Исследование ранних стадий образования гибридных клеток, получаемых при слиянии эмбриональных стволовых клеток и фибробластов

Гридина, Мария Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование ранних стадий образования гибридных клеток, получаемых при слиянии эмбриональных стволовых клеток и фибробластов
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование ранних стадий образования гибридных клеток, получаемых при слиянии эмбриональных стволовых клеток и фибробластов"

На правах рукописи

004669101

■'.'■'Л \ 1:4 *1

ГРИДИНА МАРИЯ МИХАИЛОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ РАННИХ СТАДИЙ ОБРАЗОВАНИЯ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК, ПОЛУЧАЕМЫХ ПРИ СЛИЯНИИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И ФИБРОБЛАСТОВ

03.02.07-генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 СЕН 2010

Новосибирск 2010

004609101

Работа выполнена в лаборатории генетики развития Учреждения Российской академии наук Институт цитологии и генетики сибирского отделения РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Серов О.Л.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук, Кикнадзе И.И.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук, Лебедев И.Н.

Учреждение Российской академии медицинских наук НИИ медицинской генетики СО РАМН, г. Томск

Ведущее учреждение:

Институт общей генетики РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится

;а на утреннем заседании

диссертационного совета Д 003.011.01 в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект акад. Лаврентьева 10, тел/факс: (383) 3331278, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан" 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Т.М. Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Развитие начинается с деления-дробления оплодотворенной яйцеклетки - зиготы. Программа развития, заложенная в этой тотипотентной клетке, реализуется в процессе онтогенеза через дифференцировку, в результате которой формируется более 200 типов специализированных клеток, представленных во взрослом организме. Процесс дифференцировки сопровождается потерей первоначальной тотипотентности, которую можно условно градуировать: плюрипотентность, мультипотентность, коммитированность и терминальная детерминация. Важным элементом потери потенциала является ее одновекторность и, в большинстве случаев, необратимость. В нормальном развитии эукариот примеры восстановления дифференцированной клеткой утраченного потенциала чрезвычайно редки. В связи с этим исследователями не раз предпринимались попытки экспериментальным путем восстановить утраченный потенциал соматических клеток.

Одним из способов восстановления потенциала (репрограммирования) генома соматической клетки является ее слияние с эмбриональной стволовой (ЭС) клеткой. В 1996 году было обнаружено, что слияние мышиных ЭС клеток и спленоцитов приводит к формированию гибридных клеток, которые обладают многими свойствами ЭС клеток, в том числе способностью участвовать в формировании химерных животных (Матвеева и др., 1996; Matveeva et al, 1998). Эти данные нашли подтверждение в целом ряде экспериментов по слиянию ЭС клеток с В- и Т-лифмоцитами (Tada et al, 2001; Kimura et al, 2004), незрелыми нейральными клетками (Do et al., 2004), незрелыми гемопоэтическими клетками (Ying et al., 2003) и фибробластами (Sullivan étal., 2006; Kruglova et al, 2008). Исследования таких гибридных клеток показали, что в них происходит: активация генов, неактивных в соматических клетках (таких как Oct4 и Nanog), реактивация неактивной Х-хромосомы, изменения профилей метилирования ДНК и модификаций гистоновых белков (Tada etal., 2001; Kimura étal, 2004; Do etal., 2007; Battulin etal., 2009). Все это является свидетельством репрограммирования, происходящего в геноме соматической клетки после слияния с ЭС клеткой. Изменения профиля экспрессии генов, происходящие в гибридных клетках такого типа, а также приобретение этими клетками плюрипотентных свойств говорит о доминировании генома ЭС клеток над геномом соматических клеток.

Представление о доминировании генома одного партнера по слиянию над другим долгое время было популярным не только для гибридных клеток, получаемых при слиянии ЭС клеток с соматическими клетками, но и для гибридов, получаемых при слиянии двух соматических клеток различной тканевой принадлежности. После слияния двух соматических клеток возможно, используя ингибиторы клеточного деления, оставить клетку на стадии гетерокариона, когда в общей цитоплазме присутствуют два ядра родительских клеток. В таких гетерокарионах, как правило, доминирует партнер с большей по объему цитоплазмой и укороченным клеточным циклом и под его воздействием меняется организация второго ядра и паттерн экспрессии генов на свойственный доминантному ядру. Примерами такого доминирования могут служить

гетерокарионы, полученные при слиянии эритроцитов птиц или амфибий с какими-либо растущими и делящимися в культуре клетками млекопитающих (Harris, 1967) или при слиянии кератиноцитов мыши с миобластами мыши (Zhang etal., 2007). Однако недавно появилась работа, в которой показано обоюдное влияние ядер в гетерокарионах между кератиноцитами и мышечными клетками, а не доминирование одного ядра над другим (Palermo etal, 2009). Таким образом, возникает вопрос - возможно ли альтернативное проявление геномов родительских клеток при слиянии соматических клеток с ЭС клетками или же в данном случае наблюдается строгое доминирование ядер ЭС клеток?

Для достижения целей были поставлены следующие задачи:

1. Модифицировать метод идентификации гетерокарионов и гибридных клеток на ранних стадиях после слияния ЭС клеток и фибробластов.

2. Провести иммунофлюоресцентный анализ маркеров плюрипотентных ЭС клеток (Oct4 и Nanog), фибробластов (коллагена I типа и фибронектина) и дифференцированных клеток (ламина А/С) в гетерокарионах и гибридных клетках в первые часы (с 4-ого до 20-ого) и дни (с 1-го до 4-го) после слияния ЭС клеток и фибробластов.

3. Провести анализ профилей метилирования ДНК 5'-регуляторной области гена Oct4 в гибридных клетках через разные интервалы времени после слияния ЭС клеток и фибробластов.

4. Исследовать состояние Х-хромосом в гетерокарионах и гибридных клетках посредством иммунофлюоресцентного анализа факультативного гетерохроматина с использованием антител против триметилированного лизина в 27-ом положении в гистоне НЗ (НЗК27теЗ), маркирующего неактивную Х-хромосому.

Научная новизна и практическая значимость.

1. Модифицирован метод идентификации продуктов слияния ЭС клеток и фибробластов, позволяющий с 90% точностью дискриминировать гетерокарионы и гибридные клетки от гомокарионов и гибридных клеток, образовавшихся при слиянии двух родительских клеток одного типа (ЭС клетка-ЭС клетка и фибробласт-фибробласт).

2. Впервые обнаружено существование двух фенотипически контрастных типов гетерокарионов и гибридных клеток, полученных при слиянии диплоидных ЭС клеток с диплоидными фибробластами - одни имеют признаки ЭС клеток, а другие фибробластов.

3. Впервые показано, что деметилирование ДНК 5'-регуляторной области эпиаллеля фибробласта гена Oct4 в гибридных клетках с фенотипом ЭС клеток происходит в течение первых 4-х дней после слияния, в то же время в гибридных клетках с фибробласто-подобным фенотипом происходит метилирование 5'-регуляторной области эпиаллеля ЭС клеток гена Oct4.

4. Полученные в ходе данной работы результаты используются при чтении лекций спецкурса «Генетика развития» в Новосибирском государственном университете (НГУ).

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены в работе следующих конференций и симпозиумов: 3-я международная конференция «Наука для медицины» (Новосибирск, 2007); симпозиум с международным участием «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза». (Москва, 2007); всероссийский симпозиум по биологии клетки в культуре «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» (Санкт-Петербург, 2007); международная научная конференция молодых ученых «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007); 4-ая международная конференция сообщества стволовых клеток северной Рейн-Вестфалии (Дюссельдорф, 2007); LXXIII симпозиум по количественной биологии (Cold Spring Harbor, 2008); 1-ый ежегодный международный конгресс по регенеративной медицине и стволовым клеткам (Фошан, 2008); V съезд Вавиловского общество генетиков и селекционеров (Москва, 2009); 5-ый международный конгресс по биотехнологии стволовых клеток (Тегеран, 2009); всероссийский симпозиум по биологии клетки в культуре «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» (Санкт-Петербург, 2009).

Материалы диссертации изложены в 3-х статьях, опубликованных в отечественном и международных журналах, входящих в перечень ВАК.

Положение, выносимое на защиту. В клетках, получаемых при слиянии диплоидных ЭС клеток мыши и диплоидных фибробластов мыши, начиная со стадии гетерокариона, наблюдается альтернативное проявление родительских геномов. В результате чего формируются гибридные клетки, обладающие двумя контрастными фенотипами: ЭС-подобным и фибробласто-подобным.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 120 страницах, проиллюстрирована 27 рисунками и содержит 2 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали следующие культуры клеток:

• эмбриональные стволовые клетки линии E14Tg2aSc4TP6.3, полученные из ВКМ бластоцисты мыши Mus musculus линии 129/Ola. Клетки этой линии маркированы GFP, устойчивы к пуромицину и ГФРТ" (Pratt et al., 2000), имеют кариотип 2N = 40,XY. Линия была любезно предоставлена доктором Остином Смит (University of Edinburgh).

• первичные культуры эмбриональных фибробластов, полученные из 12,5-дневных эмбрионов мышей линии DD/c M musculus; первичные культуры эмбриональных фибробластов с кариотипом 2N = 40,XX, полученные из 14,5-дневных эмбрионов линии DD/c M. musculus-, первичные кулыуры эмбриональных фибробластов, полученные из 12,5-дневных эмбрионов мышей Mus caroli.

Культивирование ЭС клеток и гибридных клеток проводили по методу, описанному ранее Матвеевой и др. (Matveeva et al., 1998). Условия

культивирования фибробластов и метод слияния клеток описан ранее Кругловой и др. (Круглова и др., 2008). Мечение фибробластов проводили полистироловыми флуоресцентными микросферами (Invitrogen, США) согласно приложенной инструкции.

Иммунофлюоресцентный анализ проводили согласно методу, описанному ранее Кругловой и др. (Kruglova et al., 2010). В анализе использовали следующий набор первичных антител к: Oct4 (1:500; Abeam, Великобритания), Nanog (1:200; Abeam, Великобритания), коллагену I типа (1:1000; Chemicon, США), фибронектину (1:1000; Abeam, Великобритания), ламину А/С (1:150; Chemicon, США), триметилированному лизину в 27 положении гистона НЗ (1:500; Molecular Probes). Вторичные антитела конъюгированные с флуорохромом Alexa Fluor 546 к: IgG мыши, (1:300; Molecular Probes, США), IgG кролика (1:300; Molecular Probes, США). Анализ проводили с помощью флуоресцентного микроскопа Axioscope-2 (Carl Zeiss, Германия) и программного обеспечения WinView software (Rooper Scientific Photometrix).

Для дискриминации родительских митохондриальных ДНК (мтДНК) использовали аллель-специфичный полиморфизм мтДНК. Выделение мтДНК из единичных клеток проводили согласно методу, описанному в работе Зукотти и Монка (Zuccotti, Monk, 1995) с описанными в работе модификациями.

Определение нуклеотидной последовательности проводили согласно протоколу ABI PRISM BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems, Perkin-Elmer Corporation, США) в Межинститутском центре секвенирования ДНК (Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН).

Бисульфитную обработку ДНК проводили с использованием реагентов EZ DNA Methylation-Direct Kit (Zymo Research, США) согласно приложенной инструкции. Субклонирование продуктов ПРЦ проводили с использованием набора реактивов pGEM-T Easy Vector System (Promega, США) согласно приложенной инструкции.

В работе использовали штамм Е. coli XLIO-Gold (Stratagene, США). Приготовление и трансформацию компетентных клеток Е. coli проводили согласно протоколу фирмы Stratagene, прилагаемому к данному штамму. После трансформации клеток Е. coli, клонированные фрагменты индивидуальных клонов амплифицировали в ПЦР и затем секвенировали.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ Идентификация гетерокарионов и гибридных клеток в первые часы и сутки после слияния ЭС клеток и фибробластов

На первом этапе исследования нами был разработан метод идентификации гетерокарионов и гибридных клеток в первые часы и сутки после слияния ЭС клеток и фибробластов. Метод основан на использовании прижизненных флуоресцентных меток: «зеленое» свечение цитоплазмы ЭС клеток благодаря экспрессии в них трансгенного GFP и мечение цитоплазмы фибробластов «синими» гранулами. Такое маркирование родительских клеток позволило дискриминировать обе популяции родительских клеток и продукты слияния между ними.

Для оценки точности предложенного способа идентификации гибридных клеток мы провели анализ родительских мтДНК в гибридных клетках. Последовательности мтДНК мышей линий 129/01а и 01)/с имеют различие в участке гена третьей субъединицы цитохромоксидазы, которое представляет собой замену й А в положении 9348. Нами была проведена гибридизация ЭС клеток, линии Е14Т§2а8с4ТР6.3, полученной из бластоцисты мыши 129/01а, и фибробластов, полученных из эмбрионов мышей ОБ/с. Через 48 ч после слияния 20 гибридных клеток были отобраны и перенесены в индивидуальные пробирки, для каждой клетки индивидуально проводили ПЦР с использованием праймеров к участку мтДНК, в котором находится полиморфизм между линиями мышей 129/01а и ОБ/с. Продукты ПЦР секвенировали и идентифицировали родительские формы мтДНК (рис. 1А, Б, В). Результаты проведенного анализа показали, что из 20 образцов 18 имели четко выраженные сигналы, соответствующие обоим нуклеотидам, что указывает на присутствие в образце обеих родительских форм мтДНК, а в 2 образцах содержалась мтДНК только клеток линии 129/01а. Кроме того, был проведен дополнительный анализ продуктов рестрикции, выявляющий тот же полиморфизм мтДНК, результаты которого, подтвердили данные, полученные в ходе секвенирования.

Морфология гетерокарионов и гибридных клеток

Используя описанный выше способ идентификации гетерокарионов и гибридных клеток, был проведен морфологический анализ популяции клеток, полученной после проведения слияния ЭС клеток и фибробластов. Через 4 ч после слияния можно было выделить два морфологически различающихся типа гетерокарионов: фибробласто-подобные - крупные клетки с низким ядерно-цитоплазматическим соотношением и большим количеством отростков; ЭС-подобные - небольшие округлые клетки с высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением и без выраженных отростков (таблица 1, рис. 2А и Б). Через 45 ч и 69 ч после слияния встречались гетерокарионы только с фибробласто-подобной морфологией (рис. 2В). Первое деление гетерокарионов происходило в период между 8 ч и 45 ч после слияния. Среди, появившихся через 21 ч после слияния, гибридных клеток 81% имели фибробласто-подобную морфологию (рис. 2Г), и только 19% клеток обладали морфологическими сходствами с ЭС клетками (таблица 1). ЭС-подобных гибридных клеток.

Таблица 1.

Соотношение гетерокарионов и гибридных клеток различной морфологии в разное время после слиянии ЭС клеток и фибробластов.

Популяция гибридных клеток через 45 ч и 69 ч после слияния сохраняла свою неоднородность: в ней присутствовали как колонии, образованные плотно

Время Всего Гетерокарионы Колонии гибрщных

после клеток

слняния 'Всего. Число клеток с Всею Число КО.ЮШШ

О) ОС-полобноГ! М0рф0ЛОП!СН -гибридны* клаок : с ЭС-подижон . мэшЬак« ией

4 325 325..... 18 0 0

8 : У 0 0

21 503 298 35........... 205 .............39 "

45 щш ЙЗЩ

69 504 202 0 302 133

прилегающими друг к другу клетками, морфологически сходными с ЭС клетками (рис. 2Д), так и колонии, в которых клетки, сходные с фибробластами, располагались на значительном расстоянии друг от друга (рис. 2Г и Е). Соотношение этих двух типов колоний было приблизительно 1:1 (таблица 1). Однако следует подчеркнуть, что формирование клонов гибридных клеток происходило только из клеток с ЭС-подобной морфологией, тогда как, по нашим наблюдениям, фибробластно-подобные гибридные клетки не были способны давать начало стабильным клонам гибридных клеток.

Иммунофлюоресцентный анализ экспрессии белков, маркирующих плюрипотентные и соматические клетки, в гетерокарионах и гибридных

клетках

Существует ряд генов, экспрессия которых характерна только для плюрипотентных клеток, а их активация в гибридных клетках, полученных при слиянии ЭС клеток и соматических клеток, наряду с подавлением экспрессии тканеспецифичных генов, является признаком, прошедшего в гибридных клетках, репрограммирования. В частности, принято считать экспрессию генов Oct4 и Nanog - маркерами ЭС клеток, присутствие ламина А/С в ядерной ламине - маркером дифференцированных клеток (Constantinescu et al., 2006), а наличие цитоскелета, сформированного коллагеном I типа и фибронектином (Smith et al., 1979), - маркером клеток фибробластного ряда.

Используемый нами набор первичных антител позволял проводить иммунофлюоресцентный анализ Oct4 и коллагена I типа одновременно, поскольку они имеют разную внутриклеточную локализацию: ядерную и цитоплазматическую соответственно. В результате анализа трех независимых гибридизаций ЭС клеток и фибробластов нами установлено, что через 4 ч после проведения слияния 22% гетерокарионов обладали «ожидаемым» фенотипом (в одном из ядер присутствовал Oct4, а в цитоплазме - коллаген I типа), 57% гетерокарионов обладали фибробласто-подобным фенотипом (не содержали Oct4 ни в одном из ядер, тогда как их цитоплазма была позитивна по коллагену I типа). Через 45 ч и 69 ч после слияния большинство гетерокарионов (57% и 78% соответственно) обладало «промежуточным» фенотипом (в них не обнаруживался ни Oct4, ни коллаген I типа; рис. ЗА). Первые колонии гибридных клеток, состоящие из 2-х клеток, мы обнаруживали через 21ч после слияния, 77% колоний состояли из клеток с фибробласто-подобным фенотипом, 20% колоний состояли из клеток с ЭС-подобным фенотипом и клетки 3% колоний были негативны по обоим маркерам. Через 45 ч и 69 ч после слияния колонии клеток с ЭС-подобным фенотипом (47% и 42% соответственно), наряду с колониями клеток, имеющих крупную цитоплазму и негативных по обоим маркерам (32% и 41%), составляли основную часть популяции гибридных клеток, тогда как колоний клеток с фибробласто-подобным фенотипом было меньшинство (10 и 7% через 45 ч и 69 ч после слияния соответственно; рис. ЗБ).

Используемый нами набор первых антител позволял проводить одновременно иммунофлюоресцентный анализ Nanog и коллагена I типа. Через 4 ч после слияния 87% гетерокарионов имели фибробласто-подобный фенотип (Nanog отсутствовал в обоих ядрах, а цитоплазма была позитивна по коллагену I типа). Сходная ситуация сохранялась через 8 ч и 21 ч после проведения

гибридизации. Через 45 ч и 69 ч после слияния большинство гетерокарионов (64% и 79% соответственно) обладали «промежуточным» фенотипом (большой цитоплазмой и были негативны как по так и коллагену I типа; рис. ЗВ).

Через 21 ч после слияния 81% колоний гибридных клеток состояли из клеток с фибробласто-подобным фенотипом, 15% колоний состояли из клеток с ЭС-подобным фенотипом. Через 45 ч после гибридизации в популяции присутствовали примерно в равном соотношении колонии, состоящие из гибридных клеток с ЭС-подобным (36%), фибробласто-подобным (28%) и «промежуточным» фенотипом(30%), а именно: клетки с большой цитоплазмой, в которых не было и №по§ и коллагена I типа. Через 69 ч после слияния колонии, клетки которых обладали фибробласто-подобным фенотипом, встречались лишь в 6% случаев, тогда как возрастало число колоний, клетки которых имели ЭС-подобный фенотип (52%), а число колоний, клетки которых имели «промежуточный» фенотип, существенно не менялось (35%; рис. ЗГ).

Ламин А/С является маркером дифференцированных клеток, его экспрессия полностью отсутствует в ЭС клетках (Соп51апйпе8си е/а/., 2006) и в гибридных клетках между ЭС клетками и спленоцитами (ВаИиНп е^а/., 2009). Через 4 ч после слияния 88% гетерокарионов обладали «ожидаемым» фенотипом (то есть в оболочке одного из ядер присутствовал ламин А/С) и 9% гетерокарионов имели «промежуточный» фенотип (клетки имели большую цитоплазму, а оболочки обоих ядер не содержали ламин А/С).

Рис. 1. Секвенограммы фрагмента гена третьей субъединицы цитохромоксидазы ЭС клетки, линии E14Tg2aSc4TP6.3 полученной из бластоцисты мыши линии 129/01а (А), фибробласта, полученного из эмбриона мыши линии ОО/с (Б) и образца, содержащего гибридную клетку (В).

4 ч 4 ч 45 ч 21ч 45 ч 69 ч

А Б > В * г

г . ЧГ ,

Рис. 2. Морфология гетерокарионов и гибридных клеток через разное время после слияния ЭС клеток с фибробластами (время указано над изображениями). Стрелками указаны флуоросферы. Ядра окрашены ОАР1. А и В - гетерокарионы с фибробласто-подобной морфологией; Б - гетерокарион с ЭС-подобной морфологией; Г и Е — гибридные клетки с фибробласто-подобной морфологией; Д - колония ЭС-подобных гибридных клеток.

21 45

Время после слияния (ч)

Гетерокарионы с "ожидаемым" фенотипом: Ос14 «+» для одного ядра, коллаген «+».

Л Гетерокарины с ЭС-подобным фенотипом: маленькая цитоплазма, Ой4 «+» для обоих ядер, коллаген «-».

' | Гетерокарионы с фибробласто-подобным фенотипом: большая цитоплазма, Ой4 «-» для обоих ядер, коллаген «+».

Гетерокарионы с "промежуточным" фенотипом.

21 45 69

Время после слияния (ч)

Щ Колонии гибридных клеток с ЭС-подобным фенотипом: маленькая цитоплазма, Ой4 «+», коллаген «-».

3 Скопления гибридных клеток с фибробласто-подобным фенотипом: большая цитоплазма, Ос14 «-», коллаген «+».

Щ Скопления гибридных клеток с "промежуточным" фенотипом: большая цитоплазма, Ос14 «-», коллаген «-».

Скопления гибридных клеток с "промежуточным" фенотипом, прочие.

21 45

Время после слияния (ч)

] Гетерокарионы с "ожидаемым" фенотипом: Ыапо§ «+» для одного ядра, коллаген «+».

Ц Гетерокарионы с ЭС-подобным фенотипом: маленькая цитоплазма, Nanog «+» для обоих ядер, коллаген «-».

""] Гетерокарионы с фибробласто-подобным фенотипом: большая цитоплазма, Nanog «-» для обоих ядер, коллаген «+».

Гетерокарионы с "промежуточным" фенотипом.

21 45 69

Время после слияния (ч)

| Колонии гибридных клеток с ЭС-подобным фенотипом: маленькая цитоплазма, Nanog «+», коллаген «-».

Скопления гибридных клеток с фибробласто-подобным фенотипом: большая цитоплазма, №по§ «-», коллаген «+».

Щ Скопления гибридных клеток с "промежуточным" фенотипом: большая цитоплазма, Nanog «-», коллаген «-».

Скопления гибридных клеток с "промежуточным" фенотипом, прочие.

Рис. 3. Анализ данных иммунофлюоресцентного окрашивания: Ой4 и коллагена I типа в гетерокарионах (А) и гибридных клетках (Б), Nanog и коллагена I типа в гетерокарионах (В) и гибридных клетках (Г) через разное время после слияния ЭС клеток с фибробластами. Доверительные интервалы построены для вероятности р = 0,95.

¡±Аш

8 21 15 69

Время после слияния (ч)

Гетерокарионы с "ожидаемым" фенотипом: ламин А/С «+» для одного ядра.

Щ Гетерокарионы с ЭС-подобным фенотипом: маленькая цитоплазма, ламин А/С «-» для обоих ядер.

^ Гетерокарионы с фибробласто-подобным фенотипом: большая цитоплазма, ламин А/С «+» для обоих ядер.

Гетерокарионы с "промежуточным" фенотипом: большая цитоплазма, ламин А/С «-» для обоих ядер.

В100

Время после слияния (ч)

: Гетерокарионы с "ожидаемым" фенотипом: фибронектин присутствует в цитоплазме.

Щ Гетерокарионы с ЭС-подобным фенотипом: маленькая цитоплазма, фибронектин отсутствует.

Гетерокарионы с "промежуточным" фенотипом: большая цитоплазма, фибронектин отсутствует.

Время после слияния (ч)

^ Колонии гибридных клеток с ЭС-подобным фенотипом: маленькая цитоплазма, ламин А/С «-».

Щ Скопления гибридных клеток с фибробласто-подобным фенотипом: большая цитоплазма, ламин А/С «+».

Скопления гибридных клеток с "промежуточным" фенотипом.

21 45

Время послеслияния (ч)

Щ Колонии гибридных клеток с ЭС-подобным фенотипом: маленькая цитоплазма, фибронектин отсутствует.

£ Скопления гибридных клеток с фибробласто-подобным фенотипом: большая цитоплазма, фибронектин присутствует.

Скопления гибридных клеток с "промежуточным" фенотипом: большая цитоплазма, фибронектин отсутствует.

Рис. 4. Анализ данных иммунофлюоресцентного окрашивания: ламинаА/С в гетерокарионах (А) и гибридных клетках (Б), фибронектииа в гетерокарионах (В) и гибридных клетках (Г) через разное время после слияния ЭС клеток с фибробластами. Доверительные интервалы построены для вероятности р = 0,95.

Через 21 ч после слияния 48% гетерокарионов обладали фибробласто-подобным фенотипом (большой объем цитоплазмы и ламин А/С присутствует в оболочках обоих ядер), тогда как гетерокарионы с «ожидаемым» фенотипом и «промежуточным» фенотипом встречались редко (26% и 13% соответственно; рис. 4А). Через 21 ч после слияния 85% колоний гибридных клеток состояли из клеток, обладающих фибробласто-подобным фенотипом, 15% колоний состояли из клеток с ЭС-подобным фенотипом (клетки с маленькой цитоплазмой и без ламина А/С в оболочке ядра). Через 45 ч после слияния колонии клеток с ЭС-подобным фенотипом и фибробласто-подобным фенотипом составляли большую часть популяции гибридных клеток (38% и 55% соответственно), а клетки с «промежуточным» фенотипом встречались лишь в 7% колоний (рис. 4Б).

Фибронектин, так же как и коллаген I типа, является маркером фибробластов. Через 4 ч после слияния 89% гетерокарионов обладали «ожидаемым» фенотипом (то есть в цитоплазме гетерокарионов присутствовал фибронектин). Через 21 ч после слияния данный тип гетерокарионов сохранял доминирующую позицию, но несколько увеличивалось число клеток с ЭС-подобным фенотипом (17%, гетерокарионы с маленькой цитоплазмой без фибронектина) и «промежуточным» фенотипом (12%, гетерокарионы с большой вытянутой цитоплазмой, в которых отсутствовал фибронектин). Через 45 ч и 69 ч после слияния большинство гетерокарионов имели «промежуточный» фенотип (79% и 51%, соответственно), оставшуюся часть популяции гетерокарионов составляли клетки с «ожидаемым» фенотипом (рис. 4В). Через 21 ч после слияния 58% колоний состояли из клеток с «промежуточным» фенотипом, и 38% колоний состояли из клеток с фибробласто-подобным фенотипом. Через 69 ч после проведения гибридизации колонии клеток с ЭС-подобным фенотипом (24%), фибробласто-подобным фенотипом (33%) и «промежуточным» фенотипом (43%) были представлены в примерно равных соотношениях в популяции гибридных клеток (рис. 4Г).

Суммируя полученные данные иммунофлюоресцентных анализов экспрессии белков, маркирующих родительские типы клеток, можно сделать следующие заключения: через 4 часа после слияния ЭС клеток и фибробластов маркеры родительских клеток (Oct4/Nanog для ЭС клеток; коллаген I типа, фибронектин и ламин А/С для фибробластов) одновременно выявляются в небольшом числе гетерокарионов. Среди первых гибридных клеток, появляющихся через 21 ч после слияния, мы обнаружили альтернативные фенотипы сходные либо с ЭС клетками, либо фибробластами, и промежуточные фенотипы по набору маркеров не сходные ни с одним из родительских типов клеток. После образования первых гибридных клеток во всех клетках с ЭС-подобной морфологией происходила экспрессия ОШ и Nanog и отсутствовали коллаген I типа, фибронектин и ламин А/С. Такие гибридные клетки формировали колонии, состоящие из плотно прилегающих друг к другу клеток. В отличие от клеток с ЭС-подобной морфологией, среди гибридных клеток с фибробласто-подобной морфологией встречались промежуточные фенотипы.

Анализ профилей метилирования ДНК 5'-регуляторной области гена Oct4 в ЭС клетках, фибробластах и клетках гибридного клона

Показав наличие экспрессии гена Oct4 в гибридных клетках с ЭС-подобной морфологией и ее отсутствие в гибридных клетках с фибробласто-подобной морфологией, мы направили свое внимание на исследование эпигенетических механизмов регуляции гена Oct4 в гибридных клетках, а именно метилирования его 5'-регуляторной области. Используя метод бисульфитного секвенирования, мы подтвердили, что 5'-регуляторная область гена Ос14 неметилирована в ЭС клетках Mus mus cuius (1+1%; проанализированных CpG дуплетов были метилированы), но геперметилирована в фибробластах Mus caroli (42+5%; рис. 5), в которых отсутствует его экспрессия.

ЭС клетки M. musculus Фибробласты M. caroli

(1+1%) (42+5%)

Клетки гибридного клона M. musculus M. caroli

(3+2%) (13±3%)

Рис. 5. Профили метилирования 5'-регуляторной области гена Oct4 в ЭС клетках, фибробластах и гибридных клетках. Белыми кружками обозначены неметилированные сайты, черными - метилированные. В скобках указан процент метилированных сайтов + стандартная ошибка.

Поскольку последовательность 5'-регуляторной области гена Oct4 у М. musculus и М. caroli имеет различия, метод бисульфитного секвенирования позволяет отдельно исследовать метилирование аллелей родительских видов в гибридных клетках. Анализ клеток высоко плюрипотентного клона гибридных клеток (любезно предоставленного Васильковой A.A.), полученных при слиянии ЭС клеток М. musculus и фибробластов М. caroli, показал, что оба родительских эпиаллеля Oct4 были деметилированы (рис. 5). Эти результаты согласуются с полученными ранее данными по метилированию 5'-регуляторной области Oct4 в межвидовых гибридных клетках типа М. musculus ЭС клетка-спленоцит М. caroli (Battulin et al., 2009).

48 часов после слияния

Гибридные клетки с ЭС-подобной морфологией (1+1%, 27+4%)

Гибридные клетки с фибробласто-подобной морфологией (2+1%. 53+5%)

96 часов после слияния

Гибридные клетки с ЭС-подобной морфологией (1+1%, 7+2%)

Гибридные клетки с фибробласто-подобной морфологией (47+5%. 57+5%)

8 дней после слияния

Гибридные клетки с фибробласто-лодобной морфологией М. тизси/иэ (60+4%)

М. саго// (64+5%)

о—•—ово-с- -

-0-§С - -____ -

~о#-#—#-8о-##—•

Рис. 6. Профили метилирования 5'-регуляторной области гена Ое/4 в гибридных клетках через 48, 96 часов и 8 дней после слияния (А, Б и В соответственно). Белыми кружками обозначены неметилированные сайты, черными - метилированные. В скобках указан процент метилированных сай тов + стандартная ошибка.

Анализ профилей метилирования ДНК 5'-регуляторной области Oct4 в гибридных клетках через 48 ч, 96 ч и 8 дней после слияния

Анализ профилей метилирования 5'-регуляторной области гена Oct4 на ранних этапах формирования гибридных клеток проводили отдельно для клеток с ЭС-подобной морфологией и фибробласто-пододобной морфологией. Через 48 ч после слияния в гибридных клетках с ЭС-подобной морфологией эпиаллель гена Oct4 ЭС клетки был неметилирован (1±1%, проанализированных CpG дуплетов были метилированы), эпиаллель гена Oct4 фибробласта был заметно гипометилирован (27+4%), по сравнению с уровнем метилирования 5'-регуляторной области Oct4 в исходных фибробластах, но оставался выше, чем в ЭС клетках (рис. 6А). Через 96 ч после слияния в гибридных клетках с ЭС-подобной морфологией уровень метилирования обоих эпиаллелей Ос!4 был сопоставим с таковым в ЭС клетках (1+1% для эпиаллеля M. musculus и 7+2% для эпиаллеля M. caroli; рис. 6Б).

В гибридных клетках с фибробласто-подобной морфологией через 48 ч после слияния степень метилирования обоих эпиаллелей была сходной с таковой в родительских клетках: 2+1% для эпиаллеля Oct4 M. musculus и 53+5% - для эпиаллеля Oct4 M. caroli (рис. 6А). Через 96 ч и 8 дней после слияния в таких гибридных клетках метилирование обоих эпиаллелей Oct4 было на уровне, характерном для фибробластов (рис. 6Б, В).

Таким образом, метилирование-деметилирование 5'-регуляторной области гена Oct4, как один из механизмов «закрепления» результатов репрограммирования этого гена в гибридных клетках, реализуется в течение 4-х дней после слияния.

Состояние неактивной Х-хромосомы в гетерокарионах и гибридных

клетках

Наличие двух активных Х-хромосом (для клеток мыши с кариотипом: 2N = 40,XX) является одним из признаков плюрипотентного состояния клеток. После слияния ЭС клеток (с кариотипом: 2N = 40,XY) и соматических клеток (2N = 40,XX) в гибридных клетках происходит реактивация неактивной Х-хромосомы, что является одним из признаков репрограммирования генома соматической клетки (Matveeva et al, 1998; Tada et al, 2001; Do etal., 2007; Do et al., 2008).

Триметилирование гистона НЗ по лизину в 27 положении (НЗК27теЗ) является признаком неактивного хроматина, при проведении иммунофлуоресцентного анализа клеток с кариотипом 2N = 40,XX с использованием антител против НЗК27теЗ в ядрах обнаруживают интенсивно окрашенные тельца, соответствующие неактивной Х-хромосоме (Maherali et al., 2007; Silva etal., 2008). Иммунофлюоресцентный анализ H3K27me3, проведенный нами на культуре фибробластов (2N = 40,XX), показал, что в интерфазных ядрах 85% клеток мы наблюдали сигнал, соответствующий неактивной Х-хромосоме, такого сигнала не было выявлено в ядрах ЭС клеток с кариотипом 2N = 40,XY (рис. 7А).

Ц 100% 75%

НЗК27теЗЛЗРРЛЭАР1 НЗК27т»ЗЮАР1

«Звь» К м

Ш ЗОрт 1 I I 1 > ЗОит 1111

^ 100% -1

75% ■ ■ ■

| [II 1

4 8 21 45 69

Время послеслияния (ч)

Гетерокарионы с "ожидаемым" фенотипом: в одном из ядер есть один сигнал, соответствующий неактивной Х-хромосоме

Щ Гетерокарионы с ЭС-подобным фенотипом: маленькая цитоплазма, нет ни одного сигнала, соответствующего неактивной Х-хромосоме

Гетерокарионы с "промежуточным" фенотипом: большая цитоплазма, нет ни одного сигнала, соответствующего неактивной Х-хромосоме

21 45 69

Время послеслияния (ч)

53 Колонии гибридных клеток с ЭС-подобным фенотипом: маленькая цитоплазма, нет ни одного сигнала, соответствующего неактивной Х-хромосоме

Ц Скопления гибридных клеток с фибробласто-подобным фенотипом: большая цитоплазма, есть сигнал, соответствующий неактивной Х-хромосоме

Скопления клеток с "промежуточным" фенотипом большая цитоплазма, нет ни одного сигнала, соответствующего неактивной Х-хромосоме

Рис. 7. А - Иммунофлюоресцентное окрашивание НЗК27шеЗ в ЭС клетках с кариотипом: 2>) = 40,ХУ (слева) и фибробластах 21^ = 40,XX (справа). Стрелками указан сигнал, соответствующий неактивной Х-хромосоме. Антитела против иммуноглобулинов мечены флуорохромом А1еха Ииог 546, ядра окрашены БАР1. Б и В - Анализ данных иммунофлюоресцентного окрашивания НЗК27теЗ в гетерокарионах и гибридных клетках, соответственно, через разное время после слияния ЭС клеток 2Ы = 40,ХУ и фибробластов 2N = 40,XX. Доверительные интервалы построены для вероятности р = 0,95.

Мы провели иммунофлюоресцентный анализ гетерокарионов и гибридных клеток, полученных в результате трех независимых гибридизаций ЭС клеток (2К = 40,ХУ) и фибробластов (214 = 40,XX). Через 4 ч после проведения гибридизации 79% гетерокарионов обладали «ожидаемым» фенотипом (то есть в одном из ядер присутствовало одно интенсивно окрашенное тельце), и 18% гетерокарионов имели «промежуточный» фенотип (клетки с крупной

многоотростчатой цитоплазмой, а в ядрах нет ни одного сигнала НЗК27теЗ). Сходная ситуация сохранялась и через 8 ч после слияния. Через 21 ч после проведения гибридизации доля гетерокарионов с «промежуточным» фенотипом возрастала до 30% и продолжала расти. Через 45 ч и 69 ч после слияния гетерокарионы с «ожидаемым» фенотипом и «промежуточным» фенотипом присутствовали в приблизительно равных соотношениях (рис. 7Б). Через 21ч после слияния клетки 49% колоний имели «промежуточный» фенотип (крупную многоотростчатую цитоплазму, а в ядрах нет ни одного ярко окрашенного тельца), 15% колоний состояли из клеток с ЭС-подобным фенотипом, а оставшиеся колонии состояли из клеток с фибробласто-подобным фенотипом. Через 45 ч и 69 ч после слияния колонии, состоящие из клеток с ЭС-подобным и «промежуточным» фенотипами, составляли в примерно равном соотношении большинство колоний гибридных клеток, тогда как лишь 20% колоний состояли из клеток с фибробласто-подобным фенотипом (рис. 7В).

Подводя итог проделанной работе, основываясь на результатах трех независимы анализов (анализе экспрессии генов, метилирования ДНК и активации Х-хромосомы) можно говорить, что репрограммирование генома соматической клетки начинается на стадии гетерокариона. Мы наблюдали не доминирование генома менее дифференцированной клетки (в нашем случае ЭС клетки) в составе гибридной клетки, а альтернативное проявление геномов родительских клеток, в виде гетерогенности популяции гетерокарионов и гибридных клеток, среди которых были как ЭС-подобные клетки, так и фибробласто-подобные клетки. Существование гибридных клеток с двумя контрастными морфологиями не является следствием изменения соотношения родительских геномов, однако механизм формирования альтернативных фенотипов не ясен и требует дальнейшего изучения.

ВЫВОДЫ

1. Модифицирован метод идентификации гетерокарионов и гибридных клеток в первые часы после слияния ЭС клеток и фибробластов, основанный на использовании флуоресцентных маркеров, дискриминирующих родительские типы клеток. Показано, что надежность такой идентификации составляет не менее 90%. Впервые установлено, что через 21ч после слияния выявляются два морфологически различных типа гибридных клеток: один, имеющий сходство с ЭС клетками, другой - с фибробластами.

2. Показано, что через 21 ч после слияния ЭС клеток и фибробластов в гибридных клетках, имеющих морфологическое сходство с ЭС клетками, есть экспрессия Ос(4 и Nanog - генов, характерных для плюрипотентных клеток, но отсутствуют коллаген I типа, фибронектин и ламин А/С, маркеры, типичные для фибробластов. Сигнал, выявляемый антителами к НЗК27теЗ, маркирующий неактивную Х-хромосому, не обнаружен в гибридных клетках такого типа.

3. Установлено, что в течение 96 ч после слияния ЭС клеток М. ти$си\и$ и фибробластов М. сагоИ в гибридных клетках, имеющих морфологическое сходство с ЭС клетками, происходит деметилирование ДНК 5'-регуляторной области эпиаллеля фибробласта гена ОШ, до уровня характерного для этого района в ЭС клетках.

4. Впервые показано, что через 21ч после слияния ЭС клеток и фибробластов в гибридных клетках морфологически сходных с фибробластами отсутствуют Oct4 и Nanog. Для части гибридных клеток такого морфологического типа показана экспрессия коллагена I типа, фибронектина и ламина А/С, а также выявлен сигнал, маркирующий неактивную Х-хромосому.

5. В течение 96 ч после слияния в гибридных клетках, имеющих морфологическое сходство с фибробластами, происходит метилирование ДНК 5'-регуляторной области эпиаллеля ЭС клеток гена Oct4 до уровня характерного для этого района Oct4 фибробластов.

6. Впервые показано, что для гибридных клеток, полученных при слиянии диплоидных ЭС клеток и диплоидных фибробластов, наблюдается альтернативное проявление родительских геномов и формируются контрастные типы гибридных клеток: в одном из которых, доминирует геном, привнесенный ЭС клетками, другом - доминирует геном фибробласта.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Круглова A.A., Гридина М.М., Матвеева Н.М., Серов О Л. Гибридные клетки, полученные слиянием эмбриональных стволовых клеток с ди- и тетраллоидными фибробластами, имеют альтернативные родительские фенотипы // Докл. Акад. Наук. 2008. Т. 422. №1. С. 125-127. (Перечень ВАК)

2. Kruglova A.A., Kizilova Е.А., Zhelezova A.I., Gridina M.M., Golubitsa A.N., Serov O.L. Embryonic stem cell-fibroblast hybrid cells with near-tetraploid karyotype provide high yield of chimeras // Cell Tissue Res. 2008. V. 334. P. 371-380. (Перечень ВАК)

3. Kruglova A.A., Matveeva N.M., Gridina M.M., Battulin N.R., Karpov A.V., Kiseleva E.V., Morozova K.N., Serov O.L. Dominance of parental genomes in embryonic stem cell/fibroblast hybrid cells depends on the ploidy of the somatic partner // Cell Tissue Res. 2010. DOI: 10.1007/s00441 -010-0987-3. (Перечень ВАК)

4. Матвеева H.M., Круглова A.A., Гридина М.М., Кизилова Е.А., Батгулин Н.Р., Пузаков М.В., Серов O.JI. Доминантность и рецессивность родительских геномов в гибридных клетках, полученных слиянием диплоидных эмбриональных стволовых клеток с ди- и тетраплоидными фибробластами // 3rd International Conference Basic Science for Medicine. Новосибирск. 2007. С. 66.

5. Круглова A.A., Гридина М.М., Матвеева Н.М., Серов O.JI. Влияние плоидности соматического партнера на фенотип гибридных клеток, полученных при слиянии с эмбриональными столовыми клетками // Тезисы международной научной конференции молодых ученых "Проблемы молекулярной и клеточной биологии". Томск. 10-12 мая. 2007. С. 106-107.

6. Кизилова Е.А., Круглова A.A., Голубица А.Н., Железова А.И., Гридина М.М., Матвеева Н.М., Серов ОЛ. Анализ химеризма генерированного инъекцией в бластоцель гибридных клеток, полученных слиянием эмбриональных стволовых клеток с фибробластами // Симпозиум с международным участием «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза». Москва. 9-11 октября 2007. С. 74-76.

7. Kruglova A.A., Gridina М.М., Matveeva N.M., Serov O.L. Phenotype and chromosome segregation in hybrid cells generated by fusion embryonic stem cells and tetraploid fibroblasts // IV International Meetings Stem Cells Network North Rhine-Westphalia. Düsseldorf. Germany. 8-9 October. J. Regenerative Medicine. Nov. 2007. Vol.2. No. 6. P.S8.

8. Круглова A.A., Гридина M.M., Мензоров А.Г., Матвеева Н.М., Серов O.JI. Фенотип гибридных клеток, полученных при слиянии эмбриональных стволовых

клеток и тетраплоидных фибробластов // Цитология. Тезисы докладов. Санкт-Петербург. 16-19 октября 2007. Т. 49, № 9. С. 762.

9. Gridina М.М., Kruglova А.А., Matveeva N.M., Serov O.L. Alternative dominance of parental genomes in embryonic stem cell-fibroblast cell hybrids // Abstracts of papers presented at the LXXIII Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. Control and regulation of stem cell. Cold Spring Harbor, USA. 28 May - 2 June. 2008. P.71

10. Gridina M.M., Kruglova A.A., Kizilova E.A., Matveeva N.M., Serov O.L. Alternative expression of parental genomes in embryonic stem cell-fibroblast cell hybrids // BIT Life Sciences 1st Annual World Congress of Regenerative Medicine and Stem Cells. Foshan, China, December 2-4,2008, P. 105.

11. Круглова A.A., Матвеева H.M., Кизилова E.A., Гридина М.М., Батгулин Н.Р., Пристяжнюк И.Е., Серов О.Л.. Сходство ранних стадий перепрограммирования фибробластов после их слияния с эмбриональными стволовыми клетками и при индукции в них шпорипотентности путем транзиторной трансфекции векторами экспрессиругощими OCT4/SOX2 // V Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров. Москва. 21-27 июня 2009. Т. 1. С. 131.

12. Gridina М.М., Serov O.L. Reprogramming of parental genomes in Embryonic stem cell - fibroblast heterokaryons and synkaryons // Abstract book of the 5th Royan international on stem cells biology and technology. Tehran. Iran. 23 - 25 September 2009. P.96.

13. Серов О.Л., Круглова A.A., Матвеева H.M., Гридина М.М., Кизилова Е.А., Батгулин Н.Р. Ранние стадии перепрограммирования фибробластов в гетеро- и синкарионах и при индукции в них шпорипотентности с помощью трансфекции векторами экспрессиругощими Oct4/Sox2 и Nanog/Lin28 II Тезисы докладов и сообщений, представленных на Всероссийский симпозиум по биологии клетки в культуре «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» (Санкт-Петербург, 12-14 октября 2009 г.) Цитология, 2009, Т.51, №9. С. 785.

Подписано к печати 17.05.2010

Формат бумаги 60 х 90 1/16. Печ. 1. Уч. изд. 07.

Тираж 110 экз. Заказ 48.

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гридина, Мария Михайловна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Эмбриональные стволовые клетки.

1.1.1. Рост ЭС клеток в культуре.

1.1.2. Способы оценки плюрипотентности ЭС клеток.

1.1.3. Внешние факторы, необходимые ЭС клеткам.

1.1.4. Транскрипционные факторы, регулирующие плюрипотентное состояние ЭС клеток.

1.1.5. Эпигенетическая регуляция плюрипотентности.

1.1.5.1. Организация хроматина в ЭС клетках.

1.1.5.2. Метилирование ДНК в ЭС клетках.

1.1.5.3. Состояние Х-хромосом в ЭС клетках.

1.2. Репрограммирование геномов соматических клеток через слияние с ЭС клетками.

1.2.1. Метод слияния клеток.

1.2.2. Гибридные клетки между ЭС клетками и соматическими клетками

1.2.2.1. Потенциал гибридных клеток между ЭС клетками и соматическими клетками.

1.2.2.2. Профиль экспрессии генов в гибридных клетках.

1.2.2.3. Эпигенетическое состояние генома гибридных клеток.

1.2.3. Для репрограммирования генома соматической клетки необходимо и достаточно ядро ЭС клетки.

1.2.4. Ранние этапы процесса репрограммирования.

1.2.4.1. Ранние этапы процесса перепрограммирования при слиянии двух соматических клеток.

1.2.4.2. Ранние этапы процесса репрограммирования при слиянии ЭС клеток и соматических клеток.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование ранних стадий образования гибридных клеток, получаемых при слиянии эмбриональных стволовых клеток и фибробластов"

Эксперименты по переносу ядер соматических клеток в энуклеированный ооцит, впервые выполненные еще в середине XX века на амфибиях, показали, что в результате действия факторов, содержащихся в цитоплазме ооцита, возможно восстановление потенциала соматической клетки. Реконструированные ооциты в редких случаях (не более 2-4%) способны обеспечить развитие эмбриона и рождение животного. Данный метод был успешно применен ко многим видам млекопитающих, таким как: овца, мышь, корова, коза, свинья, кролик, кошка и многие другие (Wilmut etal., 1997; Gurdon, Byrne, 2003). Следует подчеркнуть, что даже при использовании ядер терминально дифференцированных клеток таких как, например, B-лимфоцитов, в которых произошла перестройка иммуноглобулиновых генов, возможно рождение «клонированных» животных (Hochedlinger, Jaenisch, 2002). Процесс, в результате которого происходит восстановление утраченного ранее потенциала соматических клеток, благодаря чему такие клетки способны обеспечить полное развитие организма, был назван репрограммированием. В ходе этого процесса происходит кардинальное изменение профиля экспрессии генов, глобальная реорганизация (ремоделирование) хроматина, деметилирование ДНК, корректировка экспрессии импринтированных генов, изменения модификаций и набора гистоновых белков и восстановление укороченных концов теломер (Tamada, Kikyo, 2004). Всестороннее изучение репрограммирования, в свою очередь, может помочь в понимании процессов, происходящих в развитии и при дифференцировке клеток.

Помимо переноса ядер соматических клеток в энуклеированный ооцит, существуют и другие способы репрограммирования генома соматической клетки. В 1996 году было обнаружено, что слияние мышиных эмбриональных стволовых (ЭС) клеток и спленоцитов приводит к формированию гибридных клеток, которые обладают многими свойствами ЭС клеток, в том числе способностью участвовать в формировании химерных животных (Матвеева и др., 1996; Matveeva et al., 1998). Эти данные нашли подтверждение в целом ряде экспериментов по слиянию ЭС клеток с В- и Т-лифмоцитами (Tada et al., 2001; Kimura et al., 2004), незрелыми нейральными клетками (Do et al., 2004), незрелыми гемопоэтическими клетками (Ying et al., 2003) и фибробластами (Sullivan et al., 2006; Kruglova et al., 2008). Высокая репрограммирующая активность ЭС клеток человека была также показана в опытах по их слиянию с фибробластами (Cowan et al., 2005). Исследования таких гибридных клеток показали, что в них происходит: активация генов, неактивных в соматических клетках (таких как Oct4 и Nanog), реактивация неактивной Х-хромосомы, изменения профилей метилирования ДНК и модификаций гистоновых белков (Tada et al., 2001; Kimura et al., 2004; Do et al., 2007; Battulin et al., 2009). Все это является свидетельствами репрограммирования, происходящего в геноме соматической клетки после слияния с ЭС клеткой. Изменения профиля экспрессии генов, происходящие в гибридных клетках такого типа, а также приобретение этими клетками плюрипотентных свойств говорит о доминировании генома ЭС клеток над геномом соматических клеток.

Представление о доминировании генома одного партнера по слиянию над другим долгое время было популярным не только в случае гибридов, получаемых при слиянии ЭС клеток с соматическими клетками, но и для гибридных клеток, получаемых при слиянии двух соматических клеток различной тканевой принадлежности. После слияния двух соматических клеток возможно, используя ингибиторы клеточного деления, оставить клетку на стадии гетерокариона, когда в общей цитоплазме присутствуют два ядра родительских клеток. В таких гетерокарионах, как правило, доминирует более крупный и чаще делящийся партнер, и под его воздействием меняется организация второго ядра и паттерн экспрессии генов в нем на свойственный доминантному ядру. Примерами такого доминирования могут служить гетерокарионы, полученные при слиянии эритроцитов птиц или амфибий с какими-либо растущими и делящимися в культуре клетками млекопитающих (Harris, 1967) или при слиянии кератиноцитов мыши с миобластами мыши (Zhang etal., 2007). Однако недавно появилась работа, в которой показано обоюдное влияние геномов в гетерокарионах между кератиноцитами и мышечными клетками, а не доминирование одного над другим (Palermo etal., 2009). Таким образом, возникает вопрос - возможно ли альтернативное проявление геномов родительских клеток при слиянии соматических клеток с ЭС клетками или же в данном случае наблюдается строгое доминирование ядер ЭС клеток?

Цели и задачи исследования. Целью данного исследования является изучение динамики становления фенотипа гибридных клеток на ранних стадиях после слияния диплоидных ЭС клеток мыши с диплоидными эмбриональными фибробластами мыши. Нас интересовали следующие вопросы: 1) характер проявления родительских геномов в гетерокарионах и гибридных клетках в первые часы и сутки после слияния ЭС клеток с фибробластами; 2) когда появляются первые признаки репрограммирования одного из родительских геномов; 3) когда происходит становление фенотипа гибридных клеток.

Для достижения целей были поставлены следующие задачи: 1. Модифицировать метод идентификации гетерокарионов и гибридных клеток на ранних стадиях после слияния ЭС клеток и фибробластов.

2. Провести иммунофлюоресцентный анализ маркеров плюрипотентных ЭС клеток (Ос14 и Ыапод), фибробластов (коллагена I типа и фибронектина) и дифференцированных клеток (ламина А/С) в гетерокарионах и гибридных клетках в первые часы (от 4-ого до 20-ого) и дни (от 1-го до 4-го) после слияния ЭС клеток и фибробластов.

3. Провести анализ профилей метилирования ДНК 5'-регуляторной области гена ОсМ в гибридных клетках через разные интервалы времени после слияния ЭС клеток и фибробластов.

Научная новизна и практическая значимость.

3. Впервые показано, что деметилирование ДНК 5'-регуляторной области эпиаллеля фибробласта гена ОсМ в гибридных клетках с фенотипом ЭС клеток происходит в течение первых 4-х дней после слияния, в то же время в гибридных клетках с фибробласто-подобным фенотипом происходит метилирование 5'-регуляторной области эпиаллеля ЭС клеток гена ОсМ.

Материалы диссертации изложены в 3-х статьях, опубликованных в отечественном и международных журналах.

Положения, выносимые на защиту. В клетках, получаемых при слиянии диплоидных ЭС клеток мыши и диплоидных фибробластов мыши, начиная со стадии гетерокариона, наблюдается альтернативное проявление родительских геномов. В результате чего формируются гибридные клетки, обладающие двумя контрастными фенотипами: ЭС-подобным и фибробласто-подобным.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Гридина, Мария Михайловна

ВЫВОДЫ

1. Модифицирован метод идентификации гетерокарионов и гибридных клеток в первые часы после слияния ЭС клеток и фибробластов, основанный на использовании флуоресцентных маркеров, дискриминирующих родительские типы клеток. Показано, что надежность такой идентификации составляет не менее 90%. Впервые установлено, что через 21 ч после слияния выявляются два морфологически различных типа гибридных клеток: один, имеющий сходство с ЭС клетками, другой - с фибробластами.

2. Показано, что через 21 ч после слияния ЭС клеток и фибробластов в гибридных клетках, имеющих морфологическое сходство с ЭС клетками, есть экспрессия ОЫ4 и Ыапод - генов, характерных для плюрипотентных клеток, но отсутствуют коллаген 1-го типа, фибронектин и ламин А/С, маркеры, типичные для фибробластов. Сигнал, выявляемый антителами к НЗК27теЗ, маркирующий неактивную Х-хромосому, не обнаружен в гибридных клетках такого типа.

3. Установлено, что в течение 96 ч после слияния ЭС клеток М. тивсиШв и фибробластов М. сагоН в гибридных клетках, имеющих морфологическое сходство с ЭС клетками, происходит деметилирование ДНК 5'-регуляторной области эпиаллеля фибробласта гена ОсМ, до уровня характерного для этого района в ЭС клетках.

4. Впервые показано, что через 21 ч после слияния ЭС клеток и фибробластов в гибридных клетках морфологически сходных с фибробластами отсутствуют Ос14 и Ыапод. Для части гибридных клеток такого морфологического типа показана экспрессия коллагена 1-го типа, фибронектина и ламина А/С, а также выявлен сигнал, маркирующий неактивную Х-хромосому.

5. В течение 96 ч после слияния в гибридных клетках, имеющих морфологическое сходство с фибробластами, происходит метилирование

ДНК 5'-регуляторной области эпиаллеля ЭС клеток гена ОсМ до уровня характерного для этого района 0&4 фибробластов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гридина, Мария Михайловна, Новосибирск

1. Круглова А.А., Гридина М.М., Матвеева Н.М. и др. Гибридные клетки, полученные слиянием эмбриональных стволовых клеток с ди- и тетроплоидными фибробластами, имеют альтернативные родительские фенотипы // Доклады АН. 2008. V. 422. Р. 125-127.

2. Матвеева Н.М., Шилов А.Г., Байбородин С.И. и др. Гибриды между эмбриональными стволовыми и соматическими клетками сохраняют плюрипотентность //Доклады АН. 1996. V. 349. Р. 129-132.

3. Мензоров А.Г. Матвеева Н.М., Ларкин Д.М., и др. Судьба родительских митохондрий в эмбриональных стволовых гибридных клетках // Цитология. 2008. V. 50. Р. 711-718.

4. Пузаков М.В., Баттулин Н.Р., Темирова С.А., и др. Анализ экспрессии родительских аллелей Xist и Gla в межвидовых эмбриональных гибридных клетка в условиях индуцированной in vitro инактивации Х-хромосом // Онтогенез. 2007. V. 38. Р. 1-8.

5. Рингерц Н., Сэвидж Р. Гибридные клетки // М.: Мир. 1979. С. 191-209.

6. Ambrosi D.J., Tanasijevic В., Kaur A. et al. Genome-wide reprogramming in hybrids of somatic cells and embryonic stem cells // Stem Cells. 2007. V. 25. P. 1104-1113.

7. Atkin N.B., Baker M.C., Robinson R. et al. Chromosome studies on 14 near-diploid carcinomas of the ovary// Eur. J. Cance. 1974. V. 10. P. 144-146.

8. Avilion A.A., Nicolis S.K., Pevny L.H. et al. Multipotent cell lineages in early mouse development depend on SOX2 function // Genes Dev. 2003. V. 17. P. 126-40.

9. Baharvand H., Matthaei K.I. The ultrastructure of mouse embryonic stem cells // Reproductive Bio. Med. Online. 2003. V. 7. P. 330-335.

10. Baribault H., Kemler R. Embryonic stem cell culture and gene targeting in transgenic mice // Mol. Biol. Med. 1989. V. 6. P. 481-492.

11. Barski G., Sorieul S., Cornefert F. Production dans des cultures in vitro de deux souches cellulaires en association de cellules de caractere "hybride" // C. R. Acad. Sc. 1960. V. 251. P. 1825-1827.

12. Boumil R.M., Lee J.T. Forty years of decoding the silence in X-chromosome inactivation // Hum Mol Genet. 2001. V. 10. P. 2225-2232.

13. Boyer L.A., Lee T.I., Cole M.F. etal. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells // Cell. 2005. V. 122. P. 947-956.

14. Cartwright P., McLean C., Sheppard A. etal. LIF/STAT3 controls ES cell self-renewal and pluripotency by a Myc-dependent mechanism // Development. 2005. V. 132. P. 885-896.

15. Chambers I., Colby D., Robertson M. etal. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells // Cell. 2003. V. 113. P. 643-655.

16. Collas P., Noer A., Timoskainen S. Programming the genome in embryonic and somatic stem cells //J. Cell. Mol. Med. 2007. V. 4. P. 602-620.

17. Constantinescu D., Gray H.L., Sammak P.J. et al. Lamin A/C expression is a marker of mouse and human embryonic stem cell differentiation // Stem Cells. 2006. V. 24. P. 177-185.

18. Cowan C.A., Atienza J., Melton D.A. etal. Nuclear reprogramming of somatic cells after fusion with human embryonic stem cells // Science. 2005. V. 309. P. 1369-1373.

19. Do J.T. and Scholer H.R. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells//Stem Cells . 2004. V. 22. P. 941-949.

20. Do J.T. and Scholer H.R. Comparison of neurosphere cells with cumulus cells after fusion with embryonic stem cells: reprogramming potential // Reprod Fertil Dev. 2005. V. 17. P. 143-149.

21. Do J.T. Han D.W., Gentile L. et al. Erasure of cellular memory by fusion with pluripotent cells//Stem Cells. 2007. V. 25. P. 1013-1020.

22. Do J.T. Han D.W., Gentile L., et a/. Enhanced Reprogramming of Xist by Induced Upregulation of Tsix and Dnmt3a II Stem Cells. 2008. V. 26. P. 2821-2831.

23. Evans M.J. and Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos // Nature. 1981. V. 292. P. 154-156.

24. Farivar S., Yamaguchi S., Sugimoto M. et al. X-chromosome inactivation in differentiating mouse embryonic stem cells carrying X-linked GFP and lacZ transgenes // Int. J. Devel. Biol. 2004. V. 48. P. 629-635.

25. Gidekel S., Bergman Y. A unique developmental pattern of Oct-3/4 DNA methylation is controlled by a cis-demodification element // J Biol Chem. 2002. V. 277. P. 34521-34530.

26. Gossler A., Doetschman T.C., Korn R. et al. Transgenesis by means of blastocyst derived embryonic stem cell lines // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 9065-9069.

27. Gu P., Menuet D., Chung A.C.K. et al. Differential Recruitment of Methylated CpG Binding Domains by the Orphan Receptor GCNF Initiates the Repression and Silencing of Oct4 Expression // Mol. Cel. Biol. 2006. V. 26. P. 9471-9483.

28. Gurdon J.B. and Byrne J.A. The first half-century of nuclear transplantation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 2003. V. 100. P. 8048-8052.

29. Han D.W., Do J.T., Gentile L. etal. Pluripotential reprogramming of the somatic genome in hybrid cells occurs with the first cell cycle // Stem Cells. 2008. V. 26. P. 445-454.

30. Harris H. The reactivation of the red cell nucleus // J. Cell Sci. 1967. V. 2. P. 23-32.

31. Harris H. and Watkins J. F. Hybrid ceils derived from mouse and man: artificial heterokaryons of mammalian cells from different species // Nature. 1965. V. 205. P. 640-646.

32. Hattori N., Nishino К., Ко Y. et al. Epigenetic control of mouse Oct-4 gene expression in embryonic stem cells and trophoblast stem cells // J. Biol Chem. 2004. T. 279. P. 17063-17069.

33. Hattori N., Imao Y., Nishino K. etal. Epigenetic regulation of Nanog gene in embryonic stem and trophoblast stem cells // Genes Cells. 2007. V. 12. P. 387-396.

34. Hiratani I., Leskovar A., Gilbert D.M. Differentiation-induced replication-timing changes are restricted to AT-rich/long interspersed nuclear element (LINE)-rich isochores // Proc Natl Acad Sci. USA. 2004. V. 101. P. 16861-16866.

35. Hochedlinger K. and Jaenisch R. Monoclonal mice generated by nuclear transfer from mature В and T donor cells // Nature. 2002. V. 415. P. 1035-1038.

36. Hough S.R., Clements I., Welch P.J. etal. Differentiation of mouse embryonic stem cells after RNA interference-mediated silencing of OCT4 and Nanog 11 Stem Cells. 2006. V. 24. P. 1467-1475.

37. Kahan B.W. and Ephrussi B. Developmental potentialities of clonal in vitro cultures of mouse testicular teratoma // J. Natl. Cancer Inst. 1970. V. 44. P. 1015-1036.

38. Kim J., Chu J., Shen X. etal. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells // Cell. 2008. V. 132. P. 1049-1061.

39. Kimura H., Tada M., Hatano S. et al. Chromatin reprogramming of male somatic cell-derived Xist and Tsix in ES hybrid cells // Cytogenet. Genome Res. 2002. V. 99. P. 106-114.

40. Kimura H., Tada M., Nakatsuji N. et al. Histone code modifications on pluripotential nuclei of reprogrammed somatic cells // Mol Cell Biol. 2004. V. 24. P. 5710-5720.

41. Kinoshita K., Ura H., Akagi T. etal. GABPalpha regulates Oct-3/4 expression in mouse embryonic stem cells // Biochem Biophys Res Commun. 2007. V. 353. P. 686-691.

42. Ko S.Y., Kang H.Y., Lee H.S. et al. Identification of Jmjdla as a STAT3 downstream gene in mES cells // Cell Struct Funct. 2006. V. 31. P. 53-62.

43. Kruglova A.A., Kizilova E.A., Zhelezova A.I. etal. Embryonic stem cell/fibroblast hybrid cells with near-tetraploid karyotype provid high yield of chimeras // Cell Tissue Res. 2008. V. 334. P. 371-380

44. Kuroda T., Tada M., Kubota H. etal. Octamer and Sox elements are required for transcriptional eis regulation of Nanog gene expression // Mol Cell Biol. 2005. V. 25. P. 2475-2485.

45. Latha B.M. Role of Signaling pathways and transcription factors in the self renewal and pluripotency of embryonic stem cells // Current Trends in Biotechnology and Pharmacy. 2008. V. 2. P. 349-366.

46. Legros F., Malka F., Frachon P. et al. Organization and dynamics of human mitochondrial DNA//J. Cell Sei. 2004. V. 117. P. 2653-2662.

47. Li J., Greco V., Guasch G. etal. Mice cloned from skin cells // Proc. Natl. Acad. Sei. 2006. V. 104. P. 2738-2743.

48. Li J. Pan G., Cui K. et al. A dominant-negative form of mouse SOX2 induces trophectoderm differentiation and progressive polyploidy in mouse embryonic stem cells//J Biol Chem. 2007. V. 282. P. 19481-19492.

49. Liu N., Lu M., Tian X. et al. Molecular mechanisms involved in self-renewal and pluripotency of embryonic stem cells // J. Cell Physiol. 2007. V. 211. P. 279-286.

50. Loh Y.H., Zhang W., Chen X. et al. Jmjdla and Jmjd2c histone H3 Lys 9 demethylases regulate self-renewal in embryonic stem cells // Genes Dev. 2007. V. 21. P. 2545-2557.

51. Maherali N., Sridharan R., Xie W. et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution // Cell Stem Cell. 2007. V. 1. P. 55-70.

52. Maherali N., Ahfeldt T., Rigamonti A. et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells // Cell Stem Cell. 2008. V. 3. P. 340-345.

53. Marikawa Y., Fujita T.C., Alarcon V.B. Heterogeneous DNA methylation status of the regulatory element of the mouse Oct4 gene in adult somatic cell population // Cloning Stem Cells. 2005. V. 7. P. 8-16.

54. Martin G.R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells // Proc. Natl. Acad. Sci. 1981. V. 78. P. 7634-7638.

55. Matsumura H., Tada M., Otsuji T. et al. Targeted chromosome elimination from ES-somatic hybrid cells // Nat. Methods. 2007. V. 4. P. 23-25.

56. Matveeva N.M., Shilov A.G., Kaftanovskaya E.M. et al. In vitro and in vivo study of pluripotency in intraspecific hybrid cells obtained by fusion of murine embryonic stem cells with splenocytes // Mol Reprod Dev. 1998. V. 50. P. 128-138.

57. Mayer W., Niveleau A., Walter J. et al. Demethylation of the zygotic paternal genome // Nature. 2000. V. 403. P. 501-502.

58. Meshorer E., Yellajoshula D., George E. et al. Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells // Dev Cell. 2006. V. 10. P. 105-116.

59. Miller R.A. and Ruddle F.H. Pluripotent teratocarcinomathymus somatic cell hybrids // Cell. 1976. V. 9. P. 45-55.

60. Mitsui K., Tokuzawa Y., Itoh H. et al. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells // Cell. 2003. V. 113. P. 631-642.

61. Nagy A., Gocza E., Diaz E.M. et al. Embryonic stem cells alone are able to support fetal development in the mouse // Development. 1990. V. 110. P. 815-821.

62. Nichols J., Zevnik B., Anastassiadis K. et al. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryos depends on the POU transcription factor Oct4 II Cell. 1998. V. 95. P. 379-391.

63. Niwa H., Miyazaki J., Smith A.G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells // Nat.Genet. 2000. V. 24. P. 372-376.

64. Niwa H., Burdon T., Chambers I. et al. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3 // Genes Dev . 1998. V. 12. P. 2048-2060.

65. Okada Y., Murayama F. Multinucleated giant cell formation by fusion between cells of two different strains // Exp. Cell Res. 1965. V. 40. P. 154-158.

66. Okita and Yamanaka. Intracellular signaling pathways regulating pluripotency of embryonic stem cells // Curr Stem Cell Res & Therapy. 2006. V. 1. P. 103-111.

67. Oswald J., Engemann S., Lane N. et al. Active demethylation of the paternal genome in the mouse zygote // Curr. Biol. 2000. V. 10. P. 475-478.

68. Palermo A., Doyonnas R., Bhutani N. et al. Nuclear reprogramming in heterokaryons is rapid, extensive, and bidirectional // FASEB J. 2009. V. 23. P. 1431-1440.

69. Pan G.J., Pei D.Q. Identification of two distinct transactivation domains in the pluripotency sustaining factor nanog// Cell Res. 2003. V. 13. P. 499-502.

70. Pan G., Li J, Zhou Y., Zheng H. et al. A negative feedback loop of transcription factors that controls stem cell pluripotency and self-renewal // FASEB J . 2006. V. 20. P. 1730-1732.

71. Panning B. and Jaenisch R. DNA hypomethylation can activate Xist expression and silence X-linked genes // Genes Dev. 1996. V. 10. P. 1991-2002.

72. Pereira C.F., Terranova R., Ryan N.K. et al. Heterokaryon-based reprogramming of human B lymphocytes for pluripotency requires Oct4 but not Sox2// PLOS Genetics. 2008. V. 4. P.e1000170.

73. Perry P., Sauer S., Billon N. et al. A dynamic switch in the replication timing of key regulator genes in embryonic stem cells upon neural induction // Cell Cycle. 2004. V. 3. P. 1645-1650.

74. Pralong D., Trounson A.O., and Verma P.J. Cell fusion for reprogramming pluripotency toward elimination of the pluripotent genome // Stem Cell Reviews. 2006. V. 2. P. 331-340.

75. Pratt T., Sharp L., Nichols J. et al. Embryonic stem cells and transgenic mice ubiquitously expressing a tau-tagged green fluorescent protein // Dev. Biol. 2000. V. 228. P. 19-28.

76. Rodda D.J., Chew J,L., Lim L.H. et al. Transcriptional regulation of Nanog by OCT4 and SOX2 // J. Biol Chem. 2005. V. 280. P. 24731-24737.

77. Scholer H.R., Ciesiolka T., Gruss P. A nexus between Oct-4 and E1 A: implications for gene regulation in embryonic stem cells // Cell. 1991. V. 66. P. 291-304.

78. Shen Y., Chow J., Wang Z. et al. Abnormal CpG island methylation occurs during in vitro differentiation of human embryonic stem cells // Hum. Mol. Genet. 2006. V. 15. P. 2623-2635.

79. Silva J. Mak W., Zvetkova I. et al. Establishment of Histone H3 Methylation on the Inactive X Chromosome Requires Transient Recruitment of Eed-Enx1 Polycomb Group Complexes // Dev. Cell. 2003. V. 4. P. 481-495.

80. Silva J., Barrandon O., Nichols J. et al. Promotion of Reprogramming to Ground State Pluripotency by Signal Inhibition // PLoS Biol. 2008. V. 10.

81. Singh A.M., Hamazaki T., Hankowski K.E. et al. A Heterogeneous Expression Pattern for Nanog in Embryonic Stem Cells // Stem Cells. 2007. V. 25. P. 2534-2542.

82. Smith H.S., Riggs J.L., Mosseson M.W. Production of fibronectin by human epithelial cells in culture // Canser Res. 1979. V. 39. P. 4138-4144.

83. Stead E., White J., Faast R. et al. Pluripotent cell division cycles are driven by ectopic Cdk2, cyclin A/E and E2F activities // Oncogene. 2002. V. 21. P. 8320-8333.

84. Stadtfeld M., Maherali N., Breault D.T. et al. Defining Molecular Cornerstones during Fibroblast to iPS Cell Reprogramming in Mouse // Cell Stem Cell. 2008. V. 2. P. 230-240.

85. Sullivan S., Pells S., Hooper M. et al. Nuclear Reprogramming of Somatic Cells by Embryonic Stem Cells Is Affected by Cell Cycle Stage II Cloning and stem cells. 2006. V. 8. P. 174-188.

86. Tada M., Takahama YM Abe K. et al. Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells // Curr Biol. 2001. V. 11. P. 1553-1558.

87. Tada M., Tada T., Lefebvre L. et ai Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells // EMBO J. 1997. V. 16. P. 6510-6520.

88. Tamada H., Kikyo, N. Nuclear reprogramming in mammalian somatic cell nuclear cloning // Cytogenet Genome Res. 2004. V. 105. P. 285-291.

89. Terranova R., Pereira C.F., Du Roure C. et al. Acquisition and extinction of gene expression programs are separable events in heterokaryon reprogramming // J. Cell Sci. 2006. V. 119. P. 2065-2072.

90. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., ShapiroS.S. et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts // Science. 1998. V. 282. P. 1145-1147.

91. Tsumura A., Hayakawa T., Kumaki Y. etal. Maintenance of self-renewal ability of mouse embryonic stem cells in the absence of DNA methyltransferases Dnmtl, Dnmt3a and Dnmt3b // Genes Cells. 2006. V. 11. P. 805-814.

92. Ura H., Usuda M., Kinoshita K. etal. STAT3 and Oct-3/4 control histone modification through Induction of Eed in embryonic stem cells // J. Biol Chem. 2008. V. 283. P. 9713-9723.

93. Vasilkova A.A., Kizilova H.A., Puzakov M.V. etal. Dominant manifestation of pluripotency in embryonic stem cell hybrids with various numbers of somatic chromosomes // Mol Rep and Dev. 2007. V. 74. P. 941-951.

94. Veomrtt G., Prescott D.M., Shay J. et al. Reconstruction of mammalian cells from nuclear and cytoplasmic components separated by treatment with cytochalasin B // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1974. V. 5. P. 1999-2002.

95. Wakayama S., Hikichi T., Suetsugu R. etal. Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies // Stem Cells. 2007. V. 25. P. 986-993.

96. Wiblin A.E., Cui W., Clark A.J. etal. Distinctive nuclear organization of centromeres and regions involved in pluripotency in human embryonic stem cells // J Cell Sci. 2005. V. 118. P. 3861-3868.

97. Williams R.L., Hilton D.J., Pease S. etal. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells II Nature. 1988. V. 336. P. 684-687.

98. Wilmut I., Schnieke A.E., McWhir J. et al. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells // Nature . 1997. V. 385. P. 810-813.

99. Wobus A.M., Holzhausen H., Jakel P. et al. Characterization of a pluripotent stem cell line from a mouse embryo // Exp. Cell Res. 1984. V. 152. P. 810-813.

100. Yeom Y.I., Fuhrmann G., Ovitt C.E. etal. Germline regulatory element of Oct-4 specific for the totipotent cycle of embryonal cells // Development. 1996. V. 122. P. 881-894.

101. Yerganian G. and Nell M.B. Hybridization of dwarf hamster cells by UV-inactivated Sendai virus // Proc Natl Acad Sci. 1966. V. 55. P. 1066-1073.

102. Ying Q.L., Nichols J., Chambers I. etal. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3 // Cell. 2003 V. 115. P. 281-292.

103. Yoshimizu T., Sugiyama N., De Felice M. etal. Germline-specific expression of the Oct-4/green fluorescent protein (GFP) transgene in mice // Dev Growth Differ. 1999. V. 41. P. 675-684.

104. Yu J. and Thomson J.A. Pluripotent stem cell lines // Genes Dev. 2008. V. 22. P. 1987-1997.

105. Zhang F., Pomerantz J.H., Sen G. etal. Active tissue-specific DNA demethylation conferred by somatic cell nuclei in stable heterokaryons // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2007. V. 104. P. 4395-4400.

106. Zuccotti M., Monk M. Methylation of the mouse Xlst gene in sperm and eggs correlates with imprinted Xist expression and paternal X-inactivation // Nat. Genet. 1995. V. 9. P. 316-320.

Информация о работе

Гридина, Мария Михайловна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2010
ВАК 03.02.07

Диссертация

Исследование ранних стадий образования гибридных клеток, получаемых при слиянии эмбриональных стволовых клеток и фибробластов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Исследование ранних стадий образования гибридных клеток, получаемых при слиянии эмбриональных стволовых клеток и фибробластов - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы