Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оценка плюрипотентности клеточных гибридов, полученных от слияния эмбриональных стволовых клеток и спленоцитов мыши

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Оценка плюрипотентности клеточных гибридов, полученных от слияния эмбриональных стволовых клеток и спленоцитов мыши"

На правах рукописи УДК 575.16

□□ЗОВ45ВБ

А

ПУЗАКОВ МИХАИЛ ВАСИЛЬЕВИЧ

ОЦЕНКА ПЛЮРИПОТЕНТНОСТИ КЛЕТОЧНЫХ ГИБРИДОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ОТ СЛИЯНИЯ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И СПЛЕНОЦИТОВ МЫШИ

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2.3 АВ Г 2007

Новосибирск 2007

003064566

Работа выполнена в Лаборатории генетики развития Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Серов Олег Леонидович Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Стегний Владимир Николаевич Томский государственный университет, НИИ биологии и биофизики, г. Томск

кандидат биологических наук, Шевченко Александр Игоревич Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Институт общей генетики РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится 19 сентября 2007 года на утреннем заседании диссертационного совета Д-003.011,01 в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: проспект акад. Лаврентьева 10, г. Новосибирск, 630090, тел/факс: (383)3331278, e-mail: dis.sov@bionet.nsc.ru С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан « » августа 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук ——/г.Д. Груздев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Одной из фундаментальных проблем генетики развития является изучение плюрипотентности — способности клеток к дифференцировке в различные клеточные типы in vitro и in vivo, которая характерна для клеток эмбриона на ранних стадиях развития и эмбриональным стволовым клеткам (ЭСК). То, какими механизмами осуществляется контроль над сохранением и утратой этого свойства в процессе дифференцировки клеток, к настоящему времени остается во многом неясным. С этим вопросом связана также не менее важная проблема, касающаяся эпигенетических изменений генома, происходящих при дифференцировке клеток, и возможности репрограммирования генома дифференцированных клеток взрослых животных. Долгое время считалось, что эмбриональные клетки очень рано теряют плюрипотентность, однако было показано, что пересадка ядер дифференцированных клеток, взятых у взрослого животного, в энуклеированные ооциты не препятствует нормальному развитию организма (Di Berardino, 1997; Wilmut et al., 1997; Wakayama et al., 1998). Таким образом, было установлено, что ядра дифференцированных клеток способны репрограммироваться и даже обеспечить полное развитие организма. Метод переноса ядер в последнее время широко применяется в клонировании млекопитающих и является очень эффективным способом репрограммирования ядер дифференцированных клеток. Однако существует альтернативный, не менее эффективный, экспериментальный подход к репрограммированию генома дифференцированных клеток, основанный на использовании высокого потенциала эмбриональных стволовых клеток, при их слиянии с дифференцированными клетками (Матвеева и др., 1996; Matveeva et al., 1998; Tada et al., 2001).

В настоящее время ЭСК, полученные из внутренней клеточной массы бластоцисты, являются «связующим звеном» в исследованиях in vitro и in vivo. При культивировании ЭСК сохраняют плюрипотентные свойства в течение длительного времени, однако индукция дифференцировки in vitro приводит к образованию в культуре различных клеточных типов, соответствующих трем зародышевым листкам эмбриона. Более того, ЭСК, при введении в бластоцисту, принимают участие в образовании большинства органов и тканей химерных животных, в том числе и гонад (Tarn, Rossant, 2003). Культуры ЭСК широко используются для изучения функции гена и для создания трансгенных животных, для исследования ранних этапов дифференцировки и сохранения плюрипотентности.

Для изучения плюрипотентности клеток применяют разносторонние методы. Для гисто- и иммуногистохимического анализа плюрипотентности используют маркеры, характерные для клеток ВКМ: активность щелочной фосфатазы и поверхностные антигены. Способность участвовать в формировании органов и тканей химерного животного (Таш, Rossant, 2003), а также в формировании тератом (Wobus et al., 1984) и эмбриоидных телец (Rastan, Robertson, 1985), является наиболее адекватным свидетельством высокого потенциала исследуемых клеток. По наличию экспрессии таких генов

как Oct4, Sox2 и Nanog, «генов плюрипотентности», можно также оценить, являются ли клетки плюрипотентными.

Клеточные гибриды, получаемые слиянием ЭСК с дифференцированными клетками, представляют уникальную экспериментальную модель, в которой гомологи с разным онтогенетическим статусом находятся в одном ядре. Гибридные клетки такого типа сохраняют плюрипотентные свойства на достаточно высоком уровне и, что очень важно, гены дифференцированного партнера репрограммируются в результате взаимодействия с геномом ЭСК (Matveeva et al., 1998; Tada et al., 2001; 2003; Terada et al., 2002; Ying et al., 2002; Do, Schôler, 2004). Одним из несомненных достоинств такой модельной системы является возможность создания набора гибридных клеток с разным соотношением родительских хромосом. То есть открывается возможность оценить роль индивидуальных хромосом в поддержании плюрипотентности и исследовать способность отдельных хромосом к репрограммированию. И хотя в большинстве работ гибридные клетки имеют около- или тетраплоидный кариотип (Tada et al., 2001, 2003; Terada et al., 2002; Ying et al., 2002; Cowan et al., 2005), полного описания состава хромосом проведено не было.

Используемые в данной работе межвидовые клеточные гибриды серии НМС, полученные от слияния ЭСК Mus musculus и спленоцитов близкого вида мыши M. caroli (Серов и др., 2003), имеют целый ряд преимуществ, наиболее важным из которых является детально описанный хромосомный состав (Matveeva et al., 2005; Пристяжнюк и др., 2005). Результаты подсчета хромосом показали, что их количество варьирует в широких пределах, как внутри каждого клона, так и между клонами - от околодиплоидного до околотетраплоидного. В большинстве клонов среднее число хромосом было существенно ниже тетрагагоидного, что указывает на сегрегацию хромосом, имевшую место в период от момента слияния клеток до момента цитогенетического анализа. Цитогенетический и микросателлитный анализ продемонстрировали сохранение всех маркеров хромосом M. musculus и значительное разнообразие по содержанию хромосом M caroli - от нескольких до полного диплоидного соответствия. Более того, некоторые гибридные клоны, будучи тетраплоидными, содержали одну или несколько хромосом соматического партнера вследствие «скрытой» сегрегации (Пристяжнюк и др., 2005).

Другое преимущество гибридных клонов серии НМС состоит в том, что использование в клеточной гибридизации разных, но близкородственных видов, облегчило поиск генетических различий в кодирующих участках генов и позволило нам надежно маркировать аллельные варианты разного родительского происхождения.

Благодаря используемой нами экспериментальной модели появилась возможность для более полной оценки плюрипотентности и интерпретации полученных данных в соответствии с общим хромосомным составом и присутствием хромосом соматического партнера.

Цель и задачи работы

Цель работы заключалась в оценке плюрипотентности межвидовых клеточных гибридов, полученных от слияния эмбриональных стволовых клеток мыши М. musculus и спленоцитов М. caroli.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить плюрипотентность клонов межвидовых гибридных клеток in vitro с помощью маркеров, характерных для недифференцированных клеток: активности щелочной фосфатазы и эмбрионального поверхностного антигена ЕСМА-7.

2. Сравнить плюрипотентность клонов межвидовых гибридных клеток в экспериментах in vivo - получение химерных животных, с последующей оценкой вклада гибридных клеток в формирование тканей и органов химер.

3. Изучить в клонах межвидовых гибридных клеток экспрессию генов Oct4 и Nanog, ответственных за поддержание плюрипотентности.

4. Сравнить экспрессию родительских аллелей генов Oct4, Nanog и Gla в гибридных клетках и, тем самым, оценить способность к репрограммированию генома дифференцированных клеток взрослого животного.

5. Оценить активность Х-хромосом, полученных из геномов с различным эпигенетическим статусом, при индуцированной дифференцировке гибридных клеток in vitro.

Научная новизна работы.

1. Впервые проведено комплексное исследование плюрипотентности межвидовых гибридных клеток серии НМС, полученных слиянием эмбриональных стволовых клеток мышей М. musculus линии 129/01а и спленоцитов М. caroli. Для оценки плюрипотентности использовали молекулярные, гисто- и иммуногистохимические маркеры, а таюке тест на получение химерных животных. Показано, что уровень плюрипотентности в гибридных клетках типа ЭСК-спленоцит мало зависим или полиостью независим от числа хромосом соматического партнера в гибридном кариотипе, то есть плюрипотентность проявляется у гибридных клеток как доминантный признак.

2. В данной работе впервые описаны химерные животные, полученные микроинъекционным способом с использованием межвидовых клеточных гибридов серии НМС. Показано сохранение хромосом соматического партнера в потомках гибридных клеток при развитии химерного организма.

3. В гибридных клетках серии НМС впервые проведен анализ активности Х-хромосом, полученных из геномов с различным эпигенетическим статусом, и показано отсутствие предпочтительной инактивации Х-хромосом при индуцированной дифференцировке гибридных клеток in vitro.

Положения, выносимые на защиту. В клонах гибридных клеток серии НМС, полученных слиянием эмбриональных стволовых клеток М. musculus со спленоцитами взрослой самки М. caroli, показано присутствие активности щелочной фосфатазы и эмбрионального антигена ЕСМА-7 (маркеров, свойственных недифференцированным эмбриональным клеткам) и «маркеров плюрипотентности» Nanog и Oct4. Показана реактивация аллелей генов Oct4, Nanog и Gla М. caroli, неактивных в геноме спленоцитов. Анализ экспрессии

генов Gla и Xist в гибридных клетках после индуцированной дкфференцировки их in vitro показал отсутствие признаков предпочтительной инактивации Х-хромосом, имеющих разную «онтогенетическую историю». Установлено, что клоны гибридных клеток, содержащие единичные хромосомы М. caroli и клоны с высоким содержанием хромосом М. caroli, способны участвовать в формировании тканей и органов химерных животных. Полученные данные свидетельствуют о сохранении плюрипотентности у гибридных клеток серии НМС на уровне сходным с ЭСК и, более того, о доминировании этого свойства у клеточных гибридов такого типа.

Научно-практическая значимость работы. Результаты данной работы способствуют расширению знаний о процессах поддержания плюрипотентности и репрограммирования и используются при чтении курса «Генетика развития» в НГУ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 93 страницах, содержит 16 рисунков и 8 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе были использованы культуры клеток: ЭСК, линии НМ-1 (ГФРТ-; ХУ); 20 первичных ГАТ-резистентных клонов межвидовых гибридных клеток серии НМС, полученных от слияния ЭСК линии НМ-1 мыши М. musculus и спленоцитов мыши М. caroli (ГФРТ+; XX) (Серов и др., 2003). Кроме того, в работе использовали 2 субклона гибридного клона НМС15. Культивирование клеток проводили по методу описанному ранее (Matveeva et al., 1998, 2005).

Гистохимическое выявление щелочной фосфатазы проводилось согласно методу описанному ранее (Pain et al., 1996). Для оценки активности щелочной фосфатазы на окрашенных препаратах подсчитывалось число колоний клеток различного типа: состоящие из окрашенных клеток (АР+), из неокрашенных клеток (АР-) и как из окрашенных, так и неокрашенных клеток (АРсм), общая выборка составляла 500-700 колоний. Затем подсчитывалась доля колоний каждого типа.

Иммуногистохимическое выявление экспрессии ЕСМА7 (Baribault Н., KemlerR., 1989).

Для получения эмбриоидных телец in vitro культуру клеток трипсинизировали и суспендировали стандартным способом. Клеточную суспензию высевали на обработанные 1% агарозой чашки в ростовую среду, не содержащую LIF (Robertson, 1997; Matveeva et al., 1998). Эмбриоидные тельца брали в анализ на 9-12 сутки.

Для получения химерных животных 10-20 ЭСК или гибридных клеток инъецировали в реципиентные бластоцисты мышей линии C57B1/J6. Инъецированные бластоцисты трансплантировали реципиентным псевдобеременным самкам Fl (C57D1/J6 х CBA-Lac) (Matveeva et al., 1998).

Вклад ЭСК и гибридных клеток в ткани химерных животных оценивали с помощью биохимического выявления аллельных вариантов глюкозофосфатизомеразы (ГФИ) (DeLorenzo, Ruddle, 1969).

Выделение ДНК из клеток проводили с помощью DNAzol согласно рекомендациям производителя (Life Technology, USA), из эмбриоидных телец ДНК выделяли с использованием Trizol Reagent (Life Technology, USA) согласно рекомендациям производителя и го тканей животных — фенол-хлороформным методом (Маниатис и др., 1984).

Тотальную РНК из клеток, эмбриоидных телец, а также из тканей взрослых мышей выделяли с использованием Trizol Reagent (Life Technology, USA) согласно рекомендациям производителя.

Для синтеза кДНК использовали набор реактивов Reverse Transcription System (Promega, USA) по методу производителя.

Реакционная смесь ПЦР объемом 25 мкл содержала ПЦР буфер (65 мМ Tris-HCl, рН 8,8, 16 мМ (NH4)2S04 и 0,01% Twecn 20), 1,5-3,0 мМ MgCl2 (табл. 1), 0,2 мМ каждого дезоксннуклеотида (дАТФ, дЦТФ, дГТФ, дТТФ), по 1 мкМ обоих праймеров (табл. 1), 0,5 ед. Taq ДНК полимеразы и 50-500 нг ДНК. Условия ПЦР включали исходную денатурацию геномной ДНК в течение 3 мин при 95°С, 30 циклов амплификации (денатурация 30 сек при 95°С, отжиг праймеров 15-30 сек при Т указанной в таблице 1, элонгация 20 сек при 72°С), элонгация в течение 3 мин при 72°С. Для электрофоретического разделения фрагментов ДНК использовали 3% агарозный гель.

Рестрикционный анализ проводили в реакционной смеси объемом 20 мкл содержащей 17 мкл раствора амплифицированной ДНК, 100 мкг/мл BSA, 2 мкл десятикратного буфера для соответствующей рестрикгазы и 5 ед. фермента. Использовали эндонуклеазы рестрикции Pstl, Dral, Hinfl (СибЭнзим, Россия) и Hhal (Promega, USA). Смесь инкубировали в течение 2 ч при 37°С.

Таблица 1. Праймеры и условия ПЦР для оценки экспрессии в ЭСК и гибридных

клетках, а так же анализа химерных животных.

Ген/ маркер Последовательность праймера, от 5' к 3' Длина фрагмента, ПН MgCl2, мМ T отжига, °С

Actb ACGCACGATTTCCCTCTCAGC GGCCCAGAGCAAGAGAGGTATCC 460 2,0 58

Oct4 CTCGAACCACATCCTTCTCT GGCGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTC 312 2,0 58

Xisi ATCTAAGACAAAATACATCATTCCG CTTGGACTTAGCTCAGGTTTTGTGTC 250 3,0 55

Gla GTTCATGCAGATGGCAGAGC CAGTGACAACCATCAAATTTTAGC 318 2,5 58

Nanog GTGGTTGAAGACTAGCAATGG CCAGATGTTGCGTAAGTCTC 462 2,5 55

Nanog CACAGAGTAGTTCAGGAATAATTCC CTTCGGGGAGGACTTTCTG 148 2.5 55

Gla CCCAACGCTTTCCTAGTGGA TGCAAGGCACAACCACGC 255 1,5 58

Catsperl GGACAACCCATCAACAACACTT GGTGACTGAACGGCGCAAT 131 2,5 55

D9Mitl81 CCTCCCACAGTTCCTCATGT CTGGTCTGGCCTCAGGTG - 2,4 59

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка плгорнпотентностн клеточных гибридов с помощью маркеров недифференцированного состояния клеток.

Для первичной оценки плюрипотентности клонов серии НМС мы использовали маркеры недифференцированного состояния клеток, такие как: ферментативная активность щелочной фосфатазы (Wobus et al., 1984) и эмбриональный поверхностный антиген ЕСМА-7 (Baribault, Kemler, 1989). Гистохимический анализ гибридных клеток показал, что клоны по доле АР+ колоний можно разделить на три условные группы. Первая, в которой более 70% АР+ колоний, вторая - 30-70%, и третья — менее 30%. При этом доля АР+ колоний в ЭСК линии НМ-1 составляла около 90%. 6 клонов были иммуногистохимически проанализированы на наличие экспрессии ЕСМА7. У всех клонов выявлено присутствие этого маркера. На основании этих данных можно предположить, что все клоны сохраняют плюрипотентность, однако часть из них имеет большую склонность к дифференцировке.

Оценка плюрипотентности гибридных клеток в тесте на хнмеризм.

Для тестов на химеризм были взяты контрастные по содержанию хромосом соматического партнера и общему количеству хромосом клоны гибридных клеток НМС 15, НМС29 и субклоны НМС 15-1, НМС 15-4. У клона НМС 15 и его субклонов общий набор хромосом варьирует от триплоидного до тетраплоидного, а количество хромосом M. caroli - от 1 до 3 (Matveeva et al., 2005; Vasilkova et al., 2007), тогда как клон HMC29 содержит 80% клеток с диплоидным и околодиплоидным набором хромосом и 13 хромосом M. caroli (Matveeva et al., 2005). Нами были получены химерные животные: от клеток клона НСМ15 - две химерные самки, от клеток клона НСМ29 - один химерный самец, от клеток субклона НМС 15-1 - две самки и три самца и от клеток субклона НМС 15-4 - самка и шесть самцов. Общая доля химерных животных для клонов немногим отличалась от таковой для контрольной линии ЭСК НМ-1.

По окраске шерсти вклад клеток клона НСМ15 оценивался как 30% и 50%. Вклад потомков субклона НМС 15-1 по окраске шерсти составлял 5%, тогда как у субклона НМС 15-4 этот показатель варьировал в интервале от 5% до 30%. Вклад клеток клона НСМ29 по окраске шерсти оценивался как 5%. Для анализа вклада гибридных клеток в зародышевый путь были проведены скрещивания химерных животных с мышами линии C57B1/J6 и CBA-Lac. В результате этих скрещиваний от каждого химерного животного было получено 4-5 полноценных потомств, однако не было получено ни одного потомка с фенотипом 129/01а и с фенотипом агути (А.Н. Голубица, А.И. Железова, личное сообщение).

Вклад ЭСК линии НМ-1 потомков ЭСК по окраске шерсти достигал 50%, однако от этих химер также не было получено потомков с фенотипом 129/01а и с фенотипом агути (А.Н. Голубица, А.И. Железова, личное сообщение).

гибридные клоны серии НМС

органы н НМС15 НМС15-1 НМС15-4 НМС29

ткани номер химеры

#9,9 #21,9 #22,3 #24, 2 #25, с? #п,с? #12,3 #13, с? #14, с? #15, с? #16, с? #3,с?

семешшк или яичник + - + - - + нт + + + + -

селезенка + - - - - - - - - - - -

почка + + + - + + - - - - + +

печень + - - - - + - - - - - +

сердце + - - + - - - - + - + +

мозг + - - - + + + + + + + -

легкое + - - - - - - - - + - -

толстая кишка + + нт + - + +

тонкая кишка + + нт - -

глаз + + - + + + + + - + + +

скелетная мускулатура + - - - - + - + + - + +

кожа + + + + + + + + + + + +

"+" - присутствие маркера донорских клеток "-" - отсутствие маркера донорских клеток "их" . анализ не проводился.

В таблице 2 представлены суммарные результаты анализа вклада клеток линии НМ-1 и гибридов серии НМС в различные ткани и органы химерных животных. Этот вклад оценивали с помощью нескольких маркеров. Благодаря тому, что линия мышей 129/01а (клетки НМ-1) и линия С57ВШ6 (реципиентная линия мышей) имеют разные изоформы ГФИ, стало возможным выявлять вклад донорских клеток в органы химерных животных с помощью электрофоретического разделения в крахмальном геле. В связи с различной длиной микросателлита В9Мк181 маркирующего хромосому 9 у линии мышей 129/01а и линии С57В1ЛГ6, мы так же могли качественно показать вклад клеток в органы химер. Однако оба эти маркера выявляют присутствие потомков гибридных клеток только по наличию генома ЭСК НМ-1, тогда как используемые видоспецифичные маркеры хромосомы 19 (ген Са1Брег1) и Х-хромосомы (ген С 1а) выявляют присутствие генетического материала мыши М. сагоИ. По данным, полученным Баттулиным Н.Р. последовательности фрагментов гена С1а мыши М. сагоП (ОепВапк Ас. N0. БС)218140) и М. тшыйия, а так же последовательности фрагментов гена Са1зрег1 М. сагоП (ОепВапк Ас. N0. В<3021499) и М. тшсЫш имеют различия. На основе этих различий были созданы праймеры, которые позволили селективно амплифицировать фрагмент размером 255 пн гена й1а М. сагоП и фрагмент размером 132 пн гена Сагярег! М. сагоН.

А: '

г

12 3 4 56 7 8 9

Б .......*

12 3 4 5 6 7 8 9 Ю

Рис. 1. Вклад потомков клеточных гибридов в органы и ткани химерных животных. А - химера #9 (донор клеток клон НМС15): 1 - семенпики; 2 - селезенка; 3 -почка; 4 - печень; 5 - сердце; 6 - контроль, линия мышей С57В1Л; 7 - контроль, линия клеток НМ-1; 8 - икроножная мышца; 9 - головной мозг. Б - химера #3 (донор клеток клон НМС29): 1 - семенники; 2 - селезенка; 3 - почха; 4 - печень; 5 - контроль, линия клеток НМ-1; б - контроль, линия мышей С57В1/1; 7 - сердце; 8 - мозг; 9 - кишечник; 10 - скелетная мускулатура (икроножная мышца).

Для химеры, полученной с участием клеггок клона НМС15, с помощью микросателлита 09Мк181 показан вклад во все органы, при этом выявлялся только продукт, специфичный для родительской линии клеток НМ-1. По результатам электрофоретического анализа аллельных вариантов ГФИ присутствие потомков клеток клона НМС 15 выявлено во всех исследованных органах химерного животного (рис. 1, А). По визуальной оценке, вклад

гибридных клеток примерно равен вкладу клеток реципиентного эмбриона. Анализ химеры с помощью маркера Х-хромосомы М. caroli гена Gla не выявил присутствие этого маркера ни в одном органе. Можно предположить, что это животное образовалось с участием клеток НМ-1, которые в некотором количестве могли сохраниться в исходном клоне НМС15 при селективных условиях за счет кооперативного эффекта (Hooper et al., 1982). Соответственно, высокий вклад потомков клеток гибридного клона НМС15 в формирование химерного животного можно также объяснить участием НМ-1 клеток.

Субклоны НМС15-1 и НМС15-4, также как и исходный клон НМС15, имели околотетраплоидный набор хромосом (И.Е. Пристяжнюк, личное сообщение), и содержали 2 и 1 гомеолога М. caroli, соответственно, а также небольшую долю околодиплоидных клеток. Однако происхождение субклонов НМС15-1 и НМС15-4 из единичных клеток клона НМС15 полностью исключало присутствие в них клеток родительской линии НМ-1, то есть все клетки субклонов имеют гибридное происхождение. У всех полученных химерных животных вклад потомков клеток субклонов по окраске шерсти (5-15%) значительно снизился в сравнении с контрольной линией ЭСК и с исходным клоном НМС15 (30-50%). Вклад в органы и ткани потомков клеток субклона HMCI5-4 по биохимическому и молекулярным маркерам оказался также несколько меньше (не был выявлен вклад в селезенку, печень, легкие) по сравнению с контрольной линией ЭСК и с исходным клоном НМС15 (табл.2). Тем не менее, клетки субклона НМС15-4 дают вклад во все три зародышевых листка, но со сниженным вкладом в производные энтодермы. Вклад субклона НМС15-1 в формировании химер по тем же оценкам оказался более снижен относительно НМС15-4. Для химер, полученных с участием клеток субклона НМС15-1, показан вклад гибридных клеток в формирование лишь 5-ти органов. Такое снижение химеризма возможно связано не только с присутствием хромосом М. caroli и гибридным происхождением клеток, но и с селекцией в процессе развития в пользу диплоидных клеток ВКМ реиипиентной бластоцисты по отношению к клеткам субклонов с высокой плоидностью (Everett, West, 1996, 1998).

Вклад потомков клеток гибридного клона НМС29 был ограничен по сравнению с родительской линией НМ-1, с клоном НМС15 и с субклоном НМС15-4. По результатам электрофоретического разделения ГФИ вклад выявлен только в нескольких органах: семенник, сердце, мозг, кишечник (рис. 1, Б), а ПЦР анализ с видоспецифичными маркерами показал вклад в 7-ми из 12-ти органов (табл. 2). Возможно, что наличие большого количества хромосом мыши М. caroli ограничивает потенциал клеток клона НМС29, что проявляется как снижение химеризма по окраске шерсти и по вкладу в отдельные ткани. Однако если оценивать по закладкам, то потомки клеток клона НМС29 дают вклад во все три зародышевых листка, хотя вклад в производные энтодермы очень низкий (табл. 2).

Особо следует отметить, что, несмотря на выявленное присутствие потомков гибридных клеток в гонадах, их прохождение через зародышевый путь установлено не было, так как не было получено потомства химерных животных

с генами от донорских клеток. Возможно, это связано с накопленными хромосомными перестройками у ЭСК линии НМ-1 в процессе пассирования, или с несбалансированностью набора хромосом у клонов НМС15 и НМС29, и субклонов НМС15-1 и НМС15-4.

Данные о вкладе клеток клонов в формирование органов химер свидетельствуют о том, что гибридные клетки сохраняют плюрипотентность. Важным отличием данной работы от предшествующих является то, что был проведен частичный анализ хромосомного состава химерных животных, полученных из эмбриональных гибридных клеток. Для корректной оценки потенциала гибридных клеток необходимо быть уверенным, что химерные животные произошли именно из клеток, имеющих хромосомы соматического партнера. Нами показано, что маркеры, по крайней мере, 2-х хромосом соматического партнера не элиминируются. Это свидетельствует о том, что в процессе развития химерного животного, когда снимается селективное давление факторов использованных при получении гибридных клеток (ГAT), и в то же время включаются механизмы клеточной селекции связанные с несбалансированностью генома гибридных клеток или повышенной плоидностью, доля потомков клеточных гибридов с хромосомами соматического партнера достаточно велика.

В целом, полученные данные о вкладе гибридных клеток в формировании химер показали, что клоны с разным числом хромосом соматического партнера (спленоцитов), от 1-3 в клоне НМС 15 и его субклонах до 13 хромосом в клоне НМС29, имеют сходный уровень плюрипотентности, который, в свою очередь, сопоставим с таковым родительских клеток НМ-1. Эти данные свидетельствуют о том, что плюрипотентность проявляется у гибридных клеток как доминантный признак. Следует также отметить, что этот вывод получил подтверждение в недавних исследованиях в лаборатории генетики развития, где удалось получить серию химерных животных в опытах по инъекции гибридных клеток типа ЭСК-фибробласт (Е.А. Кизилова, личное сообщение) и имевших околотетраплоидный кариотип. Более того, микросателлитный анализ показал, что все хромосомы фибробластного происхождения присутствовали в гибридных клетках ЭСК-фибробласт (A.A. Круглова, личное сообщение).

Анализ экспрессии «генов плюрипотентности» Oct4 и Nanog в гибридных клетках.

Еще одним способом оценки плюрипотентности является анализ экспрессии генов Oct4 и Nanog. Эти гены активны только в раннем эмбриональном развитии и являются ключевыми в поддержании плюрипотентных свойств, наличие их экспрессии свидетельствует о сохранении плюрипотентности в гибридных клетках. Анализ экспрессии гена Oct4 показал, что во всех клонах серии НМС выявляются транскрипты этого гена, хотя следует отметить, что в клонах НМС6 и НМС44 уровень его экспрессии низкий. Анализ экспрессии другого молекулярного маркера «плюрипотентности» - гена Nanog показал, что во всех клонах серии НМС присутствуют его транскрипты. Однако в клоне НМСб уровень экспрессии этого гена заметно снижен.

Предполагаемое снижение уровня экспрессии генов ОМ и Nanog в некоторых клонах согласуется с их повышенной склонностью к дифференцировке, так что, по-видимому, большинство клеток этих клонов находится на начальных этапах дифференцировки и лишь небольшая доля клеток обладает плюрипотентными свойствами и экспрессирует Ос14 и

Сравнение экспрессии родительских аллелей генов Ос14, Nanog и С/я в гибридных клетках.

Для дискриминации транскриптов аллелей генов Ос14, Nanog и (7/а, экспрессирующиеся в ЭСК и в спленоцитах альтернативным образом, был использован рестрикционный полиморфизм между аллелями родительских видов. При сравнении последовательностей фрагментов генов Ос(4 (ОепВапк Ас. N0. 0(3250732), Nanog (ОепВапк Ас. N0. 0(2250731) и Ыа (ОепВапк Ас. N0. 0<3218140) М. сагоИ с гомологичными последовательностями М. ти$си1ш были выявлены видоспецифичные сайты рестрикции (рис. 2) (по данным, полученным Н.Р. Баттулиным).

; OCf-4

' М. caroli ; М. musculus

; G/a

I М. caroll ■ М. musculus

Psti

I

-aggccctgcag ■aggccrt tgcag

ctcag-ctcag-

Hin fl

Jr

■tagtggaatc -tagtgggatc

AAACA' aaaca1

HinH

I

Xist

' M. caroli M. musculus

t

Hin fl

• 58+254 ; ■312

174+46+98 220+98

250

97+153

—gtccttttacatctca-—gtccttttaaatctca-f

Oral

— agccatIgcac!atttta-

— agccatgcgcwtttta-

L_r_r

Hha I

Рис. 2. Различия аллелей генов Oct4, Nanog, Gla и Xist мышей M. caroli и M. musculus.

; Nanog

M. caroli M. musculus

• 148 ■ 101+47

и 00 НМ-1 Саг НМС1 НМС2 НМС4 НМС21 НМС28 НМС2Э НМСЗО НМС41 НМС42 НМС50 НМС56 ИОО I

!312пн " - ■ ' ■ ■ . ;

; —*" -—..:-.. . ~ . . . .............. .

254пн ...___• 1 - ;

Рис. 3. Результаты ОТ-ПЦР анализа экспрессии аллелей М. сагок и М. тшсиЫ.ч гена Ос14 в ЭСК НМ-1 и гибридных клетках серии НМС. Ь - маркер с шагом 100 нп.

На рис. 3 представлены продукты амплификации кДНК гена ОМ клеточных гибридов после обработки ферментом РяА. Фрагмент размером 312 пн соответствует аллелю М. тихсики;, тогда как фрагмент 254 пн

соответствует аллелю М, сагоИ. Выявлено, что в 12 клонах содержащих хромосому 17 М. сагоН наблюдается экспрессия аллеля соматического партнера.

На рис. 4 представлены результаты ОТ-ПЦР-анализа экспрессии аллелей М. сагоН и М. ттслти, гена Иапоё в клонах НМС, Фрагмент размером 148 пн маркирует транскрипт ал л с ля М. сагоН, тогда как фрагмент 10] пн аллель М. тиБсиЬч. Из приведенной иллюстрации видно, что во всех клонах гибридных клеток содержащих хромосому 6 М. сагоН имеет место экспрессия аллеля соматического партнера гена ^'сшор.

148 пн

101 пн

НМС1 НМС2 НМС4 НМС6 НМС15 НМС21 НМ-1

...

148 пн

101 пн

НМС4 НМС6 НМС27 НМС28 НМС47 НМС50

Рис. 4, Результаты ОТ-ПЦР-анализа экспрессии аллелей М. сагоН и М. /тиси!ш гена Nalюg в гибридных клетках серии НМС и ЭСК НМ-1. Присутствие 1ЩР продукта размером 101 пн маркирует транскрипт аллеля М- тиусиШ.ч. а 148 пи экспрессию аллеля М сагоН. (рисунок предоставлен студентом-диплом киком НГУ Н.Р. Баттуяишы)

220 пн

174 пн

220 пн

174 пн

|

НМС1 НМС2 НМС4 НМС6 НМС15 НМС21 НМ-1

■■•■

■.. т^- ^ '

НМС1 НМС28 НМС29 НМС41 НМС56 НМ-1

ш

Рис. 5. Результаты ОТ-пцр-анализа экспрессии аллелей М. сагоН и М. тихайиз гена 0!а В гибридных клетках серии НМС и ЭСК НМ-1, Присутствие ПЦГ продукта размером 220 пн маркирует тралскрипт аллеля Ш ти$си1из, а 174 пн экспрессию аллеля М. сагоН. (рисунок предоставлен студентом-дипломником Н1"У Н.Р. Еаттулиным)

На рис. 5 представлена электрофореграмма продуктов амплификации кДНК гена Gla клеточных гибридов после обработки ферментом Hlnfi. Фрагмент размером 220 пн маркирует транскрипты аллеля М. musculus, фрагмент 174 пн - аллеля М. caroli. Проведенный анализ показал присутствие транскриптов аллеля М. caroli гена Gla во всех исследованных клонах.

Поскольку гены Oct4, Nanog и Gla были неактивны в геноме спленоцитов, то перечисленные выше факты свидетельствуют об их реактивации. Важно отметить, что даже в клоне НМС6, в котором, по-видимому, уровень экспрессии генов Oct4 и Nanog снижен по сравнению и с остальными клонами, и родительской линией ЭСК НМ-1, выявляются транскрипты М. caroli Oct4 и Nanog. На основании полученных данных можно предположить, что при взаимодействии с геномом ЭСК генома дифференцированной клетки (спленоцит) происходит его репрограммирование.

Инактивация Х-хромосомы при индуцированной in vitro дифференцнровке гибридных клонов серии НМС.

Инактивация Х-хромосом у естественных гибридов Ft, полученных от скрещивания М. musculus с М. caroli, происходит случайным и равновероятным способом, то есть количество клеток с активной Х-хромосомой М. musculus и М. caroli примерно одинаково (Chapman, Shows, 1976). Известно, что в гибридных клетках, полученных слиянием ЭСК генотипа ХУ с соматическими клетками генотипа XX или ХУ, Х-хромосомы находятся в активном состоянии (Matveeva et al., 1998; Tada et al. 2001). Также известно, что гибридные клетки, так же как и ЭСК, способны образовывать in vitro эмбриоидные тельца (ЭТ), в которых активно происходят процессы дифференцировки, включая инактивацию одной из Х-хромосом (Rastan, Robertson, 1985; Matveeva et al., 1998).

При слиянии клеток НМ-1 М. musculus генотипа ХУ со спленоцитами взрослой самки М. caroli в гибридной клетке ожидается присутствие 3-х Х-хромосом, две из которых принадлежат М. caroli и одна М. musculus. Однако анализ соотношения родительских Х-хромосом в клонах гибридных клеток (Пузаков и др., 2007) с помощью «двуцветной» гибридизации in situ, показал, что в большинстве изученных клонов клетки содержали две Х-хромосомы, одну М. musculus и другую М. caroli. Учитывая эти данные, мы отобрали 5 гибридных клонов, в которых содержание двух родительских Х-хромосом в большинстве клеток было близким к 1:1, и индуцировали их дифференцировку in vitro. Такой подход позволяет выяснить случайно или неслучайно происходит инактивация Х-хромосом, различавшихся своим онтогенетическим статусом до момента образования гибридных клеток.

Для того чтобы охарактеризовать процесс инактивации Х-хромосом в ЭТ мы использовали два маркерных гена Gla и Xist, первый является маркером активной Х-хромосомы, (активен только ЭСК (Adler et al., 1977), в спленоцитах он неактивен (Freeman et al., 1998)), тогда как второй является не только маркером неактивной Х-хромосомы, но ключевым элементом самого процесса инактивации. Для дискриминации транскриптов родительских аллелей генов Gla и Xist был использован обнаруженный Батгулиным Н.Р. рестрикционный

полиморфизм между М. mm cuius и М. caroli (рис. 2). Аллели гена Gla у М. musculus и М caroli (GcnBank Ac. No. DQ218140) различаются наличием сайта для эндонуклеазы рестрикции Hinjl у М. caroli. Аллель гена Xist (GenBank Ac, No. DQ218L3S) М. caroli отличается от М. musculus наличием сайта ддя эндонуклеазы рестрикции Dral у М. musculus.

Предложенный метод является более масштабным тестом для оценки репрограммирования, нежели реактивация отдельных генов, поскольку инактивация хотя и оценивается на уровне отдельных гекои, но характеризует состояние целой хромосомы.

Анализ транскрипции родительских аллелей генов Xist и Gla проводился в эмбриоидных тельцах ЕВ1. ЕВ28, ЕВ 29, ЕВ4 i и ЕВ56. полученных из суспензионных культур гибридных клонов НМС1, НМС28, IIMC29, 1-ГМС41 и KMC56, соответственно (рис. 6, 7). На рис. 6 представлены результат ОТ-ПЦР анализа экспрессии гена Xis< в ЭТ. Пиказано, что экспрессия гена Xist обнаруживается во всех ЭГ и существенно выше, чем в клетках НМ-1, Обработка ферментом Dral продуктов амплификации с кДНК гена Xist выявила экспрессию обоих аллелей этого гена во всех исследованиях ЭТ. Судя но визуальной оценке, соотношение транскритггов обоих аллелей соответствует примерно без признаков преобладания какого-либо из них.

ЕВ1

гзопн

■■■■ íé

153 пн

ES28

ЕВ29

И 00

ЕВ41

ЕВ56

НМ-1

И 00

шЩ" ,,;-. Ц ■ ' Яр ' ■ mm

Рис. 6. Экспрессия аллелей Ы. caroli и М. musculus гена Xist в ЭТ: ЕВЕ ЕВ28, ЕВ29, ЕВ41, ВВ56, образовавшихся из клеток клонов НМС1. ИМС28, НМС29-3, ИМС41 и НМС56 и из ЭСК НМ-1. "-" - Сеч обработки Г1ЦР продуктов рестриктазой Oral: "+" - пислс обработки ПЦР продуктов рестриктазой Dral; L1G0 - маркер с шагом 100 пн. Присутствие 11ЦР продукта размером 250 пн маркирует транскрипт аллели М. caroli, а 153 пн - аллеля М. musculus

ев1 ев2й ев41 ев56 1-100 hwic1 нмс2э нмс29 нмс41 hwíc56 нм-1

Рис. 7. Результаты ОТ-11ЦР-анализа транскрипции аллелей гена Gla г? гибридных клонах НМСI, ПМС28. НМС29-3, НМС41 и НМС46 и в ЭТ (ЕВ), ЕВ28, ЕВ29. EB4I), обрадовавшиеся из клеток этих клонов, Присутствие ПЦР продукта размером 220 па маркирует активность аллеля М- musculus, а 174 пн экспрессию аллеля М, caroti', фрагмент 98 пн образуется при обработке Hinfl ПЦР продуктов обоих аллелей. Lf 00 -молекулярный маркер с шагом 100 Ш-

При анализе экспрессии гена Gla транскрипты этого гена были обнаружены в пяти исследованных клонах гибридных клеток, в ЭТ, полученных из них, и в ЭСК, тогда как в спленоцитах они отсутствовали (рис. 7). Обработка продуктов ОТ-ПЦР эндонуклеазой рестрикции Hinjl показала, что и в исследованных гибридных клетках и в полученных из них ЭТ наблюдается высокая активность обоих родительских аллелей гена Gla и (по визуальной оценке) примерно в равном соотношении.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о случайной инактивации Х-хромосом M. musculus и M. caroli в гибридных клетках, несмотря на первоначальные эпигенетические различия родительских хромосом, при индуцированной дифференцировке in vitro. Предположительно это может быть результатом «стирания» эпигенетических различий под действием факторов генома плюрипотентного партнера.

ВЫВОДЫ

1. В клонах гибридных клеток серии НМС, полученных слиянием эмбриональных стволовых клеток M. musculus со спленоцитами взрослой самки M. caroli, показано присутствие маркеров, свойственных недифференцированным эмбриональным клеткам: активность щелочной фосфатазы и присутствие эмбрионального антигена ЕСМА7. По активности щелочной фосфатазы выявлены межклональные различия, возможно обусловленные присутствием разного числа хромосом соматического партнера.

2. Установлено, что клон гибридных клеток, содержащий единичные хромосомы M. caroli, и клон с высоким содержанием хромосом M. caroli способны участвовать в формировании тканей и органов химерных животных, что является свидетельством сохранения ими плюрипотенгности и, более того, доминирования этого свойства у гибридных клеток.

3. В клонах гибридных клеток показана экспрессия генов-маркеров плюрипотентности Nanog и Oct4 и реактивация аллелей генов Oct4, Nanog и Gla M. caroli, неактивных в геноме спленоцитов.

4. Анализ экспрессии генов Gla и Xist в гибридных клетках после индуцированной дифференцировки их in vitro показал отсутствие признаков предпочтительной инактивации Х-хромосом, имеющих разную «онтогенетическую историю».

5. Полученные данные свидетельствуют, что клоны гибридных клеток серии НМС сохраняют плюрипотентные свойства на уровне сходным с ЭСК, то есть плюрипотентность проявляется у гибридных клеток как доминантный признак. Однако в некоторых клонах, такие как НМС6 и НМС44, имеются признаки снижения их потенциала и повышенная склонность к дифференцировке.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Серов О.Л., Матвеева Н.М., Кизилова Е.А., Кузнецов С.Б., Железова А.И., Голубица А.Н., Пристяжнюк И.Е., Пузаков М.В. «Хромосомная память» родительских геномов в эмбриональных гибридных клетках. // Онтогенез, 2003, Т. 34, № 3, С. 216-227.

2. Пузаков М.В., Баттулин Н.Р., Темирова С.А., Матвеева Н.М., Сердюкова H.A., Графодатекий A.C., Серов O.JI. Анализ экспрессии родительских аллелей Л'ist и Gla в межвидовых эмбриональных гибридных клетках в условиях индуцированной in vitro инактивации Х-хромосом. // Онтогенез, 2007, Т. 38, № 2, С. 1-8.

3. Vasilkova A.A., Kizilova H.A., Puzakov M.V., Shilov A.G., Zhelezova A.I., Golubitsa A.N., Battulin N.R., Vedernikov V.E., Menzorov A.G., Matveeva N.M., Serov O.L. Dominant manifestation of pluripotency in embryonic stem cell hybrids with various numbers of somatic chromosomes. // Mol. Reprod. Dev., 2007, V. 74, № 8, P. 941-951.

4. Серегин A.B., Пузаков M.B., Мензоров А.Г. Сегрегация хромосом во внутривидовых и межвидовых клеточных гибридах, полученных от слияния эмбриональных стволовых и соматических клеток мыши и анализ их плюрипотентности. // Материалы XL Международной научной студенческой конференции, Биология. Новосиб. гос. университет., Новосибирск, 2002, С. 101103.

5. Пузаков М.В., Кизилова Е.А. Разработка метода количественной оценки плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток и их гибридов в условиях in vitro. II III международная научная конференция молодых ученых и студентов, Казахский национальный университет им. аль-Фараби, Алматы, 2003, С. 186187.

6. Пузаков М.В., Кизилова Е.А., Матвеева Н.М., Шилов А.Г., Мензоров А.Г., Василькова A.B., Серов O.JI. In vitro-анализ плюрипотентности клеточных гибридов, полученных от слияния эмбриональных стволовых клеток и спленоцитов мыши. // Цитология, 2003, Т. 45, № 9, С. 917-918.

7. Серов O.JL, Матвеева Н.М., Кизилова Е.А., Кузнецов С.Б., Железова А.И., Голубица А.Н., Пристяжнюк И.Е., Петракова О.С., Темирова С.А., Пузаков М.В. «Онтогенетическая память» родительских хромосом в гибридах, полученных от слияния эмбриональных стволовых клеток и спленоцитов взрослого животного. // Цитология, 2003, Т. 45, № 9, С. 926.

8. Пузаков М.В., Василькова A.A., Матвеева Н.М., Серов O.JI. Сравнение плюрипотентности межвидовых клеточных гибридов, полученных от слияния эмбриональных стволовых клеток и спленоцитов мыши. // Труды 3-го съезда ВОГиС, Москва, 6-12 июня 2004, Т.2, С.403.

9. Матвеева Н.М., Пристяжнюк И.Е., Пузаков М.В., Мензоров А.Г., Василькова A.A., Голубица А.Н., Железова А.И., Темирова С.А., Серов О.Л. Эмбриональные стволовые гибридные клетки - модель для изучения контроля плюрипотентности в условиях in vitro. // Материалы Международного симпозиума, Санкт-Петербург. Цитология, 2004, Т.46, № 10, С.927.

10.Баттулин Н.Р., Пузаков М.В. Анализ экспрессии родительских аллелей генов Nanog, Oct4, Gla, Xist и Lmna в межвидовых гибридных клетках. // Материалы XLIV Международной научной студенческой конференции, Биология, Новосиб. гос. университет, Новосибирск, 2006, С. 112.

П.Василькова A.A., Кизилова Е.А., Пузаков М.В., Батгулин Н.Р., Шилов А.Г., Железова А.И., Голубица А.Н., Мензоров А.Г., Матвеева Н.М., Серов О.Л. Полное доминирование эмбрионального генома в гибридных клетках индуцирует восстановление потенций (репрограммирование)

дифференцированных клеток. // Материалы международной конференции «Фундаментальные науки - биотехнологии и медицине», Новосибирск, 2006, С. 16.

12. Пузаков М.В., Баттулин Н.Р. и Серов О.Л. Изучение репрограммирования Х-хромосом спленоцитов в геноме эмбриональных гибридных клеток. // Цитология, 2006, Т. 48, № 9. С. 795.

13.Мензоров А.Г., Ведерников В.Е., Пузаков М.В., Василькова A.A., Шилов А.Г., Кизилова Е.А., Серов О.Л. Сохранение маркеров хромосом соматического партнера в геноме внутри- и межвидовых эмбриональных гибридных клеток мыши в условиях дифференцировки in vivo. // Цитология, 2006, Т. 48, №9. С. 780-781.

Подписано к печати 27.07.2007

Формат бумаги 60 х 90 1/16. Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0,7.

Тираж 100 экз. Заказ 79.

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пузаков, Михаил Васильевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Проблема восстановления потенциала дифференцированной клетки.

1.2. Изучение репрограммирования генома соматических клеток с помощью переноса соматических ядер.

1.3. Изучение репрограммирования генома соматических клеток с помощью их слияния с эмбриональными стволовыми клетками.

1.3.1. Классификация клеток обладающих высоким потенциалом.

1.3.2. Получение, поддержание и дифференцировка ЭСК.

1.3.3. Применение ЭСК для изучения генетической регуляции развития и направленного мутагенеза.

1.3.4. Клеточные гибриды между ЭСК и соматическими клетками.

1.4. Методы оценки плюрипотентности ЭСК и гибридных клеток.

1.4.1. Гисто- и иммуногистохимические маркеры.

1.4.2. Анализ экспрессии генов-маркеров плюрипотентности.

1.4.3. Оценка плюрипотентности клеток в тестах in vivo - получение химерных животных.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Клетки и клеточные линии.

2.2. Культивирование клеток в монослое.

2.3. Замораживание клеток.

2.4. Размораживание клеток.

2.5. Гистохимическое выявление щелочной фосфатазы.

2.6. Оценка активности щелочной фосфатазы.

2.7. Иммуногистохимическое выявление экспрессии ЕСМА7.

2.8. Получение химерных животных.

2.9. Получение эмбриоидных телец in vitro.

2.10. Биохимическое выявление глюкозофосфатизомеразы (ГФИ).

2.11. Выделение ДНК.

2.12. Выделение РНК.

2.13. Синтез кДНК.

2.14. ПЦР-анализ.

2.15. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК в агарозном геле.

2.16. Рестрикционный анализ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Гистохимический анализ активности щелочной фосфатазы в гибридных клетках серии НМС.

3.2. Иммуногистохимический анализ эмбрионального антигена ЕСМА7 в гибридных клетках.

3.3. Оценка плюрипотентности гибридных клеток в тесте на химеризм.

3.4. Анализ экспрессии генов Oct4 и Nanog в гибридных клетках.

3.5. Сравнение экспрессии родительских аллелей генов Oct4, Nanog и Gla в гибридных клетках.

3.6. Инактивация Х-хромосомы при индуцированной in vitro дифференцировке гибридных клеток.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Оценка плюрипотентности клеточных гибридов, полученных от слияния эмбриональных стволовых клеток и спленоцитов мыши"

Актуальность. Одной из фундаментальных проблем генетики развития является изучение плюрипотентности - способности клеток к дифференцировке в различные клеточные типы in vitro и in vivo, которая характерна для клеток эмбриона на ранних стадиях развития и эмбриональным стволовым клеткам (ЭСК). То, какими механизмами осуществляется контроль над сохранением и утратой этого свойства в процессе дифференцировки клеток, к настоящему времени остается во многом неясным. С этим вопросом связана также не менее важная проблема, касающаяся эпигенетических изменений генома, происходящих при дифференцировке клеток, и возможности репрограммирования генома дифференцированных клеток взрослых животных. Долгое время считалось, что эмбриональные клетки очень рано теряют плюрипотентность, однако было показано, что пересадка ядер дифференцированных клеток, взятых у взрослого животного, в энуклеированные ооциты не препятствует нормальному развитию организма (Di Berardino, 1997; Wilmut et al., 1997; Wakayama et al., 1998). Таким образом, было установлено, что ядра дифференцированных клеток способны репрограммироваться и даже обеспечить полное развитие организма. Этот метод в последнее время широко применяется в клонировании млекопитающих и является очень эффективным способом репрограммирования ядер дифференцированных клеток. Однако существует альтернативный, не менее эффективный, экспериментальный подход к репрограммированию генома дифференцированных клеток, основанный на использовании высокого потенциала эмбриональных стволовых клеток, при их слиянии с дифференцированными клетками (Matveeva et al., 1998; Tada et al., 2001).

В настоящее время ЭСК, полученные из внутренней клеточной массы бластоцисты, являются "связующим звеном" в исследованиях in vitro и in vivo. При культивировании ЭСК сохраняют плюрипотентные свойства в течение длительного времени. Однако в ЭСК может быть легко индуцирована дифференцировка in vitro с образованием производных трех зародышевых листков. Более того, ЭСК, при введении в бластоцисту, принимают участие в образовании большинства органов и тканей химерных животных, в том числе и гонад (Tarn,

Rossant, 2003). Культуры ЭСК широко используются для исследования ранних этапов дифференцировки, для изучения функции гена и для создания трансгенных животных.

Гибридные клетки, полученные слиянием ЭСК с дифференцированными клетками, открывают новые экспериментальные возможности изучения механизмов поддержания плюрипотентности и процессы репрограммирования. Гибридные клетки такого типа сохраняют плюрипотентные свойства на достаточно высоком уровне и, что очень важно, гены дифференцированного партнера репрограммируются в результате взаимодействия с геномом ЭСК (Matveeva et al, 1998; Tada et al, 2001; 2003; Terada et al, 2002; Ying et al, 2002; Do, Schöler, 2004). Одним из несомненных достоинств такой модельной системы является возможность создания набора гибридных клеток с разным соотношением родительских хромосом. То есть открывается возможность оценить роль индивидуальных хромосом в поддержании плюрипотентности и исследовать способность отдельных хромосом к репрограммированию.

Для изучения плюрипотентности клеток применяют разносторонние методы. Для гисто- и иммуногистохимического анализа плюрипотентности используют маркеры характерные для клеток ВКМ: активность щелочной фосфатазы и поверхностные антигены. Способность участвовать в формировании органов и тканей химерного животного (Tarn, Rossant, 2003), а также в формировании тератом и эмбриоидных телец (Rastan, Robertson, 1985) является наиболее адекватным свидетельством высокого потенциала исследуемых клеток. По наличию экспрессии генов Oct4 и Nanog, генов «плюрипотентности», можно также оценить являются ли клетки плюрипотентными.

В настоящее время практически отсутствуют разработанные методы количественной оценки плюрипотентности, однако использование подобных методов позволило бы больше узнать о том, какое влияние оказывают хромосомы соматического партнера на сохранение плюрипотентности у клеточных гибридов.

В лаборатории генетики развития Института цитологии и генетики были получены внутривидовые клеточные гибриды серии HESS от слияния плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток линии НМ-1 мыши линии 129/01а и спленоцитов (клеток селезенки) мыши линии DD/c. Гибридные клетки сохраняли плюрипотентные свойства, характерные для ЭСК, что было доказано тестами in vitro и in vivo (Матвеева и др., 1996; Matveeva et al, 1998). Таким образом, было показано, что присутствие в клеточных гибридах хромосом дифференцированной клетки не препятствует сохранению плюрипотентности.

В той же лаборатории были получены межвидовые гибриды серии НМС от слияния плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток Mus musculus и спленоцитов близкого вида мыши M. caroli. Полученные гибридные клоны сохраняли фенотип ЭСК и имели подробно описанный состав хромосом (Пристяжшок и др., 2005). Благодаря этому появилась возможность для более полной оценки плюрипотентности и интерпретации полученных данных в соответствии с общим хромосомным составом и присутствием хромосом соматического партнера.

Цели и задачи работы.

Цель работы заключалась в оценке плюрипотентности межвидовых клеточных гибридов, полученных от слияния эмбриональных стволовых клеток мыши Mus musculus и спленоцитов М. caroli.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить плюрипотентность клонов межвидовых гибридных клеток in vitro с помощью маркеров, характерных для недифференцированных клеток: активности щелочной фосфатазы и эмбрионального поверхностного антигена ЕСМА7.

2. Сравнить плюрипотентность клонов межвидовых гибридных клеток в экспериментах in vivo - получение химерных животных, с последующей оценкой вклада гибридных клеток в формирование тканей и органов химер.

3. Изучить в клонах межвидовых гибридных клеток экспрессию генов Oct4 и Nanog, ответственных за поддержание плюрипотентности.

4. Сравнить экспрессию родительских аллелей генов Oct4, Nanog и Gla в гибридных клетках и, тем самым, оценить способность к репрограммированию генома дифференцированных клеток взрослого животного.

5. Оценить активность Х-хромосом, полученных из геномов с различным эпигенетическим статусом, при индуцированной дифференцировке гибридных клеток in vitro.

Научная новизна.

1. Впервые проведено комплексное исследование плюрипотентности межвидовых гибридных клеток серии НМС, полученных слиянием эмбриональных стволовых клеток мышей М. musculus линии 129/01а и спленоцитов М. caroli. Для оценки плюрипотентности использовали молекулярные, гисто- и иммуногистохимические маркеры, а также тест на получение химерных животных. Показано, что уровень плюрипотентности в гибридных клетках типа ЭСК-спленоцит мало зависим или полностью независим от числа хромосом соматического партнера в гибридном кариотипе, то есть плюрипотентность проявляется у гибридных клеток как доминантный признак.

2. В данной работе впервые описаны химерные животные, полученные микроинъекционным способом с использованием межвидовых клеточных гибридов серии НМС. Показано сохранение хромосом соматического партнера в потомках гибридных клеток при развитии химерного организма.

3.В гибридных клетках серии НМС впервые проведен анализ активности Х-хромосом, полученных из геномов с различным эпигенетическим статусом, и показано отсутствие предпочтительной инактивации Х-хромосом при индуцированной дифференцировке гибридных клеток in vitro.

Практическая значимость. Результаты данной работы способствуют расширению знаний о процессах поддержания плюрипотентности и репрограммирования и используются при чтении курса «Генетика развития» в НГУ.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на XL международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2002), на международной научной конференции молодых ученых и студентов (Алматы, 2003), на 1-м съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003), на международном симпозиуме по биологии клетки в культуре «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия» (Санкт-Петербург, 2004), на 3-м съезде ВОГиС (Москва, 2004), на международном симпозиуме по биологии клетки в культуре (Санкт-Петербург, 2006), на ХЫУ международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2006), на международной конференции «Фундаментальные науки - биотехнологии и медицине», (Новосибирск, 2006).

Материалы диссертации изложены в 3-х статьях, опубликованных в отечественных и международном журналах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 93 страницах, содержит 16 рисунков и 8 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Пузаков, Михаил Васильевич

ВЫВОДЫ

1. В клонах гибридных клеток серии НМС, полученных слиянием эмбриональных стволовых клеток М. musculus со спленоцитами взрослой самки М. caroli, показано присутствие маркеров, свойственных недифференцированным эмбриональным клеткам: активность щелочной фосфатазы и присутствие эмбрионального антигена ЕСМА7. По активности щелочной фосфатазы выявлены межклональные различия, возможно обусловленные присутствием разного числа хромосом соматического партнера.

2. Установлено, что клон гибридных клеток, содержащий единичные хромосомы М. caroli, и клоп с высоким содержанием хромосом М. caroli способны участвовать в формировании тканей и органов химерных животных, что является свидетельством сохранения ими плюрипотентпости и, более того, доминирования этого свойства у гибридных клеток.

3. В клонах гибридных клеток показана экспрессия генов-маркеров плюрипотентпости Nanog и Oct4 и реактивация аллелей генов Oct4, Nanog и Gla М. caroli, неактивных в геноме сгшеноцитов.

4. Анализ экспрессии генов Gla и Xist в гибридных клетках после индуцированной дифференцировки их in vitro показал отсутствие признаков предпочтительной инактивации Х-хромосом, имеющих разную «онтогенетическую историю».

5. Полученные данные свидетельствуют, что клоны гибридных клеток серии НМС сохраняют плюрипотентные свойства на уровне сходным с ЭСК, то есть плюрипотентность проявляется у гибридных клеток как доминантный признак. Однако в некоторых клонах, такие как НМС6 и НМС44, имеются признаки снижения их потенциала и повышенная склонность к дифференцировке.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пузаков, Михаил Васильевич, Новосибирск

1. Матвеева Н.М., Шилов А.Г., Байбородин С.И., Филимоненко В.В., Ролинская И.В., Серов О.Л. Гибриды между эмбриональными и соматическими клетками мыши сохраняют шпорипотентность. // Докл. РАН, 1996, Т.249, №1, С.129-132.

2. Пристяжшок И.Е., Темирова С.А., Мензоров А.Г, Круглова А.А., Матвеева Н.М., Серов О.Л. Видимая и «скрытая» сегрегация родительских хромосом в эмбриональных стволовых гибридных клетках. // Онтогенез, 2005, Т.36, №2, С.150-157.

3. Рингерц II., Сэвидж Р. Гибридные клетки. // "Мир" Москва, 1979, С.191-209.

4. Серов О.Л., Матвеева Н.М., Кизилова Е.А., Кузнецов С.Б., Железова А.И., Голубица А.Н., Пристяжшок И.Е., Пузаков М.В. «Хромосомная память» родительских геномов в эмбриональных гибридных клетках. // Онтогенез, 2003, Т. 34, №3, С. 216-227.

5. Adler D.A., West J.D., Chapman V.M. Expression of alpha-galactosidase in preimplantation mouse embryos. //Nature, 1977, V.267 (5614), P.838-839.

6. Ambrosi D.J., Tanasijevic В., Kaur A., Obergfell C., O'Neill R.J., Krueger W., Rasmusscn T.P. Genome-wide reprogramming in hybrids of somatic cells and embryonic stem cells. // Stem Cells, 2007, V.25, №5, P.l 104-1113.

7. Ambrosi D.J., Rasmussen T.P. Reprogramming mediated by stem cell fusion. // J. Cell Mol. Med., 2005, V.9, P.320-330.

8. Andrews P.W., Goodfellow P.N. Antigen expression by somatic ccll hybrids of a murine embryonal carcinoma cell with thymocytes and L cells. // Somat. Cell Genet., 1980, V.6, P.271-284.

9. Artzt K., Jacobs-Cohen R.J., DiMeo A., Alton A.K., Darlington G. Reexpression of a T/t-complex antigen (tl2) in thymocyte x embryonal carcinoma cell hybrids. // Somatic. Ccll Genet., 1981, V.7, P.423-434.

10. Avilion A.A., Nicolis S.K., Pevny L.H., Perez L., Vivian N. and Lovell-Badge R. Multipotent cell lineages in early mouse development depend on SOX2 function. // Genes and Dev., 2003, V.17, №1, P.126-140.

11. Avner P. and Heard E. X-chromosome inactivation: counting, choice and initiation. // Nat Rev Genet, 2001, V.2, P.59-67.

12. Baribault H., Kemler R. Embryonic stem cell culture and gene targeting in transgenic mice. // Mol. Biol. Med., 1989, V.6, P.481-492.

13. Blau H.M., Brazelton T.R. and Weimann J.M. The evolving concept of a stem cell: entity or function? // Cell, 2001, V.105, P.829-841.

14. Bradley A., Evans M., Kaufman M.H., Robertson E. Formation of germ-line chimeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. // Nature, 1984, V.309, P.255-256.

15. Brazelton T.R., Rossi F.M., Keshet G.I., Blau H.M. From marrow to brain: expression of neuronal phenotypes in adult mice. // Science, 2000, V.290, P.758-766.

16. Briggs R., King T.J. Nuclear transplantation studies on the early gastrula (Rana pipiens). // Dev. Biol., 1960, V.2, P.252-270.

17. Briggs R., King T.J. Transplantation of living nuclei from blastula cells into enucleated frog' eggs. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1952, V.38, P.455-463.

18. Brook F.A., Gardner R.L. The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, V.94, P.5709-5712.

19. Buehr M. and McLaren A. An electrophoretically detectable modification of glucosephosphate isomerase in mouse spermatozoa. // J. Reprod. Fert., 1981, V.63, P.169-173.

20. Calarco-Gillam P. Cell-cell interaction in mammalian preimplantation development. // Dev. Biol, a comprehensive synthesis V.2. The cellular basis of morphogenesis. Ed. Browder L.W. Plenum, 1986, P.329-371.

21. Campbell K.H., McWhir J., Ritchie W.A., Wilmut I. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. //Nature, 1996, V. 380, P. 64-66.

22. Chambers I., Colby D., Robertson M., Nichols J., Lee S., Tweedie S., Smith A. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. // Cell, 2003, V.l 13(5), P.643-655.

23. Chapman V.M., Shows T.B. Somatic cell genetic evidence for X-chromosome linkage of three enzymes in the mouse. // Nature, 1976, V.259, P.665-667.

24. Cibelli J.B., Stice S.L., Golueke P.J., Kane J.J., Jerry J., Blackwell C. Transgenic bovine chimeric offspring produced from somatic cell-derived stem-like cells. // Nat. Biotechnol., 1998, V.16, P.642-646.

25. Cowan A., Atienza J., Melton D., Eggan K. Nuclear reprogramming of somatic cells after fusion with embryonic stem cells. // Science, 2005, V.309, P.1369-1373.

26. DeLorenzo R.J., Ruddle F.H. Genetic control of two electrophoretic variants of glucose phosphate isomerase. // Biochem. Genet., 1969, V.3, P.151-162.

27. Di Berardino M.A. Genomic potential of differentiated cells. // Columbia University Press, New York, 1997, 386 p.

28. Do J.T., Scholcr H.R. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells. // Stem Cells, 2004, V.22, P.941-949.

29. Doetschman T., Eistetter H., Katz M., Schmidt W., Kemler R. The in vitro development of blastocyst derived embryonic stem cell lines: formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. // J. Embryol. Exp. Morph, 1985, V.87, P.27-45.

30. Doetschman T, Maeda N, Smithies O. Targeted mutation of the Hprt gene in mouse embryonic stem cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, V.85(22), P.8583-8587.

31. Edwards M.K.S., Harris J.F. and McBurney M.W. Induced muscle differentiation in an embryonal carcinoma cell line. // Molecular and Cellular Biology, 1983, V.3, N.12, P.2280-2286.

32. Everett C.A., West J.D. Evidence for selection against tetraploid cells in tetraploid <-» diploid mouse chimeras before the late blastocyst stage. // Genet. Res., 1998, V.72, P.225-228.

33. Everett C.A. and West J.D. The influence of ploidy on distribution of cells in chimaeric mouse blastocysts. // Zigote, 1996, V.4, P.59-66.

34. Farivar, S., Yamaguchi, S., Sugimoto, M., Takagi, N. X-chromosome inactivation in differentiating mouse embryonic stem cells carrying X-linked GFP and lacZ transgenes // Int. J.Dev. Biol., 2004, V.48, P.629-635.

35. Flechon J.-E. What are ES cells? // In Transgenic Animals: Generation and Use, 1995, P.157-166.

36. Forejt J., Gregorova S., Dohnal K., Nosek J. Gene expression of differentiated parent in teratocarcinoma cell hybrids. Repression or reprogramming? // Cell Dif, 1984, V.15, P.229-234.

37. Freeman T.C., Dixon A.K., Campbell E.A., Tait T.M., Richardson P.J., Rice K.M., Maslen G.L., Metcalfe A.D., Streuli C.H., Bentley D.R. Expression Mapping of Mouse Genes. // MGI Direct Data Submission, 1998.

38. Galli R., Borello U., Gritti A., Minasi M.G., Bjornson C., Coletta M., Mora M., De Angelis M.G., Fiocco R., Cossu G., Vescovi A.L. Skeletal myogenic potential of human and mouse neural stem cells. // Nat. Neurosci., 2000, V.3, P.986-991.

39. Gossler A., Joyner A.L., Rossant J., Skarnes W.C. Mouse embryonic stem cells and report constructs to detect developmentally regulated genes. // Science, 1989, V.28, P.463-465.

40. Grover A., Oshima R.G. and Adamson E.D. Epithelial layer formation in differentiating aggregates of F9 embryonal carcinoma cells. // The Journal of Cell Biology, 1983, V.96, P.1690-1696.

41. Hadjantonakis A.-K., Macmaster S. and Nagy A. Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal. // BMC Biotechnology, 2002, V.2, P.l 1.

42. Hahnel A.C., Rappolee D.A., Millan J.L., Manes T., Ziomek C.A., Theodosiou N.G., Werb Z., Pedersen R.A. and Schultz G.A. Two alkaline phosphatase genes are expressed during early development in the mouse embryo. // Development, 1990, V.110, P.555-564.

43. Hart A.H., Hartley L., Ibrahim M., Robb L. Identification, cloning and expression analysis of the pluripotency promoting Nanog genes in mouse and human. // Dev Dyn, 2004, V.230 (1), P.187-198.

44. Hatano S.-Y., Tada M., Kimura H., Yamaguchi S., Kono T., Nakano T., Suemori II., Nakatsuji N., Tada T. Pluripotential competence of cells associated with Nanog activity. // Mechanisms of Development, 2005, V.123, P.67-79.

45. Hollands P. Embryonic stem ccll grafting: the therapy of the future? // Hum. Reprod., 1991. V.6(l). P.79-84.

46. Hong Y., Winkler C., Schartl M. Production of mcdakafish chimeras from a stable embryinic stem cell line. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1998, V.95, P.3679-3684.

47. Hooper M.L. Metabolic co-operation between mammalian cells in culture. // Biochimica et Biophysica Acta, 1982, V.657, P.85-103.

48. Iannacone P.M., Taborne G.U., Garton R.L., Caplice M.D., Brenin D.R. Pluripotent embryonic stem cells from rat are capable of producing chimeras. // Dev. Biol. 1994. V. 163. P. 288-292.

49. Jones-Villenneuve E.M.V., McBurney M.W., Rogers K.A. and Kalnins V.I. Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells differentiate into neurons and glial cells. // The Journal of Cell Biology, 1982, V.94, P.253-262.

50. Jones-Villeneuve E.M., Rudnicki M.A., Harris J.F., McBurney M.W. Retinoic acid-induced neural differentiation of embryonal carcinoma cells. // Mol. Cell Biol., 1983, V.3(12), P.2271-2279.

51. Kamachi Y., Uchikawa M., and Kondoh H. Pairing SOX off. // Trends Genet., 2000, V. 16, №4, P. 182-187.

52. Kawase E., Suemori H., Takahashi N., Okazaki K., Hashimoto K., Nakatsuji N. Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines. // Int. J. Dev. Biol. 1994. V. 38 (2). P.385-390.

53. Kimura H., Tada M., Hatano S., Yamazaki M., Nakatsuji N, Tada T. Chromatin rcprogramming of male somatic cell-derived Xist and Tsix in ES hybrid cells. // Cytogenet. Genome Res., 2002, V.99, P. 106-114.

54. Lallemand Y., Brulet P., An in situ assessment of the routes end extents of colonization of the mouse embryo by embryonic stem cells and their descendants. // Development, 1990, V.l 10, P.1241-1248.

55. Latham K.E. Mechanisms and control of embryonic genome activation in mammalian embryos. // Int. Rev. Cytol., 1999, V.193, P.71-124.

56. Lawson K.A. and Hage W.J. Clonal analysis of the origin of primordial germ cells in the mouse. // In Germline Development Ciba Foundation Symposium, 1994, V.182, P.68-91.

57. Ledermann B., K. Burki. Establishment of a germ-line competent C57BL/6 embryonic stem cell line. //Exp. Cell. Res. 1991. V. 197. P. 254-258.

58. Lee J.T. and Jaenisch R. Long-range cis-effects of ectopic X-inactivation centers on a mouse autosome. // Nature, 1997, V.386, P.275-279.

59. Lo C.W., Coulling M. and Kirby C. Tracking of mouse cell lineage using microinjected DNA sequences: analysis using genomic Southern blotting and tissue-section in situ hybridization. // Differentiation, 1987, V.35, P.37-44.

60. Low M.G. and Saltiel A.R. Structural and functional roles of glycosyl-phosphatidylinositol in membranes. // Scicnce, 1988, V.239, P.268-275.

61. Lyko F., Paro R. Chromosomal elements conferring epigenetic inheritance. // BioEssays., 1999, V.21, P.824-832.

62. Magin T.M., McWhir J., Melton D.W. A new mouse embryonic stem ccll line with good germ line contribution and gene targeting frequency. // Nucl. Acid. Res., 1992, V.20, P.3795-3796.

63. Martin G.R. and Evans M.J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1975, V,72, N.4, P.1441-1445.

64. Matsui Y., Zsebo K. and Hogan B.L. Derivation of pluripotcntial embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture. // Cell, 1992, V.70, P.841-847.

65. McBurney MW. Hemoglobin synthesis in cell hybrids formed between teratocarcinoma and Friend erythroleukemia cells. // Cell, 1977, V.12, P.653-662.

66. McBurney MW, Featherstone MS, Kaplan H. Activation of teratocarcinoma-derived hemoglobin genes in teratocarcinoma-Friend cell hybrids. // Cell, 1978, V.15, P.1323-1330.

67. McBurney M.W., Jones-Villeneuve E.M., Edwards M.K., Anderson P.J. Control of musclc and neuronal differentiation in a cultured embryonal carcinoma cell line.//Nature, 1982, V.299(5879), P.165-167.

68. McGrath J., Solter D. Inability of mouse blastomere nuclei transferred to enucleated zygotes to support development in vitro. II Science, 1984, V.226, P.1317-1319.

69. McKinnell R.G. Intraspecific nuclear transplantation in frogs. // J.Hered., 1962, V.53, P.199-207.

70. Miller R.A., Ruddle F.II. Pluripotent teratocarcinoma-thymus somatic cell hybrids. // Cell. 1976. V. 9. P. 45-55.

71. Miller RA, Ruddle FH. Properties of teratocarcinoma-thymus somatic cell hybrids. // Somat. Cell Genet., 1977, V.3, P.247-261.

72. Mitsui K., Tokuzawa Y., Itoh H., Segavva K., Murakami M., Takahashi K., Maruyama M., Maeda M., Yamanaka S. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epibiast and ES cells. // Cell, 2003, V.l 13(5), P.631-642.

73. Moens A., Flechon B., Degrouard J., Vignon X., Ding J., Flechon J.-E., Bctteridge K.J., Renard J.-P. Ultrastructural and immunocytochemical analysis of diploid germ cells isolated from fetal rabbit gonads // Zygote, 1997, V.5, P.47-60.

74. Morcau J.F., Donaldson D.D., Bennett F., Witek-Giannotti J., Clark S.C., Wong G.G. Leukaemia inhibitory factor is identical to the myeloid growth factor human interleukin for DA cells. // Nature, 1988, V.336, P.690-692.

75. Mummery C.L., Feyen A., Freund E., Shen S. Characteristic of cmbryonic stem cell differentiation: a comparison with two embryonal carcinoma cell lines. // Cell Diff. Devel., 1990, V.30, P.195-206.

76. Nagy A., Gocza E., Diaz E.M., Prideaux V.R., Ivanyi E., Markkula M., Rossant J. Embryonic stem cells alone are able to support fetal development in the mouse. // Development, 1990, V. 110, P.815-821.

77. Nagy A., Rossant J., Nagy R., Abramow-Newerly W., Roder J.C. Derivation of completely cell culture derived mice from early-passage cmbryonic stem cells. // I'roc. Natl. Acad. Sci USA, 1993, V.90 (18), P.8424-8428.

78. Narisawa S., Frohlander N., Millan J.L. Inactivation of two mouse alkaline phosphatase genes and establishment of a model of infantile hypophosphatasia. // Dev. Dyn., 1997, V.208(3), P.432-46.

79. Nichols J, Zevnik B, Anastassiadis K, Niwa H, Klewe-Nebenius D, Chambers I, Scholer H, Smith A. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo on the POU transcription factor Oct4. II Cell, 1998, V.95, P.379-391.

80. Niwa II., Miyazaki J. and Smith A.G. Quantitative expression oCOct-3/4 defines differetiation, ddifferentiation of self-renewal of ES cells. // Nature Genetics, 2000, V.24, N.4, P.372-376.

81. Pain B., Clark M.E., Shen M., Nakazavva H., Sakura M., Samarut J., Etches R.J. Long-term in vitro culture and characterization of avian embryonic stem cells with multiple morphogenetic potentialities // Development, 1996, V.122, P.2339-2348.

82. Panning, B., Dausman, J., Jaenisch, R. X chromosome inactivation is mediated by Xist RNA stabilization. // Cell, 1997, V.90(5), P.907-916.

83. Pells, S., Di Domenico, A.I., Gallagher, E.J., McWhir, J. Multipotentiality of neuronal cells after spontaneous fusion with embryonic stem cells and nuclear reprogramming in vitro. // Cloning Stem Cells, 2002, V.4, P.331-338.

84. Pesce M., Gross M.K., Schöler II.R. In line with our ancestors: Oct4 and the mammalian germ. //Bioessays, 1998, V.20, P.722-732.

85. Pesce M., Schöler H.R. Oct4: Gatekeeper in the biginnings of mammalian development // Stem Cells, 2001 V.19. P.271-278.

86. Piedrahita J.A., Anderson G.B., BonDurant R.H. On the isolation of embryonic stem cells: comparative behavior of murine, porcine and ovine embryos // Thcrigenology. 1998. V. 34. P. 879-891.

87. Prelle K., Vassiliev I.M., Vassilieva S.G., Wolf E., Wobus A.M. Establishment of pluripotent cell lines from vertebrate species present status and future prospects. // Cells Tissues Organs, 1999, V.165, P.220-236.

88. Prelle K., Zink N. and Wolf E. Pluripotent stem cells model of embryonic development, tool for gene targeting, and basis of cell therapy. // Anat. Histol. Embryol., 2002, V.31, P.169-186.

89. Pristyazhnyuk I.E., Temirova S.A., Menzorov A.G., Kruglova A.A., Matveeva N.M., Serov O.L. Visible and "cryptic" segregation of parental chromosomes in embryonic stem hybrid cells. // Russian J. Develop. Biol., 2005, V.36, P.119-126.

90. Rastan S., Robertson E.J. X-chromosome deletions in embryo-derived (EK) cell lines associated with lack of X-chromosome inactivation. // J. Embryol. Exp. Morphol, 1985, V.90, P.379-388.

91. Rcsnick J.L., Bixler L.S., Cheng L., Donovan P.L. Long-term proliferation of mouse primordial germ cells in culture. //Nature, 1992, V.359, P.550-551.

92. Risau W., Sariola H., Zerwes H.G., Sasse J., Ekblom P., Kemler R., Doetschman T. Vasculogenesis and angiogenesis in embryonic-stem-cell-derived embryoid bodies. II Development, 1988, V.102(3), P.471-478.

93. Roach M.L., Stock J.L., Byrum R., Koller B.H., McNeish J.D. A new embryonic stem cell line from DBA/llacJ mice allows genetic modification in a murine model of human inflammation. //Exp.Cell Res., 1995, V.221(2), P.520-525.

94. Robertson E.J., Conlon F.L., Barth K.S., Costantini F., Lee J.J. Use of embryonic stem cells to study mutations affecting postimplantation development in the mice. // Ciba. Found. Symp., 1992, V.165, P.237-250.

95. Robertson E., Bradley A., Kuehn M., Evans M. Germ line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. // Nature, 1986, V.323, P.445-448.

96. Robertson E.J. Embryo-derived stem cell lines. Teratocarcinomas and embryonic stem cells. A practical approach. // Oxford: IRL Press, 1987, P.71-112.

97. Rossant J., Croy B.A., Clark D.A., Chapman V.M. Interspecific hybrids and chimcras in mice. //J. Exp. Zool, 1983, V.228(2), P.223-233.

98. Rossant J., McBurney M.W. The developmental potential of a euploid male teratocarcinoma cell line after blastocyst injection. // J. Embryol. Exp. Morphol., 1982, V.70, P.99-112.

99. Rousset J.P., Bucchini D., Jami J. Hybrids between F9 nullipotent teratocarcinoma and thymus cells produce multidifferentiated tumors in mice. // Dev. Biol., 1983, V.96, P.331-336.

100. Rousset J-P., Jami J., Dubois P., Aviles D., Ritz E. Developmental potentialities and surface antigens of mouse teratocarcinoma-lymphoid cell hybrids. // Somat. Cell Genet., 1980, V.6, P.419-433.

101. Rousset J.P., Dubois P., Lasserre C., Aviles D., Fellous M., Jami J. Phenotype and surface antigens of mous teratocarcinoma x fibroblast cell hybrids. // Somatic Cell Genet., 1979, V.5(6), P.739-752.

102. Schaap G.H., Devilee P., van Klaveren P., Jongkind F. Gene expression in flow sorted mouse teratocarcinoma-human fibroblast heterokaryons. // Differentiation, 1984, V.26, P.127-133.

103. Scholer H.R. Octamania: the POU factors in murine development. // Trends. Genet., 1991, V.7, P.323-329.

104. Selfridge J., Pow A.M., McWhir J., Magin T.M., Melton D.W. Gene targeting using a mouse IIPRT minigene/HPRT-deficient embryonic stem cell system: inactivation of the mouse ERCC-1 gene. // Somat Cell Mol Genet, 1992, V.18(4), P.325-336.

105. Shen C.N., Slack J.M. and Tosh D. Molecular basis of transdifferentiation of pancreas to liver. // Nat. Cell Biol., 2000, V.2, P.879-887.

106. Shiels P.G, Kind A.J, Campbell K.H, Waddington D, Wilmut I, Colman A, Schnieke A.E. Analysis of telomere lengths in cloned sheep. // Nature, 1999, V.399, P.316-317.

107. Shuman R.M. Production of transgenic birds. // Experientia, 1991, V.47 (9), P.897-905.

108. Smith A.G. Culture and differentiation of embryonic stem cells. // J. Tiss. Cult. Meth., 1991, V.13, P.89-94.

109. Smith A.G., Heath J.K., Donaldson D.D., Wong G.G., Moreau J., Stahl M., Rogere D. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. // Nature, 1988, V.336, P.688-690.

110. Soltcr D. Dolly is a clone and no longer alone. // Nature, 1998, V.394, P.315.

111. Solter D. Role of cell surface molecules in mammalian development. // Progr. Immunol. V.6, 6lh Int. Congress Immunol., 1986, P. 1070-1078.

112. Stewart C.L., Gadi I. and Bhatt II. Stem cell from primordial germ cells can reenter the gene line. // Dev. Biol., 1994, V.161, P.626-628.

113. Strelchenko N. Bovine pluripotent stem cells. // Theriogcnology, 1998, V.45, P.131-140.

114. Strickland S., Mahdavi V. The induction of differentiation in teratocarcinoma stem cells by retinoic acid. // Cell, 1978, V.15 (2), P.393-403.

115. Studer L., Csete M., Lee S.-H., Kabbani N., Walikonis J., Wold B., McKay R. Enhanced proliferation, survival, and dopaminergetic differentiation of CNS precursors in lowered oxygen. // J. Neurosci., 2000, V.20, P.7377-7383.

116. Sun L., Bradford C.S., Ghosh C., Collodi P. ES-like cell cultures derived from early Zebrafish embryos // Mol. Mar. Biol. Biotechnol., 1995, V.4, P.193-199.

117. Surani, M.A. Reprogramming of genome function through epigenetic inheritance. // Nature, 2001, V.414, P.122-128.

118. Tada M., Tada T., Lefebvre L., Barton S.C, Surani M.A. Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells. // The EMBO Journal., 1997, V.15, P.6510-6520.

119. Tada M., Morizane A., Kimura IT, Kawasaki H., Ainscough J.F.X., Sasai Y., Nakatsuji N. and Tada T. Plutipotency of reprogrammed somatic genomes inembryonic stem hybrid cells. // Developmental Dynamics, 2003, V.227, P.504-510.

120. Tada M., Takahama Y., Abe K., Nakatsuji N. and Tada T. Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells. // Current Biology, 2001, V.l 1, P.1553-1558.

121. Takagi, N. Requirement of mitoses for the reversal of X-inactivation in cell hybrids between murine embrynal carcinoma and normal thymocytes. // Exp. Cell Res., 1988, V.175, P.363-375.

122. Talbot N.C., Rexroad C.E.Jr., Pursel V.G., Powell A.M. Alkaline phosphotase of pig and sheep epiblast cells in culturc. // Mol. Rcprod. And Devel., 1993, V.36, P.139-147.

123. Tam P.P.L. and Rossant J. Mouse embryonic chimeras: tools for studying mammalian development. // Development, 2003, V.130, P.6155-6163.

124. Terada N., Hamazaki T., Oka M., Hoki M., Mastalerz D.M., Nakano Y., Meyer E.M., Morel L., Petersen B.E. and Scott E.W. Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion. // Nature, 2002, V.416, P.542-545.

125. Thomson J.A., Kalishman J., Golos T.G., Durning M., Harris C.P., Hearn J.P. Pluripotcnt cell lines derived from common marmoset (Callithrix jacchus) blastocysts. // Biol.Rcprod., 1996, V.55, P.254-259.

126. Thomson J.A., Itskovitz-Eldon J., Shapiro S.S., Waknitz M.A., Swiergiel J.J., Marshall V.S., Jones J.M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocyst. // Sciencc, 1998, V.282, P.l 145-1147.

127. Thomson J.A., Kalishman J., Golos T.G., Durning M., Harris C.P., Becker R.A., Hearn J.P. Isolation of primate embryonic stem cell line. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, V.92, P.7844-7848.

128. Tsunoda Y, Tokunaga T, Imai II, Uchida T. Nuclcar transplantation of male primordial germ cells in the mouse. //Development, 1989, V.l07, P.407-411.

129. Tsunoda Y., KatoY. Nuclear transplantation of embryonic stem cells in mice. // J. Reprod. Fertil., 1993, V.98, P.537-540.

130. Wakayama T., Perry A.C.F., Zuccotti M., Jihnson K.R., Yanagimachi R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. //Nature, 1998, V.394, P.369-379.

131. Wells D.N., Misika P.M., Day T.A., Tervit H.R. Production of cloned lambs from an established embryonic cell line: A comparison between in vivo- and in vitro-matured cytoplasts. // Biol. Reprod., 1997, V.57, P.385-393.

132. Wells D.N., Misika P.M., Tervit H.R. Production of cloned calves following nuclear transfer with cultured adult mural granulosa cells. // Biol. Reprod., 1999, V.60, № 4, P.996-1006.

133. Wheeler M.B. Development and validation of swine embryonic stem cells: a review. // Reprod. Fert. Dev., 1994, V.6, P.563-568.

134. Wilmut I., Schnieke A.E., McWhir J., Kind A.J., Campbell K.H.S. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. // Nature, 1997, V.385, P.810-813.

135. Wobus A.M., Holzhausen H., Jakel P., Schoneich J. Characterization of a pluripotent stem cell line from a mouse embryo. // Exptl. Cell Res., 1984, V.152, P.810-813.

136. Wolffe A.P., Matzke M.A. Epigenetics: regulation through repression. // Science. 1999. V.286.P. 481-486.

137. Wood S.A., Pascoe W.S., Schmidt C., Kemler R., Evans M.J., Allen N.D. Simple and efficient production of embryonic stem cell-embryo chimeras by co-culture. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, V.90, P.4582-4585.

138. Ying Q.-L., Nichols J., Evans P.E. and Smith A.G. Changing potency by spontaneous fusion. // Nature, 2002, V.416, P.545-548