Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Повторяющиеся последовательности генома тупай

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тен, Олег Андреевич

Основные обозначения и сокращения

Введение

Глава 1 .Обзор литературы: Основные типы повторяющихся последовательностей в геноме высших эукариот

1.1. Сатсллитная ДНК

1.1.1. Общая характеристика и структурная организация тандемно организованных повторов и составляющих их элементов

1.1.2. Основные классы сателлитной ДНК в геноме человека

1.1.3. Альфа-сателлитпая ДНК — доминирующий класс центромерных ДНК

1.1.4. Иерархическая организация а-сателлитной ДНК

1.1.5. Происхождение и эволюция тандемно организованных повторов

1.1.6. Значения для генома

1.2. Рассеянные по геному повторяющиеся последовательности.

1.2.1. Общая характеристика рассеянных по геному повторяющихся элементов

1.2.2. ДНК-транспозоны

1.2.3. Ретротранспозоны

1.2.4. LTR-содержащие ретротранспозоны

1.2.5. Длинные ретропозоны

1.2.6. Короткие ретропозоны

1.2.7. 7SL- РНК родственные КР

1.2.8. Происхождение и эволюция 7SL РНК-родственных КР

1.2.9. Малые РНК и их гены, ведущие происхождение от 78Ь-родственных КР

1.2.10. Значение КР для генома

1.2.11. Перспективы использования КР в филогенетических исследованиях

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Материалы и реактивы, использованные в работе

2.1.1. Ферменты и наборы

2.1.2. Плазмидные векторы

2.1.3. Другие реактивы

2.1.4. Материалы

2.1.5. Приборы

2.2. Животные, ткани и ДНК

2.3. Выделение геномной ДНК

2.4. Дот-гибридизация

2.5. Гибридизация по Саузерну

2.6. Электрофорез ДНК в агарозном геле

2.6.1 .Выделение ДНК из геля

2.7. Полимсразпая ценная реакция (ПЦР)

2.8. Радиоактивное мечение ДНК

2.9. Создание геномных библиотек и их скрининг

2.10. Выделение плазмидной ДНК

2.11. Секвепирование ДНК

2.11.1. Секвенирование с использованием модифицированной

Т7 ДНК-полимеразы (секвеназы)

2.11.2. Секвенирование с использованием Taq-полимеразы

2.11.3. Секвенирующий электрофорез в ПААГ

2.12. Компьютерный анализ

Глава 3. Результаты

3.1. Изучение распространения 7SL РНК-родственных

SINE среди млекопитающих

3.2. Клонирование и секвенирование 78Ь-родственных КР

3.3. Обнаружение и клонирование высокоповторнющихся последовательностей генома Tupaiaglis

3.4. Основной короткий ретропозон генома тупай

3.5. Основная тандемная последовательность генома Tupaia glis

Глава 4. Обсуждение результатов

4.1. Тандемный повтор

4.2. 78Ь-родствснные короткие ретропозоны

4.3. Основной короткий ретропозон генома тупай 78 Выводы 82 Благодарности 83 Список литературы

Основные обозначения и сокращения

ДЭАЭ-мембрана диэтиламиноэтил-целлюлозиая мембрана кДНК комплементарная ДНК

ПААГ полиакриламидный гель

ОРС открытая рамка считывания

ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота

SSC стандартный солевой раствор

SDS додецилсульфат натрия

SRP signal recognition particles

ДР длинный ретропозоп

КР короткий ретропозон

7SL-KP 7SL РНК-родственные ретропозоны

LTR long terminal repeats

LINE long interspersed elements

SINE short interspersed elements

FAM fossil Alu monomer

FLAM free left Alu monomer

FRAM free right Alu monomer pBl proto B

ERV Endogenous retroviruses

Введение Диссертация по биологии, на тему "Повторяющиеся последовательности генома тупай"

Несмотря на значительные успехи в исследованиях повторяющихся последовательностей ДНК, они остаются одним из наиболее загадочных компонентов геномов эукариотических организмов. Особый интерес представляют их происхождение и эволюция, а также роль в жизни и эволюции самих организмов. Повторяющиеся последовательности составляют значительную долю геномов эукариот и подразделяются на два основных класса — тандемные и рассеянные по геному. Тандемные повторы (сателлитная ДНК) занимают очень протяженные области в центромерных и прицентромерных частях хромосом. Длина повторяющейся единицы (мономер) сателлитной ДНК может варьировать у разных видов от 5 до нескольких сотен п.н. Число мономеров сателлитных последовательностей в геноме обычно исчисляется миллионами копий. В пределах одного биологического вида копии мономеров значительно меньше отличаются друг от друга, чем от сателлитных мономеров, выделяемых из родственных видов. Это происходит благодаря процессу так называемой согласованной (concerted) эволюции, основанной на неравном кроссинговере. В эволюции происходит довольно быстрая смена одних сателлитных ДНК другими, поэтому виды, принадлежащие разным родам, могут не иметь общих сателлитных последовательностей (Henikoff et al., 2001). Сателлитная ДНК, вероятно, вовлечена в формирование хромосомных центромер и, тем самым, должна играть определенную роль в митозе и мейозе (Lamb and Birchler, 2003).

Рассеянные по геному повторяющиеся последовательности представлены, главным образом, различными видами мобильных генетических элементов, среди которых выделяют ДНК-транспозоны, ретротранспозопы (или LTR-содержащие транспозоны), а также длинные (ДР) и короткие ретропозоны (КР), более известные под названиями LINEs (long interspersed elements) и SINEs (short interspersed elements) соответственно (Deininger and Batzer, 2002; Smit, 1999). Мобильные элементы, за исключением ДНК-транспозонов, используют для размножения процесс обратной транскрипции. Причем, если ретротранспозоны и ДР кодируют свои собственные обратные транскриптазы, то КР используют обратную транскриптазу ДР. В геноме млекопитающих имеется лишь одно семейство активных ДР — L1 (пе считая Bov-B крупного рогатого скота), тогда как КР разнообразны, и к настоящему времени известно не менее 30 семейств активных КР млекопитающих. КР (100^00 п.н.) значительно меньше, чем полноразмерные копии других мобильных генетических элементов (4-7 т.п.п.). Обычно геном содержит от одного до трех семейств КР (Kramerov and Vassetzky, 2005) и каждое семейство, как правило, представлено 105-106 копиями. За исключением Alu-элементов приматов и В1-элементов грызунов, которые произошли от 7SL РНК (малой цитоплазматической РНК, участвующей в синтезе секретируемых белков), КР ведут свое происхождение от тех или иных видов тРНК. На 5'-конце таких КР располагается район, обладающий сходством с тРНК и содержащий промотор РНК-полимеразы III, который состоит из боксов А и В, расположенных па расстоянии 30-35 п.н. друг от друга. За тРНК-родственным районом следует участок неизвестного происхождения, специфичный для каждого семейства КР. На 3'-конце КР находится А-богатая последовательность (млекопитающие и растения) или участок, состоящий из нескольких очень коротких прямых повторов (рептилии и рыбы). Многие свойства КР, как и других мобильных генетических элементов, свидетельствуют об их паразитической природе. Однако существование каждого семейства КР в геноме в течение многих миллионов лет делает их важными факторами эволюции. Например, встраиваясь около генов или в их интроны, они могут изменять транскрипцию и сплайсинг генов (Makalowski, 2000). КР могут играть важную роль в защите клеток от стресса (Allen et al., 2004).

КР оказались хорошими филогенетическими маркерами, поскольку независимое возникновение одинаковых семейств КР событие крайне маловероятное (Serdobova and Kramerov, 1998; Shedlock and Okada, 2000). КР сохраняются в геноме на протяжении десятков и даже сотен миллионов лет. Поэтому все виды, имеющие данное семейство КР должны быть филогенетически более близки друг другу, чем тем видам, которые этим семейством не обладают.

Тупайи — группа млекопитающих, внешне напоминающих белок, состоящая из 5 родов и 18 видов, обитающих в Юго-Восточной Азии. Первоначально тупай относили к отряду насекомоядных, позднее стали считать наиболее примитивным семейством отряда приматов. (Этот взгляд остается весьма распространенным в отечественной литературе (Соколов, 1988; Фридман, 1979)). Затем их выдели в отдельный отряд - Scandentia (Butler, 1972; Павлинов, 2003). Однако до сих пор филогенетическое положение этих интереснейших млекопитающих остается неясным.

Тупайи (Г. glis и Т. belangeri) часто используются как лабораторные животные в физиологических и медицинских исследованиях (более 300 публикаций в год). Ценность тупай в этом отношении состоит в том, что они, видимо, ближе к приматам, чем любые другие лабораторные животные, а их содержание проще и дешевле, чем содержание приматов. Поэтому изучение генома тупай представляется, несомненно, важным для дальнейшего развития медико-биологических исследований, проводимых на этом модельном лабораторном животном. До сих пор об их генах и геноме было известно очень мало. Проведенный в данной работе анализ основных повторяющихся последовательностей ДНК Т. glis может послужить отправной точкой для дальнейшего развития геномики и молекулярной биологии тупай.

Цель и задачи исследования

Исходной целью данной работы было выяснение того, какие группы млекопитающих содержат в своих геномах 7SL РНК-родственные КР (В1 и Alu). Такие данные позволили бы сделать вывод о филогенетическом родстве этих млекопитающих. Также целью работы было охарактеризовать наиболее богато представленные в геноме Tupaia glis повторяющиеся последовательности. Работа проводилась в рамках проекта, целью которого было проверить гипотезу о том, что КР имеются в геномах млекопитающих всех отрядов. В ходе исследования планировалось решить следующие экспериментальные задачи. Используя гибридизацию ДНК, детектировать 7SL РПК-родственные КР в геномах млекопитающих, в частности предполагалось проверить, характерны ли они для многочисленных семейств отряда грызунов. Клонировать и секвенировать 7SL РНК-родственные КР из ряда видов, где они ранее не были описаны. Провести сравнительный анализ структур 7SL РНК-родственных КР из разных видов. Обнаружить, клонировать и секвенировать мпогокопийные повторяющиеся последовательности генома Tupaia glis. Провести анализ их нуклеотидных последовательностей.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Тен, Олег Андреевич

выводы.

1. Установлено, что мобильные генетические элементы, относящиеся к классу коротких ретропозопов и ведущих свое происхождение от 7SL РНК, характерны не только для приматов (Alu-элементы) и грызунов (В 1-элементы), но и тупай; при этом они отсутствуют в геномах млекопитающих других отрядов. Эти данные свидетельствуют о родстве отрядов грызунов, приматов и тупай.

2. 7SL РНК - родственные элементы тупайи, в отличие от подавляющего большинства В1-элементов, не содержат внутренней тандемной дупликации. Анализ 29-нуклеотидной дупликации в В1-элементах грызунов позволил предложить модель, согласно которой образование этой дупликации связано с очень короткими повторами, фланкирующими дуплицировавшийся участок. Эта модель объясняет образование ряда внутренних делеций и дупликаций в коротких ретропозонах.

3. Клонированы и секвенированы копии основного короткого ретропозона из геномов тупай Tupaia glis и Dendrogale murina. Показано, что он характерен только для тупай, представлен в их геноме 200 тысячами копий, имеет длину около 260 п.н. и ведет свое происхождение от глициновой тРНК(ССС). С помощью компьютерного анализа установлено, что транскрипт этого ретропозона должен иметь выраженную вторичную структуру, причем длинные полипуриновый и полипиримидиновые участки вносят большой вклад в ее формирование.

4. Охарактеризована тандемная повторяющаяся последовательность из генома Tupaia glis с длиной мономера около 365 п.н. Компьютерный анализ ее нуклеотидной последовательности указывает на то, что она представляет собой центромерную сателлитную ДНК.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает сердечную благодарность своему научному руководителю Д.А. Крамерову за руководство и терпение, О.Р Бородулиной за помощь в некоторых экспериментах, а также Н.С. Васетскому и Н.Ю. Опариной за ценные советы при работе с компьютерными программами. Отдельная благодарность всем тем, кто предоставил образцы тканей и ДНК, использованных в настоящей работе.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тен, Олег Андреевич, Москва

1. Alexandrov, 1. A., Mashkova, T. D., Akopian, T. A., Medvedev, L. I., Kisselev, L. L., Mitkevich, S. P., and Yurov, Y. B. (1991). Chromosome-specific alpha satellites: two distinct families on human chromosome 18. Genomics 11, 15-23.

2. Alexandrov, I. A., Mitkevich, S. P., and Yurov, Y. B. (1988). The phylogeny of human chromosome specific alpha satellites. Chromosoma 96, 443-453.

3. Allen, T. A., Von Kaenel, S., Goodrich, J. A., and Kugel, J. F. (2004). The SINE-encoded mouse B2 RNA represses mRNA transcription in response to heat shock. Nat Struct1. Mol Biol 11, 816-821.

4. Andreazzoli, M., and Gerbi, S. A. (1991). Changes in 7SL RNA conformation during the signal recognition particle cycle. Embo J 10, 767-777.

5. Antunez-de-Mayolo, G., Antunez-de-Mayolo, A., Antunez-de-Mayolo, P., Papiha, S. S., Hammer, M., Yunis, J. J., Yunis, E. J., Damodaran, C., Martinez de Pancorbo, M.,

6. Bachvarova, R. (1988). Small B2 RNAs in mouse oocytes, embryos, and somatic tissues. DevBiol 130, 513-523.

7. Bandyopadhyay, R., Berend, S. A., Page, S. L., Choo, К. H., and Shaffer, L. G. (2001). Satellite III sequences on 14p and their relevance to Robertsonian translocation formation. Chromosome Res 9, 235-242.

8. Bandyopadhyay, R., Heller, A., Knox-DuBois, C., McCaskill, C., Berend, S. A., Page, S. L., and Shaffer, L. G. (2002). Parental origin and timing of de novo Robertsonian translocation formation. Am J Hum Genet 71, 1456-1462.

9. Batzer, M. A., and Deininger, P. L. (2002). Alu repeats and human genomic diversity. Nat Rev Genet 3, 370-379.

10. Batzer, M. A., Stoneking, M., Alegria-Hartman, M., Bazan, H., Kass, D. H., Shaikh, Т. H., Novick, G. E., Ioannou, P. A., Scheer, W. D., Herrera, R. J., and et al. (1994).

11. African origin of human-specific polymorphic Alu insertions. Proc Natl Acad Sci ^ USA 91, 12288-12292.

12. Boeke, J. D., and Chapman, К. B. (1991). Retrotransposition mechanisms. Curr Opin Cell Biol 3, 502-507.

13. Borodulina, O. R., and Kramerov, D. A. (2001). Short interspersed elements (SINEs) from insectivores. Two classes of mammalian SINEs distinguished by A-rich tailstructure. Mamm Genome 12, 779-786.

14. Brown, T. A. (2002). Genomes, Second Edition edn (United States of America: BIOS Scientific Publishers Ltd).

15. Butler, P. M. (1972). The problem of insectivore classification., In Studies in Vertebrate Evolution, K. A. Joysey, and T. S. Kemp, eds. (Edinburgh: Oliver and Boyd), pp. 253-265.

16. Carter, А. В., Salem, A. H., Hedges, D. J., Keegan, C. N., Kimball, В., Walker, J. A., Watkins, W. S., Jorde, L. В., and Batzer, M. A. (2004). Genome-wide analysis of the human Alu Yb-lineage. Hum Genomics 1,167-178.

17. Cooper, K. F., Fisher, R. В., and Tyler-Smith, C. (1992). Structure of the pericentric long arm region of the human Y chromosome. J Mol Biol 228, 421-432.

18. Cooper, K. F., Fisher, R. В., and Tyler-Smith, C. (1993). Structure of the sequences adjacent to the centromeric alphoid satellite DNA array on the human Y chromosome. J Mol1. Biol 230, 787-799.

19. Corneo, G., Ginelli, E., and Polli, E. (1967). A satellite DNA isolated from human tissues. J Mol Biol 23, 619-622.

20. Corneo, G., Ginelli, E., and Polli, E. (1968). Isolation of the complementary strands of a human satellite DNA. J Mol Biol 33, 331-335.

21. Corneo, G., Ginelli, E., and Polli, E. (1970). Repeated sequences in human DNA. J Mol Biol 48, 319-327.

22. Corneo, G., Ginelli, E., and Polli, E. (1971). Renaturation properties and localization in heterochromatin of human satellite DNA's. Biochim Biophys Acta 247, 528-534.

23. Cost, G. J., Feng, Q., Jacquier, A., and Boeke, J. D. (2002). Human LI element target-primed reverse transcription in vitro. Embo J 21, 5899-5910.

24. Craig, N. L., Craigie, R., Gellert, M., and Lambowitz, A. M., eds. (2002). Mobile DNA II (Washington, DC.: ASM Press).

25. Csink, A. K., and Henikoff, S. (1998). Something from nothing: the evolution and utility of satellite repeats. Trends Genet 14,200-204.

26. Dagan, Т., Sorek, R., Sharon, E., Ast, G., and Graur, D. (2004). AluGene: a database of Alu elements incorporated within protein-coding genes. Nucleic Acids Res 32, D489- 492.27.28,2930,31,32,33,34,35,36,37,38.39,40.

27. Deininger, P. L., and Batzer, M. A. (2002). Mammalian retroelements. Genome Res 12, 1455-1465.

28. Deininger, P. L., Jolly, D. J., Rubin, С. M., Friedmann, Т., and Schmid, C. W. (1981). Base sequence studies of 300 nucleotide renatured repeated human DNA clones. J Mol Biol 151,17-33.

29. Dewannieux, M., Esnault, C., and Heidmann, T. (2003). LINE-mediated retrotransposition of marked Alu sequences. Nat Genet 35,41-48.

30. Evgen'ev, M. В., and Arkhipova, I. R. (2005). Penelope-like elements--a new class of retroelements: distribution, function and possible evolutionary significance. Cytogenet Genome Res 110, 510-521.

31. Feng, Q., Moran, J. V., Kazazian, H. H., Jr., and Boeke, J. D. (1996). Human LI retrotransposon encodes a conserved endonuclease required for retrotransposition. Cell 87, 905-916.

32. Feschotte, C., Jiang, N., and Wessler, S. R. (2002). Plant transposable elements: where genetics meets genomics. Nat Rev Genet 3, 329-341.

33. Flavell, A. J., Pearce, S. R., Heslop-Harrison, P., and Kumar, A. (1997). The evolution of Tyl-copia group retrotransposons in eukaryote genomes. Genetica 100,185-195.

34. Fry, K., and Salser, W. (1977). Nucleotide sequences of HS-alpha satellite DNA from kangaroo rat Dipodomys ordii and characterization of similar sequences in other rodents. Cell 12, 1069-1084.

35. Ganal, M., and Hemleben, W. (1988). Insertion and amplification of a DNA sequence in satellite DNA of Cucumis sativus L. Theoretical and Applied Genetics75, 357-361.

36. Georgiev, G. P. (1984). Mobile genetic elements in animal cells and their biological significance. Eur J Biochem 145, 203-220.

37. Gogolevskaya, I. K., Koval, A. P., and Kramerov, D. A. (2005). Evolutionary History of 4.5SH RNA. Mol Biol Evol.

38. Goodier, J. L., Ostertag, E. M., Du, K., and Kazazian, H. H., Jr. (2001). A novel active LI retrotransposon subfamily in the mouse. Genome Res 11, 1677-1685.

39. Grady, D. L., Ratliff, R. L., Robinson, D. L., McCanlies, E. C., Meyne, J., and Moyzis, R. K. (1992). Highly conserved repetitive DNA sequences are present at human centromeres. Proc Natl Acad Sci U S A 89, 1695-1699.

40. Greig, G. M., and Willard, H. F. (1992). Beta satellite DNA: characterization and localization of two subfamilies from the distal and proximal short arms of the human acrocentric chromosomes. Genomics 12, 573-580.54