Сегрегация хромосом и митохондрий во внутри- и межвидовых эмбриональных гибридных клетках мыши

Мензоров, Алексей Гавриилович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сегрегация хромосом и митохондрий во внутри- и межвидовых эмбриональных гибридных клетках мыши
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Сегрегация хромосом и митохондрий во внутри- и межвидовых эмбриональных гибридных клетках мыши"

На правах рукописи

МЕНЗОРОВ АЛЕКСЕЙ ГАВРИИЛОВИЧ

СЕГРЕГАЦИЯ ХРОМОСОМ И МИТОХОНДРИЙ ВО ВНУТРИ- И МЕЖВИДОВЫХ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ГИБРИДНЫХ КЛЕТКАХ МЫШИ

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2006

Работа выполнена в лаборатории генетики развития Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, Серов Олег Леонидович Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Графодатский Александр Сергеевич Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук, Гуляева Людмила Фёдоровна Институт молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение:

Институт биологии гена РАН, г. Москва

Зашита диссертации состоится 22 марта 2006 года на утреннем заседании диссертационного совета Д-003.011.01 в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адрес)': 630090, г. Новосибирск, проспект акад. Лаврентьева 10, тел/факс: (383)3331278, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан" " февраля 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

А.Д. Груздев

ХОР с А Z&3B

ВВЕДЕНИЕ

А1сгуальность. Эмбриональные стволовые (ЭС) клетки обладают плюрипотентными и даже тотипотентными свойствами, которые сохраняются при длительном культивировании in vitro (Hogan et al., 1994; Smith, 2001; Carpenter et al., 2003; Ginis et al., 2003; Hubner et al., 2003; Toyooka et al., 2003; Geijsen et al., 2004). При комбинировании ЭС клеток с эмбрионами ранних стадий развития, ЭС клетки способны участвовать в формировании химер, причем вклад ЭС клеток прослеживается во всех соматических тканях и в зародышевом пути (Robertson et al., 1986; Allan, 1987; Robertson, 1987; Joyner, 1993; Hogan et al., 1994).

В 1996 году впервые была предпринята попытка использовать ЭС клетки для репрограммирования генома дифференцированных клеток. С этой целью шпорипотентные ЭС клетки мыши были слиты со спленоцитами взрослого животного. Полученные в этом эксперименте клеточные гибриды обладали плюрипотентными свойствами, сопоставимыми с ЭС клетками (Матвеева и др., 1996; Matveeva et al., 1998). Эти данные получили подтверждение при анализе гибридов, полученных от слияния ЭС клеток с тимоцитами (Tada et al., 2001; 2003) или незрелыми клетками-предшественниками гемопоэза или нейрогенеза (Terada et al., 2002; Ying et al., 2002). В недавно опубликованных данных по анализу гибридных клеток, полученных слиянием ЭС клеток человека с человеческими фибробластами, также отмечается высокий уровень плюрипотентности, сходный с ЭС клетками (Cowan et al., 2005). Сопоставление процессов репрограммирования в ядрах дифференцированных клеток после их переноса в энуклеированный ооцит или яйцо с таковыми в гибридных клетках типа ЭС-соматическая клетка показывает их значительное сходство и, следовательно, гибридные клетки являются новым перспективным инструментом изучения фундаментальных проблем репрограммирования и восстановления проспективных потенций генома дифференцированных клеток.

Однако, прежде чем изучать молекулярные механизмы поддержания плюрипотентности и репрограммирование генома соматического партнера, необходимо знать хромосомный состав гибридных клеток. До недавнего времени исследованиям этой важной характеристики гибридных клеток типа ЭС-дифференцированная клетка не уделялось должного внимания. В ряде работ по слиянию ЭС и дифференцированных клеток авторы не исследовали кариотип гибридных клеток на том основании, что клетки имели тетраплоидный набор хромосом (Tada et al., 2001; Terada et al., 2002; Ying et al., 2002). Однако, по данным других исследователей, в гибридных клетках, полученных слиянием ЭС клеток мыши с тимоцитами и спленоцитами, наблюдается сегрегация хромосом (Matveeva et al., 1998; Матвеева и др., 2001; Tada et al., 2003). Сходные данные были получены при исследовании гибридных клеток, образовавшихся от спонтанного слияния in vivo незрелых клеток-предшественников гемопоэза с клетками печени (Wang et al., 2003).

Следует заметить, что применение цитогенетических методов для идентификации родительских хромосом внутривидовых и межвидовых гибридных

клеток (полученных слиянием клеток от близких видов) затруднено или невозможно из-за морфологического сходства гомологичных хромосом. Между тем, дискриминация родительских хромосом возможна с использованием альтернативных методов, например, с помощью микросателлитов в качестве маркеров хромосом. Микросателлиты высокополиморфны у лабораторных линий мышей и равномерно распределены в геноме мыши (Dietrich etal., 1992; 1996). В 1998 году появилась одна из первых работ, в которой микросателлиты использовали для маркирования родительских хромосом у гетероплоидных внутривидовых гибридных клеток (Hiñes et al., 1998).

При образовании гибридных клеток происходит объединение не только ядерных геномов, но и цитоплазмы родительских клеток. Как отмечалось выше, имеются противоречивые и неполные данные о судьбе родительских хромосом в геноме гибридной клетки типа ЭС-соматическая клетка, а информация об организации гибридной цитоплазмы практически полностью отсутствуют. Учитывая способность митохондриальной ДНК (мтДНК) к репликации, представляется актуальным изучение взаимоотношений родительских митохондриальных геномов в гибридной цитоплазме, что может пролить свет на ее организацию. Следует также отметить, что, согласно некоторым данным, существует взаимосвязь между сегрегацией хромосом и митохондрий Так. в гибридных клетках от слияния между клетками человека и мыши происходит сегрегация митохондрий того партнера, чьи хромосомы теряются (Francesco et al., 1980). Гибридные клетки от слияния клеток мыши и китайского хомячка, а также мыши и крысы, сохраняли как хромосомы, так и митохондрии обоих партнеров (Hayashi et al., 1982; Zuckerraan et al., 1984).

Таким образом, не вызывает сомнений актуальность изучения судьбы родительских хромосом в геноме гибридных клеток типа ЭС-дифференцированная клетка, полученных от слияния диплоидных клеток разных линий мышей или близких видов, ' с использованием микросателлитов. позволяющих дискриминировать родительские гомологи. Представляется не менее актуальным изучение поведения родительских митохондрий в цитоплазме гибридных клеток для выявления связи между формированием генома гибридной клетки и ее цитоплазмы.

Цели и задачи исследования

При выполнении работы преследовали две цели: 1) описать с помощью микросателлитов поведение родительских хромосом в гибридных клетках, полученных слиянием ЭС клеток М musculus линии 129/01а со спленоцитами или эмбриональными фибробластами мышей линии DD/c, и в наборе клонов межвидовых гибридных клеток, полученных слиянием ЭС клеток М musculus со спленоцитами М caroli; 2) исследовать судьбу родительских митохондрий в цитоплазме внутри- и межвидовых гибридных клеток, используя полиморфизм родительских мтДНК.

Для достижения этих целей были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Провести поиск полиморфных микросателлитов, способных дискриминировать каждую пару родительских хромосом у линий мышей 129/Ola и DD/c и у линии мышей 129/Ola М. musculus и азиатской мыши М. caroli. Оптимизировать условия полимеразной цепной реакции (ГПДР) для анализа аллельных вариантов микросателлитов и оценить чувствительность метода путем анализа искусственной смеси геномной ДНК мышей М musculus линии 129/Ola и М caroli.

2. Провести анализ микросателлитов, маркирующих каждую пару родительских хромосом, в 3-х клонах серии HESS, полученных от слияния ЭС клеток мышей 129/01а и спленоцитов взрослой мыши DD/c, и в 5-ти клонах серии HESF, полученных от слияния ЭС клеток и эмбриональных фибробластов мышей DD/c, с целью описания их хромосомного состава.

3. Провести анализ микросателлитов, маркирующих каждую пару родительских хромосом, в 20-ти клонах серии НМС, полученных от слияния ЭС клеток М musculus и спленоцитов азиатской мыши М caroli, с целью описания их хромосомного состава.

4. Провести секвенирование D-петли, генов третьей субъединицы цитохромоксидазы, третьей и шестой субъединиц НАД-Н дегидрогеназы мтДНК у мышей линий 129/Ola и DD/c с целью выявления нуклеотидных замещений, позволяющих дискриминировать их мтДНК.

5. Исследовать родительское происхождение мтДНК в 3-х клонах серии HESS, 5-ти клонах серии HESF и в 20-ти клонах серии НМС. Провести анализ мтДНК индивидуальных клеток в некоторых гибридных клонах для оценки межклональной вариабельности.

Научная новизна и практическая значимость

1. В работе впервые подробно детализированы условия применения полиморфных микросателлитов в качестве маркеров родительских хромосом в межи внутривидовых гибридных клетках, полученных слиянием диплоидных ЭС клеток со спленоцитами и эмбриональными фибробластами Предлагаемый подход имеет хорошую воспроизводимость, менее трудоемок, чем цитогенетический анализ, и позволяет провести быструю оценку хромосомного состава гибридных клеток.

2. С помощью анализа микросателлитов впервые выявлено сохранение всех хромосом плюрипотентного и практически всех соматического партнера, за исключением хромосомы 14, во внутривидовых гибридных клетках, полученных слиянием ЭС клеток с фибробластами, в противоположность выраженной потере соматических хромосом в гибридных клетках типа ЭС-спленоцит. Важно подчеркнуть, что выявление такой сегрегации хромосом у внутривидовых гибридных клеток с помощью традиционных цитогенетических методов возможно лишь для единичных хромосом.

3. С помощью анализа мтДНК впервые показана предпочтительная сегрегация митохондрий соматического партнера в гибридных клетках, полученных слиянием ЭС клеток со спленоцитами другой линии мышей и спленоцитами близкого вида, М caroli.

Описанную сегрегацию родительских хромосом и митохондрий соматического партнера следует учитывать при оценке плюрипотентности гибридных клеток и в экспериментах, связанных с изучением механизмов репрограммирования.

Полученные в ходе данной работы результаты используются при чтении лекций спецкурса «Генетика развития» в Новосибирском государственном университете (НГУ).

Апробация работы и публикации.

Результаты работы были представлены на международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2002), на интеграционной междисциплинарной конференции молодых ученых СО РАН и высшей школы (Иркутск. 2003). на международной научной конференции молодых ученых и студентов (Алматы, 2003). на 1-м съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003), на международном симпозиуме «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия» (Санкт-Петербург, 2004), на 3-ем съезде ВОГиС (Москва, 2004). на школе-конференции «Актуальные проблемы биологии развития и биотехнологии» (Москва, 2005), на VI международной конференции по молекулярной генетике соматических клеток (Москва, 2005).

Материалы диссертации изложены в 2-х статьях, опубликованных в отечественном и международном журналах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 103-х страницах, иллюстрирована 11-ю рисунками и содержит 13 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы культуры клеток: ЭС клетки, линия НМ-1 (ГФРТ); 20 первичных ГАТ-резистентных гибридных клонов, полученных от слияния ЭС клеток линии НМ-1 М musculus и спленоцитов самки азиатской мыши М caroli (ГФРТ1') (серия НМС); 8 внутривидовых гибридных клонов, полученных от слияния ЭС клеток линии НМ-1 М musculus со спленоцитами (3 клона, серия HESS) и эмбриональными фибробластами (5 клонов, серия HESF) мыши линии DD/c (ГФРТ+). Кроме того, в работе использовали 3 субклона внутривидовых гибридных клонов и 7 субклонов межвидовых гибридных клонов.

Культивирование клеток проводили по методу, описанному Матвеевой с соавторами (Matveeva et. al., 1998).

Выделение ДНК проводили с помощью DNAzol согласно рекомендациям производителя (Life Technology, США), и фенольно-хлороформным методом по Маниатису с соавторами (Маниатис и др., 1984).

Для дискриминации хромосом М. musculus 120/01а, М. musculus DD/c и М. caroli в гибридных клетках использовали метод ПЦР-анализа аллельных вариантов микросателлитов (Dietrich etal., 1992) с описанными в этой работе модификациями.

Для дискриминации родительских мтДНК использовали аллель-специфичный полиморфизм мтДНК. Выделение мтДНК из единичных клеток проводили согласно методу, описанному в работе Зукотти и Монка (Zuccotti, Monk, 1995) с описанными в этой работе модификациями.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Оптимизация условий ПЦР для алельных вариантов микросателлитов

Праймеры для микросателлитов, опубликованные в базе данных Джексоновской лаборатории (Jackson Laboratory, http://www.informatics.jax.org), были разработаны для проведения ПЦР при «стандартных» для большинства маркеров условиях. Однако последовательности ДНК, гомологичные праймерам, могут различаться у разных линий и, тем более, видов мышей, что может бьггь причиной отсутствия продукта ПЦР в «стандартных» условиях (Dietrich etal, 1992). В базе данных отсутствовала информация о полиморфизме микросателлитов у мышей линии DD/c и мышей М. caroli. Мы провели поиск полиморфных маркеров и из 86-ти микросателлитов выбрали маркеры, позволяющие дискриминировать родительские хромосомы во внутри- и межвидовых гибридных клетках. При анализе клеточных гибридов с помощью молекулярных маркеров следует учитывать возможность сегрегации хромосом одного из партнеров по слиянию и внутриклональную вариабельность хромосомного состава. В таком случае, микросателлиты, маркирующие родительские хромосомы, могут быть представлены в различном количественном соотношении в разных клонах. В связи с этим возникла необходимость в адаптации метода ПЦР микросателлитов для их использования в качестве маркеров родительских хромосом в геноме гибридных клеток. Для каждого маркера были индивидуально подобраны условия ПЦР -температура отжига праймеров и концентрация MgCI2. Целью оптимизации было нахождение таких условий ПЦР, при которых амплификация обоих аллельных вариантов микросателлитов осуществлялась бы с равной или близкой к этому эффективностью. Нами был определен порог выявления микросателлитов в смеси «родительских» ДНК, который варьирует от 5 до 10%. Достигнутая чувствительность метода для большинства маркеров близка к разрешающей способности цитогенетического метода. При рутинном анализе 20-25 метафазных пластинок чувствительность цитогенетического метода принято оценивать в 4-5%.

На рисунке 1 представлен пример ПЦР-анализа присутствия микросателлитов в гибридных клонах серии НМС.

Рис. 1. Электрофоретический анализ продуктов ПЦР микросателлитов в межвидовых гибридных клонах серии НМС, на примере маркера хромосомы 13

D13MU57

К НМ-1 саг 50 44 54 47 48 56

НМ-1 - присутствие продукта ПЦР хромосомо-специфичного микросателлита М musculus, саг - присутствие продукта ПЦР хромосомо-специфичного микросателлита М caroh, К - отрицательный контроль (без добавления ДНК). Номерами обозначены клоны серии НМС.

Сегрегация хромосом во внутривидовых гибридных клонах

Как уже упоминалось, в гибридных клетках нередко наблюдается сегрегация (потеря) хромосом одного из партнеров по слиянию (Рингерц. Сэвидж, 1979). Подсчет числа хромосом в трех клонах HESS2, HESS3 и HESS4 показал, что их кариотипы содержат от 41 до 43 хромосом вместо ожидаемых 80-ти, что свидетельствует о сегрегации хромосом (Matveeva et al., 1998: Матвеева и др.. 2001). В противоположность этим данным, проведенный подсчет хромосом в клонах серии HESF показал присутствие в их кариотипах от 70-ти до 80-ти хромосом, что указывает на умеренную сегрегацию хромосом.

Возникает вопрос, сегрегация хромосом какого родителя происходит в клонах серии HESS и HESF? Хромосомный состав гибридных клонов HESS был проанализирован ранее (Матвеева и др., 2001), однако, после оптимизации метода и добавления новых маркеров, анализ этих клонов был проведен нами повторно. Всего было исследовано 3 первичных клона серии HESS. 5 первичных клонов серии HESF и субклоны HESF1-1, HESF3-1, HESF5-2, полученные из индивидуальных клеток соответствующих первичных клонов. В таблице 1 представлены суммарные результаты анализа микросателлитов, маркирующих родительские хромосомы в гибридных клетках серий HESS и HESF.

Следует отметить сохранение маркеров всех хромосом плюрипотентного партнера в клонах внутривидовых гибридных клеток. В то же время мы наблюдали интенсивную потерю маркеров хромосом соматического партнера в клонах серии HESS и сохранение всех, или практически всех маркеров хромосом соматического партнера в клонах серии HESF. В гибридных клонах серии HESF отмечено только отсутствие аллельного варианта микросателлита D14Mit38, маркирующего хромосому 14 мышей линии DD/c, в клонах HESF1, HESF3 и трех субклонах Таким образом, данные о присутствии хромосомо-специфичных микросателлитов и результаты подсчета хромосом в клонах серии HESF свидетельствуют об умеренной сегрегации родительских хромосом, в отличие от клонов серии HESS, где наблюдается потеря большинства хромосом соматического партнера Различия в сегрегации хромосом в клонах HESS и HESF, вероятно, связаны с типом клеток соматического партнера, участвовавших в гибридизации.

Таблица 1. Распределение хромосомо-специфичных микросателлитов линии мышей ОБ/с во внутривидовых гибридных клонах

N Маркер Клоны серии HESS Клоны серии Ш&Р Субклоны HESF

2 3 4 1 2 3 4 5 1-1 3-1 5-2

1 DlMit200 + + + + + + + + + + +

2 D2Mit9 - - - + + + + + + + +

3 D3Mi218 - - - + + + + + + + 4-

4 D4Mitl 1 - - - + + + + + + + 1-

5 D5Mit346 - - - + + + + + + + +

6 D6Mit201 - - - + + + + + + + +

7 D7Mit309 - - - + + + + + + + +

8 D8Mit248 - - - + + + + + + + +

9 D9Mitl81 - - - + + + + + + + +

10 D10Mitl09 - - - + + + + + + + +

11 Dl lMit2 + + + + + + + + + + -t-

12 D12Mit270 - - - + + + + + + + +

13 D13MitlO - - - + + + + + + +

14 D14Mit38 - - - - + - + + - - -

15 D15Mitl4 - - - + + + + + + + -Г

16 D16Mit4 - - - + + + + + + + -

17 D17Mit66 - - - + + + + + + + -

18 D18Mit36 - - - + + + + + + + -г

19 D19Mitl0 + + + + + + + + + + +

X DXMitl59 + + + + + + + + Т + +

N - хромосомная локализация мнкросателлита,

(+) - присутствие хромосомо-специфичного микросателлита ЭО/с,

(-) - отсутствие хромосомо-специфичного микросателлита БО/с.

Все хромосомо-специфичные микросателлиты ЭС клеток НМ-1 выявляются во всех гибридных клонах и субклонах, в таблице они не показаны

Сегрегация хромосом в межвидовых гибридных клонах

С помощью анализа микросателлитов в 20-ти клонах серии НМС было проведено первое описание поведения родительских гомеологов 17-ти аутосом в клонах межвидовых гибридных клеток типа ЭС-соматическая клетка.

Из данных таблицы 2 следует, что из 20-ти исследованных клонов в 13-ти отмечена потеря микросателлитов, маркирующих хромосомы исключительно М сагок, при сохранении всех маркеров М. тщси!ш. Наиболее значительная потеря маркеров хромосом М. сагоП была отмечена в 5-ти клонах: НМС 15, НМС47. НМС48, НМС54 и НМС58, в которых выявлено от 3-х до 8-ми маркеров хромосом соматического партнера. В 8-ми клонах наблюдалась умеренная потеря

микросателлитов M caroli, например, в клонах НМС29, НМСЗО и НМС56. Семь клонов сохраняли все маркеры хромосом M. caroli.

В целом, проведенный анализ микросателлитов в гибридных клонах серии НМС выявил выраженную межклональную вариабельность как по количеству хромосом соматического партнера, так и по содержанию индивидуальных хромосом. Условно можно выделить три типа клонов: сохраняющие все маркеры хромосом соматического партнера, с умеренной потерей маркеров хромосом соматического партнера (менее 10-ти) и с отсутствием большинства маркеров соматического партнера.

Как упоминалось выше, в ряде исследований показано, что гибридные клетки мыши типа ЭС-дифференцированная клетка сохраняют тетраплоидный набор хромосом, появившийся в результате слияния двух диплоидных клеток (Tada et al., 2001; Terada et al., 2002; Ying et al., 2002). При сопоставлении наших данных с результатами этих исследователей необходимо отметить несколько существенных отличий в способах получения гибридных клеток типа ЭС-соматическая клетка. Во-первых, для получения гибридных клеток использовался полиэтиленгликоль, индуцирующий слияние любых типов клеток (Рингерц, Сэвидж, 1979), тогда как Тада с соавторами (Tada et al., 2001; 2003) получали гибриды типа ЭС-тимоцит посредством электрослияния. Образование гибридных клеток в экспериментах других исследователей (Terada et al., 2002; Ying et al., 2002; Wang et al., 2002) происходило путем спонтанного слияния родительских клеток либо ш vitro, либо m vivo. Известно, что разные типы клеток различаются по склонности к спонтанному слиянию, наиболее присущему макрофагам (Wang et al., 2002). К этому следует добавить, что анализ микросателлитов, позволяющий идентифицировать родительские хромосомы в гибридных клетках, проводился нами для большинства клонов гибридных клеток на 14-30 пассажах, тогда как для описанных гибридных клеток подсчет хромосом и ограниченный цитогенетический анализ осуществлялся на более ранних пассажах (не позднее 10-го), кроме того, в цитируемых работах дискриминация родительских аутосом не проводилась (Tada et al., 2001: 2003; Terada et al., 2002; Ying et al., 2002). Возможно, выбор шпорипотентного партнера также оказывает влияние на сегрегацию хромосом в гибридных клетках. Так, по данным Тада (Tada et al., 2003) 62% гибридных клеток, полученных слиянием ЭС клеток линии НМ-1 с тимоцитами, сохраняли тетраплоидный набор хромосом, тогда как гибридные клетки, полученные от слияния ЭС-клеток линии МР4 M musculus molossinus с тимоцитами, все были тетраплоидными.

Таблица 2 Распределение хромосомо-специфичных микросателлитов М сагоИ в клонах гибридных клеток серии НМС

N Маркер Гибридные клоны серии НМС

1 2 4 6 15 Я 23 27 28 29 30 41 42 44 47 48 50 54 56 5«

1 01М11200 + + + + - + + + + + + + + + - - + + + -

2 гам.!« + + + + - + + + + + - + + + - - + - + -

3 ОЗМШОЗ + + + + - + + + + + + + + + - - + - + -

4 D4M.ll 1 + + + + - + + + + - - + + + - - + - + -

5 05М1046 + + + + - + + - + + + + + + + + + + + -

6 D6M.ii о: + + + + - + + + + - - + + + + - + - - -

7 07Мк|7 + + + + - + + + + - ± + + + - - + - + -

8 08М.[248 + + + + + + + - + - - + + + - - - - + +

9 D9M.II 81 + + + + - + + + + - + + + + + ± + - + ±

10 ЭЮМШОЧ + + + + - + + + + + + + + + - + + - - -

11 Р11МП67 + + + + ± + + + + + - + + + - - + - - +

12 Ш2М1С70 + + + + - + + + + + + + + + + - + + + ±

13 01ЭМ.157 + + + + - + + + + + + + + + ± + + + + -

14 014МПП + + + + - + + + + - + + - + - - + + - -

15 015МШ4 + 4- + + + + + + + - + + + + - ± + + + +

16 016МК4 + + + + - + + + + + + + + + - - + + + -

И 017МК66 + + + + - + - - + + + + + + - - + - + -

18 ОКМШЗЗ + + + + + + + + + + + + + + - - + + + -

19 Э19М Н78 + + + + - + + + + + + + + + + + + - + -

X РХМИЗ! + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

N - хромосомная локализация микросателлита,

(+) - присутствие продукта ПЦР хромосомо-специфичного микросателлита М сагоИ, (-) - отсутствие продукта ПЦР хромосомо-специфичного микросателлита М сагоИ, (±) - нестабильность выявления маркера при анализе клонов на разных пассажах культивирования.

Во всех гибридных клонах серии НМС были выявлены микросателлиты, маркирующие все хромосомы плюрипотентного партнера, в таблице они не представлены.

Межклональная вариабельность межвидовых гибридных клонов по содержанию хромосом соматического партнера может быть связана с гетерогенностью популяции спленоцитов. В селезенке встречаются как зрелые неделяшиеся лимфоциты, так и активно делящиеся клетки, в том числе гемопоэтические клетки, близкие по свойствам к стволовым клеткам. Известно, что при несовпадении клеточных циклов в первые моменты после слияния может наблюдаться интенсивная сегрегация хромосом (Рингерц. Сэвидж, 1979). Можно предположить, при слиянии ЭС клеток с неделящимися клетками, такими как зрелые В-лимфоциты, происходит интенсивная сегрегация хромосом соматического партнера, а при слиянии с активно делящимися клетками хромосомы соматического партнера сохраняются с большей вероятностью.

Сегрегация митохондрий во внутривидовых гибридных клонах

Для дискриминации митохондрий во внутривидовых гибридных клонах мы использовали полиморфизм мтДНК. Нами были секвенированы несколько последовательностей мтДНК мышей линий 129/01а и DD/c и в гене третьей субъединицы цитохромоксидазы была найдена нуклеотидная замена A-G в положении 9348 между мышами линий 129/Ola (GenBank Ас. No. AY836751) и DD/c (GenBank Ас. No. AY836752). В последовательности мтДНК мышей линии 129/01а был идентифицирован сайт для рестриктазы TthlIII. который отсутствует у DD/c. Порог выявления мтДНК DD/c в смеси продуктов ПЦР мтДНК двух родительских линий мышей составляет 2%.

Анализ мтДНК во внутривидовых гибридных клонах показал, что все клоны от слияния ЭС клеток со спленоцитами не содержат мтДНК соматического происхождения при пороге выявления мтДНК DD/c 2%. В то же время, все пять клонов от слияния ЭС клеток с эмбриональными фибробластами содержали мтДНК как плюрипотентного, так и соматического партнера (Рис. 1). Сохранение родительских мтДНК обоих типов свидетельствует об отсутствии заметной сегрегации родительских митохондрий в гибридных клетках такого типа.

Суммируя данные анализа родительских мтДНК в клонах внутривидовых гибридных клеток, можно отметить зависимость сегрегации митохондрий от типа соматического партнера. Мы наблюдали потерю мтДНК в гибридных клонах типа ЭС-спленоцит и сохранение обоих родительских типов мтДНК в гибридных клонах типа ЭС-эмбриональный фибробласт. Возможно, различия в сегрегации мтДНК в этих типах гибридных клеток объясняются разным числом митохондрий в родительских клетках. Например, можно предположить, что количество митохондрий, вносимых в гибридную клетку спленоцитом, существенно меньше, чем количество митохондрий в ЭС клетках. В этом случае сегрегация митохондрий спленоцитов будет происходить с большей вероятностью из-за случайных процессов. Известно, что фибробласты человека содержат 1600-2000 молекул мтДНК (Legros et al., 2004), в то время как лимфоциты содержат 240-420 молекул мтДНК (Szuhai et al., 2001), а моноциты периферической крови около 400 (Gahan etal., 2001). Кроме того, митохондрии могут содержать более одной молекулы мтДНК в зависимости от клеточного типа. Однако сложно корректно оценить роль

этих факторов, так как отсутствуют данные о количестве митохондрий в ЭС клетках.

Рис. 1. Идентификация родительских мтДНК в клонах серий HESS и HESF

М - маркер с шагом 100 п н (Ladder 100 bp, Medigen).

НМ-1 - продукты обработки фрагмента мтДНК клеток НМ-1 рестриктазой Tthl 11\\

DD/c - фрагмент мтДНК мышей линии DD/c.

Другое объяснение различий в сегрегации митохондрий между гибридами типа ЭС-спленоцит и ЭС-эмбриональный фибробласт - возможная различная организация митохондрий в спленоцитах и эмбриональных фибробластах. Так, для фибробластов человека в культуре показано, что мтДНК организована в нуклеоиды (нуклеопротеиновые комплексы), обогащенные mtTFA (митохондриальный транскрипционный фактор А). Каждый нуклеоид содержит от 2-х до 8-ми молекул мтДНК. в среднем 2.3 молекулы. Более того, показан обмен молекулами мтДНК межд. отдельными митохондриями (Legros et al., 2004). Показано также, что \ млекопитающих может происходить слияние митохондрий (Ishihara et al., 2003: Mattenberger et al.. 2003). To есть, при образовании гибридных клеток, родительские митохондрии, возможно, могут сливаться или обмениваться молекулами мтДНК. Для объяснения случаи стабильного сохранения гетероплазмии по мтДНК была предложена гипотеза митохондриального нуклеоида (Jacobs et al., 2000). По этой гипотезе, группа молекул мтДНК объединена в нуклеоид и при репликации образуются дочерние нуклеоиды. генетически идентичные. При этом нуклеоид может содержать генетически различающиеся копии молекул мтДНК. То есть, возможно, присутствие мтДНК обоих родительских типов в гибридных клетках типа ЭС-фибробласт можно объяснить такого рода гетероплазмией.

Сегрегация митохондрий в межвидовых гибридных клонах

При анализе родительских мтДНК в клонах межвидовых гибридных клеток серии НМС мы использовали подход, аналогичный изложенному выше. Район D-петли мтДНК М caroh был секвенирован сотрудником лаборатории Д.М. Ларкиным и в последовательности М caroli был идентифицирован сайт для рестриктазы Dra\. который отсутствует у М muscvlus Порог выявления мтДНК М caroli в смеси продуктов ГТЦР мтДНК двух родительских видов составляет 0,2%.

Анализ мтДНК в клонах серии НМС показал, что из 20-ти исследованных клонов в 17-ти присутствует мтДНК только плюрипотентного партнера, тогда как в

3-х клонах - НМС4, НМС27 и НМС44, присутствует мтДНК обоих родительских видов. В качестве примера, на рис. 2 приведены результаты анализа родительских мтДНК в клонах НМС4, НМС27, НМС44, НМС21, НМСЗО и НМС48.

Рис. 2. Идентификация родительских мтДНК в клонах серии НМС

М - маркер с шагом 100 п.н. (Ladder 100 bp, Medigen), фрагмент 100 п н. подписан на рисунке; НМ-1 - фрагмент мтДНК мышей М musculus\

caroli - продукты обработки фрагмента мтДНК М caroli рестриктазой Oral

Для оценки внутриклональной вариабельности мы провели анализ мтДНК в индивидуальных клетках в клонах НМС4 и НМС27. На рис. 3 представлены результаты этого анализа.

Рис. 3. Идентификация родительских мтДНК в индивидуальных клетках клонов

НМС4 и НМС27

мтДНК единичных клеток клона НМС4

шшщтшт «м jggaa»

мтДНК единичных клеток клона НМС27

car М

501 ян 2В9пи 212 пл

100 пм

саг - продукты обработки фрагмента мтДНК М caroli рестриктазой Dral, М - маркер с шагом 100 п.н. (Ladder 100 bp, Medigen), фрагмент 100 п.н. подписан на рисунке

Анализ мтДНК 31-й клетки клона НМС4 показал, что единичные клетки могут содержать мтДНК как исключительно соматического партнера, так и плюрипотентного. В то же время, есть и промежуточные варианты. Такое распределение генотипов свидетельствует о том, что в клоне НМС4 происходит случайная двусторонняя сегрегация родительских митохондрий. В клоне НМС27 при анализе суммарной ДНК наблюдается преобладание мтДНК плюрипотентного партнера. В то же время, анализ единичных клеток показал, что часть клеток НМС27 содержит мтДНК только плюрипотентного партнера, в то время как

остальные клетки содержат мтДНК обоих родительских типов. Наличие клеток с приблизительно равным соотношением родительских мтДНК, то есть с существенно большей долей мтДНК М. caroli, чем в среднем в популяции, свидетельствует в пользу предположения о случайной сегрегации родительских митохондрий и в клоне НМС27.

Можно предположить несколько причин, объясняющих предпочтительную сегрегацию мтДНК соматического партнера в большинстве межвидовых гибридных клонов. Во-первых, может существенно различаться количество митохондрий в родительских клетках. В этом случае, вследствие случайных процессов, в гибридной клетке с большей вероятностью останутся митохондрии партнера, имеющего большее число митохондрий. Во-вторых, последовательности мтДНК D-петли М. caroli и М musculus существенно отличаются (около 20% различий), что может сказываться на скорости репликации мтДНК различного родительского происхождения. Однако анализ мтДНК единичных клеток клона НМС4 показывает, что отличия в последовательности D-петли не приводят к преимущественной сегрегации митохондрий одного из партнеров.

Подводя итоги изучения родительских мтДНК в клонах гибридных клеток серии НМС. можно сделать вывод, что, как и в случае внутривидовых гибридных клеток, имеет место предпочтительная потеря митохондрий соматического партнера в большинстве клонов серии НМС. В то же время, в одном из клонов этой серии, НМС4, не выявлено признаков предпочтительной утраты митохондрий соматического партнера. Более того, анализ индивидуальных клеток этого клона свидетельствует о двусторонней сегрегации митохондрий, по-видимому, равновероятной.

Возможно различие в сегрегации митохондрий в гибридных клетках серий HESS, HESF и НМС, объясняется различиями в скорости репликации мтДНК в родительских типах клеток. Известно, что скорость репликации митохондрий различна для разных типов клеток. Логично предположить, что в быстро делящихся ЭС клетках репликация митохондрий происходит быстро, так как ЭС клетки имеют короткий клеточный цикл. После объединения родительских цитоплазм в гибридной клетке, митохондрии спленоцитов М. caroli могут какое-то время сохранять низкую скорость репликации и, соответственно, их доля в геноме гибридных клеток будет уменьшаться. Различия в скорости деления митохондрий, возможно, объясняют сегрегацию митохондрий во внутривидовых клонах от слияния со спленоцитами и сохранение обоих типов мтДНК в гибридах от слияния с эмбриональными фибробластами. Время удвоения ЭС клеток составляет 10-12 часов, фибробластов - 22-24 часа. Соответственно, митохондрии ЭС клеток и фибробластов могут обладать сходной скоростью репликации, в отличие от митохондрий спленоцитов, которые активно не делятся.

Возникает вопрос о связи между сегрегацией родительских хромосом и митохондрий. Сравнение гибридных клонов серий HESS и HESF показывает, что в клонах серии HESS наблюдается предпочтительная сегрегация хромосом соматического происхождения и мтДНК соматического партнера, а в клонах серии

НЕвР - сохранение как хромосом, так и мтДНК обоих партнеров. То есть, наблюдается тенденция к совместной потере или, наоборот, присутствию хромосом и мтДНК соматического партнера. Однако анализ гибридных клонов серии НМС показывает, что, несмотря тенденцию к сохранению всех маркеров хромосом и мтДНК соматического партнера в клонах НМС4 и НМС44, в ряде клонов, в которых отсутствуют признаки сегрегации хромосом, отсутствует мтДНК спленоцитов, например, в клоне НМС41. В то же время, в клоне НМС27 выявлена умеренная потеря хромосом соматического партнера, но присутствуют оба типа мтДНК. Таким образом, направление сегрегации сходно как в ядерных, так и в митохондриальных геномах, но однозначной связи между этими процессами не выявляется.

Проведенный анализ хромосомного состава позволит в дальнейшем проводить исследование плюрипотентности полученных клонов Следует подчеркнуть, что незнание реального соотношения хромосом родительских геномов исследователями, изучающими репрограммирование соматического генома на уровне отдельных генов и, особенно, на геномном уровне, например, с применением микрочиповой технологии, потенциально может привести к получению некорректных результатов. Полученные данные показывают, что микросателлитный анализ, позволяющий дискриминировать родительские хромосомы, является адекватным способом описания хромосомного состава гибридных клеток.

ВЫВОДЫ

1. Впервые из 86-ти тестированных микросателлитов проведен подбор полиморфных маркеров, которые позволяют дискриминировать гомеологи всех хромосом М тиБсикк и азиатской мыши М сагоН. Выявлено 10 новых микросателлитов, способных надежно дискриминировать гомологи 10-ти хромосом мышей линий 129/01а и ОБ/с. Отобранные микросателлиты позволили идентифицировать родительские хромосомы в меж- и внутривидовых гибридных клетках типа ЭС-спленоцит и ЭС-фибробласт.

2. Установлено, что в 5-ти клонах гибридных клеток типа ЭС-фибробласт присутствуют практически все маркеры хромосом соматического партнера, за исключением маркера хромосомы 14 в 2-х клонах, а также все маркеры хромосом плюрипотентного партнера. Умеренная потеря хромосом соматического партнера контрастирует с выраженной потерей этих хромосом в гибридных клетках типа ЭС-спленоцит.

3. Анализ микросателлитов в 20-ти клонах межвидовых гибридных клеток, полученных слиянием ЭС клеток М тизсии спленоцитов М сагоН, показал сохранение всех маркеров хромосом плюрипотентного партнера, тогда как присутствие маркеров хромосом соматического партнера значительно варьировало в разных клонах. По этому критерию клоны делятся на три группы: с присутствием всех маркеров хромосом соматического партнера, с умеренной потерей маркеров

хромосом соматического партнера и с отсутствием большинства маркеров соматического партнера. Впервые показана предпочтительная сегрегация 17-ти индивидуальных хромосом соматического партнера.

4. Впервые показано, что во внутривидовых гибридных клонах, полученных от слияния ЭС клеток со спленоцитами, происходит полная потеря мтДНК соматического партнера при сохранении мтДНК ЭС клеток, в то же время в гибридных клетках типа ЭС-фибробласт наблюдается сохранение мтДНК как плюрипотентного, так и соматического партнеров, то есть отсутствуют признаки сегрегации родительских митохондрий.

5. Показано, что в 17-ти исследованных межвидовых гибридных клонах присутствует мтДНК только плюрипотентного партнера, тогда как в 3-х клонах (НМС4, НМС27 и НМС44), присутствует мтДНК обоих родительских видов. Таким образом, впервые установлена предпочтительная сегрегация митохондрий соматического партнера в большинстве клонов гибридных клеток типа ЭС-спленоцит.

6. С помощью анализа индивидуальных клеток гибридных клонов, в которых присутствует мтДНК обоих родительских видов, установлено, что сегрегация родительских митохондрий в этих клонах носит случайный двусторонний характер.

7. Сопоставление сегрегации маркеров родительских хромосом и мтДНК показывает предпочтительную сегрегацию как хромосом, так и митохондрий соматического партнера в гибридных клетках, полученных от слияния ЭС и соматических клеток, хотя прямой связи между этими процессами не выявлено.

Список публикаций по теме диссертации:

1. Пристяжнюк И.Е., Темирова С.А., Мензоров А.Г., Круглова A.A., Матвеева Н.М., Серов O.JI. Видимая и «скрытая» сегрегация родительских хромосом в эмбриональных стволовых гибридных клетках // Онтогенез. 2005. Т. 36, № 2. С. 151-158.

2 Matveeva N.M., Pristyazhnyuk I.E., Temirova S.A., Menzorov A.G., Vasilkova A.A., Shilov A.G., Smith A., Serov O.L. Unequal segregation of parental chromosomes in embryonic stem cell hybrids // Mol. Reprod. Dev. 2005. V. 71. P. 305-314.

3. Матвеева H.M., Пристяжнюк И.Е., Пузаков M.B., Мензоров А.Г., Василькова A.A., Голубица А.Н., Железова А.И., Темирова С.А., Серов О.Л. Эмбриональные стволовые гибридные клетки - модель для изучения контроля плюрипотентности в условиях in vitro II Цитология. Санкт-Петербург. 2004 Т. 46, № 10. С. 927-928.

4. Мензоров А.Г. Сегрегация хромосом во внутривидовых клеточных гибридах, полученных от слияния эмбриональных стволовых и соматических клеток мыши // Актуальные вопросы современной биологии и биотехнологии (23-25 апреля 2003 г., г. Алматы): Тезисы III международной научной конференции молодых ученых и студентов, посвященной 70-летию Казахского

национального университета имени аль-Фараби. Казахский национальный университет имени аль-Фараби. Алматы. 2003. С. 114.

5. Мензоров А.Г., Круглова A.A., Матвеева Н.М., Серов O.JI. Сегрегация хромосом и митохондрий в межвидовых эмбриональных гибридных клетках мыши. Труды 3-го съезда ВОГиС. Москва. 6-12 июня 2004. Т. 2. С. 403.

6. Мензоров А.Г., Круглова A.A., Темирова С.А., Серов O.JI. Характеристика ядерного и митохондриального геномов во внутри- и межвидовых эмбриональных стволовых гибридных клетках мыши // VI Международная конференция по молекулярной генетике соматических клеток. Звенигород. Москва. 2005. С. 99-100.

7. Мензоров А.Г., Круглова A.A., Шилов А.Г., Матвеева Н.М. Использование микросателлитов для идентификации родительских хромосом в эмбриональных гибридных клетках // Научные школы Сибири: взгляд в будущее. Труды второй интеграционной междисциплинарной конференции молодых ученых СО РАН и высшей школы (Иркутск, 6-10 октября 2003 г.). Издательство Института географии СО РАН. Иркутск. 2003. С. 107-108.

8 Мензоров А.Г., Серов О.Л.. Сегрегация митохондрий во внутри- и межвидовых эмбриональных гибридных клетках мыши // Онтогенез. 2005. Т. 36, № 5. С. 383.

9. Пузаков М.В., Кизилова Е.А., Матвеева Н.М., Шилов А.Г., Мензоров А.Г., Василькова A.A., Серов О.Л. In vz'rro-анализ плюрипотентности клеточных гибридов, полученных от слияния эмбриональных стволовых клеток и спленоцитов мыши // Цитология. 2003. Т. 45, № 9. С. 917-918.

10. Серегин A.B., Пузаков М.В., Мензоров А.Г. Сегрегация хромосом во внутривидовых и межвидовых клеточных гибридах, полученных от слияния эмбриональных стволовых и соматических клеток мыши и анализ их плюрипотентности // Материалы XL Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс»: Биология Новосиб. гос. университет. Новосибирск. 2002. С. 101-103.

Подписано к печати 1/112006

Формат бумаги 60 х 90 1/16. Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0,7.

Тираж 100 экз. Заказ 6.

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10.

¿006 к #-3633

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мензоров, Алексей Гавриилович

ф ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Эмбриональные стволовые клетки как связующее звено исследований проблем эмбриональной дифференцировки в системах in vitro и in vivo.

1.1.1. Общая характеристика стволовых клеток эмбрионального происхождения.

1.1.2. Эмбриональные стволовые клетки.

1.1.3. Культивирование эмбриональных стволовых клеток.

1.1.4. Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток in vitro.

Ф 1.1.5. Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток in vivo.

1.2. Применение эмбриональных стволовых клеток.

1.3. Гибридные клетки между стволовыми и дифференцированными клетками как модель для изучения процессов репрограммирования.

1.4. Сегрегация хромосом в гибридных клетках.

1.5. Использование микросателлитов в качестве генетических маркеров.

1.6. Роль митохондрий в нормальном развитии, экспериментально реконструированных зиготах и гибридных клетках.

1.6.1. Организация митохондрий млекопитающих.

1.6.2. Сегрегация мтДНК у клонированных млекопитающих, полученных методом трансплантации ядер соматических клеток в энуклеированные ооциты.

1.6.3. Сегрегация мтДНК при гетероплазмии.

1.6.4. Сегрегация мтДНК в гибридных клетках.

ГЛАВА 2; МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Клетки и клеточные линии.

2.2. Работа с культурами клеток.

2.2.1. Пассирование клеток.

2.2.2. Субклонирование.

2.2.3. Замораживание клеток.

А 2.2.4. Размораживание клеток.

2.3. Выделение геномной ДНК.

2.4. ПЦР-анализ микросателлитов.

2.4.1. Условия ПЦР для амплификации микросателлитов.

2.4.2. Электрофоретический анализ продуктов ПЦР.

2.5. Анализ мтДНК.

2.5.1. ПЦР фрагментов мтДНК.

2.5.2. Выделение амплифицированного фрагмента ДНК.

2.5.3. Подготовка фрагмента мтДНК для секвенирования.

2.5.4. Секвенирование мтДНК.

2.6. Рестрикционный анализ мтДНК.

2.7. ПЦР-анализ мтДНК единичных клеток.

2.8. Цитогенетический анализ.

2.8.1. Приготовление препаратов метафазных хромосом.

2.8.2. Подсчет хромосом.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Идентификация родительских хромосом в гибридных клетках типа ЭС-спленоцит и ЭС-фибробласт с помощью полиморфных микросателлитов.

3.1.1. Выбор микросателлитных маркеров, дискриминирующих гомологичные хромосомы мышей линий 129/01а, БО/с и мышей М. сагоЫ.

3.1.2. Оптимизация условий ПЦР для алельных вариантов микросателлитов у мышей линий 129/01а и БЭ/с.

3.1.3. Оптимизация условий ПЦР для анализа аллельных вариантов микросателлитов мышей М. тшсгйив и М. сагоИ.

3.2. Сегрегация хромосом в клонах внутривидовых гибридных клеток.

3.3. Сегрегация хромосом в клонах межвидовых гибридных клеток.

3.4. Сегрегация митохондрий в клонах внутривидовых гибридных клеток.

3.5. Сегрегация митохондрий в клонах межвидовых гибридных клеток.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сегрегация хромосом и митохондрий во внутри- и межвидовых эмбриональных гибридных клетках мыши"

Актуальность. Эмбриональные стволовые (ЭС) клетки обладают плюрипотентными и даже тотипотентными свойствами, которые сохраняются при длительном культивировании in vitro (Hogan et al., 1994; Smith, 2001; Carpenter et al., 2003; Ginis et al., 2003; Hubner et al., 2003; Toyooka et al., 2003; Geijsen et al., 2004). При комбинировании ЭС клеток с эмбрионами ранних стадий развития, ЭС клетки способны участвовать в формировании химер, причем вклад ЭС клеток прослеживается во всех соматических тканях и в зародышевом пути (Robertson et al., 1986; Allan, 1987; Robertson, 1987; Joyner, 1993; Hogan et al., 1994).

В 1996 году впервые была предпринята попытка использовать ЭС клетки для репрограммирования генома дифференцированных клеток. С этой целью плюрипотентные ЭС клетки мыши были слиты со спленоцитами взрослого животного. Полученные в этом эксперименте клеточные гибриды обладали плюрипотентными свойствами, сопоставимыми с ЭС клетками (Матвеева и др., 1996; Matveeva et al., 1998). Позднее эти данные получили подтверждение при анализе гибридов, полученных от слияния ЭС клеток с тимоцитами (Tada et al., 2001; 2003) или незрелыми клетками-предшественниками гемопоэза или нейрогенеза (Terada et al., 2002; Ying et al., 2002). В недавно опубликованных данных по анализу гибридных клеток, полученных слиянием ЭС клеток человека с человеческими фибробластами, также отмечается высокий уровень плюрипотентности, сходный с родительскими ЭС клетками (Cowan et al., 2005). Высокий потенциал гибридных клеток типа ЭС-соматическая клетка подразумевает доминирование плюрипотентности - ключевого свойства ЭС клеток. В свою очередь, это предполагает репрограммирование генома соматического партнера. Свидетельства репрограммирования аллелей соматического партнера для целого ряда генов были найдены в гибридах, полученных от слияния ЭС клеток Mus musculus domesticus и тимоцитов M. musculus molossinus (Tada et al., 2001; 2003; Hatano et al., 2005). Прямые доказательства масштабного репрограммирования генома соматического партнера (фибробласта) и связанного с этим изменения профиля экспрессирующихся генов (свыше 99%) по типу ЭС клеток были получены с помощью микрочиповой технологии при анализе гибридов ЭС клеток человека с фибробластами (Cowari et al.,

2005). Сопоставление процессов репрограммирования в ядрах дифференцированных клеток после их переноса в энуклеированный ооцит или яйцо с таковыми в гибридных клетках типа ЭС-соматическая клетка показывает значительное сходство и, следовательно, гибридные клетки являются новым перспективным инструментом изучения фундаментальных проблем репрограммирования и восстановления проспективных потенций генома дифференцированных клеток.

Однако при этом следует особо отметить, что для изучения молекулярных механизмов как поддержания плюрипотентности в гибридном геноме, так и репрограммирования генома соматического партнера необходимо знать хромосомный состав гибридных клеток. Между тем, до недавнего времени исследованиям этой важной характеристики гибридных клеток типа ЭС-дифференцированная клетка не уделялось должного внимания. В ряде работ по слиянию ЭС и дифференцированных клеток авторы не исследовали кариотип гибридных клеток на том основании, что клетки имели тетраплоидный набор хромосом, что, как полагают авторы, свидетельствует об отсутствии сегрегации хромосом. Так, Тада и соавторы (Tada et al., 2001) описали в клеточных гибридах, полученных от слияния ЭС клеток и тимоцитов, околотетраплоидный набор хромосом, по их мнению, сохранившийся от момента слияния двух диплоидных клеток. Тетраплоидный набор хромосом был обнаружен в гибридных клетках, полученных от спонтанного слияния ЭС клеток со стволовыми клетками костного мозга или недифференцированными клетками головного мозга эмбрионов (Terada et al., 2002; Ying et al., 2002). Однако, согласно более поздним данным Тада и соавторов (Tada et al., 2003), только 62% гибридных клеток, полученных слиянием ЭС клеток мыши с тимоцитами, сохраняли тетраплоидный набор хромосом. Более того, интенсивная сегрегация хромосом была отмечена в гибридных клетках, полученных от слияния ЭС клеток и спленоцитов, в результате чего кариотипы некоторых клонов гибридных клеток содержали околодиплоидный набор хромосом (Matveeva et al., 1998; Матвеева и др., 2001). Сходные данные были получены при исследовании количества хромосом в гибридных клетках, образовавшихся от спонтанного слияния in vivo незрелых клеток-предшественников гемопоэза с клетками печени (Wang et al., 2003).

Следует заметить, что применение цитогенетических методов для идентификации родительских хромосом внутривидовых и межвидовых гибридных клеток (полученных слиянием клеток от близких видов) затруднено или невозможно из-за морфологического сходства гомологичных хромосом. Между тем, дискриминация родительских хромосом возможна с использованием альтернативных методов, например, с помощью микросателлитов в качестве маркеров хромосом. Микросателлиты высокополиморфны у лабораторных линий мышей и равномерно распределены в геноме мыши (Dietrich etal., 1992; 1996). В 1998 году появилась одна из первых работ, в которой микросателлиты использовали для маркирования родительских хромосом у внутривидовых гибридных клеток (Hiñes etal., 1998). Авторы использовали набор микросателлитов, дискриминирующих все гомологичные хромосомы, представленные в геноме гибридных клеток от разных линий мышей. Анализ микросателлитов позволил выявить направленность сегрегации в зависимости от фенотипа гибридов.

При образовании гибридных клеток происходит объединение не только ядерных геномов, но и цитоплазмы родительских клеток. Как отмечалось выше, имеются противоречивые и неполные данные о судьбе родительских хромосом в геноме гибридной клетки. В то же время, сведения об организации гибридной цитоплазмы практически полностью отсутствуют. Учитывая способность митохондриальной ДНК (мтДНК) к репликации, представляется актуальным изучение взаимоотношений родительских митохондриальных геномов в гибридной цитоплазме, что может пролить свет на ее организацию. Следует также отметить, что, согласно некоторым данным, существует взаимосвязь между сегрегацией хромосом и митохондрий. Так, в гибридных клетках от слияния между клетками человека и мыши происходит сегрегация митохондрий того партнера, чьи хромосомы теряются (Francesco etal., 1980). Гибридные клетки от слияния клеток мыши и китайского хомячка, а также мыши и крысы, сохраняли как хромосомы, так и митохондрии обоих партнеров (Hayashi etal., 1982; Zuckerman etal., 1984). В настоящее время отсутствуют данные о судьбе родительских митохондрий как во внутривидовых, так и межвидовых гибридных клетках, полученных от слияния диплоидных ЭС клеток с диплоидными дифференцированными клетками.

В свете выше изложенного, не вызывает сомнений актуальность изучения судьбы родительских хромосом в геноме гибридных клеток типа ЭС-дифференцированная клетка, полученных от слияния диплоидных клеток разных линий мышей или близких видов, с использованием микросателлитов, позволяющих дискриминировать родительские гомологи. Представляется не менее актуальным изучение поведения родительских митохондрий в цитоплазме гибридных клеток для установления причинно-следственных связей между формированием генома гибридной клетки и ее цитоплазмы. Знание о реальном соотношении родительских хромосом в ядерном геноме и о взаимоотношениях родительских митохондриальных геномов в цитоплазме необходимо при исследовании как плюрипотентности генома гибридных клеток, так и для понимания механизмов репрограммирования генома дифференцированных клеток.

Цели и задачи исследования

При выполнении работы преследовали две цели: 1) описать с помощью микросателлитов поведение родительских хромосом в гибридных клетках, полученных слиянием ЭС клеток М. musculus линии 129/01а со спленоцитами или эмбриональными фибробластами мышей линии DD/c, и в наборе клонов межвидовых гибридных клеток, полученных слиянием ЭС клеток М. musculus со спленоцитами М. caroli; 2) исследовать судьбу родительских митохондрий в цитоплазме внутри- и межвидовых гибридных клеток, используя анализ полиморфных районов родительских мтДНК.

Для достижения этих целей были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Провести поиск полиморфных микросателлитов, способных дискриминировать каждую пару родительских хромосом у мышей линий 129/01а и DD/c (доноры ЭС клеток, спленоцитов и эмбриональных фибробластов) и у мышей линии 129/Ola М. musculus и азиатской мыши М. caroli (доноры ЭС клеток и спленоцитов, соответственно). Оптимизировать условия полимеразной цепной реакции (ПЦР) для анализа аллельных вариантов микросателлитов и оценить чувствительность метода путем анализа искусственной смеси геномной ДНК мышей М. musculus линии 129/01а и М. caroli.

2. Провести анализ микросателлитов, маркирующих каждую пару родительских хромосом, в 3-х клонах серии HESS, полученных от слияния ЭС клеток мышей 129/Ola и спленоцитов взрослой мыши DD/c, и в 5-ти клонах серии HESF, полученных от слияния ЭС клеток и эмбриональных фибробластов мышей DD/c, с целью описания их хромосомного состава.

3. Провести анализ микросателлитов, маркирующих каждую пару родительских хромосом, в 20-ти клонах серии НМС, полученных от слияния ЭС клеток М. musculus и спленоцитов азиатской мыши М. caroli, с целью описания их хромосомного состава.

4. Провести секвенирование D-петли, генов третьей субъединицы цитохромоксидазы, третьей и шестой субъединиц НАД-Н дегидрогеназы мтДНК у мышей линий 129/01а и DD/c с целью выявления нуклеотидных замещений, позволяющих дискриминировать их мтДНК.

Научная новизна и практическая значимость

1. В работе впервые подробно детализированы условия применения полиморфных микросателлитов в качестве маркеров родительских хромосом в меж- и внутривидовых гибридных клетках, полученных слиянием диплоидных ЭС клеток со спленоцитами и эмбриональными фибробластами. Предлагаемый подход имеет хорошую воспроизводимость, менее трудоемок, чем цитогенетический анализ, и позволяет провести быструю оценку хромосомного состава гибридных клеток.

2. С помощью анализа микросателлитов впервые выявлено сохранение всех хромосом плюрипотентного и практически всех соматического партнера, за исключением хромосомы 14, во внутривидовых гибридных клетках - мыши, полученных слиянием ЭС клеток с фибробластами, в противоположность выраженной потере соматических хромосом в гибридных клетках типа ЭС-спленоцит. Важно подчеркнуть, что выявление такой сегрегации хромосом у внутривидовых гибридных клеток с помощью традиционных цитогенетических методов возможно лишь для единичных хромосом.

3. С помощью анализа мтДНК впервые показана предпочтительная сегрегация митохондрий соматического партнера в гибридных клетках, полученных слиянием

ЭС клеток со спленоцитами другой линии мышей и спленоцитами близкого вида, М. сагоИ.

Апробация работы и публикации.

Результаты работы были представлены на международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2002), на интеграционной междисциплинарной конференции молодых ученых СО РАН и высшей школы (Иркутск, 2003), на международной научной конференции молодых ученых и студентов (Алматы, 2003), на 1-м съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003), на международном симпозиуме «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия» (Санкт-Петербург, 2004), на 3-ем съезде ВОГиС (Москва, 2004), на школе-конференции «Актуальные проблемы биологии развития и биотехнологии» (Москва, 2005), на VI международной конференции по молекулярной генетике соматических клеток (Москва, 2005).

Материалы диссертации изложены в 2-х статьях, опубликованных в отечественном и международном журналах.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Мензоров, Алексей Гавриилович

ВЫВОДЫ

1. Впервые из 86-ти тестированных микросателлитов проведен подбор полиморфных маркеров, которые позволяют дискриминировать гомеологи всех хромосом М. ттсиЫз и азиатской мыши М. сагоИ. Выявлено 10 новых микросателлитов, способных надежно дискриминировать гомологи 10-ти хромосом мышей линий 129/01а и Б Б/с. Отобранные микросателлиты позволили идентифицировать родительские хромосомы в меж- и внутривидовых гибридных клетках типа ЭС-спленоцит и ЭС-фибробласт.

3. Анализ микросателлитов в 20-ти клонах межвидовых гибридных клеток, полученных слиянием ЭС клеток М. тшси1ш и спленоцитов М. сагоИ, показал сохранение всех маркеров хромосом плюрипотентного партнера, тогда как присутствие маркеров хромосом соматического партнера значительно варьировало в разных клонах. По этому критерию клоны делятся на три группы: с присутствием всех маркеров хромосом соматического партнера, с умеренной потерей маркеров хромосом соматического партнера и с отсутствием большинства маркеров хромосом соматического партнера. Впервые показана предпочтительная сегрегация 17-ти индивидуальных хромосом соматического партнера.

5. Показано, что в 17-ти исследованных межвидовых гибридных клонах присутствует мтДНК только плюрипотентного партнера, тогда как в 3-х клонах

НМС4, НМС27 и НМС44), присутствует мтДНК обоих родительских видов. Таким образом, впервые установлена предпочтительная сегрегация митохондрий соматического партнера в большинстве клонов гибридных клеток типа ЭС-спленоцит.

7. Сопоставление сегрегации маркеров родительских хромосом и мтДНК показывает предпочтительную сегрегацию как хромосом, так |и митохондрий соматического партнера в гибридных клетках, полученных от слияния ЭС и соматических клеток, хотя прямой связи между этими процессами не выявлено.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мензоров, Алексей Гавриилович, Новосибирск

1. Болыпева Н.Л., Лупатов А.Ю., Егоров Е.Е., Золотарев В.Ю., Егорова И.Н., Зеленин A.B. Скорость сегрегации хромосом в соматических гибридах человек-мышь контролируется геномом мыши // Докл. РАН. 1993. Т. 330, №4. С. 516519.

2. Корниенко И.В., Брень А.Б., Войнова Н.В., Гуськов Е.П. Структурная организация митохондриальной ДНК позвоночных животных // Успехи современной биологии. 2004. Т. 124, №1. С. 17-27.

3. Макгрегор Г., Варли Д. Методы работы с хромосомами животных // М.: Мир. 1986. С. 271.

4. Матвеева Н.М., Кузнецов С.Б., Кафтановская Е.М., Серов О.Л. Сегрегация родительских хромосом в гибридных клетках, полученных от слияния эмбриональных стволовых и дифференцированных клеток взрослого животного//Докл. РАН. 2001. Т. 379, № 1. С. 118-120.

5. Матвеева Н.М., Шилов А.Г., Байбородин С.И., Филимоненко В.В., Ролинская И.В., Серов О.Л. Гибриды между эмбриональными и соматическими клетками мыши сохраняют плюрипотентность // Докл. РАН. 1996. Т. 249, №1. С. 129-132.

6. Пристяжнюк И.Е., Темирова С.А., Мензоров А.Г., Круглова A.A., Матвеева Н.М., Серов О.Л. Видимая и «скрытая» сегрегация родительских хромосом в эмбриональных стволовых гибридных клетках // Онтогенез. 2005. Т. 36, № 2. С. 151-158.

7. Рингерц Н., Сэвидж Р. Гибридные клетки // М.: Мир. 1979. С. 191-209.

8. Серов О.Л., Матвеева Н.М., Кизилова Е.А., Кузнецов С.Б., Железова А.И., Голубица А.Н., Пристяжнюк И.Е., Пузаков М.В. «Хромосомная память» родительских геномов в эмбриональных гибридных клетках // Онтогенез. 2003. Т. 34. №3. С. 216-227.

9. Allan В. Production and analysis of chimeric mice // Teratocarcinoma and Embryonic Stem Cells. A Practical Approach. Oxford: IRL Press Limited. 1987. P. 125-139.

10. Ambrosi D.J., Rasmussen T.P. Reprogramming mediated by stem cell fusion // J. Cell. Mol. Med. 2005. V. 9 (2). P. 320-330.

11. Andrews P.V., Goodfellow P.N. Antigen expression by somatic cell hybrids of a murine embryonal carcinoma cell with thymocytes and L cell // Somat. Cell Genet. 1980. V. 6. P. 271-284.

12. Atsumi T., Shirayoshi Y., Takeichi M., Okada T.S. Nullipotent teratocarcinoma cells acquire the pluripotency for differentiation by fusion with somatic cells // Differentiation. 1982. V. 23. P. 83-86.

13. Baribault H., Kemler R. Embryonic stem cell culture and gene targeting in transgenic mice // Mol. Biol. Med. 1989. V. 6. P. 481-492.

14. Battersby B.J., Loredo-Osti J.C., Shoubridge E.A. Nuclear genetic control of mitochondrial DNA segregation//Nature Genetics. 2003. V. 33. P. 183-186.

15. Battersby B.J., Shoubridge E.A. Selection of a mtDNA sequence variant in hepatocytes of heteroplasmic mice is not due to differences in respiratory chain function or efficiency of replication // Human Molecular Genetics. 2001. V. 10(22). P. 2469-2479.

16. Bibb M.J., Van Etten R.A., Wright C.T., Walberg M.W. and Clayton D.A. Sequence and gene organization of mouse mitochondrial DNA // Cell. 1981. V. 26. P. 167-180.

17. Carpenter M.K., Rosier E., Rao M.S. Characterization and differentiation of human embryonic stem cells // Cloning Stem Cells. 2003. V. 5(1). P. 79-88.

18. Chambers I., Colby D., Robertson M., Nichols J., Lee S., Tweedie S., Smith A. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells // Cell. 2003. V. 113(5). P.643-655.

19. Cieplinski W., Reardon P., Testa M.A. Non-random human chromosome distribution in human-mouse myeloma somatic cell hybrids // Cytogenet. Cell Genet. 1983. V. 35(2). P. 93-99.

20. Correani A., Croce S.M. Expression of teratocarcinoma phenotype in hybrids between totipotent mouse teratocarcinoma and myeloma cells // J. Cell. Physiol. 1980. V. 105. P. 73-79.

21. Cowan C.A., Atienza J., Melton D.A., Eggan K. Nuclear reprogramming of somatic cells after fusion with human embryonic stem cells // Science. 2005. V. 309. P. 13691373.

22. Dey R., Barrientos A., Moraes C.T. Functional constraints of nuclear-mitochondrial DNA interactions in xenomitochondrial rodent cell lines // The Journal of Biological Chemistry. 2000. V. 275(40). P. 31520-31527.

23. Dietrich W.F., Katz H., Lincoln S.E., Shin H.-S., Friedman J., Dracopoli N.C., Lander E.S. A genetic map of the mouse suitable for typing intraspecific crosses // Genetics. 1992. V. 131. P. 423-447.

24. Dietrich W.F., Miller J., Steen R., Merchant M.A., Damron-Boles D., Husain Z., Dredge R., Daly M.J., Ingalls K.A., O'Connor T.J. A comprehensive genetic map of the mouse genome //Nature. 1996. V. 380(6570). P. 149-52.

25. Doetschman T., Eistetter H., Katz M., Schmidt W., Kemler R. The in vitro development of blastocyst derived embryonic stem cell lines: formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium // J. Embryol. Exp. Morph. 1985. V. 87. P. 27-45.

26. Donovan P.J. Growth factor regulation of mouse primordial germ cell development // Curr. Top. Dev. Biol. 1994. V. 29. P. 189-225.

27. Dunbar D.R., Moonie P.A., Jacobs H.T., Holt I.J. Different cellular backgrounds confer a marked advantage to either mutant or wild-type mitochondrial genomes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 6562-6566.

28. Evans M.J., Gurer C., Loike J.D., Wilmut I., Schnieke A.E., Schon E.A. Mitochondrial DNA genotypes in nuclear transfer-derived cloned sheep // Nature Genetics. 1999. V. 23. P. 90-93.

29. Evans M.J., Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryo//Nature. 1981. V. 292. P. 154-156.

30. Francesco L., Attardi G., Groce C.M. Uniparental propagation of mitochondrial DNA in mouse-human cell hybrids // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. V. 77(7). P. 4079-4083.

31. Geijsen N, Horoschak M, Kim K., Gribnau J., Eggan K., Daley G.Q. Derivation of embryonic germ cells and male gametes from embryonic stem cells // Nature. 2004. V. 427. P. 148-154.

32. Ginis I., Luo Y., Miura T., Thies S., Brandenberger R., Gerecht-Nir S., Amit M., Hoke A., Carpenter M.K., Itskovitz-Eldor J., Rao M.S. Differences between human and mouse embryonic stem cells // Dev Biol. 2004. V. 269(2). P. 360-380.

33. Gmur R., Solter D., Knowles B.B. Independent regulation of H-2K and H-2D gene expression in murine teratocarcinoma somatic cell hybrids // J. Exp. Med. 1980. V. 151. P. 1349-1359.

34. Gossler A., Doetschman T.C., Korn R., Serfling E., Kemler R. Transgenesis by means of blastocyst derived embryonic stem cell lines // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 9065-9069.

35. Gossler A., Joyner A.L., Rossant J., Skarnes W.C. Mouse embryonic stem cells and report constructs to detect developmentally regulated genes // Science. 1989. V. 28. P. 463-465.

36. Graves J.A. Chromosome segregation from cell hybrids. I. The effect of parent cell ploidy on segregation from mouse-Chinese hamster hybrids // Can. J. Genet. Cytol. 1984. V. 26(5). P. 557-563.

37. Graves J.A., Barbieri I. Chromosome segregation from cell hybrids. VII. Reverse segregation from karyoplast hybrids suggests control by cytoplasmic factors // Genome. 1992. V. 35(3). P. 537-540.

38. Graves J.A., Wrigley J.M. Chromosome segregation from cell hybrids. II. Do differences in parental cell growth rates and phase times determine direction of loss? // Can. J. Genet. Cytol. 1986. V. 28(5). P. 735-743.

39. Graves J.A., Young G.J. X-chromosome activity in heterokarions and hybrids between mouse fibroblasts and teratocarcinoma stem cells // Exp. Cell Res. 1982. V. 141. P. 87-97.

40. Hatano S., Tada M., Kimura H., Yamaguchi S., Kono T., Nakano T., Suemori H., Nakatsuji N., Tada T. Pluripotential competence of cells associated with Nanog activity//Mechanisms of Development. 2005. V. 122. P. 67-79.

41. Hines M.D., Radomska H.S., Eckhardt L.A. Transcription factor effects on chromosome constitution of cell hybrids // Cytogenet. Cell Genet. 1998. V. 83. P. 6472.

42. Hitomi Y., Yamada T., Oikawa T. Extinction of expression of PU.l/Sfpi-1 putative oncogene encoding a B-cell- and macrophage-specific transcription factor in somatic cell hybrids // Cancer Res. 1993. V. 53. P. 5759-5765.

43. Hogan B., Beddington R., Constantini F., Lacy E. Manipulating the Mouse Embryo // Second Edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1994. P. 497.

44. Hooper M.L. Metabolic co-operation between mammalian cells in culture // BiochimicaetBiophysicaActa. 1982. V. 651. P. 85-103.

45. Jacob H., Boon T., Gaillard J., Nicolas J., Jacob F. Teratocarcinome de la souris: Isolement, culture et propriétés de cellules a potencialites multiple // Ann. Microbiol. Inst. Pasteur. 1973. V. 124. P. 269-282.

46. Jacobs H.T., Lehtinen S.K., Spelbrink J.N. No sex please, we're mitochondria: a hypothesis on the somatic unit of inheritance of mammalian mtDNA // Bioassays. 2000. V. 22(6). P. 564-572.

47. James R.M., Arends M.J., Plowman S.J., Brooks D.G., Miles C.G., West J.D., Patek C.E. K-ras proto-oncogene exhibits tumor suppressor activity as its absence promotes tumorigenesis in murine teratomas I I Mol. Cancer Res. 2003. V. 11. P. 820825.

48. Jenuth J.P., Peterson C.A., Shoubridge E.A. Tissue-specific selection for different mtDNA genotypes in heteroplasmic mice //Nature Genetics. 1997. V. 16. P. 93-95.

49. Joyner A.L. Gene Targeting // A Practical Approach. Oxford: University Press. 1993. P. 234.

50. Kaneda H., Hayashi J.-I., Takahama S., Taya C., Lindahl K.F., Yonekawa H. Elimination of paternal mitochondrial DNA in interspecific crosses during early mouse embiyogenesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 4542-4546.

51. Kruglyak S., Durrett R.T., Schug M.D., Aquadro C.F. Equilibrium distributions of microsatellite repeat length resulting from a alance between slippage events and point mutations //Proc. Natl. Akad. Sci. USA. 1998.V. 95. P. 10774-10778.

52. Legros F., Malka F., Frachon P., Lombes A., Rojo M. Organization and dynamics of human mitochondrial DNA //Journal of Cell Science. 2004. V. 117. P. 2653-2662.

53. Litt M., Luty J.A. A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene // Am. J. Hum. Genet. 1989. V. 44. P. 397-401.

54. Magin T.M., McWhir J., Melton D.W. A new mouse embryonic stem cell line with good germ line contribution and gene targeting frequency // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20 (14). P. 3795-3796.

55. Martin G.R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78. P. 7631-7636.

56. Matsui Y., Zsebo K., Hogan B.L. Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture // Cell. 1992. V. 70. P. 841-847.

57. Mattenberger Y., James D.I., Martinou J.C. Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin // FEBS Lett. 2003. V. 538(1-3). P. 53-59.

58. Matveeva N.M., Pristyazhnyuk I.E., Temirova S.A., Menzorov A.G., Vasilkova A., Shilov A.G., Smith S., Serov O.L. Unequal Segregation of Parental Chromosomes in Embryonic Stem Cell Hybrids // Mol. Reprod. Dev. 2005. V. 71. P. 305-314.

59. McBurney M.W. Hemoglobin synthesis in cell hybrids formed between teratocarcinoma and Friend erythroleukemia cell // Cell. 1977. V. 12. P. 654-662.

60. McBurney M.W., Strutt B. Fusion of embryonal carcinoma cells to fibroblast cells, cytoplasts, and karyoplasts. Developmental properties of viable fusion products // Exp. Cell Res. 1979. V. 124. P. 171-180.

61. Meirelles F.V., Smith L.C. Mitochondrial genotype segregation during preimplantation development in mouse heteroplasmic embryos // Genetics. 1998. V. 148. P. 877-883.

62. Meirelles F.V., Smith L.C. Mitochondrial genotype segregation in a mouse heteroplasmic lineage prodused by embryonic karyoplast transplantation // Genetics. 1997. V. 145(2). P. 445-451.

63. Michaels G.S., Hauswirth W.W., Laipis P.J. Mitochondrial DNA copy number in bovine oocytes and somatic cells // Dev. Biol. 1982. V. 94(1). P. 246-251.

64. Miller R.A., Ruddle F.H. Pluripotent teratocarcinoma-thymus somatic cell hybrids // Cell. 1976. V. 9. P. 45-55.

65. Miller R.A., Ruddle F.H. Teratocarcinoma x Friend erythroleukemia cell hybrids resemble their pluripotent embryonal carcinoma parent // Dev. Biol. 1977. V. 56. P. 157-173.

66. Moreau J.F., Donaldson D.D., Bennett F., Witek-Giannotti J., Clark S.C., Wong G.G. Leukaemia inhibitory factor is identical to the myeloid growth factor human interleukin for DA cells //Nature. 1988. V. 336. P. 690-692.

67. Motta P.M., Nottola S.A., Makabe S., Heyn R. Mitochondrial morphology in human fetal and adult female germ cells // Human Reproduction. 2000. V. 15. P. 129-147.

68. Mummery C.L., Feyen A., Freund E., Shen S. Characteristic of embryonic stem cell differentiation: a comparison with two embryonal carcinoma cell lines // Cell Diff. Devel. 1990. V. 30. P. 195-206.

69. Nagy A., Rossant J., Nagy R., Abramov-Newerly W., Roder J.C. Derivation of completely cell culture derived mice from early-passage embryonic stem cells // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1993. V. 90(18). P. 8424-8428.

70. Piko L., Taylor K.D. Amounts of mitochondrial DNA and abundance of some mitochondrial gene transcripts in early mouse embryos // Dev. Biol. 1987. V. 123(2). P. 364-374.

71. Prager E.M., Orrego C., Sage R.D. Genetic variation and phylogeography of central asian and other house mice, including a major new mitochondrial lineage in Yemen // Genetics. 1998. V. 150. P. 835-861.

72. Rathjen P.D., Toth S., Willis A., Heath J.K., Smith A.G. Differentiation inhibiting activity is produced in matrix-associated and diffusible forms that are generated by alternate promoter usage // Cell. 1990. V. 62. P. 1105-1114.

73. Resnick J.L., Bixler L.S., Cheng L., Donovan P.J. Long-term proliferation of mouse primordial germ cells in culture //Nature. 1992. V. 359. P. 550-551.

74. Roach M.I., Stock J.L., Byrum R., Koller B.H., McNeish J.D. A new embryonic stem cell line from DBA/1 lacJ mice allows genetic modification in a murine model of human inflammation // Exp.Cell Res. 1995. V. 221(2). P. 520-525.

75. Robertson E.J. Embryo-derived stem cell lines // Teratocarcinomas and embryonic stem cell lines: a practical approach. IRL Press Limited. 1987. Ch. 4. P. 71-112.

76. Robertson E.J., Bradley A., Kuehn M., Evans M. Germ line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector // Nature. 1986. V. 323. P. 445-448.

77. Rossant J., Papaioannou V.E. The relationship between embryonic, embryonal carcinoma and embryo-derived stem cells // Cell Differentiation. 1984. V. 15. P. 155161.

78. Rousset J.-P., Dubois P., Lasserre C., Aaviles D., Fellous M., Jami J. Phenotype and surface antigens of mouse teratocarcinoma x fibroblast cell hybrids // Somat. Cell Genet. 1979. V. 5. P. 739-752.

79. Rudnicki M.M., McBurney M.W. Cell culture methods and induction of differentiation of embryonal carcinoma cell lines // Teratocarcinomas and embryonic cell lines: a practical approach. 1987. IRL Press Limited. Ch. 2. P. 19-49.

80. Rushton A.R. Quantitative analysis of human chromosome segregation in man-mouse somatic cell hybrids // Cytogenet. Cell. Genet. 1976. V. 17. P. 243-253.

81. Scholer H.R. Octamania: The POU factors in murine development // TIG. 1991. V. 7. P. 323-329.

82. Shay J.W., Ishii S. Unexpected nonrandom mitochondrial DNA segregation in human cell hybrids // Anticancer Res. 1990. V. 10(2A). P. 279-284.

83. Shimazaki T., Okazawa H., Fujii H., Ikeda M., Tamai K., McKay R.D.G., Muramatsu M., Hamada H. Hybrid cell extinction and re-expression of Oct-3 function correlates with differentiation potential // EMBO J. 1993. V. 12. P. 44894498.

84. Smith A.G., Heath J.K., Donaldson D.D., Wong G.G., Moreau J., Stahl M., Rogere D. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purifiedm polypeptides // Nature. 1988. V. 336. P. 688-690.

85. Smith AG. Embryo-derived stem cells: of mice and men // Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 2001. V. 17. P. 435-462.

86. Solter D., Knowles B.B. Monoclonal antibody defining stage-specific mouse embryonic antigen (SSEA-1) // Proc. Nat. Acad. Sci. 1978. V. 75. P. 5565-5569.

87. Steinborn R., Zakhartchenko V., Wolf E., Muller M., Brem G. Non-balanced mix of mitochondrial DNA in cloned cattle produced by cytoplast-blastomere fusion // FEBS Letters. 1998. V. 426. P. 357-361.

88. Stevens L.C. Comparative development of normal and parthenogenetic mouse embryos, early testicular and ovarian teratomas and embryoid bodies // Teratomas and differentiation / Eds Sherman C.H., Solter D. N. Y. 1975. P. 17-32.m

89. Stevens L.C. The biology of teratomas // Adv. Morphogen. 1967. V. 6. P. 131.

90. Stewart C.L. Formation of viable chimaeras by aggregation between teratocarcinomas and preimplantation mouse embryos // J. Embryol. Exp. Morph. 1982. V. 67. P. 167-179.

91. Tada M., Morizane A., Kimura H., Kawasaki H., Ainscough J.F.X., Sasai Y., Nakatsuji N., Tada T. Pluripotency of reprogrammed somatic genomes in embryonic stem hybrid cells // Dev. Dyn. 2003. V. 227. P. 504-510.

92. Tada M., Takahama Y., Abe K., Nakatsuji N., Tada T. Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells // Curr. Biol. 2001. V. 11. P. 1553-1558.

93. Takagi N. Mouse embryonal carcinoma cell-somatic cell hybrids as experimental tools for study of cell differentiation and X chromosome activity // Cancer Genet. Cytogenet. 1997. V. 93. P. 48-55.

94. Takagi N. Variable X chromosome inactivation patterns in near-tetraploid murine EC x somatic hybrid cells differentiated in vitro II Genetica. 1993. V. 88. P. 107-117.

95. Takagi N., Yoshida M.A., Sugawara O., Sasaki M. Reversal of X-inactivation in female mouse somatic cells hybridazed with murine teratocarcinoma stem cells in vitro II Cell. 1983. V. 34. P. 1053-1062.

96. Takeda K., Takahashi S., Onishi A., Hanada H., Imai H. Replicative advantage and tissue-specific segregation of RR mitochondrial DNA between C57BL/6 and RR heteroplasmic mice // Genetics. 2000. V. 155(2). P. 777-783.

97. Tautz D. Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers // Nucleic Acids Res. 1989. V. 17. P. 6463-6471.

98. Terada N., Hamazaki Т., Oka M., Hoki M., Mastalerz D.M., Nakano Y., Meyer E.M., Morel L., Petersen B.E., Scott E.W. Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion // Nature. 2002. V. 416. P. 542545.

99. Toth G., Gaspari Z., Jurka J. Microsatellites in different eukaryotic genomes: survey and analysis // Genome Research. 2000. V. 10. P. 967-981.

100. Toyooka Y., Tsunekawa N., Akasu R., Noce T. Embryonic stem cells can form germ cells in vitro II Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 11457-11462.

101. Wakayama Т., Perry A.C.F., Zuccotti M., Jihnson K.R., Yanagimachi R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei //Nature. 1998. V. 394. P. 369-379.

102. Wang X., Willenbring H., Akkari Y., Torimaru Y., Foster M., Al-Dhalimy M., Lagasse E., Finegold M., Olson S., Grompe M. Cell fusion is the principal source of bone- marrow-derived hepatocytes //Nature. 2003. V. 422(6934). P. 897-901.

103. Weber J.L., May P.E. Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction // Am. J. Hum. Genet. 1989. V. 44. P. 388-396.

104. Web-сайт // http://www.informatics.jax.org (Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA).

105. White F.A., Bunn C.L. Segregation of mitochondrial DNA in human somatic cell hybrids // Mol. Gen. Genet. 1984. V. 197(3). P. 453-460.

106. Wilmut I., Schnieke A.E., McWhir J., Kind A.J., Campbell K.H.S. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells // Nature. 1997. V. 385. P. 810-813.

107. Wobus A.M. Holzhausen H., Jakel P., Schoneich J. Characterization of a pluripotent stem cell line from a mouse embryo // Exp. Cell Res. 1984. V. 152. P. 810-813.

108. Ying Q-L., Nichols J., Evans E.P., Smith A.G. Changing potency by spontaneous fusion //Nature. 2002. V. 416. P. 545-548.

109. Zelesco P.A., Graves J.A. Chromosome segregation from cell hybrids. III. Segregation is independent of spindle constitution // Genome. 1987. V. 29(4). P. 528531.

110. Zuccotti M., Monk M. Methylation of the mouse Xist gene in sperm and eggs correlates with imprinted Xist expression and paternal X-inactivation // Nat. Genet. 1995. V. 9(3). P. 316-320.

111. Zuckerman S.H., Solus J.F., Gillespie F.P., Eisenstadt J.M. Retention of both parental mitochondrial DNA species in mouse-Chinese hamster somatic cell hybrids // Somat. Cell Mol. Genet. 1984. V. 10(1). P. 85-91.

Информация о работе

Мензоров, Алексей Гавриилович
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2006
ВАК 03.00.15

Диссертация

Сегрегация хромосом и митохондрий во внутри- и межвидовых эмбриональных гибридных клетках мыши - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы