Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика копий мобильного элемента МДГ1 и близлежащих повторяющихся последовательностей в геноме

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика копий мобильного элемента МДГ1 и близлежащих повторяющихся последовательностей в геноме"

, «А , 1 ,

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, - ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ям. М.В. ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи УЖ 578,233.422

БАЛАКИРЕВА Мария Дмитриевна

ХАРАКТЕРИСТИКА КОПИЙ • МОБИЛЬНОГО ЭЛЕМЕНТА МДП И БЛИЗЛЕЖАЩИХ ПОВТОРЯЮЩИХСЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В ГЕНОМЕ ВЕОЭОРШЬА МЕЬАЖЖАвТЕЯ

03.00.03 — Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва— 1988

/

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики АН СССР

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор Гвоздев В.А.

Социальные оппоненты:

- доктор биологических наук Гаузе Г.Г.

- кандидат биологических наук /^сеев В.В.

Ведусая организация - Институт молекулярной биологии АН СССР

Завита диссертации состоится *21 -/¿лг^г 1988 г. в/^ час. Ъо мин. на заседании Специализированного совета Д.053.50.70 при Московском государственном университете ще. М.В.Ломоносова.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического Факультета МГУ по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, Д!ГУ, Биологический Факультет.

Автореферат разослан 1988 г.

Ученый секретарь. Совета . кандидат' химических наук

В.Н,КаГранано0

У-'..-vim

v' T.« - 1

4

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Более 10% генома Droaophila nelanogaster приходится на мобильные элементы. Существенную часть мобильных элементов составляют ретротранспоэоны, к которым относятся со-* piа-подобные элементы, или мобильные диспергированные гены (ЧДГ). ВДГ ограничены длинными концевыми повторами (ДКП) и обладают определенным структурным сходством с проретровирусами позвоночных. Общепринято представление о том, что перемещения мобильных элементов могут быть источником геномной изменчивости и вызывать мутации. Однако, это справедливо не для всех мобильных элементов. Так, пока не обнаружен мутагенный эффект перемещений МДП и МДГ&. В то же время показано, что множественные перемеие-ния мобильных элементов "адаптивные транспозиции") сопровождаются изменением уровня приспособленности у Drosophila melanogas-ter (Гвоздев,1981; Гвоздев и Кайданов, 1986). Анализ распределения МДГ по длине политенных хромосом методом гибридизации in situ выявил наличие горячих точек их локализации, в особенности для ВДГ1 (Беляева и др., 1984; Пасюкова и др., Ш4). Структурная организация районов горячих точек локализации МДГ1 и причины выбора их в качестве мишеней транспозиции элемента не известны. Поэтому молекулярный анализ районов локализации МДГ1 можно рассматривать как первый шаг к выяснению структурно-функциональных особенностей распределения МДГ1 по геному дрозофилы.

Цель и задачи исследования. Характер геномной изменчивости может определяться не только выбором мишени транспозиции для копии данного семейства мобильных элементов, но и внедрением з определенный сайт генома того или иного структурного варианта копий МДГ1. Структурный полиморфизм описан для отдельных семейств ретротранспозонов, однако он не был обнаружен внутри семейства МДП. Задачи данной работы состояли в изучении структурного полиморфизма копий МДГГ и исследовании молекулярной структуры тех сайтов генома Drosophila melanogaster, которые могут служить мишенями внедрения МДП.

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе впервые обнаружен структурный полиморфизм копий МДП. Выявлен« два основных варианта элемента, которые отличаются по структуре

длинных концевых повторов. Обнаружены копии МДП в гетерохроматических районах генома. В составе окружающих МДП повторяющихся последовательностей генома выявлено новое семейство гетерохроматических повторов и определена их нуклеотиднад последовательность. Обнаруженный новый компонент гетерохроматина составляет лишь небольшую его часть и представлен короткими повторами, ор- -ганизованными в нерегулярные кластеры.

Ранее была показана корреляция между характером распределения копий МДП по геному и уровнем жизнеспособности и приспособленности особей. В результате селекции в определенном направлении отмечались характерные изменения в распределении сайтов локализации МДП в геноме дрозофилы. Полученные в данной работе результаты открывают подход к анализу перемещений разных полиморфных копий МДП, а также к анализу характера изменчивости гетерохроматических районов генома дрозофилы в процессе селекции.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 16 конференции ФЕБО (Москва, 1984), У и У* Всесоюзных симпозиумах "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1983, 1987), У съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова (Москва. 1987).

Структура и об»ем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, экспериментальной части обсуждения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на

страницах машинописного текста, включает 33 рисунка, таблицы и названий библиографии.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава I. Структурный полиморфизм геномных копий МДГ1 и.анализ их распределения в геноме методом саузерн-гибридизации. МДП - ретротранспозон, принадлежащий к классу copla.подобных элементов. Структура одного из двух ранее описанных вариантов представлена на рисЛА (Hyin «t al., 1980). Было сделано, заключение, что такой структурный вариант МДП является основным, если не единственным в геноме дрозофилы, и копии МДП не различаются по сайтам Ecori рестрикции.

( 2 3 Ц 5 6

Г1

-3,0

8

Рио.1. Структурный полиморфизм копий ЫДП. А. Схема организации двух структурных вариантов МДГ1) указаны сайты рестрикции ЕеоШ и Н1пахи и размеры ЕсоШ-фрагментов в т.п.н. Б, Гибридизация ЕсоШ-реотриктов МДГ1 (I), космиды РвЬ18 (2), и тотальных ДНК линий 5ие<И8|1 (3), 171 (4), 68 (5) и НА (6) с А-фрагментом МДГ1.

Структурная организация геномных копий МДГ1 была исследована более детально с помощью метода саузерн-гибридизации ЕсоШ-рестриктов ДНК мух и при анализе клонированных копий элемента, включая космиду Р8Ь18, отобранных из банка генов линии вь ча (см.гл.2). Было продемонстрировано разнообразие структурных вариантов геномных копий внутри семейства МДГ1. На рис ЛБ представлен результат гибридизации ЕсоШ-рестриктов геномных ДНК разных линий дрозофилы с А-фрагментом "канонической" копии МДГ1. Наряду с ожидаемым геномным рестриктом размером 2,8 т.п.н.г-вы! является гибридизующийся геномный фрагмент, который включает около 3,0 т.п.н.

Определение нуклеотидной последовательности части ДКП "неканонической" копии МДП, клонированной в составе космиды ;.сказало, что образование ЕсоМ-фрагмента размером 3,0 т.п.н. в этом случае вызвано исчезновением одного из сайтов рестрикции

ЕсоВ1 в результате точечной замены - транзиции Т-*-С. В результате размер геномного ЕсоШ-фрагмента, гибридизующегося с А-Фрагментом МДГ1, увеличивается на длину внутреннего БсоМ-ЕсоВ1-• Фрагмента ДКП. Оба ДКП этой копии МДГ1 одинаковы по сайтам ЕсоШ рестрикции; размер .В-фрагмента по элёктроФоретической подвижности не отличается от В-Фрагмента "канонической" копии МДГ1 (см. . . рисЛА).

Два обнаруженных варианта копий МДГ1 присутствуют во веек. исследованных линиях-дрозофилы. Судя по интенсивности гибридиза- ' ции, их соотношение во всех линиях постоянно: 70-76Х копий относятся к основному варианту и 20-2р% копий имеют гибридизующийся с А-Фрагментом рестрикт размером около 3,0 т.п.н. (рис.1Б). Постоянство соотношения числа копий МДГ1, относящихся к двум структурным вариантам может свидетельствовать о селективной ценности разных классов копий МДГ1 в геноме. Кроме этих двух структурных вариантов, во всех исследованных линиях обнаруживаются гибридизующиеся с А-Фрагментом Есои-рестрикты, отличные от 2,8 т.гГ.н. и 3,0 т.п.н., причем, наборы таких рестриктов различаются в разных линиях. Эти гибридизующиеся ЕсоЯ1-рестрикты могут отражать существование "дефектных" делеционных вариантов, а также копий МДГ1, несущих инсерцию или имеющих измененную рестриктную карту. Существование структурного полиморфизма в организации геномных копий МДГ1 подтверждается при анализе копий элемента, клонированных из банка генов линии вь ма (см.табл.1)

С помощью нхпйхи рестрикции тотальных ДНК разных линий. 0го9орМ1а в«1апо8авЬег, используя соответствующие гибридизаци-онные зонды, можно исследовать окружение отдельных копий МДИ (рис.Ш. Эксперименты показали, что в каждой из исследованных линий выявляется 3-5 полос с повышенной интенсивностью гибридизации. Кроме того, в ДНК разных линий дрозофилы, в том числе линий, не имеющих одинаковых сайтов локализации МДГ1 по длине по-литенных хромосом, выявляются отдельные Н1шП11-рестрикты с одинаковыми молекулярными весами. Это можно рассматривать как указание на то, что в геномах разных линий дрозофилы, не имеющих общих сайтов локализации МДГ1, присутствуют копии элемента со сходным ближайшим окружением.

Таким образом, внутри семейства МДГ1 выявлен структурный

полиморфизм по сайтам рестрикции ЕсоН1; получены данные, указывающие на присутствие в геноме копий МДГ1 с одинаковым ближайшим окружением,

Глвва 2. Характеристика клонированных в косищах копий МДГ1 • и окружающих их последовательностей! кластеры повторяющихся ■элементов в составе геномного окружения МДГГ.

Для анализа геномного окружение копий МДГ1 из банка генов линии gt w® (предоставлен В.Е.Алаторцевым) было отобрано 14 ре-комбинантных космид, гибридизующихся с А- и/или В-Фрагментами ИДГ1. р косищах были клонированы геномные фрагменты размером 25-36 т.п.н, в векторе рНС79 (Hohn, Colllna, 1980). Особенности структурной организации клонированных копий МДГ1 исследовали методом саузерн-гибридизации рестриктов космид с Eeofli-фрагмвнтами "канонической" копии МДГ^. Для определения хромосомной локализации клонированных фрагментов.космиды гибридизовали in situ с по-литенными хромосомами разных линий. Результаты этих экспериментов суммированы в табл.1.

Гибридизация Ecori-рестриктов космид с Фрагментами МДГГ подтвердила существование структурного полиморфизма геномных копий МДГ1, выявленного на "саузернах" тотальных ДНК (см.рисЛБ). В 5 космидах (N 14, 32, 36, 24, 46) с А-фрагментом МДГ1 гибриди-зуется Есонх.рестрикт размером 2,8 т.п.н., а в 3 (N 18, 31, 48)-рестрикт размером 3,0 т.п.н. Как и ожидалось, меньшая часть космид несет геномный вариант МДГГ с увеличенным А-Фрагментом. В космидах pgt34, pgt35 и pgt40 проклонированы копии элемента, имеющие "измененный" А-Фрагмент,размер которого отличается от двух основных структурных вариантов. 3 из 14 космид (N 24, 45 и 46) были исключены из дальнейшего анализа, так как несли случайно обкдиненные Фрагменты из разных участков генома (см.табл.1),

10 космид гибридизовали in situ с политенными хромосомами нескольких линий дрозофилы: gt wa, из ДНК которой получен банк генов, и родственных между йобой по происхождению линий НА и 68, сильно различающихся по сайтам локализации МДГ1 (Пасюкова и др., 1984). Только для 4 космид (N 14, 32, 36 и 34) удается выявить один "главный" сайг гибридизации, как наиболее интенсивный, присутствующий в хромосомах всех исследованных линий. В этих случа-

характеристика копий ВДГ1 (Коой1-Рестрикция)

сайты гибридизации главный х-ц доп.сайты"

1 14

2 32

3 36

4 34

В 18

6 31

7

8 9

10 II

"ЙГ

13

14

33 48 40 42 35

2,в

2,8 2,8 2,4 1,95 3,0 3,0

(1,5) 3,0

■Л1

"14 6) 3,5

1,75 2,65 1,75 2,2 1,95 1,75 3,4

1,75 не иссл. не иссл. не иссл.

Т?д»

2,0 2,2

2,0 3 4 2,2 2,0 19 "(7 2)

41АВ 39СБ 19ЯС 73С

+ +

+ +

+ + + +

не исследовалась

+ ♦

+ + •

+ + +

+

г»"

24

45

46

.2.8 "(¿.6) 2,6

(1,4) - несет две копии вектора

не иссл. 1,9 несет две копии вектора не иссл. 0,9 несет 2 фрагмента генома

Таблица I. Характеристика МДГ1-несущих космид, отобранных из банка генов линии ^ «*• Условные обозначения: А, В и С -размеры (в т.п.н.) вОоН1-Р0Стриктов, гибридизующихся с в и С-Фрагментами МДГГ, *( ) - фрагмент подсоединен к вектору, в скобках указан размер гибридизующегося ВсоЩ-рестрикта", * * -космида содержит случайно объединенные фрагменты из разных участков генома; а -наиболее интенсивно гибридизующийся,присутствующий во всех линиях сайт; б - сайты не обусловленные присутствием МДГ1, различающиеся в разных линиях; в - по данным

О.Я.Шевелева; х«ц - хромоцентр. »

ях удается установить участок генома, который клонирован в ^сос-миде: так, в составе космид рбЯ4, рв*32 и р^Зб клонированы копии МДГ1 из районов горячих точек локализации элемента. Хот* ЫДГ1 в линии ф; »* не гибридизуется с районом хромоцентра (данные Е.В, Ананьева и Е.Сп.Беляевой), по крайней мере, 8 космид давали сильную гибридизацию с районом хромоцентра и проксимальными участками хромосом, прилежащими к хромоцентру. Гибридизация с хромоцентром космид pgtI4 и по-видимому, указывает на

то, что вблизи копий МДГ1 находятся повторяющиеся элементы генома, которыми обогащена ДНК хромоцентра. Для шести активно гибри-

дизующихся с хромоцентром космид (М 18, 31, 33, 48, 40, 42) не удается выявить главного сайта. Можно предположить, что в их состава клонированы Фрагменты из гетерохроматических районов генома, которые не представлены (недореплицированы) в политенных хромосомах. Это подтвердили данные о сильной недорепликации в ДНК политенных хромосом последовательности ближайшего окружения МДГ1 из космиды pgtl8 (данные Ю.Я.Шевелева). Гибридизация in situ фрагментов ближайшего окружения копии МДГ1 из космиды pgtI8 подтвердила, что в ней клонирован Фрагмент из района хромоцентра (см.ниже).

При гибридизации целых космид с хромосомами линии gt н*'для 9 из 10 исследованных космид наряду с сайтами характерными для МДГ1 выявляются дополнительные сайты гибридизации по длине политенных хромосом. Многие дополнительные сайты совпадают с' сайтами интеркалярного гетерохроматина и сайтами предпочтительтельной локализации МДГ1, обнаруживаемыми в разных линиях дрозофилы. Гибридизация космид с политенными хромосомами линий НА и 68 показала,что многие дополнительные сайты в разных линиях различаются. Эти данные свидетельствуют о том, что в составе клонированных МДГ1-несущих фрагментов генома присутствуют другие повторяющиеся элементы генома, часть из которых мобильна. Кроме того, обращает на себя внимание наличие общих дополнительных сайтов гибридизации для космид, содержащих фрагменты из разных участков генома, то есть, в составе окружения разных геномных копий МДГ1 могут присутствовать одни и те же повторяющиеся елементы генома.

Для анализа окружающих МДГ1 гетерохроматических последовательностей ДНК была выбрана космида pgfcI8, имеющая наибольшее . число дополнительных сайтов гибридизации (48) с политенными хромосомами. В составе pgtl8 клонирована одна копия МДГ1 с утраче-ным EcoBi сайтом в составе ДКП (см.гл.1). Для клонированного в pgtI8 фрагмента ДНК была построена рестриктная карта, предстан.-. ленная на рис.2. Окружающие МДГ1 последовательности (зонды 1-ХУ) гибридиэовали с рестриктами МДП-несущих космид,с Hindlll-рест-риктами тотальных ДНК разных линий и in situ с политенными хромосомами нескольких линий. Большинство дополнительных различаю-

.я для разных линий сайтов гибридизации раЫ8 обусловлено гибридизацией с фрагментами ДНК, непосредственно не прилежащими

,1 т.п.и.

Н Н Н* ЕЕНГГЕ Е НЕ £ j н" . ЕН

Рис. 2. Рестрик^ная карта коСмиды pgtI8. Отмечены сайты рестрикции EcoRi (е.), Hindin (Н), Taqi (т) (отмечены не все -сайты Taqi)| ориентация в космиде Фрагмента, ограниченного Н-сайтами, отмеченными звездочками, не определена. Волнистой линией показана область вектора рнс?9, заштрихованными квадратами отмечены ДКП МДГ1. 1-1У - зонды, использованные в работе,-в качестве зонда III использован фрагмент EcoRi-Taql после обработки нуклеазой Ваш для удаления нуклеотидов ДКП) цифры над круглыми скобками указывают рестрикты, гомологичные соответствующим зон-Д^У..

к 1Щ7 (зонды I и XX). Саузерн-гибридиэация этих фрагментов с ДНК мух раздых линий после Hindlli-рестрикции подтвердила их мобильность, выявляемую при гибридизации с политенными хромосома-пи. Таким образом, в космиде pgtI8 присутствуют повторяющиеся элементы, гомологичные мобильным последовательностям ДНК генома дрозофилы. Результаты гибридизации зондов ill и 1У in situ с политенными хромосомами и с Hindlll-рестриктами тотальных ДНК разных линий показали, что эти последовательности также являются повторяющимся, однако, они, по-видимому, не мобильны, и значительная часть .геномных копий этих последовательностей представлена в ДНК гетерохроматина (см.гл.З и 4).

Гибридизация рестриктов космиды pgtlß с зондами 1-1У пока-ла, что последовательность зонда Ш или часть ее представлена по длине клонированного фрагментаj по крайней мере, 4 раза и окружает копию МДГ1 с обеих сторон. Саузерн-гибридизация других

МДП-несущих космид с зондами 1-1У показала, что последовательность зонда Iii (ближайшее окружение МДП) представлена еще в трех МДП-несущих космидах (н 31,33 и 48), что указывает на неслучайность соседства копий ИДИ с этой последовательностью. Неслучайность соседства этой последовательности о копиями МДП в геноме подтверждают следующие расчеты. Гибридизация космидного банка генов линии st wa (I5•IО3 клонов) с зондом III выявляет около 150-200 положительных сигналов, то есть каждая сотая коо-мида содержит последовательности, гомологичные зонду III. Следовательно, при независимом распределении в геноме МДП и этой последовательности вероятность обнаружить 4 космиды, несущие ату последовательность, среди И, несущих МДП, чрезвычайно низка и составляет по Формуле Бернулли 10~8 (Вентцелъ, 1969). Таким образом, в составе окружения МДП в космиде pgtI8 присутствует повторяющаяся последовательность, которая являетоя одним из часто встречающихся вариантов окружения МДП в геноме.

Таким образом, из геномной библиотеки дрозофилы были отобраны космиды, несущие копии МДП из районов горячих точек его локализации и гетерохроматических районов Генома. Среди И отобранных космид, по крайней мере, 9 содержат другие повторяющиеся элементы, гибридизующиеся in »ltu с хромоцентром и/или рядом сайтов по длине политенных хромосом. 4 космиды содержат повторяющиеся последовательности, гомологичные ближайшему окружению МДП в одной из космид.

Глава 3. Новое семейство гетерохроматических повторов, неслучайно соседствующих с копиями МДП.

1 Для исследования нуклеотидной последовательности, неслучайно соседствующей с копиями МДП (зонд III), были выбрайы фрагменты ближайшего окружения МДП из космиды pgtI8, Были определены нуклеотидные последовательности районов гомологии и характер »' их распределения в геноме. Рестриктная карта ДКП МДП и фрагментов блияайиего огсружения элемента, на которой отмечены области гомологии и стратегия определения нуклеотидных последовательностей этих областей представлена на рис. ЗА, а на рис. ЗБ - схема организации двух гомологичных последовательностей из окружения МДП в космиде pgtI8, При сравнении двух вариантов этой последо-

6.

■f 2 l—| 253п.Н. [ 233л».

П»птт'

ч Y К

¿.-Ч^бЗп.к. | 233П.Н.

200пн

4 AT.

304 ПН. | 208п.ц. -

2

3.

2

— 2WriH. 3//Л.М.

4

\t&2n.n\—

ВДГ1>

Рис. 3. Структурная организация района локализации МДП в космиде pgtlö, А. Рестриктная карта Фрагментов ближайшего окружения ЩГ1. Заштрихованными прямоугольниками показаны ДКП, цифрами обозначены блоки гомологичных последовательностей; круглыми скобками отмечен район гомологии с зондом хУt стрелками указана стратегия определения нуклеотидных последовательностей блоков 1-4 (сплошная линия) и АТ-последовательностей (волнистая линия. Рестриктазы: EcoRI (е), Hindlll (н), EgllX (g), Taql (т), Pvuil (р). Б. Схема расположения блоков М-последовательности и АТ-последовательностей в окружении МДП. +) - данные Ю.Я.Шевелева.

i

вательности из pgt18, а также гомологичной им последовательности из окружения МДГ1 в космиде pI7I-3I из банка генов линии 171 (данные Ю.Я.Шевелева) были выявлены участки .гомологии (блоки), на рисунках обозначенные цифрами 1-4. Границы блоков определялись по исчезновению гомологии. ■ • .

* Сравнение нуклеотидных последрвательностей областей гомологии из космиды pgt18 выявляет небольшое число единичных нуклеотидных замен и коротких (3-10 п.н.) вставок (делений). Такого же рода замены и вставки обнаруживаются и при сравнении последовательностей из pgt18 и pJ7I-3I. Нуклеотидные замены и инсерции в составе блоков обуславливают различия в положении сайтов рестрикции в гомологичных последовательностях, а также различия в длине отдельных блоков последовательностей, включающих 200-300 , п.н. Сравнение первично^ структуры окружающих МДГ1 гомологичных . последовательностей показало, что несмотря на протяженные области гомологии, в их составе могут отсутствовать отдельные блоки гомологии в 200-300 п.н| Наиболее полно последовательность представлена в варианте 2 (в составе окружения со стороны 2,0 т.п.н. фрагмента МДГ1 из космиды pgt18). В двух других случаях имеются "делеционные" варианты последовательности, в которых отсутствуют отдельные блоки гомологии. Поэтому нуклеотидные последовательности, обнаруженные в гетерохроматине по соседству с МДГ1 можно рассматривать в первом приближении как составленные из отдельных блоков (модулей) и назвать М-последовательностями.

Их сравнение с другими известными эукариотическими и вирусными последовательностями, представленными в Европейском банке данных (emel, 14 release), не выявило значимых гомологий. То есть, в составе ближайшего окружения гетерохроматичеокой копии МДГ1 из pgt18 обнаружено новое семейство повторяющихся последовательностей, неслучайно соседствующих с МДГ1 в генома. Последо* вательности блоков не содержат протяженных открытых рамок считывания и нуклеотидных мотивов, характерных для промоторных районов РНН-полимеразы II.

Для анализа распределения М-последовательности в геноме Hindin-рестрикты тотальных ДНК разных линий дрозофилы гибриди* зовали с последовательностями блоков гомологии 1,2 и 3 (рио.ЗА). Результаты гибридизации показали, что эти последовательности

представлены в геноме повторами. Характер распределения гибриди-зущихся Н1п<1111рестриктов в разных линиях дрозофилы сходен, что не позволяет отнести обнаруженные повторы к мобильным элементам. Большинство геномных рестриктов несут все три блока гомологии. Структурный вариант из pgtI8, лишенный блока 3, встречается редко, так как одни и те же рестрикты выявляются при гибридизации с блоками 2 и 3. Вместе с тем в геноме присутствуют копии М-лосле-довательности без блока I (вариант из космиды pI7I-3I). Полученные' данные показывют, что в основном в геноме присутствуют копии М-последовательности, повторяющаяся единица которых включает, по крайней цере I т.п.н. (блоки I, 2, 3 и, по-видимому, 4).

Гибридизация отдельных блоков на рестрикты МДГ1-несущих космид показала, что в составе клонированных фрагментов генома размером 15-25 т.п.н, они представлены 2-4 раза, то есть копии U-последовательности присутствуют в геноме в виде кластеров. Гибридизация рекомбинантных клонов из банка генов линии st "а с М-последовательностью показала, что в геноме дрозофилы присутствует около 50 кластеров М-последовательности. Анализ геномных блотов позволяет предположить, что повторяющаяся единица таких кластеров может включать не только М-последовательность, но и другие последовательности, например, последовательность, выявляемую) непосредственно за блоком 4 в космиде pgtI8 (см.ниже).

При гибридизации М-последовательности (зонд Ш) с политен-ными хромосомами разных линий дрозофилы выявляются только два района локализации: хромоцентр и сайт интеркалярного гетерохро-матина Х-хромосомы I2E, которые, по-видимому, содержат основное число геномных копий М-последовательности. Отдельные копии Ы-последовательности могут присутствовать и в других сайтах интеркалярного и прицентомерного гетерохроматина, но in situ они не выявляются из-за сильной недорешшкации в ДНИ политенных хромосом, Таким образом, в геноме дрозофилы в составе гетерохроматина, кроме сателлитной ДНК, присутствуют другие повторяющиеся немобильные элементы, организованные в кластеры, по-видимому, отличные от кластеров сателлитной ДНК. Рели считать, что размер основного геномного парианта М-последовательности составляет около I т.п.н,, то на долю М-последовательности должно приходиться не менее 0,5-1% от массы сателлитной ДНК (PrutiaB,I980).

Таким образом, при анализе клонированных окружающих ВДГ1 повторяющихся последовательностей ДНК было обнаружено новое семейство гетерохроматических повторов,неслучайно соседствующих о МДГГ, и определены их нуклеотидные последовательности. В геноме присутствует около 50 кластеров таких повторов, локализованных преимущественно в хромоцентре и районе интеркалярного гетёрохро-матина 12Е.

Глава 4. Соседствующие с МДГ1, обогащенные АТ-парами, повторы, ДНК содержат нуклеотидные мотивы, обеспечивающие, согласно литературным данным, автономную репликацию участков генома дрозофилы.

В окружении МДГ1, кроме последовательностеЯ блоков 1-4, присутствуют и другие перекрестно гибридизующиеся Фрагменты: зонд 1У (рестрикт т.н) гибридизуется с рестриктом а-Т (рис.ЗА). Возможно рестрикты с-Т и т.н содержат гомологичные последовав тельности, входящие в состав двух тандемных несовершенных повторов, начинающихся с блоков I и 2, причем, первый из этих повторов прерван внедрением МДГ1. Гибридизация зонда 1У с Н1паи1-рестриктаыи тотальных ДНК нескольких линий показала, что этот фрагмент является повторяющимся и, по-видимому, не мобильным элементом генома как и последовательности блоков 1-3. Последовательность зонда ХУ гибридизуется с геномными Шгхпп.рестриктами размером 2,8 т.п.н. и 2,5 т.п.н., с которыми интенсивно гибриди-» зуются блоки 1-3. При гибридизации зонда 1У о Н1п<пи-рестрикта-ми ДНК политенных хромосом рестрикты размером 2,8 т.п.н. и 2,5 т.п.н. практически изчезают, что может говорить о локализации* этих копий последовательности в недореплицирующихся гетерохроматических районах генома. При гибридизации зонда 1У с политенными хромосомами линии кь V* выявляется интенсивное мечение хромо-центра и сайта интеркалярного гетерохроматина Х-хромосомы 12Б-,- ' что совпадает с районами локализации М-лоследовательности. Таким образом, данные саузерн-гибридизации и гибридизации с поли-теннйми хромосомами свидетельствуют в пользу совместного присутствия М-последовательности и гетерохроматических копий прилежащей к ней в pgtI8 повторяющейся последовательности (зонд 1У) в составе повторяющихся единиц гетерохроматических кластеров.

у- Д ----

TTTTATTTTT TATGAATATT АТТТСТСАСО TATGTCTTCT TTTQGTAATT 50

TANGAATTAC IGTAGCTATA АТААТТТСТА ТТОТАСТТСС ТТТААТТАТТ 100

TAOTACATTT ATTAAGTCAT TTGACTTAAT ATGATGTAAC ATTAAGATTA 150

AAAGTGCTTC ААААТАААТА TTTCGCTTTT САААААСТОТ CAGATGAGAO 200 ,-А-—>

AGAAAATAAA АТААААААТА ААТАТАААТА TGTAAATGÖT AGCTAATTCG 250 у и. » - ■■ ■■> V-К-->

AGCGGCGATT TTAACCGAGT Т

Рис.4. Первичная структура последовательности ATg из косми-дн pgtI8. Отмечены усредненные нуклеотидные мотивы, обеспечивающие, согласно литературным данным, амплификацию генов белков хориона дрозофилы (А - ттт(с)tattgtt(А)Т(А)Т) и автономную реплика цию фрагментов ДНК в клетках дрожжей (* - т(А)тттата(о)тттт(А}),

Были определены нуклеотидные последовательности двух'участков в составе зонда 1У и гибридизующегося с ним фрагмента (рис. ЗА), которые, как оказалось, содержат нуклеотидные мотивы,'обеспечивающие автономную репликацию ДНК в геноме эукариот, в том числе последовательности уникальные для генов белков хориона (см.рио.4). Эти участки ДНК сильно обогащены АТ-парами - 74-763! (геном дрозофилы содержит 60Я АТ-пар), поэтому для удобства они были названы АТ-последовательностями (AT j и ATg,рис.3).На рис.4 представлена последовательность ATg, входящая в состав зонда 1У. Согласно имеющимся литературным данным к последовательностям, обеспечивающим автономную репликацию ДНК, относятся нуклеотидные мотивы ARS . T(A)TTTATA(G)TTTT(A) _ последовательность, обеспечивающая- автономную репликацию ДНК в клетках дрожжей (Marunouchi et al.,1987), и TTT(C)TATTGTT(A)T(A)T _ последовательность, связанная с амплификацией генов белков хориона дрозофилы (Kaifayan «t al., 1986). В составе АТ-последовательностей, во фрагментах длиной £00-300 п.н. было обнаружено несколько таких нуклеотидных мотивов с уровнем гомологии 85-100% (отмечены на рис.4), что свидетельствует о возможности амплификации повторяющихся единиц

кластера путем автономной репликации.

Полученные данные позволяют предположить, что кластеры таких гетерохроматических повторов, как и сателлиты, могли образоваться при амплификации исходной повторяющейся единицы, после чего последовательности повторов дивергировали. Дивергенция мог~-ла сопровождаться рекомбинацией, утратой блоков гомологии, ин-серцией мобильных элементов и последующей амплификацией измененных единиц. Неслучайность соседства копий МДГ1 и обнаруженных гетерохроматических повторов может быть связана, как с использованием последовательностей повторов в качества излюбленной мияе-ни для транспозиций МДГ1 в гетерохроматине, так и с амплифйкаци-ей интегрировавших копий в составе повторяющихся единиц кластера.

I

в ы! в о д ы

1. Показан структурный' полиморфизм внутри семейства МДГ1. Выявлено два основных варианта МДГ1, присутствующих в разных линиях дрозофилы в одном и том же соотношении и отличающихся по структуре длинных концевых повторов.

2. Из геномной библиотеки дрозофилы отобрано II КОСМИД, Несущих копии МДГ1 в составе фрагментов размером 25-35 т.п.н.

9 космид содержали другие повторяющиеся элементы, гибридизующиа-ся с хромоцентром и/или рядом сайтов предпочтительной локализации МДГ1,обнаруживаемых по длине политенных хромосом в разных линиях дрозофилы. Судя по результатам клонирования, вблизи большинства копий МДГ1 локализованы повторы, которыми обогащен хро-моцентр. Часть этих повторов, согласно результатам гибридизации 1п аПи, представлена мобильными элементами.

3. Определена нуклеотидная последовательность нового семейства гетерохроматических геномных повторов, неслучайно соседствующих с копиями МДГ1 в геноме. Можно предположить, что эти повторяющиеся последовательности являются мишенями инсерций копий МДГ1, интеграция которых сопровождается дупликацией последовательности ДНК в сайте внедрения. Показано, что в геноме дрозофилы содержится около 50 кластеров таких повторов, локализующихся преимущественно в гетерохроматине ( хромоцентре и сайте ин-

" теркалярного гетерохррматина Х-хромосомы I2E).

4. В составе кластеров гетерохроматических повторов обнаружены участки (200-300 п.н,),резко обогащенные АТ-парами и содержащие несколько вариантов II-12-членных нуклеотидных мотивов, обеспечивающих, согласно литературным данным, автономную репликацию участков генома дрозофилы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Балакирева М.Д., Беляева Е.Сп., Коган ГЛ., Алаторцев В.Е., Гвоздев В.А-. Транспозиции мобильных диспергированных генов (МДГ) у Drosophlla B«l«noga»ter, Тезисы 16 конференции ФЕБО, Москва, 1984, с.259.

2. Балакирева М.Д., Алаторцев В.Е., Гвоздев В.А. Особанности геномного окружения мобильного элемента МДГ1 у Droeophila о«1а_ g«et»r. в сб.: Молекулярные механизмы генетических процессов. Москва, Наука, 1985, с.27-34.

3. Шевелев D.H., Балакирева М.Д, Молекулярная организация районов локализации МДП в геноме Drosophlla mtlanogaster, Тезисы 5-го Всесоюзного генетического съезда, Москва, 1987, т.6, с.52.

4. Шевелев Ю.Я., Балакирева М.Д., Гвоздев В.А. Неизиенное расположение копий мобильного элемента МДП в гетерохроматических районах хромосом разных линий DroaophUa melanogaater, Докл. Акад. Наук. СССР , 1987, т.297, N 5, с.1243-1246.

5. Балакирева М.Д., Шевелев D.H., Гвоздев В.А. Новое семейство повторяющихся последовательностей в гетерохроматических районах генома Drosophll« otlanogaater. Докл. Акад. Наук. СССР, 1988,! т.299, N I, с.231-236. |