Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ сегрегации хромосом межвидовых гибридов, полученных слиянием эмбриональных стволовых клеток Mus musculus и спленоцитов Mus caroli

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Анализ сегрегации хромосом межвидовых гибридов, полученных слиянием эмбриональных стволовых клеток Mus musculus и спленоцитов Mus caroli"

На правах рукописи

ТЕМИРОВА СЫМБАТ АКБАГЫШОВНА

АНАЛИЗ СЕГРЕГАЦИИ ХРОМОСОМ МЕЖВИДОВЫХ ГИБРИДОВ, ПОЛУЧЕННЫХ СЛИЯНИЕМ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК Mus musculus И СПЛЕНОЦИТОВ Mus caroli

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

»

I

)

Новосибирск 2005

Работа выполнена в лаборатории генетики развития Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

доктор биологических наук, профессор Серов Олег Леонидович Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук, профессор Рубцов Николай Борисович Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук, профессор Стегний Владимир Николаевич Томский государственный университет, г. Томск

Институт биологии гена РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится___2005 года

на утреннем заседании диссертационного совета Д-003.011.01 в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект акад. Лаврентьева 10, тел/факс: (383^)331278, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

ЪО - оЛ^г**^

Автореферат разослан DU " а^Р'ЧСУУгА, 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета докгор биологических наук """ I " А.Д. Груздев

' 1 J ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. Эмбриональные стволовые (ЭС) клетки обладают плюрипагентными и даже тотипотентными свойствами, которые сохранится при длительном культивировании in vitro (Hogan et al, 1994; Smith, 2001; Hübner et al, 2003; Toyooka et al, 2003; Geijsen et al., 2004). Потенциал ЭС клеток наиболее полно раскрывается при их комбинировании с эмбрионами ранних стадий развития (морулы, бластоцисты). В этом случае ЭС клетки способны участвовать в формировании химер, причем, вклад ЭС клеток прослеживается во всех соматических тканях и в зародышевом пути (Robertson, Bradley, 1986; Robertson, 1987; Allan, 1987; Joyner, 1993; Hogan et al., 1994). По существу, ЭС клетки позволили установить «мост» между методами изучения развития in vivo и in vitro, существенно расширяя возможности исследования процессов дифференцировки и репрограммирования геномов дифференцированных клеток.

Впервые попытка использовать высокий потенциал ЭС клеток для репрограммирования генома дифференцированных клеток была реализована в экспериментах по гибридизации ЭС клеток мыши со спленоцитами взрослых животных (Матвеева и др., 1996). Гибриды типа ЭС-спленоцит сохраняли плюрипотснтность на высоком уровне, вплоть до способности генерировать химерных животных (Matveeva et al, 1998). Высокие плюрипотентные свойства были также выявлены в гибридных клетках, полученных от слияния ЭС клеток мыши с тимоцитами (Tada et al, 2001; 2003) или незрелыми клетками-предшественниками гематопоэза или нейрогенеза (Terada et al, 2002; Ying et al., 2002). Эти эксперименты показали, что потенциал ЭС клеток сохраняется в геноме гибридных клеток и способствует восстановлению плюрипотентности генома дифференцированных клеток.

Однако при изучении механизмов репрограммирования необходимо знать реальное соотношение родительских геномов в гибридных клетках и об изменениях их кариотипа в процессе культивирования in vitro. Между тем, до настоящего времени не были проведены детальные цитогенетические исследования гибридов, полученных от слияния ЭС и дифференцированных клеток Имеются лишь огрывочные, к i ому же противоречивые, данные по сегрегации хромосом в гибридных клетках типа ЭС-дифференцированная клетка. Согласно данным одних авторов (Tada et al., 2001; 2003; Terada et al., 2002; Ying et al., 2002), гибридные клетки мыши типа ЭС-дифференцированная клетка сохраняют тстрагатоидный набор хромосом, формирующийся в результате слияния двух диплоидных клеток, то ссть признаки сегрегации хромосом отсутствуют. Однако по данным других авторов при цитогенетическом анализе гибридных клеток типа ЭС-спленоцит была выявлена отчетливая преимущественная элиминация только хромосом спленоцитов (Matveeva et al, 1998; Матвеева и др., 2001; Серов и др., 2001). Сегрегацию хромосом в гибридных клетках, образовавшихся in vivo or слияния незрелых клеток-предшественников гематопоэза с клетками печени, описали Вассилопоулус и Ванг с соавторами (Vassilopoulos et al., 2003; Wang et al, 2003). Важно также подчеркнуть, что в последнее время все большее внимание исследователей привлекает спонтанное слияние клеток in vivo, то есть

и>с нлцаовдьлля I

БИБЛИОТЕКА }

образование гибридных клеток в разных органах и тканях взрослого животного. Биологические свойства и кариотипы таких гибридных клеток мало исследованы, хотя и представляют несомненный интерес как для специалистов в области канцерогенеза, так и для тех, кто исследует потенции стволовых клеток in vivo (Alvarez-Dolado et al., 2003; Speers et a!, 2003; Vassilopoulos, Rusell, 2003; Que et al, 2004; Mortensen et al., 2004). Следует отметить, что применение цитогенетических методов для идентификации хромосом у внутривидовых и межвидовых гибридов, полученных от близких видов, затруднено из-за морфологического сходства гомологичных хромосом.

Таким образом, не вызывает сомнений актуальность цитогенетического исследования гибридных клеток типа ЭС-дифференцированная клетка для установления соотношения родительских хромосом в гибридном геноме и их эволюции при культивировании in vitro Знание о реальном соотношении родительских хромосом абсолютно необходимо как для оценки плюрипотентности генома гибридных клеток, так и для исследования механизмов репрограммирования хромосом дифференцированных клеток.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы является цигогенетический анализ хромосомного состава набора клонов межвидовых гибридных клеток, полученных слиянием ЭС клеток Mus musculus со спленоцитами Mus caroli Выбор азиатской мыши M caroli был обусловлен несколькими соображениями, во-первых, M. musculus и M caroli являются близкими видами со сходным онтогенезом относительно временных параметров, о чем свидетельствует возможность получения полноценных химер посредством агрегации 8-клеточных эмбрионов обоих видов; во-вторых, межвидовые 1ибриды, полученные от скрещивания M. musculus и M caroli, развиваются нормально, хотя и стерильны (Rossant, Freís, 1980; Rossant, Chapman, 1983); в-третьих, M musculus и M caroli имеют сходные, если не идентичные, кариошпы по числу и морфологии хромосом; в-четвертых, имеется зонд, который позволяет дискриминировать центромеры хромосом M musculus и M caroli в гибридном геноме (Siracusa et al., 1983).

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать кариотип ЭС клеток родительской линии НМ-1 в ходе длительного культивирования m vitro.

2. Изучить хромосомный состав 6-ти клонов гибридных клеток серии D3T, полученных от слияния двух линий плюриногентных ЭС клеток, D3 и TgTP6 3, для оценки изменений тетраплоидного кариотипа при длительном культивировании in vitro.

3. Провести детальный цитогенетический анализ 20-ти клонов межвидовых гибридных клеток, полученных от слияния ЭС клеток M musculus со спленоцитами взрослой самки азиатской мыши M caroli Данный анализ включал:

а) подсчет хромосом в гибридных клетках индивидуальных клонов;

б) оценку количественного соотношения родительских хромосом в геноме гибридных клеток;

в) оценку количественных соотношений гомеологов хромосом 1, 17 и X М тилсиЫв и М сагоН в геноме гибридных клонов.

Научная новизна и практическая значимость

1. Данная работа представляет собой первое детальное цитогенетическое исследование количественного соотношения родительских хромосом гибридных клеток, полученных слиянием ЭС клеток со спленоцитами взрослого животного.

2. Установлено, что в большинстве клонов (90%) межвидовых I ибридлых клеток ЭС-спленоцит наблюдается сегрегация хромосом, вплогь до образования гибридных клеток с околодиплоидным набором хромосом.

3. Установлено, что примерно в 50% клонов имела место односторонняя элиминация только хромосом М сагоН.

4 Впервые выявлена двусторонняя сегрегация родительских

хромосом, хотя и с заметным преобладанием сегрегации хромосом М сагоН.

5. Впервые выявлена «скрытая» сегрегация соматического партнера {М сагоН), в результате чего около 20% гибридных клонов с околотетраплоидным набором хромосом содержали либо единичные хромосомы М. сагоН, либо ограниченное их количество (не более 10).

6. Установлена предпочтительная сегрегация гомологов хромосом 1, 17 и X М сагоН в большинстве исследованных клонов. Важно отметить, что во многих клонах ирису тс1вовали гибридные клетки без Х-хромосомы М сагоН, несмотря на то, что она несет селективный маркер.

Описанную двустороннюю сегрегацию родительских хромосом и особенно явление ('скрытой» сегрегации хромосом соматического партнера следует учитывать при оценке потенциала гибридного генома и в экспериментах, связанных с изучением механизмов репрограммирования.

Полученные в ходе данной работы результаты используются при чтении лекций спецкурса «Генетика развития» в Новосибирском государственном университете (НГУ).

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на 1-ом съезде общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003), на 3-ем съезде ВОГиС (Москва, 2004), на международной конференции «Биология клетки в кульгуре» (Санкт-Петербург, 2004).

Материалы диссертации изложены в 2 статьях, опубликованных в отечественном и международном журналах.

Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, 4-х глав, выводов, приложения и списка литературы. Работа изложена на 109 страницах, иллюстрирована 20 рисунками и содержит 7 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы 3 линии ЭС клеток: 11М-1(ГФРТ), Т£ТР6.3 (ГФРТ' и резистентные к пуромицину) и ПЗ (ГФРТ+, чувствительные к

пуромицину) Детальный цитогенетический анализ был проведен в 20-ти первичных ГАТ-резистентных гибридных клонах, полученных от слияния ЭС клеток линии НМ-1 М. musculus и спленоцитов самки азиатской мыши М, caroh (ГФРТ+) Кроме того, мы анализировали хромосомный состав 6-ти клонов гибридных клеток, полученных от слияния двух линий ЭС клеток TgTP6.3 и D3

Препараты метафазных хромосом готовили, по стандартному протоколу следуя методу, описанному Фантес и соавшрами (Fantes et al., 1995) в модификации (Nesterova et al., 1998) и окрашивали DAPI.

Для дискриминации хромосом М musculus и М caroli в гибридных клетках использовали метод гибридизации in situ с меченым зондом (плазмида pMSat5) специфичным для большинства хромосом М musculus, но не М caroli.

Для дискриминации гомеологов хромосом 1, 17 и X в гибридных клетках использовали метод гибридизации in situ с зондами мечеными двумя разными флуорохромами, в результате чего один зонд выявлял специфическую хромосому, а другой (pMSat5) метил центромеры только гомологов М. musculus.

Мечение видоспецифичного зонда проводили с помощью метода ник-трансляции, с использованием биотинилированной ник-трансляционной смеси, а хромосомо-снецифичные зонды были мечены дигоксигенином с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ кариотипа ЭС клеток родительской линии НМ-1

Для того чтобы оценить изменения кариотипа ЭС клеток в ходе продолжительного культивирования in vitro, мы анализировали хромосомный состав клеточной линии НМ-1 - плюрипотентный партнер при получении гибридных клеток - в течение 3-4 месяцев культивирования. Цитогенетический анализ показал, что в основном клетки НМ-1 сохраняют нормальный кариотип, хотя при длшельном культивировании мы о (метили отклонения от диплоидного кариотипа' трисомия по хромосомам 8 и 11, потеря Y-хромосомы и в редких случаях обнаруживаются перестройки.

Исследование динамики чисел хромосом в клеточных гибридах тияа ЭС-ЭС

Для изучения эволюции тетраплоидного кариотипа in vitro мы проводили анализ 6-ти клонов внутривидовых гибридных клеток серии D3T, полученных ог слияния ЭС клеток линий D3 и TgTP6.3. Клетки D3 и TgTP6.3 имеют нормальный диплоидный кариотип. Цитогенетический анализ всех гибридных клонов серии D3T на 7-8 пассажах показал, что более 90% клегок имеют от 75 до 85 хромосом и 60-80% из них приходится на долю клеток с 80 хромосомами (рис.1 А, Б). Важно отметить, что сходное распределение чисел хромосом в клонах D3T7 и D3T14 мы наблюдали после 19-20 пассажей, причем, последние 8 пассажей гибридные клетки культивировали в неселективных условиях (рис.1В, Г). Данные свидетельствуют, что теграплоидный набор ЭС-ЭС клеточных гибридов достаточно стабильный и сохраняется в течение продолжительного культивирования, как в селеюивных, так и в неселективных условиях. Таким образом, полученные данные об изменении кариотипа тетраплоидных

гибридных ЭС клеток при длительном культивировании могут служить, своего рода, контролем поведения тетраготоидного кариотипа. Этот контроль учитывает также влияния условий гибридизации (слияния) клеток на эволюцию тетраплоидного кариотипа.

А N=52 1 1 0--,-,_,- 40 50 60 70 Ю 90 Б N=55 16 Н 1 40 80 90 70 80 90 100

В N=63 .1 40 50 вО 70 00 90 100 Г N=62 и 40 50 60 70 80 90 1Х

Рис.1. Распределение чисел хромосом в клетках гибридных клонов ОЗТ7 и ОЗТ14 на 7-8 пассажах, соответственно (А, Б), и в тех же клонах на 19-20 пассажах, включая 8 пассажей культивирования в неселективных условиях (В, Г). По оси абсцисс показано число хромосом в метафазных пластинках, а по оси ординат - числа клеток с разным числом хромосом. N - число исследованных метафазных пластинок для каждого клона.

Цитогенетический анализ клонов межвидовых гибридных клеток

Первым шагом цитогенетической характеристики гибридных клеток был подсчет хромосом в 20-ти первичных клонах межвидовых гибридных клеток. Результаты подсчета показали, что количество хромосом в клетках варьирует в широких пределах как внутри одного клона, так и между клонами - от околодиилоидного до околотетраплоидного

Сравнение кариотипов 20-ти межвидовых гибридных клонов типа ЭС-спленоциты с кариотипами клонов серии БЗТ показало, что только пять гибридных клонов (НМС44, НМС48, НМС50, НМС54 и НМС58) имеют

околотетраплоидный набор хромосом (рис.2А, Б), напоминающий кариотипы клонов серии D3T (рис.1). Что касается остальных 15-ти клонов серии IIMC, то во всех отмечено существенное снижение числа хромосом по сравнению с ожидаемым модальным числом 80 (рис.2В, Г). Среди этих 15-ти клонов можно легко заметить межклональные различия в числе хромосом - от околодиплоидного в клоне НМС29 (рис.2Г) до модального триплоидного набора в клонах НМСЗО, НМС42 и НМС56 или промежуточного триплоидно-тетраплоидного (клоны НМС1, НМС2, НМС6, НМС21, НМС23 и НМС28) (рис.2В). Это, несомненно, является признаком сегрегации, которая либо произошла на первых этапах формирования гибридных клеток, либо перманентно продолжается. Однако неясно, каков вклад каждого из родительских геномов в процесс утраты хромосом гибридными клетками.

А N=120 Li 40 50 60 70 вО 90 100 Б N=86 . 1в IlB lulJ^L 1 40 SO во 70 во 90 100

В N=110 30-1 U 0. JL,-шЛ^-,-- 40 50 вО 70 вО 60 100 Г N=57 i Hk в, vi J , 40 50 вО 70 80 90 100

Рис 2. Распределение количества хромосом в гибридных клетках клонов: А - НМС54; Б - НМС44; В - НМС1; Г - НМС29. По оси абсцисс показано число хромосом в метафазных пластинках, а по оси ординат - числа клеток с разным числом хромосом. N - число исследованных метафазных пластинок для каждого клона.

Анализ соотношения хромосом М. musculus и М. caroli в гибридных клетках. Для выяснения реального соотношения родительских хромосом в гибридных клетках мы использовали FISH с видоспецифичным зондом pMSat5,

А А * vV' ->■ ■ » * • > а # , v v Б ■ •А-

" » ! * * te ej 3 £

i * » ■т * <

» в . * -' « »» • ■ '«. * т » . " - • > «г * ■ - . > , * . > % > - -л' « * . » % * * " . / f . " *

Д ' " ■ 1 * » k » 'V - * » • ' ■ , * " , «•. »* "•■ • ! ■»■ ■ ' * * ' • ■ * # •• E • tj - • ■ ■ 4 V ■ ■■ '1 ia'. ■ *

Рис.3. Результаты FISH видоспецифичных зондов - pMSat5 и суммарной ДНК М. caroli с метафазными хромосомами клеток. А - метафазная пластинка клетки НМ-1 с видимыми позитивными сигналами с pMSat5 в центромерных районах большинства хромосом, за исключением Y-хромосомы и аутосом 8 и 14 (отмечены стрелками); Б - метафазная пластинка М caroli после гибридизации с меченым зондом pMSat5. Можно видеть отсутствие какой-либо перекрестной реакции зонда с хромосомами М. caroli; В и Д - метафазные пластинки клеток гибридных клонов НМС15 и НМС58 после гибридизации с зондом pMSat5. Г, Е - метафазные пластинки клеток гибридных клонов НМС15 и НМС58 после гибридизации с меченой суммарной ДНК М, caroli, соответственно. Видны 2 меченые хромосомы в клетке НМС15 и 5 в НМС58.

маркирующего большинство хромосом М. тшыйш, но не М сагоП Зонд рМБа15 дает сильный сигнал в центромерном районе большинства метафазных хромосом М. тшсгйш, за исключением хромосом 8, 14 и У (рис.ЗА). Этот зонд не дает перекрестной реакции с метафазными хромосомами М сагоП (рис.ЗБ). Таким образом, использование этого зонда позволило надежно выявлять 35 из 40 хромосом в диплоидном наборе М тичсШш С помощью этого подхода изучено 20 клонов гибридных клеток По соотношению меченых и немеченых хромосом гибридные клоны можно разделить на несколько групп- 1) клоны 1-й группы (НМС44, НМС50) имеют околотеграплоидный набор хромосом, представленный полным набором хромосом как плюрипотентного (не менее 35 меченых хромосом), так и соматического партнера (свыше 40 немеченых хромосом) Иллюстрацией этому является клон НМС44, где значительное количество клеток содержит примерно равное соотношение меченых и немеченых хромосом (рис 4). Эти результаты свидетельствуют, что в клонах этого типа сегрегация родительских хромосом либо происходила на низком уровне, либо полностью отсутствовала; 2) в клонах 2-й группы (НМС23, НМС27), наблюдали присутствие 35 и более меченых хромосом, но заметно меньше 40 немеченых хромосом. Такое распределение указывает на умеренную сегрегацию хромосом соматического партнера при сохранении полного диплоидного набора хромосом плюрипотентного партнера (рис 4), 3) в третьей группе клонов (НМС4, НМС21. НМС'41) большинство клеток имело 35 меченых хромосом и варьирующее число немеченых, но в части клеток мы обнаружили количество меченых хромосом М тшсиЫч ниже ожидаемых 35. Так в клонах НМС4, НМС21 и НМС41 меченых хромосом было меньше 35 в 28%, 27%, 39% клеток, соответственно. Количество меченых хромосом ниже 35 может свидетельствовать о частичной потере хромосом плюрипотентного партнера; 4) в клонах 4-й группы (НМС1, НМС2, НМС6, НМС28, НМС29, НМСЗО, НМС42; НМС56) наблюдали несомненные признаки двусторонней сегрегации хромосом обоих родительских геномов. В большинстве клеток этих клонов число меченых хромосом было ниже 35 (наиболее часто от 20 до 30) и существенно ниже 40 немеченых хромосом. Наиболее выраженная двусторонняя сегрегация была отмечена в клоне НМС29 с околодиплоидным набором хромосом (рис.4).

Таким образом, проведенный нами цитогенетический анализ выявил преимущественную сегрегацию хромосом соматического партнера в большинстве гибридных клонов. Однако уровень этой сегрегации был выражен в разной степени, в одних клонах она носила умеренный характер, тогда как в 5-ти клонах из 20-ти сохранялись лишь единичные хромосомы М. сагоП (рис.3Г, Е. рис.4). В 9-ти клонах серии НМС мы наблюдали сегрегацию хромосом только соматического партнера Однако в ряде клонов впервые отмечены признаки двусторонней сегрегации хромосом, то есть наряду с сегрегацией хромосом М сагоП, в 9-ти клонах наблюдалась потеря хромосом плюрипотентного партнера.

Рис.4. Соотношение меченых и немеченых хромосом в клетках гибридных клонов по данным FISH с использованием зонда pMSat5, специфичного для хромосом М. musculus. Под гистограммами отложены числа меченых хромосом в индивидуальных метафазных пластинках, а слева - общее число хромосом в пластинке. Серым цветом выделены меченые хромосомы, а черным -немеченые. Белой линией показано ожидаемое число (35) меченых хромосом в гибридных клетках при сохранении диплоидного набора хромосом плюрипотентного партнера, М musculus.

Заслуживает особого внимания группа клонов (НМС15, НМС47, НМС48,

НМС54 и НМС58) с околотстранлоидным набором хромосом, основу которых, однако составили, главным образом, хромосомы шнорипотентного партнера, как например, в клонах НМС15 и НМС58 (рис ЗВ, Д). Результаты гибридизации т situ с использованием меченой тотальной ДНК М caroli показали, что, действительно, клоны HMCI5 и НМС58 содержит 2 и 5 хромосом М caroli, соответственно (рис ЗГ, Е) Эта «скрытая» односторонняя сегрегация хромосом может вводить в заблуждение исследователей, если они ограничиваются только подсчетом хромосом Важно подчеркнуть, что клоны такого типа встречаются с высокой частотой (в 5-ти из 20-ти клопов) Это означает, что тетраплоидный набор хромосом в гибридных клетках, cam по себе, не служит критерием отсутствия сегрегации хромосом Выявленная «скрьпая» сегрегация хромосом указывает на необходимость детального цитогенетическо! о анализа родительских хромосом для характеристики гибридных клеток гипа ЭС-сомагические клетки

С помощью гибридизации т situ с двойной меткой с использованием видоспецифичного и хромосомо-специфично1 о зондов, нам удалось проследить сегрегацию гомеологов хромосом 1, 17 и Х-хромосомы В исследованных клонах гибридных клеток наблюдается заметное отклонение от ожидаемого числа копий юмологов хромосом, которое складывается при слиянии двух родительских геномов Так, например, для Х-хромосомы, после слияния двух диплоидных родительских клеток, в шбридной клетке ожидается одна X-хромосома М musculus и две Х-хромосомы М caroli Согласно нашим данным, отпа группа клонов характеризуется присутствием двух Х-хромосом М musculus и одной Х-хромосомы М caroli, а другая - одной Х-хромосомой М mmculus и одной Х-хромосомой А/ caroli (Табл 1) Таким образом, во всех исследованных ктмшу имеет место поiеря одной т Х-хромосом сомашческого партнера и, прсдпотожитсльно, это могла быть неактивная Х-хромосома спленоцитов На фоне потери Х-хромосомы М caroli увеличение копий Х-хромосомы М musculus в ряде клонов однозначно указывает на предпочти!ельное сохранение Х-хромосом плюрипотентно1 о партнера Это было характерно для клопов со «скрытой» сегрегацией Заслуживает внимания и факт появления клеюк с полной потерей Х-хромосомы М caroli, несмотря на то, чго Э1а хромосома несет селективный маркер, ген ГФР Г дикого т ииа. Сама возможность появление таких клеток, безусловно, связана с предпочтительной потерей, возможно перманентной, Х-хромосомы соматического партнера, поскольку не найдено клеток, лишенных Х-хромосомы М musculus. Выживание клеток без X-хромосомы М caroli в селективной среде обязано кооперативному эффекту (Hooper, 1982).

В гибридной клетке после слияния ожидается четыре гомолога хромосомы 1: два гомолога М musculus и два гомолога М. caroli В трех клонах из 13-ти, содержащих оба родительских гомолога, мы наблюдали высокий процент клеток с таким соотношением 1:1 родительских хромосом 1 (Табл.2).

Таблица 1. Соотношение родительских Х-хромосом в 18-ти клонах гибридных

клеток

Название клонов Число анализированных пластинок Клетки с 3 копиями: 1 ХМ musculus и 2 ХМ caroli Клетки с 3 копиями: 2 ХМ musculus и IX М caroli Клетки с 2 копиями: 1 ХМ musculus и IX М caroli Клетки с 2 ХМ musculus Клетки с 1 X М musculus

♦НМС47 29 23(80%) 3(10%) 3(10%)

»HMC48 30 24(80%) 6(20%)

НМС50 28 24(86%) 2(7%) 2(7%)

»HMC58 21 16(76%) 5(24%)

»HMC54 26 16(61%) 7(27%) 3(12%)

НМС28 28 — — 28(100%) — —

НМСЗО 31 31(100%)

НМС42 18 17(94%) 1(6%)

НМС41 40 3(8%) 37(92%)

НМС21 22 20(91%) 2(9%)

НМС56 41 — — 37(90%) — 4(10%)

НМС1 35 — — 28(80%) — 7(20%)

НМС27 34 _ 1(3%) 27(79%) 1(4%) 5(15%)

НМС23 27 2(7%) 3(11%) 16(60%) 5(19%) 1(4%)

НМС4 36 13(36%) 16(45%) 7(19%)

*НМС15 40 3(8%) 14(35%) 17(43%) 6(14%) _

* клоны со «скрытой» сегрегацией

Таблица 2 Содержание родительских гомологов хромосомы 1 в 9-ти клонах __ гибридных клеток__

Название клонов Число исследованных пластинок Клетки с 4 копиями 2-М musculus к2-М caroli Клетки с 2 копиями' 1 -М musculus и 1 -М caroh Клетки с 3 копиями: 1 -М musculus и2-М caroli Клетки с 3 копиями. 2-М musculus и 1 -М. caroli Клетки с 5 копиями- 2-М musculus пЗ-М caroli Клетки с 4 копиями: 1 -М musculus иЗ-М. caroli Клетки с 5 копиями: 3-М. muscul us и 2 -М caroli

НМС42 29 22(76%) 2(7%) 3(10%) 2(7%) — — —

НМС28 25 18(72%) (8%) 4(16%) 1(4%)

НМС2 32 21(66%) 2(6%) 7(22%) 2(6%) — — —

НМС6 23 8(35%) — 2(9%) 4(17%) 6(26%) 3(13%) —

НМС1 25 5(20%) 1(4%) 16(64%) 3(12%)

НМС27 23 3(13%) — — — — — 20(87 %)

НМС41 32 7(22%) клетки с 4 копиями: 2-М musculus и 1 -М caroli 8(25%) 17(53 %)

НМС54 18 4(22%) клетки с 4 копиями: 3-М muscu lusal-М caroli 14(78%)

НМС56 29 1(3%) 1(3%) 3(11%) 24(83%)

Таблица 3. Содержание родительских гомологов хромосомы 17 в 8-ми клонах ___гибридных клеток ___

Название клонов Число исследованных пластинок Клетки с 4 копиями: 2-М тшси!ш и2-М саго/1 Клетки с 2 КОПИЯМИ' 1 -М тизыЛш и 1 -М сагоИ Клетки с 3 копиями 2-М тшси1ш и 1 -М сагоЬ Клетки с 3 копиями • 1 -м тиьсиЫз и2-М сагок Клетки с 5 копиями. 3-М тшси1 ш и 2 -М сагоЪ Клетки с 4 копиями' 3 -М тшси1т и 1 -М сагоЬ

НМС4 25 18(72%) 2(8%) 1(4%) 4(16%) — —

НМС6 19 14(74%) — 2(10%) — 3(16% ) —

НМС28 27 — 23(85%) - — 4(15%)

НМС41 21 3(14%) — 18(86%) — — —

НМС56 23 — — 23(100%) — — —

НМС42 24 — — 24(100%) — — —

НМС1 31 — — 31(100%) — — —

НМС2 24 2(8%) — 22(92%) — —

В противовес выше описанным клонам, в клонах НМС15, НМС47, НМС48 мы наблюдали четыре, а в некоторых клетках даже пять гомологов первой хромосомы и все они принадлежали М тшсиЫз, то есть в этих клонах эгих произошла полная сегрегация хромосом соматического партнера. Отсутствие маркера хромосомы 1 соматического партнера, подтверждаются результатами независимого микросателлитного анализа проведенного аспирантом нашей лаборатории А.Г. Мензоровым. В остальных исследованных клонах наблюдалась заметная сегрегация родительских гомологов хромосомы 1, о чем свидетельствует невысокий процент клеток с 4-мя копиями хромосомы 1 и равным соотношением родительских гомологов. Важно отметить, что мы наблюдали как увеличение числа копий хромосомы 1, так и уменьшение.

Интересно, что общее число копий гомологов хромосомы 1 М тизси1ш в исследованных клетках клонов НМС41, НМС56, НМС54 и НМС27 было заметно большим, чем таковых М сагок (123:56, 55'33, 50:18 и 86:66, соответственно), тогда как в клонах НМС1 и НМС6 имеется небольшое преобладание числа копий гомолога М сагоН над таковыми М тшси1ш (68:47 и 51:39, соответственно) (Табл.2). Если в первом случае можно говорить, в какой-то мере, о предпочгательной потере гомолога М сагоН, то во втором - либо о слабо выраженной предпочтительной потере гомолога М тизси1ш, либо об эффекте недостаточного объема выборки.

После слияния клеток НМ-1 и спленоцитов в гибридной клечкс ожидается 4 родительских гомолога хромосомы 17: 2 гомолога М тшсгйия и 2 гомолога М сагоН Такое соотношение родительских гомологов мы нашли в двух клонах из 8-ми исследованных клонов. Следовательно, можно сказать, что в данных клонах сегрегация родительских гомологов хромосомы 17 носила умеренный характер. Остальные 6 клонов в большинстве клеток (85%-100%) содержали 2 гомолога М тшси1ш и 1 гомолог М сагоЬ Такое удивительное однообразие в соотношениях гомологов в разных клонах предполагает возможное участие отбора в пользу такого сочетания родительских гомологов хромосомы 17, причем связанное с потерей гомолога соматического партнера

Таким образом, в результате анализа можно заключить, что во всех исследованных гибридных клетках не наблюдали полной сегрегации гомологов хромосом плюрипотентного партнера по исследованным индивидуальным хромосомам.

Как можно объяснить такую природу межклональной вариабельности по составу хромосом в гибридных клонах серии НМС, которая не наблюдается в гибридных клонах серии ПЗТ? В первом случае в качестве партнера по слиянию ОС клеток использовали клетки селезенки, которые гстсрогенны по клеточному составу ог незрелых предшественников до клеток с терминальной дифференцировкой и следовательно, в слиянии с ЭС клетками могли участвовал как первые, так и вторые типы клеток И это обстоятельство, возможно, является определяющим в предопределении межклональной вариабельности сегрегации родительских хромосом На основе результатов цитогенетического анализа гибридов серии 03Т можно предположил,, что одинаковый или близкий онтогенетический статус родительских клеток способствует стабилизации тетраплоиднот о кариотипа, формирующегося в момент образования гибридной клетки. Возможно, различия в онто1 енетическом статусе родительских клеток не только индуцируют сегре1ацию хромосом в гибридных клетках, но и определяют направление сегрегации родительских хромосом Это выражается в односторонней сегрегации хромосом соматического партнера в большинстве клонах гибридных клеток типа ЭС-спленоцит.

Различия в степени дифференцированное™ родительских клеток, ЭС клеток и спленоцитов, предполагают, что их хромосомы могут различаться по эпигенетической организации К таким эпигенетическим событиям, связанным с дифференцировкой, относятся, например, укорочение длины теломерной ДНК, увеличение длины клеточного цикла, локальное или глобальное метилирование

ДНК, ремоделирование хроматина и т.д. В этом случае, сегрегация хромосом может использоваться как важный тест, отражающий уровень эпигенетического сходства родительских хромосом. В таком случае, равная вероятность сегрегации гомологов родительских хромосом, возможно, указывает на одинаковый уровень их глобальной организации и наоборот, различия в организации хромосом могут приводить к предпочтительной сегрегации гомологов хромосом того или иного партнера по слиянию. В данном контексте се!регационный тес! потенциально может оценивать также, стиракнся ли в гибридных клетках предполагаемые начальные эпигенетические различия родительских гомологов хромосом.

ВЫВОДЫ

1 Показано, что в ЭС клетках линии IIM-1 только при длительном культивировании (30-60 пассажей) появляются отклонения от диплоидного кариотипа: трисомия по хромосомам 8 и И, потеря Y-хромосомы и в редких случаях обнаруживаются перес 1ройки.

2. Установлено, что в клонах внутривидовых гибридных клеток, полученных слиянием двух линий ЭС клеток, сохраняется тетраплоидный кариотип, стабильный при культивировании до 22-23 пассажей, как в селективных, так и в неселективных условиях.

3. Анализ 20-ти межвидовых гибридных клонов, полученных слиянием ЭС клеток М. musculus и спленоцитов М. caroli показал, что количество хромосом в клонах варьирует в широких пределах: от околодиплоидного до околотетраплоидного, что свидетельствуе! о сегрегации хромосом в гибридах гипа ЭС-спленоцит.

4. С помощью гибридизации in situ с использованием зонда, специфичного для хромосом М musculus, показано, что в 9-ти из 20-ти исследованных клонов имела место потеря только хромосом М caroli, тогда как в 9-ти клопах выявлена двусторонняя сегрегация родительских хромосом, причем в меньшей степени она затрагивала хромосомы плюрипотентного партнера Это первое описание двусторонней сегрегации в гибридных клетках, полученных слиянием диплоидных геномов с разным онтогенетическим статусом.

5. Показано, что в 5-ш клонах гибридных клеток с околотетраплоидным набором хромосом, геном М caroli представлен либо ограниченным числом хромосом, либо единичными хромосомами. Это явление «скрытой» сегрегации в гибридных клетках шпа ЭС-соматические клетки описано впервые, и это следует учитывать при оценке плюринотентности гибридных клеток.

6. С помощью меченых хромосомо-специфичного и видоспецифичного зондов, в 13-ти из 16-ти исследованных клонов выявлена выраженная предпочтительная потеря гомологов Х-хромосом М caroli, вплоть до полного ее отсутствия в 5%-24% клеток, несмотря на го, что Х-хромосома М caroli несет селективный маркер. Показано также, что во мношх клонах, содержащих хромосомы 1 и 17 обоих родительских видов, числа копий гомологов были близки к соотношению 2:1 в пользу М musculus.

Таким образом, прямой метод идентификации гомеодогов 1, 17 и X однозначно свидетельствуют о предпочтительной сегрегации соматического партнера.

Список публикаций по теме диссертации:

1. Пристяжнюк И.Е., Темирова С.А., Мензоров А.Г., Круглова A.A., Матвеева Н.М., Серов O.JI. Видимая и "скрытая" сегрегация родительских хромосом в эмбриональных стволовых гибридных клетках // Онтогенез. 2005. Т. 36. № 2. С. 151-158.

2 Matveeva N.M., Pristyazhnyuk I.E., Temirova S.A., Menzorov A.G., Vasilkova A.A., Shilov A.G., Smith A., Serov O.L. Unequal segregation of parental chromosomes in embryonic stem cell hybrids // Mol. Reprod. Dev. 2005. V. 71. P. 305-314.

3. Пристяжнюк И.Е., Петракова O.C., Темирова С.А., Матвеева Н.М., Шилов А.Г., Серов О.Л. Гибриды между эмбриональными стволовыми и соматическими клетками как модель для изучения репрограммирования хромосом дифференцированных клеток // Цитология, Тезисы докладов. Санкт-Петербург. 2003. Т. 45. № 9. С. 916-917.

4. Серов О.Л, Матвеева Н.М., Кизилова Е.А., Кузнецов С.Б., Железова А.И., Голубица А.Н., Пристяжнюк И.Е., Петракова О.С., Темирова С.А., Пузаков М.В. "Онтогенетическая намять" родительских хромосом в гибридах, полученных от слияния эмбриональных стволовых клеток и спленоцитов взрослого животного // Цитология, Тезисы докладов. Санкт-Петербург. 2003. Т. 45. № 9. С. 926-927.

5. Темирова С.А., Пристяжнюк И.Е., Матвеева Н.М., Серов О.Л. Сегрегация родительских хромосом в межвидовых гибридных клеток мыши, полученных от слияния эмбриональных стволовых клеток со спленоцигами // III съезд ВОГИС, Москва, 6-12 июня 2004. С. 273.

6 Матвеева Н М., Пристяжнюк И.Е, Пузаков М.В., Мензоров А.Г, Василькова A.A., Голубица А.Н., Железова А.И., Темирова С.А, Серов О.Л. Эмбриональные стволовые гибридные клетки - модель для изучения контроля плюрипотентности в условиях in vitro // Цитология, Тезисы докладов. Санкт-Петербург. 2004. Т 46. № 10. С. 927-928

Подписано к печати 2.06.2005 г. Формат бумаги 60 х 90 1/16, печ. л. 1, уч. изд. л. 0,7 Тираж 100. Заказ 72

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10.

IP 1 5 4 3 7

РНБ Русский фонд

2QQ6-4 11582

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Темирова, Сымбат Акбагышовна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Гибриды соматических клеток и их выделение.

1.2. Сегрегация хромосом в гибридах соматических клеток.

1.2.1. Предполагаемые механизмы сегрегации хромосом в гибридах соматических клеток.

1.3. Гибридные клетки, полученные от слияния эмбриональных стволовых и соматических клеток.

1.3.1. Сегрегация хромосом в клеточных гибридах, полученных слиянием эмбриональных стволовых и соматических клеток.

1.4. ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ РОДИТЕЛЬСКИХ ХРОМОСОМ в КЛЕТОЧНЫХ ГИБРИДАХ.

1.4.1. Дифференциальное окрашивание хромосом.

1.4.2. Методы in situ гибридизации.

1.4.3. Исследование клеточных гибридов и химерных мышей с помощью цитогенетических методов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. МАТЕРИАЛЫ.

2.1.1. Клеточные линии

2.1.2. ДНК пробы.

2.2. МЕТОДЫ.

2.2.1. Приготовление препаратов метафазных хромосом.

2.2.3. QFD - дифференциальное окрашивание метафазных хромосом.

2.2.4. Биотинилирование зондов.

2.2.5. FISH с видоспецифичными зондами, мечеными биотином.

2.2.6. FISH с геномной ДНК М. caroli.

2.2.7. Двухцветная FISH с видоспецифичным и хромосомо-специфичным зондами

2.2.8. FISH с хромосомо-специфичным зондом на Y-хромосому.

2.2.9. Микроскопирование и обработка изображений.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Анализ кариотипа ЭС клеток родительской линии НМ-1.

3.2. Исследование динамики числа хромосом в клеточных гибридах типа ЭС-ЭС.

3.3. Цитогенетический анализ клонов межвидовых гибридных клеток.

3.3.1. Распределение числа хромосом в клетках гибридных клонов.

3.3.2. Анализ соотношения хромосом М. musculns и М. caroli в гибридных клетках .55 3.3.3 Исследование сегрегации гомеологов хромосом 1, 17 и X в клонах гибридных клеток.

3.3.3.1. Сегрегация Х-хромосом.

3.3.3.2. Сегрегация гомеологов хромосомы 1.

3.3.3.3. Сегрегация гомеологов хромосомы 17.

3.3.4. Анализ элиминации Y-хромосомы М. musculus в гибридных клетках.

3.3.5. Хромосомные перестройки в клонах гибридных клеток серии НМС.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ сегрегации хромосом межвидовых гибридов, полученных слиянием эмбриональных стволовых клеток Mus musculus и спленоцитов Mus caroli"

Актуальность. Эмбриональные стволовые (ЭС) клетки обладают плюрипотентными и даже тотипотентными свойствами, которые сохраняются при длительном культивировании in vitro (Hogan et al., 1994; Smith, 2001; Hubner et al., 2003; Toyooka et al., 2003; Geijsen et al., 2004). Потенциал ЭС клеток наиболее полно раскрывается при их комбинировании с эмбрионами ранних стадий развития (морулы, бластоцисты). В этом случае ЭС клетки способны участвовать в формировании химер, причем, вклад ЭС клеток прослеживается во всех соматических тканях и в зародышевом пути (Robertson, Bradley, 1986; Robertson, 1987; Allan, 1987; Joyner, 1993; Hogan et al., 1994). По существу, ЭС клетки позволили установить «мост» между методами изучения развития in vivo и in vitro, существенно расширяя возможности изучения процессов дифференцировки и репрограммирования геномов дифференцированных клеток.

Впервые попытка использовать высокий потенциал ЭС клеток для репрограммирования генома дифференцированных клеток была реализована в экспериментах по гибридизации ЭС клеток мыши со спленоцитами взрослых животных (Матвеева и др., 1996). Гибриды типа ЭС-спленоцит сохраняли плюрипотентность на высоком уровне, вплоть до способности генерировать химерных животных (Matveeva et al., 1998). Высокие плюрипотентные свойства были также выявлены в гибридных клетках, полученных от слияния ЭС клеток мыши с тимоцитами (Tada et al., 2001; 2003) или незрелыми клетками-предшественниками гематопоэза или нейрогенеза (Terada et al., 2002; Ying et al., 2002). Эти эксперименты показали, что потенциал ЭС клеток сохраняется в геноме гибридных клеток и индуцирует восстановление плюрипотентности генома дифференцированных клеток.

Уникальным свойством гибридных клеток типа ЭС-дифференцированная клетка является то, что в одном ядре совмещаются два генома с разной историей развития, то есть появляется возможность оценить роль цис- и транс- регуляторных факторов как в поддержании плюрипотентного статуса ЭС клеток, так и в репрограммировании генома соматического партнера. Непросто предсказать, как будут реагировать цис-регуляторные эпигенетические системы гомологичных хромосом, сложившиеся в ходе индивидуального развития в родительских клетках, в ответ на действие трансдействующих сигналов, исходящих от контрастных родительских геномов. Однако при этом необходимым условием является знание кариотипа гибридных клеток и его изменения в процессе культивирования in vitro и реального соотношения родительских геномов. Между тем, до настоящего времени не были проведены детальные цитогенетические исследования гибридов, полученных от слияния ЭС и дифференцированных клеток. Имелись лишь противоречивые данные по сегрегации хромосом в гибридных клетках типа ЭС-дифференцированная клетка. Согласно данным одних авторов (Tada et al., 2001; 2003; Terada et al., 2002; Ying et al., 2002), гибридные клетки мыши типа ЭС-дифференцированная клетка сохраняют тетраплоидный набор хромосом, появившийся в результате слияния двух диплоидных клеток, то есть признаки сегрегации хромосом отсутствуют. Однако по данным других авторов, полученных при цитогенетическом анализе гибридных клеток типа ЭС-спленоцит, имеет место отчетливая преимущественная элиминация хромосом спленоцитов (Matveeva et al., 1998; Матвеева и др., 2001; Серов и др., 2001). Сегрегацию хромосом в гибридных клетках, образовавшихся in vivo от слияния незрелых клеток-предшественников гематопоэза с клетками печени, описали Вассилопоулус и Ванг с соавторами (Vassilopoulos et al., 2003; Wang et al., 2003). Важно также подчеркнуть, что в последнее время все большее внимание исследователей привлекает спонтанное слияние клеток, то есть образование гибридных клеток в разных органах и тканях взрослого животного. Биологические свойства и кариотипы таких гибридных клеток мало исследованы, хотя и представляют несомненный интерес как для специалистов в области канцерогенеза, так и для тех, кто исследует потенции стволовых клеток in vivo (Alvarez-Dolado et al., 2003; Speers et al., 2003; Vassilopoulos, Rusell, 2003; Que et al., 2004; Mortensen et al., 2004). Следует отметить, что применение прямых цитогенетических методов для внутривидовых и межвидовых гибридов, полученных от близких видов, затруднено из-за морфологического сходства гомологичных хромосом.

Таким образом, не вызывает сомнений актуальность цитогенетического исследования гибридных клеток типа ЭС-дифференцированная клетка для установления реального соотношения родительских хромосом в гибридном геноме и их эволюции при культивировании in vitro. Знание о реальном соотношении родительских хромосом абсолютно необходимо как для оценки плюрипотентности генома гибридных клеток, так и для понимания механизмов репрограммирования хромосом дифференцированных клеток.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы является цитогенетический анализ хромосомного состава набора клонов межвидовых гибридных клеток, полученных слиянием ЭС клеток Mus musculus со спленоцитами Mus caroli. Выбор азиатской мыши М. caroli был обусловлен несколькими соображениями: во-первых, М. musculus и М. caroli являются близкими видами со сходным онтогенезом относительно временных параметров, о чем свидетельствует возможность получения полноценных химер посредством агрегации 8-клеточных эмбрионов обоих видов; во-вторых, межвидовые гибриды, полученные от скрещивания М. musculus и М. caroli, развиваются нормально, хотя и стерильны (Rossant, Frels, 1980; Rossant, Chapman, 1983); в-третьих, M. musculus и М. caroli имеют сходные, если не идентичные, кариотипы по числу и морфологии хромосом; в-четвертых, имеется зонд, который позволяет дискриминировать центромеры хромосом М. musculus и М caroli в гибридном геноме (Siracusa et al., 1983).

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать кариотип ЭС клеток родительской линии НМ-1 в ходе длительного культивирования in vitro.

2. Изучить хромосомный состав 6-ти клонов гибридных клеток серии D3T, полученных от слияния двух линий плюрипотентных ЭС клеток, D3 и TgTP6.3, для оценки изменений тетраплоидного кариотипа при длительном культивировании in vitro.

3. Провести детальный цитогенетический анализ 20-ти клонов межвидовых гибридных клеток, полученных от слияния ЭС клеток М. musculus со спленоцитами взрослой самки азиатской мыши М. caroli. Данный анализ включал: а) подсчет хромосом в гибридных клетках индивидуальных клонов; б) оценку количественного соотношения родительских хромосом в геноме гибридных клеток; в) оценку количественных соотношений гомеологов хромосом 1, 17 и X М. musculus и М. caroli в геноме гибридных клонов.

Научная новизна и практическая значимость

1. Данная работа представляет собой первое детальное цитогенетическое исследование количественного соотношения родительских хромосом гибридных клеток, полученных слиянием ЭС клеток со спленоцитами взрослого животного.

2. Установлено, что в большинстве клонов (90%) межвидовых гибридных клеток ЭС-спленоцит наблюдается сегрегация хромосом, вплоть до образования гибридных клеток с околодиплоидным набором хромосом.

3. Установлено, что примерно в 50% клонов имела место односторонняя элимнация только хромосом М. caroli.

4. Впервые выявлена двусторонняя сегрегация родительских хромосом, но с заметным преобладанием сегрегации хромосом М. caroli, в других 50% клонов гибридных клеток.

5. Впервые выявлена «скрытая» сегрегация соматического партнера (М caroli), в результате чего около 20% гибридных клонов с околотетраплоидным набором хромосом содержали либо единичные хромосомы М. caroli, либо ограниченное их количество (не более 10).

6. Установлена предпочтительная сегрегация гомологов хромосом 1, 17 и ХМ. caroli в большинстве исследованных клонов. Важно отметить, что во многих клонах присутствовали гибридные клетки без X-хромосомы М. caroli, несмотря даже на то, что она несет селективный маркер.

Описанную двустороннюю сегрегацию родительских хромосом и особенно явление «скрытой» сегрегации хромосом соматического партнера следует учитывать при оценке потенциала гибридного генома и в экспериментах, связанных с изучением механизмов репрограммирования.

Полученные в ходе данной работы результаты используются при чтении лекций спецкурса «Генетика развития» в Новосибирском государственном университете (НГУ).

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на 1-ом съезде общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003), на 3-ем съезде ВОГиС (Москва, 2004), на международной конференции «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2004).

Материалы диссертации изложены в 2 статьях, опубликованных в отечественном и международном журналах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, выводов, приложения и списка литературы. Работа изложена на 109 страницах, иллюстрирована 20 рисунками и содержит 7 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Темирова, Сымбат Акбагышовна

ВЫВОДЫ

1. Показано, что в ЭС клетах линии НМ-1 только при длительном культивировании (30-60 пассажей) появляются отклонения от диплоидного кариотипа: трисомия по хромосомам 8 и 11, потеря Y-хромосомы и в редких случаях обнаруживаются перестройки.

2. Установлено, что в клонах внутривидовых гибридных клеток, полученных слиянием двух линий ЭС клеток, сохраняется тетраплоидный кариотип, стабильный при культивировании до 22-23 пассажей, как в селективных, так и в неселективных условиях.

3. Анализ 20-ти межвидовых гибридных клонов, полученных слиянием ЭС клеток М. musculus и спленоцитов М. caroli показал, что количество хромосом в клонах варьирует в широких пределах: от околодиплоидного до околотетраплоидного, что свидетельствует о сегрегации хромосом в гибридах типа ЭС-спленоцит.

4. С помощью гибридизации in situ с использованием зонда, специфичного для хромосом М. musculus, показано, что в 9-ти из 20-ти исследованных клонов имела место потеря только хромосом М. caroli, тогда как в 9 -ти клонах выявлена двусторонняя сегрегация родительских хромосом, причем в меньшей степени она затрагивала хромосомы плюрипотентного партнера Это первое описание двусторонней сегрегации в гибридных клетках, полученных слиянием диплоидных геномов с разным онтогенетическим статусом.

5. Показано, что в 5-ти клонах гибридных клеток с околотетраплоидным набором хромосом, геном М. caroli представлен либо ограниченным числом хромосом, либо единичными хромосомами. Это явление «скрытой» сегрегации в гибридных клетках типа ЭС-соматические клетки описано впервые, и это следует учитывать при оценке плюрипотентности гибридных клеток.

6. С помощью меченых хромосомо-специфичного и видоспецифичного зондов, в 13-ти из 16-ти исследованных клонов выявлена выраженная предпочтительная потеря гомологов Х-хромосом М. caroli, вплоть до полного отсутствия в 5%-24% клеток, несмотря на то, что Х-хромосома М. caroli несет селективный маркер. Показано также, что во многих клонах, содержащих хромосомы 1 и 17 обоих родительских видов, числа копий гомологов были близки к соотношению 2:1 в пользу М. musculus. Таким образом, прямой метод идентификации гомеологов 1, 17 и X однозначно свидетельствуют о предпочтительной сегрегации соматического партнера.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Темирова, Сымбат Акбагышовна, Новосибирск

1. Дыбан А.П. Ранее развитие млекопитающих // Ленинград. Наука. 1988. 288 с.

2. Макгрегор Г., Варли Дж. Методы работы с хромосомами животных // Москва. Мир. 1986. 271 с.

3. Матвеева Н.М., Шилов А.Г., Байбородин С.И., Филимоненко В.В., Ролинская И.В., Серов О.Л. Гибриды между эмбриональными стволовыми и соматическими клетками мыши сохраняют плюрипотентность // Докл. РАН. 1996. Т. 249. №1. С. 129-132.

4. Матвеева Н.М., Кузнецов С.Б., Кафтановская Е.М., Серов О.Л. Сегрегация родительских хромосом в гибридных клетках, полученных от слияния эмбриональных стволовых и дифференцированных клеток взрослого животного //Докл. РАН. 2001. Т. 379. №1. С. 118-120.

5. Нестерова Т.Б., Исаенко А.А., Матвеева Н.М. и др. Перспективы получения картирующей панели гибридов соматических клеток сумчатое — грызун для короткохвостого опоссума Monodelphis domestica II Генетика. 1994. Т. 30. С. 1516-1524.

6. Рингерц Н., Сэвидж Р. Гибридные клетки. М. Мир. 1979. 415 с.

7. Серов О.Л., Матвеева Н.М., Кузнецов С.Б., Кафтановская Е.М. Эмбриональные гибридные клетки: новые возможности в изучении плюрипотентности и репрограммирования хромосом дифференцированных клеток // Известия АН. 2001. №6. С. 711-716.

8. Серов О.Л., Матвеева Н.М., Кизилова Е.А. и др. «Хромосомная память» родительских геномов в эмбриональных гибридных клетках // Онтогенез. 2003. Т. 34. С. 216-227.

9. Allan В. Production and analysis of chimeric mice // Teratocarcinoma and Embryonic Stem Cells. A Practical Approach. Oxford: IRL Press Limited. 1987. P.125.139.

10. Alvarez-Dolado M., Pardal R., Carcia-Verdugo J.M.et al. Fusion of bone marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes // Nature. 2003. V.425. P.968-973.

11. Arrighi F., Hsu T.C. Localization of heterochromatin in human chromosomes // Cytogenet. Cell Genet. 1971. V. 10. P. 81-86.

12. Atsumi Т., Shirayoshi Y., Takeichi M. et al. Nullipotent teratocarcinoma cells acquire the pluripotency for differentiation by fusion with somatic cells // Differentiation. 1982. V. 23. P. 83-86.

13. H.Barski G., Sorieul S., Cornefert F. Production dans des cultures in vitro de deux souches cellulaires en association de cellules de caractere "hybride" // C. R. Acad. Sc. 1960. V. 251. P. 1825-1827.

14. Barski G., Sorieul S., Cornefert F. Hybrid type cells in combined cultures of two different mammalian cell strains // J. Natl. Cancer Inst. 1961. V. 251. P. 1269-1291.

15. Bonnet H.T., Eriksson T. Transfer of algal chloroplasts into protoplasts of higher plants // Planta. 1974. V. 115. P. 355-367.

16. Burkin D.J., O'Brien P.C.M., Broad Т.Е. et al. Isolation of chromosome-specific paints from high resolution flow karyotypes of the sheep (Ovis Aries) // Chromosome Res. 1997. V. 5. P. 102-108.

17. Caspersson Т., Farber S., Foley G.E. et al. Chemical differention along metaphase chromosomes // Exp. Cell Res. 1968. V. 49. P. 219-222.

18. Caspersson Т., Lomakka G., Zech L. The 24 fluorescence patterns of the human metaphase chromosomes — distinguishing characters and variability // Hereditas. 1971. V.67. P. 89-102.

19. Croce C.M. Loss of mouse chromosomes in somatic cell hybrids between HT-1080 human fibrosarcoma cells and mouse peritoneal macrophages // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1976. V. 73. P. 3248-3252.

20. Damjanov I., Damjanov A., Solter D. Production of teratocarcinomas from embryos transplanted to extrauterine sites // Teratocarcinomas and embryonic stem cell lines: a practical approach. IRL Press Limited. Ch. 1987. V. 1. P. 1-17.

21. D'Ancona G.G., Croce C.M. Segregation of rat chromosomes in somatic cell hybrids between rat cells and HT-1080 human fibrosarcoma cells // Hum. Genet. 1979. V. 53. P. 17-21.

22. Davidson R.L., Ephrussi B. A selective system for isolation of hybrids between L cells and normal cells//Nature. 1965. V. 205. P. 1170-1171.

23. Davidson R.L., Gerald P.S. Improved techniques for the induction of mammalian cell hybridization by polyethylene glycol // Somatic Cell Genet. 1976. V. 2. P. 165-176.

24. Dutrillaux В., Lejenne J. Sur une nouvelle technique d'analyse du caryotype humain // C.R. Acad. Sc. 1971. V. 273. P. 2638-2640.

25. Evans M.G., Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotent cells from mouse embryos // Nature. 1981. V. 292. P. 154-156.

26. Fantes J.A., Oghene K., Boyle S. et al. A high resolution integrated physical, cytogenetic and genetic map of human chromosome 11 from the distal region of pl3 to the proximal part of pi 5.1 // Genomics. 1995. V. 25. P. 447-461.

27. Feguson-Smith M.A. Genetic analysis by chromosome sorting and painting: Phylogenetic and diagnostic applications // Eur. J. Hum. Genet. 1997. V. 5. P. 253265.

28. Forejt J., Gregorova S., Dohnal K. et al. Gene expression of differentiated parent in teratocarcinoma cell hybrids. Repression or reprogramming? // Cell. Diff. 1984. V. 15. P. 229-234.

29. Geijsen N, Horoschak M, Kim K. et al. Derivation of embryonic germ cells and male gametes from embryonic stem cells // Nature. 2004. V. 427. P. 148-154.

30. Gershon D., Sachs L. Properties of a somatic hybrid between mouse cells with different genotypes //Nature. 1963. V. 198. P. 912-913.

31. Gordon S., Cohn Z. Macrophage melanocyte heterokaryons. I. Preparation and properties //J. Exp. Med. 1970. V. 131. P. 981-1003.

32. Gray J.W., Carrano A.V., Steinmetz L.L. Chromosome measurement and sorting by flow systems //Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1975. V. 72. P. 1231-1234.

33. Graves J.M. DNA synthesis in heterokaryons formed by fusion of mammalian cells from different species // Exp. Cell Res. 1972a. V. 72. P. 393-403.

34. Graves J.M. Cell cycles and chromosome replication pattern in interspecific somatic hybrids // Exp. Cell Res. 1972b. V. 78. P. 81-94.

35. Graves J.M. Chromosome segregation from cell hybrids. I. The effect of parent cell ploidy on segregation from mouse Chinese hamster hybrids // Can. J. Genet. Cytol. 1984. V. 26. P. 557-563.

36. Graves J.M., Wrigley J.M. Chromosome segregation from cell hybrids. II. Do differences in parental cell growth rates and phase times determine direction of loss? // Can. J. Genet. Cytol. 1986. V. 28. P. 735-743.

37. Graves J.M., Zelesco P.A. Chromosome segregation from cell hybrids. V. Does segregation result from asynchronous centromere separation? // Genome. 1988. V. 30. P. 124-128.

38. Graves J.M., Barbieri I. Chromosome segregation from cell hybrids. VII. Reverse segregation from karyoplast hybrids suggest control by cytoplasmic factors // Genome. 1992. V. 35. P. 537-540.

39. Green H. Prospects for the chromosomal localization of human genes in human — mouse somatic cell hybrids // Wistar Inst. Symp. Monogr. 1969. V. 9. P. 51-59.

40. Grzeschik K.H., Allderdice P. W., Crzeschik A. et al. Cytological mapping of human X linked genes by use of somatic cell hybrids involving an X - aytosome translocation // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1972. V. 69. P. 69-73.

41. Grzeschik K.H. Utilization of somatic cell hybrids for genetic studies in man // Hum. Genet. 1973. V. 19. P. 1-40.

42. Gurdon J.B. Nuclear transplantation in eggs and oocytes // J. Cell Sci. Suppl. 1986. V. 4. P. 287-318.

43. Gurdon J.B. Genetic reprogramming following nuclear transplantation in Amphibia // Semin. Cell Devel. Biol. 1999. V. 10. P. 239-243.

44. Handmaker S. Cytogenetic analysis of Chinese hamster mouse hybrid cell // Nature. 1971. V. 2330. P. 416-419.

45. Handmaker S. Hybridization of eukaryotic cells // Ann. Rev. Microbiol. 1973. V. 27. P. 189-204.

46. Harris H., Watkins J.F. Hybrid cells derived from mouse and man: artificial heterokaryons of mammalian cells from different species // Nature. 1965. V. 205. P. 640-646.

47. Heneen W.K., Nichols W.W., Levan A. et al. Polykaryocytosis and mitosis in a human cell line after treatment with measles virus // Hereditas. 1970. V. 64. P. 53-84.

48. Hogan В., Beddington R., Constantini F. et al. Manipulating the Mouse Embrio // Second Edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1994. P. 497.

49. Hooper M.L. Metabolic co-operation between mammalian cells in culture // Biochim. Biophys. Acta. 1982. V. 651. P. 85-103.

50. Hubner K, Fuhrmann G, Christenson L.K. et al. Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells // Science. 2003. V. 300. P. 1251-1256.

51. Jacob H., Ruiz F. Preferential loss of kangaroo chromosomes in hybrids between Chinese hamster and kangaroorat somatic cells // Exp. Cell Res. 1970. V. 62. P. 310314.

52. Jacob H., Boon T. et al. Teratocarcinome de la souris: Isolement, culture et proprietes de cellules a potencialites multiple // Ann. Microbiol. Inst. Pasteur. 1973. V. 124. P. 269-282.

53. Jami J., Grandchamp S. Karyological properties of human mouse somatic hybrids // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1971. V. 68. P. 3097-3101.

54. Jami J., Grandchamp S., Ephrussi B. The kariologic behaviour of human mouse cellular hybrids // C. R. Acad. Sc. 1971. V. 272. P. 323-326.

55. Jeanisch R., Bird A. Epigenetic regulation of the gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals // Nature Genet. 2003. V. 33. P. 245254.

56. Joyner A.L. Gene Targeting // A Practical Approach. Oxford: University Press. 1993. P. 234.

57. Kao F.T., Puck T.T. Linkage studies with human Chinese hamster cell hybrids // Nature. 1970. V. 228. P. 329-332.

58. Kao K.M., Michayluk M.R. A method of high-frequency intergenetic fusion of plant protoplasts // Planta. 1974. V. 115. P. 355-367.

59. Kimura H., Tada M., Nakatsuji N. et al. Histone code modifications on pluripotential nuclei of reprogrammed somatic cells // Mol. Cell Biol. 2004. V. 24. P. 5710-5720.

60. Kipling D., Mitchell A., Masumoto H., et al. CENP-B Binds a novel centromeric sequence in the Asian mouse Mus caroli II Mol. Cell Biol. 1995. V. 15. P. 40094020.

61. Koyama H., Yatabe I., Ono T. Isolation and characterization of hybrids between mouse and hamster cell lines // Exp. Cell Res. 1970. V. 62. P. 455-463.

62. Kucherlapati B.S., Bakor R.M., Ruddle F.M. Ouabain as a selective agent in the isolation of somatic cell hybrids // Cytogenet. Cell Cenet. 1975. V. 14. P. 192.

63. Labella Т., Amati P., Marin G. Relationship between the ratio of parental chromosomes and parental doubling times in Chinese hamster mouse somatic cell hybrids // J. Cell Physiol. 1973. V. 81. P. 347-354.

64. Labella Т., Colletta G., Marin G. Asynchronous DNA replication and asymmetrical chromosome loss in Chinese hamster mouse somatic cell hybrids // Somatic Cell Genet. 1976. V. 2. P. 1-10.

65. Langford C.F., Fischer P.E., Binns M.M. et al. Chromosome-specific paints from a high resolution flow karyotype of the dog // Chromosome Res. 1996. V. 4. P. 115123.

66. Lasserre C., Jami J., Aviles D. Patterns of chromosome segregation in Chinese hamster mouse cell hybrids between permanent cell lines and thymus cells // J. Cell Physiol. 1980. V. 104. P. 403.

67. Littlefield J.W. Three degrees of guaylic acid inosinic acid pyrophosphorylase deficiency in mouse fibroblasts // Nature. 1964. V. 203. P. 1142-1144.

68. Liu X., Wu H., Loring J. et al. Trisomy eight in ES cells is a common potential problem in gene targeting and interferes with germ line transmission // Dev. Dyn. 1997. V. 209. P. 85-91.

69. Magin T.M., McWhir J., Melton D.W. A new mouse embryonic stem cell line with good germ line contribution and gene targeting frequency // Nucl. Acid Res. 1992. V. 20. P. 3795-3796.

70. Marin G., Pugliatti Crippa L. Preferential segregation of homospecific groups of chromosomes in heterospecific somatic cell hybrids // Exp. Cell Res. 1972. V. 70. P. 253-256.

71. Martin G.R. Isolation of pluripotent cell line from mouse embryos cultured in medium conditioned to teratocarcinoma stem cells // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1981. V. 9. P. 7643-7638.

72. Matsui Y., Zsebo K., Hogan B.L. Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture // Cell. 1992. V. 70. P. 841-847.

73. Matsuya Y., Green H., Basilico C. Properties and uses of human mouse hybrid cell lines//Nature. 1968. V. 220. P. 1199-1202.

74. Matsuya Y., Takashi N., Yamane Y. Enhancement of PEG mediated hybridization of animal cells by lectin or basic polymer // Proc. Jap. Cancer Assoc. 1979. P. 133.

75. Matveeva N.M., Shilov A.G., Kaftanovskaya E.M. et al. In vitro and in vivo study of pluripotency in intraspesific hybrid cells obtained by fusion of murine embryonic stem cells with splenocytes // Mol. Reprod. Dev. 1998. V. 50. P. 128-138.

76. Medrano L., Phalente L., Buttin G. Differential staining and segregation of parental chromosomes in mouse-rabbit hybridomas // Cell Biol. Int. Rep. 1979. V. 3. P. 503514.

77. Migeon B.R. Hybridization of somatic cells derived from mouse and Syrian hamster: Evolution of karyotype and enzyme studies // Biochem. Genet. 1968. V. 1. P. 305322.

78. Migeon B.R., Miller C.S. Human mouse somatic cell hybrids with single human chromosome (group B): Link with thymidine kinase activity // Science. 1968. V. 162. P.1005-1006.

79. Miller R.A., Ruddle F.H. Properties of teratocarcinoma-thymus somatic cell hybrids // Somat. Cell Genet. 1977. V. 3. P. 247-261.

80. Minna J.D., Gazdar A.F., Iverson G.M. et al. Oncornavirus expression in human — mouse hybrid cells segregating mouse chromosomes // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1974. V. 71. P. 1695-1700.

81. Minna J.D., Coon H.G. Human mouse hybrid cells segregating mouse chromosomes and isozymes // Nature. 1974. V. 252. P. 401-404.

82. Modlinski J.A., Gerhauser D.} Lioli B. et al. Nuclear transfer from teratocarcinoma cells into mouse oocytes and eggs // Devolopment. 1990. V. 108. P. 337-348.

83. Mogens R. Chromosome preparation and high resolution banding // In vivo. 1990. V. 4. P. 337-366.

84. Mortensen K., Lichtenberg J., Thomsen P.D. et al. Spontaneous fusion between cancer cells and endothelial cells // Cell Mol. Life Sci. 2004. V.61. P. 2125-2131.

85. Nabholz M., Miggiano V., Bodmer W. Genetic analysis with human mouse somatic cell hybrids // Nature. 1969. V. 223. P. 358-364.

86. Nesterova T.B., Duthie S.M., Mazurok N.A. et al. Comparative mapping of X-chromosomes in vole species of the genus Microtus II Chromosome Res. 1998. V. 6. P. 41-48.

87. Okada Y., Murayama F. Multinucleated giant cell formation by fusion between cells of two different strains // Exp. Cell Res. 1965. V. 40. P. 154-158.

88. Pack S.D., Zhdanova N.S., Sukoyan M.A. et al. Chromosomal and regional localization of the genes for UMPH2, APRT, PEPD, PEPS, PSP, and PGP in mink: comparison with man and mouse // Cytogenet. Cell Genet. 1989. V. 50. P. 127-131.

89. Pan G.J., Chang Z.Y., Sholer H.R. et al. Stem cell pluripotency and transcription factor Oct4 // Cell Research. 2002. V. 12. P. 321-329.

90. Papaioannou V.E., Rossant J. Effects of the embryonic environment on proliferation and differention of embrional carcinoma cells // Cancer Surveys. 1983. V. 2. P. 165183.

91. Peters J.H., Wille W. High yield mammalian cell fusion induced by polyethylene glycol. Pseudopodia involved in the initiation of the fusion process // Cytobiologic. 1977. V. 15. P. 250-258.

92. Pinkel D., Straume Т., Gray J.W. Cytogenetic analysis using quantitative, high — sensitivity, fluorescence hybridization // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 2934-2938.

93. Pontecorvo G. Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment // Somatic. Cell Genet. 1975. V. 1. P. 397-400.

94. Pratt Т., Sharp L., Nichols J. et al. Embryonic stem cells and transgenic mice ubiquitously expressing a tau-tagged green fluorescent protein // Dev. Biol. 2000. V. 228. P. 19-28.

95. Que J., Oakley R.M.E., Salto-Tellez. et al. Generation of hybrid cell lines with endothelial potential from spontaneous fusion of adult bone marrow cells withembryonic fibroblast feeder // In vitro Cell Dev. Biol.-Animal. 2004. V. 40. P. 143149.

96. Rabbitts P., Impey H., Heppell-Parton A. Chromosome specific paint from a high resolution flow karyotype of the mouse // Nat. Genet. 1995. V. 9. P. 369-375.

97. Ricciuti F.C., Ruddle F.H. Biochemical and cytological evidence for a triple cell line formed from fusion of three different cells // Science. 1971. V. 172. P. 470472.

98. Rideout W.M., Eggan K., Jeanisch R. Nuclear cloning and epigenetic reprogramming of the genome // Science. 2001. V. 293. P. 1093-1098.

99. Robertson E.J., Bradley A. Production of permanent cell lines from early embryos and their use in studying developmential problems // Cambridge: University Press. 1986. P. 475-508.

100. Robertson E.J. Embrio-derived stem cell lines // Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells. A Practical Approach. Oxford: IRL Press Limited. 1987. P. 71-112.

101. Rousset J .P., Dubois P., Lassere C. et al. Phenotype and surface antigens of mouse teratocarcinoma fibroblast cell hybrids // Somat. Cell Genet. 1983. V. 5. P. 739-752.

102. Rossant J., Frels W.I. Interspecific chimeras in mammals: successful production of the live chimeras between Mus musculus and Mus caroli II Science. 1980. V. 208. P. 419-421.

103. Rossant J., Chapman V.M. Somatic and germline mosaicism in interspecific chimaeras between Mus musculus and Mus caroli II J. Embryol. Exp. Morphol. 1983. V. 63. P. 193-205.

104. Ruddle F.H., Chen Т., Shows T.B. et al. Interstrain somatic cell hybrids in the mouse. Chromosome and enzyme analysis // Exp. Cell Res. 1970. V. 60. P. 139-147.

105. Rushton A.R. Quantitative analysis of human chromosome segregation in man mouse somatic cell hybrids // Cytogenet. Cell Genet. 1976. V. 17. P. 243-253.

106. Scaletta L.J., Rushforth N.B., Ephrussi B. Isolation and properties of hybrids between somatic mouse and Chinese hamster cells //Genetics. 1967. V. 57. P. 107124.

107. Schall D., Rechsteiner M. Kinetics of human chromosome loss from 3T3 — human hybrid cells // Somatic Cell Genet. 1978. V. 4. P. 661-676.

108. Scherthan H., Cremer Т., Arnason U. Comparative chromosome painting discloses homologous segments in distantly related mammals // Nat. Genet. 1994. V. 6. P. 342-347.

109. Schnedl W. The karyotype of the mouse // Chromosoma. 1971. V. 35. P. 111116.

110. Schnedl W., Dann O., Schweizer D. Effects of counterstaining with DNA binding drugs on fluorescent banding patterns of human and mammalian chromosomes // Eur. J. Cell Biol. 1980. V. 20. P. 290.

111. Scholer H.R. Octamania: the POU factors in murine development // Trends Genet. 1991. V. 7. P. 323-329.

112. Schroder J., Autio K., Jarvis J. M. et al. Chromosome segregation and expression of rat immunoglobulins in rat mouse hybrid myelomas // Immunogenetics. 1980. V. 10. P. 125.

113. Schrock E., Veldman Т., Hesed Padilla-Nash. et al. Spectral karyotyping refines cytogenetic diagnostics of constitutional chromosomal abnormalities // Hum. Genet. 1997. V. 101. P. 255-262.

114. Schwartz A.G., Coor P.R., Harris H. Correction of a genetic defect in mammalian cell //Nature. 1971. V. 230. P. 5-8.

115. Seabright M. A rapid banding technique for human chromosomes // Lancen. 1971. V. 2. P. 971-972.

116. Serov O.L., Zhdanova N.S., Pack S.D. et al. The mink X chromosome: organization and inactivation // Isozymes: Structure, Function, and Use in Biology and Medicine. Prog. In Clin. And Biol. Res. New York: Willey-Liss. 1990. V. 344. P. 589-619.

117. Siracusa L.D., Chapman V.M., Bennett K.L. et al. Use of repetitive DNA sequences to distinguish Mus musculus and Mus caroli cells by in situ hybridization // J. Embryol. Exp. Morphol. 1983. V. 73. P. 163-178.

118. Smith AG. Embryo-derived stem cells: of mice and men // Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 2001. V. 17. P. 435-462.

119. Sorieul S., Ephrussi B. Kariological demonstration of hybridization of mammalian cells in vitro //Nature. 1961. V. 190. P. 653-654.

120. Speers J.L., Olson S.D., Ylostalo J. et al. Differentiation, cell fusion, and nuclear fusion during ex vivo repair of epithelium by human adult stem cells from bone marrow stroma // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 2397-2402.

121. Speicher M.R., Gwyn Ballard S., Ward D.C. Karyotyping human chromosomes by combinatorial multi-fluor FISH // Nat. Genet. 1996. V. 12. P. 368375.

122. Sumner A.T. A simple technique for demonstrating centromeric heterochromatin // Exp. Cell Res. 1972. V. 75. P. 304-306.

123. Surani A.M. Reprogramming of genome function through epigenetic inheritance// Science. 2001. V. 414. P. 122-128.

124. Szybalski W., Szybalska E.H., Ragni G. Genetic studies with human cell lines //Natl. Cancer Inst. Monogr. 1962. V. 6. P. 75-89.

125. Tada M., Tada Т., Lefebvre L. et al. Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells // The EMBO Journal. 1997. V. 16. P. 6510-6520.

126. Tada M., Takahama Y., Abe K. et al. Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells // Curr. Biol. 2001. V. 11. P. 1553-1558.

127. Tada M., Morizane A., Kimura H. et al. Pluripotency of reprogrammed somatic genomes in embryonic stem hybrid cells // Dev. Dyn. 2003. V. 227. P. 504510.

128. Takagi N., Yashida M.A., Sugawara O. et al. Reversal of X inactivation in female mouse somatic cells hybridized with murine teratocarcinoma stem cells in vitro// Cell. 1983. V. 34. P. 1053-1062.

129. Takagi N. Requirement of mitoses for the reversal of X-inactivation in cell hybrids between murine embrynal carcinoma and normal thymocytes // Exp. Cell Res. 1988. V. 175. P. 363-375.

130. Takagi N. Variable X chromosome inactivation patterns in near tetraploid murine EC somatic cell hybrid cells differentiated in vitro // Genetica. 1993. V. 88.1. P. 107-117.

131. Telenius H., Pelmear A.H., Tunnacliffe A. et al. Cytogenetic analysis by chromosome painting using DOP-PCR amplified flow-sorted chromosomes // Genes Chromosomes Cancer. 1992. V. 4. P. 257-263.

132. Terada N., Hamazaki Т., Oka M. et al. Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion // Nature. 2002. V. 416. P. 542-545.

133. Toyooka Y., Tsunekawa N., Akasu R. et al. Embryonic stem cells can form germ cells in vitro И Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 11457-11462.

134. Van Dilla M.A., Deaven L.L., Albright K.L. Human chromosome-specific DNA libraries: Construction and availability // Biotechnology. 1986. V. 4. P. 537552.

135. Vassilopoulos G., Wang P.R., Russell DW. Transplanted bone marrow regenerates liver by cell fusion // Nature. 2003. V. 422. P. 901-904.

136. Vassilopoulos G., Russell D.W. Cell fusion: an alternative to stem cell plasticity and its therapeutic implications // Curr. Opinion Genet. Dev. 2003. V. 13. P. 480-485.

137. Vig B.K. Sequence of centromere separation: role of centromeric heterochromatin // Genetics. 1982. V. 102. P. 795-806.

138. Vig B.K. Sequence of centromere separation: occurrence, possible significance and control // Cancer Genet. Cytogenet. 1983. V. 8. P. 249-274.

139. Vig B.K., Swearngin S.E. Sequence of centromere separation: premature centromere separation in multicentric chromosomes // Cytobios. 1985. V. 43. P. 253262.

140. Wakayama Т., Yanagimachi R. Mouse cloning with nucleus donor cells of different age and type // Mol. Reprod. Dev. 2001. V. 58. P. 376-383.

141. Wang X., Willenbring H., Akkari Y. et al. Cell fusion is the principal source of bone- marrow-derived hepatocytes //Nature. 2003. V. 422. P. 897-901.

142. Weiss M.C., Ephrussi В. Studies of interspecific (rat mouse) somatic hybrids. I. Isolation, growth and evolution of the karyotype. Genetics. 1966. V. 54. P. 1095-1109.

143. Weiss M.C., Green H. Human mouse hybrid cell lines containing partial complements of human chromosomes and functioning human genes // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1967. V. 58. P. 1104-1111.

144. Westerveld A., Visser R., Freeke M.A. et al. Evidence for linkage of PGK, HGPRT and GGPD in Chinese hamster cells studied by using a relationship between gene multiplicity and enzyme activity // Biochem. Genet. 1972. V. 7. P. 33-40.

145. Wiblin C.N., MacPherson I. Reversion in hybrids between SV40- transformed hamster and mouse cells //Int. J. Cancer. 1973. V. 12. P. 148-161.

146. Womack J.E., Moll I.D. Gene map of the cow: conservation of linkage with mouse and man // J. Hered. 1986. V. 77. P. 2-7.

147. Wong A., Biddle F., Rattner J. The chromosomal distribution of the major and minor satellite is not conserved in the genus Mus II Chromosoma. 1990. V. 99. P. 190-195.

148. Ying Q-L., Nichols J., Evans E.P. et al. Changing potency by spontaneous fusion // Nature. 2002. V. 416. P. 545-548.

149. Yunis J.J. High resolution of human chromosomes // Science. 1976. V. 191. P.1268-1270.

150. Zelesco P.A., Graves J.M. Chromosome segregation from cell hybrids. IV. Movement and position of segregant set chromosomes in early phase interspecific cell hybrids // J. Cell Science. 1988. V. 89. P. 49-56.

151. Zhdanova N.S., Astakhova N.M., Kuznetsov S.B. et al. Characterization of pig mink cell hybrids: Assignment of the TK 1 and UMPH2 genes to pig chromosome 12 // Mamm. Genome. 1994. V. 5. P. 781-784.

152. Zijlstra C., Bosma A.A., de Haan N.A. et al. Characterization of pig rodent somatic cell hybrids // Proc. 10th Europ Colloquin on Cytogenetics of Domestic Animal. Utrecht. Univ. The Netherlands. 1992. V. 18. P. 290-294.