Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Проявление родительских геномов в гибридных клетках, полученных слиянием диплоидных эмбриональных стволовых клеток с ДИ- и тетраплоидными фибробластами

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Проявление родительских геномов в гибридных клетках, полученных слиянием диплоидных эмбриональных стволовых клеток с ДИ- и тетраплоидными фибробластами"

На правах рукописи

КРУГЛОВ А АННА АЛЕКСАНДРОВНА

ПРОЯВЛЕНИЕ РОДИТЕЛЬСКИХ ГЕНОМОВ В ГИБРИДНЫХ КЛЕГКАХ, ПОЛУЧЕННЫХ СЛИЯНИЕМ ДИПЛОИДНЫХ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК С ДИ- И ТЕТРАПЛОИДНЫМИ ФИБРОБЛАСТАМИ

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2009

003458913

Работа выполнена в лаборатории генетики развития Учреждения Российской академии наук Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

Серов Олег Леонидович Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Кикнадзе Ия Ивановна

кандидат биологических наук, Сукоян Марина Александровна

Ведущее учреждение: Институт биологии гена

РАН, г." Москва

Защита диссертации состоится года на утреннем заседании

диссертационного совета Д-003.011.01 в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект акад. Лаврентьева 10, тел/факс: (383)3331278, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

А. Д. Груздев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Изучение природы такого свойства генома эмбриональных клеток, как плюрипотентность, является одной из важнейших задач современной биологии развития. Остаются не выясненными механизмы контроля над поддержанием или утратой плюрипотентности в ходе эмбрионального развития. Кроме этого, мало изучены масштабы изменения генома плюрипотентной клетки при дифференцировке и возможность обратимости данных изменений. К настоящему времени разработано несколько экспериментальных подходов к репрограммированию дифференцированного генома до илюрипотентного уровня. Например, с помощью переноса ядер соматических клеток в энуклеированный ооцит или оплодотворенную яйцеклетку (Di Berardino, 1997; Wilmut et al., 1997; Wakayama et al., 1998), или путем слияния эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) с соматическими клетками взрослого животного (Матвеева и др., 1996; Matveeva et al, 1998; Tada et al., 2001; Serov et al., 2001; Ambrosi, Rasmussen, 2005). Такие гибридные клетки обладают всеми свойствами эмбриональных стволовых клеток, не зависимо от того, какие соматические клетки участвовали в слиянии (Tada et al., 2001; 2003; Terada étal, 2002; Ying étal, 2002; Cowan etal., 2005; Vasilkova et al., 2007). Высокий потенциал гибридных клеток типа ЭСК-соматическая клетка подразумевает доминирование плюрипотентности -ключевого свойства ЭСК. В основе доминирования лежит репрограммирование генома соматического партнера. Свидетельства репрограммирования аллелей соматического партнера для целого ряда генов были найдены в гибридах, полученных от слияния ЭСК Mus musculus domesticus и тимоцитов M. musculus molossinus (Tada etal., 2001; 2003;). Прямые доказательства масштабного репрограммирования генома соматического партнера (фибробласта) и связанного с этим изменения профиля экспрессирующихся генов (свыше 99%) по типу ЭСК были получены с помощью микрочиповой технологии при анализе гибридов от слияния ЭСК человека с фибробластами (Cowan etal., 2005). Сохранение стабильного кариотипа при длительном культивировании ЭСК и их плюрипотентный потенциал делает модель гибридных клеток, полученных при участии ЭСК и соматических клеток, привлекательной для изучения репрограммирования и свойств полученных гибридных клеток. Причины доминирования свойств ЭСК на данный момент не выяснены, поэтому крайне важно установить факторы, влияющие на доминирование плюрипотентности в гибридных клетках. Следует отметить, что для изучения молекулярных механизмов поддержания плюрипотентности в гибридном геноме, и репрограммирования генома соматического партнера, необходимо знать хромосомный состав гибридных клеток. Однако данные о хромосомном составе гибридных клеток носят противоречивый характер. Согласно данным одних авторов (Tada et al, 2001; 2003; Terada et al., 2002; Ying et al., 2002), гибридные клетки мыши типа ЭСК-дифференцированные клетки сохраняют тетраплоидный набор хромосом, появившийся в результате слияния двух диплоидных клеток, то есть признаки сегрегации хромосом отсутствуют. По данным других авторов, полученным при цитогенетическом анализе гибридных клеток типа ЭСК-спленоциты, имеет место отчетливая

преимущественная элиминация хромосом спленоцитов (Matveeva et al., 1998; Матвеева и др., 2001; Серов и др., 2003; Пристяжнюк и др., 2005). В связи с этим, актуальность полноценного анализа хромосомного состава гибридных клеток, который позволит избежать ошибок в интерпретации масштабов репрограммирования, трудно переоценить.

Одним из наиболее адекватных способов оценки потенциала плюрипотентных клеток является получение химерных животных при введении клеток в полость бластоцисты. Однако на данный момент имеется очень мало сведений о получении химерных животных, полученных при введении около-тетраплоидных плюрипотентных клеток (Tada et al., 2001; Ying et al., 2002; Pells et al., 2002). Кроме этого, в цитированных работах нет доказательств сохранения исходного около-тетраплоидного кариотипа клеток при развитии химерного животного. Таким образом, в данной работе впервые будет проведен анализ хромосомного состава потомков около-тетраплоидных гибридных клеток, давших вклад в органы и ткани химерного животного, что позволит однозначно ответить на вопрос, связан ли плюрипотентный потенциал вводимых гибридных клеток с репрограммироваяием хромосом дифференцированной родительской клетки или с их потерей.

Цели и задачи исследования. При выполнении работы преследовалась следующая цель: исследовать влияние плоидности соматического партнера на морфологию и свойства гибридных клегок, полученных при слиянии эмбриональных стволовых клеток мыши с ди- и тетраплоидными фибробластами.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить гибридные клетки между ЭСК Mus musculus линии 129/Ola и диплоидными фибробластами Mus musculus линии DD/c;

2. Получить гибридные клетки между ЭСК M. musculus линии 129/01а и тетраплоидными фибробластами M musculus линии DD/c;

3. Оценить уровень экспрессии генов Oct4 и Nanog (экспрессия которых типична для ЭСК), коллагена 1-го типа и фибронектина (экспрессия которых типична для фибробластов) в полученных клонах гибридных клеток методами ПЦР в реальном времени и иммуноокрашиванием;

4. Провести анализ хромосомного состава гибридных клеток типа ЭСК-диплоидные фибробласты и ЭСК-тетраплоидные фибробласты цитогенетическими методами, а также используя микросателлитные маркеры для идентификации родительских хромосом;

5. Исследовать хромосомный состав потомков гибридных клеток с около-тетраплоидным набором хромосом, полученных слиянием ЭСК и диплоидных фибробластов, давших вклад в органы и ткани химерных животных.

Научная новизна и практическая значимость.

1. Впервые показано доминирование фенотипа соматического партнера в гибридных клетках, полученных при слиянии ЭСК и тетраплоидных фибробластов.

2. Впервые показано сохранение исходного кариотипа у потомков гибридных клеток с около-тетраплоидным набором хромосом в

химерных животных, полученных при тестировании плюрипотентности гибридных клеток. Апробация работы и публикации.

Результаты работы были представлены на II конгрессе общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2007), IV International Meeting Stem Cell Network North Rhine-Westphalia (Дюссельдорф, 2007), 3rd International Conference Basic Science for Medicine (Новосибирск, 2007), LXXIII Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology (Колд Спринг Харбор, 2008).

Материалы диссертации изложены в трех статьях, опубликованных в отечественных и международном журналах. Положения, выносимые на защиту.

1. В гибридных клетках наблюдается альтернативное проявление родительских геномов: доминирование генома ЭСК в клетках типа диплоидные ЭСК-диплоидные фибробласты и, наоборот, доминирование генома фибробласта в клетках типа диплоидные ЭСК-тетраплоидные фибробласты. Таким образом, альтернативное проявление родительских геномов в исследованных гибридных клетках определяется плоидностью соматического партнера.

2. Потомки гибридных клеток с около-тетраплоидным набором хромосом, полученных при слиянии диплоидных эмбриональных стволовых клеток с диплоидными фибробластами, сохраняют исходный кариотип в органах и тканях химерных животных, полученных при тестировании плюрипотентности гибридных клеток.

3. Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, 4-х глав, выводов, списка литературы и 3-х приложений. Работа изложена на 102-х страницах, иллюстрирована 12-ю рисунками и содержит 8 таблиц

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использованы культуры клеток:

- линию ЭСК E14Tg2aSc4TP6.3 из линии мышей 129/01а ("зеленый белок", ГФРТ", устойчива к пуромицину. Линия была любезно предоставлена доктором Остином Смитом (University of Edinburgh);

- первичные культуры эмбриональных фибробластов (линия мышей DD/c М. musculus); первичные культуры фибробластов из взрослой мыши (линия мышей DD/c М. musculus); линия тетраплоидных эмбриональных фибробластов (линия мышей DD/c М. musculus)',

- четыре независимых клона гибридных клеток, полученных при слиянии ЭСК линии E14Tg2aSc4TP6.3 и эмбриональных фибробластов мышей линии DD/c М. musculus-. teO, tef4, tef6, tef9;

- одиннадцать независимых клонов гибридных клеток, полученных при слиянии ЭСК линии E14Tg2aSc4TP6.3 и фибробластов, выделенных из взрослой мыши линии DD/c М. musculus-. taf2, taf4, taf5, tafB, taflO, tafl5, tafl6, taf20, taf22, taf23, taf31;

- одиннадцать независимых клонов гибридных клеток, полученных при слиянии ЭСК линии E14Tg2aSc4TP6.3 и тетраплоидных фибробластов мышей

линии DD/c M. musculus: tef-tl, tef-t3, tef-t4, tef-t7, tef-t8, tef-t9, tef-tlO, tef-tl2, tef-tl8, tef-t22, tef-t27;

- пять культур первичных эмбриональных фибробластов из пяти химерных эмбрионов, полученных после инъекций гибридных клеток клона taf5 в бластоцисты мышей C57BL/6J;

- культуры первичных фибробластов из кожи двух взрослых химерных мышей, полученных после инъекций гибридных клеток клона tef4 и taf2 в бластоцисты мышей C57BL/6J;

Культивирование эмбриональных стволовых и гибридных клеток, проводили по методу, описанному ранее (Matveeva et al., 1998; 2005). Условия культивирования фибробластов, слияния клеток описаны в работе Кругловой с соавторами (Круглова и др., 2008).

Активность щелочной фосфатазы выявляли стандартным способом (Vasilkova et al., 2007).

Для иммунофлуоресцентного анализа экспрессии генов Nanog, Ocî4, коллагена 1-го типа (Со/-7) и фибронектина (Fbn), клетки фиксировали и окрашивали по методике, описанной ранее (Kruglova et al., 2008). Использовали следующие разведения антител (Abeam, Великобритания): против NANOG (1:200); ОСТ4 (1:500); COL-1 (1:1000); FBN (1:500); фаллоидин, конъюгированный с флуорохромом Alexa Fluor 546 - 1:100; антитела, конъюгированные с флуорохромом Alexa Fluor 546 (goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 546; Molecular Probes, США) - 1:300. Препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Axioscope-2 (Carl Zeiss, Germany) и программного обеспечения WinView software (Rooper Scientific Photometrix).

Количественный анализ экспрессии генов Oct4, Nanog, Col-J и Fbn проводили с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). Суммарную РНК из клеточных линий и клонов гибридных клеток выделяли с помощью Trizol Reagent (Invitrogene, США) согласно рекомендациям производителя. Для синтеза кДНК использовали набор реактивов ImProm II Reverse Transcription System (Promega, США) по методу производителя. Концентрацию полученной кДНК доводили до 100 нг/мкл. Для проведения ПЦР-РВ в объеме 50 мкл использовали: 1х реакционную смесь (KCl, Tris-HCl (pH 8.8), 7.5 мМ MgCl2, дезоксинуклеотидтрифосфаты, глицерин, Tween 20, Taq ДНК-полимеразу и пассивный референсный краситель ROX) (Синтол, Россия), 900 нМ прямого и обратного праймеров, 250 нМ зонда, меченого по 5'-концу флуорохромом (карбоксифлуоресцеин, F AM) и несущего на 3'-конце поглотитель флуоресценции BHQ (Black Hole Quancher), 20 нг кДНК и воду. В качестве эндогенного контроля использовали набор праймеров и зонд для анализа уровня экспрессии гена 18s рРНК (TagMan Endogenous Controls; Applied Biosystems, США). Для каждого образца реакция была проведена 3 раза. Готовую реакционную смесь по 50 мкл наносили на 96-луночное плато (ABI PRISM 96-Well Optical Reaction Plate With Barcode; Applied Biosystems, США), лунки закрывали оптически прозрачными крышками (ABI PRISM Optical Caps, 8 caps/strip; Applied Biosystems, США) и помещали в амплификатор (ABI Prism 7000 Sequence Detection System; Applied Biosystems, США). Условия проведения

реакции: 10 мин 95°С, затем - 40 циклов 95°С - 15 с. и Т01Ж°С - 60 с (Табл. 1). Результаты ПЦР реакции анализировали с помощью программного обеспечения ABI Prism 7000 vl.l SDS сравнительным методом (2'дда) относительного количественного анализа.

Выделение ДНК проводили с помощью DNAzol согласно рекомендациям производителя (Life Technology, США). Для дискриминации хромосом линия мышей 129/Ola М. musculus и линия мышей DD/c М. mitsculus в гибридных клетках использовали метод ПЦР-анализа аллельных вариантов микросателлитов (Круглова и др., 2008).

Препараты метафазных хромосом готовили по стандартному протоколу, следуя методу, описанному Фантес с соавторами (Fantes et al., 1995) в модификации (Nesterova et al., 1998) и окрашивали DAPI. Для идентификации хромосомных перестроек использовали метод гибридизации in situ с дигоксигенин- или ФИТЦ- мечеными зондами, специфичными для хромосом X, 4, 6 и 17. Препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Axioscope-2 (Carl Zeiss, Germany), пакета прикладных программ ISIS3 (In Situ Imaging System) компании MetaSystems GmbH.

Таблица 1. Последовательность нуклеотидов праймеров и зондов,

использованных при проведении ПЦР-РВ

Название гена Последовательность 5'-3' Т * отж.

Oct4 Прямой праймер CCACCATCTGTCGCTTCGA 56°С

Обратный праймер GGCCGCAGCTTACACATGTT

TagMan зонд FAM-TGCAGCTCAGCCTTA-BHQ

Nanog Прямой праймер GCAGCTATCCCCAGGGCTAT 56°С

Обратный праймер CTGCCCCACATGGAAAGG

TagMan зонд FAM-TGGTGAATGCATCTGG-BHQ

Col-1 Прямой праймер GCACGAGTCACACCGGAACT 58°С

Обратный праймер CCAAGGGAGCCACATCGAT

TagMan зонд FAM-CACCAAGACCTCCCGCCTGCC-BHQ

Fbn Прямой праймер TGGAATCCGGGAGCTTTTC 58°С

Обратный праймер TGCAAGGCAACCACACTGA

Та§Мап зонд FAM-AGCTGCAGGGCCTCAGGCCG-BHQ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Получение гибридных клеток между ЭСК и диплоидными фибробластами

Было проведено два независимых эксперимента по слиянию ЭСК с эмбриональными фибробластами и с фибробластами, полученными из взрослых животных ("взрослыми" фибробластами). На 8-10 день после слияния клеток мы наблюдали появление 19-ти ГАТ- и пуромицин-резистентных колоний клеток в экспериментах по слиянию ЭСК с эмбриональными фибробластами и 31-й колонии в опытах по слиянию ЭСК со "взрослыми" фибробластами. Все 50 колоний были морфологически сходными с колониями ЭСК. На 15-18 день после слияния для дальнейшего культивирования были пересажены 19 колоний гибридных клеток типа ЭСК-эмбриональные фибробласты (серия 1е£) и 24 колонии типа ЭСК-"взрослые" фибробласты (серия 1а£). В процессе культивирования многие первичные клоны гибридных клеток спонтанно

дифференцировались, в результате чего удалось получить 4 стабильные клеточные линии из 19 клонов серии tef и 11 линий из 31 первичного клона серии 1а£

Гибридные клетки всех клонов, полученных от слияния диплоидных эмбриональных или "взрослых" фибробластов с ЭСК, имели фенотип, типичный для ЭСК: формировали компактные колонии с четкими границами, состоящие из небольших по размеру округлых клеток с малым объемом цитоплазмы (рис. \А, Г). Важно отметить, что во всех полученных клонах гибридных клетках серий 1еГ и 1аГ был обнаружен зеленый белок - маркер родительской линии ЭСК (рис. 1 Б,

Рис. 1. Морфология ЭСК, фибробластов и гибридных клеток типа ЭСК-диплоидные фибробласты. Культура ЭСК, линия E14Tg2aSc4TP6.3 (А) (фазовый контраст), иммунофлуоресцентное свечение зеленого белка и ядер, окрашенных DAPI в родительской линии ЭСК (Б); иммунофлуоресцентное выявление цитоскелета ЭСК с помощью фаллоидина, меченого флуорохромом Alexa Fluor 546 и ядер, окрашенных DAPI (В); культура гибридных клеток типа ЭСК-диплоидные фибробласты, клон tef4 (Г) (фазовый контраст), иммунофлуоресцентное свечение зеленого белка и ядер, окрашенных DAPI в гибридных клетках клона tef4 (Д), иммунофлуоресцентное выявление цитоскелета клеток клона tef4 с помощью фаллоидина и ядер, окрашенных DAPI (£); иммунофлуоресцентное выявление цитоскелета фибробластов с помощью фаллоидина и ядер, окрашенных DAPI (Ж);

Хромосомный состав гибридных клеток типа ЭСК-диплоидные фибробласты

В гибридных клетках часто наблюдается потеря хромосом (сегрегация) одного из партнеров по слиянию. Потенциально потеря хромосом одного из родителей может быть причиной преимущественного проявления в гибридной клетке свойств того родительского генома, который сохраняет полный набор хромосом. После слияния двух диплоидных клеток (2п=40) ожидается, что кариотип гибридной клетки будет представлять собой сумму двух родительских наборов хромосом. В случае потери родительских хромосом следует ожидать отклонение от ожидаемого числа хромосом (80-ти). Подсчет хромосом в 15-ти клонах гибридных клеток серий tef и taf показал, что в 9-ти из них клетки содержали около-тетраплоидный набор хромосом (рис. 2А, Б), а в шести клонах (tel'6, taf4, tafl5, taf 16, taf20, tai23) - около-гексаплоидный набор (рис. 2Д Г). Среди 9-ти около-тетраплоидных клонов первой категории в 5-ти клонах 42-85% клеток содержали 76 - 80 хромосом, а в 4-х клонах большинство клеток

содержали 70 - 76 хромосом. Гибридные клетки с около-гексаплоидным набором хромосом, предположительно, возникли в результате слияния двух ЭСК с одним фибробластом или, наоборот, одной ЭСК с двумя фибробластами. Возможность слияния двух ЭСК с одним фибробластом может объясняться высокой склонностью ЭСК в суспензии образовывать ассоциации из двух и более клеток из-за своих высоких адгезивных свойств.

Рис. 2. Числа хромосом в гибридных клетках серий tef и taf: tef4 (A), taf2 (Б); tef6 (В), tafl5 (Г). По оси абсцисс показано число хромосом, по оси ординат -процент клеток, содержащих данное число хромосом, N - число анализированных метафазных пластинок.

Таким образом, большинство клеток клонов серий tef и taf содержит около-тетраплоидный или около-гексаплоидный набор хромосом, что указывает На отсутствие заметной сегрегации хромосом в клетках. Методы цитогенетического анализа не позволяют идентифицировать родительскую принадлежность хромосом в полученных гибридных клетках, поскольку родительские клетки происходили из мыши линий DD/c (донор фибробластов) и 129/01а (донор ЭСК), принадлежащих к одному виду M. mus cuius. В связи с этим, для дискриминации родительских хромосом в гибридных клетках использовали ПЦР-анализ молекулярных маркеров - микросателлитов. Для проведения ПЦР-анализа гибридных клеток серий tef и taf была подобрана группа микросателлитов, надежно дискриминирующих гомологичные хромосомы линий мышей 129 и DD, за исключением хромосом 11 и X. Вывод о наличии той или иной родительской хромосомы в гибридных клетках был

основан на присутствии или отсутствии микросателлита, специфичного для того или иного гомолога. Результаты микросателлитного анализа показали, что в гибридных клетках всех клонов серий tef и taf присутствуют микросателлиты, маркирующие все родительские хромосомы, за исключением микросателлита D14Mit38 хромосомы 14 соматического партнера в клонах tef3 и taf4. При цитогенетическом анализе не было обнаружено видимых хромосомных перестроек ни в одном из полученных клонов гибридных клеток. Для более надежной идентификации хромосомных перестроек в клонах, мы провели эксперименты по гибридизации in situ с использованием меченых дигоксигенин-или ФИТЦ- зондов, специфичных для хромосом X, 4, 6 и 17. Хромосомных фрагментов анализированных хромосом ни в одном исследованном клоне гибридных клеток обнаружено не было.

Характеристика гибридных клеток типа ЭСК-диплоидные фибробласты

Гибридные клетки серий taf и tef имеют выраженное морфологическое сходство с ЭСК. Это сходство проявляется также в организации f-акгинового цитоскелета (рис. 1Д Е, Ж). Высокая активность фермента щелочной фосфатазы (ЩФ) является наиболее характерной особенностью недифференцированных плюрипотентных клеток. Процент позитивных по активности фермента колоний в клонах гибридных клеток, в среднем, составил 70-90%.

Н Oct4 (RQ) ■ Nanog (RQ)

1,8 т-1,6 — 1,4

tefâ Îef4 teffi Îef9 taf2 taf4 taf5 tafB taf10 taf 15 taf 16 taf20 taf22 taf23 taf31 ESC

Рис. 3. Количественная оценка экспрессии генов Oct4 и Nanog в клонах гибридных клеток типа ЭСК-диплоидные фибробласты с помощью метода ПЦР-РВ. По оси абсцисс указаны названия клонов гибридных клеток, по оси ординат - уровень экспрессии анализированных генов в клонах по отношению к уровню экспрессии в родительской линии ЭСК (ESC) (Relative Quantification -RQ).

Важнейшей характеристикой ЭСК является плюрипотентность, поддерживаемая активностью двух ключевых генов: Oct4 и Nanog. Экспрессия

этих генов в гибридных клетках серий taf и tef была исследована двумя способами - иммунофлуоресцетным анализом белковых продуктов в клетках и количественной оценкой экспрессии с использованием метода ПЦР-РВ. По результатам иммунофлуоресцентного анализа, в полученных гибридных клетках присутствуют белковые продукты генов Oct4 и Nanog. Во всех клонах гибридных клеток, полученных при слиянии ЭСК и диплоидных фибробластов, обнаружена экспрессия генов Oct4 и Nanog. Уровень экспрессии Oct4 во всех клонах гибридных клеток сопоставим с уровнем экспрессии в ЭСК (рис. 3).

Суммируя приведенные выше данные, можно сделать вывод о том, что все проанализированные гибридные клетки серий taf и tef имеют характеристики, по многим параметрам сходные с ЭСК, но значительно отличаются по своим фенотшшческим свойствам от эмбриональных и "взрослых" фибробластов.

Анализ хромосомного состава клеточных культур, полученных из тканей химерных эмбрионов или взрослых химер

Наиболее полным и адекватным методом irt vivo оценки потенциала ЭСК является их введение в бластоцисту и получение химерных животных, с последующим анализом вклада исследованных клеток в органы и ткани животного. Наличие в гибридных клетках серий taf и tef цитоплазматического маркера, зеленого белка, значительно упрощает анализ вклада гибридных клеток в ткани химер. Однако при использовании теста на химеризм для оценки уровня плюрипотентности гибридных клеток возникает вопрос: сохраняется ли исходный кариотип тестируемых гибридных клеток в ходе развития химерных животных? Можно предположить, что вклад гибридных клеток в ткани химерного животного является результатом потери хромосом соматического партнера из генома гибридных клеток после их инъекций в реципиентную бластоцисту. Работы по получению химерных животных были проведены сотрудниками лаборатории генетики развития ИЦиГ СО РАН: Кизиловой Еленой Александровной, Железовой Антониной Ивановной и Голубицей Алевтиной Николаевной. Для экспериментов по микроинъекциям было отобрано пять клонов гибридных клеток: tef4, tef9, taf2, taf5, taOl, содержащих 76-80 хромосом в 85%, 70%, 80%, 82% и 46% клеток соответственно. В этих экспериментах было получено 21 взрослое химерное животное и 9 химерных эмбрионов (на 11-й день внутриутробного развития). В задачу эксперимента входило: 1) получение клеточных культур из химерных эмбрионов и взрослых химер; 2) проведение цитогенетического анализа полученных клеточных культур; 3) проведение анализа микросателлитов, маркирующих хромосомы мышей линий: 129 (донор ЭСК), DD (донор фибробластов) и C57BL (донор реципиентных бластоцист) в клетках полученных кулыур; 4) анализ микросателлитов, маркирующих родительские хромосомы гибридных клеток, в популяции "зеленых" клеток (потомков гибридных клеток), отсортированных из селезенки химерного животного.

Было исследовано два взрослых химерных животных, полученных после введения клеток клона tef4 в бластоцисты, одно животное, полученное после введения клеток клона taf2, и пять 11-дневных эмбрионов, полученных при введении клеток клона taf5. Таким образом, мы исследовали хромосомный

состав клеточных потомков 3-х тестированных плюрипотентных клонов гибридных клеток, способных давать развитие химерам.

В качестве источника материала для получения препаратов метафазньтх хромосом, а также проведения ПЦР анализа использовали культуры клеток, полученных из кожи взрослых животных или целых эмбрионов. Для некоторых химер (1еГ4#7-38) было возможно получение клеточного материала из селезенки и анализ клеточной суспензии проводился после сортировки клеток по наличию зеленого белка на проточном цитофлуориметре. Однако, применение данного метода оказалось ограниченным из-за очень малого вклада гибридных клеток в селезенку других химерных животных, менее 2% позитивных по "зеленому белку" клеток (химера 1а12#7-35).

Для проведения ПЦР анализа хромосомного состава клеточных культур, полученных из тканей химерных животных, была подобрана группа микросателлитов, достоверно маркирующих три генома: два генома, присутствующих в вводимых в бластоцисты гибридных клетках-линии ЭБ/с и 129/01а, и геном реципиентной бластоцисты - линия мышей С57В1. Из-за отсутствия значительного полиморфизма длин ПЦР продуктов хромосомо-специфичных микросателлитов не удалось маркировать хромосомы 8, 11, 14, 19, X всех трех генотипов.

Ы5#6, N=46

ШМУ-Ж, N=12

Рис. 4. Распределение хромосом в культурах клеток, полученных из химерных животных 1е£4#7-38 (А), га{5#6 (Е). По оси абсцисс отложено число хромосом, по оси ординат - процент клеток, содержащих данное число хромосом, Ы-число анализированных метафазных пластинок

По результатам анализа, в селезенке химерного животного (1еГ4#7-38), полученного при введении в реципиентную бластоцисту клеток клона присутствуют ПЦР продукты всех хромосомо-специфичных микросателлитов обеих родительских линий, кроме ПЦР продукта 18-й хромосомы 129/01а. Подсчет хромосом в культуре клеток, полученных из кожи данного животного (не менее 50% клеток, позитивных по зеленому белку), показал наличие 72-76 хромосом в 59% клеток (рис. 4А).

результатам анализа хромосомного состава культур клеток, выявлены маркеры практически всех хромосом обеих родительских клеток, участвовавших в слиянии - линии ББ/с и 129/01а. Исключение составляют: в химере #1 -хромосома 18 (129/01а), в химере #3 - хромосомы 4 и 12 (ББ/с), в химере #5 -хромосома 18 (129/01а) и в химере #6 - хромосома 12 (ББ/с) и хромосома 18 (129/01а) (Таблица 2). Подсчет хромосом в клетках культур эмбриональных фибробластов показал, что около 50% клеток содержит 74-78 хромосом (рис. 3Б). Таким образом, полученные около-тетраплоидные гибридные клетки обладают свойствами ЭСК, включая способность давать вклад в ткани химерных животных, сохраняя при этом хромосомный состав, сходный с кариотипом инъецированных гибридных клеток.

Фенотип гибридных клеток типа ЭСК-тетраплоидные фибробласты

При слиянии тетраплоидных фибробластов с диплоидными ЭСК было получено 11 клонов гибридных клеток. Все гибридные клетки данного типа имели фенотип, типичный для фибробластов (рис. 5.4, Г). Полученные гибридные клетки, в отличие от ЭСК, растущих компактными колониями, не образовывали подобных клеточных островков.

Рис. 5. Морфология клеток линии тетраплоидных фибробластов и гибридных клеток типа ЭСК-тетраплоидные фибробласты. Культура растущих тетраплоидных фибробластов (А) (фазовый контраст), отсутствие флуоресцентного свечения зеленого белка в линии тетраплоидных фибробластов (Б), иммунофлуоресцентное выявление цитоскелета тетраплоидных фибробластов с помощью фаллоидина, меченого флуорохромом ФИТЦ и ядер, окрашенных БАР1 (В); Культура растущих гибридных клеток типа ЭСК-тетраплоидные фибробласты, клон tef-t8 (Г) (фазовый контраст), флуоресцентное свечение зеленого белка в цитоплазме гибридных клеток tef-t8 (Д), иммунофлуоресцентное выявление цитоскелета клеток клона tef-t8 с помощью фаллоидина, меченого флуорохромом Alexa Fluor 546 и ядер, окрашенных Б API (Е).

Во всех клегках наблюдали флуоресцентное свечение зеленого белка (рис. 5Б, Д) и отсутствие активности фермента ЩФ. Кроме этого, стоит отметить схожую организацию f-актинового цитоскелета у гибридных клеток типа ЭСК-

Таблица 2. Распределение хромосомо-специфичных микросателлитов в культурах клеток, полученных из эмбрионов или взрослых химерных животных

Взрослые химерные животные и химерные эмбрионы, доноры клеточных культур

Маркер

tef4#7-38 1аШ7-35 Ы5ПЗ М5#4 Ы5#5

129 БО 129 ОБ 129 129 00 129 00 129 00 129 00

01'Мк2002 + + + + + + + + + + + + + +

02Мк9 + + + + + + + + + + + + + +

БЗШ257 + + + + + + + + + + + + + +

Б4Ш11 + + + + + + + - + + + + + +

05МИ346 + + + + + + + + + + + + +

06М1Ш1 + + + + + + + + + + + + + +

07Мк309 + + + + + + + + + + + + + +

09Мк181 + + + + + + + + + + + + + +

Ш0Мк109 + + + + + + + + + + + + + +

012МИ270 + + + + + + + - + + + + + -

013Мк78 + + + + + + + + + + + + + +

015МИ14 + + + + + + + + + + + + + +

016МИ4 + + + + + + + + + + + + + +

017МИ66 + + + + + + + + + + + + + +

018МЮ6 - + + + - + + + + + - + - +

1 - номер хромосомы, на которой локализован микросателлит;

2 - индивидуальный номер микросателлита; 129 - линия мышей 129/01а (источник ЭСК);

ОБ - линия мышей ОБ/с (источник фибробластов);

1еГ4, гаГ5 - гибридные клоны, из клеток которых получещл химерные животные;

#7-35, #7-38, #1, #3, #4, #5, #6 - индивидуальные номера химерных животных; (+) - присутствие хромосомо-специфичного микросателлита; (-) - отсутствие хромосомо-специфичного микросателлита;

В клетках культур (не менее 50% клеток, позитивных по зеленому белку) из кожи взрослого химерного животного (1аО#7-35), полученного при введении в бластоцисту гибридных клеток клона 1аС, так же присутствуют микросателлитные маркеры всех хромосом обоих родительских линий. Кроме этого, источником для клеточных культур были пять 11-дневных химерных эмбрионов (50-70% клеток культуры, позитивных по зеленому белку), полученных при введении в бластоцисту клеток гибридного клона 1а£5. По

тетраплоидные фибробласты и фибробластов (рис. 4Д £). Как в исходных фибробластах, так и в гибридных клетках этого типа, каждая отдельная клетка обладает хорошо организованным каркасом, состоящим из пучков ориентированных нитей f-актина (рис. 4В, Е).

Таким образом, гибридные клетки, полученные при слиянии ЭСК с диплоидными фибробластами, имели морфологию ЭСК, а при слиянии с тетраплоидными фибробластами - фибробласта.

Хромосомный состав клоиов типа ЭСК-тетраплоидные фибробласты

При слиянии диплоидных ЭСК (40 хромосом) с тетраплоидными фибробластами (80 хромосом), ожидаемое количество хромосом в гибридной клетке- 120. Подсчет числа хромосом показал присутствие от 105 до 120 хромосом во всех клонах гибридных клеток, причем доля таких клеток в большинстве гибридных клонов составила от 72% до 94% (рис. 6). Цитогенетический анализ не выявил видимых хромосомных перестроек ни в одном из полученных клонов. П1ДР анализ полиморфных микросателлитов, маркирующих родительские хромосомы, показал присутствие маркеров всех хромосом обоих партнеров во всех гибридных клонах серии tef-t, за исключением хромосомы 18 плюрипотентного партнера в клоне tef-t4.

Рис. 6. Распределение чисел хромосом в клонах гибридных клеток ГеГ-П (А) и 1е£-110 (Б). По оси абсцисс отложено число хромосом, по оси ординат - процент клеток, содержащих данное число хромосом, N - число анализированных метафазных пластинок

Анализ экспрессии маркерных генов ЭСК и фибробластов в гибридных клетках типа ЭСК-тетраплоидные фибробласты

Во всех клонах гибридных клеток, полученных при слиянии ЭСК и тетраплоидных фибробластов, обнаружена экспрессия генов коллагена и фибронектина (рис. 7), при этом экспрессия генов Осг4 и Nanog не обнаружена ни в одном из полученных клонов гибридных клеток.

В заключении хотелось бы отметить, что гибридные клетки типа ЭСК-диплоидные фибробласты не только имеют схожую с ЭСК морфологию, но обладают и другими свойствами, характерными для плюрипотентных клеток: высоким уровнем активности ЩФ, экспрессией транскрипционных факторов ОШ и Nanog, способность давать вклад в органы и ткани химерных животных.

Гибридные клетки типа ЭСК-тетраплоидные фибробласты имеют морфологию и свойства, типичные для линии родительских фибробластов, и экспрессируют гены-маркеры фибробластов - коллаген 1-го типа и фибронектин. Кроме этого, хотелось бы отметить, что клоны гибридных клеток обладают свойствами, типичными для исходной линии тетраплоидных фибробластов или ЭСК на фоне присутствия всех хромосом соответственно плюрипотентного или соматического партнеров. Уровни экспрессии генов-маркеров в большинстве клонов гибридных клеток сопоставимы или выше уровня экспрессии в родительских клетках. Межклональную вариабельность в экспрессии генов-маркеров можно объяснить как разным числом копий анализируемых генов, так и разным уровнем экспрессии генов в клетках клонов. Например, уровень экспрессии может различаться из-за разного уровня метилирования промоторов анализируемых генов. Изменение числа копий генов, и, как следствие, разный уровень экспрессии, может происходить при сегрегации хромосом, на которых гены-маркеры расположены.

[Й?Ьп_1 ■""СоГ_1

14 7--------

!

1 3 4 7 8 9 10 12 18 22 27 tDD

Рис. 7. Экспрессия генов фибронектина (Fbnl) и коллагена 1-го типа (Col l) в тетраплоидных фибробластах (tDD) и клонах гибридных клеток типа ЭСК-тетраплоидные фибробласты с помощью метода ПЦР-РВ. На оси абсцисс обозначены номера клонов гибридных клеток серии tef-t и линия тетраплоидных фибробластов tDD, на оси ординат - уровень экспрессии анализированных генов в клонах по отношению к уровню экспрессии в родительской линии тетраплоидных фибробластов (Relative Quantification - RQ).

В данной работе впервые показано доминирование фенотипа соматического партнера в гибридных клетках, полученных при слиянии ЭСК и соматических клеток. Решающим фактором, влияющим на альтернативное проявление свойств фибробласта или ЭСК в гибридных клетках, является плоидность соматического партнера, однако причины альтернативного

доминирования на данный момент остаются неизвестными. Для выявления регуляторяых механизмов, приводящих к альтернативному проявлению родительских геномов необходимо дальнейшее более детальное исследование генома полученных гибридных клеток.

ВЫВОДЫ

1. При слиянии диплоидных эмбриональных стволовых клеток мыши с диплоидными эмбриональными фибробластами получено 4 клона гибридных клеток, при слиянии диплоидных ЭСК с диплоидными фибробластами, полученными из взрослой мыши - 11 клонов гибридных клеток. Цитогенетический анализ и анализ микросателлитов, маркирующих родительские хромосомы, показали, что в большинстве клонов гибридных клеток сохраняются хромосомные наборы обеих линий родительских клеток.

2. Гибридные клетки, полученные при слиянии эмбриональных стволовых клеток мыши с диплоидными фибробластами, имели морфологию и свойства, типичные для эмбриональных стволовых клеток: высокую активность щелочной фосфатазы, сопоставимый с эмбриональными стволовыми клетками уровень экспрессии генов Ос14 и Nanog, и сходную с эмбриональными стволовыми клетками организацию Гактинового цитоскелета.

3. Впервые установлено, что в тесте на химеризм, применяемом для оценки плюрипотентности, около-тетраплоидный набор хромосом тестируемых гибридных клеток, полученных при слиянии диплоидных эмбриональных стволовых клеток с диплоидными фибробластами, сохраняется при развитии химерных животных.

4. При слиянии тетраплоидных фибробластов с диплоидными эмбриональными стволовыми клетками было получено 11 независимых клонов гибридных клеток. Цитогенетический анализ показал, что все клоны содержали около-гексаплоидный набор хромосом и микросателлиты, маркирующие большинство хромосом обеих линий родительских клеток.

5. Все клоны гибридных клеток, полученных при слиянии тетраплоидных фибробластов с диплоидными эмбриональными стволовыми клетками, имели морфологию и свойства, типичные для фибробластов: сходную организацию ^актинового цитоскелета, отсутствие активности щелочной фосфатазы, высокий уровень экспрессии генов коллагена 1-го типа и фибронектина и полное отсутствие экспрессии генов Ос14 и Nanog.

6. Впервые описано альтернативное проявление родительских геномов в гибридных клетках: доминирование генома ЭСК в клетках типа диплоидные ЭСК-диплоидные фибробласты и, наоборот, доминирование генома фибробласта в клетках типа диплоидные ЭСК-тетраплоидные фибробласты. Таким образом, альтернативное проявление родительских геномов в исследованных гибридных клетках определялось плоидностыо соматического партнера.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Пристяжнюк И.Е., Темирова С.А., Мензоров А.Г., Круглова A.A., Матвеева Н.М., Серов О.Л. Видимая и «скрытая» сегрегация родительских хромосом в эмбриональных стволовых гибридных клетках // Онтогенез. 2005. Т. 36, №2. С. 151-158.

2. Круглова A.A., Гридина М.М., Матвеева Н.М., Серов О.Л. Гибридные клетки, полученные слиянием эмбриональных стволовых клеток с ди- и тетраплоидными фибробластами, имеют альтернативные родительские фенотипы // Докл. Акад. Наук. 2008. Т. 422. №1. С. 125-127.

3. Kruglova A.A., Kizilova Е.А., Zhelezova A.I., Gridina M.M., Golubitsa A.N.,Serov O.L. Embryonic stem cell-fibroblast hybrid cells with near-tetraploid karyotype provide high yield of chimeras // Cell Tissue Res. 2008. D0110.1007/s00441-008-0702-9

4. Kruglova A.A., Gridina M.M., Matveeva N.M., Serov O.L. Phenotype and chromosome segregation in hybrid cells generated by fusion embryonic stem cells and tetraploid fibroblasts // IV International Meetings Stem Cells Network North Rhine-Westphalia. Düsseldorf. 8-9 October. Germany. J. Regenerative Medicine. Nov. 2007. Vol.2. No. 6. P.S8.

5. Gridina M.M., Kruglova A.A., Matveeva N.M., Serov O.L. Alternative dominance of parental genomes in embryonic stem cell-fibroblast cell hybrids // Abstracts of papers presented at the LXXIII Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. Control and regulation of stem cell. 28 May- 2 June. Cold Spring Harbor, USA. P.71

6. Матвеева H.M., Круглова A.A., Гридина М.М., Кизилова Е.А., Батгулин Н.Р., Пузаков М.В., Серов О.Л. Доминантность и рецессивность родительских геномов в гибридных клетках, полученных слиянием диплоидных эмбриональных стволовых клеток с ди- и тетраплоидными фибробластами // 3rd International Conference Basic Science for Medicine. Новосибирск. 2007. С. 66.

7. Круглова A.A., Гридина M.M., Мензоров А.Г., Матвеева Н.М., Серов О.Л. Фенотип гибридных клеток, полученных при слиянии эмбриональных стволовых клеток и тетраплоидных фибробластов // Цитология. Тезисы докладов. Санкт-Петербург. 2007. Т. 49, № 9. С. 762.

8. Круглова A.A., Гридина М.М., Матвеева Н.М., Серов О.Л. Влияние плоидности соматического партнера на фенотип гибридных клеток, полученных при слиянии с эмбриональными столовыми клетками. Тезисы международной научной конференции молодых ученых "Проблемы молекулярной и клеточной биологии". Томск. 10-12 мая. 2007. С. 106-107.

9. Мензоров А.Г., Круглова A.A., Матвеева Н.М., Серов О.Л. Сегрегация хромосом и митохондрий в межвидовых эмбриональных гибридных клетках мыши. Труды 3-го съезда ВОГиС. Москва. 6-12 июня 2004. Т. 2. С. 403.

10. Мензоров А.Г., Круглова A.A., Темирова С.А., Серов О.Л. Характеристика ядерного и митохондриального геномов во внутри- и межвидовых эмбриональных стволовых гибридных клетках мыши // VI Международная конференция по молекулярной генетике соматических клеток. Звенигород. Москва. 2005. С. 99-100.

Подписано к печати 20.11. 2008 г.

Формат бумаги 60 х 90 1/16. Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0,7.

Тираж 100 экз. Заказ 143.

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Круглова, Анна Александровна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Гибридизация клеток как способ изучения взаимодействия геномов.

1.1.1. Гетерокарионы как модель изучения взаимодействий ядер разного типа.

1.1.2. Гибридные клетки как модель изучения взаимодействия объединенных геномов.

1.1.3. Соматические гибридные клетки, полученные при слиянии клеток с разной плоидностью.

1.2. Свойства стволовых клеток эмбрионального происхождения и получение гибридных клеток между ними и соматическими клетками.

1.2.1. Характеристика стволовых клеток эмбрионального происхождения.

1.2.2. Дифференцировка стволовых клеток эмбрионального происхождения in vivo и in vitro.

1.2.3. Гибридные клетки между соматическими и стволовыми клетками.

1.2.4. Получение химерных животных с участием гибридных клеток ЭСК-соматическая клетка как метод in vivo оценки их потенциала.

1.2.5. Репрограммирование генома соматического партнера в гибридных клетках типа ЭСК -соматическая клетка.

1.3. Хромосомный состав гибридных клеток.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Клетки и клеточные линии.

2.2. Условия культивирования клеток.

2.3. Получение и культивирование клеточных культур и гибридных клеток.

2.3.1. Получение культур первичных эмбриональных фибробластов.

2.3.2. Получение линии тетраплоидных фибробластов мыши.

2.3.3. Получение культуры фибробластов из органов и тканей взрослого животного.

2.3.4. Получение гибридных клеток.

2.3.5. Культивирование эмбриональных стволовых клеток и клонов гибридных клеток типа ЭСК-диплоидные фибробласты.

2.3.6. Культивирование фибробластов и гибридных клеток ЭСК-тетраплоидные фибробласты.

2.4. Анализ маркеров ЭСК в гибридных клетках.

2.4.1. Оценка активности щелочной фосфатазы.

2.4.2 Иммунофлуоресцентный анализ Nanog, Oct4, коллагена 1-го типа (Со/-/) и фибронектина (Fbn) в ЭСК, фибробластах и гибридных клетках.

2.4.3. Анализ экспрессии генов Oct4, Nanog, Coll и Fbn с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ).

2.4.3.1. Выделение РНК.

2.4.3.2. Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ).

2.5 Идентификация родительских хромосом в клонах гибридных клеток.

2.5.1. Анализ хромосомного состава с помощью микросателлитных маркеров.

2.5.1.1. Выделение ДНК.

2.5.1.2. ПЦР-анализ микросателлитных маркеров.

2.5.2. Приготовление препаратов метафазных хромосом и подсчет хромосом в клетках.

2.5.3. In situ гибридизация с хромосомоспецифическими пробами.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1 Получение гибридных клеток типа ЭСК-диплоидные фибробласты.

3.2. Хромосомный состав клонов типа ЭСК-диплоидные фибробласты.

3.3.Характеристика гибридных клеток типа диплоидные ЭСК-диплоидные фибробласты.

3.4. Хромосомный и микросателлитный анализы клеточных культур, полученных из тканей химерных эмбрионов или взрослых химер.

3.5. Фенотип гибридных клеток типа ЭСК-тетраплоидные фибробласты.

3.6. Хромосомный состав клонов типа ЭСК-тетраплоидные фибробласты.

3.7. Анализ экспрессии маркерных генов ЭСК и фибробластов в гибридных клетках типа ЭСК-тетраплоидные фибробласты.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Проявление родительских геномов в гибридных клетках, полученных слиянием диплоидных эмбриональных стволовых клеток с ДИ- и тетраплоидными фибробластами"

Актуальность. Изучение природы такого свойства генома эмбриональных клеток, как плюрипотентность, является одной из важнейших задач современной биологии развития. Остаются не выясненными механизмы контроля над поддержанием или утратой плюрипотентности в ходе эмбрионального развития. Кроме этого, оставались не выясненными масштабы изменения генома плюрипотентной клетки при дифференцировке и возможность обратимости данных изменений. К настоящему времени разработано несколько экспериментальных подходов к репрограммированию соматического генома до плюрипотентного уровня. Например, с помощью переноса ядер соматических клеток в энуклеированный ооцит или оплодотворенную яйцеклетку (Di Berardino, 1997; Wilmut et al., 1997; Wakayama et al., 1998), или путем слияния эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) с соматическими клетками взрослого животного (Матвеева и др., 1996; Matveeva et al., 1998; Tada et al., 2001; Serov et al., 2001; Ambrosi, Rasmussen, 2005). Такие гибридные клетки обладают всеми свойствами эмбриональных стволовых клеток, не зависимо от того, какие соматические клетки участвовали в слиянии (Tada et al., 2001; 2003; Terada etal., 2002; Ying et al., 2002; Cowan et al., 2005). Высокий потенциал гибридных клеток типа ЭСК-соматическая клетка подразумевает доминирование плюрипотентности - ключевого свойства ЭСК. В основе доминирования лежит репрограммирование генома соматического партнера. Свидетельства репрограммирования аллелей соматического партнера для целого ряда генов были найдены в гибридах, полученных от слияния ЭСК Mus musculus domesticus и тимоцитов M. musculus molossinus (Tada etal., 2001; 2003;). Прямые доказательства масштабного репрограммирования генома соматического партнера (фибробласта) и связанного с этим изменения профиля экспрессирующихся генов (свыше 99%) по типу ЭСК были получены с помощью микрочиповой технологии при анализе гибридов ЭСК человека с фибробластами (Cowan et al., 2005). Сохранение стабильного кариотипа при длительном культивировании ЭСК и их плюрипотентный потенциал делает модель гибридных клеток, полученных при участии ЭСК и соматических клеток, привлекательной для изучения репрограммирования и свойств полученных гибридных клеток. Причины доминирования свойств ЭСК на данный момент не выяснены, поэтому крайне важно установить факторы, влияющие на доминирование плюрипотентности в гибридных клетках. Однако при этом следует особо отметить, что для изучения возможных молекулярных механизмов поддержания плюрипотентности в гибридном геноме и репрограммирования генома соматического партнера, необходимо знать хромосомный состав гибридных клеток, поскольку данные о хромосомном составе гибридных клеток носят противоречивый характер. Согласно данным одних авторов (Tada et al., 2001; 2003; Terada et al., 2002; Ying et al., 2002), гибридные клетки мыши типа ЭСК-дифференцированные клетки сохраняют тетраплоидный набор хромосом, появившийся в результате слияния двух диплоидных клеток, то есть признаки сегрегации хромосом отсутствуют. По данным других авторов, полученным при цитогенетическом анализе гибридных клеток типа ЭСК-спленоциты, имеет место отчетливая преимущественная элиминация хромосом спленоцитов (Matveeva et al., 1998; Матвеева и др., 2001; Серов и др., 2003; Пристяжнюк и др., 2005). В связи с этим актуальность полноценного анализа хромосомного состава гибридных клеток, который позволит избежать ошибок в интерпретации масштабов репрограммирования, трудно переоценить.

Одним из наиболее адекватных способов оценки потенциала плюрипотентных клеток является получение химерных животных при введении клеток в полость бластоцисты. Исследование химерных животных, полученных введением тетраплоидных гибридных клеток в реципиентные бластоцисты, показало лишь незначительный вклад гибридных клеток в органы и ткани химерного животного (Tada et al., 2001). Имеются сообщения о рождении двух химерных животных, полученных при введении около-тетраплоидных плюрипотентных клеток, однако необходимо отметить, что в данных работах нет доказательств получения химерных животных именно из таких клеток, так же как и доказательств сохранения исходного кариотипа клеток при развитии химерного животного (Ying et al., 2002; Pells et al., 2002). Таким образом, в данной работе впервые будет проведен анализ хромосомного состава потомков около-тетраплоидных гибридных клеток, давших вклад в органы и ткани химерного животного, что позволит однозначно ответить на вопрос, связан ли плюрипотентный потенциал вводимых гибридных клеток с репрограммированием дифференцированных хромосом или с их утерей.

Цели и задачи исследования. При выполнении работы преследовалась следующая цель: исследовать влияние плоидности соматического партнера на морфологию и свойства гибридных клеток, полученных при слиянии эмбриональных стволовых клеток мыши с ди- и тетраплоидными фибробластами.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить гибридные клетки между ЭСК Mus musculus линии 129/Ola и диплоидными фибробластами Mus musculus линии DD/c;

2. Получить гибридные клетки между ЭСК M musculus линии 129/Ola и тетраплоидными фибробластами M. musculus линии DD/c;

3. Сравнить уровень экспрессии генов Oct4 и Nanog (экспрессия которых типична для ЭСК), коллагена 1-го типа и фибронектина (экспрессия которых типична для фибробластов) в полученных клонах гибридных клеток методом ПЦР в реальном времени;

4. Провести анализ хромосомного состава гибридных клеток типа ЭСК-диплоидные фибробласты и ЭСК-тетраплоидные фибробласты цитогенетическими методами, а также используя микросателлитные маркеры для идентификации родительских хромосом;

5. Исследовать хромосомный состав потомков гибридных клеток (полученных слиянием ЭСК и диплоидных фибробластов) с около-тетраплоидным набором хромосом, давших вклад в органы и ткани химерных животных.

Научная новизна и практическая значимость.

1. Впервые показано доминирование фенотипа соматического партнера в гибридных клетках, полученных при слиянии ЭСК и тетраплоидных фибробластов.

2. Впервые показано сохранение исходного кариотипа у потомков гибридных клеток с около-тетраплоидным набором хромосом в химерных животных при in vivo оценке их плюрипотентных свойств.

Апробация работы и публикации.

Результаты работы были представлены на II конгрессе общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2007), IV International Meeting Stem Cell Network North Rhine-Westphalia (Дюссельдорф, 2007), 3rd International Conference Basic Science for Medicine (Новосибирск, 2007), LXXIII Cold Spring Harbor Symosium on Quantitative Biology (Колд Спринг Харбор, 2008).

Материалы диссертации изложены в трех статьях, опубликованных в отечественных и международном журналах.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, 4-х глав, выводов, списка литературы и 3-х приложений. Работа изложена на 102-х страницах, иллюстрирована 12-ю рисунками и содержит 8 таблиц

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Круглова, Анна Александровна

ВЫВОДЫ

1. При слиянии диплоидных эмбриональных стволовых клеток мыши с диплоидными эмбриональными фибробластами получено 4 клона гибридных клеток, при слиянии диплоидных ЭСК с диплоидными фибробластами, полученными из взрослой мыши - 11 клонов гибридных клеток. Цитогенетический анализ и анализ микросателлитов, маркирующих родительские хромосомы, показали, что в большинстве клонов гибридных клеток сохраняются хромосомные наборы обеих линий родительских клеток.

2. Гибридные клетки, полученные при слиянии эмбриональных стволовых клеток мыши с диплоидными фибробластами, имели морфологию и свойства, типичные для эмбриональных стволовых клеток: высокую активность щелочной фосфатазы, сопоставимый с эмбриональными стволовыми клетками уровень экспрессии генов Ос14 и Nanog, и сходную с эмбриональными стволовыми клетками организацию 1-актинового цитоскелета.

3. Впервые установлено, что в тесте на химеризм, применяемом для оценки плюрипотентности, около-тетраплоидный набор хромосом тестируемых гибридных клеток, полученных при слиянии диплоидных эмбриональных стволовых клеток с диплоидными фибробластами, сохраняется при развитии химерных животных.

4. При слиянии тетраплоидных фибробластов с диплоидными эмбриональными стволовыми клетками было получено 11 независимых клонов гибридных клеток. Цитогенетический анализ показал, что все клоны содержали около-гексаплоидный набор хромосом и микросателлиты, маркирующие большинство хромосом обеих линий родительских клеток.

5. Все клоны гибридных клеток, полученных при слиянии тетраплоидных фибробластов с диплоидными эмбриональными стволовыми клетками, имели морфологию и свойства, типичные для фибробластов: сходную организацию Г-актинового цитоскелета, отсутствие активности щелочной фосфатазы, высокий уровень экспрессии генов коллагена 1-го типа и фибронектина и полное отсутствие экспрессии генов ОШ и Nanog.

6. Впервые описано альтернативное проявление . родительских геномов в гибридных клетках: доминирование генома ЭСК в клетках типа диплоидные ЭСК-диплоидные фибробласты и, наоборот, доминирование генома фибробласта в клетках типа диплоидные ЭСК-тетраплоидные фибробласты. Таким образом, альтернативное проявление родительских геномов в исследованных гибридных клетках определялось плоидностью соматического партнера.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Круглова, Анна Александровна, Новосибирск

1. Косимов Р.Б., Сухарев С.И., Поспелова Т.В., Прудовский ИА., Зеленин A.B. Синтез ДНК в гетерокарионах, полученных слиянием лейкоцитов и клеточных культур с разным пролиферативным потенциалом // Цитология. 1991. Т.ЗЗ, №2. С. 48-56.

2. Макгрегор Г., Варли Дж. Методы работы с хромосомами животных // Москва. Мир. 1986. 271 с.

3. Матвеева Н.М., Шилов А.Г., Байбородин С.И., Филимоненко В.В., Ролинская И.В., Серов O.JI. Гибриды между эмбриональными и соматическими клетками мыши сохраняют плюрипотентность // Докл. РАН. 1996. Т. 349, №1. С. 129-132.

4. Матвеева Н.М., Кузнецов С.Б., Кафтановская Е.М., Серов О.Л. Сегрегация родительских хромосом в гибридных клетках, полученных от слияния эмбриональных стволовых и дифференцированных клеток взрослого животного // Докл. РАН. 2001. Т. 379, № 1. С. 118-120.

5. Пристяжшок И.Е., Темирова С.А., Мензоров А.Г., Круглова A.A., Матвеева Н.М., Серов О.Л. Видимая и «скрытая» сегрегация родительских хромосом в эмбриональных стволовых гибридных клетках // Онтогенез. 2005. Т. 36, № 2. С. 151-158.

6. Прудовский И.А., Егоров Е.Е., Косимов Р.Б., Капник Е.М., Гуменюк P.P., Ходаков А.Л., Онищенко Г.Е., Цонг Т. Позитивная и негативная регуляция реплекации в гибридных клетках // Молек. Биол. 1991. Т. 25, №5. С. 1157-1180.

7. Серов О.Л., Матвеева Н.М., Кизилова Е.А., Кузнецов С.Б., Железова А.И., Голубица А.Н., Пристяжнюк И.Е., Пузаков М.В. «Хромосомная память» родительских геномов в эмбриональных гибридных клетках // Онтогенез. 2003. Т. 34. №3. С. 216-227.

8. Abbondanzo S.J., Gadi I., Stewart C.L. Derivation of embryonic stem cell lines // Methods in Enzymology. 1993. V. 225. P. 803-823.

9. Andrews P.V., Goodfellow P.N. Antigen expression by somatic cell hybrids of a murine embryonal carcinoma cell with thymocytes and L cell // Somat. Cell Genet. 1980. V. 6. P. 271-284.

10. Baribault H., Kemler R. Embryonic stem cell culture and gene targeting in transgenic mice // Mol. Biol. Med. 1989. V. 6. P. 481-492.

11. Barski G., Sorieul S., Cornefert F. Production dans des cultures in vitro de deux souches cellulaires en association de cellules de caractere "hybride" // C. R. Acad. Sc. 1960. Y. 25l.P. 1825-1827.

12. Beddington R.S., Robertson E.J. An assessment of the developmental potential of embryonic stem cells in the midgestation mouse embryo // Dev. 1989. V. 105. P. 733737.

13. Brackett B.G., Baranska W., Sawicki W., Koprowski H. Uptake of heterologous genome by mammalian spermatozoa and its transfer to ova through fertilization // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1971. V. 68. P. 353-357.

14. Carlsson S.-A., Savage R.E., Ringertz N.R. Behavior of differetiated hen nuclei in the cytoplasm of rat myoblasts and myotubes //Nature. 1970. Y. 228. P. 869-871.

15. Cowan C.A., Atienza J., Melton D.A., Eggan K. Nuclear reprogramming of somatic cells after fusion with human embryonic stem cells // Science. 2005. V. 309. P. 13691373.

16. Di Berardino M.A. Genomic Potential of Differentiated Cells // New York: Columbia University Press. 1997. 386 p.

17. Dinsmore J., Ratliff J., Deacon T., Pakzaban P., Jacoby D., Galpern W., Isacson O. Embryonic stem cell differentiated in vitro as a novel source of cell for transplantation // Cell Transpl. 1996. V. 5. P. 131-143.

18. Do J.T., Scholer H.R. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells// Stem Cells. 2004. V.22. P. 941-949.

19. Dubbs D.R., Kit S. Reactivation of chick erythrocyte nuclei in heterokaryons with temperature-sensetive Chinese hamster cells // Somat. Cell Genet. 1976. V. 2. P. 11-19.

20. Edwards M.K.S., McBurney M.W. The concentration of retinoic acid determine differentiated cell types formed by teratocarcinoma cell lines // Dev. Biol. 1983. V. 98. P. 187-191.

21. Ephrussi B. Weiss M.C. Interspecific hybridization of somatic cells // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1965. V. 53. P. 1040-1042.

22. Evans M.J., Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryo //Nature. 1981. V. 292. P. 154-156.

23. Forejt J., Gregorova S., Dohnal K., Nosek J. Gene expression of differentiated parent in teratocarcinoma cell hybrids. Repression or reprogramming? // Cell Differ. 1984. V. 15(2-4). P. 229-234.

24. Forejt J., Saam J.R., Gregorova S., Tilghman S.M. Monoallelic expression of reactivated imprinted genes in embryonal carcinoma cell hybrids // Exp. Cell Res. 1999. Y. 252. P. 416-422.

25. Fougere C., Ruiz F., Ephrussi B. Gene dosage dependence of pigment synthesis in melanoma x fibroblast hybrids // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1972. V. 69. P. 330-334.

26. Geijsen N., Horoschak M., Kim K., Gribnau J., Eggan K., Daley G.Q. Derivation of embryonic germ cells and male gametes from embryonic stem cells // Nature. 2003. V. P. 1-6.

27. Gledhill B.L., Sawicki W., Croce C.M., Koprowski H. DNA synthesis in rabbit spermatozoa after treatment with lysolecitin and fusion with somatic cells // Exp. Cell Res. 1972. V. 73. P. 33-40.

28. Gmur R., Solter D., Knowles B.B. Independent regulation of H-2K and H-2D gene expression in murine teratocarcinoma somatic cell hybrids // J. Exp. Med. 1980. V. 151. P. 1349-1359.

29. Gordon S., Cohn Z. Macrophage-melanocytes heterokaryons // I. Preparation and Properties. 1971. J. Exp. Med. V. 131. P. 981-1003.

30. Gossler A., Doetschman T.C., Korn R., Serfling E., Kemler R. Transgenesis by means of blastocyst derived embryonic stem cell lines // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 9065- 9069.

31. Graves J.A. Chromosome segregation from cell hybrids. I. The effect of parent cell ploidy on segregation from mouse-Chinese hamster hybrids // Can. J. Genet. Cytol. 1984. V. 26(5). P. 557-563.

32. Graves J.A., Barbieri I. Chromosome segregation from cell hybrids. VII. Reverse segregation from karyoplast hybrids suggests control by cytoplasmic factors // Genome. 1992. V. 35(3). P. 537-540.

33. Graves J.A., Wrigley J.M. Chromosome segregation from cell hybrids. II. Do differences in parental cell growth rates and phase times determine direction of loss? // Can. J. Genet. Cytol. 1986. V. 28(5). P. 735-743.

34. Graves J.A., Zelesco P.A. Chromosome segregation from cell hybrids. V. Does segregation result from asynchronous centromere separation? // Genome. 1988. V. 30 (2). P. 124-128.

35. Graham C.F. The fusion of cells with one- and two-cell mouse embryos // Wistar Inst. Symp. Monogr. V. 9. P. 19-33.

36. Harris H. The reactivation of the red cell nucleus // J. Cell Sci. 1967. V. 2. P. 23-32.

37. Harris H., Cook P.R. Synthesis of an enzyme determined by an erythrocyte nucleus in a hybrid cell // J. Cell Sci. 1969. V. 5. P. 121-134.

38. Harris H., Watkins J.F. Hybrid cells derived from mouse and man: artificial heterokaryons of mammalian cells from different species // Nature. 1965. V. 205. P. 640-646.

39. Harris II., Watkins J.F., Ford C.E., Schoefl G.I. Artificial heterokaryons of animl cells from different species // J. Cell Sci. 1966. V. 1. P. 1-30.

40. Hines M.D., Radomska H.S., Eckhardt L.A. Transcription factor effectss on chromosome constitution of cell hybrids // Cytogenet. Cell Genet. 1998. Y. 72. P. 64-72.

41. Hogan B., Beddington R., Constantini F., Lacy E. Manipulating the Mouse Embryo // Second Edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1994. P. 497.

42. Illmensee K., Mintz B. Totipotency and normal differentiation of single teratocarcinoma cells cloned by injection into blastocytes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. V. 73. P. 549-553.

43. Johnson R.T., Harris H. DNA synthesis and mytosis in fused cells. II. HeLa chick erythrocyte heterokaryons // J. Cell Sci. 1969. Y. 5. P. 645-697.

44. Kimura H., Tata M., Nakatsuji N., Tada T. Histone code modifications on pluripotential nuclei of reprogrammed somatic cells // Mol.Cell.Biol. 2004. V.24. P. 5710-5720.

45. Kuai X.L., Bian Y.H., Cong X.Q., Li X.L., Xiao S.D. Differentiation of mouse embryonic stem cells into hepatocytes in vitro and in vivo // Chinese J. Digestive Disease. 2003. V. 4. P. 75-80.

46. Kushch A.A., Prudowskii I.A., Zelenin A.V. Chromatin activation in peritoneal exudate leukocytes after fusion with L cell cytoplasts // Cytobiologie. 1978. V. 18. P. 5966.

47. Lassar A.B., Paterson B.M., Weinraub H. Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts // Cell. 1986. V. 47. P. 649-656.

48. Lasserre C., Jami J., Aviles D. Patterns of chromosome segregation in Chinese hamster x mouse cell hybrids between permanent cell lines and thymus cells // J. Cell Physiol. 1980. V. 104(3). P. 403-413.

49. Ledermann B., Burki K. Establishment of a germ-line competent C57BL/6 embryonic stem cell line // Exp. Cell. Res. 1991. V. 197. P. 254-258.

50. Malawista S.E., Weiss M.C. Expression of differentiated functions in hepatoma cell hybrids: high frequency of induction of mouse albumin production in rat hepatoma-mouse lymphoblast hybrids // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1974. V. 71. P. 927-931.

51. Martin G.R. Teratocarcinomas and mammalian embryogenesis // Science. 1980. V. 209. P. 768-776.

52. Martin G.R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78. P. 7631-7636.

53. Matsui Y., Zsebo K., Hogan B.L. Derivation of pluripotential embryonic stem cells from the murine primordial germ cells in culture // Cell. 1992. V. 70. P. 841-847.

54. McBurney M.W. Hemoglobin synthesis in cell hybrids formed between teratocarcinoma and Friend erythroleukemia cell // Cell. 1977. V. 12. P. 654-662.

55. Miller R.A., Ruddle F.H. Pluripotent teratocarcinoma-thymus somatic cell hybrids // Cell. 1976. V. 9. P. 45-55.

56. Miller R.A., Ruddle F.H. Teratocarcinoma x Friend erythroleukemia cell hybrids resemble their pluripotent embryonal carcinoma parent // Dev. Biol. 1977. V. 56. P. 157173.

57. Nakano T., Kodama H., Honjo T. Generation of lymphohaematopoietic cells from embryonic stem cells in culture // Science. 1994. V. 265. P. 1098-1101.

58. Nyman U, Lanfranchi G, Bergman., M, Ringertz NR. Changes in nuclear antigens during reactivation of chick erythrocyte nuclei in heterokaryons // J. Cell Physiol. 1984. V. 120. P. 257-262.

59. Okada Y., Murayama F. Multinucleated giant cell formation by fusion between cells of two different strains // Exp. Cell Res. 1965. V. 40. P. 154-158.

60. Okita K., Ichisaka T., Yamanaka S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells //Nature. 2007. V.448. P. 313-317.

61. Pells S., Di Domenico A.I., Gallagher E.J., Me Whir J. Multipotentiality of neuronal cells after spontaneous fusion with embryonic stem cells and nuclear reprogramming in vitro// Cloning and Stem Cells 2002. V. 4. P. 331-338.

62. Peterson J.A., Weiss M.S. Expression of differentiated functions in hepatoma cell hybrids: Induction of mouse albumin production in rat hepatoma-mouse fibroblast hybrids // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1972. V. 69. P. 571-575.

63. Pierce G.B., Stevens L.C., Nakane P.K. Ultrastructural analysis of the early development of teratocarcinomas // J. Natl. Cancer Res. 1967 V. 39. P. 755-773.

64. Pontecorvo G. Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment // Somatic. Cell Genet. 1976. V. 1. P. 397-400.

65. Pravtcheva D.D., Ruddle F.H. Normal X-chromosome induced reversion in the direction of chromosome segregation in mouse-hamster somatic sell hybrids // Exp. Cell. Res. 1983. V. 148(1). P. 265-272.

66. Prudovsky I.A., Yegorov Y.E., Zelenin A.V. DNA synthesis in the heterokaryons of non-dividing differentiated cells and culture cells with various proliferative potentials // Cell Differ. 1985. V. 17. P. 239-246.

67. Resnick J.L., Bixler L.S., Cheng L., Donovan P. Long-term proliferation of mouse primordial germ cells in culture //Nature. 1992. V. 359. P. 550-551.

68. Ringertz N.R., Carisson S.-A., Ege T., Bolund L. Detection of human and chick nuclear antigens in nuclei of chick erythrocytes during reactivation in heteroKaryons with HeLa cells // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1971. V. 68. P. 3228-3232.

69. Roach M.I., Stock J.L., Byrum R., Koller B.H., McNeish J.D. A new embryonic stem cell line from DBA/llacJ mice allows genetic modification in a murine model of human inflammation //Exp.Cell Res. 1995. V. 221(2). P. 520-525.

70. Robertson E.J., Bradley A., Kuehn M., Evans M. Germ line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector // Nature. 1986. V. 323. P. 445-448.

71. Rousset J.-P., Dubois P., Lassere C. Aviles D., Fellows M., Jami J. Phenotype and surface antigens of mous teratocarcinoma x fibroblast cell hybrids // Somatic Cell Genet. 1979. V. 5(6). P. 739-752.

72. Rousset J.P., Bucchini D., Jami J. Hybrids between F9 nullipotent teratocarcinoma and thymus cells produce multidifferentiated tumors in mice // dev. Biol. 1983. V. 96. P. 331-336.

73. Sawicki W., Koprowski H. Fusion of rabbit spermatozoa with somatic cells cultivated in vitro // Exp. Cell Res. 1971. Y. 66. P. 145-151.

74. Schneider J.A., Weiss M.C. Expression of differentiated functions in hepatoma cell hybrids. I. Tyrosine aminotransferase in hepatoma fibroblast hybrids // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1971. Y. 68. P. 127-131.

75. Scholer H.R., Hatzopoulos A.K., Balling R., Suzuki N., Gruss P. A family of octamer-specific proteins present during mouse embryogenesis: Evidence for germline-specific expression of an OCT factor // EMBO J. 1989. V. 8. P. 2543-2550.

76. Smith AG. Embryo-derived stem cells: of mice and men // Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 2001. V. 17. P. 435-462.

77. Solter D., Skreb N., Damjanov I. Extrauterine growth of mouse egg-cylinders results in malignant teratoma // Nature Lond. 1970. V. 227. P. 503-504.

78. Solter D., Knowles B.B. Monoclonal antibody defining a stage-specific mouse embryonic antigen (SSEA-1) // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1978. V. 75. P. 5565-5569.

79. Sorieul S., Ephrussi B. Kariological demonstration of hybridization of mammalian cells in vitro II Nature. 1961. V. 190. P. 653-654.

80. Spencer R.S., Hauschka T.S., Amos D.B., Ephrussi B. Co-dominance of isoantigens in somatic hybrids of murine cells grown in vitro II J. Natl. Canser Inst. 1964. V. 33. P. 893-903.

81. Stevens L.C. The development of transplantable teratocarcinomas from intratesticular grafts of pre- and postimplantation mouse embryos // Dev. Biol. 1970. V. 21. P. 364-382.

82. Stewart, C.L. Formation of viable chimaeras by aggregation between teratocarcinomas and preimplantation mouse embryos // J. Embryol. Exp. Morph. 1982. Y. 67. P. 167-179.

83. Sukoyan M.A., Vatolin S.Y., Golubitsa A.N., Zhelezova A.I., Semenova L.A., Serov O.L. Embryonic stem cells derived from morulae, inner cell mass, and blastocysts of mink: Comparisons of their pluripotencies // Mol. Reprod. Dev. 1993. V. 36. P. 148-158.

84. Tada T., Tada M., Hilton K., Barton S.C., Sado T., Takagi N., Surani M.A. Epigenotype switching of imprintable loci in embryonic germ cells // Dev. Gehne Evol. 1998. V. 207. P. 551-561.

85. Tada M., Morizane A., Kimura H., Kawasaki H., Ainscough J.F.X., Sasai Y., Nakatsuji N., Tada T. Pluripotency of reprogrammed somatic genomes in embryonic stem hybrid cells // Dev. Dyn. 2003. V. 227. P. 504-510.

86. Tada M., Takahama Y., Abe K., Nakatsuji N., Tada T. Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells // Curr. Biol. 2001. V. 11. P. 15531558.

87. Takagi N. Variable X chromosome inactivation patterns in near-tetraploid murine EC x somatic hybrid cells differentiated in vitro II Genetica. 1993. V. 88. P. 107-117.

88. Takashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors // Cell. 2006. V.126. P. 663-676.

89. Takahashi K., Tanabe K., Ohnuki M., Narita M., Ichisaka T., Tomoda K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors // Cell. 2007. V. 131. P. 861-872.

90. Terada N., Hamazaki T., Oka M., Hoki M., Mastalerz D.M., Nakano Y., Meyer E.M., Morel L., Petersen B.E., Scott E.W. Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion //Nature. 2002. V. 416. P. 542-545.

91. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S., Waknitz M.A., Swiergiel J.J., Marsshall V.S., Jones J.M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts // Science. 1998. V. 282. P. 1145-1147.

92. Toyooka Y., Tsunekawa N., Akasu R., Noce T. Embryonic stem cells can form germ cells in vitro II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 11457-11462.

93. O.L. Dominant manifestation of pluripotrney in embryonic stem cell hybrids with various numbers of somatic chromosomes //Mol. Reprod. Dev. 2007. V. 74. P. 941-951.

94. Watkins J.F., Grace D.M. Studies on the surface antigens of interspecific mammalian cell heterokaryons // J. Cell Sci. V. 2. P. 193-204.

95. Weiss M.C., Green H. Human-mouse cell lines containing partial complements of human chromosomes and functioning human genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1967. V. 58. P. 1104-1111.

96. Wells N.D., McWhir J., Hooper M.L., Wilmut I. Factor influencing the isolation of murine embryonic stem cells // Theriogenology. 1991. V. 35. P. 293.

97. Wernig M., Meissner A., Foreman R., Brambrink T., Ku M., Hochedlinger K., Bernstein B.E., Jaenisch R. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state //Nature. 2007. V.448. P. 318-324.

98. Willing M.C., Nienhuls A.W., Anderson W.F. selective activation of human J3- but not y-globin gene in human fibroblast x mouse erythroleukaemia cell hybrids // Nature. 1979. V.277. P. 534-538.

99. Wobus A.M. Holzhausen H., Jakel P., Schoneich J. Characterization of a pluripotent stem cell line from a mouse embryo // Exp. Cell Res. 1984. V. 152. P. 810-813.

100. Wobus A.M. Potential of embryonic stem cells // Mol Aspects Med. 2001. V. 22(3). P. 149-64

101. Wollweber L., Munste H., Hoffmann S., Siller K., Greulish K.O. Early phase karyotype analysis of chromosome segregation after formation of mouse-mouse hybridomas with chromosome painting probes // Chromosome Res. 2000. V. 8(1). P. 3744.

102. Yamada T., Yoshikawa M., Kanda S. In vitro differentiation of embryonic stem cells into hepatocyte-like cells identified by cellular uptake of indocyanine green // Stem Cells. 2001. V. 20. P. 146-154.

103. Ying Q-L., Nichols J., Evans E.P., Smith A.G. Changing potency by spontaneous fusion //Nature. 2002. V. 416. P. 545-548.pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells // Science. V. 318. P. 19171920

104. Zelesco P. A., Graves J. A. Hybrids between irradiated and unirradiated mammaliancells: survival and chromosome segregation // J. Cell. Physiol. 1983 V. 116(1). P. 98-102.