Исследование механизма импорта 5SpPHK в митохондрии клеток человека и использование рекомбинантных форм 5SpPHK как векторов

Смирнов, Александр Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование механизма импорта 5SpPHK в митохондрии клеток человека и использование рекомбинантных форм 5SpPHK как векторов
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование механизма импорта 5SpPHK в митохондрии клеток человека и использование рекомбинантных форм 5SpPHK как векторов"

На правах рукописи

СМИРНОВ Александр Владимирович

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ИМПОРТА 55 рРНК В МИТОХОНДРИИ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ФОРМ 58 рРНК КАК

ВЕКТОРОВ

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ 003400232

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва-2009

003480232

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.ВЛомоносова, г. Москва, и в Институте физиологии и биологической химии, г. Страсбург, Франция.

Крашенинников Игорь Александрович Энтелис Нина Сергеевна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук

Колб Вячеслав Адамович

доктор биологических наук, профессор

Добров Евгений Николаевич

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

Защита состоится ^О О^Рь^/^) 2009 года в (0_ ч на заседании совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.ВЛомоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ ФХБ имени А.Н.Белозерского, ауд. 536.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

кандидат биологических наук

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.ВЛомопосова.

Автореферат разослан аг^ТУ^л^^Ш) г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

И.А. Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Среди известных на сегодняшний день генетических систем одной из наиболее динамичных, вне всякого сомнения, является система митохондрий. В процессе эволюции эукариотической клетки с огромной скоростью происходили и продолжают происходить глубочайшие перестройки аппарата воспроизведения и реализации генетической информации органелл. В контексте постоянного диалога с ядерным геномом митохондрии потеряли свою автономию вследствие переноса практически всех белок-кодирующих генов в ядро. В то же время значительная часть генов РНК (несмотря на явно «пробелковый» характер эволюции митохондриальных метаболических систем) и генов, кодирующих белки электрон-транспортной цепи, сохранена в митохондриальном геноме. Сосуществование двух относительно независимых генетических систем, контролирующих метаболизм митохондрий, привело к возникновению весьма сложных механизмов взаимодействия.

К таким механизмам в первую очередь относится импорт кодируемых ядерным геномом макромолекул в органеллы. Направленное перемещение белков из цитозоля в митохондрии, очевидно, является одним из наиболее древних приобретений эукариотической клетки. Осуществляемое благодаря работе высоко консервативного белкового аппрата, оно было тщательно исследовано и в настоящее время описано в деталях. Вместе с тем, значительно позже и, очевидно, независимо в разных систематических группах митохондрии начали терять также отдельные гены РНК, что усилило их интеграцию в эукариотическую систему клетки-хозяина. Потеря своих РНК (и, по крайней мере, в одном случае, описанном у дрожжей, развитие нового адаптивного механизма) привела к необходимости выработать специальный механизм для их импорта из цитозоля. У протистов, растений, грибов и животных самые разнообразные белковые системы были использованы для осуществления этой задачи. Отличающиеся в первую очередь поразительной непохожестью друг на друга, системы импорта РНК в разных таксонах оказались весьма сложными для исследования. Не является исключением и человеческая клетка, в которой был показан митохондриальный импорт нескольких РНК, важнейшей из которых явлется 5 Б рРНК.

Впервые обнаруженная в митохондриях быка, цитозольная 5Б рРНК оказалась едва ли не самым высоко представленным в органеллах видом рибонуклеиновой кислоты. Присутствие её в матриксе выглядело несколько неожиданным, т.к. было принято считать, что гены 5Б рРНК бесследно исчезли из митохондриальных геномов животных и грибов, а её функцию взяли на себя новые белки, столь характерные для миторибосом. Вместе с тем, недавний цикл работ, направленных на выявление функции этой маленькой, но, как оказалось, весьма-

важной молекулы, показал, что 5S рРНК, являясь одной из наиболее консервативных макромолекул в рибосоме, выполняет роль «администратора», ответственного за координацию работы функциональных сайтов рибосомной машины. С уверенностью можно сказать, что без этого высшего регуляторного центра последовательное, чёткое и закономерное осуществление реакций элонгации является невозможным. Каким же образом эукариотические клетки решали проблему исчезновения 5S рРНК из митохондриального генома? Один из способов, как это уже отмечалось выше, состоит в замещении 5S рРНК новыми рибосомными белками, формирующими центральный протуберанец большой субчастицы (трипаносоматиды, дрожжи). Однако очевидное существование пути импорта цитозольной 5S рРНК в митохондрии позвоночных, как и ряд других косвенных данных, заставляет нас предположить, что в последнем случае может иметь место прямая замена утраченной 5S рРНК на её эукариотический ортолог. Исследованию механизма импорта 5S рРНК в митохондрии клеток человека, его регуляции и функциональной роли транспортируемой молекулы в органеллах посвящена настоящая работа.

Цель исследования.

Целью настоящей работы было исследование механизма импорта и возможной функции 5S рРНК в митохондриях клеток человека и создание рекомбинантных форм 5S рРНК, способных служить митохондриальными векторами.

Основные задачи исследования:

1. Выявить структурные элементы 5S рРНК, служащие сигналами её митохондриальной

локализации (детерминанты импорта).

2. Идентифицировать белковые факторы, необходимые для проникновения 5S рРНК в

митохондрии (факторы импорта).

3. Исследовать роль каждого фактора импорта в процессе транспорта 5S рРНК в

митохондрии.

4. Проверить гипотезу об участии импортируемой 5S рРНК в митохондриальной

трансляции.

5. Сконструировать на основе 5S рРНК векторные молекулы, способные переносить

гетерологичные последовательности РНК в матрикс человеческих митохондрий от vivo.

Научная новизна и практическая ценность работы

В результате выполнения данной работы детально охарактеризован механизм импорта 5S рРНК в митохондрии человеческих клеток. Систематическое исследование эффективности импорта мутантных версий 5 S рРНК позволило выявить существование двух сигналов митохондриальной локализации, один из которых расположен в проксимальной части спирали I, а другой - в спирали IV и петле D. Эти структурные элементы соответствуют сайтам связывания с двумя факторами импорта: митохондриальным рибосомным белком L18 (MRP-L18) и митохондриальным ферментом роданезой. Оба белка работают в молекулярном конвейере, обеспечивая эффективный «захват» молекул 5S рРНК и направление их в митохондрии. Создана минимальная in vitro система импорта 5S рРНК в человеческие митохондрии, составленная из очищенных компонентов. Охарактеризовано взаимодействие факторов импорта с молекулой РНК. Впервые продемонстрированы РНК-связывающие свойства роданезы, а также необычный шаперонный эффект, который 5S рРНК способна оказывать на денатурированный или синтезируемый на рибосоме фермент. Показано, что MRP-L18, ранее фактически не охарактеризованный представитель семейства самых консервативных 5S рРНК-связывающих белков, способен взаимодействовать с 5S рРНК прокариотического типа, но, очевидно, приобрёл также в процессе эволюции способность формировать неклассический комплекс с эукариотической 5S рРНК. Этот-результат позволил нам предположить, что комплекс 5S pPHK/MRP-LI 8 является основной формой существования 5S рРНК в митохондриях. Выделение и изучение митохондриальных' рибосом из печени крысы впервые подтвердило присутствие в их составе цитозольной 5S рРНК. Исследования in vivo, в которых подавлялась экспрессия роданезы или MRP-L18, показали, что при уменьшении импорта 5S рРНК в митохондрии наблюдается пропорциональное снижение уровня митохондриальной трансляции. Таким образом, участие импортируемой 5S рРНК как компонента миторибосомы в реакциях митохондриальной трансляции более не вызывает сомнений.

Раскрытие механизма импорта 5S рРНК позволило нам сконструировать высокоэффективную векторную систему, обеспечивающую доставку гетерологичных РНК-последовательностей в органеллы in vivo. Использование этой системы открывает широчайшие возможности как для генетических манипуляций над митохондриями, так и для терапии многочисленных заболеваний, связанных с мутациями в митохондриальном геноме.

Апробация работы

Диссертация была апробирована на заседании кафедры молекулярной биологии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. Материалы исследований, представленных в работе, докладывались или были представлены в виде стендовых сообщений на следующих международных конференциях: конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2007), XVIII Менделеевский конгресс по общей и прикладной химии (Москва, 2007), Конгресс «Meetochondrie» (Франция, 2008,2009).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из глав «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты исследования» и «Обсуждение результатов исследования». Работа завершается выводами и списком цитируемой литературы ссылок. Работу иллюстрируют^рисунков,¿таблицы и ¿приложения. Общий объём диссертации страниц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

5S рРНК высших эукариот отличается, вероятно, наиболее сложной схемой внутриклеточных перемещений. Синтезируемая за пределами ядрышка (в отличие от прочих рРНК), она нуждается в специальном пути для доставки к месту сборки рибосомных субчастиц. Путь этот оказался довольно запутанным. На системе ооцитов Xenopus laevis было показано, что 5S рРНК сначала покидает ядро в комплексе с транскрипционным фактором TFIIIA, в цитозоле она котрансляционно связывается с рибосомным белком L5 и проникает в ядрышко. После встраивания в большую рибосомную субчастицу она в последний раз покидает ядро для постоянной цитоплазматической локализации. Есть данные, позволяющие предполагать, что аналогичный транспортный путь существует также в клетках высших позвоночных. Эта схема, однако, оказалась ещё более сложной после того, как значительная часть (около 1%) пула 5S рРНК была обнаружена в митохондриальном компартменте. Детерминанты импорта 5S рРНК, механизм, посредством которого она проникает в матрикс митохондрий, наконец, её возможная функциональная роль в системе органелл на протяжении полутора десятка лет оставались неизвестными.

Разработанная ранее система импорта 5S рРНК in vitro, в которой в присутствии цитозольных белковых экстрактов удалось избирательно направить меченые молекулы РНК в матрикс выделенных человеческих митохондрий, позволила несколько приблизиться к пониманию этого процесса. В частности, было установлено, что импорт является АТФ-зависимым процессом, происходит только при наличии электро-химического потенциала на внутренней митохондриальной мембране и необходимо нуждается в растворимых цитозольных белковых факторах и интактном аппарате импорта предшественников митохондриальных белков. В настоящей работе предпринято детальное исследование механизма импорта 5S рРНК в митохондрии клеток человека на уровне детерминант и факторов импорта, возможных способов регуляции и использования этого процесса, а также той функции, которую 5S рРНК может выполнять в органеллах.

Детерминанты импорта 58 рРНК в митохондрии клеток человека

Стратегия поиска детерминант импорта. При поиске структурных элементов 5Б рРНК, ответственных за её митохондриальную локализацию в клетках человека, была использована

следующая стратегия:

СртМЛьШ«A J

UGAUC UCGGGC CAGGGUGG

Петля С с | |00 | nil I 11IIIIII

GCUGUAGCCCG GUCCCACC

Спираль II Спираль V Спираль IV

„,70

80 А

jfemnfiL

и*

Домен р

-GCCWeCUSUAWCUUGGUGGG \

IIIIII iDoea п о || 111 А !Лея)ляО

UGGGCCAMAAO!GGUCCACCAp <

Петля А т c-gW ПетляЕ

G - U С -G

Домен

и - А C-G б. C-G 2 G - С Я 5 U и _ 1MU

Сайтсвяэьванияс риОосожым белком LS

I Сайг связывания с у TFIIIA

'] Последовательность, соответствующая внутреннему промотору

G7U, GSA, СЭЦ +А(7В-вЗ] / Д(4М0)

Петля С

A74Q ДЦ7Э\ А103.С104, \

I UQAUCSUCeeeC CAGGGUGGV- ------

5 I I ooij HI III I MM II l\

U73.A74U, A77C

A(78-6S)

rGCOCUAOOCqp (J^CCCACC

О 140-240 % О 75-125 *

ПетпяО

U111C.U112C + Af78-BB)

Рис. 1. Вторичная структура 5S рРНК человека (А) и схема мутагенеза, применённая при поиске детерминант импорта (Б). Здесь и далее приведены значения относительной эффективности импорта мутантных версий в митохондрии /л vitro, в процентах от уровня 5S рРНК дикого типа.

1) in silico, с использованием программ предсказания вторичной структуры и данных о

третичной структуре отдельных модулей или целых молекул 5S рРНК были смоделированы мутантные версии человеческой 5S рРНК, в которых отдельные структурные элементы подверглись направленным изменениям (Рис. 1);

2) in vitro, транскрипты генов полученных мутантных версий были протестированы на

способность проникать в выделенные митохондрии;

3) in vivo, данные, полученные в системе in vitro, проверялись путём трансфекции

человеческих клеток мутантными транскриптами с последующим анализом эффективности их импорта.

При разработке схемы мутагенеза следующие полученные ранее данные и предположения были приняты во внимание:

> 5S рРНК дрожжей S. cerevisiae, в отличие от естественного субстрата, с довольно низкой

эффективностью (<25%) проникает в человеческие митохондрии in vitro —» особое внимание уделялось модулям, структуры которых различаются в указанных 5S рРНК;

> изолированный домен у проникает в митохондрии с очень высокой эффективностью

(-480%), в то время как домен (i практически не способен к митохондриальной локализации in vitro —» по крайней мере, часть детерминант импорта находится в домене у, в то время как домен Р, по-видимому, лишён их;

> детерминанты импорта 5S рРНК, скорее всего, соответствуют сайтам связывания с

факторами импорта, ответственными за перенос молекулы в органеллы —» мутагенез затрагивал структурные модули, потенциально способные к взаимодействию с белком. Эти данные позволили усовершенствовать стратегию поиска детерминант и ограничить набор мутантных версий.

Роль главных доменов в импорте SS рРНК. Анализ импорта in vitro гибридных версий 5S рРНК человека, в которых домены р или у, были замещены на соответствующие участки дрожжевой молекулы, подтвердил сделанные ранее выводы о возможном расположении детерминант импорта в домене у. версия с заменой домена у снизила эффективность своего импорта почти вдвое (Рис. 2А). Инертность домена р в контексте полноразмерной 5S рРНК в реакциях, связанных с импортом 5S рРНК в митохондрии, была также подтверждена в ходе анализа трёх делеций, затрагивающих отдельные структурные элементы домена: даже удаление большей части домена не приводило к снижению эффективности импорта более чем на 25% (Рис. 2Б). Основное внимание, таким образом, было сосредоточено на домене у. Влияние мутаций в домене у на эффективность импорта 5S рРНК in vitro. Систематический мутагенез домена у выявил существование трёх групп мутаций (Рис. 2В):

> нейтральные (некоторые мутации в спирали V и петле Е);

> снижающие эффективность импорта (в эту группу входят мутации, дестабилизирующие и

разрушающие район петли Е и спирали 1У-петли О);

> повышающие эффективность импорта (мутации в тех же структурных элементах, но с

противоположным, стабилизирующим эффектом). Таким образом, была выявлена отчётливая корреляция между уровнем стабильности дистапьной части домена у и способностью 5Б рРНК проникать в выделенные митохондрии. Необходимость стабилизации этой области позволила нам заключить, что спираль IV и петля О составляют одну из детерминант импорта 55 рРНК в митохондрии, вероятно, представляя собой сайт взаимодействия с тем или иным фактором импорта. Действительно, значительное расширение большой бороздки и наличие ряда неклассических структурных особенностей в этом районе (Рис. 2Г) делают его потенциально весьма благоприятным для специфичного

Д 5Э рРНК 5Б рРНК Замена Замена Б

человека дрожжей домена р домена у ¿(49-50) Д(35-42) 4(28-51) 1 2 3 4 12 12 1 2 12

В А103е,С1040, С105Э 1 2

125%

с - 0

и —

70 в С 105

— и - А

и 0 и

75 О л _ д 0 0 о А А 100

— С Г)

и —

80 и 0 и

. с- - С 95

- С

и - А

85 С- - С

_ 0 - С

~~ - 0 А 90

190% 240% 1 Петляй

иГЗА.АГ4Ц еэди.АЮШ,

А770 11102А

Д, 2 1 2

Щ> т

140% 160%

Рис. 2. Импорт мутантных версий 58 рРНК в выделенные митохондрии I. (А) Сравнение эффективностей импорта 5Э рРНК человека, дрожжей и двух мутантных версий с заменами основных доменов 55 рРНК человека на дрожжевые. Радиоавтографы денатурирующих гелей. 1 - контроль количества РНК (1-5% от реакционной смеси), 2 - РНК, проникшая в митохондрии, 3 - реакция в отсутствие факторов импорта, 4 - реакция в отсутствие митохондрий. (Б) Импорт версий 55 рРНК человека с делениями в домене р. (В) Импорт версий 55 рРНК человека с мутациями в домене у. (Г) Вторичная и третичная структуры домена у эукариотической 55 рРНК.

связывания с белковыми факторами. В то же время тот факт, что максимальное снижение эффективности импорта, вызванное описанными мутациями, не превышало 50%, заставил нас предположить существование сигналов митохондриальной локализации также в области домена а и петли A 5S рРНК.

Влияние мутаций в домене а и петле А на эффективность импорта 5S рРНК in vitro. Из четырёх мутаций в этой области молекулы две, затрагивающие петлю А и компенсированную G:U пару спирали I, не оказали значительного эффекта на импорт 5S рРНК (Рис. ЗА, Б). В тоже время, две другие мутации, вызывающие размыкание нуклеотидных пар в проксимальной части спирали I или превращающие консервативную некомпенсированную G:U пару в уотсон-криковскую G.C., приводили к такому же падению эффективности импорта 5S рРНК в выделенные митохондрии, как и в случае описанных выше мутаций в домене у

Анализ двойных мутантов 5S рРНК по выявленным детерминантам. Таким образом, в молекуле 5S рРНК было обнаружено два отчётливых структурных центра, мутации в которых вызывали заметное снижение эффективности импорта in vitro. Основным доказательством того, что эти центры действительно представляют собой детерминанты импорта 5S рРНК в митохондрии, явились результаты анализа двойных мутантов, в которых оба сайта были нарушены (Рис. ЗВ). Ни один из них не оказался способным к эффективному проникновению в выделенные митохондрии. Таким образом, два обнаруженных нами сайта в известной мере дублируют друг друга, позволяя 5S рРНК направленно перемещаться в митохондрии. Вместе с тем, интактность обоих этих модулей необходима для достижения нормальной эффективности процесса.

Анализ импорта мутантных версий 5S рРНК в человеческие митохондрии in vivo. Для проверки справедливости наших выводов в условиях живой клетки был проведён анализ эффективности импорта характеристических мутантных версий 5S рРНК из каждой из

(Рис. 1-3).

A G7U,GSft,

АС10, AU12 C9U

G7U,GSft, g с

C9U

i 2 Helix

с Helix V

12 12

70% 50%

м. ' ' ' '

РСАСС о UGGG Y

„fui ^ I '

80% 50%

В U111C, U112C + G7U, G8A,

12 12

AÍ78-9Í

<5%

Д(78-38)

<5%

^ и 1, C9U ♦ 5'- G - С "35

U 5

Рис. 3. Импорт мутантных версий 58 рРНК в выделенные митохондрии II. (А)

Импорт версий 55 рРНК человека с мутациями в домене а. Обозначения те же, что и на рис. 2. (Б) Вторичная структура домена а и области петли А 5Б рРНК человека. (В) Импорт двойных мутантов 58рРНК человека по детерминантам доменов а и у.

описанных выше групп в трансфицированных транскриптами человеческих клетках линии HepG2 (Рис. 4). Чтобы обойти проблему детектирования мутантных транскриптов в условиях подавляющего избытка эндогенных 5S рРНК, мы воспользовались тем фактом, что домен Р не принимает участия в импорте и, следовательно, может быть использован для введения гетерологичной РНК-последовательности («ярлыка»). Использование радиоактивно меченых зондов, комплементарных этому «ярлыку», позволяет избирательно отслеживать содержание мутантных РНК в митохондриальном компартменте методом Норзерн-блот гибридизации. Описанный подход позволил получить ряд важных результатов. Так, было показано, что дестабилизирующие мутации в обеих детерминантах приводят к снижению импорта in vivo, причём, если повреждение в домене а характеризуется лишь сравнительно небольшим эффектом, то делеция сайта в домене у приводит к резкому падению уровня импорта, независимо от состояния второго сайта. Эти данные позволяют заключить, что область спирали IV и петли D является основной детерминантой импорта 5S рРНК in vivo, в то время как спираль I скорее выполняет роль дополнительной платформы для взаимодействия с факторами импорта.

5S рРНК как вектор. Другим важным результатом описанного эксперимента явился фактически первый случай успешной доставки гетерологичной последовательности РНК длиной в 13 нуклеотидов в митохондрии живых человеческих клеток с помощью естественного эндогенного механизма импорта 5S рРНК. В другом эксперименте, где человеческие клетки были стабильно трансфицированы генами соответствующих мутантных

Д Б Тотальная РНК

сРи

C—G AG-Ua

AU—0A5Q

G-c АД- ua AAG_CG гои—А С— О c — G ео С—G А — иг С —G С —в

дополнительных U96A G7U. G8A мутаций G97A C9U

087 С. G98U

G7U, G8A

C9U+ Нетрансф ициро ванные ¿(78-981 иням

Мутант ная SS рРНК <4* ШЯШ вИ*" ш

ЬАтто тРНК (Лей) 1ЯШ ЯЯШ ШШШш ЯИРВ

5SpPHK дикого тип: ЩШт тт ш» ■«иг

Штахондриапьная РНК

Ь^тантная SSpPHK Ш ты». Ш

Мчто тРНК(Лей) щшШш fiSSSil ИВ т- щц ÉR

Цито т Р Н К (Лиз) §¡¡§¡ ЯШ "i . :1 "г :

SSpPHK энного типа шш ШЯЯШ Мк. ш ■ш

Эффективно ешь импорта

100% 95% 75% 25% 35%

Рис. 4. Импорт мутантных версий 5S рРНК in vivo. (А) Вторичная структура домена р 5S рРНК человека с заменой спирали III и петли С на гетерологичную РНК-последовательность (выделена). (Б) Норзерн-блот гибридизация препаратов тотальной и митохондриальной РНК, выделенных из клеток HepG2, которые были трансфицированы мутантными 5S рРНК на основе версии с заменой в домене р.

5Б рРНК, удалось показать, что вектор со встройкой нормально экспрессируется, экспортируется из ядра и проникает в митохондрии (Рис. 5А). Таким образом, в результате наших экспериментов оказалось возможным создание высокоэффективных РНК-векторов, которые из-за нарушения сайта связывания с рибосомным белком Ь5 не способны к встраиванию в цитозольные рибосомы и, следовательно, не оказывают токсического влияния на систему трансляции, а направленно проникают в митохондрии с эффективностью в 20 раз более высокой, чем естественный субстрат. Основными структурными особенностями векторов на основе 5Б рРНК являются (Рис. 5Б):

> наличие зоны внутреннего промотора для обеспечения экспрессии;

> сохранение сайтов связывания с белком ТРША для экспорта из ядра;

> наличие интактных детерминант импорта в митохондрии;

> замена большей части домена (5 на переносимую РНК-последовательность.

Эта система открывает новые возможности для генетических манипуляций над митохондриями млекопитающих. В настоящее время векторы на основе 55 рРНК используются в нашей лаборатории для доставки в человеческие митохондрии терапевтических последовательностей РНК, способных подавлять репликацию мутантных

А Т М

« ^ « /

5Б рРНК дикого типа

5Э рРНК с заменой в домене р. ... ш м

Сайт связывания с рибосомным белком 15 замещён на гетерологшную Р НК-последо езтельность (вста

1„

Сайты связывания с ТИПА необходимы для зксяорта из ядра

А^дд е: с

\ »а'шиееэиае—>

5,1111 !!! ¡1 ! П I И

дШ8Й «всосс иаоосс.»!

1-ж:®

¡8.-1

Ы А си фйипоо

«мРвеитсое /

Пййкейогатвйьнссгй. сййгзетстгу-ощие / внутреннему промотору, Н«:Об?СОЯЙЙЫ ЙКЯ транскрипции

.....

Домен р

X |: Ф

СЕ

с -о

А - и У ~ А

с-о с -в

6-С

г и ■ки

Домен

-ч /Зртерминэнта импорта домена у

Детерминанта импорта домена а

Рис. 5. 58 рРНК человека как вектор. (А) 58 рРНК с заменой в домене (5 эффективно экспрессируется в человеческих клетках и проникает в митохондрии. Результаты ОТ-ПЦР на тотальных (Т) и митохондриальных (М) препаратах РНК, выделенных из трансфицированных клеток. (Б) Схема организации вектора на основе 5Б рРНК человека.

геномов и, таким образом, нивелировать негативные эффекты многих митохондриальных синдромов, до того считавшихся неизлечимыми.

Факторы импорта 58 рРНК в митохондрии клеток человека

По крайней мере два белковых фактора участвуют в импорте 5Б рРНК. Ранее было показано, что 5Б рРНК нуждается в определённых цитозольных белках, направляющих её импорт в митохондрии. Чтобы идентифицировать эти белки, было проведено многоступенчатое фракционирование грубого клеточного экстракта с использованием дифференциального осаждения, гель-фильтрации, ионообменной и аффинной хроматографии. На каждой стадии проверялась способность фракций направлять импорт 5Б рРНК в выделенные человеческие митохондрии. Интересно, что начиная с первых же этапов фракционирования ни одна из полученных фракций не оказалась импорт-компетентной, и лишь определённая комбинация двух фракций обеспечивала эффективный импорт 58 рРНК (Рис. 6А). Этот результат показывает, что, по крайней мере, два белковых фактора необходимы для проникновения 5Б рРНК в человеческие митохондрии, перекликаясь с приведёнными выше данными о существовании двух детерминант импорта.

Роданеза как фактор импорта. Дальнейшее фракционирование одной из активных фракций с последующим анализом её компонентов методами денатурирующего гель-электрофореза и

Рис. 6. Роданеза как фактор импорта 5S рРНК. (А) Импорт in vitro 5S рРНК в присутствии белковых фракций, полученных дифференциальным осаждением сульфатом аммония (первая панель), аффинной хроматографией на гепарин-сефарозе (вторая панель), и при замене одной из фракций на коммерческий препарат роданезы (третья панель). (Б) Импорт 5S рРНК зависит от количества роданезы в растворе. Приведены результаты тестов на импорт 5S рРНК в выделенные человеческие митохондрии в присутствии возрастающих концентраций роданезы (верхняя панель) или белковых фракций, в которых роданеза была предварительно иммунопреципитирована специфичными антителами (нижняя панель).

Норс-вестерн блот гибридизации показало существование в ней белка размером -33 кДа, обладающего 5S рРНК-связывающей активностью. Среди кандидатов, выявленных масс-спектрометрическим анализом, особый интерес представляла роданеза. Это митохондриальный фермент, синтезируемый на свободных цитозольных рибосомах, который, благодаря шаперонам, сохраняется в энзиматически неактивном состоянии до тех пор, пока не проникнет в митохондриальный матрикс. Его роль в метаболизме митохондрий предположительно состоит в осуществлении окислительно-восстановительных реакций, связанных с детоксикацией цианида, синтезом железо-серных кластеров и, возможно, другими процессами. Роданеза является членом огромного семейства белков, чьи функции простираются от ферментативного катализа до сигнальных процессов. Её участие в импорте 5S рРНК в митохондрии удалось показать напрямую: при реконституции системы импорта in vitro фракцию, в которой она была идентифицирована, можно заменить на чистый фермент без потери системой способности направлять импорт 5S рРНК (Рис. 6А, Б). Более того, эффективность импорта возрастала с увеличением концентрации роданезы, пока не достигала насыщения (Рис. 6Б). В обратном эксперименте, когда роданеза была путём иммунопреципитации удалена из белкового экстракта, эффективность импорта снижалась

5SfiPHK человекэ

Wli

• мм» ••««*

Моляршй избыток конкурентной РНК

g мутжт

Роданеза - •

Натисный гель

0.5 1 1.5 2 2.5 [Связанная 5S рРНК),нМ

Без добялеми РНК СО Ш

Сюбодная 5S рРНК

Денатурирующий гель

^ ^-роданеза

>35S

Рис. 7. Взаимодействие роданезы с 58 рРНК. (А) 58 рРНК-роданезный комплекс, выявленный методом задержки в геле, и Скэтчард-плот для оценки его константы диссоциации. (Б) Влияние неспецифического (тРНК Е. соИ) и специфического (немеченая 58 рРНК человека) конкурентов на формирование 58 рРНК-роданезного комплекса. (В) Взаимодействие роданезы с 55 рРНК, мутантными по детерминантам импорта. Приведён Скэтчард-плот для оценки константы диссоциации комплекса с рРНК с делецией в домене у. (Г) Котрансляционное связывание 5в рРНК с роданезой в кроличьем ретикулоцитном лизате. Реакции трансляции проводились в присутствии 1 мкМ добавленной РНК.

вплоть до его полного прекращения. Таким образом, роданеза, традиционно считавшаяся лишь второстепенным митохондриальным ферментом, представляет собой первый идентифицированный фактор импорта 5S рРНК в человеческие митохондрии, что существенным образом расширяет круг её функций в клетке.

Взаимодействие роданезы с 5S рРНК. Приведённые выше результаты позволяют предположить, что роданеза как фактор импорта 5S рРНК в митохондрии обладает специфическим сродством к своему субстрату. Вместе с тем, никаких данных о способности роданезы связывать нуклеиновые кислоты в литературе не существует. Таким образом, взаимодействие между роданезой и 5S рРНК нуждалось в специальном исследовании.

Интересно, что энзиматически активная роданеза оказалась практически не способной к взаимодействию с 5S рРНК. Однако ввиду отсутствия в цитозоле нативных молекул роданезы (см. выше), было выдвинуто предположение, что, возможно, какая-либо ненативная конформация роданезы окажется лучшим партнёром по связыванию с 5S рРНК. Широкий диапазон подобных неправильно сложенных форм можно получить, используя стандартный метод денатурации в присутствии мочевины с последующим разбавлением денатуранта. Методом задержки в геле было показано, что денатурированная роданеза, как и было предсказано, с очень сильным сродством (Kj ~ 20 пкМ) связывала 5S рРНК (Рис. 7А). Исследование влияния специфических и неспецифических конкурентов на это взаимодействие показало, что значительная часть комплексов (-20%) являются 5S рРНК-специфическими, что в условиях сосуществования в растворе множества разных по физико-химическим характеристикам форм роданезы является весьма хорошим показателем (Рис. 7Б). Так как роданеза является фактором импорта, было выдвинуто предположение, что её сайты связывания с 5S рРНК по крайней мере частично перекрываются или полностью соответствуют детерминантам импорта, идентифицированным ранее. Анализ взаимодействия денатурированного фермента с мутантной версией 5S рРНК с делецией спирали IV и петли D показал, что константа диссоциации комплекса возрастает в ~200 раз. Разрушение же детерминанты в спирали I приводит к полной потере сродства к роданезе (Рис. 7В). Таким образом, основным сайтом связывания для роданезы является спираль I 5S рРНК, в то время как детерминанта из домена у выполняет, по-видимому, вспомогательную роль, позволяя сильно повысить прочность комплекса.

С результатами описанных выше экспериментов хорошо согласуется тот факт, что денатурированная роданеза является гораздо более активной в реакциях импорта 5S рРНК in vitro, чем нативная (в последнем случае, вполне возможно, импорт объясняется частичной денатурацией фермента в процессе проведения реакции) (Рис. 6Б). Однако вопрос о биологической значимости «неправильной» конформации роданезы оставался открытым.

Было выдвинуто предположение, что роданеза может взаимодействовать с 5Б рРНК котрансляционно, ещё до того, как с ней свяжутся шапероны. Ранее было показано, что 5Б рРНК взаимодействует таким образом с рибосомным белком Ь5, причём в процессе связывания оба партнёра изменяют конформацию друг друга, т.е. являются взаимными шаперонами. Чтобы проверить, возможен ли подобный тип формирования комплекса в случае роданезы, был проведён аналогичный эксперимент. Радиокативно меченая роданеза была синтезирована в кроличьем ретикулоцитном лизате в присутствии флуоресцентно меченой 5Б рРНК, неспецифической РНК либо в отсутствии каких-либо добавок. В том случае, если 58 рРНК была внесена в самом начале трансляции, ~35% новосинтезированного белка обнаруживалось в составе 58 рРНК-роданезных комплексов (Рис. 7Г). Если то же количество 5Б рРНК добавляли, когда трансляция уже практически прекратилась (т.е. постгрансляционно), не более 10% белка попадало в комплекс с 58 рРНК. В отсутствии дополнительной 58 рРНК или при добавлении неспецифической РНК ~5% новосинтезированного фермента находилось в комплексе с 58 рРНК (очевидно, эндогенной). Необходимо отметить, что комплекс с 58 рРНК во всех случаях представлял собой, по-видимому, единственный РНП, формируемый роданезой в ретикулоцитном лизате. Таким образом, бьио показано, что связывание 58 рРНК с роданезой не только может происходить в физиологических условиях, но, более того, осуществляется котрансляционно. 58 рРНК как шаперон для роданезы. Полученные нами данные выявили значительное сходство в способах взаимодействия 58 рРНК с такими непохожими белками, как роданеза и Ь5. Кроме того, тот факт, что роданеза сразу после трансляции оказывается связанной шаперонами и пребывает в энзиматически неактивном состоянии, заставил нас предположить, что 5Б рРНК также способна выполнять роль шаперона при взаимодействии с неправильно сложенной роданезой. Для проверки этой гипотезы был использован стандартный тест на агрегацию денатурированной роданезы после разбавления денатуранта. В присутствии шаперонов этот процесс замедляется или даже полностью останавливается, что является рутинным методом для доказательства их активности. Так как обычно конформация шаперона является критической для его активности, были протестированы две формы человеческой 58 рРНК. Теоретически, петля А практически любой рРНК, представляющая собой типичное трёхосевое соединение (Рис. 1А), способна принимать одну из двух возможных конформаций: компактную палочкообразную и разветвлённую. Первая из них соответствует функционально активной, рибосомной форме, вторая была продемонстрирована, в частности, для одной бактериальной 58 рРНК в растворе. Анализ подвижности человеческой 58 рРНК в нативном ПААГ показал, что она также способна принимать две альтернативные конформации: быстро мигрирующую в присутствии ионов

Mg2+ (5S pPHKMg) и менее подвижную в их отсутствие (5S pPHKEDTA) (Рис. 8А). Измерение расстояния между концами доменов р и у методом FRET в геле показало, что в первом случае оно весьма велико (>120 Â), в то время как во втором концы доменов сближены до 35-38 Â, в полном соответствии с параметрами, ожидаемыми для компактной и разветвлённой конфораций 5S рРНК, соответственно (Рис. 8Б). Интересно, что лишь последняя форма оказалась активной в тесте на агрегацию роданезы. В то время как в отсутствие каких-либо добавок агрегация продолжалась даже спустя 10 мин после разбавления денатуранта, в присутствии 5S pPHKEDTA кривая приобретала характерную двуфазную форму (Рис. 8В). В первые 1-1,5 мин никакого эффекта не наблюдалось: неправильно сложенные молекулы роданезы активно формировали агрегаты. Но после этого наступала резкая остановка агрегации без существенного дальнейшего роста оптической плотности, что свидетельствует о практически мгновенном исчезновении «липких» форм роданезы из раствора. Та же самая

5S рРНК H Y H Y

ЭДТА + + - -

Мд(2+) - - + +

Нативный гель

Денатурирующий гель

0,14 ■ 0,12

£! 0-08 ■

со <

о.ое ■ о,м 0.02 о

» .у.

$Г

JrBft®*

^ïaiililîlli

> 120 А

5S рРНКМд человека (семейство С)

5S pPHKEDTA человека (семейство А)

Рис. 8. 5S рРНК как шаперон для роданезы. (А) Подвижность в нативном ПААГ человеческой (Н) и дрожжевой (Y) 5S рРНК, свёрнутых в присутствии или в отсутствие ионов магния. (Б) Модели третичных структур 5S рРНК человека, построенные на основе измерений расстояния между концами доменов Р и у методом FRET в геле. (В) Тест на агрегацию роданезы. Верхняя группа кривых (несупремированных) соответствует агрегации фермента в отсутствие каких-либо добавок либо при добавлении 5S рРНКМе человека, мутантных версий 5S рРНКЭДТА человека по сайтам связывания с роданезой, тРНК Е. coli, одно- или двуцепочечных ДНК. Нижняя группа кривых (супрессированных) соответствует агрегации в присутствии разных концентраций 5S рРНКэд А человека и дрожжей и 5S pPHKMg дрожжей.

35-38 А

кинетика наблюдалась при добавлении 58 рРНК дрожжей, которая, независимо от присутствия ионов магния в растворе, обладает довольно рыхлой конформацией, близкой по подвижности к 5в рРНКЭДТА человека (Рис. 8А, В). Подобная кинетика подавления агрегации («резкая отложенная остановка»), хотя и не является классической, была описана для ряда белковых шаперонов, что, очевидно, отражает механистические отличия этого процесса от традиционного «постепенного замедления».

Добавление того же количества человеческой 5в рРНКМв, неспецифических РНК или ДНК никоим образом не отражалось на кинетике агрегации роданезы, что свидетельствует о том, что наблюдаемый эффект является не только 5в рРНК-специфическим, но, более того, конформационно-специфическим. Остановка агрегации непосредственным образом зависит от взаимодействия роданезы с 5Б рРНКЕ0ТА, т.к. мутантные формы 5Б рРНК с разрушенными сайтами связывания с роданезой оказались неспособными подавлять агрегацию, даже будучи сложенными в отсутствие ионов магния (Рис. 8). Характерным для этого взаимодействия является также тот факт, что 58 рРНК, в отличие от «классических» шаперонов, не восстанавливала энзиматическую активность роданезы. Измерение УФ-спектров роданезы в разных состояниях показало, что конформация, возникающая при взаимодействии с 58 рРНК, сочетает в себе признаки как нативной, так и денатурированной форм: хотя её спектр ближе по форме к последней, в отличие от неё, конформация роданезы в комплексе куда более компактная, приближаясь к таковой нативного фермента. Эти результаты прекрасно согласуются с данными об отсутствии роданезной активности в цитозоле, что позволяет

№|цепрЭЦ1Я РНК зкррнкчзлмзе

HÜ«**

SSpPHKf.coA1

§§м>«*»«»*■« •

H'TBUW В Д0М»Н9

jtkÀ, wP

Koiирпрац| я РНК

pOI l(J , I M

Рис. 9. 5S рРНК-связывающие свойства MRP-L18.

анализа митохондриальных белков на связывание с анализ взаимодействия MRP-L18 с 5S рРНК Е. coli и рРНК человека.

(А) Радиоавтограф Норс-вестерн блот 5S рРНК человека. (Б) Скэтчард-плот различными мутантными версиями 5S

предполагать, что 5S рРНК, взаимодействуя с роданезой в процессе трансляции, подобно белковым шаперонам, участвует в её «консервировании» в неактивной конформации, таким образом обеспечивая и свой собственный импорт в митохондрии.

MRP-L18 как 5S рРНК-связывающий фактор. Норс-вестерн блот анализ митохондриального белкового экстракта выявил существование в органеллах всего двух 5S рРНК-связывающих белков (Рис. 9А). Один из них (~33 кДа), вероятно, соответствует роданезе, в то время как другой (~18 кДа) ранее охарактеризован не был. Среди митохондриальных белков такого размера наиболее интересным является рибосомный белок L18 (MRP-L18). Интересен он прежде всего потому, что принадлежит к тому же семейству, что и цитозольный L5, т.е. входит в группу самых консервативных 5S рРНК-связывающих белков. Однако, как уже было отмечено, митохондриальная 5S рРНК довольно давно была потерена в процессе эволюции животной клетки, в то время как её основной белковый партнёр сохранился и присутствует в составе больших субчастиц миторибосом млекопитающих. Факт существования пути импорта 5S рРНК из цитозоля заставил нас предположить, что MRP-L18 не потерял своей 5S рРНК-связывающей способности, но, вероятно, научился также распознавать -импортированную 5S рРНК эукариотического типа. Так как этот белок до настоящего времени оставался совершенно не изученным, было предпринято детальное исследование его РНК-связывающих своств (Рис. 9Б). Для этого как зрелый рекомбинантный MRP-L18, так и его предшественник были экспрессированы в бактериальной культуре и очищены до индивидуального состояния. Полученные препараты использовались для исследования их РНК-связывающих свойств методом задержки в геле с последующим анализом по Скэтчарду. Оба белка идентичным образом взаимодействовали со всеми РНК, формируя комплексы одинаковой подвижности. Выяснилось, что хотя MRP-L18 всё ещё способен взаимодействовать с 5S рРНК бактериального типа (Kj = 18 нМ), с заметно лучшим сродством он связывает человеческую 5S рРНК (Kj = 0,83 нМ), что свидетельствует о значительном смещении в РНК-связывающих свойствах этого бактериального по происхождению белка. Изменение специфичности MRP-L18 сопровождалось не только значительными перестройками в его структуре (в том числе в основных 5S рРНК-связывающих модулях), но и, как показали наши эксперименты, изменением способа формирования комплекса. Так, оказалось, что мутации или даже полное уничтожение основных сайтов связывания 5S рРНК с белками еЬ5/Ы8-семейства (спирали I и III, петля А) мало или вообще не сказываются на константе диссоциации комплекса, в то время как делеция спирали IV и петли D, которые ни в одном известном случае не взаимодействуют с рибосомными белками, приводили к полному исчезновению сродства 5S рРНК к MRP-L18.

Эти данные явно указывают на неклассический характер формирования комплекса между MRP-L18 и импортированной 5S рРНК.

IlpeMRP-L18 как Фактор импорта 5S рРНК. Любопытно, что обнаруженный нами сайт связывания 5S рРНК с MRP-L18 совпадает с одной из детерминант импорта 5S рРНК в человеческие митохондрии. Это позволяет предполагать, что npeMRP-L18 может также быть вовлечён в процесс доставки 5S рРНК к митохондриям. Действительно, роданеза в сочетании с npeMRP-L18 оказались способными обеспечить высокий уровень импорта 5S рРНК в выделенные человеческие митохондрии без необходимости добавления каких-либо иных белковых факторов. Количество импортированной РНК, как и в предыдущем случае, возрастало с увеличением концентрации npeMRP-L18 (Рис. 10А). Таким образом, нам впервые удалось реконструировать минимальную систему импорта 5S рРНК в человеческие митохондрии из очищенных компонентов (Рис. 10Б). Своё функциональное объяснение получили также детерминанты импорта, которые, в полном согласии с выдвинутым предположением, соответствуют сайтам связывания с двумя факторами импорта 5 S рРНК в митохондрии.

Система npeMRP-L 18/поданеза как молекулярный конвейер. Сайты взаимодействия 5S рРНК с факторами импорта, очевидно, перекрываются: область спирали IV и петли D является хотя и дополнительным, но весьма важным участком связывания для роданезы и совершенно необходима для формирования комплекса с npeMRP-L18. Отсюда возникает вопрос: каким образом роданеза и (npe)MRP-L18 взаимодействуют с транспортируемой молекулой в цитозоле и в митохондриальном матриксе в контексте описанной двубелковой системы? Для ответа на него мы исследовали методом задержки в геле формирование комплексов 5S рРНК в присутствии обоих факторов импорта, находящихся либо в «цитозольных», либо в «митохондриальных» конформациях.

В первом случае роданеза была предварительно денатурирована, как описано выше, а MRP-L18 сохранял сигнальный пептид. При повышении концентрации роданезы, как и следовало ожидать, концентрация комплекса с npeMRP-L18 постепенно снижалась, a 5S рРНК-роданезного - возрастала. При этом последний комплекс формировался более чем на порядок лучше, чем в отсутствие npeMRP-L18 (Рис. 10В). Однако наиболее необычным был тот факт, что с ростом концентрации npeMRP-L 18 всё больше 5S рРНК включалось не в комплекс с ним, а опять же в комплекс с роданезой. Это поведение весьма характерно для последовательных реакций. Таким образом, очевидно, npeMRP-L 18 взаимодействует с 5S рРНК, подготавливая её для последующего связывания с роданезой. Так как в отсутствие npeMRP-L 18 5S рРНК лишь незначительно включается в комплекс с роданезой, резонно предположить, что рибосомный белок, подобно прочим представителям семейства eL5/L18,

обладает сильной РНК-шаперонной активностью и способен вызывать переход 5Б рРНК в другую конформацию, благоприятную для связывания с роданезой. Это предположение согласуется с полученными нами данными о том, что лишь необычная конформация семейства А является шаперонно-активной при взаимодействии с роданезой. Справедливость этой гипотезы подтверждается в тесте на агрегацию роданезы (Рис. ЮГ): в то время как 55 рРНКм« (см. Рис. 8В) и преМКР-Ы8 поодиночке оказываются неспособными повлиять на ход агрегации денатурированной роданезы, та же 58 рРНКМе, преинкубированная с каталитическими количествами преМЯР-Ы8, вызывает заметное подавление агрегации и даже некоторое обращение процесса спустя 7 мин после начала реакции. Таким образом, система преМЯР-Ы8 представляет собой молекулярный конвейер, в котором имеют место

| 50

|!зо

Рода I июль

iptURF-LtS, I шопь

* ** ♦

141Т08СШЬНЫв фермы

6 Koirpont ЮЛ1Ч6СТК1 РНКО^) + - + + - Роаанзэ

- + + - + ipedRPLis

+ + + - - MlTOXOUpil

ans -

ф Еез/оСавок □ Рода1С5а * ipe URP-L1S д Р<иа1ЕИ* iceUHP-L1S* ♦ S3 рР НК (Mfl) ЧЕЛО и ta

Time, min

Митосонфизлыыв формы

л- НгтммредаваЮэяит)* Ф „V ♦ URP-L1S

Рис. 10. IIpeMRP-L18 как фактор импорта. (А) Импорт 5S рРНК в выделенные человеческие митохондрии положительно зависит от концентрации npeMRP-L18. (Б) Реконституция минимальной системы импорта 5S рРНК в митохондрии in vitro. (В) Формирование комплексов между 5S рРНК, роданезой и (npe)MRP-L18 в условиях, когда белки находятся в «цитозольных» (денатурированная роданеза и npeMRP-L18) или «митохондриальных» (нативная роданеза и MRP-L18) конформациях. (Г) Кинетика агрегации роданезы в присутствии 5S рРНКм®, преинкубированной с npeMRP-L18.

два шаперонных эффекта: преМ11Р-1Л8 изменяет конформацию 5Б рРНК, позволяя ей активно взаимодействовать с роданезой, для которой уже она является шапероном (Рис. II). Нами была разработана математическая модель этого конвейера, позволившая оценить константы скорости каждой стадии (к/ = 4 -105 М"'-с"', кг ~ 5,0 -107 М"' с"', 25°С). Полученные значения объясняют ряд характерных моментов поведения системы:

передача 58 рРНК на роданезу происходит столь быстро, что ни значительные количества комплекса с преМЯР-Ы8, ни тем более тройственный комплекс не наблюдаются; > достаточно лишь каталитических количеств преМКР-Ы8, для обеспечения работы «конвейера» - белок, таким образом, функционирует в «миницикле», обеспечивая эффективный забор молекул 55 рРНК, которые тут же «сбрасываются» на роданезу.

Таким образом, роданеза, очевидно, функционирует как переносчик 5S рРНК к митохондриям, в то время как npeMRP-L18 выполняет роль промежуточного, «адапторного» звена в пути импорта. Действительно, если заменить npeMRP-L18 в системе импорта in vitro

на зрелый белок, способный взаимодействовать с 5S рРНК, но не проникать в митохондрии, эффективность импорта нисколько не уменьшается. Напротив, при замене денатурированной роданезы на нативную, не способную к связыванию 5S рРНК, и проведении реакции в присутствии тиосульфата, предотвращающего денатурацию фермента, импорт 5S рРНК прекращается.

Совершенно иначе складывается ситуация в митохондриальном матриксе. При инкубации 5S рРНК с нативной роданезой и зрелым MRP-LI8 формируется исключительно комплекс с последним белком, что было вполне ожидаемо, т.к. нативный фермент лишён 5S рРНК-связывающей активности (Рис. 10В). Таким образом, MRP-L18 в этой системе остаётся единственным 5S рРНК-связывающим фактором, позволяя предполагать, что именно в форме комплекса с ним 5S рРНК существует в митохондриях млекопитающих.

Полученные данные позволили нам предложить детальную модель системы импорта 5S рРНК в человеческие митохондрии (Рис. 11). 5S рРНК, экспортированная из ядра, становится объектом конкуренции между двумя альтернативными путями. Первый из них осуществляется через взаимодействие с рибосомным белком L5, который направляет 5S рРНК, в конечном счёте, в цитозольные рибосомы. Второй обеспечивается его митохондриальным ортологом npeMRP-L18, который представляет собой первое звено в цепи импорта в митохондрии. ПреМКР-L 18 довольно быстро изменяет конформацию 5S рРНК и котрансляционно передаёт её на роданезу. Энзиматически неактивная роданеза в прочном комплексе с 5S рРНК затем перемещается к митохондриям и обе молекулы проникают в матрикс. При этом роданеза благодаря шаперонам приобретает нативную конформацию и утрачивает сродство к 5S рРНК, которая, таким образом, снова меняет партнёра по взаимодействию на MRP-L18.

Система импорта SS рРНК in vivo. Чтобы продемонстрировать необходимость роданезы и npeMRP-L18 для импорта 5S рРНК in vivo и, соответственно, подтвердить справедливость выводов, сделанных нами на основании исследования системы импорта in vitro, были проведены исследования на культуре клеток человека, в которых экспрессия одного из этих белков была подавлена с помощью специфических малых интерферирующих РНК (Рис. 12). В обоих случаях наблюдался один и тот же эффект: количество импортированной в митохондрии 5S рРНК снижалось пропорционально уменьшению концентрации фактора импорта. И напротив, восстановление экспрессии фактора спустя несколько дней после трансфекции клеток сопровождалось нормализацией уровня импорта 5S рРНК. Таким образом, оба этих белка необходимы для транспорта 5S рРНК в человеческие митохондрии как in vitro, так и in vivo.

Возможная функция 5S рРНК в митохондриях млекопитающих

Митохондрии млекопитающих отличаются от прочих аналогичных систем (например, дрожжей и трипаносоматид), в которых произошла потеря собственных генов 5S рРНК, двумя характерными моментами:

> в ядерном геноме кодируется, экспрессируется и затем обнаруживается в составе

миторибосом важнейший и наиболее консервативный 5S рРНК-связывающий белок -MRP-L18;

> цитозольная 5S рРНК импортируется в митохондрии, где она является одним из самых

высоко представленных типов РНК.

Ф Роданээа

SSpPHK M

tRLmt M

tRMcyt M

SSfPHK т

tRLmt т

tRMcyt т

^ ^РШ

•щ» Ш Ш 4»

©Тубулт

sspPHK

tRTmt

tRKcyt

SSpPHK tRTmt

* »»«л

» *

— '

Рис. 12. Импорт 5S рРНК в человеческие митохондрии in vivo. (А) и (Г) Обратимое подавление экспрессии роданезы и MRP-L18 в клетках HepG2, трансфицированных соответствующими миРНК. Показаны результаты Вестерн-блот анализа. (Б) и (Д) Норзерн-блот анализ митохондриальных (М) и тотальных (Т) препаратов РНК из трансфицированных клеток с зондами,

комплементарными 5S рРНК, митохондриалышм тРНКЛсй (tRLmt) и тРНКТрс (tRTmt) и цитозольным тРНКМст (tRMcyt) и тРНКЛю (tRKcyt) . (В) и (Е) Радиоавтограф

денатурирующего геля с продуктами митохондриальной трансляции в

трансфицированных клетках.

Оба этих факта явно указывают на возможность вовлечения 5S рРНК в формирование структуры миторибосом. Это предположение было впоследствии подкреплено также количественным анализом, показавшим, что число митохондриальных копий 5S рРНК практически совпадает с числом миторибосом. Ещё одним свидетельством в пользу выдвинутой гипотезы являются полученные в настоящей работе данные о взаимодействии MRP-L18 с импортированной 5S рРНК.

Обнаружение факторов импорта 5S рРНК открыло новые возможности для исследования её функций в митохондриях. Описанная выше система импорта in vivo, в которой проникновение 5S рРНК в митохондрии может быть эффективно подавлено путём выключения экспрессии роданезы или MRP-L18, позволила напрямую наблюдать фенотипические эффекты снижения импорта. Как и ожидалось, уменьшение уровня 5S рРНК приводило к пропорциональному общему снижению уровня митохондриальной трансляции (Рис. 12В, Е). При этом, если в случае подавления экспрессии MRP-L18 полученный эффект ещё можно было бы объяснить прямым воздействием на один из важнейших миторибосомных белков, то в случае роданезы, которая никоим образом не вовлечена в реакции трансляции, вывод оказывается однозначным: импортированная 5S рРНК участвует в митохондриальной трансляции, вероятнее всего, как компонент рибосомы.

Хотя все приведённые выше данные практически не оставляют места сомнениям относительно «заместительной» функции импортированной 5S рРНК, до сих пор никакие попытки локализовать её в митохондриальных рибосомах не увенчались успехом. Полагая, что это может быть связано со значительной лабильностью связей 5S рРНК (или 5S рРНК-MRP-L18 комплекса) с остальной рибосомой и вероятной потерей этого компонента в процессе выделения, мы предприняли прямое фракционирование митохондриального лизата печени крысы центрифугированием в сахарозном градиенте. Этот подход впервые позволил

хЛЛ Концентрация лЛ^ д РНК*ЫЛ

Б 1 2 3 4 5 6 7 0 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1В 19

5SPPHK ISSpPHK _ .„«._<

12S рРНК * * Г •<■ ~

5S рРНК *» « «i р^ *»«»*,#< » • 5.8S РРНК

5.8S рРНК

Рис. 13. Импортированная 58 рРНК обнаруживается в составе миторибосом. (А)

Норзерн-блот анализ препаратов РНК из митохондрий, предварительно обработанных РНКазой А. (Б) Норзерн-блот анализ фракций, полученных фракционированием митохондриального лизата на сахарозном градиенте. Приведена первая половина градиента (нумерация фракций от более лёгких к более тяжёлым).

показать, что в препарате лизата митохондрий значительная часть 5S рРНК кофракционируется с митохондриальными рибосомами (Рис. 13Б). При предварительной обработке митохондрий РНКазой А (для снижения уровня цитозольного загрязнения) 5S рРНК сохраняется в составе фракции миторибосом, в то время как 5,8S рРНК практически полностью расщепляется. Грубый препарат миторибосом, получаемый высокоскоростным центрифугированием из митохондриального лизата, также демонстрирует характерное снижение доли цитозольного загрязнения с ростом концентрации РНКазы А при чётком сохранении соотношения количеств 5S рРНК и 12S рРНК (Рис. 13А). Интересно, что после РНКазной обработки митохондрий в градиенте исчезает характерный пик свободной 5S рРНК, что явно говорит о практически полном включении импортированных молекул 5S рРНК в состав миторибосом. Этот результат согласуется с уже упомянутыми данными о равенстве числа молекул митохондриальной 5S рРНК и миторибосом, а также с нашей моделью системы 5S рРНК/роданеза/МКР-1Л8, согласно которой в митохондриях 5S рРНК преимущественно должна быть вовлечена в комплекс с MRP-L18. Таким образом, в полном согласии с выдвинутой гипотезой, 5S рРНК, импортируемая из цитозоля, включается в состав миторибосом (по-видимому, в составе комплекса с MRP-L18), где выполняет важную роль в поддержании митохондриальной трансляции. Описанное явление представляет собой довольно редкий, а во многом даже уникальный, случай прямой замены компонента генетической системы бактериального типа на его эукариотический ортолог. В целом, рассмотренный в настоящей работе адаптивный механизм сильно выделяет митохондриальную систему млекопитающих среди её аналогов из других систематических групп, демонстрируя совершенно новую тенденцию в эволюции этих органелл.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружены структурные элементы, обусловливающие митохондриальную локализацию

5S рРНК человека (детерминанты импорта), - область спирали IV-петли D и проксимальная часть спирали I.

2. Идентифицированы и охарактеризованы белковые факторы импорта 5S рРНК -

митохондриальный фермент роданеза и предшественник митохондриального рибосомного белка L18 (npeMRP-L18).

3. Детально исследовано взаимодействие между факторами импорта и 5S рРНК и механизм,

обеспечивающий митохондриальную локализацию 5S рРНК.

4. Впервые показано присутствие импортированной 5S рРНК в миторибосомах

млекопитающих, получены данные об её участии в митохондриальной трансляции.

5. Создана высоко эффективная векторная система на основе 5S рРНК, обеспечивающая доставку гетерологичных РНК-последовательностей в человеческие митохондрии in vivo.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ Статьи

1. Smirnov, A. Tarassov, I., Mager-Heckel, А.-М., Letzelter, M., Martin, R.P. Krasheninnikov,

I.A., and Entelis, N. (2008). Two distinct structural elements of 5S rRNA are needed for its import into human mitochondria. RNA, 14,749 - 759.

2. Смирнов A.B., Энтелис Н.С., Крашенинников И.А., Мартэн Р., Тарасов И.А. (2008). ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ 5S рРНК, ЕЁ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С МАКРОМОЛЕКУЛАМИ И ВОЗМОЖНЫЕ ФУНКЦИИ. Успехи биологической химии, т. 48, сс. 133-180.

3. Smirnov, А. V., Entelis, N. S., Krasheninnikov, I. A., Martin, R. and Tarassov, I. A. (2008).

Specific Features of 5S rRNA Structure - Its Interactions with Macromolecules and Possible Functions. Biochemistry (Moscow), Vol. 73, No. 13, pp. 1418-1437.

Тезисы докладов

1. Entelis, N., Mager-Heckel, A.M., Kolesnikova., O., Smirnov., A., Boucheham, A., Karicheva,

O., Krasheninnikov, I., Martin, R.P., Tarassov, I. Directed RNA import into' human mitochondria as a way to complement pathogenic mutations in mtDNA. XVIII Mendeleev Congress on General and Applied Chemistry, Moscou, 23-28 September 2007.

2. Смирнов A.B., Энтелис H.C., Крашенинников И.А., Мартэн Р., Тарасов И.А. Специфические и неспецифические РНК-связывающие свойства роданезы: новая функция старого домена. XIV Международная молодежная научная конференция "Ломоносов-2007", Москва, 2007.

3. Heckel, А.-М., Comte, С., Entelis, N., Smirnov, A., Lombès, A., Martin, R., Tarassov, I. Anti-genomic approach to mitochondrial therapy by exploiting RNA mitochondrial import Congrès «Meetochondrie», Aussois, avril 2008.

4. Comte, С., Entelis, N., Smirnov, A., Martin, R., Tarassov, I. Rhodanese as a new RNA mitochondrial import factor. Congrès «Meetochondrie», Aussois, avril 2008.

5. Entelis, N., Heckel, A.-M., Comte, С., Smirnov, A., Lombès, A., Martin, R., Tarassov, I. RNA mitochondrial import and gene therapy. Congrès «Meetochondrie», Aussois, avril 2008.

6. Smirnov, A., Comte, С., Mager-Heckel, A.-M., Krasheninnikov, I., Martin, R., Entelis, N.,

Tarassov, I. An interplay between mitochondrial ribosomal protein L18 and enzyme rhodanese assures targeting of a functional 5S rRNA into human mitochondria. Congrès «Meetochondrie», La Grande Motte, 4-7 mai 2009.

7. Comte, С., Heckel, A.-M., Martin, R., Lombès, A., Smirnov, A., Tarassov, I., Entelis, N.

Import d'ARN recombinants dans les mitochondries humaines comme voie d'inhibition de la replication de l'ADN mitochondrial portant des mutations pathogéniques. Congrès «Meetochondrie», La Grande Motte, 4-7 mai 2009.

8. Tarassov, I., Smirnov, A., Comte, C., Kamenski, P., Mager-Heckel, A.-M., Martin, R.P., Krasheninnikov, I., Entelis, N. Adressage d'ARN dans les mitochondries et traduction mitochondriale: différentes voies menant à la même fonction? Congrès «Meetochondrie», La Grande Motte, 4-7 mai 2009.

Подписано в печать:

17.09.2009

Заказ № 2514 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Смирнов, Александр Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Особенности структуры 5S рРНК, её взаимодействия с макромолекулами и возможные функции.

1. Общие сведения о 5S рРНК.

2. Особенности структуры 5S рРНК.

2.1. Спираль I.

2.2. Спираль II.

2.3. Петли В и С.

2.4. Спираль III.

2.5. Спирали IV и V и петля D.

2.6. Петля Е.

Петля Е бактериального типа.

Петля Е эукариотического типа.

2.7. Конформационная подвижность и реорганизация структуры 5S рРНК.

3. Взаимодействия с биологическими макромолекулами.

3.1. Взаимодействие с транскрипционным фактором IIIA.

3.2. Взаимодействия с рибосомными белками eL5/L 18-ссмейства.

3.3. Взаимодействие с рибосомным белком L5 прокариот.

3.4. Взаимодействие с бактериальным рибосомным белком L25.

3.5. Взаимодействие с 23S рРНК.

4. Функции 5S рРНК.

5. Импорт 5S рРНК в митохондрии клеток млекопитающих.

Возможная роль 5S рРНК в митохондриях млекопитающих.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

1. Штаммы Е. coli и линии клеток человека.

1.1. Штаммы Е. coli.

1.2. Линии клеток человека.

2. Генно-инженерные конструкции.

2.1. Генно-инженерные конструкции для клонирования и экспрессии генов версий 5S рРНК.

2.2. Генно-инженерные конструкции для экспрессии генов (npe)MRP-L18.

3. Моделирование вторичных структур версий 5S рРНК in silico.

4. Генно-инженерные методы.:.

4.1. Создание генов мутантных версий 5S рРНК.

ПЦР-мутагенез генов 5SрРНК.

Клонирование генов 5SрРНК.

4.2. Клонирование генов (npe)MRP-L18.

ПЦР-амплификация генов (npe)MRP-L18.

Клонирование генов (npe)MRP-L18.

5. Экспрессия мутантных версий 5S рРНК.

5.1. Экспрессия мутантных версий 5S рРНК in vitro.

ПЦР генов мутантных версий 5SрРНК.

Рестрикция ПЦР-продуктов.

77-транскрип ция.

5.2. Экспрессия мутантных версий 5S рРНК in vivo.

Стабильная трансфекция человеческих клеток генами мутантной

5S рРНК.

Выделение тотальной РНК из трансфицированных клеток.

Обратная транскрипция с последующей ПЦР (ОТ-ПЦР).

6. Экспрессия генов белков.

6.1. Экспрессия генов (npe)MRP-L18 в клетках Е. coli.

6.2. Экспрессия генов белков в бесклеточной сопряжённой системе транскрипции-трансляции.

ПЦР генов белков.

Бесклеточная сопряжённая система транскрипции-трансляции.

7. Анализ конформации 5S рРНК.

7.1. Нативный гель-электрофорез.

7.2. Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) в геле.

Сборка и гель-электрофорез 5 S рРНК.

Количественный анализ данных FRET в геле.

8. Методы, использованные в экспериментах с роданезой.

8.1. Характеристика фермента и хранение.

8.2. Определение энзиматической активности.

8.3. Денатурация.

8.4. Термоинактивация.

8.5. Реактивация.

8.6. Агрегация.

8.7. Измерение УФ-спектров роданезных форм.

8.8. Вестерн-блот анализ.

Гель-электрофорез белков по Лэммли.

Вестерн-блоттинг.

8.9. Иммунодеплетирование роданезы из белковых экстрактов.

9. Анализ РНК-белковых взаимодействий.

9.1. Задержка в геле.

9.2. Анализ по Скэтчарду.

9.3. Норс-Вестерн блоттинг.

10. Котрансляционное взаимодействие между роданезой и 5S рРНК.

10.1. Флуоресцентное мечение 5S рРНК.

10.2. Реакция котрансляционноо связывания.

11. Импорт белков и 5S рРНК в выделенные митохондрии человека.

11.1. Выделение митохондрий из клеток человека.

11.2. Импорт белков в выделеннные митохондрии.

11.3. Импорт 5S рРНК в выделенные митохондрии человека.

Выделение и фракционирование белков, направляющих импорт 5S рРНК.

Дефосфорилирование Т7-транскриптов 5SpPHK.

Меченые транскриптое.

Реакция импорта 5SрРНК в выделенные митохондрии.

Расчёт эффективности импорта версий 5S рРНК в выделенные митохондрии.л.

12. Импорт 5S рРНК in vivo.

12.1. Импорт мутантных версий 5S рРНК в митохондрии стабильно трансфицированных человеческих клеток.

12.2. Импорт мутантных версий 5 S рРНК в митохондрии человеческих клеток, трансфицированных транскриптами.

Трансфекция человеческих клеток транскриптами.

Норзерн-блот гибридизация.

Расчёт эффективности импорта версий 5SрРНК в митохондрии in vivo.

13. Ингибирование экспрессии генов роданезы и MRP-L18 с помощью РНК-интерференции.

14. Анализ экспрессии митохондриальных белков in vivo.

15. Выделение и анализ митохондриальных рибосом.

15.1. Выделение и Норзерн-блот анализ грубого препарата митохондриальных рибосом.

Выделение грубого препарата миторибосом печени крысы.

Норзерн-блот анализ РНК из грубого препарата миторибосом.

15.2. Фракционирование митохондриального лизата печени крысы на сахарозном градиенте.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Детерминанты импорта 5S рРНК в митохондрии клеток человека.

1.1. Стратегия поиска детерминант импорта.

1.2. Роль главных доменов в импорте 5S рРНК.

1.3. Влияние делеций в домене р на эффективность импорта 5 S рРНК in vitro.

1.4. Влияние мутаций в домене у на эффективность импорта 5S рРНК in vitro.

1.5. Влияние мутаций в домене а и петле А на эффективность импорта 5S рРНК in vitro.

1.6. Анализ двойных мутантов 5S рРНК по доменам а и у.

1.7. Анализ импорта мутантных версий 5S рРНК в человеческие митохондрии in vivo.

1.8. Возможный механизм регуляции распределения 5S рРНК в эукариотической клетке.

1.9. 5S рРНК как вектор.

2. Факторы импорта 5S рРНК в митохондрии клеток человека.

2.1. Получение и анализ белковых фракций, направляющих импорт 5S рРНК in vitro.

2.2. Роданеза как фактор импорта.

2.3. Взаимодействие роданезы с 5S рРНК.

2.4. 5S рРНК как шаперон для роданезы.

Анализ конформации 5SрРНК человека в растворе.

Конформационно-специфичный шаперонный эффект 5S рРНК. 146 Конформация роданезы в комплексе с 5S рРНК.

2.5. MRP-L18 как 5S рРНК-связывающий фактор.

2.6. IïpeMRP-L18 как фактор импорта 5S рРНК.

2.7. Система преМЯР-ЬШроданеза как молекулярный конвейер.

Взаимодействия 5S рРНК с роданезой и (npe)MRP-L18 в минимальной системе импорта.

Математическая модель, описывающая конвейерный механизм передачи 5 S рРНК.

Взаимодействия 5S рРНК с "митохондриальными" формами роданезы и MRP-L18.

2.8. Система импорта 5S рРНК in vivo.

3. Возможная функция 5 S рРНК в митохондриях млекопитающих.

Необходимость импортированной 5S рРНК для поддержания митохондриальной трансляции.

Импортированная 5S рРНК как компонент миторибосомы млекопитающих.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Ранние этапы эволюции рибосомы.

Эволюция митохондриальной рибосомы. Вариант I: протисты.А75 Эволюция митохондриальной рибосомы. Вариант II: растения и животные.

Развитие механизма импорта 5SрРНК в митохондрии.

TIpeMRP-Ll8 как первый фактор импорта.

Роданеза как второй фактор импорта или один из «вторых факторов»?.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование механизма импорта 5SpPHK в митохондрии клеток человека и использование рекомбинантных форм 5SpPHK как векторов"

К таким механизмам в первую очередь относится импорт кодируемых ядерным геномом макромолекул в органеллы. Направленное перемещение белков из цитозоля в митохондрии, очевидно, является одним из наиболее древних приобретений эукариотической клетки. Осуществляемое благодаря работе высоко консервативного белкового аппрата, оно было тщательно исследовано и в настоящее время описано в деталях. Вместе с тем, значительно позже и, очевидно, независимо в разных систематических группах митохондрии начали терять также отдельные гены РНК, что усилило их интеграцию в эукариотическую систему клетки-хозяина. Потеря своих РНК (и, по крайней мере, в одном случае, описанном у дрожжей, развитие нового адаптивного механизма - Катепзк! а1., 2007) привела к необходимости выработать специальный механизм для их импорта из цитозоля. У протистов, растений, грибов и животных самые разнообразные белковые системы были использованы для осуществления этой задачи (см. для обзора ТагаББОУ е/ а1., 2007). Отличающиеся в первую очередь поразительной непохожестью друг на друга, системы импорта РНК в разных таксонах оказались весьма сложными для исследования. Не является исключением и человеческая клетка, в которой был показан митохондриальный импорт нескольких РНК, важнейшей из которых явлется 5Б рРНК (ЕЩеИв е1 а!., 2001).

Впервые обнаруженная в митохондриях быка, цитозольная 5Б рРНК оказалась едва ли не самым высоко представленным в органеллах видом рибонуклеиновой кислоты (Ма§аШае8 ега1., 1998). Присутствие её в матриксе выглядело несколько неожиданным, т.к. было принято считать, что гены 5Б рРНК бесследно исчезли из митохондриальных геномов животных и грибов, а её функцию взяли на себя новые белки, столь характерные для миторибосом (БЬагша е? а/., 2003). Вместе с тем, недавний цикл работ, направленных на выявление функции этой маленькой, но, как оказалось, весьма важной молекулы, показал, что 58 рРНК, являясь одной из наиболее консервативных макромолекул в рибосоме, выполняет роль «администратора», ответственного за координацию работы функциональных сайтов рибосомной машины (ЮрапБОУ еХ а1., 2005). С уверенностью можно сказать, что без этого высшего регуляторного центра последовательное, чёткое и закономерное осуществление реакций элонгации является невозможным.

Каким же образом эукариотические клетки решали проблему исчезновения 58 рРНК из митохондриального генома? Один из способов, как это уже отмечалось выше, состоит в замещении 58 рРНК новыми рибосомными белками, формирующими центральный протуберанец большой субчастицы (трипаносоматиды, дрожжи - 8Ьагта е1 а1, 2009). Однако очевидное существование пути импорта цитозольной 58 рРНК в митохондрии позвоночных, как и ряд других косвенных данных, заставляет нас предположить, что в последнем случае может иметь место прямая замена утраченной 58 рРНК на её эукариотический ортолог.

Исследованию механизма импорта 5 S рРНК в митохондрии клеток человека, его регуляции и функциональной роли транспортируемой молекулы в органеллах посвящена настоящая работа.

Целью настоящей работы было исследование механизма импорта и возможной функции 5 S рРНК в митохондриях клеток человека и создание рекомбинантных форм 5 S рРНК, способных служить митохондриальными векторами.

Основные задачи исследования:

1. Выявить структурные элементы 5S рРНК, служащие сигналами её митохондриальной локализации (детерминанты импорта).

2. Идентифицировать белковые факторы, необходимые для проникновения

5S рРНК в митохондрии (факторы импорта).

3. Исследовать роль каждого фактора импорта в процессе транспорта 5 S рРНК в митохондрии.

4. Проверить гипотезу об участии импортируемой 5S рРНК в митохондриальной трансляции.

5. Сконструировать на основе 5 S рРНК векторные молекулы, способные переносить гетерологичные последовательности РЕЙС в матрикс человеческих митохондрий in vivo. В результате выполнения данной работы детально охарактеризован механизм импорта 5 S рРНК в митохондрии человеческих клеток. Систематическое исследование эффективности импорта мутантных версий 5 S рРНК позволило выявить существование двух сигналов митохондриальной локализации, один из которых расположен в проксимальной части спирали I, а другой - в спирали IV и петле D. Эти структурные элементы соответствуют сайтам связывания с двумя факторами импорта: митохондриальным рибосомным белком L18 (MRP-L18) и митохондриальным ферментом роданезой. Оба белка работают в молекулярном конвейере, обеспечивая эффективный «захват» молекул 5S рРНК и направление их в митохондрии. Создана минимальная in vitro система импорта 5 S рРНК в человеческие митохондрии, составленная из очищенных компонентов. Детально охарактеризовано взаимодействие факторов импорта с молекулой РНК. Впервые продемонстрированы РНК-связывающие свойства роданезы, а также необычный шаперонный эффект, который 5 S рРНК способна оказывать на денатурированный или синтезируемый на рибосоме фермент.

Показано, что MRP-L18, ранее фактически не охарактеризованный представитель семейства самых консервативных 5 S рРНК-связывающих белков, способен взаимодействовать с 5 S рРНК прокариотического типа, но, очевидно, приобрёл в процессе эволюции способность формировать также неклассический комплекс с эукариотической 5 S рРНК. Этот результат позволил нам предположить, что комплекс 5S pPHK/MRP-L18 является основной формой существования 5S рРНК в митохондриях. Выделение и изучение митохондриальных рибосом из печени крысы впервые подтвердило присутствие в их составе цитозольной 5 S рРНК. Исследования in vivo, в которых подавлялась экспрессия роданезы или MRP-L18, показали, что при уменьшении импорта 5 S рРНК в митохондрии наблюдается пропорциональное снижение уровня митохондриальной трансляции. Таким образом, участие импортируемой 5 S рРНК как компонента миторибосомы в реакциях митохондриальной трансляции более не вызывает сомнений.

Раскрытие механизма импорта 5 S рРНК позволило нам сконструировать высокоэффективную векторную систему, обеспечивающую доставку гетерологичных РНК-последовательностей в органеллы in vivo. Использование этой системы открывает широчайшие возможности как для генетических манипуляций над митохондриями, так и для терапии многочисленных заболеваний, связанных с мутациями в митохондриальном геноме.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Особенности структуры 58 рРНК, её взаимодействия с макромолекулами и возможные функции

Малые некодирующие РНК привлекают внимание исследователей как сохранившиеся до нашего времени представители гипотетического «мира РНК», который, по-видимому, предшествовал современному этапу эволюции жизни на Земле. Среди малых РНК особый интерес представляет 5Б рРНК. Она является компонентом рибосом всех живых организмов, за исключением рибосом митохондрий грибов и животных, и взаимодействует с разнообразными белковыми факторами, а также с 23 Б (288) рРНК. Предполагают, что 5Б рРНК должна играть важную роль в процессе синтеза белка на рибосоме. Вместе с тем, несмотря на обилие данных о структуре и взаимодействиях 5 Б рРНК с другими биологическими макромолекулами, её функция остаётся невыясненной.

За более чем тридцатилетнюю историю изучения 5 Б рРНК стала классическим модельным объектом в исследованиях структуры и динамики РНК в растворе и в составе комплексов с белками, процесса РНК-белкового распознавания и связывания. Весьма интригующим стало открытие импорта 5Б рРНК эукариотического типа в митохондрии позвоночных, хотя механизм этого переноса до сих пор не ясен. Загадочна и роль эукариотической 58 рРНК в прокариотической системе митохондрий. Настоящий обзор посвящён рассмотрению особенностей структуры 58 рРНК в контексте её взаимодействий с разнообразными факторами и выполняемых ею функций.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Смирнов, Александр Владимирович

ВЫВОДЫ

1. Обнаружены структурные элементы, обусловливающие митохондриальную локализацию 5S рРНК человека (детерминанты импорта), — область спирали IV-петли D и проксимальная часть спирали I.

2. Идентифицированы и охарактеризованы белковые факторы импорта 5S рРНК - митохондриальный фермент роданеза и предшественник митохондриального рибосомного белка L18 (npeMRP-L18).

3. Детально исследовано взаимодействие между факторами импорта и 5S рРНК и механизм, обеспечивающий митохондриальную локализацию 5S рРНК.

4. Впервые показано присутствие импортированной 5S рРНК в миторибосомах млекопитающих, получены данные об её участии в митохондриальной трансляции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Смирнов, Александр Владимирович, Москва

1. Andersen, J. and Delihas, N. (1986) J. Biol. Chem. 261, 2912-2917. Aoyama, K., Tanaka, T., Hidaka, S. and Ishikawa, K. (1984) J. Biochem. 95, 11791186.

2. Ban, N;, Nissen, P., Hansen, J., Moore, P.B. and Steitz, T.A. (2000) Science 289, 905920.

3. Ehresmann, С. (1991) У. Mol. Biol. 218, 69-81. Baumstark, T., Schröder, A.R.W. and Riesner, D. (1997) EMBO J. 16, 599-610. Bear, D.G., Schleich, T., Noller, H.F. and Garrett, R.A. (1977) Nucl. Acids Res. 4, 2511-2526.

4. Bhattacharyya, A.M. and Horowitz, P.M. (2001) J Biol Chem 276, 28739-28743. Blobel, G. (1971) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 68, 1881-1885.

5. Bogdanov, A.A., Dontsova, O.A., Dokudovskaya, S.S., Lavrik, I.N. (1995) Biochem.

6. Cell. Biol. 73, 869-876. Bokov, K. and Steinberg, S.V. (2009) Nature 457, 977-980.

7. Branch, A.D., Benenfeld, B.J., and Robertson, H.D. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82, 6590-6594.

8. Brubacher-Kauffmann, S., Maréchal -Drouard, L., Cosset, A., Dietrich, A. and Duchêne, A.-M. (1999) Nucleic Acids Res., 27, 2037-2042.

9. Chen, H.-C., Viry-Moussaid, M., Dietrich, A. and Wintz, H. (1997) Biochem. and

10. Biophys. Research Comm. 237, 432-437. Chow, C.S., Hartmann, K.M., Rawling, S.L., Huber, P.W., and Barton, J.K. (1992)

11. Biochemistry 31, 3534-3542. Ciesiolka, J., and Krzyzosiak, W.J. (1996) Biochem. Mol. Biol. Int. 39, 319-328. Clegg, R.M., Murchie, A.I.H., Zechel, A., Carlberg, C., Diekmann, S. and Lilley,

12. D.M.J. (1992) Biochemistry 31, 4846-4856. Correll, C.C., Beneken, J., Plantinga, M.J., Lubbers, M. and Chan, Y.-L. (2003) Nucl.

13. R. (1996) RNA 2, 146-152. Dontsova, O., Tishkov, V., Dokudovskaya, S., Bogdanov, A., Döring, T., RinkeAppel, J., Thamm, S., Greuer, B., and Brimacombe, R. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91, 4125-4129.

14. Dörner, M., Altmann, M., Pääbo, S. and Morl, M. (2001) Mol. Biol. Cell 12, 26882698.

15. Douthwaite, S., Garrett, R.A., Wagner, R. and Feunteun, J. (1979) Nucl. Acids Res. 6, 2453-2470.

16. Dulbecco, R. and Freeman, G. (1959) Virology. 8, 396-397. Eilers, M., and Schatz, G. (1986) Nature 322, 228-232.

17. Enriquez, J.A., Cabezas-Herrera, J., Bayona-Bafaluy, M.P., and Attardi, G. (2000) J

18. Biol Chem 275, 11207-11215. Entelis, N., Brandina, I., Kamenski, P., Krasheninnikov, I.A., Martin, R.P., and

19. Tarassov, I. (2006) Genes Dev 20(12), 1609-1620. Entelis, N.S., Kolesnikova, O.A., Dogan, S., Martin, R.P., and Tarassov, I.A. (2001) J.

20. Biol. Chem. 276, 45642-45653. Erdmann, V.A., Fahnestock, S., Higo, K., and Nomura, M. (1971) Proc. Natl. Acad.

21. Sei. USA 68, 2932-2936. Fahnestock, S.R. and Nomura, M. (1972) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69, 363-365. Fernandez-Silva, P., Martinez-Azorin, F., Micol, V., and Attardi, G. (1997). Embo J 16, 1066-1079.

22. Forget, B. G.; Weissman, S. M. (1967) Science 158, 1695-1699. Förster, Th. (1948) Phys. 2, 55-75.

23. Funari, S.S., Rapp, G., Perbandt, M., Dierks, K., Vallazza, M., Betzel, C., Erdmann,

24. V.A., Svergun, D.I. (2000) JBiol Chem 275(40), 31283-31288. Giegerich, R., Haase, D., Rehmsmeier, M. (1999) Pacific Symposium on

25. Biocomputing 126-137. Glick, B., and Schatz, G. (1991) Annu Rev Genet 25, 21-44. Glover, K.E., Spencer, D.F., and Gray, M.W. (2001) J. Biol. Chem. 276, 639-648.

26. Grohmann, L., Graack, H.R., Kruft, V., Choli, T., Goldschmidt-Reisin, S., Kitakawa,

27. M. (1991) FEBS Lett 284, 51-56. Hanas, J.S., Bogenhagen, D.F. and Wu, C.W. (1984) Nucl. Acids Res. 12, 2745-2758. Hancock, K., LeBlanc, A.J., Donze, D., and Hajduk, S.L. (1992) J. Biol Chem. 267, 23963-23971.

28. Haslbeck, M. (2006) Int J Biol Macromol 38(2), 107-14.

29. Helm, M. (2006) Nucl. Acids Res. 34, 721-733.

30. Henis, Y.I. and Levitzki, A. (1976) Eur JBiochem 71, 529-532.

31. Hofacker, I.L. (2003) Nucl Acids Res. 31, 3429-3431.

32. Home, J.R. and Erdmann, V.A. (1972) Mol Gen Genet 119(4), 337-344.

33. Home, J.R. and Erdmann, V.A. (1973) Proc. Natl Acad. Sci. USA 70, 2870-2873.

34. Horowitz, P.M., and Criscimagna, N.L. (1990) J Biol Chem 265, 2576-2583.

35. Huber, P. W., Rife, J. P., Moore, P. B. (2001) J. Mol Biol V. 312, 823.

36. Huber, P. W. and Wool, I.G. (1984) Proc. Natl Acad. Sci. USA 81, 322-326.

37. Huber, P.W. and Wool, I.G. (1986) Proc. Natl Acad. Sci. USA 83, 1593-1597.1.oda, N., Tanaka, T. and Ishikawa, K. (1981) J. Biochem. 90, 551-554.

38. Kamenski, P., Kolesnikova, O., Jubenot, V.,Entelis, N., Krasheninnikov, I.A., Martin,

39. Kiparisov, S., Petrov, A., Meskauskas, A., Sergiev, P.V., Dontsova, O.A., Dinman, J.D. (2005) Mol. Gen. Genomics 274, 235-247.

40. Kiprekar, F., Douthwaite, S., and Roepstorff, P. (2000) RNA 6, 296-306.

41. Koc, E.C., Burkhart, W., Blackburn, K., Moyer, M.B., Schlatzer, D.M., Moseley, A., and Spremulli, L.L. (2001) J. Biol. Chem. 276, 43958-43969.

42. Kolesnikova, O.A., Entelis, N.S., Jacquin-Becker, C., Goltzene, F., Chrzanowska-Lightowlers, Z.M., Lightowlers, R.N., Martin, R.P., and Tarassov, I. (2004) Hum Mol Genet 13, 2519-2534.

43. Korepanov, A.P., Gongadze, G.M., and Garber, M.B. (2004) Biochemistry 69, 607611.

44. Koulintchenko, M., Konstantinov, Y., and Dietrich, A. (2003) EMBOJ22(6), 12451254.

45. Koulintchenko, M., Temperley, R.J., Mason, P.A., Dietrich, A., and Lightowlers, R.N. (2006) Human Mol Genet 15(1), 143-154.

46. Kouvela, E.C., Gerbanas, G.V., Xaplanteri, M.A., Petropoulos, A.D., Dinos, G.P. and Kalpaxis, D.L. (2007) Nucl. Acids Res. 1-12.

47. Magalhäes, P.J., Andreu, A.L., and Schon, E.A. (1998) Mol. Biol. Cell 9, 2375-2382.

48. Mager-Heckel, A.-M., Brandina, I., Kamenski, P., Entelis, N., Martin, R.P., Tarassov,1. (2007) Methods Mol. Biol. 373, 235-253.

49. Marechal-Drouard, L., Weil, J.-H. and Guillemaut, P. (1988) Nucleic Acids Res. 16, 4777-4788.

50. Martin, R.P., Schneller, J.M., Stahl, A.J. and Dirheimer, G. (1979) Biochemistry 18, 4600-4605.

51. Maruyama, S. and Sugai, S. (1980) J. Biochemistry 88, 151-158.

52. Maslov, D.A., Sharma, M.R., Butler, E., Falick, A.M., Gingery, M., Agrawal, R.K., Spremulli, L.L., Simpson, L. (2006) Molecular and Biochemical Parasitology 148, 69-78.

53. Matthews, D.E., Hessler, R.A., Denslow, N.D., Edwards, J.S., and O'Brien, T.W. (1982) J Biol Chem 257, 8788-8794.

54. Matthews, D.H., Sabina, J., Zuker, M. & Turner, D.H. (1999) J. Mol. Biol. 288, 911940.

55. McDougall, J. and Wittmann-Liebold, B. (1994) Eur. J. Biochem. 221, 779-785.

56. Mears, J.A., Sharma, M.R., Gutell, R.R., McCook, A.S., Richardson, P.E., Caulfield, T.R., Agrawal, R.K., and Harvey, S.C. (2006) J Mol Biol 358, 193-212.

57. Meskauskas, A. and Dinman, J.D. (2001) RNA 7, 1084-1096.

58. Miller, D.M., Delgado, R., Chirgwin, J.M., Hardies, S.C., and Horowitz, P.M. (1991) J Biol Chem 266, 4686-4691.

59. Minami, Y., Hohfeld, J., Ohtsuka, K„ Hartl, F.U. (1996) J Biol Chem 271(32), 19617-19624.

60. Miyazaki, M. (1974) J. Biochem. 75, 1407-1410.

61. Momen, H. (2001) Int JParasitol 31, 640-642.

62. Moreira, D., Kervestin, S., Jean-Jean, O. and Philippe, H. (2002) Mol Biol and Evolution 19, 189-200.

63. Mottram, J.C., Bell, S.D., Nelson, R.G., and Barry, J.D. (1991) J. Biol. Chem. 266, 18313-18317.

64. Nakashima, T., Yao, M., Kawamura, S., Iwasaki, K., Kimura, M., and Tanaka, I. (2001)m4 7, 692-701.

65. Nazar, R.N., Willick, G.E., and Matheson, A.T. (1979) J. Biol. Chem. 254,1506-1512.

66. Nierlich, D.P. (1982) Mol. Cell. Biol 2, 207-209.

67. Nishikawa, K., and Takemura, S. (1974) FEBS Lett. 40, 106-109.

68. Nishikawa, K. and Takemura, S. (1977) J.Biochem. 81, 995-1003.

69. Nishikawa, K. and Takemura, S. (1978) J. Biochem. 84, 259-266.

70. Nishikori, S., Yamanaka, K., Sakurai, T., Esaki, M., Ogura, T. (2008) Genes Cells 13(8), 827-838.

71. Nissen, P., Ippolito, J.A., Ban, N., Moore, P.B., and Steitz, T.A. (2001) Proc. Natl Acad. Sci. USA 98, 4899-4903.

72. O'Brien, T. W., Liu, J., Sylvester, J.E., Mougey, E.B., Fischel-Ghodsian, N., Thiede, B., Wittmann-Liebold, B., and Graack, H.-R. (2000) J. Biol Chem. 275: 18153 -18159.

73. Ogata, K., Terao, K. and Uchiumi, T. (1980) J. Biochem. 87, 517-524.

74. Ogata, K., Kurashashi, A., Nishiyama, C., and Terao, K. (1993) Eur J Biochem 213(3), 1277-82.

75. Oshima, T. (1994) Tanpakushitsu Kakusan Koso 39(15), 2406-2047.

76. Pace, B., Matthews, E.A., Johnson, K.D., Cantor, C.R., and Pace, N.R. (1982) Proc.

77. Sei. USA 102, 3913-3920. Raue, H.A., Lorenz, S., Erdmann, V.A. and Planta, R.J. (1981) Nucl. Acids Res. 9, 1263-1269.

78. Salinas, T., Duchene, A.-M., Delage, L., Nilsson, S., Glaser, E., Zaepfel, M., and

79. Scripture, J.B. and Huber, P.W. (1995) J. Biol. Chem. 270, 27358-27365. Semrad, K., Green, R., and Schroeder, R. (2004) RNA 10, 1855-1860. Sharma, M., Booth, T.M., Simpson, L., Maslov, D.A., Agrawal, R.K. (2009) PNAS 106(24), 9637-9642.

80. Sharma, M.R., Koc, E.C., Datta, P.P., Booth, T.M., Spremulli, L.L., and Agrawal,

81. R.K. (2003) Cell 115, 97-108. Shpanchenko, O. V., Dontsova, O. A., Bogdanov, A. A. and Nierhaus, K. H. (1998) RNA 4, 1154-1164.

82. Silberg, J.J., Hoff, K.G., and Vickery, L.E. (1998) JBacteriol 180, 6617-6624. Simpson, A.M., Suyama, Y., Dewes, H., Campbell, D.A. and Simpson, L. (1989)

83. Nucleic Acids Res. 17, 5427-5444. Skibinska, L., Banachowicz, E., Gapinski, J., Patkowski, A., Barciszewski, J. (2004)

84. Biopolymers 73, 316-325. Sloan, I.S., Horowitz, P.M., and Chirgwin, J.M. (1994) J Biol Chem 269, 2762527630.

85. Smith, M.W., Meskauskas, A., Wang, P., Sergiev, P.V., and Dinman, J.D. (2001) Mol.

86. Cell. Biol. 21, 8264-8275. Smits, P., Smeitink, J.A.M., van den Heuvel, L.P., Huynen, M.A., Ettema, T.J.G.2007) Nucl Acids Res 35(14), 4686-4703. Spierer, P., Bogdanov, A.A., and Zimmermann, R.A. (1978) Biochemistry 17, 53945398.

87. Steitz, J.A., Berg, C., Hendrick, J.P., La Branche-Chabot, H., Metspalu, A., Rinke, J. and Yario, T. (1988)J.CellBiol. 106, 545-556.

88. Stoldt, M., Wohnert, J., Gorlach, M. and Brown, L.R. (1998) EMBOJ. 17, 6377-6384.

89. Stoldt, M., Wohnert, J., Ohlenschlager, O., Gorlach, M. And Brown, L.R. (1999) EMBOJ. 18, 6508-6521.

90. Studnicka, G.M, Eiserling, F.A. and Lake, J.A. (1981) Nucl. Acids Res. 9, 1885-1904.

91. Su, A.I., Wiltshire, T., Batalov, S., et al (2004). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (16), 6062-7.

92. Suzuki, T., Terasaki, M., Takemoto-Hori, C., Hanada, T., Ueda, T., Wada, A., and Watanabe, K. (2001) J. Biol. Chem. 276, 21724-21736.

93. Szymanski, M., Barciszewska, M.Z., Erdmann, V.A. and Barciszewski, J. (2000) Mol. Biol.Evol. 17, 1194-1198.

94. Szymanski, M., Barciszewska, M.Z., Erdmann, V.A. and Barciszewski, J. (2003) Biochem. J. 371, 641-651.

95. Tarassov I, Kamenski P, Kolesnikova O, Karicheva O, Martin RP, Krasheninnikov IA, Entelis N. (2007) Cell Cycle 6(20), 2473-2477.

96. Theunissen, O., Rudt, F. and Pieler, T. (1998) Eur. J. Biochemistry 258, 758-767.

97. Tompa, P. and Csermely, P. (2004) FASEB J. 18, 1169-1175.

98. Toots, I., Metspalu, A., Villems, R. and Saarma, M. (1981) Nucl. Acids Res. 9, 53315343.

99. Toots, I., Misselwitz, R., Bohm, S., Welfle, R., Villems, R. And Saarma, M. (1982) Nucl. Acids Res. 10, 3381-3389.

100. Wagner, R. and Garrett, R.A. (1978) Nucl. Acids Res., 5, 4065-4075.

101. Waltner, M., Hammen, P.K., and Weiner, H. (1996) J Biol Chem 271, 21226-21230.

102. Weber, F., and Hayer-Hartl, M. (2000) Methods Mol Biol 140, 111-115.

103. Weidner, H. and Crothers, D.M. (1977) Nucl. Acids Res. 4, 3401-3414.

104. White, S. A., Nilges, M., Huang, A., Brunger, A. T., Moore, P. B. (1992)

105. Biochemistry V. 31 1610. Williamson, J.R. (2000) Nature Struct. Biol. 7, 834-837.

106. Wimberly, B., Varani, G., and Tinoco, I, Jr. (1993) Biochemistry 32, 1078-1087. Woestenenk, E.A., Gongadze, G.M., Shcherbakov, D.V., Rak, A.V., Garber, M.B.,

107. Hard, T., Berglund, H. (2002) Biochem. J. 363, 553-561. Wong, T.W. and Clayton, D.A. (1986) Cell 45, 817-825. Xiong, Y., Sundaralingam, M. {2000) RNA V. 6 1316.

108. Yeh, L.-C. C., Horowitz, P.M., and Lee, J.C. (1988) J. Biol. Chem. 263, 17412-17417. Yoshionari, S., Koike, T., Yokogawa, T., Nishikawa, K., Ueda, T., Miura, K., and Watanabe, K. (1994) FEBS Lett. 338, 137-42.

109. Zuker, M. (2003) Nucleic Acids Res. 31, 3406-3415.

Информация о работе

Смирнов, Александр Владимирович
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Исследование механизма импорта 5SpPHK в митохондрии клеток человека и использование рекомбинантных форм 5SpPHK как векторов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Исследование механизма импорта 5SpPHK в митохондрии клеток человека и использование рекомбинантных форм 5SpPHK как векторов - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы