Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сальмонелы: вирулентность и иммуносупрессивные свойства

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Сальмонелы: вирулентность и иммуносупрессивные свойства"

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ КИЇВСЬКИЙ НАУКОВО-ДОСЛІДНИЙ ІНСТИТУТ ЕПІДЕМІОЛОГІЇ ТА ІНФЕКЦІЙНИХ ХВОРОБ ім. Л.В. ГРОМАШЕВСЬКОГО

МОЛОЖАВА Ольга Станіславівиа

САЛЬМОНЕЛИ: ВІРУЛЕНТНІСТЬ І ІМУНОСУПРЕСИВНІ ВЛАСТИВОСТІ. 03. 00.07. - мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

УДК 579.842. 15

КИЇВ -1998

Дисертацією є рукопис

Дисертаційна робота виконана у Київському університеті імені Тарас

Шевченка

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор БОРИСОВ Вадим Анатолійович, Київський університет ім. Тараса Шевченка, професор кафедри мікробіології та загальної імунології;

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор СШВАК Микола Якович, Інститут мікробіології і вірусології ім.

Д.К. Заболотного НАН України, зав. відділом; доктор медичних наук ЛУКАЧ Інна Григорівна, Київський НДІ епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського МОЗ України, старший науковий співробітник;

Провідна установа: Київська медична академія пісаядипломної освіти.

Захист дисертації відбудеться #&£ » с1998 року

М+о............................................. „..

о ' 7 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради при Київському

НДІ епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського МО;

України (253038 Київ, узвіз Прогасів Яр, 4).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці інституту Автореферат розісланий «р^>> 1993 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради каид. мед. наук

Красюк Л.С.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В інфекційній патології на теперешній час значне місце займають кишкові інфекції, зокрема сальмонельози (Покровский В.И.,

1995). В літературних джерелах неодноразово відмічають необхідність вивчення факторів вірулентності ентеробактерій, в тому числі сальмонел (Popoff M.Y., 1991; Galan J.E., Ginocchio C., 1994; Bloom P.D., Boedeker E.C.,

1996). Вважається, що відсутність ефективних засобів профілактики сальмонельозів пов'язана з недостатнім вивченням вірулентних властивостей.

Вірулентність сальмонел обумовлена здатністю проникати в клітини епітелію слизових оболонок кишкового тракту, паразитувати внутрішньоклітинно та виділяти екзо- та ендотоксини (Бойченко М.Н., Воробьев A.A., 1990). Також відомо, що сальмонели здатні викликати значні зміни в імунній системі макроорганізму, що сприяє їх виживанню в організмі (Пак С.Г. и др., 1988; Покровский В.И. и др., 1990; Groisman Е.А., Ochman H., 1997). Сальмонельозна інфекція, як і бактеріоносійство, призводять до значного пригнічення клітинного імунітету у хворих. Це було підтверджено і дослідниками (Matshui K. et аі., 1995), які вивчали вплив сальмонел та їх безмікробних екстрактів на проліферацію Т-лімфоцитів у інфікованих тварин.

Дані літератури свідчать, що багато факторів патогенності бактерій втручаються в регуляцію імунітету хворого організму (Малов В.А.и др., 1994; Румянцев А.Г. и др., 1994). В цьому плані особливу увагу дослідників привертає ендотоксин (ліпополісахарид, ЛПС) грам-негативних бактерій. (Варбанец Л.Д., 1994; Zivot J.B., Hoffman W.D., 1995; Hirohashi N., 1996). На прикладі шигел були встановлені нові дані про участь нативних ЛПС, що вміщує фільтрат культури цих бактерій, у формуванні імуносупресивних властивостей, які тісно пов’язані з вірулентністю бактерій (Борисова О.В. Борисов В.А., 1997). У відношенні сальмонел це питання ще не вивчено.

Мета досліджень. Вивчення зв’язку вірулентності сальмонел з їх імуносупресивними властивостями.

Основні завдання досліджень:

1. Виявити позаклітинні речовини вірулентних сальмонел, що обумовлюють імуносупресивні властивості.

2. Ідентифікувати позаклітинні імуносупресивні фактори та встановити їх зв’язок зі ступенем вірулентності.

3. Вивчити деякі прояви імуносупресивних властивостей вірулентних сальмонел та їх позаклітинних речовин.

Наукова новизна та значимість.

Вперше встановлено, що як високовірулентні так і низьковірулентні сальмонели та їх безмікробні фільтрати культур здатні пригнічувати клітинно-опосередкований імунітет.

Вперше в культуральній рідині виявлені фактори вірулентності, які володіють властивостями ліпополісахаридів (ЛПС) - високою молекулярною масою, ліпідною природою та специфічністю О-антигену бактерій - і обумовлюють імуносупресивні властивості вірулентних сальмонел.

ВіІСрШС ПСКиЗаНО, ЩО МІЖ БіруЛСНТКІСТЮ СаЛЬМОпСЛ 1 ІМуКОСуїІрЄСйБКИМИ

властивостями їх ЛПС існує зв’язок. В складі нативного екстрацелюлярного ЛПС високовірулентних сальмонел виявлені дві активні імуносупресивні фракції (термолабільна і термостабільна). В складі нативного ЛПС низь-ковірулентних сальмонел виявлена лише одна термостабільна фракція.

Хімічна обробка нативних екстрацелюлярних ЛПС сальмонел фенолом або трихлороцтовою кислотою повністю усуває їх імуносупресивні властивості, але ці властивості можна відновити редокс обробкою. Препарат ЛПС сальмонел, отриманий водно-феноловою екстракцією, не володіє імуносупресивною активністю, однак набуває її після редокс обробки.

Вперше показано, що сальмонельозна імуносупресія може бути перенесена від тварин, оброблених нативними ЛПС-фракціями, нормальним синген-ним реципієнтам за допомогою суміші лімфоїдних клітин, яка повинна вміщати Т-лімфоцити.

Результати роботи розширюють перспективи досліджень нативних екстрацелюлярних ЛПС, контролю їх активності генами вірулентності, дії ЛПС на імунну систему.

Показана можливість отримання препаратів фактора переносу ГСТ (ФП) до ліпополісахаридів, як активних так і неактивних у відношенні пригнічення імунної системи.

Практична цінність. Результати роботи можуть використовуватись при розробці нових методів виділення нативних ЛПС. Препарати ФП, що одержані до ЛПС сальмонел, можуть бути використані для лікування імунодефіцитних станів різної етнології та створення комплексного вакцинного препарату. Результати роботи доцільно використовувати в медичній практиці при призначенні імунокорегуючої терапії при сальмонельозах.

Основні положення, що виносяться на захист :

• Патогенність сальмонел має прояв не тільки у вигляді вже відомих елементів

- адгезивності, інвазивності, токсичності - але й у вигляді імуносупресивності, що проявляється у відношенні клітинної імунної відповіді і гуморальної тимуезалежної імунної відповіді.

з

• Безмікробні фільтрати культур сальмонел вміщують імуносупресивні речовини, які мають властивості ЛПС.

• ЛПС сальмонел різної вірулентності відрізняються за своїм складом: ЛПС високовірулентних штамів вміщують дві активні імуносупресивні фракції, які відрізняються за молекулярною масою і чутливістю до температури, а ЛПС низьковірулентних штамів вміщують тільки одну активну термостабільну імуносупресивну фракцію.

• Нативні екстрацелюлярні ЛПС сальмонел втрачають свою імуносупресивну активність в результаті обробки фенолом або трихлороцтовою кислотою, однак вони можуть бути реактивовані в результаті редокс обробки.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота пов’язана з науковою тематикою лабораторії мікробіологічних та імунологічних проблем біотехнології КУ ім. Тараса Шевченка, тема № 97085 (№ держреєстрації 0197U003569) «Механізми розвитку та регуляції імунної відповіді на антигенні субстанції патогенних та умовно-патогенних бактерій.».

Впровадження результатів роботи. Викладені в дисертації матеріали використовуються при читанні нормативного курсу лекцій з імунології та спецкурсів «Імунопатологія» та «Бактерійна імуносупресія» на кафедрі мікробіології та загальної імунології біологічного факультету Київського університету ім. Тараса Шевченка.

Особистий внесок у розробку наукових результатів. Всі результати одержані особисто автором або з його безпосередньою участю.

Апробація роботи. Матеріали дисертації були викладені та обговорені на науковій конференції викладачів та аспірантів Аграрного університету (Київ,

1997) та Міжнародному Симпозіумі з Вуглеводів (Утрехт, 1997). Робота пройшла апробацію на засіданні кафедри мікробіології та загальної імунології Київського університету ім.Тараса Шевченка.

Публікації результатів досліджень. За матеріалами досліджень, представлених в дисертації, опубліковано 12 наукових праць, з них 4 статті у журналах.

Об’єм і структура дисертації. Дисертація складається із вступу, трьох глав огляду літератури, чотирьох глав експериментальної частини, узагальнення, висновків та списку літератури. Робота викладена на 122 сторінках машинописного тексту, вміщує 13 таблиць, 9 рисунків. Список літератури включає 211 найменувань, з них 153 іноземних.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ Матеріали та методи досліджень

В роботі використовували типові, в S-формі, бактерії роду Salmonella з колекції Київського НДІ епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського, які були отримані від хворих на гострий ентероколіт. Це були низьковірулентні штами S. dublin , S. virchow та високовірулентні штами S. kisangani, S. derby, S.cholerae-suis, S. typhimurium. Ці штами відрізнялися по кератокон’юктивіальній пробі у морських свинок і значенню LD50. Використовували також штами S. typhimurium 415 та 415/307. Вони були сконструйовані в лабораторії генетики вірулентності Московського НДІ епідеміології і мікробіології ім. Н.Ф.Гамалеї (проф. В.М. Бондаренко). Штам S. typhimurium 415 викликав кератокон’юктивіт у морських свинок і був високовірулентним для мишей ( LD50 = 2,9 х 10 3 мікр. клітин), він мав плазміду вірулентності 60 iÀ. Штам S. typhimurium 415/307 не викликав кератокон’юктивіту у морських свинок, був низьковірулентним для мишей (LD5o = 5,7 х 10 8 мікр. клітин) і не мав плазмід. Був використаний також низьковірулентний безплазмідний штам S. typhimurium BL 3759.

Приготування бактеріальної суспензії та безмікробних фільтратів культур (БФК) сальмонел проводили, як описано раніше (Борисов В.А., Фролов А.Ф., 1990). Використовували також комерційний водно-феноловий екстракт ЛПС

S.typhimurium (Sigma).

Імуносорбенти отримували глютаральдегідним методом з комерційних адсорбованих сальмонельозних антисироваток до різних рецепторів О - та Н -антигенів (Диагностикум, Москва). Виснаження БФК сорбентами проводили в пробірках згідно описаному методу (Фримель Г., 1987). Використовували також обробку БФК суміппо етилового спирту та ефіру в співвідношенні 3:1, обробку БФК фенолом та трихлороцтовою кислотою, їх прогрівання при 100 °С на протязі 30 хвилин, а також редокс обробку (Борисова Е.В., 1996).

Гельфільтрацію БФК сальмонел проводили через колонку геля сефадекса G-200 (Фримель Г., 1987). Використовували метод вертикального

електрофорезу в поліакриламідному гелі (Chart H.et al., 1995).

В роботі використовували безпородних мишей, мишей ліній CC57W, Balb/c, морських свинок, телят. Як модель клітинної імунної відповіді використовували гіперчутливість сповільненого типу (ГСТ) до вбитих нагріванням спленоцитів морської свинки (CMC) у мишей. Рівень ГСТ визначали по збільшенню маси підколінного лімфовузла (Борисов В.А., Фролов А.Ф., 1990). Бактерії, БФК і їх фракції вводили мишам внутрішньочеревно одночасно з вирішальною дозою CMC. .

Первинну антитільну імунну відповідь індукували імунізацією мишей комерційним ЛПС Shigella sonnei або бичачим сироватковим альбуміном (БСА). Антитіла в сироватці крові визначали в реакції пасивної гемагтлютинації. Вторинну імунну відповідь до ЛПС S. sonnei та БСА викликали аналогічною імунізацією мишей, яким раніше (3-4 тижні тому) внутрішньочеревно вводили ЛПС або розчин неагрегованого БСА як описано раніше (Борисова Е.В., 1994). Обробку мишей циклофосфамідом та

левамізолом проводили згідно відомої методики (Фонталин JI.H., 1994). Імплантацію клітин селезінки, тимусу та кісткового мозку проводили внутрішньочеревно (Klaus G.G.B., 1990).

Для отримання фактору переносу ГСТ проводили сенсибілізацію телят віком до 1 року в радгоспі ім.Тараса Шевченка Кагарлицького району. Для цього використовували ЛПС сальмонел, активні і неактивні у відношенні пригнічення клітинного імунітету. Діалізований екстракт лейкоцитів (ДЕЛ) отримували згідно відомої методики (Lawrence H.S., 1969). ДЕЛ тестували на наявність антигенспецифічної та ад’ювантної активності фактора переносу ГСТ в тестах інгібіції міграції макрофагів та відновлення розеткоутворення у трипсинізованих лімфоцитів (Wilson G.B., Fudenberg H.H., 1981; Necam K.et al., 1981).

Результати дослідів обробляли статистичними методами.

Основні результати досліджень Виявлення імуносупреснвного фактору у сальмонел різної вірулентності та вивчення його природи. Вивчення впливу клітин сальмонел на розвиток клітинної імунної відповіді на моделі ГСТ показало, що внутрішньочеревне введення мишам живих клітин низьковірулентних сальмонел призводило до достовірного зниження клітинної реактивності в дослідній групі тварин в порівнянні з неінфікованою контрольною групою.

В експерименті з введенням вбитих прогріванням сальмонел цих же низьковірулентних штамів - S.virchow, S.dublin - спостерігався аналогічний ефект - рівень ГСТ знижувався в такій же мірі, як і при введенні живих бактерій. Введення тваринам вбитих прогріванням клітин високовірулентних штамів сальмонел - S. derby, S. typhimurium, S. cholerae-suis, S. kisangani - також завжди викликало імуносупресивну дію. Таким чином, наявність імуносупресивної дії сальмонел залежала від стійкої до прогрівання речовини і була характерною для всіх високовірулентних і низьковірулентних сальмонел.

Імуносупресивний ефект викликав і безмікробний фільтрат культурального середовища (БФК) сальмонел. Виявилось, що

внутрішньочеревне введення такого фільтрату обумовлює значне зниження імунної реакції у тварин.

Імуносупресивний вплив спостерігався з боку БФК всіх штамів сальмонел незалежно від вірулентності. Він не зникав і після прогрівання БФК, що підтвердило наявність термостабільної речовини, яка викликає пригнічення імунітету (рис.1).

4оо і % ГСТ і-

200-

к

-±г гЬ] гЗгі -ї-і РН -£-1

ж в Н п в н п

300

100

о

4707 1468

Рис 1. Вплив внутрішньочеревного введення високовірулентних Б .ІурЬітигіит 1468, низьковірулентних 8.уігс1ю\у 4707 та їх БФК на формування ГСТ у мишей.

К- рівень ГСТ у контрольної групи тварин; Ж - ГСТ при введенні живих бактерій; В - ГСТ при введенні бактерій, вбитих прогріванням; Н - ГСТ при введенні нативних БФК; П - ГСТ при введенні прогрітих БФК; І та II - рівень ГСТ при введенні бактерій або БФК відповідно.

При обробці БФК декількох штамів суміппо спирт-ефіру отримали ліпідну, розчинну в спирт-ефірній суміші, фракцію БФК. Було показано, що внутрішньочеревне введення мишам ліпідної фракції всіх штамів викликає пригнічення ГСТ. Неліпідна фракція, нерозчинна в спирт-ефірній суміші, при введенні тваринам подібного впливу на рівень ГСТ не виявляє. Таким чином, встановлено, що в складі імуносупресивної речовини сальмонел є ліпідний компонент.

Виснаження БФК Б. сІиЬІіп 1538 імуносорбентом, що був отриманий з антитіл до специфічного для цього виду бактерій О-антигену 9, приводило до повної втрати імуносупресивної властивості БФК. О-специфічна речовина, яка була знятою з анти09 - імуносорбенту при введенні тваринам пригнічувала

рівень ГСТ. Напроти, виснаження БФК Б. сіиЬІіп 1538 імуносорбентом, що був отриманий з антитіл до неспецифічних О-антигенів 6 та 7, які не характерні для цього виду сальмонел, не знижувало імуносупресивної активності БФК. БФК при цьому не втратив можливість пригнічувати ГСТ при внутрішньочеревному введенні мишам. Елюат з такого імуносорбенту не проявляв імуносупресивної активності по відношенню до ГСТ (рис.2).

600

500

400

300

200

100

0

%

К

і

нл

В:

^1

ФК

Ы

тх

ві

Рис 2. Вплив внутрішньочеревного введення БФК Б. сіиЬІіп 1538, який піддавався різній обробці, на формування ГСТ до тест-антигену у мишей.

К - контрольний рівень ГСТ без введення БФК; Л, НЛ - ГСТ при введенні ліпідної та неліпідної фракції БФК; О, В - ГСТ при введенні елюату з О-специфічного сорбента та виснаженого сорбентом БФК відповідно; ФК - ГСТ при введенні нативного БФК; ТХ, ВФ - ГСТ при введенні БФК, обробленого трихлороцтовою кислотою чи водним розчином фенолу.

При дослідженні БФК 8.уігсЬо\у 4707 та 8.їурЬітигіит 415 з використанням імуносорбентів було також встановлено, що імуносупресивна речовина здобувалася із БФК імуносорбентом тільки з антитіл до О-антигену. Виявилось, що активні імуносупресивні речовини не можливо видалити з БФК цих сальмонел імуносорбентами, що отримані з антитіл до Н-антигенів, включаючи і специфічні для дослідних штамів. Таким чином, імуносупресивні речовини сальмонел за своєю специфічністю відповідають їх О-антигену, тобто мають в своєму складі О-специфічний ланцюг.

В результаті проведених досліджень було встановлено, що імуносупресивна речовина має в своєму складі ліпідний компонент та О -специфічний полісахаридний ланцюг. Це дає можливість віднести імуносупресивну речовину до ліпополісахариду сальмонел, але літературні

джерела не мають даних про вплив слідових концентрацій нативного ЛПС сальмонел на клітиноопосередкований імунітет.

Відомо, що обробка бактеріальних клітин фенолом або трихлороцтовою кислотою при отриманні препаратів ЛПС здатна змінювати його біологічну активність. Наступним етапом було вивчення впливу цих речовин на активність БФК. БФК обробляли фенолом та трихлороцтовою кислотою. Виявилося, що внутрішньочеревне введення мишам оброблених БФК, не супроводжується пригніченням ГСТ у експериментальних тварин (рис.2). Показано також, що

ІМуНССуПрССИВНу аКТИЗїїіСТЬ ЕФІС МОЖНа буЛО БіДНОБйТИ рсДОКС ОирииКОЮ.

Для підтвердження можливості активації препарату ЛПС під впливом хімічної обробки нами був використаний комерційний препарат ЛПС, що був отриманий класичним водно-феноловим методом з Б. Іуріїітигіит. Його внутрішньочеревне введення мишам не викликало пригнічення ГСТ. Після редокс обробки цей ЛПС починав проявляти імуносупресивну активність при внутрішньочеревному введенні мишам в дозі 1-2 мкг. Як виявилось, переведення із неактивного стану в активний речовин БФК і комерційного водно - фенолового препарату ЛПС можна проводити багаторазово, використовуючи описані процедури.

Таким чином, результати досліджень свідчать, що імуносупресивна речовина БФК сальмонел має О-специфічний компонент (О-полісахаридний ланцюг) та ліпідний компонент. Такою речовиною у сальмонел може бути тільки ЛПС в складі якого є виявлені компоненти. Досліди з використанням хімічно чистого, комерційного ЛПС підтверджують здатність ЛПС проявляти подібну імуносупресивну активність після редокс обробки.

При дослідженні комерційного водно-фенолового ЛПС Б. ІурЬітигішп і редокс обробленого варіанту цього ЛПС методом електрофорезу в поліакриламідному гелі виявилось, що фарбований азотнокислим сріблом профіль електрофоретичної траси активного редокс обробленого ЛПС не відрізняється від профілю неактивного водно-фенолового ЛПС. Фарбування електрофоретичних пластин за допомогою Кумассі - Я 250 не дозволило виявити білкових компонентів на електрофоретичній трасі цих препаратів ЛПС. Дані дослідження підтверджують відсутність грубих змін в ЛПС в процесі активації та інактивації. В зв’язку з цим, можна припустити, що активація та інактивація пов’язана з тонкими змінами в молекулі ЛПС.

Вивчення властивостей фракцій екстрацелюлярного ліпополісахариду сальмонел різної вірулентності. Гельфільтрація БФК високовірулентного плазмідного штаму Б. ІурЬітигіит 415 через колонку геля сефадексу 6 - 200

показала, що на гельхроматограмі пік оптичної густини був зосереджений в області виходу імуноглобулінів класу М та й. Імуносупресивну активність проявляли фракції ЛПС, які знаходилися на ділянці наростання оптичної густини, тобто високомолекулярні (М.м.~ 800 кД), і фракції з меншою молекулярною масою (М.м ~ 200 кД), які відповідають зоні зниження оптичної густини (рис.З).

Виявлено, що гельфільтраційні фракції мають різну чутливість по відношенню до прогрівання. Високомолекулярні фракції ЛПС штаму

З.їурЬітигіит 415 є термочутливими і внутрішньочеревне введення прогрітих фракцій мишам не викликає пригнічення ГСТ, в той час як низькомолекулярні фракції зберігають свої імуносупресивні властивості. Таким чином, після прогрівання фракцій БФК 415 вірулентного штаму зона інгібування ГСТ на гельхроматограмі значно звужується за рахунок інактивації початкових її фракцій. Аналогічні дані одержані при гельфільтрації БФК високовірулентного штаму БЛурЫтипит 1468.

Рис 3. Результати дослідження впливу внутрішньочеревного введення фракцій БФК високовірулентних Б.ІурЬітигішп 415, що отримані після фільтрації через колонку геля сефадекса О - 200, на ГСТ у мишей.

1 - оптична густина фракцій при Д 280; 2 - рівень ГСТ при введеіші нативних фракцій БФК; 3 - ГСТ при введенні прогрітих фракцій; 4 - ГСТ в контрольній групі тварин; М, в - зони виходу І§ М і ^ О людської сироватки. По осі абсцис

- номера фракцій, по осі ординат - рівень ГСТ / % /.

При гельфільтрації низьковірулентного безплазмідного штаму Б. ІурЬіти-гіит 415/307 (рис.4) на гельхроматограмі була виявлена вузька зона фракцій з імуносупресивними властивостями. Вона відповідала зоні виходу імуноглобуліну Є та розташовувалась на кінці піку оптичної густини.

В результаті гельфільтрації БФК низьковірулентних сальмонел Б. уігсЬо\у 4707, Б. <іиЬ1іп 1538 та безплазмідного штаму Б. ІурЬітигіит ВЬ 3759 були отримані аналогічні дані - імуносупресивна фракція виділялась на кінці піку оптичної густини в районі виділення імуноглобуліну класу О.

Після редокс обробки БФК цих низьковірулентних штамів сальмонел імуносупресивна активність була виявлена також і серед фракцій з більш високою молекулярною масою. Всі фракції зони імуносупресивної активності БФК низьковірулентних сальмонел були термостабільними, а всі фракції з більш високою молекулярною масою, які стали активними після редокс обробки, проявляли чутливість до прогрівання.

%

Рис 4. Результати дослідження впливу внутрішньочеревного введення фракцій БФК безплазмідних низьковірулентних S.typhimurium 415/307, отриманих після фільтрації через колонку геля сефадекса G - 200, на ГСТ у мишей.

1 - оптична густина фракцій при Д 280; 2 - рівень ГСТ при введені нативнш фракцій БФК; 3 - ГСТ при введенні редокс оброблених фракцій; 4 - ГСТ е контрольній групі тварин; М, G - зони виходу Ig М і Ig G людської сироватки, По осі абсцис - номера фракцій, по осі ординат - рівень ГСТ /%/.

В дослідах з виснаженням термостабільних та термолабільнш гельфільтраційних фракцій БФК S.typhimurium 415 та S.typhimurium 415/3 O'/ імуносорбентами, що отримали з антитіл до специфічних для цього штаму О-

антигенів, було показано, що активна речовина обох фракцій вміщує О-специфічний полісахаридний ланцюг. Це підтверджує відношення активної речовини до ЛПС сальмонел.

Результати проведених досліджень дають можливість зробити припущення, що активність високомолекулярної фракції ЛПС високовірулентних сальмонел детермінується генами плазміди вірулентності, а активність фракції ЛПС з меншою молекулярною масою, яка є активною у високовірулентних і низьковірулентних сальмонел - генами хромосоми. Гени плазміди вірулентності детермінують активацію термолабільного фактору, а не його синтез, оскільки у безплазмідного штаму цей фактор зберігається, але він неактивний. Його активацію можна спостерігати після редокс обробки.

Деякі імупобіологічні особливості вірулентних сальмонел та їх ліпополісахариду. Особливості впливу живих сальмонел на формування антитіл при імунізації тимусзалежним та тимуснезалежним антигеном вивчали використовуючи культуру сальмонел низьковірулентного штаму. Живу культуру 8. уігсЬоау 4707 в дозі 20 млн мікробних клітин вводили внутрішньочеревно мишам в день імунізації БСА (тимусзалежний антиген) та ЛПС Б. боппєі (тимуснезалежний антиген). В порівнянні з контрольною групою тварин, яким сальмонели не вводили, у тварин експериментальної групи титр антитіл в РПГА до БСА був значно нижчий. У тварин, які були імунізовані ЛПС, вірогідних різниць у формуванні антитіл в контрольній та дослідній ірупах не спостерігалось. Ці результати були отримані як при первинній, так і при вторинній імунній відповіді. Таким чином, сальмонели пригнічують тільки залежну від Т - лімфоцитів імунну відповідь.

Подальші дослідження були спрямовані на з’ясування клітинних механізмів пригнічення ГСТ сальмонельозним ЛПС. Реципієнтам з попередньо індукованою ГСТ до СМС в день вирішальної ін’єкції СМС імплантували лімфоїдні клітини. Клітини тимусу, селезінки та кісткового мозку отримували від інтактних донорів або від донорів, яким за один день до забору в них органів вводили гельфільтраційну ЛПС - фракцію сальмонельозного БФК. У випадку імплантування клітин лимфоїдних органів від інтактних донорів рівень ГСТ у реципієнтів не змінювався. Він не змінювався також при пересадках клітин кісткового мозку, які були взяті у мишей, яких обробляли БФК сальмонел. Однак, при імплантації клітин тимусу або селезінки, які отримані від оброблених ЛПС - фракцією мишей, експресія ГСТ у донорів достовірно знижувалась. Можна припустити, що зниження рівню ГСТ спричинено участю Т- клітин.

В подальших досліджених застосовували імуномодулюючі речовини, такі як левамізол - для стимуляції Т - хелперів, та циклофосфамід - для пригнічення Т - і В - супресорів. Попереднє введення левамізолу в дозі, яка стимулювала Т-хелперну активність та ГСТ у контрольних тварин, не знімало супресивної дії сальмонельозного БФК у експериментальних тварин. Внутрішньочеревне введення циклофосфаміду у низькій і високій дозі, яке супроводжувалось підвищенням рівня ГСТ у контрольної групи тварин, не знімало супресію ГСТ, що була викликана введенням сальмонельозного фільтрату. Встановлені факти вказують, що дискримінація Т - супресорних і В - супресорних лімфоцитів циклофосфамідом не знімає інгібуючого впливу БФК сальмонел.

В зв’язку з тим, що нативний ЛПС сальмонел та редокс активований комерційний водно-феноловий ЛПС пригнічують клітинно-опосередкований імунітет, викликало інтерес вивчення можливості отримання препарату фактора переносу ГСТ на фоні імуносупресії, яку викликає сальмонельозний ЛПС. Цей фактор здатен переносити антигенспецифічний клітинний імунітет і розглядається як перспективний імуногенний препарат. В літературних джерелах немає даних про отримання факторів переносу до ЛПС.

Для імунізації були використані різні за імуносупресивними властивостями комерційні ЛПС - препарати Б. ІурЬішигіиш - початковий водно-феноловий препарат та оброблений редокс системою. Після трьохкратної імунізація здорових телят у тварин з позитивною ГСТ брали кров, з якої отримували діалізований екстракт лейкоцитів (ДЕЛ).

Тестування в реакції інгібіції міграції лейкоцитів (миші та морської свинки) показало, що обидва препарати ДЕЛ, отриманий після імунізації водно-феноловим ЛПС і отриманий після імунізації редокс обробленим ЛПС, виявились активними. У тесті відновлення лімфоцитами морської свинки рецепторів до еритроцитів кроля також була показана висока активність обох препаратів. Ці результати свідчать, що препарати ДЕЛ містять ФП.

Для підтвердження специфічної активності отриманих нами препаратів був проведений дослід з використанням антигенів, якими проводили імунізацію тварин. Після інкубації препаратів ДЕЛ з різними антигенами в тесті інгібіції міграції макрофагів було показано, що обидва препарати ДЕЛ при взаємодії з сальмонельозним ЛПС повністю втрачають свій інгібуючий вплив. Це дає можливість припустити, що в препаратах цих ДЕЛ присутні специфічні молекули фактора переносу.

Таким чином, вперше показано, що після імунізації різними за імуномодулюючими властивостями ліпополісахаридами сальмонел - як імуносупресивно активними, так і неактивними - у тварин індукується вироблення фактору переноса і є можливість отримання препаратів ДЕЛ, які во-

лодіють як специфічними так і ад’ювантними властивостями. В зв’язку з цим,

вивчення цих препаратів є дуже перспективним.

ВИСНОВКИ

1. Патогенність сальмонел має прояв не тільки у вигляді вже відомих елементів

- адгезивності, інвазивності, токсичності - але й у вигляді імуносупресивності.

2. Високовірулентні та низьковірулентні сальмонели здатні пригнічувати імунну систему макроорганізму, що проявляється у відношенні клітинної імунної відповіді і гуморальної тимусзалежної імунної відповіді.

3. Вперше показано, що у фільтраті культуральної рідини сальмонел різної вірулентності знаходиться екстрацелюлярний імуносупресивний фактор, який є високомолекулярною речовиною, має ліпідну природу і специфічність О - антигену сальмонел, що свідчить про належність його до ліпополісахариду.

4. З'ясовано, що до складу нативного екстрацелюлярного ліпополісахариду ви-соковірулентних сальмонел входять дві активні імуносупресивні фракції -термостабільна, з молекулярною масою біля 150 - 200 кД та термолабільна, з молекулярною масою 800 кД та вище. До складу екстрацелюлярного ліпополісахариду низьковірулентних сальмонел входить лише одна активна імуносупресивна термостабільна фракція з молекулярною масою 150 -200 кД.

5. Високомолекулярна фракція ліпополісахариду низьковірулентних сальмонел, в тому числі безплазмідного штаму, набуває імуносупресивну активність в результаті редокс обробки. Активність обох фракцій ЛПС, висо-комолекулярної термолабільної і низькомолекулярної термостабільної може бути усунена обробкою фенолом або трихлороцтовою кислотою і відновлена редокс обробкою.

6. Препарати ліпополісахариду, які екстраговані фенолом або трихлороцтовою кислотою з бактеріальної маси сальмонел, не мають імуносупресивної активності, однак проявляють її після редокс обробки.

7. Вперше показана можливість отримання препаратів фактора переносу ГСТ (ФП) до ліпополісахаридів, як активних так і неактивних у відношенні пригнічення імунної системи.

РОБОТИ, ЩО ОПУБЛІКОВАНІ ПО ТЕМІ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Моложавая О.С., Борисов В.А., Борисова Е.В. Изучение иммуносупрессив-ной активности фильтрата культуры невирулентных сальмонелл // Мікробіол. журнал. - 1997. - № 2. - С. 73 - 78.

2. Борисова Е.В., Бондаренко В.М., Моложавая О.С., Борисов В.А. Иммуносу-прессирующее действие различных фракций липополисахарида Salmonella typhimurium // Ж. микробиол.- 1997. - № 5. - С.120 - 123.

3. Моложавая О.С., Борисова Е.В., Борисов В.А. Клеточные механизмы саль-монеллезной иммуносупрессии у мышей і і Иммунология.- 1998. - № 2. -С. 42-45.

4. Борисов В.А., Чеусова З.В., Моложава О.С. Одержання та вивчення ад’ювантної та специфічної активності факторів переносу до антигенів Candida albicans // Фізіологічний журнал. - 1998. - Т. 44, № 4. - С. З - 9.

5. Моложава О.С. Пригнічення імунної системи сальмонелами, роль ліпополісахариду // 13 з’їзд Українського наукового товариства мікробіол., епідеміол. та паразитологів ім. Д.К. Заболотного.Тези допов. - Київ -Вінниця. - 1996. - С.80.

6. Онуфрієв В.П., Шивінда А., Міськевіч С.В., Моложава О.С., Козловська Г.В., Скибицышй В.Г. Фактор переносу активного імунітету у тварин проти вірусних та бактеріальних інфекцій // Сучасні проблеми ветеринарної медицини. Матеріали доповідей наукової конференції. Національний аграрний університет.Тези допов. - Київ. - 1997. - С. 33 - 34.

7. Onufriev V.V., Vershigora А.Е., Kholodna L.S., Molozhava О.S., Miskevich

S.V., Novosilova E.V., Shivinda A. Bovine transfer factor to Rotavirus and Cory-nebacterium diphteriae J Clostridium tetani antigens // X International symposium on Transfer Factor. Abstracts.-Bologna (Italy)- 1995.- P.13.

8. Borisova E.V., Molozhavaya O.S., Borisov B.A. The location of chemical groups with immunosuppressive activity in bacterial lipopolysaccharide // XVIII International carbohydrate symposium. Abstracts. - Milan (Italy). - 1996. - P.569.

9. Molozhavaya O.S., Borisova E.V. Salmonella lipopolysaccharide - induced immunosuppression in mice // Journal of Molecular Medicine. Congress of Molecular Medicine. Abstracts. - Berlin (Germany) - 1997. -V.75, №5,- P. B60/190.

10.Molozhavaya O.S., Borisova E.V. The Mechanisms and Factors of Salmonella-Determined Immunosuppression // 13th European Immunology Meeting. Abstracts. - Amsterdam (The Netherlands) - 1997. - P. 485.

11.Borisova E.V., Borisov B.A, Molozhavaya O.S. Lipopolysaccharide peculiarity of virulent and avirulent Salmonella // Proceedings of the International regional seminar: modem studies in ecology and microbiology. Abstracts.- Uzhgorog (Ukraine) - 1997. - P. 256 - 258.

[2.Molozhavaya O.S., Borisova E.V., Borisov B.A. Biological properties Salmonella lipopolysaccharide // 9th Evropean carbohydrate symposium. Abstracts. - Utrecht (ТЪе Netherlands) - 1997.- P. 410.

Анотація

УІоложава O.C. Сальмонели: вірулентність і імуносупресивні властивості. Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук із спеціальності ил л/G.и і. - мікрооіологія. Київським науково-дослідний інститут гпідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського. Київ, 1998.

В рукописі відображені результати вивчення імуносупресивних властивостей сальмонел різної вірулентності. Показано, що сальмонели здатні іригнічувати Т - залежну гуморальну та клітинну імунну відповідь. Імуносупресивні властивості визначаються наявністю ліпополісахариду. В залежності від вірулентності сальмонел в складі їх ЛПС виявляються одна або іві імуносупресивні фракції. Обробка фенолом або трихлороцтовою кислотою призводить до втрати імуносупресивної властивості ЛПС, редокс обробка відновлює цю властивість.

Ключові слова: сальмонели, вірулентність, ліпополісахарид, імуносупресивність.

Аннотация

Моложавая О.С. Сальмонеллы: вирулентность и иммуносупрессивные свойства. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07. - микробиология. Киевский научно-исследовательский институт эпидемиологии и инфекционных болезней им. Л.В. Громашев-

ского. Киев, 1998.

В рукописи отражены результаты изучения иммуносупрессивньтх свойств сальмонел различной вирулентности. Показано, что сальмонеллы способны подавлять Т-зависимый гуморальный и клеточный иммунный ответ. Иммуносу-прессивное свойство бактерий определяется во многом липополисахаридом. В зависимости от вирулентности сальмонелл в составе их ЛПС обнаруживается одна или две активные иммуносупрессивные фракции. Обработка фенолом или грихлоруксусной кислотой устраняет иммуносупрессивное свойство ЛПС, редокс обработка восстанавливает это свойство.

Ключевые слова: сальмонеллы, вирулентность, липополисахарид, иммуносупрессивность.

Summary

Molozhavaya O.S. Salmonella: virulence and immunosuppressive properties.

Thesis for degree of Phylosofy Doctor in the speciality 03.00.07 - microbiology. Gromashevsky Research Institute of Epidemiology and Infectious Diseases. Kiev, 1998.

In manuscript there are the results of study on immunosuppressive peculiarities of Salmonella with various virulence. It has been shown that Salmonellae possess property to suppress T-depenoent humorai and ceiiuiar immune response. The immunosuppressive property of bacteria is determined by lipopolysaccharide. LPS contains one or two active immunosuppressive fractions. Phenol or trichloracetic treatment eliminates the immunosuppressive property of LPS, redox treatment reco- vers this property.

Key words: Salmonella, virulence, lipopolysaccharide, immunosuppressive activity.