W. (1994) Neutrophil and В cell expansion in mice that lack the murine IL-8 receptor homolog. Science 265:682-684.

24. Carr M.W., Roth S.J., Luther E., Rose S.S., and Springer T.A. (1994) Monocyte chemoattractant protein 1 acts as a T-lymphocyte chemoattractant. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91:3652-3656.

25. Cassatella M.A. (1999) Neutrophil-derived proteins: selling cytokines by the pound. Adv. Immunol. 73:369-509.

26. Cham B.P., Gerrard J.M., and Bainton D.F. (1994) Granulophysin is located in the membrane of azurophilic granules in human neutrophils and mobilizes to the plasma membrane following cell stimulation. Am. J. Pathol. 144:1369-1380.

27. Charo I.F., and Ransohoff R.M. (2006) The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. N. Engl. J. Med. 354:610-621.

28. Chavakis Т., Willuweit A.K., Lupu F., Preissner K.T., and Kanse S.M. (2001) Release of soluble urokinase receptor from vascular cells. Thromb. Haemost. 86:686-693.

29. Chen L., and Sendo F. (2001) Cytokine and chemokine mRNA expression in neutrophils from CBA/NSlc mice infected with Plasmodium berghei ANKA that induces experimental cerebral malaria. Parasitol. Int. 50:139-143.

30. Clark-Lewis I., Dewald В., Geiser Т., Moser В., and Baggiolini M. (1993) Platelet factor 4 binds to interleukin 8 receptors and activates neutrophils when its N terminus is modified with Glu-Leu-Arg. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:3574-3577.

31. Clark-Lewis I., Kim K.S., Rajarathnam K., Gong J.H., Dewald В., Moser В., Baggiolini M., and Sykes B.D. (1995) Structure-activity relationships of chemokines. J. Leukoc. Biol. 57:703-711.

32. Cohen A.B., Stevens M.D., Miller E.J., Atkinson M.A., and Mullenbach G. (1992) Generation of the neutrophil-activating peptide-2 by cathepsin G and cathepsin G-treated human platelets. Am. J. Physiol. 263:L249-L256.

33. Crippa M.P. (2007) Urokinase-type plasminogen activator. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 39:690-694.

34. Dahlgren C., Johansson A., Lundqvist H., Bjerrum O.W., and Borregaard N. (1992) Activation of the oxygen-radical-generating system in granules of intact human neutrophils by a calcium ionophore (ionomycin). Biochim. Biophys. Acta. 1137:182-188.

35. Del Prete A., Locati M., Otero K., Riboldi E., Mantovani A., Vecchi A., and Sozzani S. (2006) Migration of dendritic cells across blood and lymphatic endothelial barriers. Thromb. Haemost. 95:2228.

36. Devalaraja R.M., Nanney L.B., Du J., Qian Q., Yu Y., Devalaraja M.N., and Richmond A. (2000) Delayed wound healing in CXCR2 knockout mice. J. Invest. Dermatol. 115:234-244.

37. Doherty D.E., Downey G.P., Worthen G.S., Haslett C., and Henson P.M. (1988) Monocyte retention and migration in pulmonary inflammation. Requirement for neutrophils. Lab. Invest. 59:200213.

38. Dunican A.L., Leuenroth S.J., Ayala A., and Simms H.H. (2000) CXC chemokine suppression of polymorphonuclear leukocytes apoptosis and preservation of function is oxidative stress independent. Shock 13:244-250.

39. Durr U.H., Sudheendra U.S., and Ramamoorthy A. (2006) LL-37, the only human member of the cathelicidin family of antimicrobial peptides. Biochim. Biophys. Acta. 1758:1408-1425.

40. Eck M., Schmausser В., Scheller K., Toksoy A., Kraus M., Menzel Т., Muller-Hermelink H.K., and Gillitzer R. (2000) CXC chemokines Gro(alpha)/IL-8 and 1P-10/MIG in Helicobacter pylori gastritis. Clin. Exp. Immunol. 122:192-199.

41. Faurschou M., and Borregaard N. (2003) Neutrophil granules and secretory vesicles in inflammation. Microbes Infect. 5:1317-1327.

42. Fazioli F., Resnati M., Sidenius N., Higashimoto Y., Appella E., and Blasi F. (1997) A urokinase-sensitive region of the human urokinase receptor is responsible for its chemotactic activity. EMBO J. 16:7279-7286.

43. Fletcher C.M., Harrison R.A., Lachmann P.J., and Neuhaus D. (1994) Structure of a soluble, glycosylated form of the human complement regulatory protein CD59. Structure 2:185-199.

44. Forssmann U., Magert H.J., Adermann K., Escher S.E., and Forssmann W.G. (2001) Hemofiltrate CC chemokines with unique biochemical properties: HCC-l/CCL14a and HCC-2/CCL15. ./. Leukoc. Biol. 70:357-366.

45. Fossati G., Bucknall R.C., and Edwards S.W. (2002) Insoluble and soluble immune complexes activate neutrophils by distinct activation mechanisms: changes in functional responses induced by priming with cytokines. Ann. Rheum. Dis. 61:13-19.

46. Foxman E.F., Campbell J.J., and Butcher E.C. (1997) Multistep navigation and the combinatorial control of leukocyte chemotaxis.Cell Biol. 139:1349-1360.

47. Frendeus В., Godaly G., Hang L., Karpman D., Lundstedt A.C., and Svanborg C. (2000) Interleukin 8 receptor deficiency confers susceptibility to acute experimental pyelonephritis and may have a human counterpart. J. Exp. Med. 192:881-890.

48. Friedrichson Т., and Kurzchalia T.V. (1998) Microdomains of GPI-anchored proteins in living cells revealed by crosslinking. Nature 394:802-805.

49. Gasperini S., Calzetti F., Russo M.P., De Gironcoli M., and Cassatella M.A. (1995) Regulation of GRO alpha production in human granulocytes. J. Inflamm. 45:143-151.

50. Gasser O., Hess C., Miot S., Deon C., Sanchez J.C., and Schifferli J.A. (2003) Characterisation and properties of ectosomes released by human polymorphonuclear neutrophils. Exp. Cell Res. 285:243257.

51. Gaudry M., Combadiere C., Marquetty C., and Hakim J. (1990) A comparison of the priming effect of phorbol myristate acetate and phorbol dibutyrate on fMet-Leu-Phe-induced oxidative burst in human neutrophils. Immunopharmacology 20:45-56.

52. Geiser Т., Dewald В., Ehrengruber M.U., Clark-Lewis I., and Baggiolini M. (1993) The interleukin-8-related chemotactic cytokines GRO alpha, GRO beta, and GRO gamma activate human neutrophil and basophil leukocytes. J. Biol. Chem. 268:15419-15424.

53. Gennaro R., and Zanetti M. (2000) Structural features and biological activities of the cathelicidin-derived antimicrobial peptides. Biopolymers 55:31-49.

54. Ghosh S., Brown R., Jones J.C., Ellerbroek S.M., and Stack M.S. (2000) Urinary-type plasminogen activator (uPA) expression and uPA receptor localization are regulated by alpha 3beta 1 integrin in oral keratinocytes. J. Biol. Chem. 275:23869-23876.

55. Gillitzer R., Ritter U., Spandau U., Goebeler M., and Brocker E.B. (1996) Differential expression of GRO-alpha and IL-8 mRNA in psoriasis: a model for neutrophil migration and accumulation in vivo. J. Invest. Dermatol. 107:778-782.

56. Godaly G., Hang L., Frendeus В., and Svanborg C. (2000) Transepithelial neutrophil migration is CXCR1 dependent in vitro and is defective in IL-8 receptor knockout mice. J. Immunol. 165:52875294.

57. Godar S., Horejsi V., Weidle U.H., Binder B.R., Hansmann C., and Stockinger H. (1999) МбР/IGFII-reeeptor complexes urokinase receptor and plasminogen for activation of transforming growth factor-betal. Eur. J. Immunol. 29:1004-1013.

58. Granelli-Piperno A., Vassalli J.D., and Reich E. (1977) Secretion of plasminogen activator by human polymorphonuclear leukocytes. Modulation by glucocorticoids and other effectors. J. Exp. Med. 146:1693-1706.

59. Grigat J., Soruri A., Forssmann U., Riggert J., and Zwirner J. (2007) Chemoattraction of macrophages, T lymphocytes, and mast cells is evolutionarily conserved within the human alpha-defensin family. J. Immunol. 179:3958-3965.

60. Gudewicz P.W., and Gilboa N. (1987) Human urokinase-type plasminogen activator stimulates chemotaxis ofhuman neutrophils. Biochem. Biophys. Res. Commun. 147:1176-1181.

61. Guerrero J., Santibanez J.F., Gonzalez A., and Martinez J. (2004) EGF receptor transactivation by urokinase receptor stimulus through a mechanism involving Src and matrix metalloproteinases. Exp. Cell Res. 292:201-208.

62. Gullberg U., Bengtsson N., Biilow E., Garwicz D., Lindmark A., and Olsson I. (1999) Processing and targeting of granule proteins in human neutrophils. J. Immunol. Methods. 232:201-210.

63. Gyetko M.R., Sitrin R.G., Fuller J.A., Todd R.F. 3rd, Petty H., and Standiford T.J. (1995) Function of the urokinase receptor (CD87) in neutrophil chemotaxis. J. Leukoc. Biol. 58:533-538.

64. Gyetko M.R., Todd R.F. 3rd, Wilkinson C.C., and Sitrin R.G. (1994) The urokinase receptor is required for human monocyte chemotaxis in vitro. J. Clin. Invest. 93:1380-1387.

65. Hansell C.A., Simpson C.V., and Nibbs R.J. (2006) Chemokine sequestration by atypical chemokine receptors. Biochem. Soc. Trans. 34:1009-1013.

66. Harder Т., Scheiffele P., Verkade P., and Simons K. (1998) Lipid domain structure of the plasma membrane revealed by patching of membrane components. J. Cell Biol. 141:929-942.

67. Hebert C.A., Vitangcol R.V., and Baker J.B. (1991) Scanning mutagenesis of interleukin-8 identifies a cluster of residues required for receptor binding. J. Biol. Chem. 266:18989-18994.

68. Heinzelmann M., Polk H.C. Jr., and Miller F.N. (1998) Modulation of lipopolysaccharide-induced monocyte activation by heparin-binding protein and fucoidan. Infect. Immun. 66:5842-5847.

69. Heiple J.M., and Ossowski L°. (1986) Human neutrophil plasminogen activator is localized in specific granules and is translocated to the cell surface by exocytosis. J. Exp. Med. 164:826-840.

70. Hokeness K.L., Deweerd E.S., Munks M.W., Lewis C.A., Gladue R.P., and Salazar-Mather T.P. (2007) CXCR3-dependent recruitment of antigen-specific T lymphocytes to the liver during murine cytomegalovirus infection. J. Virol. 81:1241-1250.

71. Hoyer-Hansen G., BehrendtN., Ploug M., Dan0 K., and Preissner K.T. (1997) The intact urokinase receptor is required for efficient vitronectin binding: receptor cleavage prevents ligand interaction. FEBS Lett. 420:79-85.

72. Hoyer-Hansen G., Ploug M., Behrendt N., Ronne E., and Dano K. (1997) Cell-surface acceleration of urokinase-catalyzed receptor cleavage. Eur. J. Biochem. 243:21-26.

73. H0yer-Hansen G., Ronne E., Solberg H., Behrendt N., Ploug M., Lund L.R., Ellis V., and Dan0 K. (1992) Urokinase plasminogen activator cleaves its cell surface receptor releasing the ligand-binding domain. J. Biol. Chem. 267:18224-18229.

74. Huang H.J., Ross C.R., and Blecha F. (1997) Chemoattractant properties of PR-39, a neutrophil antibacterial peptide. J. Leukoc. Biol. 61:624-629.

75. Jenne D.E. (1994) Structure of the azurocidin, proteinase 3, and neutrophil elastase genes. Implications for inflammation and vasculitis. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 150:S147-S154.

76. Jo M., Thomas K.S., O'Donnell D.M., and Gonias S.L. (2003) Epidermal growth factor receptor-dependent and -independent cell-signaling pathways originating from the urokinase receptor. J. Biol. Chem. 278:1642-1646.

77. Jones S.A., Dewald В., Clark-Lewis I., and Baggiolini M. (1997) Chemokine antagonists that discriminate between interleukin-8 receptors. Selective blockers of CXCR2. J. Biol. Chem. 272:1616616169.

78. Kaiko G.E., Horvat J.C., Beagley K.W., and Hansbro P.M. (2008) Immunological decisionmaking: how does the immune system decide to mount a helper T-cell response? Immunology 123:326338.

79. Kasama Т., Strieter R.M., Lukacs N.W., Burdick M.D., and Kunkel S.L. (1994) Regulation of neutrophil-derived chemokine expression by IL-10. J. Immunol. 152:3559-3569.

80. Kasama Т., Strieter R.M., Standiford T.J., Burdick M.D., and Kunkel S.L. (1993) Expression and regulation of human neutrophil-derived macrophage inflammatory protein 1 alpha. J. Exp. Med. 178:63-72.

81. Kidd P. (2003) Thl/Th2 balance: the hypothesis, its limitations, and implications for health and disease. Altem. Med. Rev. 8:223-246.

82. Kilpatrick L., Johnson J.L., Nickbarg E.B., Wang Z.M., Clifford T.F., Banach M., Cooperman B.S., Douglas S.D., and Rubin H. (1991) Inhibition of human neutrophil superoxide generation by alpha 1-antichymotrypsin. J. Immunol. 146:2388-2393.

83. Kim C.H. (2004) Chemokine-chemokine receptor network in immune cell trafficking. Curr. Drug Targets Immune Endocr. Metabol. Disord. 4:343-361.

84. Kim J.S., Jung H.C., Kim J.M., Song I.S., and Kim C.Y. (2000) Helicobacter pylori water-soluble surface proteins activate human neutrophils and up-regulate expression of CXC chemokines. Dig. Dis. Sci. 45:83-92.

85. Kitsis E., and Weissmann G. (1991) The role of the neutrophil in rheumatoid arthritis. Clin. Orthop. Relat. Res. 265:63-72.

86. Kolset S.O., and Gallagher J.T. (1990) Proteoglycans in haemopoietic cells. Biochim. Biophys. Acta. 1032:191-211.

87. Korkmaz В., Moreau Т., and Gauthier F. (2008) Neutrophil elastase, proteinase 3 and cathepsin G: Physicochemical properties, activity and physiopathological functions. Biochimie 90:227-242.

88. Kugler M.C., Wei Y., and Chapman H.A. (2003) Urokinase receptor and integrin interactions. Curr. Pharm. Des. 9:1565-1574.

89. Kuziel W.A., Morgan S.J., Dawson T.C., Griffin S., Smithies O., Ley K., and Maeda N. (1997) Severe reduction in leukocyte adhesion and monocyte extravasation in mice deficient in CC chemokine receptor 2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94:12053-12058.

90. Lacal P., Pulido R., Sanchez-Madrid F., and Mollinedo F. (1988) Intracellular location of T200 and Mol glycoproteins in human neutrophils. J. Biol. Chem. 263:9946-9951.

91. Lee J.K., Lee E.H., Yun Y.P., Kim K., Kwack K., Na D.S., Kwon B.S., and Lee C.K. (2002) Truncation of NH2-terminal amino acid residues increases agonistic potency of leukotactin-1 on CC chemokine receptors 1 and 3. J. Biol. Chem. 277:14757-14763.

92. Lee T.D., Gonzalez M.L., Kumar P., Chary-Reddy S., Grammas P., and Pereira H.A. (2002) CAP37, a novel inflammatory mediator: its expression in endothelial cells and localization to atherosclerotic lesions. Am. J. Pathol. 160:841-848.

93. Еёуеэяие J.P., Winkler I.G., Larsen S.R., and Rasko J.E. (2007) Mobilization of bone marrow-derived progenitors. Handb. Exp. Pharmacol. (180):3-36.

94. Lillard J.W. Jr., Boyaka P.N., Chertov O., Oppenheim J.J., and McGhee J.R. (1999) Mechanisms for induction of acquired host immunity by neutrophil peptide defcnsins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96:651-656.

95. Liu D., Aguirre Ghiso J., Estrada Y., and Ossowski L. (2002) EGFR is a transducer of the urokinase receptor initiated signal that is required for in vivo growth of a human carcinoma. Cancer Cell. 1:445-457.

96. Liu L., Callahan M.K., Huang D., and Ransohoff R.M. (2005) Chemokine receptor CXCR3: an unexpected enigma. Curr. Top. Dev. Biol. 68:149-181.

97. Llinas P., Le Du M.H., Gardsvoll H., Dano K., Ploug M., Gilquin В., Stura E.A., and Menez A. (2005) Crystal structure of the human urokinase plasminogen activator receptor bound to an antagonist peptide. EMBOJ. 24:1655-1663.

98. Loetscher P., and Clark-Lewis I. (2001) Agonistic and antagonistic activities of chemokines. J. Leukoc. Biol. 69:881-884.

99. Ludwig A., and Weber C. (2007) Transmembrane chemokines: versatile 'special agents' in vascular inflammation. Thromb. Haemost. 97:694-703.

100. Luttrell L.M. (2006) Transmembrane signaling by G protein-coupled receptors. Methods Mol. Biol. 332:3-49.

101. Mann K.J., Hepworth M.R., Raikwar N.S., Deeg M.A., and Sevlever D. (2004) Effect of glycosylphosphatidylinositol (GPI)-phospholipase D overexpression on GPI metabolism. Biochem J. 378:641-648.

102. Marshall B.C., Xu Q.P., Rao N.V., Brown B.R., and Hoidal J.R. (1992) Pulmonary epithelial cell urokinase-type plasminogen activator. Induction by interleukin-1 beta and tumor necrosis factor-alpha. J. Biol. Chem. 267:11462-11469.

103. Matityahu E., Feniger-Barish R., Meshel Т., Zaslaver A., and Ben-Baruch A. (2002) Intracellular trafficking of human CXCR1 and CXCR2: regulation by receptor domains and actin-related kinases. Eur. J. Immunol. 32:3525-3535.

104. Maurer M., and von Stebut E. (2004) Macrophage inflammatory protein-1. Int. J. Biochem. Cell Biol. 36:1882-1886.

105. May A.E., Kanse S.M., Lund L.R., Gisler R.H., Imhof B.A., and Preissner K.T. (1998) Urokinase receptor (CD87) regulates leukocyte recruitment via beta 2 integrins in vivo. J. Exp. Med. 188:10291037.

106. May A.E., Neumann F.J., Schomig A., and Preissner K.T. (2000) VLA-4 (alpha(4)beta(l)) engagement defines a novel activation pathway for beta(2) integrin-dependent leukocyte adhesion involving the urokinase receptor. Blood 96:506-513.

107. McColl S.R., and Clark-Lewis I. (1999) Inhibition of murine neutrophil recruitment in vivo by CXC chemokine receptor antagonists. J. Immunol. 163:2829-2835.

108. Menendez A., and Brett Finlay B. (2007) Defensins in the immunology of bacterial infections. Curr. Opin. Immunol. 19:385-391.

109. Mizukami I.F., Faulkner N.E., Gyetko M.R., Sitrin R.G., and Todd R.F. 3rd. (1995) Enzyme-linked immunoabsorbent assay detection of a soluble form of urokinase plasminogen activator receptor in vivo. Blood 86:203-211.

110. Molesworth-Kenyon S.J., Oakes J.E., and Lausch R.N. (2005) A novel role for neutrophils as a source of T cell-recruiting chemokines IP-10 and Mig during the DTH response to HSV-1 antigen. J. Leufoc. Biol. 77:552-559.

111. Moller L.B., Pollanen J., Ronne E., Pedersen N., and Blasi F. (1993) N-linked glycosylation of the ligand-binding domain of the human urokinase receptor contributes to the affinity for its ligand. J. Biol. Chem. 268:11152-11159.

112. Moller L.B., Ploug M., and Blasi F. (1992) Structural requirements for glycosyl-phosphatidylinositol-anchor attachment in the cellular receptor for urokinase plasminogen activator. Eur. J. Biochem. 208:493-500.

113. Monier S., Parton R.G., Vogel F., Behlke J., Henske A., and Kurzchalia T.V. (1995) VIP21-caveolin, a membrane protein constituent of the caveolar coat, oligomerizes in vivo and in vitro. Mol. Biol. Cell. 6:911-927.

114. Montuori N., Visconte V., Rossi G., and Ragno P. (2005) Soluble and cleaved forms of the urokinase-receptor: degradation products or active molecules? Thromb. Haemost. 93:192-198.

115. Moriuchi H., Moriuchi M., and Fauci A.S. (2000) Cathepsin G, a neutrophil-derived serine protease, increases susceptibility of macrophages to acute human immunodeficiency virus type 1 infection. J. Virol. 74:6849-6855.

116. Moser В., Clark-Lewis I., Zwahlen R., and Baggiolini M. (1990) Neutrophil-activating properties of the melanoma growth-stimulatory activity. J. Exp. Med. 171:1797-1802.

117. Mukaida N. (2000) Interleukin-8: an expanding universe beyond neutrophil chemotaxis and activation. Int. J. Hematol. 72:391-398.

118. Murphy P.M., and Tiffany H.L. (1991) Cloning of complementary DNA encoding a functional human interleukin-8 receptor. Science 253:1280-1283.

119. Naucler C., Grinstein S., Sundler R., and Tapper H. (2002) Signaling to localized degranulation in neutrophils adherent to immune complexes. J. Leukoc. Biol. 71:701-710.

120. Nauseef W.M. (2007) How human neutrophils kill and degrade microbes: an integrated view. Immunol. Rev. 219:88-102.

121. Niemann M.A., Narkates A.J., and Miller E.J. (1992) Isolation and serine protease inhibitory activity of the 44-residue, C-terminal fragment of alpha 1-antitrypsin from human placenta. Matrix 12:233-241.

122. Oelz D., Schmeiser C., and Soreff A. (2005) Multistep navigation of leukocytes: a stochastic model with memory effects. Math. Med. Biol. 22:291-303.

123. Page A.R., and Good R.A. (1958) A clinical and experimental study of the function of neutrophils in the inflammatory response. Am. J. Pathol. 34:645-669.

124. Pazgier M., Li X., Lu W., and Lubkowski J. (2007) Human defensins: synthesis and structural properties. Curr. Pharm. Des. 13:3096-3118.

125. Pedersen T.L., Plesner Т., Horn Т., H0yer-Hansen G., S0rensen S., and Hansen N.E. (2000) Subcellular distribution of urokinase and urokinase receptor in human neutrophils determined by immunoelectron microscopy. Ultrastruct. Pathol. 24:175-182.

126. Pereira H.A., Ruan X., and Kumar P. (2003) Activation of microglia: a neuroinflammatory role for CAP37. Glia 41:64-72.

127. Pereira H.A., Shafer W.M., Pohl J., Martin L.E., and Spitznagel J.K. (1990) CAP37, a human neutrophil-derived chemotactic factor with monocyte specific activity. J. Clin. Invest. 85:1468-1476.

128. Pham C.T. (2006) Neutrophil serine proteases: specific regulators of inflammation. Nat. Rev. Immunol. 6:541-550.

129. Pillinger M.H., and Abramson S.B. (1995) The neutrophil in rheumatoid arthritis. Rheum. Dis. Clin. North. Am. 21:691-714.

130. Pliyev B.K. (2008) Activated human neutrophils rapidly release the chemotactically active D2D3 form of the urokinase-type plasminogen activator receptor (uPAR/CD87). Mol. Cell. Biochem. In press.

131. Ploug M., Ronne E., BehrendtN., Jensen A.L., Blasi F., and Dano K. (1991) Cellular receptor for urokinase plasminogen activator. Carboxyl-terminal processing and membrane anchoring by glycosyl-phosphatidylinositol. J. Biol. Chem. 266:1926-1933.

132. Pruenster M., and Rot A. (2006) Throwing light on DARC. Biochem. Soc. Trans. 34:1005-1008.

133. Руке С., Eriksen J., Solberg H., Nielsen B.S., Kristensen P., Lund L.R., and Dane K. (1993) An alternatively spliced variant of mRNA for the human receptor for urokinase plasminogen activator. FEBS Lett. 326:69-74.

134. Quah B.J., and O'Neill H.C. (2005) Maturation of function in dendritic cells for tolerance and immunity. J. Cell. Mol. Med. 9:643-654.

135. Ragno P. (2006) The urokinase receptor: a ligand or a receptor? Story of a sociable molecule. Cell. Mol. Life Sci. 63:1028-1037.

136. Resnati M., Guttinger M., Valcamonica S., Sidenius N., Blasi F., and Fazioli F. (1996) Proteolytic cleavage of the urokinase receptor substitutes for the agonist-induced chemotactic effect. EMBO J. 15:1572-1582.

137. Resnati M., Pallavicini I., Wang J.M., Oppenheim J., Serhan C.N., Romano M., and Blasi F. (2002) The fibrinolytic receptor for urokinase activates the G protein-coupled chemotactic receptor FPRL1/LXA4R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99:1359-1364.

138. Riedel D.D., and Kaufmann S.H. (1997) Chemokine secretion by human polymorphonuclear granulocytes after stimulation with Mycobacterium tuberculosis and lipoarabinomannan. Infect. Immun. 65:4620-4623.

139. Rieu P., Porteu F., Bessou G., Lesavre P., and Halbwachs-Mecarelli L. (1992) Human neutrophils release their major membrane sialoprotein, leukosialin (CD43), during cell activation. Eur. J. Immunol. 22:3021-3026.

140. Ritonja A., Kopitar M., Jerala R., and Turk V. (1989) Primary structure of a new cysteine proteinase inhibitor from pig leucocytes. FEBS Lett. 255:211-214.

141. Roche J.K., Keepers T.R., Gross L.K., Seaner R.M., and Obrig T.G. (2007) CXCL1/KC and CXCL2/M1P-2 are critical effectors and potential targets for therapy of Escherichia coli 0157:H7-associated renal inflammation. Лот. J. Pathol. 170:526-537.

142. Ruan X., Chodosh J., Callegan M.C., Booth M.C., Lee T.D., Kumar P., Gilmore M.S., and Pereira H.A. (2002) Corneal expression of the inflammatory mediator CAP37. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43:1414-1421.

143. Sallusto F., and Lanzavecchia A. (1999) Mobilizing dendritic cells for tolerance, priming, and chronic inflammation. J. Exp. Med. 189:611-614.

144. Sallusto F., and Mackay C.R. (2004) Chemoattractants and their receptors in homeostasis and inflammation. Curr. Opin. Immunol. 16:724-731.

145. Scapini P., Lapinet-Vera J.A., Gasperini S., Calzetti F., Bazzoni F., and Cassatella M.A. (2000) The neutrophil as a cellular source of chemokines. Immunol. Rev. 177:195-203.

146. Schaefer R.M., Herfs N., Ormanns W., Horl W.H., and Heidland A. (1988) Change of elastase and cathepsin G content in polymorphonuclear leukocytes during hemodialysis. Clin. Nephrol. 29:307311.

147. Segal A.W. (2005) How neutrophils kill microbes. Annu. Rev. Immunol. 23:197-223.

148. Sengelov H., Kjeldsen L., and Borregaard N. (1993) Control of exocytosis in early neutrophil activation. J. Immunol. 150:1535-1543.118