Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование протяженных районов гетерохроматина Х хромосомы Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование протяженных районов гетерохроматина Х хромосомы Drosophila melanogaster"

п ^

я ^

Московский гЬсударственный университет им. М.В. Ломоносова Биологический факультет

На правах рукописи УДК 575.577

НУРМИНСКИЙ Дмитрий Игоревич

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТЯЖЕННЫХ РАЙОНОВ ГЕТЕРОХРОМАТИНА X ХРОМОСОМЫ БКОвОРШЬА MELANOOASTER

03.00.03 — молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1992

Работа .выложена в Институте молекулярной генетики АН СССР Научный руководитель доктор биологических;наук, проф.

■Е А. Гвоздев -Официальные оппоненты : доктор биологических наук

А. С. /-Антонов

доктор биологических<наук Д А.-Крамеров

■Ввдувщ организация : -.Институт молекулярной биологии Ж СССР

• 1 у! -

-Защита состоится "/-»■ " глцтХ^ 1992 г. в ■ /ь' час на заседании Специализированного 'ученого совета: Д. 053.05.70 при Московском5 государственном университете им. М. В. Ломоносова

С.диссертацией можно -ознакомиться в библиотеке.Биологического .факультета )МГУ.

Автореферат разослан л^/л^м;1992т.

I

Учений секретарь Совета кандидат•химических;наук /. ЕЕ Каграманов

Актуальность темы. Гетерохроматин представляет собой обязательный компонент генома аукариот, составляющий 30-50% ДНК. сртУ|;Q;reelanogaster основная масса гетерохроматина локализована в прицентромерных районах хромосом, где он может быть разделен на области, состоящие преимущественно иа сателлитных последовательностей, и участки, представленные среднеповторяющишся элементами генома (бега-гетерохроматин). В последних локализован ряд генетических локусов (кластеры генов рРНК, гены фер-тильности самцов, кластеры генов Stellate и др.,), эти до к/с ы представляют собой тандемные кластеры определенных геномных повторов. Такое своеобразие молекулярной структуры гетерохроматических локусов может быть указанием на специфические осо-. бекносги их функционирования или может отражать определенные пути эволюции последовательностей ДНК в гетерохроматике. Исследование протяженных районов бета-гетерохроматина представляется необходимым как для понимания молекулярных механизмов формирования подобных структур, так и для изучения их возможных функций в геноме. Структурные исследования является основой для изучения характера изменчивости бета-гетерохроматина в эволюции и в онтогенезе дрозофилы.

Задачи исследования. Целью настоящей работы являлось клонирование и исследование протяженных районов гетерохроматина X хромосомы Drosophila nelanogaster,характеристика элементов генома, составляющих эти районы,и анализ состояния описанных районов гетерохроматина в пересеваемых культурах клеток и в разных линиях D. melanogaster.

Научная новизна результатов исследования. Впервые клони-

рованы протяженные районы гетерохроматина (около 70 т.п. н.) X хромосомы D. melanogaster и исследована их структурная организация. В составе районов идентифицированы мобильные элементы copia-like (включая МДГ1) и LINE типов,а таюке фрагменты кластера генов рТЕК выявленные структурные особенности исследованных участков позволяют предположить, что в их образовании важную роль играла такдемная амплификация элементов кластера генов рРНК, которая сопровождалась иксерцилми мобильных элементов и делециями протяженных участков ДНК Показана различная по степени амплификация ряда сходных между собой по структуре районов гетерохроматина в пересеваемых культурах клеток,причем степень амплификации различается для разных районов гетерохроматина и для различных культур клеток. Исследование гетерохроматического структурного варианта ретротранспо-зона ВДГ1(ЩЦЧгет) показало, что варианты семейства МДГ1 дивергировали в процессе эволюции вида под давлением отбора ка способность к транспозициям, а интеграция и иммобилизация ЦЦГЧгет в гетерохроматике произошли в последний отрезок времени эволлции вида.

Практическая ценность. Клонированные районы полезны при полном физическом картировании X хромосомы D. rrelanogaster в свете проектов, посвященных исчерпывающему исследованию генома D. melanogaster.

Апробация работы. Результаты работы были представлены ка 12-й Европейской конференции по дрозофиле (K^inz,1991), и на 1

-й Всесоюзной конференции по генетике насекомых (Иэсква,1991).

Объем диссертации. Материал диссертации изложен на _

страницах машинописного текста, содержи _ рисунков и _

таблиц. Список цитированной литература состоит из _работ.

Основные результаты получены автором самостоятельно. Ряд экспериментов был выполнен совместно с С. В. Нуздиным и Е. В. Беневоленской. Часть клонов и информация о них была предоставлена Ю. Я Юзве левым. Результаты по гибридизации in situ получены совместно с Е. Сп. Беляевой.

• Материалы и методы.

Плазмиды и микроорганизмы. Для клонирования были использованы векторы 2xpJE8M, pTZ19R, ML3mpl9. Использовались бакте-. риалькые штаммы НВ101, DH1, DH5, JKQ3, JM109, TGI.

Традиционные манипуляции с нуклеиновыми кислотами (клонирование в космидах,субклонирование, введение радиоактивной метки в ДНК,определение нуклеотидной последовательности и др.) проводили по общепринятым методикам (Sambrook et al. ,1989) с модификациями.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОЕСУДЦЕНИЕ

I. Клонирование протяженных (около 70 т.п.н.) районов ге-терохроматина.

Космидная библиотека линии НА 6+ D. melanogaster была создана с использованием вектора 2xpJE8№ Анализ примерно 20 тыс

клонов методом гибридизации in situ с использованием в качестве зонда фрагментов ретротракспоэона МДГ1, клонированных в фаге М13шр19 (Кувакина и др. ,1989).выявил 46 космид,несущих ЩЧ.Гибридизация полученных космид in situ с политенными хромосомами слюнных желез личинок D. melanogaster позволила отнести большинство клонов к гетерохроматину дрозофилы. Гетерохроматическая природа клонов была косвенно подтверждена их насыщенностью повторяющимися последовательностями, что было показано при блот-гибридизации клонов с меченой геномной ДНК D. melanogaster. Число таких предположительно гетерохроматических клонов существенно превышало количество копий МДГ1, локализованных в гетерохроматине , что позволяло надеяться,что некоторые копии МДГ1 в гетерохроматине были клонированы многократко. Зто открывало возможность построения контиг из космидных клонов в гетерохроматине и, следовательно, описания структуры протяженных районов гетерохроматша.

Рестриктный анализ и перекрестные гибридизации космид с использованием Саузерн-блоттинга позволили выявить две группы перекрывающихся косшд, происходящие соответственно из двух разных участков генома. Все такие космиды содержат определенный вариант ЦЦГ1 - ЩГ1гет,все или почти все копии которого,как было показано.содержатся в гетерохроматине, недореплицирующем-ся в политенных хромосомах слюнных желез личинок (Shevelyov et al. , 1990). Одна группа перекрывающихся космидных клоков представлена 7 космидами (рб-02, рб-lS, рбШ.1, рб-Шб, рб-ШЗ,

рб-1429 и рб-МЗЗ); другая - 8 космидами (рб-МЗ, рбМ-4, р6-№, р6-М1Б, р6-М18, рб-М19,а также,скорее всего, рб-М31 и р6-М37). Космиды из последней группы оказались сходны с космидными клонами из библиотеки линии D. melanogaster НА 171, (Shevelyov et al. ,1990).Цри анализе района гетерохроматина.соответствутащэго этим космидам, били использованы предоставленные Ю. Я. Шевелевым космидные клоны р171- 29 и р171-31.

II. Построение рвстриктных карт перекрывающихся космидных клонов и реконструкция двух протяженных районов гетерохромати-на.

Рестрикгные карты космид были построены по результатам: полной рестрикции рядом рестриктаэ; гибридизации Саузерн-бло-. тов рестрицированной космидной ДНК с субклонировакными фрагментами космид; определения последовательности расположения сайтов рестрикции при неполном расселении рестриктазами. В последнем случае после исчерпывающего расщепления космидной ДНК рестриктазой,имеющей 1-2 сайта узнавания (в данном случае рестриктазой Sal GI),образовавшиеся фрагменты подвергали неполной' рестрикции рядом рестрикгаз. Применяя Саузерн-анализ продуктов рестрикции с использованием в качестве зондов фрагментов космидной ДНК, прилежащих к концам Sal 01 рестриктов.ма выявляли последовательность расположения сайтов узнавания рестриктаз,использованных при неполной рестрикции.

При идентификации элементов генома, составляющих описываемые районы, исходили из сравнения последовательностей,получен-

ных при сёквенировании фрагментов косыид.с известными последовательностями ДНК и из результатов гибридизации идентифицированных фрагментов с Саузерн-бюгами рестрицированной космидной ДНК. Поиск гомологий с известными последовательностями ДНК осуществляли при помощи пакета программ PC/Gene,укомплектованного базой данных EME3L 1990 г. Таким образом были идентифицированы фрагменты рДНК,включая инсерции I и II типа в ген 28S рРНК, а также G элемент. Элемент GATE был идентифицирован благодаря совпадению структуры части описываемого района со структурой гетерохроматического клона G9,описанного ранее (DiNocera et al., 1986) (см.Рис.2).

Картирование космкд р6-№,рб-й28,рб-Ш9,а также рб-Шб и сопоставление полученных рестриктных карт позволили реконструировать район гетерохроматина протяженностью около 70 тпн ко- -торый будет в дадьнейшем именоваться "районом инсерций" (рис.1) . Большую часть данного района образует тандемный повтор иксерций I типа в гены 28S рРНК, ограниченных короткими СЗЗ п. к. ) фрагментами гена 28S рРНК. Одна из копий повтора содержит инсерцию ВДГ1. Справа повтор оканчивается участком гена 28S рРНК, прерванным последовательностью инсерции II типа в гены 28S рРНК (Рис. lb). Эта структура, по-видимому, образовалась в результате делеции в кластере генов рРНК за счет разрывов в 28S рДНК и инсерции II типа. Слева тандемный повтор инсерций I типа прерывается неидентифицированнойи последовательностью, к которой прилегает фрагмент ретротранс-

-Р6-Н20 -рЫ19

• Р6-Н128

,1ТПН Н Н HS Н 5 н н НН НН Н Н SHH

1 1 м11*П* I I I I III Ii II I 11

шшшмт;//жш$ шш, щж

I i т.п.«.

В RR В В R RRRB В В В Б

I RR

-Р6-И16

утеренЩШ*; :'<nts ¡8 R R Н Н

/

/

Jita

Рис. l.a. Структура клонированного в группе перекрывающихся космид протяженного (70 т. п. н.) района гетерохроматина ("района инсерций"). Сверху указаны обозначения и протяжэн-ность космидных клонов. Ь. Увеличенное изображение отдельных участков района и гипотетическая структура предкового фрагмента кластера рдКК (указана ниже), предполагаемая делеция обозначена прерывистыми линиями. Отрезками указаны специфические для данного района гетерохроматина BarrHI-EcoRI фрагмента Белым цветом обозначены неидентифицированные последовательности. Сайты рестрикции : R, EcoRI; Е, BamHI; S, Sali; Н, HindiI

поэона GATE. Часть копии GATE делетировака, и оставшаяся последовательность GATE граничит слева с неизвестной последовательностью, включакяэй прямые BairHI-EcoRI повтора

Другой район гетерохроматина ("Stellate-содержащий район", см. Рис. 2) был ранее клонирован в ряде космидных клонов и частично исследован Ю.Я Щавелевым .Было показано,что в левой части района присутствуют Два гена Stellate, причем один из генов несет инсерции ретротраксшзонов ЫДГ1 и aurora. Такие было показано, что в геноме мух содержится около 5 копий клонированного в космидах района, которые могут различаться друг от друга наличием делеций и/или иисерций.

Наши исследования имели целью изучение структуры разных копий района, клонированных в космидах. Для исследования были выбраны космидные клоны р171-31 и pi71-23,соответствующие разным копиям района,а также космида р6-Ш.9,которая, близка по структуре,но не идентична кос мзде р171-31 (см. Рис. 2).

Сопоставление структур перекрывающихся космид позволяет реконструировать район гетерохроматина, который можно рассматривать как предшественник других дивергировавших копий, клонированных в отдельных космидах. Район фланкирован тандемными повторами инеерций I типа в гены 28S рРНК, ограниченных 33 п. н. фрагментами гена 28S рРНК.. Один из тандемных повторов инеерций I типа, расположенный справа, оканчивается 3'-фрагментом гена 28S рРНК с примыкающим к последнему нетранскрибируе-мым спейсером рДНК (nts). Центральную часть района занимает

Рис. 2. Структура клонированных районов гетерохроматина, содержащих гены Stellate. Указаны названия' соответствующих клонов и предполагаемая предковая структура района. 69, клон, описанный ранее DiNocera et al. (1986). Сайты рестрикции : G, Bglll; остальные как на Рис.1. Использованные в качестве зондов при Саузерн-аналиае геномной ДНК фрагменты элемента SATE из космиды р171-29 указаны цифрами : 1, Hindi 11 фрагмент, 2, EcoRI фрагмент. 1а-1 с, 2a-2d : EcoRI фрагменты, выявляемые соответствующими зондами.

вырожденный тандемный повтор двух единиц, имеющих структуру nts - элемент 6 с инсерцией элемента GATE - nts, причем левая единица этого повтора частично дебетирована, в результате чего последовательность 6АТЕ соседствует с повтором генов Stellate. Левая копия Ste прерывает тандемный повтор иксерций I типа в гены 2SS рРНК.

Исследование разных копий Stе11atе-содержащих районов выявило рестрикгный полиморфизм меаду ними, возникший благодаря делециям и, еозможно, нуклеотидкым заменам. Это позволило в дальнейшем идентифицировать отдельные копии таких районов при Саузерн-анализе геномной ДНК.

Изучение структуры протяженных районов гетерохроматина позволило сделать предположение, что в основном они образовались из фрагментов кластера генов рРНК,элементы которого подвергались тандемной амплификации ',; амплифицировались также элементы рибосомального кластера с интегрировавшими в них мобильными элементами (нетранскрибируемый спейсер с инсерцикми элементов 6 и GATE ,Рис. 2). Определенную роль в образовании специфической структуры районов играли также делеции протяженных участков ДНК ; подобная делеция сблизила фрагменты генов 28S рРНК (см. Рис.1) и,как мы предполагаем, делеции же объясняют соседство тандемного повтора генов Stellate с Элементом GATE и повтором инсерций I типа в ген 28S рРНК (см. Рис. 2). Механизм тандемной амплификации фрагментов кластера рДНК неясен. Возможно, определенную роль играют образование экстрахромосомных ко-

пий рДНК при компенсаторной амплификации (Tartof,1973); такие зкстрахромосомкые фрагменты кластера рДНК могут интегрировать в гетерохроматин. Эти фрагменты рДНК могут быть вовлечены в процессы амплификации, подобные происходящим при магнификации числа цистронов рРНК (Hawley et al.,1989). tern представить , что делеции протяженных участков ДНК ассоциированы с тандемной амплификацией рДНК и, следовательно,оба эти явления отражают действие механизмов, участвующих в образовании бета-гетерохро-матина D. melanogaster.

Все мобильные элементы, участвовавшие в образовании изучаемых гетерохроматических районов, в настоящее время иммобилизованы в гетерохроматике D. nelanogaster. Это показано для элементов G , инсерций I и II типа в гены 28S рРНК , а также для aurora и GATE . Однако, для ¿ЩГ1 отмечается наличие мобильных копий в эухроматине . Б то же время, все копии определенного структурного варианта МДГ1гет, присутствующего в исследованных районах гетерохроматина, иммобилизованы в гетерохроматике.

HI. Изучение гетерохроматических копий ретротранспозона

ВДк.

Рестриктные карты двух копий ЦЩЧгет из космидных клонов Р171-31 и рб-Ш8 сходны и отличаются от карты мобильной копии ЦЦГ1, ВДЧтр, клонированной из генома пересеваемой культуры клеток в плазмиде Dm58 (Рис.3). Наблюдаемые структурные различил ВДЧтр и ВДГ1гет можно объяснить,исходя из двух раз-

„.....1 т } штач

ЕюМ

Ь_1

1кЬ

Рис.3. Рестриктные карты двух структурных вариантов ВДГ1: ВДИгет и От58,.ДКП зачернены,области ОРС маркированы точками. Стрелками указана стратегия секвенирования МДИгет; стрелка с заостренным концом вверх - секвенирование по методу Сэнджера.с заостренным концом вниз - по методу Максама и Гилберта. Сайты рестрикции: 6,Ве1П; й,ЕсоЯ1; Н,Шпс1Ш; С,С1а1; Х,ХЬа1; К,Крп1; И,Ыс!е1; В, Бзрй1. Указан лишь сайт &вр1?Г, использованный при секвеяировании. Расположение сайтов С1а1, ХЬа1,Крп1 и в несеквенированной области не проверялось.

ных предположений. Либо предковая копия МДПтр превратилась в МДПгет, будучи в течение длительного времени иммобилизованной в гетерохроматине.либо два подсемейства ВДГ1 ,ЭДДГ1гет и МДПтр, эволюционировали независимо от общего предка,периодически перемещаясь и находясь под действием отбора на сохранение способности к транспозициям.. Для разрешения этой проблемы мы сек-венировали 2.5 тик с 3*- конца копии ВДГ1гет иэ рб-М28 (включая половину ОРС2 и З'-ДКП) и сопоставили нуклеотиднуя последовательность с последовательностью способной к транспозиции копии МДГГиз клона Dm58 (Аведисов и др. ,1990), Рис.4). Оказалось,что 35 нуклеотидных замен и одна микроделеция не нарушают 0РС2 в ЫДПгет.Из 35 замен в этой OFC 24 являются синонимическими. Девять делеций размером от 1 до 145 пн,две 3 пн вставки и кухлеотидкые замены в 3' -некодирущей области и ДКП МДПгет не нарушают известных регуляторных участков ,хотя одна из делеций (1919 - 2064 н ,Рис.4) удаляет 10 из 11 единиц тан-демного повтора, который, как бьшо показано, связывается с ядерным белком (Черкасова и др. ,1990).

Частичное секвенирование левого ДКП ВДПгет показало,что ДКП МДПгет сходны между собой и а шлет ко отличаются от ДКП 0ш53 .Сравнение последовательностей ДКП выявило 1Z дивергенции, между ними (1 замена и 1 микроделеция ,Рис.4). Такая дивергенция является,скорее всего, результатом замен,произошедших уже после интеграции ретротранспозонов, поскольку только что интегрировавшая копия должна иметь идентичные ДКП (Archipova et al. ,1989).

D.W lijUlt

Hi»4IIl 203 Í.58 AAGAAGCITI ACAAÍAG5CC AAAGTAATAA GTCCACTACA GAGCAGGAGC ТММ5ШТ TCACTGGGCA ATAAATCACT TCAGACCATA CCTATAJGGt •Jjlhit---------------------------------------------------------------------------

Sir Prl 309

O.M А0АСАПТС1 TAGTACAAAG TGACCA7KS ССАСТАГСАТ АТСТГТШС AATGASAAAC CCCAGTTCAA AATTAACCAG AAIGAGACTA GACTTGGACS

« <l9il.it------------------------------------------f-------A---------------------------

Sir - Pre

Fht Cum T/t Vil All Sir ÎKr All III 400

Oi58 AGTTCGAAir CACAGTAGAA TATCICAUM CCAAACATAA ICATGTCGCA 6ACCCATIQI ICCOAATAAC AATCGGAGAA CTTAAAGCAA IAAAIASAC/t

l>bi Tyr «il «la Fit Tkt AU litt

«il SirTbrTtir Clu »0

0lS3 CATACTAAAG GÍAACAACAA GAICAACAAC AACACAGAAA AATACCTGCG CAGOTCAAAA ATTGCAÎGAA CCAAATCAGA AAGAAAATAT ААААЛТСССС

Val . Sirtkr lyt

A» lyt Li« «In MO

D.53 AATATCTATC AGSTAATCAA TAACATTGAT СССШАААТ ATGTTATACT CAAAATAGAC AAGCATAAGT ÍTTTGTTGAA AAGAGGAAAA СААА1ГАШ

•Ijlhit.......................t...........-........—.....-.......A--------*----------С-------

Ask Lys lu His

Cía I - Ж 5«53 CACGTTTTSA TATGACTAAT 1ТТШТСТА ATGAAAÎAAT CGATTTAGAT СААТТСГПС AAAGGCTTAA TGAAGAAGCA AGAAÎAAAIA GCATUTTCi líglbti..........................-..............................................................

Asi Am 84<

Si58 «ACACAATIG КАССАМ TG ААСАААГСТТ CGAATTtGtC ACTATHAAGA ACWAAAGA ШККШ АДААГАСШ AAAATTTAAA AATACCGCfi

As» Asi

«al Pu №

tl53 TÎAAACAAGO TGACTAAGAT AGATAAAAAT CAIAAGGTK AAATAAAAGC AATACTGTCT AAATATCAIG ATÍAICCATC AGAAGGAGGC CATTCAGGAi

lt|llit------С----------------------------------------G----------------

All Pit

IUI A

[»53 mCTAGAAC CCTÍAGSAÍA АТ5АААААСГ «ТГ5ГГ5ГИ GCCACÍAATS ACGAA6GCCA T/.ASIGÍA7A ТС Г Ti А А АС А ГСТГГСАААТ STCAÍCAÍC .49ll.lt ^

lyi II«

Dl» CAAGACTACG AAACATACTA AAACACCGTT GACAATAACA CAAACGCCAS САЛСАССШ TGATAAAGTT TTGATAGATA CCATTGGTCC ACTGCCAAG

III

KpílPr« 12«

Oisa KA5AAAACÍ СААА1ШМ TÍCWTTACT ДТСАГГ ТО ШШСШ ATATTTGGTA АСШАССАА T ICC AAA TÍA AA5TCCAAAA TCAGTTGCJ

Pri

Mi 1кг Im

Otia AGGCTATATT CGAAAATTTT AfTCTAAAGT ACCGfCCAAT GAAAICAAIC ACAACGGACA TCCSAACGGA АГАТАААААС CAAATIATAG ACGACCTAT6

Vi! II« Ii«

Vil I400

Di» САААШАТС AAGATAAAAA ACATTACTTC AACAGCACAC CATCACCAGA CATTAGGAAC AGTAGAACGA AGTCACAGAA СТПСААССА CtATGTTCGC

II'

Cli Nil

t<53 ГСАТАГАШ CTSTTGACAA AACCGAHGG GATATATGGA ТАСААТАГТГ ГАСПАИОТ ТГСЛАСАСАА САССАГСССТ AGÎTCATCAA ТАИ6ТССАТ

As,

Alf 1«Ю

Ii» ATGAATTAGT ATTTGGAACA 1TACCAAGAC AGT1CATAGA TITIAACAGG A1AGACAGAA TASATCC1AT TTACAACATG GATGAÎÎATT CAAAAGWT

A»

Arj lyi Alt ■

C.58 TAAGCTACGA TTAGAAATAG CATATAGAAG AGCTAAAAAT ATGTIAGACA AGGCAAAAGC CGATAGAAAG ATAAAATAIG ATAGAAATAT TAGTAACTTT •ijlbit------A-----------------------------A-------------------Г—

Arg '' lys Ai»

lyi 1300

Di5S GAATTAAAGA TAGGAGATAA GATATIACTT AAAAACGAAA CGGGTCATAA ACITGACAAT AATTATTTA6 GACCATAIII AGTTTCAGAA ATAG5AGAT«

ir»

l<« itip Si»*I

D.59 ATGACAACAT ТАСДАПАТА GGAAAIAAAA ATAAAAAACA GATAGTCCAf AAASATAGCr ТААДДАТТТТ TAATTCATAA ТАСАГТП51 tIGGtlSCCC ■djli.lt .................................................С---------------------А-----

Im

2000

Ш UCCHCAÁAI ШШССК Ш1ШШ шешш шкеки ШАШКС кшиш ААССАСАШ ШШССК А1АШШ» idjIWt-------------M mi«»«« мшим» ними» инин« шиши минин шиши iiiiiiiim

2190

0t53 ССКШШ Ш1ССКМ АШАШСС АСАШША MJKMMM ! ПАПУШ ДССААТАААА ДСАТТДТААТ АСАШСПТ TACTTTGCAA

■4jlblt IIHIHIII llllllllll •I<<<I1II< <11111(111 III<I<I<II I<I<I<IIII KU-------Д---------- -KltMlli

21»

D«58 ААШААГСА ДААГДТАГА1 АТППТТТА AÎAICTCÎTT ААТСАТТСАГ TTCAAATATT AATGTACATT TAAAAAAAAA АААААААД" »tATTAIAtA <4gllitt <<1<11<1<1 кшиш mini— ----— -С---------—А----С Ct--------C-AT I--

II---rlTR ' 2300

D.58 CTTGAAAATA ACTTCATGTT ATTAC6TTAT TTItlCAAAA GGAGGGAGAT «TAGIAIAtA ССШАТААГ ААСАДШТД Д1ААСАД1АА TAinATAAT •ijlliit I---------А----------»---------Г---T---T--ГАТ5--

2«W

C<53 ШАТШТА АТШГАШ TAICAATCAt ШШААСТ СААСШТАА GTAAACTTii САССАССШ ТГССТТАСС5 КАССС1Д5Т ДСАТСТШ5 •dfllitt----------------«»III llllllllll tlKI*----------—J *--------—irillfrr IINWIII

£»8! ¡300

С«58 ДТАСАСССТ» 1ТДСТАМТА ГСССАДГГСА «САГ5ГАС6С сгтшиг сидасмс ГСССДПИТ ШССА6ГА1 СМСТТСДТД САТАСАТАГТ

ни......с-----1-----------е~ т------1- --С—с------и-----а---------------------»

цщ,1 ---------------

—ММ 2М0

ия ссдсшггс шггегсд« сдсписк гскит гстсссгсгд «дссдсаста тиши г/идгсдш шсагсасо итюа

•4)1 к>1---------------------в-С---С-------С- -Г-----в-----------------«

11Ш.1-------1-------------------5-4.....1---------С- -I------С------------------а

ш ссспдша ааассдиага аасагаша пжсмсн свпши сгттшс гасагсша бшгдсддг гсдааггадс [аса

Т—(-------------------Г-----6-?-- —----СТ -С-1—Ш1 1Н»«Н1 кшшм «*>•>----—

ШЯМ I—6---------------—I-----в-Т—------И -{-»—•••• Инин» шиши 1Н»|------

Рис.4. Сравнение последовательностей двух вариантов ИДЛ. Последовательность ЫДГ1тр(0п68,. ) сверху, МДПгет - снизу (представлены лишь от дичащиеся нуклеотвды ). Указаны аминокислоты в местах нуклеотидных замен. Делеции обозначены звездочкой; тандемно повторенный 14-нукдеотидный мотив в 3'-некодирую-щэй области выделен курсивом. Указано начало правого ДНП

(//--г1ЛК) и место инициации транскрипции (— >ИМ, сигнал инициации транскрипции и +30 коровая последовательность подчеркнуты; сигналы полиаденилирования подчеркнуты

дважды. Приведен также фрагмент последовательности левого ДКП МДПгет (И-Гй-еО Указаны сайты рестрикции, использованные при секвенировании. Последовательность 0л£8 исправлена на участке 900-1100 в на основании наших данных.

Близкое сходство левого и правого ДКП МДГ1гет при их резком отличии от ДКП Dm58 указывает на то,что дивергенция ВДПгет и Dm58 произошла в основном до интеграции копий ВДПгет в гетерохроматин. Существенно меньшее среднее количество замен в ОРС (2 %) по сравнению с 3' -некодирующей областью и ДКП (9%) подразумевает действие отбора на эволюцию вариантов МДИ, 2/3 синонимических замен в кодирующей области и интактность регуляторных элементов в МДПгет свидетельствуют о том же. Поэтому мы предполагаем, что два подсемейства ВДГ1,МДГ1гет и МДИтр, дивергировали, сохраняя способность к транспозициям.

IV. Локализация исследованных районов гетерохроматина в геноме Р. rrelanogaster.

При локализации районов гетерохроматина использовали линии дрозофил с делениями разных участков гетерохроматина X хромосомы,а также межвидовые гибриды D. melanogaster-D. sirnulans, не содержащие X хромосомы D. ¡relanogaster (последние любезно предоставлены М. Д. Балакиревой). Для выявления разных копий района, содержащего гены Stellate, использовали рестржтный полиморфизм между этими копиями (см. Рис. 2).

Саузерн-анализ показал ,что EcoRI-BamHI фрагменты,специфические для района инсерций (Рис.1, фрагменты А и В),отсутствует в ДНК гибридов D. melanogaster-D. sintulans, содержащих все хромосомы D. nelanogaster, кроме X хромосомы. Stellate-содержз-

Gft/BSsc4scBnel/sm

la —

2a- EUEZ3C3

2d—

Рис. 5. Локализации Stellate-cofiepiiamHX районов гетерохроматина в геноме D. irelanogaster. Зонда, использованные для гибридизации, характерные для определенных районов фрагменты и их размеры в т. п. н. указаны, как на рис. 5. Вверху дакы обозначения источников геномной ДНК; GA/BS,GA90/BSY; sc^sc8,sc"'scÎA; т/ s, аутосомный гибрид D. melanogaster/D.simularis JCXsimYmîl; C(l), C(1)DX.

щие районы били локализованы с помощью зондов, представляющих собой фрагменты э лежит a GATE. ДНК гибридных мух не содержала EcoRI фрагментов la, lb и 1с (см. Рис. 5),характерных соответственно для всех трех, двух и одной из клонированных копий района (см. Рис.2). Следовательно, все описываемые районы локализованы в гетерохроматике X хромосомы D. rrelanogaster, а основная масса копий элемента GATE рассеяна по гетерохроматину других хромосом.

Для более тонкой локализации использовали мух, несущи де-леции разных участков гетерохроматика длинного плеча X хромосомы (Рис.5).

В ДНК мух sс sc количество EcoRI фрагментов,характерных для ряда копий Stellate-содержащих районов (фрагмент 1Ь' на Рис.2), сильно уменьшено (см.Рис.5).Этого не наблюдается в линии C(l)Dx. Данные указывают на то,что часть копий Stellate-co-держащих районов локализована в Х-гетерохроматике дисгальнее кластера генов рРНК, но проксимальнее точки разрыва "scl(Fnc. 7).

Фрагмент 2с (Рис.2), характерный для одной из копий Stellate-содержащего района, клонированной в космиде р6-М19

• л

(фрагмент 2с на Рис. 2),отсутствует у мух GA90/B Y, ко имеется у мух sals<?"(P4c.5). Это позволяет локализовать данную копию района,содержащего Stellate,в дистальном гетерохроматике X хромосомы между точкой разрыва scSi границей материала Х-гете-рохроматина,содержащегося в BSY (Рис.6).

EcoRI фрагмент,характерный для Stellate-содержащего райо-

hD

hC

hB

hft С

Э YXD.

ШШЖ

Xh-Ste Xh-АБО or HOR

Sat 1.6S8

Ю

X-Y

ТСАНСЛ0КМ1Ш

— nil/sin

SC4LJCER С1Ш

M1«H 2-3IWI*

wSixm P171-31 рб-МР Sta-ссдажАЩК мйоное

Рис.6. Гетерохроматик Х-хромосомы D.melanogaster.Указаны цитологически выявляемые блоки гетерохроматика hA-hD; С -центромера. Показано расположение известных генетических локу-сов и кластеров повторяющихся последовательностей : Xh-Ste, кластер генов и/или псевдогекоз Stellate; Xh-AEO, abnormal oocyte; cr, compensatory response; NOR, кластер генов pPHK (ядрьаковьй организатор); Sat 1.633, кластер сателлита 1.638.

Жирными линиями показаны делеции гетерохроматика в разных линиях дрозофилы, высветленные линии указывают неопределенные концы делеций. Линии дрозофилы обозначены как на Рис. 5.

Внизу показана локализация ряда исследованных районов гетерохроматика, указаны названия соответствующие космидных клонов.

на, клонированного в космиде р171-31 (фрагмент 2d на Рис.2) и фрагменты, специфические для района инсерций.нэ удаляится деле-

AL 8й

цией sc зс и в то же время присутствуют в линии мух с делецией GA90 и дупликацией BSY (Рис.5), т.е. указанные районы могут быть расположены в дистальном Х-гетерохроматина,присутствующем в Bs Y (см. Рис.6). Локализация этих районов проксимальнее кластера рДНК маловероятна, поскольку X;Y транслокации, включающие лишь дистальнуи часть Х-гетерохроматина, сохраняют описываемые фрагменты.

Полученные данные позволили сделать вывод о локализации всех исследованных районов генома в дистальном гетерохроматине X хромосомы.

Амплификация районов гетерохгюматина в пересеваемой культуре клеток "P. melanogaster.

Амплификации районов гетерохромагина в культурах клеток D. mslanogaster исследовали при помощ Саузерн-анализа геномной ДНК из культур клеток и из мух разных линий D. iralanogaster (Рис.7). В качестве зондов использовали фрагменты ретротранс-позона 6АТЕ, практически все копии которого иммобилизованы в гетерохроматине D. melanogaster. Количественные значения степени амплификации получали после сканирования автографов на лазерном денситометре и нормирования площади пиков относительно результатов, полученных при контрольной гибридизации с геном алкоголъдегидрогеназы.

Эксперименты, проведенные ранее А. И. Калмыковой,указывали

на амплификации районов гетерохроматина,содержащих гены Stellate, в пересеваемых культурах 67J25D и Gehring-2.

Нам не удалось ' ' показать амплификацию в культурах клеток фрагментов, специфичных для "района инсерцпй". в то же время, количество EcoSi фрагмента,характерного 'для всех копий Stellate-содержашэго района (фрагмент 1а, Рис.2) 'резко (в 6 pas) увеличено в ДКК культуры клеток 67J25D по сравнению с ДКК мух линии НА. 171; отличия меньше при анализе культуры Кс (в 2.5 раза) и отсутствуют в культуре Schnei de г-2 (см. Рис. 7). Следовательно, степекь амплификации Stellate -содержащих районов в целом различается в разных пересеваемых культурах клеток. Использование рестрактного полиморфизма дало возможность проследить га амплификацией отдельных копий,клонированных в космидах р6-М19 и р17131 , для которых характерны EcoRI фрагменты 2с и 2 d соответственно (см Рис.2). Оказалось,что копия Stellate-co-держащэго района, клонированная в космиде рб-ШЭ, сильно ( в 78 раз) амплифщирована в культуре 67J25D.B меньшей степени (в 2 раза) - в культуре Кг и не амшшфицировака в культуре Schnei der-2, т.е. ее поведение в этом плане совпадает с таковым большинства копий района. Клонированная в космиде р171-31 копия также сильно (в 4 раза) амплифицирована в культуре 67J25D и,в отличие от большинства копий района, включая клони-ровакнуз в космиде р6-ЬЙ9, аышшфщирозака в 2 раза в культуре Sehneider-2. Поведение ее в культуре Кс неясно,поскольку в данном случае специфический EcoRI фрагмент отсутствует (см. Рис. 7).

D Ко Sehn

6 171 D Kc Sehn

leib-

» Ea v* "пд к-'сия

2b_ ==i

— --вага»

-6

-3

-l

2a— □□□□□

2i---- t

Рис.7. Амплификация Steilste-содержали райокоз гетерох-роматина в пересеваемых культурах: клеток, а. Результаты Сау-зерн-анализа рестрицированной EcoRI геномной ДНК с использованием в качестве зонда фрагмента 1 космиды р171-23 (см. Рис.2), Ь. - то же с фрагментом 2. Цифры справа указывают размеры фрагментов в т. п. н., слева указаны характерные для исследованных районов гетерохроматина фрагменты. Вверху даны обозначения источников геномной ДНК; линии мух : 5, НА б+; 171, НА 171; культуры клеток : D, 67J25D; Kc, Kc; Sehn, Schneider-2.

По данным А.И. Калмыковой, в онтогенезе дрозофилы ке происходит изменения числа копий Stellate-содержащих районов ге-терохроматина. Анализ геномной ДНК мух 15 разных линий D. melanogaster показал, что количество копий таких районов не более чем в 2 раза превышает их содержание в геноме линии НА 171. Поэтому наблюдаемое резкое (в 4-7 раз) увеличение числа копий Ste1late-coдеряащих районов в культуре 67J85D не может Сыть объяснено за счет мехлкнейкого полиморфизма или соматических перестроек генома в исходных клетках культуры.

Из приведенных данных южно сделать вывод о различной по степени амплификации копий района Х-гетерохроматина, содержащего гены Stellate, в геноме пересеваемой культуры клеток D. melanogaster 67J25D. Надо заметить,что наблюдаемое явление не отражает тотадьнуо амплификации Х-гетерохроыатина Действительно, по крайней мере "район иксерций" ке амплифицирован в культурах клеток, как к рДНК (данные не приведены). Использованные при Саузерн-анализе зонды представляют собой фрагменты элемента GATE, практически все копии которого диспергированы в гете-рохромагине других хромосом (см.выше); анализ автографов показывает, что лишь немногие участки генома, содержащие GATE (т.е. участки гегерохроыатина), ашлифицированы в культурах клеток (см. Рис. 7). Ш нашш данным,рДНК также не подвергается амплификации в культуре клеток.

- Полученные данные говорят об избирательной амплификации

определенных районов Х-гетерохроматина (а именно, Stellate -содержащих) в геноме культуры клеток. Заметим, что эти районы были амплифицированы также в ходе эволюции вида, поскольку присутствуют в геноме в числе примерно 5 копий.. Возможно, способность к амплификации определяется особенностями строения таких районов, хотя анализ их структуры (Рис.2) не выявил принципиальных отличий от неподверженного амплификации района инсерций (Рис.1).

Анализ структуры клонированных в космидах копий Stellate-содержащего района показал, что они были амплифицированы в ходе эволюции Еида в составе области генома, превышающей по размеру 70 т. п. к. Мы считаем, что подобный размер имеют и участки гетерохроматика, амплифицируюшдеся в культурах клеток.

ВЫВОДЫ

1. Клонированы в составе перекрывающихся космидных клонов протяженные районы бега-гетерохроматина D. melanegaster (около 70 т. п. н. ).В их составе выявлен ряд сор i а-подобных мобильных элементов (включая МДГ1).а также элементы LIME типа и фрагменты кластера рДНК. Структура описанных районов свидетельствует о том,что тандемная амплификация элементов кластера генов рРНК и делеции больших участков ДНК ,а такжэ иксерции мобильных элементов вносят определяющий вклад в формирование специфической

структуры бета-гетерохроматина.

2. Наследованные районы локализованы в дистальной относительно кластера генов рРНК области гетерохроматина X хромосомы П. тэ1апог^ег.

3. Показан структурный полиморфизм гомологичных районов гетерохроматина,что позволило дифференциально исследовать амплификация) отдельных участков гетерохроматина в пересеваемых культурах клеток Ю. те1апооаз1ег. ' Шказако, что определенные районы гетерохроматина в разной степени (в 4-7 раз) амплифици-рованы в геноме культуры клеток 67^0 на фоне отсутствия общей амшпфпсацией гетерохроматина. В разных линиях 0. ше1апо2аз1ег количество копий исследованных районов гетерохроматина сходно.

4.Анализ нуклеогидной последовательности части иммобилизованного в гетерохроматике структурного варианта рэтротранс-позона ВДП (ВДИгет) показал, что два подсемейства ВДГ1 - предок ВДПгет и мобильный ВДП - дивергировали под давлением отбора ка способность к транспозициям.

Список работ,опубликованных по теме диссертации.

1. Кувакина А. Л, Еурмикский Д. И., Коган Г. Л., Гвоздев В. А. Тракскрипты мобильного -элемента ЩГ1 в •• онтогенезе ЮгозорШа те1апо§аз1ег. Генетика, 1988, г. 24,

стр. 1234-1239.

2. Нурминский Д. К , Шевелев Ю. Я., Катукова А. И. Получение однонаправленных делеций в плазмиде -с .помощью ДНК - "протектора" и экзонуклеазы Ва131. Биорганическая химия, 1989, т. 15, стр. 1137-1139.

3. Nurminsky D.I., Sheveljov Yu. Ya., Gvozdev V. A. The structure of distal X heterochromatic region of D. melanogaster. 12th European Drosophi la Conference,Mainz. 1991, Abstract book, p. 273.