Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рост колоний микроорганизмов на плотных питательных средах: экспериментальные исследования и математическое моделирование

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Рост колоний микроорганизмов на плотных питательных средах: экспериментальные исследования и математическое моделирование"

м

< лг<р На правах рукописи

-.4 О

РОДИН ВЛАДИМИР БОРИСОВИЧ

Рост колоний микроорганизмов на плотных питательных средах: экспериментальные исследования и математическое моделирование

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Оболенск-1995

Работа выполнена в отделе питательных сред Государственного Научно-исследовательского Института прикладной микробиологии и лаборатории почвенной микробиологии Института микробиологии РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук Паников U.C.

Официальные оппонента!: доктор биологических наук Никитин Д.И.

кандидат биологических наук Бондаренко Т.Ф.

Ведущая организация: кафедра микробиологии биологического факультета МГУ, Москва

Защита диссертации состоится «¿У 1995 года в 14 час на заседании диссер-

тационного совета Д 002.64.01. Института микробиологии РАН по адресу: 117811, МОСКВА, Проспект 60 - лет Октября, 7, кор. 2..

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института микробиологии РАН. Автореферат разослан с? У г<гч^ 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета^

кавдвдат биологических наук /// Л.Б. Никитин

Список сокращений

ДМР Двухмерная модель роста колоний одноклеточных мир.р.ч• -г

Л Средневзвешанная высота колонии, находят как ныич . >,■> ш» ф I

который построен на юм же основании , что и реальная »пцп-.« колония, н имеет равновеликий объем.

Н Высота и центре колонии.

Н0 Высота монослойной микроколонии.

Радиальная скорость роста колонии.

Кн Скорость роста высоты Н.

Ц Ряпичг уруг-!Нт ГСЛГЗП«!, -фф^КШБНЫИ ралиуг гп<гпн>'!' ГТГТТрППШ.»!—~

формы.

Я0 Эффективный радиус клетки на поверхности плотной питательной

среды.

ц Удельная скорость роста микроорганизмов.

/¡,„ Максимальная величина ¿л

$ Коэффициент распределения/показывающий вероятность того, что и

процессе роста колонии дочерняя клетка остается в той же горизонтальной плоскости, что и материнская.

х Момент появления второго слоя микроколонии.

п Число генераций предшествующих появлению второго слоя.

Т Момент перехода к линейному росту микроколонии.

Я„ Кт, Нг Размеры колонии в соответствующие моменты времени.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Культивирование микроорганизмов на плотных среда в чашках Петри занимает значительное место в повседневной работе микробиологов, вырастающие на поверхности плотных сред колонии микроорганизмов, являются тра диционным объектом фундаментальных исследований в микробиологии [Pirt, 1967 Cooper и др., 1968]. Колониальный рост также интересен как упрощенный пример pea лизации гетерогенного роста микроорганизмов в почве, грунтах и других природны? средах. Однако до сих пор количественные закономерности роста колоний, их развития и внутренней организации остаются менее изученными по сравнению с другими разделами микробиологической кинетики.

Успешная работа в этом направлении невозможна без создания адекватных математических моделей. Они должны давать ответ на то, какие факторы определяют скорость роста колоний, каким образом скорость распространения колонии по поверхности среды связана с увеличением ее массы, от чего зависит форма колонии, все ли части колонии в одинаковой степени участвуют в процессе роста, каков характер коммуникации, дифференциации и "разделения труда" между клетками колонии. Решение

, ' ' У

этих вопросов несомненно обогатит традиционные области применения плотных сред новыми методическими подходами, а также облегчит изучение количественных закономерностей роста в экологии микроорганизмов.

Цель и задачи работы. - Выяснение количественных закономерностей роста колоний бактерий и дрожжей, включая:

1) регистрацию динамики роста радиуса и высоты колонии;

2) разработку кинетической двухмерной модели роста (ДМР) колоний одноклеточных микроорганизмов;

3) создание на ее основе новых методических подходов для количественной оценки колониального роста;

4) изучение роста колоний на полиакриламидной гелевой основе, заменяющей агар.

Научная новизна. Предыдущие исследования роста микроколоний проводились на специальных подложках или в камерах, то есть в условиях, отличных от таковых при культивировании в чашках Петри. В данной работе содержится экспериментальный материал, описывающий развитие колонии па поверхности агаризовапной среды в чашке Петри от одной клетки до макроколонии в одних и тех же

H?üecni;u модель Неота ¡Vir».. IW] расимагриьяет только колонии, находящиеся на видимой невооруженным глазом стадии линейного роста радиуса, и не учитывает рост колоний в высоту. Разработанная нами модель восполняет отмеченное упущение и адекватно описывает рост радиуса и высоты микро- и макроколоний. При помощи модели выведены функциональные зависимости между параметрами, характеризующими рост радиуса колонии на стадии линейного роста и максимальной удельной скоростью роста в гомогенной культуре.

Разработанная модель позволила предложить новые количественные способы оценки физиологического состояния инокулята и особенностей роста колоний микроорганизмов на плотных средах.

Практическая ценность. Результаты проведенных исследований дают возможность разработать систему биологических параметров, позволяющих контролировать качество и стандартность плотных питательных сред. Они могут быть также использованы для объективной количественной оценки особенностей роста колоний при конструировании плотных сред, в рекламных проспектах фирм производителей питательных сред и так далее.

Апробация работы. Основные результаты работ доложены на Международном микробиологическом конгрессе (Прага, 1994), а также на заседании лаборатории пита-

тельных сред ГосНИИ ПМ и лаборатории почвенной микробиологии Института микробиологии РАН.

Публикации. Материалы диссертации вошли в тезисы двух докладов и в три статьи, две из которых опубликованы и одна сдана в печать.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 97 стр., содержит 22 рисунка и 7 таблиц. Список использованной литературы содержит 40 наименований.

Объекты и методы исследования

Инокулят и условия культивирования. В работе использовали следующие культуры: Escherichia coli К-12, Е. coli К-2, Bacillus cereus RVB, Sacharomyces cerevisiae RVB, P. fluorescein В KM 1472, из коллекций ГосНИИ ПМ и ИБФМ РАН.

Дрожжи выращивали на среде, содержащей (г/л) дрожжевой экстракт (Serva) - 5, бактопептон (Difco) - 5, глюкоза - 10 (стерилизовали отдельно). Для культивирования бактерий были использованы триптозный агар (ТА) и ппокозо-минеральный агар (ГМА). Состав ТА (г/л): пашфеатический гидролиз ат рыбной муки - 10, панкреатический гидролизат казеина -10, глюкоза - 1, агар (Difco) -15. Состав ГМА (г/я): глюкоза - 10, (NROiSOi- 1, KjHPOi-ЗН О - б, КН2Р04- 3, MgS04-7H20 - 0,2. Среды автоклави-ровали при температуре 121 "С в течение 15 мин., разливали в пластиковые чашки Петри и подсушивали 15 мин. струей стерильного воздуха в ламинарном шкафу. Для изучения гомогенного роста использовали те же среды без агара.

Культивирование P.fluorescens на ГМА проводили при 25 °С, P.ßuorescens и В. cereus на ТА при 30 "С, E.coli при 37 °С, S.cerevbiae при 28 °С.

Изучение роста микроколоний на агаризованных средах и чашках ПетЩ!: Для инокуляции использовали гомогенную культуру, выращенную на tooгестствующей жидкой среде (плотность - 500-1000 КОЕ/мл). Инокулят наносили на поверхность чашки Петри при помощи микропипетки в количестве 5 микрокапель по 5 мкл каждая. После этого для облегчения дальнейшего поиска единичных клегок коигуры растекшихся микрокапель метили уколами тонкой иглы. Чашку устанавливали на предметном столике микроскопа Yenaval (Германия), и фиксировали расплавленным парафином. Микроскопирование проводили в светлом поле. Чтобы избр^-™ i ьиаНИЯ OfVT- j j. -яа ~о время микростгсгшмсских няптодснлП сю 1емпературу поддерживали на 1-1,5 "С выше путем вентиляции струей нагретого воздуха. На чашке Петри находили 3-5 единичных клеток, отмечали их координаты, используя линейку с нониусом на предметном столике микроскопа, накрывали чашку Петри крышкой и помещали микроскоп в термостат. Затем через регулярные интервалы времени производили измерения размеров выбранных микроколоний. Вначале при помощи окулярной сетки измеряли площадь микроколонии А, а затем вычисляли ее эффективный диаметр d как d = 4Аin. На более поздних стадиях, когда колония принимала правильную круглую форму диаметр измеряли окулярной линейкой. Высоту микроколонии измеряли по методу Wimpeny [1979], поочередно фокусируя изображение клеток в центре и на периферии с отсчетом по нониусу микровинта.

Изучение роста на синтетической гелевой основе. В качестве уплотнителей плотных питательных сред были использованы 1,5% агар ("Difco", США) и полиакрила-мидный гель (ПААГ) с различной концентрацией полимера. Отмытые и набухшие ПАА диски заливали равновеликим объемом питательной среды , концентрация которой была в два раза выше требуемой. Диски, погруженные в питательную среду, автоклавиро-вали при I атм 30 мин. Одновременно со стерилизацией происходила пропитка дисков питательной средой. Для устранения синерезиса (появление капелек жидкости на поверхности геля) после автоклавирования колбы с пропитанными ПАА-дисками выдер-

е

живали в о холодильнике при 4 от двух до пяти суток после чего диски в стерильных условиях раскладывали по чашкам Петри и засевали. Основную информацию о структуре ПААГ и его свойствах, как проводника диффузионных потоков питательного субстрата, получали используя метод ЯМР [Родин, Булатова и др., 1992].

Результаты и обсуждение

Динамика развития микро- и макроколоний на поверхности агаризованных сред. Все изученные микроорганизмы в течении первых пяти - семи Геннадий росли монослоем неправильной формы (рис.1). Клетки E.coli, S.cerevisiae, P.fluorescens обнаруживали "центростремительную" тенденцию к формированию максимально возможной компактной ассоциации. При этом палочковидные клетки P.fluorescens и E.coli проявляли ограниченную подвижность, группируясь в парные структуры в которых клетки /

соприкасались длинными сторонами. В результате этого формировались вытянутые микроколонии с неровным краем, а затем, по мере роста, происходило о]фугление края и формирование правильных круглых колоний. Перемещение клеток дрожжей по поверхности агара происходило исключительно за счет увеличения биомассы в микроколонии. Ее периферия с самого начала развития имела форму круга.

Время роста монослойной микроколонии, по-видимому, зависит от подвижности клеток на поверхности плотной сред ы. Так у дрожжей (неподвижные клетки) и псевдомонад (монополярное расположение жгутиков) число генераций, предшествующих появлению второго слоя (параметр л), было наименьшим и не превышало S-б. Перитри-хиальное жгутикование клеток E.coli, по видимому делает их более подвижными на поверхности плотной среды, что приводило к увеличению продолжительности фазы мо-иослойного роста до 7 - 8 генераций. Наблюдения показали, что второй слой формируется за относительно короткий промежуток времени группой клеток из центра моно-

е. сои , 1 г з

г-Г-^ <£> х <0- (Й

ю

Рз. ?1иа-гезсетгз I

сеге- о 4

у¿сеае

3 Хк Ч 5

\/1

В. свгеиз , / \ 2 \1/3 \/л Ч ч? 5 I — ) ~~ / ~ Я —

Рис.1. Динамика роста микроколоний различных микроорганизмов. Числа над стрелками - число генераций

слоя. Клетки второго слоя микроколоиии E.coli в течении 2-3 генераций.распростра-нялись монослоем по поверхности нижнего слоя, после чего появлялся третий слой. Формирование следующих слоев проследить не удавалось, однако границы первых трех оставались различимы во время дальнейшего роста.

Аномальное поведение проявили клетки B.cereus у которых, в отличие от P.fluorescens и Е. coli, формирование парных клеточных структур было слабо выражено. В самом начале клеггки росли или в виде цепочки или принимали в основном беспорядочную ориентацию, а в дальнейшем росли в виде нескольких цепочек из клеток. Их распространение по агару происходило за счет роста филаментов (тропизм, но не таксис). Следствием данных особенностей роста являлось формирование колоний B.cereus с шероховатой поверхностью, сильно изрезанным краем и длинными тонкими нитевидными выростами. Число генераций, предшествующих появлению второго слоя, варьировало в пределах 7-11 и, по-видимому, зависело от соотношения сил трения об агар и сцепления между клетками в цепочке.

Эффективный радиус монослойных микроколоний всех микроорганизмов возрастал во времени: экспоненциально, но после появления второго слоя его удельная скорость роста снижалась, а затем становилась линейной. Переход к линейному росту радиуса и высоты происходил одновременно. До этого вертикальный рост колоний протекал по экспоненциальномузакону (рис. 2).

Радиальный и вертикальный рост колоний P.fluorescens на богатой среде ТА протекал значительно быстрее, чем на ГМА. Это приводило к тому, что невооруженным глазом форма колоний на ТА воспринималась ках сегмент сферы, а на ГМА как плоский цилиндр. Отличительной особенностью колоний дрожжей явился их медленный рост и сравнительно небольшие различия в скоростях увеличения радиуса и высоты. Следствием этого было формирование ими мелких сильно выпуклых колоний.

Рис. 2. Динамика роста радиуса и высоты колоний Е. coli К-12 на среде ТА в обычной и полулогарифмической системе координат,

-:--расчет по полной ДМР,

--расчет по упрощенной ДМР

1 - 3 4 5

лл 00

лл оо оффо

пл 00 0100 0ФФФФ0

® ю «ги м лж

00 0М0 0Ф*Ф0

00 00

Рис. 3. Схема формирования моносяойной микроколонии. Числа - число генераций. 0 - дочерняя клетка, ф - родительская клетка,

ф - родительская клетка потомство которой формирует следующий слой

Максимальная удельная скорость роста микроорганизмов в гомогенной культуре была на 10-30 % выше чем на агаризованной среде. Это указывает на диффузионные ограничения интенсивного роста бактерий внутри монослобной микроколонии, где клетки обращены к источнику субстрата (агаровому слою) только частью своей общей поверхности.

Основные положения кинетической модели роста колоний. Анализ литературы и данные наблюдений позволили нам сформулировать кинетическую модель (табл. I), которая описывает динамику изменения размеров колонии в двух координатах - вдоль поверхности агара (рост радиуса) и по нормали к поверхности (рост высоты). В основу модели положены следующие положения.

1. В начале роста биомасса микроколонии возрастает экспоненциально с постоянной удельной скоростью ц„ (уравнения а, а").

2. Рост микроколонии палочковидных клеток должен проходить стадии, схематически изображенные на рис. 3, что подтверждается данными наблюдений: сначала

I аблипа 1

Двухмерная модель роста колоний одноклеточных микроор! лип ,.м,;в _на агаричованных средах__

Фаза роста Уравнения

Дифференциальная форма | Резульпи ин ici рпр^ьашм

Экспоненциальный рост монослойной микроколо нии (0 -т) dV у г тГ г/ •"„' = Mmv (а) V - У0е dt d / , \ ^ (ь) ~(R2H0) = nmR Н0 dt dH_Q (d) H0=2R0 dt

Экспоненциальный рост многослойной колонии (т- Т) dV TJ. T>- тг ц t = MmV (••) ^ - ^ M dt dt \ 1 (b>) „ ¿/Д 2 dh = 2Rh — + Я — dt dt /77? » d dt Mm dt

Линейный рост (1>Т) dt dt -rdC-KÎt T\ = 2я(Клк + КкЩ R 1 d-* = KR = com, ^R = Rt + Kr{,-T) dt " dt

формируется описанные Шапиро [Shapiro,, Hsu, 1989] двух- и четырехклеточные ассоциации. а затем микроколония растет в виде монослоя до тех пор пока остаются свободные места на поверхности агара (уравнения Ь, с и d, где Но-диаметр единичной клетки). После пяти последовательных генераций в центре монослоя выделяются 8 клеток, потомство которых не имеет другой возможности кроме как сформировать следующий слой. Из этого упрощенного представления следует, что начало роста колонии в высоту происходит с задержкой относительно роста радиуса на время т (ч), равное пяти генерациям.

3. Распределение клеточной массы между горизонтальным направлением (рост радиуса R) и вертикальным (рост высоты й) во время экспоненциального роста многослойной колонии задается коэффициентом 9 (уравнение с"). Он заключен в интервале [0,1] и отражает вероятность перемещения дочерних клеток в горизонтальном направлении. Например, численное значение в-0,8 говорит о том, что 8 из 10 дочерних клеток остаются в одной горизонтальной плоскости с родительскими клетками, а 2 перемещаются в лежащие выше слои.

В качестве меры роста колонии в вертикальном направлении была использована так называемая средневзвешенная высота колонии h, которую находят как высоту равновеликого по объему цилиндра, построенного на том же основании, что и реальная выпуклая колония. Принимая форму выпуклой колонии за сегмент сферы, мы имеем:

где Н- высота колонии в ее центре. Тогда средневзвешенная высота будет приблизительно равна 0,5Н.

4. Переход от экспоненциального роста радиуса и высоты к линейному происходит одновременно в момент Т (ч) (уравнения с", <1"), когда потенциальная скорость потребления субстрата в центре колонии становится выше скорости его диффузии к данному участку. После этого происходит дифференциация клеток внутри колонии по ско-

0)

рости роста на периферическую зону и относительно покоящийся ней ц> .....м наш

нают выполнятся условия известной модели [Перт, 1967]. Если радиус и ы . > . . :опии увеличиваются во времени с постоянной скоростью (линейная стадии р.и I ; !ч.сч колонии должен возрастать параболически, го есть пропорционально кубу времени (уравнение а"). Последующие стадии роста в дайной работе не рассматривали'-)

Упрощенная ДМР. Из данных проведенных экспериментов (рис.2) видж- чи скорости увеличения радиуса на интервалах [0, х] и / г. Г/ мало отличаются друг о г друга. Это позволяет упростить модель, ам-лч дпа зьиьнмжтчяьлт учлткл рогт» рг?: уса в один на котором он должен расти с удельной скоростью /л^. (таблица 2). Рост высоты по упрощенной модели происходит с задержкой на время т и во время экспоненциального роста может быть описан уравнением (с), в котором к - коэффициент, зависящий от формы микроколонии.В результате становится возможным найти все фундаментальные характеристики колониального роста (рт1 п, к, Нт, Нт) по измерениям КК и Кн, выполненным на видимой невооруженным глазом стадии линейного роста. В частности , можно показать, что время достижения колонией величины радиуса Я выражается через параметры ^ и следующим образом:

Выражения для кип имеют вид:

к = КИ/мт-Н~Кя/р„11+ 0.5

.( ки Л

(3)

п 1п 1п2 1

Таблица 2

Упрощенная двухмерная модель роста колоний одноклеточных микроорганизмов

на агаризованных средах

Фаза роста Уравнения

Дифференциальная форма Результат интегрирования

Экспоненциа льный рост (1<Т) а " т

Линейный рост (1>Т) ^-Кь-еап* <ь'>* = *г+ Г) л "

В отличие от работы Купера и др. (1968), где находили время роста колоний путем экстраполяции линейного участка до пересечения с осью абсцисс, полученное нами уравнение (2) позволяет более точно установить суммарное время прохождения экспоненциальной и линейной фаз (до момента г на линейной стадии, когда радиус колонии достигает размера Л). Для этого достаточно, с практической точки зрения, дважды измерить значения Я на линейном участке. В дальнейшем мы будем обращаться к уравнению (2) для определения длительности лаг-фазы в развитии индивидуальных колоний.

Идентификация параметров модели- Для этого был использован метод наименьших квадратов с предварительной линеаризацией экспериментальных кривых в координатах "1п(Я) -г" (экспоненциальные стадии до и после появления второго слоя), а также "К -г" и "Я -г" (стадия линейного роста). При этом коэффициентами уравнений линейной регрессии являются кинетические параметры Л» /4. вц^ Кк и Кн. Число генераций монослойной микроколонии (л) и параметр т устанавливали по моменту появ-

ления второго слоя. Величину радиуса и момент I (Я,) находили и» .«и. " -пи;, ра

диальной скорости роста на стадии линейно) о роста и удельной скор . и , . ;м с га

дни экспоненицального роста (с1, табл. I), полагая, что н не и|н м I , / / /% г 0.59д„Лг откуда

При расчете динамики высоты колонии полагали, что высота монослойной колонии Н0 равна 2К0 , где Я0 - эффективный радиус единичной клетки на поверхности агаризованной среды. Расчетную кривую для динамики высоты колонии строили с геми значениями параметров т, /г,„, в, Т, которые были идентифицированы гю 'жснсрнмен-тальным данным для динамики радиуса. Степень согласия в этом случае была использована в качестве критерия адекватности модели.

Результаты расчета, наряду с экспериментальными точками, отложены на рисунке 2, а в таблице 3 приведены параметры, идентифицированные изложенным выше способом. Значения стандартной ошибки аппроксимации приведены с использованием Значений распределения Стъюдента для 95 %-ного доверительного интервала. При проведении регрессионного анализа квадрат коэффициента корреляции (г*) варьировал в пределах 0,95-0,99, что свидетельствуют о вполне удовлетворительном согласии модели с данными наблюдений.

(5)

Величину Т рассчитывали из уравнения (с')

(6)

Таблица 3.

Параметры полной и упрощенной ДМР для колоний различных микроорганизмов

Модель Параметры В. сегеиз Е. сой Р. Аиогех-сепз 1472, ТА Р./1иоге$-сепз 1472, ГМА 8. сегеушае

М* (ч-1) го-мог. к-ра — 2,14±0,43 0,80±0,02 0,46±0,09 0,57±0,02

«. (ч-1) 1,15+0,17 1,62±0,05 0,72±0,06 0,38±0,03 0,40±0,06

Н0 (мкм) 2,0±0,5 1,4±0,1 1,3±0,1 0,8±0,1 3,1±0,4

т(ч) 7,0 3,56 5,5 9,5 8,5

Ят (мкм) 107,4 24,9 6,9 5,1 16,7

Полная п 11,9 8,3 5,7 : . ,5,3 ' 4.9

& 0,55 0,72 , 0,81 0,90 0,86

Лг(мкм) 350,7 186,9 126,0 _ 84,5 211,5

Нт (мкм) 50,2 25,6 26,6 6,2 28,5

Г(ч) 10,7 6,69 14,28 25,75 23,27

Кя (мкм) 1 !3,3±12,1 110,0±3,7 40,2±1,2 14,6±0,4 36,3±6,4

Кн (мкм) 14,3±5,8 15,4±2,6 10,1±1,6 2,3±0,7 22,4±4,5

1,04 1,40 0,63 0,36 0,36

п 6,1 9,0 9,5 4,2 6,9

Упрощен- г(ч) 4,08 4,47 10,48 8,16 13,6

ная А т (мкм) 217,9 157,0 118,7 82,3 201,5

Яг (мкм) 9,06 6,78 14,49 „25,98 23,23

Т(ч) 33,6 18,5 20,5 17,1 , 85,7

к 0,41 0,59 0,83 0,37 0,73

Рассчитанная по модели динамика высоты колонии не во всех сл\ чая > i, мио сопутствовала экспериментальным данным (рис.4). Наиболее вероятной причиной отклонения является принятое нами допущение о постоянстве формы колонии и динамике юста. Так, мы приняли, что форма колонии есть сегмент сферы не только на стадии инейного роста зрелой колонии [Palumbo и др., 1971; Wirapeny, 1979; Kamalh и iungay, 1988], но и на стадии экспоненциального роста, что оправдало себя только для лучаев с малым значением коэффициента #(колонии В. cereus и E.coli). Окатя-?"--:ем выше 9. тем «ent ine идекватнесп, п i см си льнее реальная скорость роста высоты [ревышает расчетные значения на экспоненциальном участке. Можно предположить, гго для высоких в, то есть в случаях, когда доля биомассы, идущей на увеличение высо-ы, очень мало, микроколония на стадии экспоненциального роста должна иметь кону-ообразную форму с вогнутой боковой поверхностью. Это предположение полностью юдгвердилось после того, как был снят профиль колонии S.cerevisiae в конце экспо-[енциальной фазы роста (рис.5). Величины объемов колонии, вычисленные точно и по прощенной формуле (уравнение а', таблица ] ) оказались близкими (203660 и 2-18279 íkm3 соответственно).

Полная и упрощенная ДМР не тождественны, между ними должны быть сле-ующие различия.

1. Максимальная удельная скорость роста микроорганизмов в составе микроко-онии, рассчитанная по упрощенной ДМР, должна быть несколько меньше параметра ш, идентифицированного по полной ДМР или простого экспоненциального роста ткроорганизмов в гомогенной культуре.

2. Степень отличия значений по полной, упрощенной ДМР и экспоненциаль-ой модели гомогенного роста должна быть тем больше, чем ниже величина в (то есть ем больше вероятность перемещения дочерних клеток ввдзх).

218. гп]

014013;

шг1 0.11: й1: ас» 0,08-аот 0.06-асе:

004;

аоз1 аог| 0,01; а

/

/

/

1

-Гл^г.:..;..---

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 . 26 28 3 время инкубации ,ч

Рис. 4. Динамика роста высоты колоний сегенЫае в обычной (I) и полулс рифмической (2) системе координат. Обозначения те же, что и на рис. 2.

Рис. 5. Профили колонии 5. сегеуЫае в конце экспоненциальной фазы рост равновеликих по объему и площади основания цилиндра и сегмента сферы.

Из таблицы 3 видно, что рассчитанная по формуле (2) величина /¡,„ следует двум предсказанным условиям.

Как и следовало ожидать, рассчитанная по упрошенной модели кривая роста радиуса на экспоненциальном участке ложится немного ниже экспериментальных точек и всегда очень хорошо совпадает с ними на стадии линейного роста (рис. 7) Рассчитанная по модели динамика высоты колонии хорошо совпадает с данными опыта и в ряде случаев более адекватно, чем изложенный выше вариант полной ДМР спгп»/*«— на экспоненциально-? у-псл»с фи»; 4>

Таким образом, анализ проведенных экспериментов позволяет утверждать, что предложенные нами полная и упрощенная двухмерные модели роста колоний одноклеточных микроорганизмов не противоречат экспериментальным данным в период линейного роста и с хорошим приближением описывают рост колоний на ранних этапах развития.

Оценка физиологического состояния при помощи параметров упрощенной ДМР. Предполагалось, что интегральной количественной характеристикой физиологического состояния инокулята может служить длительность лаг-периода клетки, инокулиро-ванной на поверхность агаризованной среды. В основе расчетов лежит уравнение (2). Лаг-фазу Ь рассчитывали по уравнению :

¿ = 1-Г (7)

где I - наблюдаемое время достижения колонией радиуса Я, а - время, рассчитанное по уравнению (2) при условии отсутствия лаг-фазы. Необходимые для расчетов значения Ли Кк легко получить в опыте, а за величину /л,„ можно взять ее максимальное значение из выборки, полученной в результате расчетов при условии / = /'. Из результатов, изложенных в предыдущем разделе, видно, что данное условие выполняется, если ино-кулят высевать из гомогенной культуры, находящейся на стадии экспоненциального роста.

Таблиц

Длительность ланиты н развитии колоний Р. fluorescens 1472 на ТА в зависимости < _физиологического состояния инокулята

Использовано в качестве инокулята Лаг-фаза, ч Число определен»

гомогенная культура (зкепоненц. фаза) 1,16 ±0,43 21

одиночные колонии, возраст 25 ч 0,63 ±0,42 20

одиночные колонии, возраст 146 ч 3,31 ±1,51 19

одиночные колонии, возраст 178 ч 3,31 ±2,50 21

одиночные колонии, возраст 167 ч 3,82 ±2,13 21

56 колоний на чашке, возраст 176 ч 4,72 ±2,00 21

Изложенный подход был опробован для расчета длительности лаг-периода зас янных на поверхности ТА клеток Рз./1иоге1сем 1472. Инокулят брали из колоний в ра личные моменты инкубации, растущих при разной густоте посева.

Из таблицы 3 видно, что наименьший лаг-период оказался для молодых культ} (гомогенная культура в экспоненциальной фазе и колонии с возрастом 25 ч). Интере но, что перенос клеток из гомогенной культуры на плотную среду сопровождался ув личением лаг-фазы и снижением разброса данных, что, по видимому, объясняете стрессом возникшем при смене типов культивирования и большей однородностью ф1 зиологического состояния клеток в гомогенной культуре. Лаг-период клеток законе мерно увеличивался при старении колоний из которых отбирали инокулят.

Таким образом, проведенный эксперимент говорит о целесообразности исполь зования среднего значения величины Ь для количественной оценки физиологическоп состояния инокулята, а ее стандартное отклонение может служить мерой однородносп физиологического состояния инокулята.

Количественная оценка особенностей колониального роста на поверхносту плотных питательных сред. Целью данного этапа исследований являлось испытанш возможности использования разработан ной кинетической модели для количественной оценки роста микроорганизмов на разных плотных питательных средах. Испытанные варианты сред отличались по питательному субстрату и типу плотной гелевой основы. С этой целью исследовали особенности роста Е.соИ К-2 на ПАА средах пропитанных триптозным бульоном с различной концентрацией полимера в плотной основе. На всех

вариантах ПАА-сред показатель КОЕ для исследуемой тест культуры не отличался от контрольной агаризованной среды. Однако колонии Е. соИ росли либо с меньшей скоростью, либо с измененной морфологией. По ростовым свойствам наиболее- близкими к контрольной агаризованной среде оказались ПАА-среды с наименьшей киннен ¡рацией полимера (рис. 6). На них вырастали типичные 8-колонии, то есть гладкие, с ровным краем, высота которых к 20 ч достигала 130 - 140 мкм. При этом радиальная скорость ^ста и радиус колоний были примерно в 3 раза меньше, чем на агаризованной среде. При концентрации полимера 4,3 % колонии становились шероховатыми (росли только как Я-формы), причем чем плотнее среди■ тем меньше высота и тем «пчыпе моршинио-тость, изрезаность края, радиус и радиальная скорость роста. В работе показано, что причиной отмеченных особенностей роста на ПАА средах является худшая, по сравнению с агаровым гелем, диффузия питательного субстрата.

В дальнейшем проводили сравнение роста Е.соИ К-2 на агаризованных и ПАА-средах с оптимальной основой, пропитанной различным питательным субстратом. Если следовать общепринятым методам оценки колониального роста, то можно констатировать, что испытанные среды по значению КОЕ не отличались друг от друга. Однако по набору величин кинетических параметров каждая среда имеет свой характерный портрет. Так, на агаризованных средах величины Кн варьировали от 0,11 до 0,23 мм/ч, а высота от 71 до 190 мкм. На ПАА средах разброс значений радиальной скорости роста был меньше (0,03-0,06 мм/ч), а высоты больше (106-286 мкм).

Данный подход, на наш взгляд, может быть использован для наглядной и объективной характеристики биологических свойств предлагаемых для продажи плотных питательных сред. В этом случае в рекламных проспектах фирм производителей достаточно ограничиться данными о величине диаметра и высоты колоний колоний к 24 ч инкубирования (024 и Н24 ), а также времени Оым) достижения ими диаметра в I мм (рис.7).

0.3-Г-

0.25-

агч

arap |

a \

0.15-

ол-

0.05-

ПААГ

3 4 5 6 7

концентрация полимера, %

ю

Рис. 6. Величины радиальной скорости роста и высоты колоний Е. coli К-2 на плотных средах из триптозного бульона в зависимости от концентрации гелеобразователя

Tryptme soy agar kutrimt agar ' ФТРМ

Bado адат ТИрЬаэа agar

^^ - *>« >

П tlx

Рнс. 7. Характеристика роста колоний Е. coli К-2 на различных коммерческих средах.

Таким образом, проведенные эксперименты убедительно покупали -¡ффсктнн-ность и целесообразность использования ДМР для получения объективной количественной информации, необходимой при работе по оптимизации шкпных. сред, для ха-актеристики роста колоний в научных публикациях, рекламных проспек тах фирм производителей питательных сред и так далее,

ВЫВОДЫ

1. Прослежена динамика рятмгщ » гтгггхы млинмп niw»rsrrr"iiuA ..ык^оошя-нилмор на лгаризииннны* средах от инокуляции до формирования зрелой макроколонии. Выделено 3 фазы развития колонии: Экспоненциальный рост моносломной микроколонии, экспоненциальный рост многослойной недифференцированной колонии и фаза линейного увеличения ее размеров.

2. Предложена двухмерная модель роста (ДМР) колоний одноклеточных микроорганизмов на агаризованных средах. Полная ДМР описывает все 3 стадии роста, учитывает горизонтальное и вертикальное перераспределение клеток в колонии, а также предполагает, что переход к линейной фазе связан с началом лимитирования роста по субстрату. Упрощенная ДМР объединяет 2 первые стадии в одну экспоненциальную фазу и позволяет с хорошим приближением воспроизводить динамику роста микроколоний по экспериментальным данным измерений линейного роста радиуса и высоты макроколонии.

3. Установлено, что максимальная удельная скорость роста микроорганизмов на агаризованной среде на 10 - 30% ниже соответствующего параметра в гомогенной культуре. Замедление роста обусловлено снижением площади контакта клеток с питательной средой и в наибольшей степени выражено у крупных клеток (дрожжи) и быстрорастущих популяций (энтеробактерии аа богатой питательной среде).

4. Форма колоний зависит от состава питательной среды и от подвижности микроорганизмов. Радиальный и вертикальный рост колоний на богатой комплексной пи-

тательной среде протекает значительно быстрее, чем на бедной глюкозо-минеральной среде. Это приводит к тому, что из-за медленного роста в высоту колония на бедной среде приобретает плоскую форму, тогда как на богатой среде она воспринимается как сегмент сферы. Колонии подвижных бактерий при переходе с бедной на богатую среду увеличивают радиальную скорость роста в большей степени, чем рост в высоту. Вследствие этого их колонии имеют более плоскую форму, чем колонии неподвижных микроорганизмов.

5. Продемонстрирована целесообразность использования модели для точной оценки физиологического состояния инокулята и характеристики роста колоний микроорганизмов на средах с различной питательной и гелевой основой. Показано, что замедление роста на ПАА средах, по сравнению с агаризованными, связано с пониженной скоростью поступления субстрата из плотной основы.

Список РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Родин В.Б., Булатова Р.Ф., Домотенко JI.B., Инковская Т.Е., Артюхин В.И. Влияние физико-химических свойств гелевой основы полиакриламидных сред на рост колоний Escherichia coli //Прикладная биохимия и микробиология. - 1992. - т. 28. - №4,-С.623-630.

2. Родин В.Б., Фролов В.Б., Грищенко Н.С., Инковская Т.Е., Шепелин А. П., Артюхин В. И. Модель роста бактериальной колонии //Прикладная биохимия и микробиология. -1994.- т. 30 - № 6 - С.871 - 876.

3. Родин В.Б., Паников Н.С. Двухмерная модель роста колоний одноклеточных микроорганизмов // Микробиология. - 1995 - В печати.

4. Родин В.Б., Булатова Р.Ф., Домотенко Л.В., Грищенко Н.С., Инковская Т.Е., Артюхин В.И. Ростовые свойства микроорганизмов на полиакриламидных средах: Пластагар, проблемы, перспективы использования в медицине и биологии /Тезисы докладов межведомственного симпозиума, Киев, 1992.

5. Panicov N.S., Rodin V.B., Belova S.E. Kinetics of colonial growth of bacteria. International union of microbiology societies - // 7 th Int. Congr. of Bact. and Appl. Microbiol. Div. - Prague Czech. Rep. - July 3 th - 8th 1994. - Supplement..