Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

САТЕЛЛИТНЫЕ ДНК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "САТЕЛЛИТНЫЕ ДНК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДША ЛЕНИНА. ШСШУТ БИОХИМИИ мм.А.Н.ЫХ!

2633Ч

На правах рукописи ШЩЗЕ Твнгиэ Георгиевич

САТЕДЖПШЕ ДНК ШС1ШХ РАСТЕНИЙ (Биохимия - 03.00.04)

Автореферат диссертации на оояскание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 1980

Работа выполнена в Институте Сдохимия растений Академии Наук Грузинской ССР,

Официальные оппонента:

доктор биологических наук, профессор ЮЛ.'ШЛШПОЕЙЧ доктор биологических наук А.С.АНТОНОВ доктор биологичеокйх наук К.А.КАФИАШ

Ведушее учреждение - Кафедра Молекулярной биологии Московского Государственного Университета км.М.В.Ломоносова

Автореферат разослан , 1980 г.

на заседании спецлалкэированного Ученого Совета (Л 0Ш.06.0І) по зашите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при ордена Ленина Институте биохимии . им.А.Н.Баха АН СССР (И707І, Москва, Ленинский пр.,33, коря.2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотека бяолоппескоЯ литературы АН СССР (Ленинский проспект 33, кори Л)

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических паук

(К.Л. Гладилии)

- З -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследование структурной организации генома эухариотов является одной кз центральных проблем совреыев-ной биохимии я молекулярной йиологий. Геном эукариотов содержит фракцию стДКК, которую удается отделить от остальной части ДНК при помощи разных способов градиентного ультрацентрифугирования. СтДНК состоят яэ многократно повторяющихся последовательностей, бо многих организмах их количество довольно значительно и может достигать более половины генома; ддя ряда стДЇХ установлена последовательность основанаа в повторяющейся элементе. Однако экспериментальные данные, касающиеся природы возникновения и функций от ДНК, отсутствует. Определение структурных особенностей и функций стДНК имеет большое значение как ддя установления организации генома эукариотов, так и ддя углубления наших знания относительно зволщин эукариотических организмов в целом.

Цель ц далачи ксс^едова^ид. Целью настоящей работы являлось исследование стЯНК высша растений. В экспериментальную задачу работы входило:

- установление степени распространения стДКК у растений;

- выяснение причин различия Слизких водов вксдях растение во содержание стДНХ;

- вцделение стДШС рада видов высших растений в «потом виде;

- изучение физико-химических свойств стДШС; ;

- проведение анализа стДИК растений с помощь» ввдонуклеаэ рестрикции;,

- установление свойотв хцЩШ сателлитовосных растений.

Со крашеная; стДНХ - сатедлитная ДНК; дДШС - ядерная ДЙК;

мтДіІК - митоховдриальная ДОС; хпДЩС - хдоропласг-ная ДКК; мпДКК - ДНК с многократно повторяти нядя последоват ельдостяш;. и?С - 5-метжлцитоаия; Соч - произведение Временя реасооциация {в сеиун-дах) я концентрации ДНК (моль нуклеотддов*ва литр); г^ - молярное соотношение Н&++ к фосфату ДКК; 1 X ЗЗС "-0.15 Ц К»С1, 0,0І5И цитрат К* , рН 7,0,

аат?. гуси

8ч; » ^ І ■ —' ..

„,л и. П. (,.,-1.-.

Научная новизна^ практическая ценность, .работы. полученные в настоящей работе результаты расширяют представления об организация генома высших растений. Ваервые в растениях была обнаружена стДНК. Получены первые данные о различиях йлизклх видов высших растений по содержанию стДНК. Вияздекы структурные особенности геномов растений, резко раалйчаицихся до содержанию стДНК. Выделены б чистом гиде стДШ четырех видов высших растений, Изучена кинетика реассоциации стДНК. Исследован процесс плавленая стДНК методом высокораэрешамдей термической денатурации. Методами градиентного ультрацентридЕугяровакия доказано наличие методе пуляркой гетерогенности в стДСС. Впервые проведен анализ стДКК растений с помощью экдонуклеаз рестрикции. Показано существование разпостепенной периодичности в стДШ растений. Изучены свойства хцВДК сателлатоно с них растений.

Полученные в работе данные могут быть использованы для выработки молекулярно-гекетических основ селекции растений, а таксе ори создании растений с ценными хозяйственными свойствами методами генной инженерии.

Апробация работы, результаты исследований были доложены на Всесоюзном симпозиуме "Генетические функции органоидов цитоплазмы* (Ленинград, 1971), на конференциях Федерации Европейских Биохимических Обществ(Амстердам,1972; Будапешт,1974; Пардзс,1975), Всесоюзном симпозиуме "Генетические аспекты фотосинтеза" (Душанбе, 1972), на ааседанаи Московского отделения Всесоюзного биохимического общества (1972), Международном симпозиуме "Структура и функции ДНК" (Якблице, ЧССР, 1973), III Всесоюзном биохимическом съезде (Рига,1974), XII Ы езду народном 'ботаническом конгрессе (Ленинград, 1975), на Конференции по экспериментальной и теоретической биологии и ыедоцша (Тбилиси,1975), Всесоюзном симпозиуме "Нуклеиновые кксдогы и синтез белка в растениях" (Ташкент,1977), на I Грузине шй республиканской конференции по молекулярной биологии и молекулярной генетике- (Тбилиси,1977), Международной конференция "Регуляция процессов развития у растений" (Халлв, ГДР, 1977), Всесоюзной конференций "Современное состояние исследований биохимии субклеточных структур" (Москва,1ЭТ7), а также.на ежегодных научных конференциях Института биохимии растений ЛЯ Грузинской ССР (I969-197S гг.).

jTyrtflaiwujHtt. Qo материалам дассергадал опубликовано 29 работ, среди них 2 обзорные статьи.

ртруктура и объем паботы.Диссертация состоит из введения, обзора литература, экспериментальной частя, включающей описание методов исследования, результата и их обсуждение, выводов и опаска цитированной литература (231 наименование). Работа изложена на 288 страницах машинописного текста, иллюстрирована 83 риоун-хш и 18 таблицами.

эюлвция тшша -сатышткая дшг

Термин "сателдитная ДНК" впервые использовал Кит для обозначения минорных фракций ДНК эукариотоз, обнаруживаемых в виде отдельной полосы при равновесном ультрацентрифутвровакии в градиенте плотности СзСХ (Kit, 1961). 3 1963 году- Чан и соавт. показали, что доля шторных Фракций ДОК растительных клеток значительно увеличивается в препаратах ДНК, выделяемых из хлоропласте в i Ошп <>t ai., 1963). £ дальнейшем сателлитные компоненты ДНК Сняп обнаружены в клетках ряда других организмов и была доказана их локализация в митохондриях и пластидах (Luck «..Reich, 1964; Hablnowlt* «t al., 1965; Edelmea et el.(* 1965). На основе работ, проведенных в 1963-1966 гг., можно было сделать вывод о тон, что «опорные Фракции, обнаруживаемые в тотальных препаратах ДНК, локализованы исключительно в цятоплазматических органелл ах.

В 1966-1Э67 гг. появились работы, которые заставали кардинально пересмотреть существующие в литературе положения, касающееся распределения сателлятвнх ДНК во фракциях клеточных орга-надл. Было показано, что в случае ряда животных и растительных организмов сама ядак является гетерогенной и содержит сателлат-нур ДНК, вследствие чего она в градиенте Oed характеризуется бимодальным распределением ( Borat a.Rutteotjerg. 1066; Comeo et «а., 1966; Бервдэе в др;, 1967; Uatauda е. Siegel, 1967). На основе этих работ сателлигными ДНК впоследствии стали обозначать исключительно фракции ДНК ядерного происхождения.

Совершенно новый смысл в термин "саталлитная ДНК" был вложен Уорингоы и Бриттеном, показавшими, что стДКК ыыши состоят . из коротких многократно повторяющихся последоватедьноотей < w»-

rlBJJ e» Britt*n, 1366). в течение последующих дет было обнаружено, что н другие стДНК характеризуются олигомерной структурой. В настоящее Брега к классу сателдитных ДНК относят также фракции. Отделяемые от основной массы ДНК в присутствия Ag+ пли Hg++ в градиенте Ca^so^, а также некоторых антибиотиков в градиенте Се01. Эти фракции обозначается как "скрытие сателлиты", так как в градиенте Се01 они совпадают по плотности с основным компонентом.

ОБИАРУЖШИЕ И РАСПРОСТРАНЕНИЕ САТЕЛШ1ТШХ ДНК 7 РАСТШИЙ

СтДКК у высшего растения ( Pbaseúlue vulgarte ) была обнаружена вами в 1967 году при исследовании распределения компонентов ДОС во фракциях клеточных органелл (Берядзе я др., 1967). На рис.1 приводится щишая распределения в градиенте плотности С»С1 препарата яДНК листьев фасоли. Бак следует из криво Б микроденся-тометрированкя, ДНК клеток фасоли содержат два компонента (соотношение компонентов 7;3). Пладучая плотность основного компонента составляет 1,694 г*с«"3, минорного - 1,703 г.см"3. В препарате ДНК, вццаленной из ядерной фракции, также обнаруживались два компонента ДИК в том se соотношении. При обработке ДШСазой оба компонента исчезали; следовательно, наблвдаеьше в УФ-свете полосы образованы молекулами ДНК.

Для понимания биологического значения обнаруженного факта в последуидие годи нами были проввдеш исследования о целью выяснения степени распространения стАНК у высших растений. Исследования велись двумя путями. Во-первых, мы проанализировали большое количество видов внутри тех родов, у которых были обнаружены стДНК (Берядзе, 1972; Веридзе, 1976). Второе наше направление би-

ло_ связано с оценкой высказанного нами предположения о том, что._

высшие растения с асимлетркчнт« характером распределения яДНК в градиенте мохут являться древними аллопо липлоп.гими. воэникиими на основе гибридизации растений с разним составом оснований яДВК, (Беридэе.Горгидзе,1973), С этой целью анализировался целый ряд высших растений,в эволюции которых адлопожплощвя сыграла зах-иую роль.

Poif Phaaefiitia . ha примере рода pbaeeolue впервые нами было показано, что близкие воды высших растений в пределах рода

Рис.1» Кривая распределения суммарной ДНК листьев фасоли в градиенте плотности СвСх (Беридзе и др. ,1967).

могут различаться да количественному содержали» дискретных по плотности стдда (Беридзе,1972), Было исследовано распределение В градиенте плотности С«С1 яДНК семя видов рода PUaeeolua, принадлежащих К двум различным зонам первичного возделывания культурных видов фаоодя. Обыкновенная ( P.vuiesxia ь. ), лнмокая (r.lunatue L. ) и многоцветковая'( p.eoeelneus Wllld. ) фасоли происходят из Центральной Америки. к американским видам фасоли откосится тахжэ новый дикий вид P.abortgtaeue Bur kart , который дает гайриды о P.vulgaris и считавгея прародителем обыкновенной фасоли. Вторая группа' культурных видов фа селя происходит из Юго-Восточной Азии. Это золотистая ( F.aureu« Roacb. ). угловатая ( angular! в а. ) и рисовая'фасоль { P. eel сага tue ЙОхЪ. ). Диплоидное ЧИСЛО всех ВИДОВ фасоли £¿»22 (ïyKOBOK»a, 1971).

На рис.2 приводятся кривые распределения яДНК семи видев рода Pha9«olu* а градиенте плотности СаС1 . Кривые расдределе-

wtA в болыишстве случаев косят четко выраженный двухкомпонентшй характер. Содержание сателлитного компонента ДОС во всех американских видах составляет приблизительно 30? от суммарного юличеотва

яднк.

Распределение яДНК азиатских видов фасоли в градиенте плотности Cod показывает, что по содержанию стДИК эти виды отличаются как между собой, так и от американских видов (рис.2)• Так, ЯДИК F.eureue характеризуется одкокомдоиентным распределением в градиенте плотности CeCi (шш^учая плотность ДНК равна 1,694 г*сы~^), сателлитшгй компонент у данного вида не обнаруживается. Дцерные ДНК Р. en guiarle и F.ealceratue характеризуются наличием тяжелого сатыиштвого компонента в количестве прийяиэитель-ао 10-15?. '

Близкое родство американских видов доказывается их взаимной скрещшаеыость», в то время как гибрида между американскими и азиатскими видами фасоли неизвестны (Klo» «t al. , 1966)»

Г°Д.Втая'и'* Существование ядерного сателлита у Eraasioa rapa впервые показали Су яма и Боннер (Suyema а. Вояпег, 1966). Из рода Braaalea были исследованы тают1) B.chlneasie я lUpeki-neneie, незначительно отличающиеся по содержанки стДЦК от В.rape (Inel* at al., 1973; liat^uda a. s le gel ^ ' 1967). Анализ геномио- . го состава разнохроносомных видов Breasica показывает, что указанные виды относятся лишь к группе I с гаплоидным числом хромосом - 10 (таОл.1). Нами было изучено распределение в градиенте плотности С'«С1 всех основных разно хромосомных культурных видов Braaaioft.

На рис.З приведены кривые распределения яДКХ девяти видов рода Bxaasica. Для рода Braeaiea характерна стДНК с плавучей шют.гастью 1,704 г*см~\ Количество стДНЙ варьирует вшироких пределах (табл.1). У В.о1«Гасеа она отсутствует, ау В.nigra ее количество достигает 77%, Остальные виды этого рода по содержанию сателлита занимают промежуточное положение. Следует отметить, что все четыре вида группы I характеризуются сходным распределением в градиенте плотности' CeCl. Значение плавучей плотности основного компонента - 1,696 г.см"3 такие идентично у всех исследованных ВИДОВ рода Brasaiоа.

Эволюция рода Braeelea' весьма сложна. В данном роде щро-

2. Распределение д£ШС разных видов фасал* a rpa-даеягв гиогносгя Cad. a - P.vu!garі* ; ö-p.ooo-«iootta ; В - FvXunatue t Г - ?.â.borlglneua î д — P.iiireuj»; a - p.&neularia ; Ж - P.oalOAratua, ■ ДИК tUorococoue lyeodelktieue (yO-X,73I r*cw~

ко представлены аллополишюиды. "Треугольником Вгвло1са " называют три генома: горчица черная {В.п1вга,2п- 16 ), кацуота огородная ( В.о1егас«в»г»« 18 ) к сурепица ( В.сышрваЪгХе, гп-20). Эта группа развивалась на диплоидном уровне. Абиссинийская капуста (В,оаг1па1® ) возникла от естественного скрещивания В.а1$г* и Й.о1вгпс«а с доследующим естественным удвоением числа хромосом; рало ( В. парив ) возник от В.о1«гпово в В.свшрев*г1» ; сарепто-кая горчица (В.^иасва) — от В.п1вгв и В.свшревЦ^в. в»3ипс*ав в.парив бшш искусственно синтезированы я этим было подтверждено ИХ происхождение. Следует отмвтать, что естественные и сивтетичео-кие вида легко скрещиваются между собой.

Таблица I

Содержание стДНК у разных вщов рода Вгавв1«а

й Группы Виды Базовое {гаплоидное) число xDowpcoM Геномный состав Содержание сателлитно-го компонента. i

I B.ownpestrie L. 10 ОС 24

В.гара L. 10 сс £0

В»chl»eneie L. 10 сс 19

B.pekineaele Rupf. 10 сс 20

II В.nigra Kooti 8 ДА 37

III B.olerecea Ь* • 9 ВВ 0

rr В* Juncea'Сова. 18 ААОС 28

У B.napua £« 19 ЕВСС 7

71 B.caariüaata Braun 17 ААВВ 25

Данные по обнаружению отДОС у ряда представителей рода Brassica свидетельствуют о том, что содержание стДНК-у трех видов "треугольника Brassica*' неравномерно: уB.oleraeea она отсутствует, у в.campestri» ее содержание составляет 24л, У B.nig-га - 37Jf. Ocoöo следует отметить, что по количеству единичного сателвитного компонента в.nigra превосходит вое изученные до сих пор эукариотяческие оргшшзш. Факт, искусственного получения алло-даляодовдов говорит о том, что отдельные виды с разным содержанием стДНК, включая беосателлитнне, могут давать аллополшиовды с количественно промежуточным содердшшем стДНК.

Рлс.3. Распределение ЯДОІ развис ВИДОВ рода Braaalea в градиенте плотности ceci : а - в.aigras Ö — В.]mo«» г В -В.оагіпоЛа ; V — B»o«mp«etria t Д - B.rep« ; в -В.рвкілссвіаг ; * —B»ohl_n»nele і Э — B.ncpua ¡ I " В.оібгаем.

Для Характеристики дДНК рода Brassica нами было проведено сравнительное исследование распределения в градиенте плотности С*гзо4 в присутствия подав ртутя дДНК трех видов: B.oi»reo«& , В.гора л В.nigra . Были подовраны такие значения rf , ера которые стДНХ - тяжелая в градиенте плотности СвС1 по сравнению с основным компонентой, становится легкой в градиенте плотности с»2зсЧ * Иа рас,4 приводятся щшвие распределения яДШС трех видов рода Br&oeica в градиенте плотности Hg+*-ce2S0í • Дцерная ДОС б.rapa в градиенте дает два основных оика; легкий» соответствующий сателлитному компоненту с плавучей плотностью 1,449 у.сы-Э, в тяжелая, более широкий, соответствуикий ССИОЙЮЩГ компоненту (плавучая плотность - 1,517 Г.см"3). Следует отметить также наличие колой Фракция ДНК о промежуточной плотность». В аналогичных: условиях в препаратах яДКК B.oleracae наблюдается лишь основной компонент с плотностью 1,520 г- см" 3. следовательно, эти эксперименты указывают ка отсутствие у в.oleracee скрытого еателлвхного компонента. Ядерная ДНК B.mgm дает три пика: два легких muta о плотностью Г»СМ~3 и 1,489 Г*СМ~3, по-вцдем0ч7, образует

стДНК {гетерогенность стДЦК в.nigra cu.далее), а пик о плотностью 1,545 р*см-3 соответствует основной JÜ1K.

Наш был проанализирован также мнлфодовой гябрлд НврЬапо-braeelca (ftaphonue aatlw>s X Brassica olerácea ). ДанкнЯ гидрид в градиенте плотности CeCi дает унимодальное распределение, ' -отсутствует какая-либо асимметрия 'вследствие йлиэоств распределения яДНК родительских видов.

Субтриба citrlnye , СтДЦК у цитрусовых растений обнаружили Ингл и ооавт. {Ingle et al., 1973). СтДЕПС цитрусовых интересны пак высоким лрбдантным содержанием, так и наибольшей среди проанализированных раотенлй плавучей плотностью (1,711-1,713 г.см-3).

Сувтряба Ci trina в включает 6 родов, изученные нами цитрусовые растения охватьтаят 4 рода (14 видов), Содержание стДНК варьирует в пределах 10-30? {Брагвадэе, Беридзе, 1379). Наивысшее содержание стДЛК наблюдается у дшюго вида подрода papeda - Citrus icheagoiisie (30%) •

Наиболее интерес¡uj результаты, связанные о исследованием яДНХ Poncirua -trlfoliata. P.trlfoliata используется как подвой в цитрусоводстве. Этот вед скрещивается с другими цитрусовыми pao-

РЯС.4. Распределение ДШК B.elermcea/а/, Г.гвра /б/

я b.nlgra/в/ в градиенте плотности Hg++-0e2304 trf - 0.7Й).

тениями, однако образуемые гибриды стерилыш. У Г. t г tí olla ta вами были обнаружены две стДНК о плотностью 1,712 ж 1,715 Гкбридине раотвиая Citiua ж Ponol-u» также характеризуется наличием двух стДНК (рис.б).

TrtticittM . Техника градиентного уаьтрацентрафута-рованшх была использована нами для определения характера распределения яДНК отдельных видов и межродовых гибридов суОтрибы Tritl-oiaae (Беридзе, Горгвдзе, 1973). В оубтрибе Tritiotnae широко представлен» аллодолядлоиднае виды. Так, мягкая пшеница ( T.aeeti-тип) считается двойным аллопсшшлоидом с формулой renouiá aaebod.

1a119

Рве .5. Распределение «яДНК разных видов сусИгрийы Citrine« в градиенте плотности c«cit а - С. limo и ; б - P. tr if olla ta ; В - гибрвд Fbnclrua X Cltrua.

По казане, что в образовании гексашювдноА пшеницы црнниыаяи участие даплоидная пшеница (геном А), а также некоторые виды рода Aegilopa (генома в в в). Хорош известны и мокусстьеннне межродовые скрещивания в пределах субтрибы Triticinae с образованием адлополипяоядов trltlcum X Aegllops, Erltioua х Sécela И др. (Чуковский, 1961). В качестве объекта исследования нами Own выбраны; Т.волососоЧиа L. (2п-1Оj Т.pala»o-oolch 1 с um £в)| í.aeotivum L. (fti«42)¡ A.equairoea L.(2n-14)j S.o<»r«ale I..(£n>14}t аллополлплояды: T.palaeo-oolchleura x A.aquarroe« {2n-42) И T.palae o-colchloum x Secóle многолетняя (2n«42).

На рис, 6 приведены кривые распределения дЩК разных видов и

мехродовых гибридов субтрибы Trttiotna« в градиенте вдотности СвСЩлавучаД плотпость. иолвкуя ДНК всех изученных растений составляет 1,701 г«сы~э. Симметричность пика «ДОС исследованных видов субтрибы TritioLna» указывает на эначительну» близость соо-тава оснований геноыэв ktВ ко. Шлучеюше данные свидетельствуют об отсутствии различий между яДВК отдельных видов и межродовых гибридов субтрдба Tritioinea в прадедах чувствительности используемого метода. Ца основе втих.исследований можно заключить, что со времени возникновениях,«ееtivuaсуммарный состав оснований дДНК родительских видов не дретеродл значительных изменение нли изменения их геномов как в свободном виде, так в в состав« Т.в«а»1тит носили одинаковые характер.

В ходе выполнения настоящей работы бшш проанализированы также яДЩС других представителей высших растений - более 20 видав. Их дальнейшее исследование не проводилось в связи о отсутствием у них дискретных по плотности стднк.

Таким образом, на основе исследований вопроса о молекулярной гетерогенности яДНК более SO видов высших растений, принадлежащих разным систематическим группам, показано, что близкие виды в пределах рода могут значительно отличаться по содержанки дно-іфвкшх «о плотности стДЯК - от О до 30-4CS сумАарпого количества ядак.

Как отмечалось выше, нами была высказана гипотеза, согласно которой определенная часть высших растений с аеишетричным характером распределения яДНК могли являться древними аадоволидяоидами, возникшими на основе гибридизации растений с разным составом оснований ДНК. (Берадзе, Горгидзе, 1973). Гипотеза била основана на установленных нам» фактах, согласно которым растения с разным количественным и качественным содержанием стДКК (рея Вгдеаіе*, субтриба citrine«) могу* давать гибриды о количественно проыехуточным содержанием стДНК. Дія подтверждения »той гипотезы было необходимо обнаружить асимметричный характер распределения яДЗХ у ка-кого-лкіо естественного кии искусственного аллошшшаонда при симметричном распределении яДКК родительских видов. С »той целью были проанализированы межродовые гибриды субтрибы Tri.tieloae, а также &в-рЬаюЪгм»1е». Во всех случаях яДЩС иэ-sa идентичности

- IG -

1,701 »

Рис. 6, Распределение дДНК разных представителей субтрибы Tritiolaae В градиенте ПЛОТНОСТЕ С«С1. а - r.aestivujn ¡ Í - X,nenooo?cum ; В - t. palaoo-aol вЫошв ; г - À.equarroaaj д - S.««real« ; е - Trlticum х Aegilops I Я — Irltloo» X 3*0»!в.

плавучей плотности ДКК родительских видов характеризовалась симметричный распределением в градиенте плотности CsCi. Дм обнаружения взаимосвязи между аллоподиллоидаей к асимметричность» распределения яДНК в градиенте плотности с«ci необходимы дальнейаяе но-сяедования большого количества искусственных и естественных аяло-шишллоидов.

СРАВНИТЕЛЬНОЕ • ИССЛЕДОВШКЕ ГОШОВ САТШШШОСШХ И ЕБССАТЕЛЖЕНШС РАСТЕНИЙ

Существу!» ли какие-либо закономерности содержания стДНК у растений? Чем обусловлены различия близких видов высших растений по содержанию стДЩСГ Вияснению этих вопросов были посвящены ваш исследования по сравнительному анализу геномов сателлитоносных и Йессателлитшсс видов — Р. лигвив — P.rulgexle H B,ol«rac«ù - B.nig-гв (Барвдза, 1Э7Э).

Унимодальный характер распределения яШК P.aureue a B.ole-гаов» в градиенте плотности Cad можно объяснить как отсутствием куклеогндиых последовательностей, характерных лм стДНК родственных им видов, так и трансяокацнонным перераспределением фрагментов стДНК по всему геному в процессе эволюции.

Важную информацию о структурной организации геномов растений удается подучить с помощь» метода термической денатурации. В настоящей работе результаты термичеокой денатурации ДНК растений представлены в виде дифференциальных кривьцс плавления. Получение тонкой структуры кривых плавления ДОС в наших' исследованиях было обусловлено двумя факторами; во-первых, использовался динамический метод термической денатурации, во время которого сложные проблемы» вызываемые необходимостью достижения оптического и термичео-кого равновесия при ступенчатом методе прогрева исключаются непрерывным повышением температуры. Во-вторых, данные оптической плотности сглаживались при расчете первого производного ( Aneerla et al.,1976), Изображение процесса плавления ДНК в результате этих операций в виде дифференциальной кривой позволяет четко выявлять отдельные субкомпоненты.

Детальное рассмотрение кривых плавления яДЛС P.aureue к y.vulgario указывает на то, что различия иехду ними обусловлены наличием в препаратах яДШС ï.vuigarle сателлитного компонента

- rs -

(рис.7). В леэой часто кривых плавления у обоих видов набяпдается четко выраженное плечо при тетературе 64°. Расхождение отмечается в правой части кривых длавлегаш. У Р.-ru 1 gario в области высокой температура наблюдается пик о максимумом при 78°. В целом фракция, плавящаяся в интервале 75-82°, уP.vulgarle составляет довольно значительную часть генома. У Р.амгеие наЛпдается та же Фракция, однако в значительно меньшем количестве. Сравнение кривых плавления суммарной яДНК и стДНК P.vulgarie. дозволяет заключить, что наличие пика на кривой плавления сумларпой ДНК с максимумом при 78° обусловлено сатедлитным компонентом.

Дифференциальная кривая плавления основного компонента ДЕК p.wiçaris почти повторяет ход плавления яДНКР.васеиа (рис.7 к П). В обоих препаратах наблюдается фракция, плавящаяся при 7S-820, однако доля этой фракции меньше, чем в суммарной яДНК P.vulgarie.

Кривые плавления яДНК B.oleraoe» н в.nigra носят в значительной степени сходный характер (рис.7). У В.nigra более четко выражено плечо при 66°, наблюдается также трехвершинный пик плавления ; у B.oieraoea вероину дика плавления составляв! лишь два компонента. Анализ кривой плавления суммарной ДНК В.пigra и отдельных его компонентов позволяет заключить, что пик о максимумом при 71,0° на кривой плавления суммарной ДШС обусловлен третьим компонентом стДНК S.nigra' (рис,7 И II).

При ренатурацви ядкк Rraesioa s Phaseolua в градиенте платности CeCl найтопдется один гомогенный пик. Это может указывать на то, что основной кодаонент ссдеркит псследовательности, характерные для стДНК и образуемая при ренатурашш паутина молекул содержит скрепленные двуспиралышми участками одданитевые цепи основного и сателлитного компонентов. Тот факт, что основной компонент ДИК P.vulgarie содержит фракции, которая плавится в том же температурном интервале, что и стДК, подтверждает это предположение. Для получения фракции стДНК в дискретном вида необходимо, чтобы длина сателлитного региона в нити хромосомной ДНК превосходила длину препаративно выделяемой ДНК. По-видимому,, при транслокацяд участков «ДИК в процессе эволюции произошло такое перераспределение, вследствие которого их длина в основном компоненте оказалась недостаточной для образования дискретного по

Рнс.7. Дифференциальные кривие плавлення яДНК расгеядй:

а — Р.aar«us ; б — í.rule&rls ; в - B.olereo»» ; Г - В.uteri ; Д - г.юау« ; « - T.üeetirum '( 0,1 X S30 ).

плотности компонента ДНК, В то же вреда эти участки при плавления выделяются в виде отдельного термического компонента. Это рассуждение правомерно я дня Р. aureus о той лишь разницей, что в данном случае наряду о транслокацией части стДКК должна была произойти элиминация основной ее массы.

На рис.в схематически изображен возможный процесс эволюция генома Rieseoiue, На первой стадия эволюции произошла амплификация сателлитной последовательности« далее посредством трансдокаций образовался вид P.rulgarle. На основе элиминации основной массы сатеялитмой последовательности мог образоваться бессателлиткый вид Р.aureus.

Второй интересуиций нас вопрос заключался в следуияем: разлж-чаются ли сравниваемые дары растений но содержанию повторяющихся последовательностей? Не означает ли отсутствие у Р.лиге ив в B.oleraoea стДНК, характерных для родственных им видов P.rulga- . rie и Б.nigra то, что их геномы содержат меньшее количество повторов?

Дня ответа на эти вопросы изучалась кинетика реассоциации яДОС растений в интервале « 0,01-10, ори котором реассоцаи-руется значительная часть повторяющихся последовательностей ДНК. Подученные результаты свидетельствуют, что разница по содержанию повторов между яШК сравниваемых растений незначительна. Так,при C^t •• 10 ДНК Р.vulgaris реассодашрована на 25%, ДНК р.cur«ив на Зб£. У другой сравниваемой пары результаты реасооциащш носят сходный характер. ДКК B.oleraoea лишенная стДШ, при C^t - Ю реаосовдшрована на ЗЭ%, ДНК в.nigra- на 43& '

исследование кинетики реассоциации яЭДК этих видов показывает, что наличие стДНК не обязательно коррелирует с болыжы содержанием повторяющихся последовательностей в ДНК. Это обстоятельство может свидетельствовать о том, что отсутствие СТДНК У Р.aureus в E.oiereoea компенсируется повторяющимися последовательностями ДНК, совпадавшими по длотпости о основным компонентом.

Исследования Ингло и соавт., изучивших распределение в градиенте плотности СаСХ суммарных ДНК около 70 видов высших растений показали, что плавучая длоткосгь подавлявшего большинства стДКК вше шготности основных компонентов { Iügle et al., 1ЭТЗ). IIa этого следует, что стДНК следует искать'у видов, яДНК которых.

WO«I «tikhA

и-О

t otmn-

^«iilliru

Рис,8. Схематичное изображение »водщии рола Xbaeaolu*.

характеризуются высоким содержанием ас-пар. Такими видами являюся злаковые растения, в частности т.мяМт™ ( ас » 46,2^) н 2*яау>( сс - 47,5$). Ядерная ДНК етях растений характеризуется симметричным распределением в градиенте плотное та CeCl, Однако кривые плавления этих ДЩ носят асилметрачный характер (рис.7). Особенно четко эта асимметричность выражена у дДНК z.mèy», Максимум пика плавления основной фракции яДЯК г.ллув соответствует 72°. По аналогии с яДЦК Р.тиісагів наблюдается минорная секция, плавящаяся в жнтерьаде температур 73-87°. Получэтше данные свидетельствуют о том, что последовательности оснований ДНК, ответственные sa плавящиеся при высокой температуре фра кош ДНЕС не сгруппированы, а распределены ш геноку, вследствие чего они не детектируются в градиенте плотности СаСі, Таким образом, наличие в ДИК высших растений участков, богатых ос-парами я плавящихсл при более высокой температуре по сравнению с основной массой ДНК, часто» явление. Ваесте с тем эти фракции в ряде случаев не детектируются в виде дискретной до плотности стДОС по той причине, что

длина блоков, содержащих era последоьательвостж, недостаточно велика!.

СВОЙСТВА САТЕШТШХ ДНК ЕЫСШХ РАСТЕНИЙ

Нами Оцли подробно изучены свойства отДНК ряда представителей высших растений. Для исследования были отобраны: стДНК в.nigra , соотавляшая значительную часть геиома; стДПК с.іішоп, ха-рактериэуюцаяся высоким ос -содерхшшем; стДНК двух видов рода PhMeolua (P. vulgar le и P.ooooineoe) {Беридзе.Брагвадзе, 1976; Беридзе, 1979а; Беридзе, 19796).

Для выделения сателлатвых компонентов ДНК расхеда! использовалось препаративное равновесное ужьтрецентрафугировшше в градиенте плотности СаСі. На рис.9 приводятся результаты сашта no распределению тотальной ДНК лимона в препаративном градиенте плотности CaCl. Заштрихованные фракции, соответствующие основному н оа-теллитному компонентам, были проанализированы в аналитическом Градиенте ПЛОТНОСТИ CaCl. Основной компонент ДНК не содержит примесей. Во фракции стДНК обнаруживаются иалые промеси основного компонента. СтДКК удается полнеет») очистить по вторным' ультрацентрифуги рованием в препаративном градиенте (рис.9).

Теы.тческад денитрация. Изображение термической денатура-ІВШ СТДНК P.vulgaris в виде дифференциальной кривой позволяет различить три пика, макелмуьи которых соответствуют 68,5°, 71,5° и 78,5° (рас.Ю). Кроме трех четко внражекных кошонентов ва кривой можно обнаружить наличие гетерогенности пра 68,0° и 76,5°. При плавления основного когаонента яДНК Р.migarle васілгщаетоя един основной пак, максимум которого соответствует 66,5° (рис.11). На левом плече пика наблюдается значительная гетерогенность. Следует также отметать, что определенная часть основного компонента плавится в интервале температур 75-82°.

Дифференциальные криша плавления кошонентов ДНК Р.ооооі-ueua в значительной степени сходны С P.Tulgaria. Доля трех первых кошонентов (о максимумами пра.68,0°, 69,0° и '71,5^) относительно ко всей стДНК у f.ooeelneue выше, чем у Р.«ligarle (рис.10).

ft) w

Pec,9, Распределение ДНК C.¿laon і дреларатгваом градиенте длотностм С* Cl, Заятрихованнне області - фраляди, собранные х ороавалвз*-роьашше в аяамтгчесгом градиенте uofsocri Caül. А - первое уяьтрадентрвфугярование; Б - рецеатрибутирование сагеллитвой фракция*

Рассмотрение дифференциальной кривой плавления стДНК B.nig-г& (рис.10) позволяет Обнаружить 4 компонента, максимумы пиков которых соответствуют следующим температурам: 65,(Я, 68,5°, 71,5 л 75, СР. На дифференциальной кривой плавления основного «оппонента ДНК s.nigr* отдельные компоненты выражены гораздо 'менее четко (рис,II). Температура перехода компонента с вал большим содержанием составляет 70,(Я. Следует отметить, что кривые плавления основного л сателлитного компонентов ДНК B.nigra значительно перекрывают друг Друга. Y стДНК В.niera отсутствуют фракции, плавящиеся при высокой температуре, характерные для стДНК других представителей высших растений - фасоли, лниояа и др.

На дифференциальной гривой плавления яДНК лимона четко просматриваются два пика. Второй пик с максимумом при 81, СР соответствует, по-видимому. сателлнтноку компоненту. Однакй рассмотрение кривой плавления индивидуальной стДЙК. лимона (рис.II) показывает, что данная фракция наряду с узким двукомаонентяым пиком, соответствующим малому компоненту на дифференциальной кривой плавления дЦШС, содержит зону, плавящуюся в широком температурном интервале 65-77°. Узкий пик, наблюдаемый на кривой плавления стДЙК,соо-тоат из двух компонентов. Ширина перехода* всего пика - 3°, а каждого составного компонента, по-видимому, составляет 1,5°. Основной компонент ДШК лимона Дает один широкий пик без видимого проявления тонкой структуры (рис.11).

При исследовании свойств стДЙК растений отмечается несоответствие ОС-содержанир, рассчитанного по Тш л плавучей плотности в Cad. Так, например, вс-содержашм стДНК лшона, рассчитанное по плотности я Тдо, составляет 53,1 и 65,4£, соответственно (табл.2), Это расхождение может указывать на■ высокое содержание в сателлитном компоненте минорного основания - 5-метилцитозина, Кекп и Саттон предложила формулу, которая на основании Тдд а алавучей плотности в CaCl позволяет рассчитать содержание этого минорного основания ( Кешр a.Sutton,1976). Допускается, что в'с снижает плотность, но не изменяет Тщ. Расчеты показывают, что содержание ш**с в стД>СС лимона составляет 24,1^ от общего количества оснований, т.е. на каждый остаток цитозина приходится 0,74 остатка а^с. Болыиач разница в плавучей плотности, наблюдаемая в эксперименте (1,712 г•ом-3) и рассчитанная по Г-. (1,724 г.см"3).

Рис, 10, Дифференциальные кривые плавление otJftK раотешЯ; а - Р.vulgaris ; 6 — Tioocelneua і і - В.nigras Г - С.limon (0,1 х 3SC).

Рис ЛІ, Дифференциальные кривив плавления основных компонентов ДНК растений: а - р.пЦдаПв ; б - F.ooocineu» і в - ».відати ї Г - с.ііш» t Д - ДИК фага T4(0,I X ЭЯС).

Шли» 2

фиэдо-хпопескве ларашгрк всипонеятов ¡ЩК, растение

Плавучая плотность Т'СяГ3 (0,11 330) ' % ОС НО плот. % сс <в5С

сателлятяыб компонент 1,704 71,3 44,9 42,5 1,5

основной компонент 1,696 69,7 36,7 38,6 8,0

Ишаео1гм Ти1ваг1и

еателлятиый кошояент 1,703 73,9 43,9 48,8 12,8

фракц, I стДКК 1,703 71,0 43,9 41,7 1.9

фравд. II стДШ 1,703 78,0 43,9 56,8 28,0

основной компонент 1,694 66,5 34,7 30,7 0,8

С1*тие Нжяа

сатедллтшШ компонент 1,712 80,7 53,1 65,4 24,1

■ основное иощоненг 1,693 67,8 33,7 33,9 5,6

- га -

может быть обусловлена высоким содержанием и5с в стДНК. В отличив от стДКК основной компонент дает хорошие совпадения при таких расчетах.

В табл.2 приводятся также значения »5e , рассчитанные для гателлитного и основного компонентов В.nigra, а также для стДНК фасоли, В последнем случае рассматриваются два варианта; а)термические компоненты представляют собой отдельные ыэлеяулы с идентичной плавучей плотность» (стДНК условно разделена на две <фак-цаи - низко- и высоко плавящиеся компоненты), б) стДКК фасоли -одна интегрированная ыодмфла. ' -

Приведенные в таблице данные указывает на то, что стДНК в.nigra должна содержать меньше vPo so сравнению с основным компонентом. Совершенно иная картина наблюдается для СтДККфасола, соотношение содержания в5с в которой во фракциях сателлит/основной компонент составляет более 15. Это значение доотвгает 35, воли допустить, что фракция IX стДКК фасоли представляет отдельную шлекулу. Заниженное количество *5С В СТДНК В.nigra дает возможность косвенно предположить, что компоненты, обнаруживаемые при плавлений, интегрированы, иначе они разделились бы в нейтральна« градиенте плотности CoCi (плотность »тих комоэцентов раашиаоь бы соответственно - 1,687, 1,£Э5. 1,703 и 1,710 г.см"3).

СтДНК fhas eolue и citru« ,а также все "тяхалые" сателлиты изученных растений, ад нокшотением стДНК В.nigra, содержат высоко-длавящийся компонент ( B«ndlcb ».Anderson, 1974; Chilton, 1975; Tímale л. Ingle, 1977). Ыалое значение и5С в стЛШС B.nlgr» может свидетельствовать о том, что данное минорное основание яреяцущест-* венно лочадизовано в высоко плавящемся компоненте стДНК растений.

I

рннетяка реассошааии. При исследовании ранатурашаоиных свойств суммарных препаратов яДШ сателлитоносных растений выявляется, что свтелдитные компоненты не обладают способностью к полной обратимей ре на ту ранки в присутствии основного компонента. После ренатурации яДКК ооычно; обнаруживается один узкий пик с плотностью, промежуточной мету натнвной и денатурированной ДНК.

Больше информации удается получить при изучении реиатураца-онных свойств индивидуальных компонентов, Так, основной компонент ДОС P.Tulgarla не претерпевает заметной ренатурации. Иефрагмен-тпро ванная стДЖ яри ренатурации расщепляется на две фракции.

Фракция I ренатурарует несколько быстрее (рис.12)* В целом« эти данные указывают на способность стДНК ?.ти1£аг1в к обратимой ре-катурации.

При изучении кинетика реассоциации обнаруживается, что часть стДКК представляет собой быстро реассоциируюцуюся фракцию ( рис. 13). (В качестве стандарта при реассоциации использовалась ДОС фаГа Т4» Значение CQt , при котором молекулы ДЫК фага Т4 реассоиди-рованы на 5ССС* составляет 0,4 м* сек* л-^), Изображение данных кинетики реассоциации в виде зависимости £цвусгырадьностя/ c^t от % днуспиралыюстж PQ Марту и ЬйкКарти (КлгвЬ KcCaxthy, ХЭ74) позволяет' рассчитать долю фракции, соответствующей быстро реаоооцян-pyweay компоненту. быстро реэссоцилрупцейся фракции

отДНК P.ruieari» составляет 0,020 м.сек«л~*. Это значение корректируется, так как в изолированном виде этот коьшовент ренатури-роиался бы быстрее - 0,02 х 0,39 ■» 7,8 х 1СГ3. Подученные данные позволяют рассчитать кинетическую сложность данных фракций, т.е. длину повторяющегося элемента (за мол.вес ДНК фага Т4 принимаемся 1,1 х ICr дальтоя), Кинетическая сложность быстро реассоции-рунцеЕся фракции стДНК ^.Tulgerie равна

х 1Д х 1С8 - 2.1 х ICf5 даяьток.

0,4

Таким образом, стДНК P.vulgarl» состоит из быстро реасоо-циирушцейся фракции с длиной повторяющегося элемента а,2 х 10s пар оснований и более медленно реассоцнируодейся части. Точное определение кинетическое сложности медленно реассощшрухщвхся фракций, также как я коррекция значений кинетической сложности стДНК на сс-содержание и а Тщ, в настоящей работе не про во далась.

. При реассоциации стДНК других видов высших растений также обнаруживаются медленно и быстро реаесоцаарущаеся фракции. Доля быотро реассошшруювдхся фракций варьирует от 30li у стДНК в.nigra да <Х% у стДНК c.iircoo. Рассчитанные на основе кинетики реассоциации длины повторяющихся звеньев быстро реассоциируюшх-ся фракций стДНК•растений приведены в табл.З».

Следует однако клеть в виду, что длина повторяющегося элемента в стДНК, определенная по кинетике реассоциации, как прави-: ло, бывает значительно завышенной по сравнению с истинной длиной повторяющегося звена ( £otehbB,I974; Southern, 1975). Причина

- зо -

Ржо, 12. Рводредвлеюю стДНК P.rul««jri» в Градввнтв доор-коотв с<сі : а - натявная; û - денатурированная. Образцы, ренатурарованвые при разных значеннях e t : в - 0,03; г - 0,12; д - 1.44і » - 3,0; * - 16,0. ' І •

во «

40

. 20 О

Ч

* ■ ■ ■

■J—L- I.

-J.0 -J.Î -1.« -0.< 0.2 1.0

i« V

РасЛЗ. Квнеїмса реаесоцаацш сгЭДК r,Tuig«rie (о), P.coceineu» B.algra (д), С.1ІЛЮЛ (*), ДНК фага Т4 ( О ).

Табляга З

Процентное содержание и кинетическая сложность бистро реассоциирууце йся фракции стДНК высших растений

Вид Доля быстро реассоцаврую-пеЙся^¡р акции, м.сек.л Кяветичео-кая сложность {пара оснований)

1Ъм*о1иа т\іІ£&г1е РЬммІїи вмоіши* Вг*4в1«* ПІ£Г« Сіїгиа li.no п 39 44 . ЗО 64 7,8*І(Ґ3 8,8х1СГ3 8,ІХІ(Г3 4,2хІ(Г3 3,2x10? .3,7x10? 3,3x10® І.8ХІ03

этого явления в том, что базисный повторяющийся елемент в результате эволюции претерпев ряд дивергенций с последующими мультипликациями, при анализе методом кинетики ре ассоциации дает завышенное значение длины. Так например, значительная дивергенция стДИК лимона в процессе эволюции доказывается плавлением реассоцаированных молекул. На рис.14 приводится дифференциальная кривая плавления Фрагментированной сгДОС лимона и повторного плавления после реассоциации при с^ - ю. Как следует из этих экспериментов, исходная форма кошонента, плавящегося в узком температурном интервале; не восстанавливается. Это указывает на несовершенство образованной спирали. В отличие от стДНК лимона, £НК фага Т4 при реассоциации полностью восстанавливает исходную структуру.

Одач из важных проблем,возникавших при исследовании стДНК высших растений, заключается а ояедукцем: связаны ли ковалентно быстро и медленно реассошяруювцмся компоненты в одну полинуклео-тидную цепь шш они представляют собой отдельные иодеіфШ? Аналогичный вопрос возникает и в результате опытов по термической денатурации - отображают ли четыре обнаруженных термических субкомпонента плавление отдельных молевул или же они интегрированы в одну молекулу? Эти вопросы должны явиться предметом дальнейшие исследований.

Молекулярная р^т^роге^н^суь в стЩЩ. Гетерогенность, обнаруживаемая методами тепловой денатурации и кинетики реассоциации,

Рва.І4. Дифференциальные кривые плавления препаратов ДНК: а - фрагментдро ванная стДНК с. limon ; ö - ДНК фага Т4, реассоциированная при C^t =10; в - стДЗК с.іішш , реассошяро ванная при c0t»io ( I х ssc >.

может отражать как внутр»-, ток к меямолвкужфкую гетерогенность. Другая техника - равновесное улътраценгржфугарованлэ в градиентах ел&тности актшоыхцан &-СяС1 : ж Hg++-C»2304 - о достоверностью показывает существование ыелюдекулярной гетерогенности в отДРК. Квеество, что богатые АТ-параыи ДНК боле« энергично связывают коны ртутя, нежели богатые -парами (Hemil et al., 1965). При сья-зиванм gg** ш&иучая плотность ДЙК в градиенте с»2зо+ седы» увеличивается. со своей сторонн ажияоюадаа » , свкзкваясь с ас богатыми участками, понижает плотность молекул ДНК в градиенте длотяоста Ceci (peaaook et •1,,1Э74).С помощью этих методов набор' разнит молекул ДНК. датих одна скк в градиенте Cad» Удается разделять на составляющие кошюнеятн. Распределен*« вндЕвадуахьдаа отДНК r.Tulgivri« s градиенте плотно с та носат гете-

рогенные характер. При rf «0,19 наблюдается дваконлояенм о

I I

I

ЛИЯ |

I

ÎKQ.IS» Распределение стдше P.Tulg«xie в градиенте плотности Нг++-а*гао4*г1 : а - 0,29; б - 0,37.

Рис .16. Распределение стДИК P.coccín«u# в градиентах ллотяості

актявошцпн Р-с»сі (А) і Вв^-Свгэо^ СБ). А- весовое соот-вовение актиношдин і) е-0,8; Б ~*t і а-0,12;

6 - 0,24. ■ . - *

Рис.17. Распределение стДНК B.algra в градиентах шютяоста акгшюмяцвя

D»CeCl (і) 'в He^-CíjSO^ (Б). А - весовое соотношение аюгиоивдив ® /ДИК;'а*- 0; б - I,Oj s - 1,33; В - rf ; а -0; б - 0,2¡ в -0,4,

плотностью 1,457 г«см-3 и 1,480 Г.сн*3 (рис.15). При увеличения rf до 0,37 дистанция между компонентами возрастает (плотность кошонентов 1,460 г.см-^ ж 1,530 г*см-3). Наличие УФ^-поглощаяцего материала между ломпонентами свидетельствует о гетерогенности СтдаК P.TUlgarla.

На рис.16 приводятся кривые распределения стДЙК Р.оооо1л®и» в градиенте плотности актиношщин D-CeCi.Epn соотновешш актансаш-цин D :ДШ»0,8 наблвдается один широкий них с плотностью 1,660 Ира'увеличении соотношения до 1,2 пик стДЦК распадается на три фракции с плотностью 1,в37, I,646 л 1,65В г.сы.

В'градиенте плотности Hg^-Ca^so^ при rf - 0,12 в стДНК P.ooooineua наблюдаются три компонента - 1,458, 1,478 а 1,485. При увеличении rf вдвое удается наблюдать 5 фракций отДИК (1,486, 1,503, 1,518, 1,539 и 1,552) (рис.16). Следует отметить, что -характер распределения стДНК р.оооо1л»ия в градиенте плотности B«"M'-Ce2SO+ ВО МНОГОМ сходен 0 распределением СТДПС P.Tulgarle .

СтДЙК B.nlgr» в градиенте плотности яктнномпцин D-CeCl так- . же делится на ряд фракций (рис.17). При соотношении аксиномшшн S : ДНК » I, на ч>иэой просматривается компонент о плотность» 1,635 г.бм** , полностью отделившийся от основной массы ДОС, плотность которой составляет 1,659 г. см-3. На летом плече основного компонента наблюдается малый компонент с плотностью 1,651 г-см"3. При соотношении 1,33 наблюдаются те же компоненты с уменьшившимися плотностями я 'добавочно появившийся компонент с плотностью 1,662 г.см""3. Таким образом, аналитическое равновесное ультрацент-рвфугирование в градиенте плотности актиноыишш s-CaCx позволяет обнаружить четыре фракции в составе стДЖ B.uigra. •

На рис. 17 представлены лфнвые распределения стДНК B.nlgra в градиенте плотное от Hg**-c«2so4 при разных значениях rf. Плотность ДНК в данном градиенте в отсутствие не** составляет 1,441 г* см*3, фа внесении ионов ртути вначале можно наблюдать два компонента с плотностью 1,458 и 1,468 г-см-3. Цря увеличения значения rf. число компонентов достигает четырех. Следует заметить, что по числу и характеру распределения стДНК B.nigra в Градиенте плотности акпшомящш &-СеС1 в Hg^-cagSO^ наОдвдает-оя значительное сходство.

На рис.18 приводятся (фпвые распределения в градиенте акти-

номидиа D-Caoa стДВК c.llnon ара разном соотноавнди актдкома-ШШ D I ДНК. Вез добавления антибиотика сии ДНК на просматривается, так как плотность исходного раствора шла для ДНК s она осаждается на дно кювета. При внесении активомищша s молекулы ДНК становятся легче и появляются в анализируемой зоне; удается обнаружить 4 компонента) из них центральный о плотностью 1,675 г*оГэ, превалирует. При увеличении соотношения адтиномвцян ь ¡дак проио-ходат дальнейшее снижение плотности ДНК; наиболее легкий компонент, наблюдаемый на кривой, всплывает на поверхность, но добавочное расщепление оставшихся компонентов не происходит.

На рис.18 приводятся также кривые распределения стДНК лимона В Градиенте Ha++-Ce2S04 при разных значениях rf . Ери rf ■ 0,3 стДНК расщепляется на два номпоневта. При увеличении rf в левой части основного дока появляется плечо с плотность» 1,471 г*с«-3, а маленький пик значительно опережает основную массу стДНК, образуя полосу с плотность» 1,456 г*см~3. при дальнейшем увеличении

этот пик оседает на дно кюветы, а в основной массе наблюдаются 4 разделившиеся фракции.

В зоне стДНК растений ряд авторов показал наличие генов PlHK ( Uateuda tt.31eg«l, 1967; Engl« «t «X., IS75; Lla&-d*-fto-riei «t ai., 1975), Предполагается, что часть стДНК представляет собой рДШи Для идентификации рДКК среди разных фракций стДКК нами был использован метод так называемой "а -петли", разработанный Томасом и соавт. (ТЬоидя et ex., 1976). Показано, что при сызео" ним двуспвральной'ДНК о однонитевой РНК в присутствии формамвда При повшенной температуре образуются R -петли, если последовательность PIK гомологична о каким-либо из сегментов ДНК. Образуемая н -петля представляет собой расплетенный участок ДНК, где од-па из Цепей сварена о FKK.

В наших опытах рШК инкубировалась о стДЗК в.nigm в условиях R-аеглеобразоваквя и далее смесь анализировалась в градиенте Плотности акгиномицмн В-Се&.Те кюдегулн в стДВК, которые образовали К -петли, вследствие увеличившейся плотности должны осесть на дао ячейки. Таким образом, полоса, соответствующая рДНК, в градиенте Cad ве должна обнаруживаться. Наблюдалось исчезновение одного из цикорных компонентов стДКК, которым следует считать рДНК.

Irl»

iL і,*»

MTl

»J

<t Л.М»

./е.-

Рис. 18. Распределение стДНК С.ііеопв градиеатаї плотности ангивомщан Р-0вЯ (А) и %++-Cí2so4 (Б), кг весовое соотношение актдношдия Р /ДНК: 'а 6 -0,5; в -1,0} Б - rf ; & -0; 6 -0,3; в -0,4; >0,45,

с

Eco« I

» • с

ци^—-

Ваші

ЄсокІ *виЫ

» *t II м»я

Peo. 19. А-денситограмш галь-электрофореза стДНК

с.Июоа , ойра&этанной аедонуклеазама рестрикции Ecor I, Sam I К £со Й+ Baa I, £ - физичеокая карте сайтов Eco а I к Ваш х.

Анализ при помощи стщоцукиеаэ рестрикции. Анализ стДНК яри помощи еядонумеаз рестрикции, т&лш как и другие фвзиво-хиадчео-кие исследованяя свидетель«твуют об як значительное гетерогенности. Э сгДНК обнаруживав гея надарив как дгишаы*, гак * коротких повторов (Poder, Beridzв,1 Э7&). Крупноблочные повтори обнаружена во всех трех исследованных стДНХ (тайя,4). Большое число фрагментов отражает наличие различных семейств периодических структур, не являющихся олигоиерами.

Особый интерес представляют результаты изучения стДЖ лимона. Eco в I« фрагменты стДНК лимона при гель-адектрофорезе образуют характерную для других стДНК крупноблочную периодичность (ряс.19). Молекулярные веса наиболее значительных фрагментов А, В'я С - 4,2, 3,7 Я 2,4 негадальтон, соответственно* Заметно наличие такие меньших по количеству Фрагмент« в.

Таблица 4

Мол. веса основных фрагментов стДЕГК высших растений, ■ полученных лря расщеплении эвдонукл вазами рестрикции

В'К д San Z ECOHI Has III

Й1лв»о1ио rulgfiTl» BrasalOA otee» Cltrue linon 1,7x1 O^ï 0.75XI06 О.ЭэсКР 2,5xlt£ 1,3x10® I,2xIQ® I,ÛxI(£ 0,7x10? 4,2x№ 3,7x100 2,4x10® 0,053xlt£ 0,063 *

Из продуктов действия Вот X на стДНК C.llmoa выделяются три фрагмента А,В и С о молекулярнш весом 1,7, 1,4 я 0,9 мегадальтои (рис. 19). При совместном воздействии Ecör I и Ben 1 наблвдается исчезновение основных продуктов действия отдельных ферментов и появление новых фрагментов А, В, С и Ь . Эти данные дают основание ■ предположить, что ярупноблочныв периодические структуры, обнаруживаемые при помощи Ecos I к Вш I , представляют Одни и те де учао-тки стДНК c.llmoa или, по 1файней мере, перекрываются. На основе анализа продуктов расцепления, образуемых под действием »«дону-клеаз рестрикции, представлена физическая карта такого участка (рис.13).

В то время как расщепление стДЖ лимона экдонуклеазами рестрикции EooR I я Bao i отражает наличие крупноблочных повторов, ендонуклеаэа рестрикции Rae Hl расщепляет стДНК лимона на мелкие блоки. Эти ферменты выявляв структурные особенности разных фракций стДНК лимона. Около 3Q? стДОК резистентна к Eco в I; при совместном воздействии Seo R I и Мй III резистентная часть рас-

целляется о образованием характерных дня Нее III фрагментов. Tarnt образом, доказывается существование двух тияов периодичности в этДКК лимона.

При действия Нее III на «даК с.гідоа обнаруживается ряд дискретных полос, представлявших пелвойлочные периодические структуры (рас.20). На рисунке цифрами обозначены 4 основных семейства фрагментов, каждое из которых состоит из двух компонентов в количествах близких к эквимолярноцу. Наиболее интенсивные полосы образуют I, I' и 2,2* фрагменты, молекулярные размеры которых равна 80, 95,170 В 200 перам оснований. Учитывая характер кривых плавления, йледует предположить, что крупноблочные повторы юлу* чаются при расщеплении участков ДИК, плавящихся при относительно низ ко! температуре. Мелкоблочная структура должка быть характерна для фракции, плавящейся в узкой температурной зове. Наблюдаемые при расиешшші Нае III семейства фрагментов, каздое из которых состоит из двух компонентов, отражает, по-видимому. структурные особенности высо ко плавящегося пика, также состоящего из двух компонентов.

Совершенно иная картина наблюдается при использовании рест-рикгярутоей эндонуклеазы Нра II, узнающей, как я Нае III, СС -богаты© участки. Сайт узнавания Нае III -GGCC , Нра II - ССОО. Исходя из того, что метилирование цвтоэииа в геноме вуввриотов происходит в С-0 -последовательностях, в стДНК лимона, характеризующейся высоким содержанием в5С Нра Ii-сайты в отличие от сайта Нае III должны бы» метилированы в значительной степени. Действительно, при действии Нра II на стДНК лимона фрагменты рао' щепленая не образуются. Эти данные косвенно могут свидетельство-~ вать о налички значительного количества в?с в стДЩС лимона.

Следует стмэтпть. что при дейотвии Нае III на стДНК ї.тиі««-ria к в.nigra обнаруживается равномерное расдредеяевхе сайтов о образованием многочисленных фрагментов размерами от ISO до 2000 пар основании.

Одновременно с указанием на сложную в гетерогенную структуру СТДНК растений, рестрвищюнныд анализ дает возможность обнаружить во всех стДЦК фрагменты, обладающие идентичной эдектрофо-ретжческой подвижностью. Следует предположить, что фрагменты с одинаковой адектрофоретической яодвихностью представляют собой

Отюсттыьм* я P»*WP Нав M {per» ин

t *

* *

r

VI t

IV! »W*

Анна

кар* основаны « ,

H»

Рис, 20. А-денсито грамма гель-электрофореза продуктов расщепления стДКК O.iiwn , ойраСоташюЯ эндо-нуклеазой рестрикции Haa III. Б- схематическое изображение расщепления и размеры основных фрагментов.

Продукты расщепления рДНК, являющейся частью гетерогенных стЯНК высших растений.

ДНК ИЮРОПЛАСТОВ САТЕДШТОЖСШХ РАСТШЙ

Вопрос о той, какай кз компонентов ДИК растительной юсетки является хцДЦХ, в течение долгого времени являлся предметом спора, Он был вызван тем обстоятельством, что хлоропласти высших растений, выделенные методом дифференциального центрифугирования, обычно загрязнены как ядерным материалом, так и митохондриями. Проблема дополнительно усложнялась для тех видов растений, яДНК которых содержали сателлитный компонент ( Кігк,197І).

Проблема возможной взаимосвязи стДНК и ДКК 'цитоплазматячео- ■ них органелл в сателлите ко сных р&стениях была поставлена Кадоури я соавт. при исследовании генома огурцов (Кд<іоиг1 е* а1., 1975). Авторы показали, что 12-1Э% тотальной ДОС' огурцов локализованы в цитопдазматических органеллах. Эта даїра значительно бодьще принятого в литературе значения (1-2?). По мления авторов сна обусловлена тем, что «хаячество ДНК в'гаплоидном ядре огурцов в 15-90 раз нижа по сравнению с другими однодольными и двудольными растениями.* Шесте с тем количество и размер хворо пластов я китоховд-рий в огурцах не отличается от обычного. Вследствие малого количества «ДНК, доля хлДШС и мтДНК в тотальной ДНК значительно возрастает, Авторы считают, что хцДНК огурцов совпадает по плотности о стД НК I (уз ш 1,701 Г.см"3), а ОТДІК с отДШ 21 (/> -1,70? г-см~3). Совпадение значений плавучих плотностей стДІЙС и ЛЩН здтоплазмати-ческих органелл, как считают авторы, может указывать на возможность наличия в яДЦК фраяхия, сходных с хпДНК и мтДЙК; по мнешш Кадрури и соавт. необходим пересмотр вопроса о субклеточной локализации стДНК растений в свете рассматриваемых явлений;

При исследовании хпДЖ фасоли мы отметили наличие двух компонентов ш аналогии с яДШС (р «1,694 и 1,703 г*см-3), Способность к обратимой ренатурацви ЛИК хлоропластов свидетельствовала о том, что эта компоненты, несмотря на совпадения с адерюыад со плотности, совершенно разные молекули (Беридзе ж др., ХЭЁ7). в настоящее время очевидно, что значительная часть тяжелого компонента в хпДК - это примесь мтДНК. Переосаждениа осадка хлоропластом в буфере для гомогенизации позволяет избавиться от прикеоеЯ мтДЕК. Цримеоя яВДК аффективно удаляются при ультрацектрп$оггврованян в незабуферевной концентрированной сахарозе (міоже, ВегІ4>*, 197Э). В результате втих операций хпДЙК изученных нами сателлито-

А

t

Б

1,69? К

1»693 И

Рис,21. Распределение хцЩЖ фасоли (А) и ткквы* (Е) в градиенте плотности CeCi * а - натпвная, б - ренатурированяая.

носных растений - фасоли и тыквы в градиенте плотности СеС1 характеризуются симметричным распределением. Плавучая плотность хдДНК саталллтоноеных растений (1,697 г,»см~3) не отличается от . плотности хпДПК бессателлитных видов (рас .21). Таким образом хпДНК саталлитокосных видов отличаются но плотности от стДШС (плавучая плотность стДЙК тыквы 1,706 г.см"®), К аналогичным выводам пришли недавно Паско в Ингл (Рааоое а. Insle, 1978).

Значительные отличия'наблюдаются такие "при сравнительном анализе дифференциальных 1фивых плавления хпДПК и стДКК. При исследовании хлДНК Euglena, . Chlorella И СЫaniydonvoIMta методом ТерШ-чеокой денатурации Сила обнаружена определенная внутримолекулярная ■ гетерогенность (Beetla et al., 1971; Belle а. Säger, IS7X; Sla-TÜc a.Kersbbergsr, I976;Baoren а. Rode,' I973J. У хцЩК высших растений такая гетерогенность не отмечалась (Kolodner a.Te*arl, 1972; KoloOner а. Те war i, 1975а; Kclodaer а. Твкаг!, I975Ö). На основе

атах работ было высказано предположение, согласно которое внутримолекулярная гетерогенность хЩЩК уменьшается с увеличением значения плавучей плотности {плотность хцЩЩ высших растений значительно выше, чем У низших) tslarik а. Herehberger, 1976).

Однако в ХЭТ9 году нами были представлены данные, поз валившие видоизменить сутцествушие в литературе положения об отсутствии внутримолекулярной гетерогенности у хпДНК высших растений (Табидэе, Беридэе,1979). При исследовали» методом высокоразреша-uueft термической денатурации хаЕНК бе ссателлатвых видов высших растений, принадлежащих разным классам и порядкам, была отмечена -значительная внутримолекулярная гетерогенность.

Тонкая структура кривых плавления хпДНК сателлитоносных видов высших растений в значительной мере сходна о хпДШС бессателяят-ных видов. Число обнаруженных компонентов в хдДЖ достигает в

(рис.22). У F.Tuigftri* сдашрн&я кривая сглажена, по-видимому, из-за равного соотношения компонентов III, 1У и У. Вариабельность количественного содержания указанных компонентов отмечается и jr бессателлитных видов, Дифференциальные кривые плавления яНВК тыквы и фасоли значительно отличаются от соответствующих хцДШС. В табл.5 приведены температуры, соответствующие максимумам компонентов ХпДВК тыквы, и их ОС -содержание. Особый интерес представляет компонент УШ, который четко прослеживается во всех препаратах ДНК и составляет приблизительно Гены рРНК в хпДНК должны обладать более высокой пяащучей плотностью вследствие высокого ОС -содержания. Соответствующий участок должен плавиться

Таблица 5

¿качения температур, соответствующе максимумам компонентов хпДНК тыквы н их GC -содержание

Ком п 0 н е н ы

I II hi д У У1 УД ущ

Температура,°С 60,0 62,0 63,7 65,5 67,5 69,5 72,5 75,5

G0 -содерхание,# 14,9 19,в 23,9 28,3 33,2 38,1 45,4 52,7

на несколько градусов выше по сравнению С основной массой ДНК* Из литературы известно, что в каждой хцЩОС присутствуют две ко-

XI t I Д П

in .'V \ 1 Ч

VII

; I '

?III I

Л.

55

(О

S5

70

75

60

»"С

Рис.22. Дифференциальные, »ряьые плавления шДЯК тыквы (а) а фасоли (а) < 0,1 х sso

шш генов рШК. Эта гены разделены участком, которых составляет около Х0£ длины хдДНК {ВейЪгоок а. Bogorad, 1976). Декатурадвоя-ыая карта хпШК показывает, что в ней присутствуют два богатых со -парами участка, которые также разделены сегментом ДНК <v I/1Q длины молекул« <Kolodn»r а. Tewari, 19756). Все эти данные позво- . лист предположить, что компонент УТИ, наблюдаемая на дифференциальных кривых плавлений, представляет собой рДНК хлоропластов.

Таким образом, как значение плавучей плотности, так к тонкая структура 1фивых плавления хпДЙК саталлитоко сных растений доказывают их полное отличие от стКИК. Гипотеза Кадоури а соавт, не поддерживается эксоериыентальнши результатами,

В Ы В ОД И

X. Методом равновесного ультраце стрингирования в градиенте плот-кости Oed в яДКК высшего растения (Fhaeeolus vulgaris )впервые бал обнаружен сателлитный компонент.

Ü. Исследован характер распределения !! аналитическом ірадаенте цлотности ceci ядак более SU видов высших растекай. Обнаружены случаи различия родственных видов высших растений как по количественному содержанию, так и во набору стДНК. Отмечена значительная вариабельность количества стДНК в пределах родов Fbaaaolua a Brasaloа, начиная о полного отсутствия до 30-40$.

3. Установлены прцчіцш различия родственных видов растений по количестве иному содержанию стДШ. Геїгоі.м бессателлитных квдов, а также основные коихонснты ДИК сателлитошснах растений содержат сателлитннс последовательности, длина которых недоста- -точна даш образования дискретных по плотности стШС.

4. Выделены в ч::отоід виде и охарактеризованы стДНК четырех видов ВЫШаж растений (їЬьввоІие vulgaris, Phaatolue eoaeineue,

Вгаээ1оа nigra, citrus limon ) , Свойства стДШС растений можно суммировать следу яшм образом:

а) стДКК представляют собой набор разных, но идентичных по плотности в Ca Cl молекул. Наличие межмолекулярной гетерогенности доказывается разделением индивидуальных схИКК на ряд составных компонентов в градиентах плотности акткнош-ЦДН 1>-СвС1 И Ks+*-Ce2S04J

б) все исследованные стДНК согласно дднпш кинетики ревссоші-ашш состоят ив медленно и быстро реассоцаируицюся фракций;

в) индивидуальные етДКХ характеризуются специфической тонкой структурой кривых плавлення;

г> У стДНК растений (за исключением стДНК B.nlgra ) отмечено несоответствие ос -содержания, рассчитанного по Тдд а плавучей плотности в градиенте ceci, что позволило высказать предположение о преимущественной локализации минорного основания - а5с в оЦЩК.

5. Проведен анализ стЛНК растений при. подаща эндонуклеаз рестрикции. СтДНК растений характеризуются наличием равностепенной периодичности. Составлены физические карты некоторых участков стДНК.

6. СтДНК растений so значению плавучей плотности и тонкой структуре кранах плавления полностью отличаются от хпДШ.

7. Представлены некоторые теоретические положения относительно образования и аволщяи стДНК растений.

Список работ, оду Линкованных по тема диссертации

. I. Беридзе Т.Г., Одинцова U.C., Сисакян Н.М, 1965. О свойствах

" ДОС хлороюшстов. Докл.АН СССР, 163. II8&-II9Q.

2, Беридзе Т.Г,, Одинцова И.О., Сисакян Н.М. 1967, Распределение

. компонентов ДНК листьев фасоли во фракциях клеточных структур. Молек.биология, 142-153,

3, Беридзе Т.Г.Одинцова U.C. 1967. Распределение ДНК проростков гороха в градиенте плотности "хлористого цезия.

Докл. АН СССР, JZ2, I209-I2ÏI.

4, Беридзе Т.Г., Одинцова U.C. "1969. ДОС цитошшзматических структур: пластдц и митохондрий. Успехи биол.химии, ІЙ, 36-63.

5, Беридзе Т.Г. 1972. Исследование саталлитных компонентов ДОС .рода Fhaaeoluà. Молек.биология, 6, 9D8-9I4.

6, Беридзе Г.Г. 1972. Дэзокслрайонуклеиновая кислота хлороплас-тов. Материалы Всесоюзного симпозиума "Генетические аспекты фотосинтеза", Душанбе, стр.10-11.

7* Беридзе Т.Г. 1973. К исследованию дезоксирвбочуклеиновой кислоты рода îhaaaoïua. В сб. "Биохимия растений", изд-во "Мец-няереба", Тбилиси, X, ІЗ-Ifi.

8. Беридзе Т.Г., Дурмяйидзе C.B., ЗСачяцзе О.Т, 1973, Распределение ядерных ЛИ некоторых представителей рода vit la L. в градиенте плотности хлористого цезия. Докл.АН СССР, 2JJ, 468-469.

9* Беридзе Т.Г,, Горгидэе А.Д. 1973. Распределение в градиенте плотности хлористого цезия ядерных ДНК некоторых видев и межродовых: гибридов лодгрибы Triticinae. Генетика, 9, 173-174.

10. Беридзе Т.Г,, Табидзе' В,Д, IS74. Свойства ДЯК хлоропластов

' высших растений. Рефераты научных сообщений 3-го Всесоюзного йиохим. съезда, 3.5, 26,

11. Беридзе Т.Г. 1974, О распределении сателлитньпс компонентов

* ДЦК в клеточных'структурах высгсих растений, В сб."Генетические функции органоидов цитоплазмы", изд-во "Наука", Ленинград, 47-52.

12. Беридзе Т.Г», Дурлипщдзе C.B., їачяхзе О.Т. 1975. Определение плавучей плотности ядерных ДОС некоторых представителей рода vitie ь. В сб. "Вопроси биохимии винограда и вина", Кзд-зво "Пищевая промини.", Йосізм, 68-71.

13. Беридзе Т.Г,. Табидае В.Д. 1976. О характере распределения ДНК хаоропдастов внсшюс растений в градиенте плотности хлористого цезия. Цолек.биология, Ii], 278-287,

14. Беридзе Т.Г. 1976. Ддерные сателлиты ДНК рода Вгаваіоа L. Иоде к, биология, iß, 538-543.

15. Бервдэе Т.Г., Брагвадзе Г.Н. 1976. О овойствах сателлятной ДНК Phaceolus r«lewie. иолах, биология, JQ, I279-I2S9.

16. Беридзе Т.Г. 1976. Сатедлитныв JCQt высших растений» Иэв.АН Груз.ССР, Серйя биол., 2, 259-271.

17. Беридзе Т.Г. 1979, Сравнительное исследование геномов некоторых представителей высших растений. Ыолек.биология, 13,925-933

18. Беридзе Т.Г. I97â. О"свойствах сателлитной ЛИК Braaaloa nigra. Биохимия, 4J, 1952-1960

19. Табадзе Б.Л.. Беридзе Т.Г. 1979. Тонхая структура плавления ДНК хлоропластов высших растений. Докл. АН СССР. 245, 12621266

20. Беридзе Т.Г. І9Ш. О свойствах сателлитной ДНК Cltrua IIjboq. Moлек.биология, 14, 126-135

21. Baridse Т.О. 1972. The satellite ШАя of higher planta. Abatreete оГ the 8th PEBS Meetlog, Anatardan, 1057.

22» Beridxo Т.О. 1972. Ш nuclear satellites oí the genus ГЬалеоІиа. Bloch1м.Blophyв.Ac ta,. 393-396.

23. Serldie Т.О. t975. DBA nuclear a&tellitea of the genua Broa»leaf variation between s poole». Biottin.Blophye.Aote, 395. 274-279.

24. Beridza T.G. 1973. ША nuolear satellite« ot bigbar plant*. Abstráete of the oympoalum ca DMA structure and function, Llbllce (Czechoslovakia), p. 1.

25. Bvrldse Т.О., Bragrad«* O.P. 1974. Propertiea oí the OHA nuclear satellites of higher planta. Abstráete of the 9-th РЕЛ5 meeting, Budapest, >4 el}.

26. Seridie Т.е., BragTsdae O.P. 1975, On heterogeneity of aatel-lite ША of Phaaeolua vulgaris. Abstracta oÍ the 10-th PEB3 «««tins, Paris, A7 127.

27. Berldsa Т.О. 197?. BITA nuclear satellites of higher plant** variabilities between cloaely related species. Abstracts of the XZI International Botanical Congree», Leningrad» P.O.

sa» Barlá** Î.G. 19ÎT* th® properíleo t>í eateUlt» mu« oí higber planta. Abstráete of International Confereno» on Régulation of Developoontal proeonaee in Planto, Rallo (CDU), №>,33.

29. Tabld*« V.D.» Btsrldse T.Q» 1979* Hleh-Maolution mvltlng of obloroplast Mti. oí hlaher plants* Fiant Solónos Le t ter», 16,157-164.

«06<jr>í (jftrtíflnO ctj ¡brtocQ

atíjowídü pce

.Тираж 200_Закалив_ УЗ 00071_

Издательство "Мешшв petía" , Тбилиси, 380060, їл. Кутузова 19 Типография АН ТССР, Тбилиси, 13&ШС0, ул, Кутузова 19