Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Геномная нестабильность и пролиферативное старение при образовании иммортальных соматических гибридов человек-мышь

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Геномная нестабильность и пролиферативное старение при образовании иммортальных соматических гибридов человек-мышь"

• ОА

1"¥Ьссийская академия наук институт молекулярной биологии имени в. а.энгельг ар дт а

На правах рукописи

ЛУПАТОВ Алексей Юрьевич

геномная нестабильность и пролиферативное старение при образовании иммортальных соматических гибридов человек-мышь

03.00.03 - Молекулярная биология 03.00.25 - Клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва

1995

Работа выполнена в Лаборатории функциональной морфологии хромосом Института молекулярной биологии имени В.А. Энгельгар-дта Российской Академии Наук.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор A.B. Зеленин, кандидат биологических наук Е.Е. Егоров.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В.В. Терских, кандидат биологических наук A.A. Минин.

Ведущая организация - Биологический факультет Московского Государственного Университета им. М. В. Ломоносова.

Защита состоится " ¡995 г. в " " часов на

заседании диссертационного совета Д.002.79.01 при Институте молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта РАН по адресу: 117984, Москва, ул. Вавилова, д.32. ,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии РАН.

Автореферат разослан " №" М4М&. Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

1995 г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Применение соматической гибридизации позволило обойти межвидовой барьер репродуктивной изоляции, существующий на уровне целостных организмов, и получать клеточные гибриды не только между близкими видами, но и отдаленными систематическими группами. Особое место среди межвидовых соматических гибридов занимают гибриды человек-мышь. Полученные на их основе клеточные линии широко используются в качестве источника хромосом человека для решения целого ряда научных задач. Однако, чем меньше филогенетическое родство партнеров по слиянию, тем более остро проявляется нестабильность гибридного генома. В случае гибридов, полученных при слиянии клеток человека и клеток грызуна, геномная нестабильность выражается в постепенной утрате (сегрегации) хромосом человека. Дополнительный вклад в геномную нестабильность могут вносить экзогенные селективные маркеры, которые широко используются для селекции гибридных клонов. При их использовании возможна дополнительная дестабилизация генома из-за амплификации векторной плазмиды и ее распространения по хромосомам, увеличения ломкости хромосом в местах интеграции или других причин, связанных с присутствием экзогенной ДНК (Pritchard, Goodfel-low,1987; Gosden, Porteous, 1987).. Нестабильность гибридного генома может играть существенную роль в образовании иммортальных гибридных клонов при использовании клеток человека, имеющих . ограниченный пролиферативный потенциал, в качестве партнера ддя межвидовой соматической гибридизации с иммортальными клетками грызунов. Механизм, посредством которого образующийся гибридный клон преодолевает пролиферативное старение, требует специального изучения, так как для внутривидовых соматических гибридов показано доминирование «смертного» фенотипа над иммор-тальным (Bunn, Tarrant 1980). Таким образом, актуальным представляется изучение в рамках одной работы вопросов, связанных как с различными аспектами геномной нестабильности гибридов, так и с проблемой пролиферативного старения при формировании гибридных клонов. Подобное исследование может не только углубить теоретические представления о процессах протекающих при образова-

нии межвидовых соматических гибридов и, следовательно, оптимизировать их практическое использование, но и способствовать пониманию таких фундаментальных биологических явлений как клеточное старение и канцерогенез.

Цель и задачи работы.

Целью настоящей работы явилось изучение геномной нестабильности и пролиферативного старения при образовании клеточных клонов межвидовых соматических гибридов. В качестве объекта исследования использовали гибриды эмбриональных фибробластов человека (ЭФЧ), несущих экзогенный селективный маркер neo, с трансформированными фибробластоподобными мышиными клетками линии А9.

Исходя из цели исследования были сформулированы следующие конкретные задачи:

1. Получить набор клонов ЭФЧ, несущих экзогенный селективный маркер neo, используя трансфекщпо кольцевой либо линеаризо-ваной плазмиды pSV2neo.

2.Получить набор иммортальных гибридных клонов человек-мышь в результате слияния клеток различных клонов ЭФЧпео* и мышиных клеток ЛИН1Ш А9.

3. Изучить особенности сегрегации хромосом в полученных гибридах и влияние на этот процесс экзогенной маркерной ДНК.

4. Сравнить количество хромосомных транслокаций в гибридах, полученных с использованием экзогенного и эндогенного селективных маркеров.

5. Оценить влияние пролиферативного потенциала ЭФЧ на эффективность образования гибридов человек-мышь.

6. Оценить репликативный потенциал индивидуальных хромосом человека в гибридах, полученных при слиянии с клонами ЭФЧпео11, находящимися на разных стадиях пролиферативного старения.

7. Проверить гипотезу об участии теломеразы в образовании иммортальных гибридных клонов.

Научная нолизна и практическая ценность работы.

Впервые продемонстрирована возможность образования клеточных клонов, несущих экзогенный селективный маркер и несодержа-щих человеческого хромосомного материала, в результате соматической гибридизации клеток мыши и ЭФЧ, трансфицированных плаз-мидой р8У2пео. Обнаружена клональная гетерогенность клеточной линии мыши по способности инициировать нестабильность экзогенного маркера, интегрированного в хромосомы партнера по слиянию. Показана необходимость наличия пролиферативного потенциала родительских клеток, а также расходование репликативного потенциала отдельной хромосомы, принадлежащей морталыюму партнеру, при образовании иммортальных гибридных клонов. Полученные результаты углубляют понимание механизмов клеточного старения, а также мох-ут быть использованы при получении соматических гибридов для картирования генома человека.

Апробация результатов.

Материалы диссертации были представлены на конференции «Геном человека-91» (Переславль-Залесский, 1991 ); на совещании «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 1992), а также на конференции «Геном человека-93» (Черноголовка, 1993).

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы содержит наименования, из них иностранных источника. Работа содержит страниц, включая рисунков и таблиц.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГАТ - селективная среда, содержащая гипоксантин, аминоп-

терин, тимидин

ПЭГ - полиэтиленгликоль

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка

ЭФЧ - эмбриональные фибробласты человека

ЭФМ - эмбриональные фибробласты мыши

у.п. - удвоений популяции

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культура клеток.

ЭФЧ получали из двухмесячного абортивиого материала по стандартной методике (Адаме, 1983) с небольшими изменениями. Линия мышиных фибробластоподобных трансформированных клеток А9 (ГФРТ ) была любезно предоставлена O.JI. Серовым (ИЦиГСО РАН, Новосибирск). Клетки культивировали при 37°С в атмосфере 5% СО. Полная ростовая среда содержала DMEM, 40 мкг/мл гентамицина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС).

Плазмида.

Была использована векторная плазмида pSV2neo, несущая ген устойчивостик антибиотику G418, находящийся под контролем промотора ранней регуляторной области вируса SV40 (Southern, Berg, 1982). Наращивание, выделение и очистку плазмиды производили согласно стандартным методикам (Маниатис, 1984).

Электротрансфскцня.

Трансфекщпо осуществляли с помощью электроманипулятора ВТХ-200 (ВТХ, США) в режиме один импульс, 99 мкеек, 4 кВ/см. Селекцию вели на среде, содержащей 400 мкг/мл G418.

Получение гибридных клеток.

Слияние клонированных ЭФЧпео* и клеток А9 проводили с помощью ПЭГа по стандартной методике (Wynford-Tomfs, et al., 1989). Гибридные клоны селектировали на полной ростовой среде содержащей 400 мкг/мл G418 и 10 5М уабаина.

Перенос хромосом при помощи микроклеток.

Микроклетки получали по стандартной методике (Kol, et al., 1989) с модификациями. С целью инициировать микронуклеащпо во флаконы с гибридными клетками добавляли 0,1 мкг/мл колцемида. Через 48 часов количество микронуклеированных клеток обычно превышало 50%. Флаконы заполняли средой с цитохолозином В и помещали в центрифужные стаканы, заполненные теплой водой. Энуклеацию проводили в центрифуге К23 при 5тыс. оборотах в минуту один

час, 37°С. Суспензию микроклеток последовательно фильтровали через фильтры с диаметром пор 10 шсм, 5 мкм, 3 мкм (PC, Nuclepore) для удаления целых клеток и крупных микроклеток и использовали для слияния при помощи ПЭГ с ЭФЧ. Резистентные колонии выращивали в среде ДМЕМ: Fl 2, содержащей 15% ЭТС, 5% пуповинной сыворотки человека и 200 мкг/мл G418.

Kapnoiипирование.

G-окрашивание хромосом проводили по стандартной методике (Sumncr, et al., 1971). Для каждого гибридного клона время гипотонической обработки подбиралось эмпирически. Идентификацию хромосом мыши в культуре клеток А9 проводили согласно стандартной номенклатуре.

Гибридизация in situ.

В качестве проб для флюоресцентной гибридизации in situ использовали: 1) тотальную ДНК человека; 2) ДНК из клеток гибридных клонов человек-мышь; 3 ) ДНК-зонды на а- сателлитшле повторы человеческих хромосом. Пробы метили биотипом (bio- 17-dATP) с помощью набора для ник-трансляцин. Гибридизацию и отмывку проводили при стандартных условиях (Кост и др., 1994). Выявление сигнала проводили при помощи системы avidin-FITC. Для гибридизации с 3Н-меченой пробой, ДНК pSV2neo метили методом ник-трансляции. После гибридизации и отмывки препараты покрывали эмульсией типа «М» (Химфотопроэкт, Москва). Для получения картины G-окрашивания, препараты выдерживали в растворе Hoechst 33258, облучали УФ и окрашивали в растворе Гимза.

Блот-гибрндшация рестрикционных фрагментов ДНК

Высокомолекулярную ДНК выделяли из клеток фенолыюдетер-гентным методом с обработкой экстракта протеиназой К (Маниа-тис,1984). Расщепление рестриктазами HindIII или Bgll проводили при 37°С в течение 12 ч. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК проводили в 0,8 %-ном агарозном геле в ТВЕ-буфере.Элек-троперенос на нейлоновый фильтр «Hybond N» проводили в 0,ЗхТВЕ в режиме 800 тА, 60 В, 3 ч, 15-20°С. В качестве зонда для гибридизации использовали плазмцдную ДНК, меченную 32Р методом шпе-тран-

сляции. Гибридизацию проводили в течение 12-16 часов при 65°С в растворе Денхардта. Отмытый фильтр подвергали радиоавтографии в течение нескольких суток.

Определите активности теломеразы.

Анализ клеток на наличие теломеразной активности проводили в соответствии с методикой, описанной Мориным (1990) с некоторыми изменениями. В специально приготовленные клеточные, экстракты добавляли затравку (ТТАССО)2 а также смесь меченных "Р и немеченых дезоксинуклеотидтрифосфатов. Оценивали способность экстрактов удлинять затравку. Поскольку теломераза чувствительна к воздействию РНК-азы, неспецифическая трансферазная активность учитывалась после обработки этим ферментом.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение клонов ЭФЧ, резистентных к С418

ЭФЧ трансфицировали плазмидой р8У2пео с целыо получения клеточных клонов, несущих экзогенный селективный маркер. Через 3-4 недели образовывалось от одного до десяти резистентных клонов на миллион обработанных клеток. С каждой чашки Петри изолировали не более одной колонии, поскольку наряду с независимыми клонами, там могли находиться и дочерние колонии.

В пяти независимых экспериментах, проведенных с использованием кольцевой полноразмерной плазмиды р8У2пео, а также в двух экспериментах с использованием линейной плазмиды с удаленным фрагментом ЕсоШ-ВатН1 было получено в общей сложности около сорока резистентных клонов, восемнадцать из которых использовали в дальнейшей работе для гибридизации с клетками мыши. Возраст клона оценивали как количество удвоений популяции (у.п.), пройденных клоном, начиная с момента, когда его размер достигал 1млн. клеток. В этом случае пролиферативный потенциал можно рассматривать как количество у.п., которое осталось пройти клону до прекращения пролиферации.

Таблица 1

Основные характеристики гибридных клонов, полученных в результате слияния ЭФЧпео* и клеток А9

Количе ств П р едпола-

Клон Плоиднос хромосом г а е м ы е Субполяция А9

человека маркиро-

ванные

хромосом

К1-2 4 п 10 - 17 6; 20 малая

К1 - 3 а 4п 10 - 20 малая

К1-ЗЬ 4 п 11-24 малая

К1 - 3 с 4п 8 - 24 малая

КI - 4 2п 4 - 8 ■ малая

К11 - 2 а 4 п 5 - 10 1 2 малая

К11 - 2 Ь 2п 1 - 2 ■ малая

КШ- 1 4 п 10 - 20 7 малая

К1У- 4 4 п 8 - 18 18; 19 малая

KV.li 2 п 0 7 большая

КУ- 1 Ь 2 п 1 - 3 20 малая

К V - 2 2 п 6 - 7 малая

КУ-З 2 п б - 7 малая

XV- 1 2а 2 п 2 - 4 малая

КУ- 1 2 Ь 2 п 8 - 9 малая

КУ1- 2 4 п 5 - 8 1 9 малая

КУП- 1 2 п 0 ? большая

К V 111 - 2 4 п 5 - 15 X малая

К1Х-2 2 п 3 - 6 1 9 малая

КХ- 1 2 п 0 ? большая

КХ1-25 2 п 0 7 большая

КХ11- 1 2 п 0 7 малая

К. X 11 - 4 2 п 2 - 5 7; 16 малая

Л I - 1 2п 1 - 4 1 6 малая

ЛИ- 1 4 71 3 - 4 20 малая

лпы 2 п 5 ? малая

Л IV- 4 2 п 2 7 большая

Л V- 4 4 п 9 - 13 16; 20; 21 малая

Л VI- 1 2 п 0 - 3 7 малая

Л VI - 2 2 п 8 малая

"К" или "Л" - кольцевая или линейная форма плазмиды

Римская цифра - номер клона ЭФЧпео

Арабская цифра - количество у.п., пройденных клоном ЭФЧпео до слияния Латинская буква - индекс, используемый для обозначения клонов, полученных от одного слияния

Получение соматических гибридов человек-мышь, несущих экзогенный селективный маркер псо.

Двенадцать клонов ЭФЧпеоа,получе11ныхв результатетрансфек-циикольцевой плазмиды, и шесть клонов, полученных при трансфек-ции шшейной формой, были использованы дня гибридизации с клетками культуры А9. В результате были изолированы тридцать независимых гибридных клонов. В некоторых случаях слияние клонов ЭФЧпеоя осуществлялось на различных пассажах. Все полученные гибридные клоны были прокариотипированы с помощью G-окрас-ки, а некоторые из них проанализированы при помощи гибридизации in situ. Основные характеристики полученных гибридов приведены в таблице 1.

Имморталыюсть гибридных клонов.

Большенство из полученных гибридных клонов поддерживалось в культуре более 100 у.п. без снижения скорости пролиферации.По-мимо длительного культивирования критерием, позволяющим отличить иммортальныс клетки, может служить наличие в них активности теломеразы (Kim, et al, 1994). Чтобы проверить предположение об участии теломеразы в образовании гибридных клонов, мы оцешиш теломеразную активность в некоторых из них. Определение активности теломеразы проводили совместно с Лабораторией химического и биологического анализа биополимеров и клеток (зав., академик РАН А.А.Краевский). Как родительские клетки А9, так и гибридные клетки, в отличие от ЭФМ, обладали высоким уровнем активности теломеразы (табл .2 ). Интересно отметить, что помимо теломераз-ной активности эти клетки проявляли существенную неспецифическую активность терминальной дезоксинуклеотиднл трансферазы, практически отсутствующую у клеток ЗТЗ Swiss.

Таблица 2

Анализ терминальной трансферазной активности

клетки удельная активность (у.е)*

общая остаточная** теломеразная

А9-1 714 357 357

А9-14 986 493 493

KV- 1а 833 278 555

KV-lb 962 385 577

KV- 12а 1000 500 500

ЗТЗ Swiss 556 93 463

ЭФМ 98 61 37

* - условные единицы

** - после обработки клеточного экстракта РНК-зой

А9-1; А9-14 - клоны культуры А9

Анализ сегрегации хромосом.

На первом этапе анализа полученных гибридных клонов мы решили выяснить предполагаемую локализацию маркерного гена. Поскольку интеграция экзогенной маркерной ДНК в человеческие хромосомы чаще всего происходит в одиночный сайт (Мигпапе, 1990), можно предположить, что в большинстве метафазных пластинок гибрида должна присутствовать хромосома, несущая селективный маркер. Так, например, в клоне Л1-1 встречаются следующие наборы хромосом человека: №1 16,7,X,22 №2 16,7,X №3 16, X №4 16,7 №5 16.

Во всех клетках данного клона присутствует хромосома 16

человека. Постоянное присутствие одной из хромосом в условиях селекции может свидетельствовать о наличии в ней селективного маркера (Табл. 1). Если с определенным клоном ЭФЧпеок было получено несколько гибридных клонов, то метафазные пластинки каждого из них должны содержать маркированную хромосому.

Кроме того, из приведенного примера видно, что при образовании клеток с кариотипом 3 хромосома 7 человека сегрегировалась,а хромосома X сохранилась; в кариотипе № 4 наоборот, сегрегировалась, хромосома X и сохранилась хромосома 7. Таким образом, порядок сегрегащш хромосом может быть различным в рамках одного клона. Это утверждение не ограничивается конкретным примером и справедливо для всех проанализированных нами гибридных клонов.

В то же время результаты хромосомного анализа показали, что в большинстве клонов определенные хромосомы человека встречаются с высокой частотой - до 50%-ов, и частоты встречаемости сходны в различных гибридных клонах. Наиболее часто встречались хромосомы 16,7,17,22,12,X, в то же время хромосомы 1,2,3,4,8,13 встречались сравнительно редко. Хромосома 9 не встретилась ни разу (рис.1)

Следует отметить, что существование ясно выраженных пиков в суммарном распределении хромосом нельзя объяснить лишь наличием генов устойчивости в соответствующих хромосомах. Если исключить из рассмотрения предполагаемые маркированные хромосомы, суммарное распределение сохранит большенство пиков, хотя их выраженность уменьшится (рис.1). Этот факт указывает на существование определенных закономерностей сегрегации хромосом человека клетками гибридов и свидетельствует в пользу существования устойчивых групп хромосом, предпочтительно сохраняющихся в составе гибрида с клетками А9 (рис.2).

Полученные нами гибридные клоны различались так же и по количеству хромосом человека. Большинство клеток, содержащих много хромосом человека, одновременно содержали и двойной набор хромосом клеток мыши (табл.1). Поскольку во многих из них встречалось 3-4 человеческих гомолога, образование таких гибридных клонов, по-видимому, связано с эндорепликацией.

Количество хромосом

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

Номера хромосом Рис. 1. Суммарное распределение хромосом человека в гибридных клетках. 1 - общее; 2 - без предполагаемых маркерных хромосом

Рис. 2. Группы хромосом, наиболее часто встречающиеся в гибридных клетках. Одна линия соответствует приблизительно трем случаям совместного присутствия хромосом в гибридах.

Клопы, резистентные к G418 и не содержащие хромосом человека

Как видно из таблицы 1, пять клонов, полученных в результате слияния ЭФЧпеоа и клеток А9, не содержали человеческих хромосом, выявляемых по результатам кариологического анализа. Кроме того, в половине метафазных пластинок гибридного клона J1VI-1 (табл.1) так же отсутствовали хромосомы человека. В результате ка-риотипирования «бесхромосомных» гибридов было установлено, что четыре из пяти гибридных клонов отличаются от остальных не только отсутствием хромосом человека, но и особенностями хромосом мыши. Это побудило нас обратить особое внимание на кариотип родительской линии клеток мыши - А9.

Хромосомный анализ показал, что использованная нами культура клеток А9 состоит, по крайней мере, из двух субпопуляцнй, отличающихся по кариотипу и составляющих соответственно 85% и 15% всех клеток. Было выявлено шесть кариотипических отличий, включающих делении, транслокации и экстрохромосомы. Эти различия делают невозможным образование одной субпопуляции из друг ой на нынешнем этапе культивирования А9.

Сравнение кариотипов гибридных клонов, с кариотипами родительских клеток А9 показало, что все гибридные клоны, содержащие хромосомы человека, за исключением клона J1IV-4, содержат совокупность признаков малой субпопуляции А9. В то же время, четыре из пяти клонов, не содержащих хромосомы человека, имеют структуру кариотипа, соответствующую таковой в большой субпопуляции.

Оставалась неясной природа устойчивости к G418 клеточных клонов, не содержащих хромосомы человека. Поскольку устойчивость могла быть обусловлена присутствием небольших хромосомных фрагментов, мы провели исследование полученных гибридов с помощью флюоресцентной гибридизации in situ, используя в качестве зонда тотальную ДНК человека.

Как показали эти эксперименты, все клоны, образованные от слияния с клетками А9 большой субпопуляции, кроме JTIV-4, не только не содержат целые хромосомы человека, но также не содержат их фрагменты, в том числе в составе хромосом мыши. Клон KXII-1, образовавшийся в результате слияния с клетками А9 малой субпопуляции и ранее отнесенный к «бесхромосомным» как исключение, со-

держал крупную транслокацию человек-мышь. Кроме того, половина метафазных пластинок клона ЛУ1-1 не содержала целых хромосом человека, но содержала транслокацию человек-мышь. Таким образом, все клоны, не содержащие человеческого хромосомного материала, образовались только от слияния с клетками большой субпопуляции А9.

Клон Л1У-4, содержащий две целых хромосомы человека и один фрагмент в составе хромосомы мыши, также образовался от слияния склетками большой субпопуляции А9. Поскольку для получения гибрида Л1У-4 использовалась плазмида, линеаризованая удалением фрагмента ЕсоШ - ВатН1, возникло предположение, что для обра. зования клонов, не содержащих человеческого хромосомного материала, необходимо наличие интактного вектора и слияние клеток-трансфектантов с клетками большой субпопуляции А9.

Клоны линии А9, отличающиеся по способности удерживать хромосомы человека в гибридах человек-мышь

Для выделения в чистом виде каждой субпопуляции А9 был использован метод лимитирующих разведений. В результате удалось изолировать 29 клонов культуры клеток мыши А9.

Кариотипический анализ подтвердил данные о наличии двух субпопуляций в культуре А9. Для дальнейшей работы были использованы клон А9-1, отнесенный к большой субпопуляции клеток А9 и клон А9-14, отнесенный к малой субпопуляции.

Следующим этапом работы было слияние клеток разных субпопуляций культуры А9 мыши с ЭФЧ, трансфицированными плазми-дой р8У2пео в линейной или кольцовой форме. Поскольку оставалось неясным, почему субпопуляция, составляющая 15% от общего числа клеток А9, дает 85% гибридных клонов (табл.1 ), мы решили оценить эффективность слияния и число долгоживущих гетерокари-онов в экспериментах с обоими клонами А9. Индекс слияния определяли как отношение количества клеточных ядер, находящихся в составе поликарионов, к общему числу ядер, выраженное в процентах. Подсчет проводили на вторые сутки после слияния. Количество долгоживущих гетерокарионов определяли через 3 недели после начала селекции. Усредненные результаты этих экспериментов представлены на рис. 3.

30-

20-

10-

о

А9-1 А9-14

Рис.3. Эффективность слияния (1 ) и образования долгоживущих гетерокарионов (2) клонами А9.

Как видно из рисунка, при одинаковой эффективности слияния клетки большой субпопуляции А9 образуют в несколько раз меньше долгоживущих гетерокарионов по сравнению с клетками малой суб-лопуляции.

Часть гибридных клонов, образовавшихся в этих экспериментах, была изолирована и использована в опытах по гибридизации in situ с тотальной ДНК человека (табл.3 ). Из тринадцати проанализированных клонов были выявлены два, не содержащие человеческого хромосомного материала. Эти клоны являлись результатом слияния клеток большой субпопуляции А9 с ЭФЧпео*, трансфицированны-ми кольцевой плазмидой. Все остальные клоны содержали от 2-х до 34-х хромосом человека, а так же их фрагменты.

Поскольку причиной полной сегрегации хромосом человека в гибридах с большой субпопуляцией А9 могло явиться чрезмерное укорачивание теломер, мы сравнили теломеразную активность в клетках большой и малой субпопуляций А9. Не было обнаружено существенных различий в активности этого фермента между клонами А9-1 и А9-14 (табл.2 ). Таким образом, отсутствие человеческих хромосом в «гибридах» с клетками большой субпопуляции А9, по-видимому, не является следствием неспособности этих клеток поддерживать стабильность теломер человеческих хромосом.

Для сравнения скорости сегрегации хромосом в гибридах, образованных при слиянии с клетками большой и малой субпопуляций А9, мы подсчитали среднее количество хромосом человека в этих гибридах до и после 6-недельного культивирования (табл.3 ). В обоих случаяхколичесгво хромосом человека в гибридных клонах в среднем уменьшилось на две хромосомы, при этом количество хромосомных фрагментов не изменилось. Этот результат свидетельствует в пользу того, что образование клонов, не содержащих человеческого хромосомного материала, не связано с повышенной способностью клеток первой субпопуляции А9 к сегрегации хромосом во время культивирования. Отсутствие хромосом человека в этом случае, по-видимому, обусловлено иным механизмом сегрегации, функционирующим на самом раннем этапе клонообразования.

Таблица 3

Количество хромосом человека и транслкаций человек-мышь в гибрвдах, полученных в результате слияния клонов А9 с ЭФЧ, трансфицированными различными формами р8У2пео

Клон А9 Хромосомы человека Транслокации человек-мышь Хромосомы человека Транслокации человек-мышь

А9 - 1 9 - 14 (9 - 14) 3 - 17 (3 - 16) 6 - 12 0 - 1 (0 - 1) 1 - (1) 2-3 5 - 8 1 - 2 0 0 1 2 0 0

А9 - 14 7 - 11 (7 - 9) 7 - 8 (7 - 8) 7 - 16 31 - 34 2-4 0 (0) 2 - 3 (2 - 3) 0 - 2 1 - 2 0 12 - 18 2 - 3

Линейная плазмида Кольцевая плазмида

в скобках - через 6 недель культивирования

Геномная нестабильность шбридов, связанная с присутствием экзогенной ДНК

Поскольку при использовании экзогенного маркера существует опасность увеличения геномной нестабильности, с которой может быть связано образование «бесхромосомных гибридов», мы решили сравнить количество хромосомных перестроек человек-мышь в гибридах, полученных с использование экзогенного маркера пео и эндогенного маркера (ГФРТ). Так как клетки А9 несут мутантный локус ГФРТ" , мы получили гибридные клоны, используя селекцию на ГАТ(табл.4).

Как и ожидалось, при использовании эндогенного маркера не было получено гибридов, несодержащих человеческого хромосомного материала. Кроме того отсутствовали существенные различия в количестве транслокаций человек-мышь между гибридами, полученными с использованием экзогенного и эндогенного маркеров.

Таблица 4

Среднее количество транслокаций человек-мышь при использовании экзогенного или эндогенного маркеров

клон ГФРТ пео

А 9- I 1,51 (8) 1,23(4)

А 9- 14 1,79(4) 1,35(8)

в скобках - число проанализированных гибридных клонов

Следующим этапом явилось изучение стабильности сайта интеграции экзогенного маркера. Для этого высокомолекулярную ДНК, выделенную из гибридного клона, обрабатывали рестршсгазой, имеющей единичный сайт узнавания в плазмиде р8У2пео, после чего проводили блот-гибридизацшо с меченой плазмидой. Для анализа были отобраны гибридные клоны: К\Ма; К\МЬ; КУ-12а, имеющие общего родителя, а так же гибриды КХ1-25 и ШУ-4.

Наличие двух полос на дорожке 1 (рис.4а), а так же соответству-щих им по подвижности в геле полос на дорожке 2 говорит о стабильной интеграции одиночной копии р8У2пео в гибридах КУ-1Ь;

КУ - 12а. Поскольку второй гибрид получен от слияния с тем же родительским клоном ЭФЧпеок, но прошедшим 11 у.п., идентичность сайта интеграции в обоих гибридах свидетельствует так же о стабильности маркера в родительских клетках. Напротив, гибрид К\Ма, образовавшийся в результате слияния того же клона ЭФЧпеоя с клетками большой субпопуляции и не содержащий человеческого хромосомного материала, показал тандемное встраивание «голова к хвосту» в новый сайт интеграции (рис.4б). В случае другого «бесхромосомного» гибрида - КХ1-25 (рис 4а) очевидно имеет место множественная интеграция конкатомеров в различные сайты, чем обусловлено наличие размытого сигнала, выявленного в результате гибридизации. Гибрид Л1\М, также образовавшийся от слияния с клетками А9 большой субпопуляции, но содержащий линейную форму плазмиды и целые хромосомы человека, имел две единичные копии плазмиды ннтегрированые в различные сайты (рис.4б).

1 2 3 4 5 6 7

Рис.4. Анализ сайтов интеграции pSV2neo. Высокомолекулярную ДНК из гибридных клеток обрабатывали рестргасгазой Hind III (а) или Bgl II ( б ). 1,7-KV-lb; 2-KV-12a; 3-KXI-25; 4-Л1У-4; 5pSV2neo; 6-KV-la.

а

Таким образом, обобщая полученные результаты, можно сделать вывод, что слияние с клетками А9 большой субпопуляции индуцирует нестабильность интеграции экзогенного маркера по крайней мере в том случае, если для трансфекции родительских клеток использовалась кольцевая плазмида.

% число клонов

50- - Ю

9

40-

30-

20-

10-

0-

-7 -6 -5 -4 -3 -2 - 1 -0

1-4 у.п

- слияние

25 - 26 у.п 1-4 у.п 25 - 26 у.п

|- с хромосомами человека

долгоживущие гетерокарионы

без хромосом человека

Рис. 5. Влияние пролиферативного потенциала ЭФЧ на результаты гибридизации с клетками А9.

Влияние пролиферативного потенциала ЭФЧ на эффективность образования гибридных клонов.

Чтобы ответить на вопрос, необходим ли для образования гибридных клонов запас пролиферативного потенциала ЭФЧ, мы использовали «состарившиеся» клоны ЭФЧпеоа (K1,KV,KXI). Все три клона прошли 25 у.п. и обладали пролиферативным потенциалом не более 1-2 у.п.. В результате шести экспериментов по слиянию был получен единственный гибридный клон KXI-25. Результаты карио-типирования и гибридизации in situ с тотальной ДНК человека показали отсутствие человеческого хромосомного материала в клетках этого клона , а также то, что его происхождение обусловлено слиянием с клеткой большой субпопуляции А9. Анализ обобщенных результатов шести экспериментов по слиянию тех же клонов ЭФЧпео'\ находящихся на стадии 1-4 у.п., и экспериментов со «старыми» ЭФЧпео* приведен на рисунке 5. Как видно из рисунка, при аналогичных условиях гибридизации на ранних пассажах было получено восемь гибридных клонов, содержащих хромосомы человека, и один «бесхромосомный» клон. Интересно, что несмотря на отсутствие гибридных клонов, содержащих хромосомы человека, в опытах со «старыми» ЭФЧпеок эффективность слияния, а также эффективность образования долгоживущих гетерокарионов не только не сократилась, но и несколько увеличилась (рис.5 ). Такое увеличение может быть связано с изменением формы и размеров клеток при их старении, что облегчает клеточное слияние.

Таким образом, выяснилось, что для образования шбридныхкло-нов, содержащих хромосомы человека, необходим запас пролиферативного потенциала. Образование гибридов с клетками, израсходовавшими свой пролиферативный потенциал либо невозможно, либо происходит с очень низкой эффективностью. В то же время, появление резистентных клонов, не содержащих человеческого хромосомного материала, по-видимому, не требует пролиферативного потенциала родителя.

Изучение репликативного потенциала хромосом человека в гибридах человек-мышь

В том случае, если «стариться» могут отдельные хромосомы и про-лиферативное старение связано с утратой их репликативного потенциала (01ovnirov,1973 ) отсутствие гибридных клонов может быть обусловлено невозможностью репликации хромосомы, несущей селективный маркер. Чтобы определить репликативный потенциал хромосомы, необходимо осуществить ее перенос в «молодые» ЭФЧ. По сохранешпо устойчивости к G418 образующимися резистентными клонами можно оценивать способность маркированной хромосомы к репликации.

В экспериментах по микроклеточному переносу были использованы гибриды ICV-lb и KV-12a. Предварительно оба гибрида были подробно проанализированы. Они содержали минимальное количество хромосом человека и несли единичную копию pSV2neo, стабильно интегрированную в один и тот же сайт (рис.4). С помощью гибридизации in situ с 3Н-меченной плазмидной ДНК, экзогенный маркер был локализован в прицентромерной области хромосомы 20.

Было проведено пятнадцать независимых экспериментов с использованием клона KV-lb ипять экспериментов склоном KV-12a. В обоих случаях через 2-3 недели селекции образовывался в среднем один клон резистентных ЭФЧ на опыт. В экспериментах с KV-lb клоны доростали до размера 50-200 клеток, а в случае KV-12а до 50-100 клеток.

Для выявления перенесенной хромосомы, крупные клоны изолировали с помощью клональных цилиндров, клетки фиксировали в минимальном объеме и проводили гибридизацию in situ с зондом на а-сателитную ДНК хромосомы 20. Идентификацию экстрахромосомы проводили по наличию дополнительного сигнала на интерфазном ядре.

Таким образом, клоны, содержащие дополнительную хромосому 20 проходили не более 7-8 у.п., после чего утрачивали устойчивость к антибиотику. В то же время, пролиферативный потенциал клона KV составлял не менее 25 у.п. при получении гибрида KV-lb и не менее 13 у.п. при получении KV-12a, В связи с этим можно заключить, что в процессе образования гибридов происходило существенное уменьшение репликативного потенциала маркированной хромосомы.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В результате проделанной работы нами получен набор иммор-тальных гибридных клонов человек-мышь, несущих экзогенный селективный маркер пео. Цитогенетический анализ позволяет разделить их на три группы: 1) гибриды, содержащие целые хромосомы человека и их фрагменты; 2) гибриды, содержащие только фрагменты человеческих хромосом, транслоцированные на хромосомы мыши; 3) «гибриды», не содержащие человеческого хромосомного материала. Резистентные клетки последней группы только условно могут быть названы гибридными, поскольку, в них не представлен геном одного из партнеров.

Для гибридов первой группы характерна геномная нестабильность, выражающаяся в постепенной сегрегации хромосом человека в процессе культивирования. Образование гибридов, содержащих только фрагменты хромосом человека, по-видимому, является крайней степенью сегрегации хромосом и происходит в том случае, когда хромосома, несущая селективный маркер, вовлечена в перестройку человек-мышь.

Анализ сегрегации хромосом человека показал, что этот процесс может идти различными путями в пределах одного клона, и, в то же время, существуют группы хромосом, преимущественно сохраняющиеся в составе гибрида.

Полученное нами распределение частот встречаемости хромосом человека незначительно отличается от таковых, полученных при использовании других родительских клеточных линий. Все хромосомы, наиболее часто встречаемые в гибридах с клетками А9 (рис. 1), в гибридах человек-хомячек встречались так же с повышенной частотой (8г^а\уага й а1.,1990).

Ни в одной из проанализированных нами метафазных пластинок не было обнаружено хромосомы 9. Отсутствие хромосомы 9 может быть связано с ее поздней репликацией, строением центромер или иными особенностями, тем более, что эта хромосома встречалась крайне редко и в гибридах человек-хомячек.

Образование резистентных клонов, не содержащих человеческого хромосомного материала, явилось результатом генетической нестабильности экзогенного маркера, приводящей к его распростране-

шпо по геному. Анализ сайтов интеграции маркерной плазмиды в «бесхромосомных гиб])идах» выявил картину аналогичную той, которая наблюдается при трансфекции в клетки имморталъных клеточных линий грызунов ( Murnan, et al.,1990 ) - тандемную интеграцию «голова к хвосту» в несколько сайтов (рис.4).

Необходимым условием образования «бесхромосомных гибридов» является слияние ЭФЧпео* с клетками большой субпопуляции А9. Возможно, это приводит к амплификации интегрированной в человеческую хромосому плазмиды с образованием эписомных форм и последующей ее реинтеграцией в хромосомы мыши. В этом случае сегрегация хромосом человека может пойти по пути разделения двух геномов (Harris, et al.,1966).

Остается неясным механизм, посредством которого клетки большой субпопуляции А9 стимулируют амплификацию и/или разделение геномов. Последовательности ДНК, индуцирующие амплификацию, были выделены из генома мыши (Holst, et al., 1988). Являясь цис-действующими элементами, они могли вызывать амплификацию плазмиды, интегрированной в геном. Однако в случае «бесхромосомных гибридов» необходимо наличие транс-действующих индукторов амплификации, поскольку в этих «гибридах» не обнаруживаются транслокации человек-мышь.

Предположение о том, что клетки большой субпопуляции А9 стимулируют разделение геномов находит подтверждение в опытах с клонами А9. Значительно меньшее количество долгоживуших гете-рокарионов при слиянии с клетками А9-1 (рис.3) может являться следствием разделения геномов клеток-партнеров. При стабильной интеграции экзогенного маркера этот процесс ведет к гибели дочерних клеток, что объясняет малую эффективность образования гибридов, по сравнению с эффективностью слияния.

Заслуживает интереса тот факт, что все околотетраплоидные гибриды получены только при слиянии с клетками А9 малой субпопуляции (табл.1;3 ). Поскольку эти гибриды образовались в результате эндорепликащш, возможно, что в исходной культуре А9 существует обратная корреляция между способностью клеток индуцировать эн-дорепликацию с одной стороны и стимулировать разделение.гено-мов с другой, послужившая основой для клеточной гетерогенности.

Вторым необходимым условием образования «бесхромосомных, гибридов» является использованиекольцевой плазмиды для трансфек-цииродительских ЭФЧ. Трансфекция линейной формой, по-видимому, приводит к интеграции маркера в составе урезанной из-за воздействия клеточных экзонуклеаз векторной ДНК (НапаЬап, е1 а1., 1980). Образование эписомных форм в этом случае может быть затруднено. Появление эписомных форм в процессе распространения по геному было показано на примере другой плазмиды, не подвергнутой линеаризации (КоеЫег, е1 а!.,1995). Не исключено, что для амплификации экзогенного маркера также необходимо наличие векторной последовательности.

Образование «бесхромосомных гибридов» не требовало запаса пролиферативного потенциала родительских ЭФЧ. Напротив, образование гибридов, содержащих хромосомы человека, происходило только при слиянии с ЭФЧ, не достигшими предела пролиферативного старения. Необходимость запаса пролиферативного потенциала ЭФЧ, по-видимому, обусловлена уменьшением репликативиого потенциала отдельных хромосом человека в процессе становления гибридного клона. Расходование репликативиого потенциала при образовании гибрида было продемонстрировано нами на примере хромосомы 20. «Молодые» ЭФЧ, получившие в результате микроклеточного переноса дополнительную хромосому 20, несущую селективный маркер, прекращали рост, пройдя около 7-8 у.п.. Поскольку пролиферативный потенциал одного из родительских клонов ЭФЧпеок составлял не менее 25 у.п., а другого около 13 у.п , в процессе становления гибридного клона КУ-1Ь был израсходован реп-ликативный потенциал соответствующий приблизительно семнадцати раундам репликации и шести раундам в случае гибрида КУ-12а.

Очевидно, что потеря репликативиого потенциала хромосом человека происходит только на начальном этапе роста гибридного клона. Гибриды, использовавшиеся в качестве доноров микроклеток, проходили от 15 до 200 у.п. и это не сказывалось на размерах клонов образующихся резистентных клеток.

Интересно отметить, что при росте клона К\МЬ, когда его размер достиг около 1 млн. клеток, наблюдался «кризис», выражавшийся в массовой гибели клеток и образовании вторичных клонов. Подобные «кризисы» наблюдаются при иммортализации ЭФЧ, и про-

хождение через них обусловлено появлением экспрессш! теломеразы, компенсирующей укорачивание теломер в процессе репликации (Wright, et al., 1989). Таким образом, стабилизация репликативного потенциала хромосом человека может быть вызвана сегрегацией хромосомы несущей ген, подавляющий экспрессию теломеразы. Экспрессия теломеразы была обнаружена нами в обоих гибридных клонах (табл.2). К сожаленшо, использованный метод определения теломе-разной активности требовал значительного количества клеток и не мог применяться на раннем этапе роста клонов. Случайность процесса сегрегации, возможно, является причиной того, что нам не удалось обнаружить существенного различия репликативного потенциала хромосомы 20 в гибридах, полученных на различных стадиях пролиферативного старения ЭФЧ.

Все приведешше выше расчеты репликативного потенциала основаны на предположении о соответствии пролиферативного потенциала клеток репликативному потенциалу хромосом. Однако это утверждение не очевидно. Так, по мнению Шея (1993), существует два барьера пролиферативного старения, которые должны пройти ЭФЧ, чтобы стать нммортальными. Первый 6apbqi (Ml) обусловлен появлением клеточных ингибиторов пролиферации и может преодолеваться благодаря экспрессии некоторых онкогенов. Наличие второго барьера (М2) связано с расходованием репликативного потенциала хромосом(ы), а конкретно - с максимально возможным укорачиванием теломер в результате репликации. Прохождение М2 связано с появлением экспрессии теломеразы. Между М1 и М2 клетки проходят приблизительно 20 у.п.. В этом случае недостаток репликативного потенциала маркированной хромосомы может быть обусловлен значительно более низкой процессивпостыо мышиной теломеразы по сравнению с теломеразой человека (Prowse, et al.,1993 ). Нельзя так же исключать возможности, что дополнительная «старая» хромосома включает в ЭФЧ Ml механизм старения. Последнее предположение основано на том, что в качестве «молекулярных часов», запускающих Ml, рассматривают укорачивание теломер до определенной длины (Harly, 1991). Все высказанные предположения, несомненно, требуют экспериментальной проверки.

выводы

1. В результате соматической гибридизации мышиных клеток линии А9 и ЭФЧ, трансфицированных плазмидой рБУ2пео. получен набор гибридных клонов человек-мышь, устойчивых к С418.

2. Процесс сегрегации хромосом человека в гибридах человек-мышь не является жестко детерминированным и может идти различными путями внутри одного клона. В то же время, существуют устойчивые группы хромосом, преимущественно сохраняющиеся в гибридах.

3. Не было выявлено различий в количестве хромосомных транслокаций человек-мышь при использовании для селекции эндогенного (ГФРТ) или экзогенного (пео) маркеров.

4. Обнаружена клональная гетерогенность культуры А9 по способности индуцировать генетическую нестабильность экзогенного маркера при слиянии с ЭФЧ, трансфицированными кольцевой плазмидой р8У2иео. Следствием этой нестабильности может явиться образование резистентных клонов, не содержащих человеческого хромосомного материала.

5. Для образования гибрида между ЭФЧ и клетками А9 требуется запас пролиферативного потенциала клеток человека.

6. В процессе образования иммортального гибридного клона реп-ликативный потенциал хромосом мортального партнера может расходоваться.

7. Показано участие теломеразы в образовании иммортальных гибридных клонов человек-мышь.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Большева Н.Л., Лупатов АЛО., Егоров Е.Е., Золотарев В.Ю., Егорова И.Н., Зеленин A.B. Скорость сегрегации хромосом в соматических гибридах человек-мышь контролируется геномом мыши II Докл. Акад. Наук, 1993, т.ЗЗО, С.516-519.

2. Лупатов А.Ю., Федорова Л.И., Лопухина A.A., Кост-Али-мова М.В., Большева Н.Л., Егоров Е.Е., Зеленин A.B. Образование клеточных клонов, резистентных к G418 и не содержащих хромосом человека, в результате соматической гибридизации клеток линии А9 с человеческими фибробластами, трансфицированными pSV2neo // Докл. Акад. Наук, 1995, (в печати ).

3. Лупатов А.Ю., Золотарев В.Ю., Федоров Ю.В., Егоров Е.Е., Большева Н.Л., Егорова И.Н., Кост М.Б., Савина C.B. Анализ гибридов диплоидных фибробластов человека с клетками мыши. // Цитология, 1992, т.34, С.79.

4. Егоров Е.Е., Лупатов А.Ю. Изучение старения эмбриональных фибробластов человека in vitro. II Цитология, 1992, т.34, С.67.

5. Лупатов А.Ю., Золотарев В.Ю., Алимов A.A., Федоров Ю.В., Егоров Е.Е., Большева Н.Л., Кост М.В. Получение гибридов диплоидных фибробластов человека с клетками мыши И Сб. тезисов. Конференция «Геном человека-91», Переславль-Залесский, 1991, С. 15.

6. Большева Н.Л., Лупатов А.Ю., Золотарев В.Ю., Егоров Е.Е., Алимов A.A.,Кост М.В., Егорова И.Н., Федоров Ю.В. Сегрегация хромосом в соматических гибридах человек-мышь контролируется геномом мыши // Сб. тезисов. Конференция «Геном человека-93", Черноголовка , 1993, С. 15.