Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Саит-специфические взаимодействия регуляторной области генов рРНК с ядерными белками у пшеницы

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Саит-специфические взаимодействия регуляторной области генов рРНК с ядерными белками у пшеницы"

РГ6 од

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

I 1 ОпТ ¡¿ЗЗимени М. В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи УДК 547.963.32

АНТОНИВ Тарас Тарасович

«САИТ-СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ РЕГУЛЯТОРНОЙ ОБЛАСТИ ГЕНОВрРНК С ЯДЕРНЫМИ БЕЛКАМИ У ПШЕНИЦЫ»

03.00.03 — молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1993

Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ онтогенеза Института физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Ванюшин Б. Ф.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Бурьянов Я. И. доктор химических наук, профессор Копылов А. М.

Ведущее учреждение — Институт общей генетики РАН

Защита диссертации состоится «———,» ¡1993 р.

в —, час. на заседании Специализированного совета Д.053.05.70. при Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет, Ученый совет.

С диссертаций можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан « ^» ¿¿¿¿^¿^1993 г_

Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат биологических наук Каграманов В. Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Несомненно, что у растений, как и у ш-вотных, решакцую роль в инициации транскрипции играют регуляторныо последовательности ДМ (ois-элементы) а белковые фактору связывающиеся с ними. К сожалению, природа этих факторов и узнавав?,-мх имя элементов промотора для генов рРНК высших растений практически но изучены. Вместе с тем, получение таких данных ваино для расшифровки механизмов регуляции транскрипции генов рРНК у растений. Особый интерес, с функциональной точки зрэння, представляет последовательность кенгенного спейсера (КЕГС). отделящая друг от друга периодически повторяющиеся кодирукцие последовательности (гены 17S, 5,03 , 25S рРНК и разделяющие'их внутренние спейсера) [Flavrall et al.,1935]. Эта область рДНК содержит элементы, обвспечивавдие инициацию и тзр-«здацию транскрипции.

Молекулярные механизмы, регулнрукщие степень вовлеченности различных субпопуляций генов рРНК в транскрипцию, остаются слабо изученными. Ранее было обнаругено, что про.чоторная область генов рРШ пшеница избирательно недометилирована. Степень метилирования этоЗ области- уменьшается с увеличением уровня транскрипции генов рРИС в ходе развития проростков пшеницы, а такте при световой нндукщга этиолированных проростков [Савельев и др.,1990, piavell at al.,19Q8]. Эти данные позволяют предположить, что метилирование остатков цитозина являемся одним из механизмов инак ивации избыточно.! транскрипции рРНК генов в клетках высших растений. Однако, мэхишям индуцированной метилированием инактивации рРЧК генов пока яеизЕес-тен. v

Цель и задачи исследования. Основная цель диссертационной работы заключалась в изучении ДНК-белковых взаимодействий в различиях участках «антенного спейсера рДНК а возмогзгаго влияния пэт^-грог.*---- .

Д11К на эти взаимодействия. Исходя из этого были поставлены следувдие задачи:

- выявление последовательностей рДНК пшеницы,связывающихся с ядерными белковыми факторами;

- изучение возможных, опосредованных белками, функциональных взаимодействий между различными участками межгенного спейсера рДНК;

- изучение влияния метилирования ссоо сайтов на способность различных участков кекгеиного спейсера рДНК связывать ядерные белки.

Научная новизна работы. В результате изучения топографии ДНК-белковых взаимодействий в межгенном спейсере генов рРНК пшеницы впервые обнаружено четыре участка специфически взаимодействующих с ядерными белками. Показано, что верхняя регуляторная область (-270 + -126) и область промотора (-126 +-11) формируют ряд ДНК-белковых комплексов различающихся по специфичности связывания. Впервые для рДНК высших растений показано существование нижней регуляторной области (+192 + +366), расположенной между точкой инициации транскрипции и началом кодирующей области, специфически связывающейся с ядерным белком с молекулярной массой около 240 кДа. Обнаружено функциональное взаимодействие между 13&-пн повторяющимся элементом ыекген-пого спейсера и нижней регуляторной областью, опосредованное ядерным белком узнавдкм обе эти последовательности. Впервые изучено влияние метилирования ссоа сайтов на способность различных участков мекген-шго спейсера рДНК пшеницы связывать ядерные белки. Установлено, что штшшрованне нижней регуляторной области уменьшает ее сродство к сй£т-спвцЕфическому белку. В то же время, метилирование 135-пн повторяющегося элемента, а также содержащей точку инициации транскрипции области не влияет на их связывание о белковыми факторами.

Практическая значимость работы. Диссертация имеет теоретический дирактэр. Полученные данные имеют важное значение в установлении

механизмов регуляции транскрипции рРНК генов у растений, а также свидетельствуют о прямом влиянии остатков 5-метилцитозина в регуля-торных элементах рДНК на специфическое связывание с ними некоторых белковых факторов. Результаты работы могут использоваться в курсах лекций по молекулярной биологии и биохимии.

Апробация работы. Материалы работы представлены на III съезде Всероссийского общества физиологов растений (Санкт-Петербург, 1993) и на „еминаре лаборатории молекулярных основ онтогенеза Института физико-химимической биологии им.А.Н.Белозерского МГУ.

Структура и обьем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы (1 наименований). Работа изложена на 1 страницах машинописи, содержит рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Выращивание проростков из семян гексаплоидной пшеницы Мироновская 808 осуществляли как описано ранее [Кирнос и др.,1984]. Выделение и очистку ядер из трехсуточных этиолированных проростков осуществляли известным методом с небольшими модификациями [Guilfoyle et al.,1986]. Ядерные белки из очищенных ядер получали методом Миками [liikami et al., 19871. Стандартные манипуляции с ДНК осуществляли по ранее описанным методам Шаниатнс и др.-, 19841. Су^фрагменты мешенного спейсера получали из плазмиды pWH2 (подробное описание - в работе [Савельев и др.,19901). Для этого плазмчду гидролизовали эндо-нуклеазами рестрикции ("Вектор" или "Fermentaa"), продукты гидролиза метили с помощью [азгР]дЩФ ("Изотоп") и фрагмента Кленова ("Phannaoia-LKB"), субфрагменты межгенного спейсера выделяли препа-

ративным электрофорезом в нативном геле Ъ% ПАА [Маниатис и др..1984]. Полученные после экстракции из геля препараты фрагментов концентрировали, осаждая этанолом,и перерастворяли в деоинивованной . воде.

Инкубацию ДНК с белками ядерного экстракта осуществляли по методике Миками и соавт. tiíikami et al., 19871, при соотношении: 1-3 нг меченого фрагмента (5—10 тыс. имп/мин), 1-3 мкг неспецифического конкурента и 1-2 мкг белка. Объем суммарной реакционной смеси составлял 10 мкл, конечная концентрация компонентов буфера: 17 v.M Нерев-КОН, рН 7,9, 60 ММ КСЬ, 7,5 Щ Mg0l2, 0,12 MM EDTA, 0,6 MM PHSP, 1,2 мМ dtt. В качестве неспецифических конкурентов использовали синтетические полинуклеотиды: poly(dA-d!T), poly(dG-dQ), poly d(I-O) ("Boeh-riger") либо высокоочиценную ДНК из эритроцитов ципленка. В качестве специфических конкурентов использовали немеченые субфрагменты межгенного спейсера рДНК пшеницы.

Образование специфических ДНК-белковых комплексов мевду , мечеными фрагментами и белкаки ядерного экстракта детектировали методом гель-ретардации в 5Ж ПМГ на 0,5 х трис-борат-ЕМ1' буфере [Маниатис и др.,19841 в течение 2,6-3 ч при напряжении 10 В/см. После электрофореза гель фиксировали в 7Я5 ТХУ, высушивали и авторадаографировали.

Метилирование фрагментов In vitro осуществляли с помощь» Б-аденозил-Ь-метионина ("Sigma") и метилазц Hpall (любезно предоставлена профессором Я.И.Бурьянозым, ИБХ РАН) в реакционной смеси, содержащей 60 мМ Трис-HOl, рН 7,6, .20 мМ ЕЮ А, 100 мкМ SAM, 1 мкг ДНК и 10 ед. метилазы в объеме 20 мкл при 37°С в течение 1 ч. Полноту метилирования проверяли по устойчивости фрагментов ДНК к рестрик-тазе Иран.

■xss__

| HIT ¿¿-Л' _

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ s-rrc___

•*r<fs

-I v^s; I

Е/

2SS

УУУУУУУУУУУУУУ^ fl /?

i ^ \

J »—I—I

c^/ <5~n о &тъ/э /Р судЪто&гуоС 4

/

S/ Л/ ¿у S/ // У /fl

-ties

/> 4

EH

Э

Э

э

его

п

202

ПН

UPO

Рис. 1. Схема строения межгенного спейсера рДНК пшеницы и локализация обнаруженных в работе регуляторных элементов. Координаты у^заны относительно точки инициации транскрипции. В - EooRI; в - ВалШ; N -Noolj А - Aval. Э - 135-ш повторявдийся элемент, предполагаемый энхансер; ВРО - 154-пн фрагмент, предполагаемая верхняя регуляторная область; П - 114-пн фрагмент, область промотора; 202 пн - содержащая точку инициации транскрипции область; НРО - нижняя регуляторная

область._;__

*Список сокращений: ИГО - мезгенннй спейсер; м5С Б-метилцитозин; пн - пара нуклеотидов; рДНК - ДНК, содержался гены р.Ж.

1 .Специфическое связывание ядерных белков с повторяющимся элементом А мекгенного спейсера рДНК пшеницы.

Семейство повторяющихся элементов А, состоящее из 18 тандемных повторов длиной 135 пн, расположенных выше точки инициации транскрипции, составляет значительную часть мекгенного спейсера (рис.1). У животных влияние аналогичных структурных элементов спейсера на транскрипцию определяется их способностью взаимодействовать с сайт-специфическими белковыми факторами (Kuhn et а1.,1990]. Исходя из втого, мы исследовали взаимодействие повторяющегося элемента А (135 пн) с ядерными белками пшеницы.

ЛТ СС АТ/СС Р

HKZ о.» и г/ 'v i/Г щ ^ и <V» V У к

Рис.2. Взаимодействие ядерных белков с 32Р меченым 135-нн повторяющимся элементом рДНК. Неспеци!|ические конкуренты: AT - poly (dA-dT); 00 - poly(fiO-dO); AT/GO - эквимолярная смесь poly(dA-dT) и poly(d(3-d0)s Д - ДНК эритроцитов цыпленка. P - свободный фрагмент; Oi-Сд -"мажорные" нуклеопротеидаые комплексы; К - 135-пн фрагмент без добавления ядерного экстракта

б

При инкубации меченого 135-нуклеотидного фрагмента с ядерными белками наблюдается формирование ряда специфических ДНК-белковнх комлексов, имеющих более низкую подвижность в геле, чем свободный 135-нуклеотидный фрагмент (рис.2). Обработка реакционной смеси нро-теиназой К перед нанесением на гель приводит к исчезновению всех радиоактивно меченых полос, кроме полосы свободного Фрагмента (рис.3). Это показывает, что в образовании всех выявляемых комплек-

Рис.З. Чувствительность специфических комплексов 135-пн повторяй-щех'ося элемента к обработке щю-теиназой К. Неспецифические конкуренты: AT - poly (dA-dT); GO -poly(dG-dO), no 1,2 мкг в каждой реакции. 1 -меченый 135-пн фрагмент без добавления ядерного экстракта. 4, 5 - в реакцию инкубации добавлена нротеиназ< К. г - свободный фрагмент; С1-С4 - нуклео-протеидные комплексы, сов участвуют молекулы белковой природы. Выраженность индивидуальных комплексов заметно варьирует в зависимости от типа использ^ мого неснецифического конкурента. Это свидетельствует о разной специфичности соответствующих ДНК-связывающих белков. По отношению подвижности комплексов к подвижности свс одного фрагмента можно приблизительно рассчитать молекулярные массы их белковых компонентов [Bading, 1988]. Оказалось, что в формированиинмажорннх"комплексов участвуют белки с молекулярной массой около РО (Ci), 220 (Сг). 250

(Сэ) и S30 кДа (04). Очевидно, что в обравопвнян наиболее пиоокомо-лекулярного комплекса (620 кДа) участвует более, чем г,1дн белок. Это

подтверждается такие и тем, что количество комплекса Сд избирательно повышается при увеличении количества ядерных белков, вносимых в стандартную реакцию. При инкубации меченого Фрагмента с ядерными белками в присутствии возрастающих количеств специфического конкурента в виде немеченого 135-пн фрагмента происходит постепенное уменьшение интенсивности полос, соответствующих большинству специфических комплексов (рис.4). Значит, количество соответствующих белков

Рис.4. Конкуренция немеченого 135-пн повторяющегося элемента А за связывание с ядерными белками. К -меченый 135-пн фрагмент без добавления ядерного экстракта. Г - свободный фрагмент; 01-Сд - нуклео-протеидные комплексы. Над дорожками указаны количества немеченого 135-пн фрагмента добавленные в реакции инкубации, в ядерном экстракте лимитировано и быстро исчерпывается при добавлении возрастающих количеств узнаваемого ими специфического фрагмента. Исключение составляет лишь полоса, соответствующая комплексу с 100 кДа белком: по-видимому, образование этого комплекса обусловлено-неспецифическим взаимодействием, а количество соответствующего белка в ядерном экстракте вполне достаточно для насыщения использованных количеств 135-пн фрагмента.

Таким образом, мы обнаружили специфическое взаимодействие ядерных белков с 135-пн повторяющимся элементом МГС рДНК пшеницы. Не исключено, что часть белков, входящих в высокомолекулярные комилек-.сы, взаимодействует с 135-пн фрагментом не непосредственно , а через другие узнающие его белки.

иг к о зо »о о з» 'о

2. Взаимодействие ядэрннх белков с промоторной (-126 * -11)

и верхней регуляторной областью (-270 ч- -12G) рДШС пшеницы. Взаимодействие FHK-полимеразы с промотором является ключевым этапом транскрипции. Однако, все еукариотические FHK-полимервзн для инициации транскрипции нуждаются в присутствии вспомогательных белковых факторов, проявляющих специфические ДНК-белковне и балок-белковые взаимодействия [Sollner-Webb et al.,19B6].

па основании данных о расположении точки инициации транскрипции [Barker et al.,1988], мы выделили участок межгенного спейсера, включающий в себя предполагаемый промотор рДНК (рис. 1). На рис.Б представлены результаты гель-ретардации 32р-меченого 114-пн фрагмента Nool(-126)-AvaI(-11), инкубированного с экстрактом ядерных белков. В

Рис.Б. Взаимодействие ядерных белков к acid с 114-н областью промотора (-126 +

-11). Неспецифические конкуренты: А - poly(dA-dT); 0 - poly(dG-dO); I -poly(dl-dO); D - ДНК эритроцитов цыпленка. К - 114-пн фрагмент без добавления ядерного вкстракта. F - свободный фрагмент; С1-Сэ - нуклеопротеид-ные комплексы.

образовании комплексов участвуют молекулы белковой природы, поскольку все они проявляют "увствителыюсть к обработке протеина^ К. Молекулярная масса белковой компоненты Oi-Сз комплексов, рассчитанная по подвижности в геле,составляет приблизительно 90, 240 и ¿"П кДа. При использовании poiy(dG-dC) в качестве несиёцифического конкурента комплексы Сг и Сз не детектируются. Это свидетельствует о повн-енном сродстве связывающихся с ДНК белков к GC-обогвщошшм последователь-

ностям. Стабильность наблюдаемых комплексов в присутствии высоких концентраций неспецифического конкурента и чувствительность к добавлению небольших количеств гомологичного немеченого фрагмента ДИК свидетельствует о высокой специфичности ДНК-белковых взаимодействий.

Поскольку сама РНК голимераза I не обладает ДИК-свяэыващей активностью, ее посадка на промотор возможна только после предварительного связывания с ним факторов инициации транскрипции [beamed et al.,1986]. Мы предполагаем, что у пшеницы такими факторами являются белки, взаимодействующие с 114-нп фрагментом промоторной области.

154-нн фрагмент Nool(-270)-Nool(-126) примыкает к Б'-окончанию промоторной области (рис.1). При исследовании его специфического связывания с белками ядерного экстракта, было обнаружено формирование целого ряда ДНК-белковых комплексов (рис.6). Как и для иромотор-

Рис.6. Взаимодействие ядерных белков с 154-нн верхней регуляторной областью (-126 + -11). Неснецифические конкуренты: А - polv(dA-dT); G -poly(dG-dC); I - poly(dl-dC); D - ДПК эритроцитов цыпленка. К - 154-пн фрагмент без добавления ядерного экстракта. F - свободный фрагмент; С1-Сз - нуклеопротеидные комплексы, ной области» эти комплексы имеют разное сродство к АН- и ас-обогащенным последовательностям. Их молекулярные массы составляют приблизительно 100, 200 и 400 кДа. Известно, что большинство промоторов рРНК генов животных состоит из двух или более доменов [Sohnapp et а1.,1990]. По аналогии с животными, мы назвали этот фрагмент верхней регуляторной областью.

ю

3.Взаимодействие ядерных белков с участком МГО, содержащим точку инициации транскрипции (-11 * +191), и нижней регуляторной областью (+191 + +366).

Предполагают, что участок мвжгенного спвЯсера Ava (-11)-AvaI(+l°l) (рис.1) играет важную роль при транскрипции. В нем расположены: точка инициации транскрипции, "TATA Ьох"-подобный элемент, консервативный для большинства растений, иалиндромная последовательность длиной 64 пн, а также 100-ш фрагмент повторяющегося элемента С1 (172 пн), имеющий некоторую гомологию с 135-ин повторяющимся элементом А [Barker et al.,1908]. Тем не менее, нам не удалось обнаружить специфические комплексы этого фрагмента с ядерными белками (рис.7). На

Рис.7. Взаимодействие ядерных белА | С 1 ■

/мхг/ к 1.г 1.6 2.1) 2.t ков с 202-iih последовательностью^

содержащей точку инициации транскрипциями * +191). Неспецифические конкуренты: А - poly(dA-dT); О - poly(dO-dC). К - 202-пн фрашент без добавления ядерного экстракта. F - свободный фрагмент; С - нук-леопротеидный комплекс, блюдаемнй низкомолекулярный комплекс не чувствителен к добавлению специфического конкурента в виде немеченого 202-пн фрагмента ДНК. Из этого следует, что связывающийся белок присутствует в ядре в больших количествах и, вероятно, играет некую структурную роль. Очевидно, образование этого комплекса обусловлено неспецифическим ваимодейст-вием. При использовании poly(dA-dT) в качестве неспеци(|ического конкурента ДНК-белковый комплекс вовсе не детектируется, что свидетельствует о сродстве белка, который его формирует, к АТ-обогащенным

i юследовательностям.

До настоящего времени не было никаких данных о существовании в рГ"К генах растений регуляторшя »лементов, расположенных ниже точки инициации транскрипции. Поэтому довольно неожиданным оказалось обнаружение специфического связывания между фрагментом Aval (+191)-Avai(+366) (рис.1) и ядерным белком с молекулярной массой около 240 кДа (рис.8). Вероятнее всего, связывание белка происходит в том

Рис.8. Взаимодействие ядерных бел-коч с 174-1ш нижней регулятивной областью ^+191 + +366). Неспецифические конкуренты: А - poly(dA-dl); О - poly(dO-dC); I - poly(dJ-dC); D - ДНК эритроцитов цыпленка. It - 174-пн фрагмент без добавления ядерного экстракта.Р - свободный фрагмент; Ci - нуклеопротеидный комплекс.

участке субповтора С2, протяженностью 30 пн, который отсутствует (замещен другой последовательностью) в субповторе С1 межгенного спейсера. Как было нами показано выше, эта часть С1 субповтора, входящая в 202-пн фрагмент Aval(-11)-AvaI(+191), не обладает специфическими белок-связываюцими свойствами. Кроме того, участок предполагаемого связывания белка фланкирован ccgj последовательностями, а их метилирование влия т на формирование комплекса (см. раздел Б).

Ф., .шциональная значимость нижней регуляторной области подтверждается эволюционной консервативностью ее нуклеотидной : лследователь-ности у пшеницы и кукурузы, в то время как окружающие ее последовательности дивергировали в значительно большей степени [Barker et al.,19881. "" нижней ■ егуляторной области примыкает обнаруженный рп-

лее ДШСаза г гиперчувствительннй сайт [ТЬотрвоп еЬ а1.,1900]

4.Связывание 135-1Ш повторяющегося элемента А с ядерными белками, узнающими другие функциональные участки межгенного снейсера.

Одним из возможных механизмов регуляторного действия 135-пн новторящегося элемента может быть конкуренция за связывание ядерны* белков, узнающих другие регуляторные элементы. В связи с этим, мы исследовали формирование ,[1!К-белковнх комплексов различных меченых Фрагментов ДНК в присутствии немеченого 135-пн ':убновтора в качество специфического конкурента. К нашему удивлению, мн обнаружили лишь ярко выраженную конкуренцию 135-пн новторящегося элемента и нижней регуляторной области (+19) + +366) за связывание ядерного белка (рис.9). Из этого следует, что один и тот не белок с молекулярной

Рис.9. Конкуренция меаду немеченым 135-нн субновтором и згР-меченой 174-пн нижней регуляторной областью (+191 + +366) за связывание с ядерными белками. В качестве специфических конкурентов использовались немеченый 174-пн фрагмент (дорожка 3) или немеченый 135-пн повторяющийся элемент рДНК (дорожки 4,5). Неспецифический конкурент - ро!у(с1А-с!Т); 1,2 мкг на реакцию. К -меченый 174-пн фрагмент без добавления ядерного экстракта.

массой около 240 кДа специфически связывается как с повторяющимся элементом А (13Б нн), так и с нижней регуляторной областью. Значение

{нг/ к^ зо1г1о 9о~1

I 2 5 ■< !

втого факта, как и самого существования нишей регуляторной области пок I неизвестно. Нэ исключено, что взаимная конкуренция субновторов зн связывание с этим белком межет служить механизмом деблокирования транскрипции. Конкуренция 135-нн су биовтора с другими участками про-моторной области за связывание с ядерными белками слабо выражена или отсутствует.

5.Влияние метилирования COGO сайтов на способность рнзличных учасков межгенного "пей^ера рДНК пшеницы связывать ядерные белки.

Степень метилирования межгешюго спвйоера рДНК пшеницы уменьшается при увеличении уровня транскрипции (Савельев и др.,19ЭП; Fla-vell et al.,1908]. Это позволяет предположить, что метилирование является одним из механизмов инактивн ш транскрииции рДНК в клетках высших растений. Однако механизм индуцированной метилированием инактивации рГНК генов пока неизвестен.

Мы обнаружили, что метили|ювание in vitro с помощью метилазы Н^ ciTI двух CCGQ сайтов в нижней регуляторной области уменьшает ее сродство к сайт-специфическому ядерному белку (рис.10). Иными словн-

К S M N

Рис.10. Влияние метилирования ме-тилазой Hpail на связывание нижней регуляторной области с ядерными

белкаь . (+191 + +366). В реакции инкубации использовали метилирование (М), исевдометилированные (S) и неметили1юван№'о (N) Фраг-

менты. К - меченый 174-ин фрагмент без добавления ядерного экстракта. Poly(dA-dT) - 1,2 мкг на реакцию.

ми, остатки м50 непосредственно влияют на связывание сайт-сиецифи-ческого белка с узнаваемой последовательностью.

Поскольку в гетерогенной популяции 135-ин повторяющихся элементов А некоторые субповторы содержат ссяо сайты, мы исследовали влияние метилирования этих сайтов на специфическое взаимодействие суммарного 135-ин фрагмента с ядериими белками (рис.11). Заметного вли-

тие. 11 Влияние метилирования метилазой ПраП на связывание 135-нн повторяющегося элемента с ядерными белками. В реакции инкубации использовали метилированные (М), исевдометилироваиные (б) и немвтили-рованные (И) фрагменты. К - меченые 135-ин фрагменты без добавления ядерного экстракта.

яния такого метилирования на образование комплексов ют не обнаружили. Следовательно, метилирование остатков цитозина в этом случае либо функционально не значимо, либо его функция носит некий региональный характер, например, изменяет структуру хроматинового домена.

к

Рис. 12. Bjih нив метилирования метилазой Ifpall на связывание 202-пн области (-11 + -191) с ядерными белками. В реакции инкубвции использовали метилированные (М), нсевдометилированныв (S) и неметидирован-* ные (N) фрагменты. К - меченые 202-пн Фрагменты без добивлегчя ядерного экстракта.

Отсутствуют какие либо изменения в связывании ядерных белков и при метилировании последовательности, содержащей точку инициации транскрипции (-11 + +191) фис.12).

Собственно ^ласт! промотора (-126 + -11) ocqg сайтов не содержит [Barker et al.,1988].

вывода

1 В результате изучения топографии ДНК-белковых взаимодействий, в межгенном спейсере рДНК пшеницы обнаружено четыре участка, специ^ич-юки взаимодействуыцих с ядерными белками: 1) новторяк ,ийся элемент А мешенного спейсера длиной 135 1Ш (18 копий, предшествующих верхней регулятопной области); 2) верхняя регуляторная область

(-270 + -126); 3) область промотора (-126 + -11); 4) нижняя регуля-торная область (+192 + +366).

2. Для верхней регуляторной области и области промотора обнару-вено формирование ряда специфических ДНК-белковых кою.лексов, имеющих разное сродство к AT- и oc-обогащенным последовательностям. Молекулярная масса белковой компоненты основных комплексов составляет приблизительно 90, 240, 420 кДа для области промотора и 100, 200, 400 кДа для нижней регуляторной области.

3. Впервые в рДНК растений выявлена юшняя регуляторная область, расположенная мекду точкой инициации транскрипции и кодирущей областью. С этой регуляторной областью специфически связывается ядерный белок с молекулярной массой около 240 кДа.

4. Содержащая точку, инициации транскрипции область (-11 + +191) не проявляет способности к специфическому связыванию ядерных белков In vitro, однако, osa весшцифачески связывает етзкомолекулярный белок со сродством к АТ-обогащенным последовательностям.

5. При исследовании. спецга|ического связывания ядерных белков с 135-пн повторяицимся элементом А мекгенного спейсера обнаружено формирование нескольких нуклеопротеидных комплексов, различающихся по специфичности связывания. В образовании наиболее высокомолекулярного комплекса (порядка 620 кДа) участвует несколько белков.

6. Показано, что один и тот se ядерный белок с молекулярной массой около 240 кДа специфически связывается с повторяющимся элементом А и нижней регуляторной областью . .

7. Обнаружено, что метилирование двух CCG0 сайтов в нижней регуляторной области уменьшает ее сродство к сайт-специфическому ядерному белку с молекулярной массой 240 кДа. В то же время, метилирование CCGG сайтов в 135-пн повторяющемся элементе, а также в содержащей точку инициации транскрипции области (-11 + +191) не влияет на их

способность связываться с ядерными белками.

Работы, опубликованные по теме диссертации

1. Антонив Т.Т.,Ашапкин В.В.,Ванюшин Б.Ф. Специфическое связывание ядерных белков с повторяющимся элементом мекгеиного спейсера рДНК пшеницы. Тезисы докладов III съезда ВОФР, Санкт-ПетерСург. 1933, т. d <-. 7.

2. Антонив Т.Т..Ашалкин В.В..Ванюшин Б.Ф. Выявление регуляторных участков мекгенного спейсера рДНК пшениц . Тезисы докладов III сьезда ВОФР, Санкт-Петербург, 199С; т i^ <■ "8

3. Атапк ш В.В., Антонив Т.Т., Ваншин Б.Ф. Метилирование ДНК

регулирует сайт-специфические взаимодействия промотора рибосомных

генов rait яцы. Тезисы докладов III сьезда ВОФР, Санкт-печ рбург,

1993. Т. i с . 9 / /

4. Aehapkin V.V., Antoniv Т Т., Vanyushin В.P. Speoifio binding oi wheat nuolear proteins to the promoter region oi ribosomal RNA genes. Plant Cell Rep., 1993, in ргевв.

5. Aehapkin V.V., Antoniv T.T., VanyuBhin B.F. Specific binding of wheat nuolear proteins to the 135 eubrepeat element of rDNA intergenio враоег. Huolclu Auld Пив., 1093, in ргссв. В i аоС^лл. t^i

Мое. ЙГоС?. ¿m-t&rrvxt., J. p.lbf'lbd.

Антонив Тарас Тарасович

САИТ-СПЕЗдИФИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ РЕГУЛЯТОРНОИ ОБЛАСТИ ГЕНОВ рРНК С ЯДЕРНЫМИ БЕЛКАМИ У ПШЕНИЦУ" (Автореферат)