Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Количественные закономерности колониального роста PSEUDOMONAS FLUORESCENS И ALCALIGENES SP.

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Количественные закономерности колониального роста PSEUDOMONAS FLUORESCENS И ALCALIGENES SP."

Институт микробиологШ1 Российской А*«Л«>ЮК Кэук р Г В ОД На права/, рукописи

БЕЛОВА Светлана Эдуардовна

КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ КОЛОНИАЛЬНОГО РОСТА ГЗЕЩЮШАБ ТШОВЕБСШЗ й ¿г.СШаЕИБ ЗР.

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссэртэши на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1995

Работа выполнена в лаборатории почвенной микробиологии Института микробиологии Российской Академии Наук

Научный руководитель: доктор биологических наук

Н.С.Паников

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор В.К.Плакунов кандидат биологических наук П.А.Кожевин

Ведущая организация; кафедра микробиологии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова

специализированного совета Д. 002 . 64 . 01; Москва, 117811, Проспект 60-летия Октября, д. 7, к. 2, Институт микробиологии, Ученый совет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии.

Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании специализированного совета, а отзывы на автореферат присылать в 2-х экземплярах.

Защита состоится

-22-ШЯВга

1Э95 г. на заседаний

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета

Никитин Л.Е.

Актуальность проблемы. Колониальный способ роста широко распространен к природе: микроорганизмы способ1я; образовывать кслсмте- и аюпленки в почве, грунтах, на поверхности яивотннх тканей, б ризосфере, фидлоштане, в водных экосистемах (Ш1шреппу, 1981). Кроме того, вкраивание микроорганизмов в виде колоний - один из основных методов культивирования и изучения свойств микробов в лабораторных

условиях. Отткйип. прсцзсс 1ЛЛ. 1 л .миГ.ныг иптгггатяг

цосчаточии быстро (Тг1пс1, 1969; 1971; Перт, 1978; Пашков и др., 1983), то в отношении количественного исследования колониального роста бактерий определенности значительно меньше. Так, до сих пор этсутствует количественная оценка даже основных физиологических процессов - таких как скорость потребления субстрата бактериальной колошей, дыхания, образования продуктов обмена.

Для наших исследований были выбраны два микроорганизма, принципиально различающиеся структурной организацией колоний. Бактерии РзеисЗотопаз /1иогезсепз широко распространены в природе, они формируют при росте на поверхности агара колонии, .гаяпенные специфических морфологических образований. Ростовые характеристики этих бактерий в гомогенных условиях достаточно хорошо изучены (Пашков, тядач, ЛТса-\igevBя яр., штамм с1Р - новый организм, выделенный в лаборатории цитологии ИНВД РАН. Несмотря на то, что рост этих бактерий в жидкой культуре практически не изучен, наш этот объект выбран в связи с необычностью его колониальной организации. Внутри колоний отит бактерий обнаружены газовые каналы и баллоны, а также гранулы, содержание гемоподобный пигмент, который, возможно, участвует в транспорте кислорода (Дуда и др., 1995).

Цель работы - выяснение количественных закономерностей роста Зактериальных колоний Р. /Хиогезсепз и АТсаИвепеэ эр. на агаризован-ной среде.

I

Задачи: I. Изучение динамики колониального роста от первых де-

лений клеток в микроколонии до формирования зрелой макроколонии. 2. Определение кинетических и стехиометрических параметров (удельная скорость роста, выход биомассы, траты на поддержание) на разных стадиях колониального роста. 3. Изучение пространственного распределения субстрата и скорости его диффузии в процессе роста бактериального газона на агаризованной среде. 4. Синтез полученной информации в форме имитационной математической модели, описывающей рост бактерий на поверхности агаризованной среда.

Научная новизна: I. Впервые произведена оценка выхода биомассы бактерий при колониальном росте и прослежено изменение основных количественных ростовых характеристик: скорости потребления субстрата, интенсивности дыхания и образования экзометаболитов, жизнеспособности клеток, формирующих колонию. 2. Созданы математические модели, удовлетворительно описывающие рост бактериального газона на агаре. 3. Выявлены отличия в кинетике роста колоний Alcaligenea ар. по сравнению с P. fluorescent: зависимость радиальной скорости роста Alcaligenea зр. от глубины агара, более высокая жизнеспособность и меньшая скорость валового роста.

Практическое значение: I. Полученные данные могут быть использованы для оптимизации биотехнологических процессов, проводимых с участием иммобилизованных культур. 2. Закономерности кинетики колониального роста, выявленные в настоящей работе, могут быть использованы в имитационном моделировании функционирования микроорганизмов in vitro и in situ. 3. Результаты работы использованы в курсе лекций "Физиология роста микроорганизмов", читаемом на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на заседаниях лаборатории почвенной микробиологии МНМИ РАН (I99I-I993) и на Международном микробиологическом конгрессе (Прага, 1994).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы две работы,

1ве статьи сданы в печать.

Объем-работы. Диссертация состоит йз ввс-дс-яия, обзора литврату-*л>. "пкгаивя .ч°тодов, 0 глав, заключения, шзодов; содержит 4£'Л ггряниц машинописного текста, ,40 рисунков, ß таблиц и список ли-?оратурн ия Яi названий (из них - зарубежные).

Автор выражает глубокую признательность к.б.н. А.Г.Дорофееву, c.ö.h. А.В.Лебединскому и М.В.Глаголеву за консультации и т™.«™ ~~

ItH IHM ПМЧТЛТ» nrtrtft^- ^

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Микроорганизмы. В работе использовали полученную из ЕКМ МБФМ 'АН культуру- Pseudomonas fluareacem 1472 и штамм Alcaligenea ар. ip, выделенный в лаборатории цитологии ИНМИ РАН из иловых отложений гресвободного озера.

Бактерии выращивали на агаризовзнной среде и в жидкой гокоген-гой культуре, используя идентичную минеральную основу (Hirsch, съп--;i, 1964). За исключением оговоренных случаев, в качестве единствен-юго источника углерода и энергии использовали тпфуват натрия (5 Ул). Культивирование проводил!! при 25°. Гомогенную культуру внрзщи-¡али в периодическом регимэ в колбах на качалке (180 об/мин). Чашки : агаром ияокулкроталя гомогенной культурой в экспоненциальной фаге юста (р опытах о Alcaligenea зр. для получения инокулята в среду избавляли 10 мг/л дрожжевого экстракта).

Аналитические методы. Концентрации биомассы в жидкой среде оп-юделяли по поглощению света бактериальной суспензией при 41U нм с гересчетом на биомассу по калибровочной кривой. Определение биомассы бактерий на агаризовзнной среде проводили весовым и бихроматным ме-одами после смыва клеток с поверхности агара. Результаты взвешива-ия выражали в мг С, принимая содержание углерода в биомассе 46i5 ilaHHKOB и др., 1988). Бихроматным методом определяли суммарное ко-ччестЕо внеклеточных OB (продукты + остаточный субстрат). Долю жиз-

неспособных клеток оценивали в микрокультурах (Postgate et al., 1961} с использованием описанной выше синтетической агаризованной питательной среды.

Концентрацию пирувата натрия определяли спектрофотометрически по методу Цока и Лампрехта с лактатдегидрогеназой и НАДН (Метода биохимических исследований, 1982). При определении его содержания в плотной среде предварительно проводили экстракцию дистиллированной водой в течение 4 ч при комнатной температуре.

Концентрацию со0 измеряли методом газовой хроматографии (хроматограф модели 3700 с катарометром, Московский завод "Хроматограф").

Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ). Образцы фиксировали парами глутарового альдегида и высушивали в закрытых чашках Петри при комнатной температуре. После высушивания колонии вместе с агаровым слоем вырезали и приклеивали к столбикам. Препараты с напыленным на них золотом анализировали под сканирующим электронным микроскопом JSM-тзоо "Jeol" и фотографировали.

Расчеты осуществляли на персональном компьютере IBM PC at с использованием электронных таблиц Lotus 1-2-3 и разработанных М.В.Глаголевым программ для Turbo Pascal.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Развитие и кинетика роста колоний

Для изучения роста микроколоний на предметное стекло помещали тонкий (около 0,5 мм) слой агаризованной среды и наносили на нее суспензию бактерий. Агаровый слой накрывали стерильным покровным стеклом, края которого парафинировали (рис. I). На препарате произвольно Еыбирали отдельную изолированную клетку, рост, деление и образование микроколонии из которой прослеживали с использованием фа-зово-контрастной микроскопии. Расчет биомассы бактерий в микроколо-нш (х) проводили на фотоснимках, принимая, что клетки имеют форму цилиндра и что плотность сырой биомассы равна 1,1 г/ем^ при содержа-

/

Рис. 1. микрскамера для изучения роста микроколоний бактерий. . - предметное стекло, 2 - агаровый блок (0,5 тО, 3 - покровное :текло, 4 - парафин.

аш воды 80 %. Для исследования кинетики роста макроколоний на 5 ¡ь«ти»ш сг п1ищ ? »»""с По три п:, наь.и-

:или по одной микрокапле суспензии бактерий и в течение 10 суток грослекивали динамику изменения размеров колонии.

По предложенной ранее трехчленной классификации' (Komagata е! 11., 1969), У Р. /1иогезсепз и Alca.ltgeneз зр. наблюдался "простой" гил деления и расположения клеток. Этот способ заключается в разделении клеток путем образования перетяжки и скольжении дочерних кле-рок друг относительно друга с последующим параллельным расположением. Однако в колониях А1саИ^епез по сравнению с Р. /Тиогезсетгв степень упорядоченности и теснота контакта клеток были меньше. В тече-ие 11-13 ч происходило 3 генерация клеток, причем ступенчатое увеличение численности в последней генерации указывает на высокую синхронность деления, В отличттз от динамики численности, суммарная био • ласса клеток увеличивалась плавно, ь у Л1са11§спав ар. на протяжении зеего опыта возрастала экспоненциально (ц=0,146 ч-1) (рис. 2а). У Р. /7иогезеепз в первые 5-6 часов наблюдалось постепенное увеличение ¡а, причем в этот период деления клеток не было, и возрастание биомассы происходило лишь за счет увеличения их размеров (рис. 26). После первой генерации удельная скорость роста биомассы быстро увеличивалась до 0,29 ч-*. Таким образом, после короткой лаг-фазы, когда величина (1 возрастает до своего максимального значения, микроколония растет экспоненциально, причем клетки Р. /1иогезсепз размножаются точти вдвое быстрее, чем А1саИвепев зр. (рис. 3).

Рис. 2. Динамика численности (I) и биомассы (2) клеток на ранних стадиях развития микроколоний Alcaligenes ар. (а) и P. fluorés cens (С).

Ir\ X

! ! 1 1 jSLe-*-"'"'""

! ! S

J ......._!_„_ —

Рис. 3. Динамика биомассы микроколоний P. fluoreacena (I) и Alcaïtgenea зр. (2) в полулогарифмических координатах.

о ,«.Г, мкм/ч

^ ' : !

1.. _______ _______

1 I 1 :• : П 5 ! ;.....

: ■ : ;

у' и •

! ' ; ! •; ( ' { 1 1 г ! .,. .1. ..]. 1 1

О и 4Э 72 96 120 144 !6Э 192 216 240

час

час

Рис. 4. Динамика радиальной скорости роста микро- и макро-:олоний А2са1 igen.es ар. (а) и Р. /1иогезсепз (0).

Традиционно при исследовании кинетики роста колоний основным количественным показателем считается радиальная скорость роста Kr=dR/dt, где R - радиус колонии. Типичная картина динамики Яг пред ставлена на рис. 4 (приведены объединенные данные, полученные в экс периментах с микро- и макроколониями). По мере увеличения размеров колонии величина радиальной скорости роста возрастала по s-образной кривой. В культуре P. fluoreacena она достигала максимума через 2 дня, в течение 3-4 суток оставалась постоянной, а затем наметилась тенденция к ее падению. У Alcaligenes ар. радиальная скорость роста продолжала увеличиваться до 6-7 суток эксперимента, после чего стабилизировалась. Следует отметить, что на 3 сутки часть колоний Alcaligenea ар. обнаруживала отклонения от правильной циркулярной фор мы, обусловленные появлением областей ускоренного роста и образованием "лопастей" по краям колонии. На рис. 5 для сравнения приведена динамика радиусов двух, колоний, имевших очень близкие начальные раз меры, одна из которых образовывала лопасти, а другая нет. В течение первых 2,5 суток зависимость радиусов колоний от времени была линей ной, после чего радиус первой колонии начал ускоренно возрастать, а скорость увеличения радиуса второй колонии не изменилась. В дальней шем мы определяли параметры роста лишь тех колоний, которые не обра зовывали подобных разрастаний.

У изученных культур наиболее существенные различия динамики Яг проявились во взаимосвязи Кр с толщиной агарового слоя (Я). Скорост роста колоний P. fliwreaeena не зависела от Я и составляла 12 и 30 мкм/ч на синтетической и комплексной средах соответственно. Близкие результаты были получены при изучении влияния различных объемов сре да в чашке на радиальную скорость роста колоний P. fluoreacena (Ра-lumbo et ai., 1971). Наоборот, у Alcaligenea эр. с увеличением Я на блюдалось резкое увеличение Яг, причем до величин, многократно превышающих таковые у псевдомонад (рис. 6).

радиус, мм

150

175 200

ЧОС

Рис. 5. Динамика роста радиуса нормальных колоний Alca.lig.eneQ |р. и иррегулярных колоний, образующих выросты.

(г, мкм/ч

Кг, мкм/ч

2

-7ГГ

глубима, мм

глубине, мм

Рис. 6. Зависимость радиальной скорости роста колоний Р. /1ио-•езеепз (I) и А1са,Ияепез зр. (2) от глубины среды с пируватом (а) [ КГС (б). Величины Я определяли на стадии линейного роста.

а

1

ь

Рис. 7. Камера для определения дыхания бактериальных колоний. I - камера из оргстекла, 2 - резиновая пробка, 3 - подставка, 4 -чашка Петри, 5 - агаризованная среда, 6 - колония, 7 - водный затвор (рН 2).

Полученные экспериментальные данные подтверждают предложенную Пертом (Перт, 1978) концепцию колониального роста, которая предполагает переход от нвлимитированного экспоненциального роста колонии, когда она еще достаточно мала, к экспоненциальному росту периферической зоны, когда поступление питательных веществ становится лимитирующим. На протяжении второй фазы роста радиус колонии увеличивается с постоянной скоростью до тех пор, пока ширина периферической зоны (у?) и удельная скорость роста клеток внутри этой зоны (ц) остаются постоянными. Зависимость Кг от Н модель Перта не объясняет.

Отэхиомвтрия роста колоний на агаризованиой среде Субстрат, который клетки потребляют в процессе роста колонии, расходуется на построение биомассы, образование экзометаболитов и дыхание. Для определения выхода биомассы по субстрату и С02, выращивание проводили в маленьких чашках Петри, которые помещали внутри герметичных камер с пробоотборниками газовой фазы (рис. 7). В динамике прослеживали накопление С02, а через 7 суток инкубации определяли биомассу выросших клеток, а также количество образовавшихся продуктов и остаточного пирувата в агаре. Итоги оценки материального баланса по углероду и вычислений стехиометрических параметров роста колоний представлены в табл. I и 2.

Таблица I

Баланс углерода в процессе роста колоний Р. flucrescsnz ;т

Al.cal ?genes ар. нз агаризоваиной среде с пируватом

Статья баланса <мг С/образец) за 7 сут

Прирост биомассы (Лх)

Дыхание (Асо.. )

Р. fluoveaoent)

0,510 ± 0,002

1,239 - 0,004

Alcallgema ар.

0,374 ir 0,005 1,896 i 0,024

Накопление внеклеточных пголтатпи rsrtuoKü i къ \

м. iirv i + > '

Iо-субстрата (Аа) 1,891 ± 0,006

2,291 ± 0,029

Таблица 2

Величины выходов биомассы колоний Р. /Хиогеасепа и Alcallgeneз ар. в процессе роста на агаризованной среде с пируватом

Р. fluoreacena Alcaltgenes ар.

Выход биомассы по субстрату 0,27 0,16

Го же за вычетом продукта У 0,29 0,17

Выход биомассы по С02 0,41 0,20

Рост колоний Р. /1иогезсепз в целом был более эффективным по сравнению с Alcaligeneэ зр.: до СО, в процессе дыхания окислялось соответственно 66 и ВЗ % потребленного пирувата. Доля экзометзболи-гое е С-обмене колоний обеих культур оказалась достаточно низкой: 7 и 2 % для Р. /1иогезсепз и Alcalígeneз зр. соответственно.

Развитие бактериального газона Использование газона вместо колонии имело своей целью свести анализ роста индивидуальной колонии, который происходит з трех измерзших, к более простому случаю, когда пространственные распределения можно рассматривать только в одном измерении - вдоль высоты сосуда.

| Для выращивания бактериального газона использовали цилиндричес-ж трубки, нижнюю часть которых плотно закрывали фольгой, после

чего их наполняли агаризованной средой. На поверхность агара нанос* ли 0,03 мл суспензии клеток. После инокуляции трубки помещали в двг эксикатора, снабженные пробоотборниками газовой фазы. В динамике проводили определение биомассы, жизнеспособности клеток и концентрг ции остаточного пирувата послойно, а также прослеживали накопление со2 в газовой фазе.

Динамика биомассы бактерий, количества шзнеспособных клеток, остаточного субстрата, С02 и продуктов метаболизма представлены на рис 8. Кривая динамики биомассы обеих культур имела s-образный характер. Рассчитанная по наклону касательных динамики биомассы удел! ная скорость роста бактерий была максимальной в начальный период культивирования (0,13 и 0,2? ч-1 для Alcaligenea ар. и P. fluorea-cens соответственно) и практически совпадала с величинами ц. в гомогенной периодической культуре (0,175 и 0,34 ч-1) и на первой стада развития микроколонии (0,146 и 0,29 ч~*). Затем на протяжении всег< эксперимента значение ц постепенно снижалось. Относительное количе< тво жизнеспособных клеток у Alcaligenea зр. изменялось незначителы и в среднем составило 7S,5 %, тогда как в культуре псевдомонад чер* трое суток жизнеспособность культуры упала с 96 до 55-65 %. На фош возрастания суммарных запасов биомассы количество шзнеспособных клеток в этот период не увеличивалось, а даже несколько падало (ри< 86). Динамика образования С02 достаточно тесно коррелировала с суммарной биомассой бактерий: интенсивность дыхания увеличивалась в т< чение первых 48 и 24 ч в опытах с Alcaligenea sp. и P. fluoréзеепа соответственно, а затем прослеживалась тенденция к ее падению, при чем максимумы абсолютных скоростей роста и дыхания совпадали. Таки образом, у изученных культур наблюдались лишь два отличия: I). рост дыхание псевдомонад в первые 48 ч были намного интенсивнее, чем у Alcaligenea ар.; Z) у псевдомонад более отчетливо выражены процесс: отмирания клеток. '

нас час

Рис. 8. Динамика суммарной оиомассы (I), некромассы (2), С02

(3), продуктов метаболизма (4) и остаточного пирувата (5) в пиоцессс роста бактериального газона на поверхности агара: а, в - АХсаИррпеа зр., б, г - Р. /1иогезсепз. Экспериментальные значения показаны в виде точек, кривые рассчитаны по уравнениям (табл. 3).

Рост газона сопровождался снижением содержания остаточного субстрата в агаризованной среде, причем в первые сутки скорость потребления субстрата, (рассчитанная как суммарная убыль пирувата по всем слоям) была низкой, затем возрастала до'0,2 мг С пирувата/ч и на этом уровне сохранялась до конца эксперимента. Пространственное распределение остаточного субстрата в агаризованной среде выявило различие между двумя организмами: убыль субстрата под газоном Р. /1ио~ гевсетгз наблюдалась раньше, чем в культуре АХсаИдепеа зр. (через сутки и двое соответственно). Постепенно зона истощения питательного субстрата продвигалась в глубь к основанию столбика агара (рис. 9). Очевидно, что наблюдавшееся пространственное распределение остаточного источника углерода обусловлено диффузионными процессами, которые через 1-2 дня начинают лимитировать поступление субстрата в газон.

Стехиоыетрическиа показатели роста газона. Характерной особенностью роста бактерий на агаризованной среде оказалось непрерывное снижение его эффективности. В первые сутки выход биомассы по субстрату был достаточно высок и составил для А1са11%епеа зр. и Р. /1ио~ гезсепз 0.52 и 0.55 г С биомассы/г С пирувата соответственно. Затем в динамике величины Уд снижались, причем более резко падение Уд происходило в:культуре псевдомонад: к концу опыта суммарный выход биомассы РаешНотопаз упал до нуля. Аналогичная закономерность наблюдалась в отношении выхода биомассы по со2.

Таким образом, можно выделить два этапа развития бактериального газона: I) первичная колонизация поверхности агара, в ходе которой бактерии растут быстро и эффективно (величины ц в этот период практически совпадали с таковыми для жидкой культуры в экспоненциальной фазе роста), все клетки находятся в одинаковых условиях среды, пространственной и физиологической дифференциации внутри биопленки еще нет; и 2) прогрессивно замедлящийся рост биопленки, который сопро-

глубина, см

0 к:

ж ж

1.5 2

3 3.5

ч\

Ад

д

А

0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 1.8 концентрация пирувата, мг С/мл

глубина, см

О 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6

концентрация пирувата, мг С/мл

Рис. 9. Динамика пространственного распределения остаточного ирувата в среде в процессе роста газона Р. /1иогезсепз (а) и А1са-Iеепез ар. (0) на поверхности агаризованной среда. Время инкубации чу. I - 1.5; 2 - 25,5; 3 - 49,5; 4 - 73.5; 5 - 97,5; 6 - 145,5. ривые рассчитаны по распределенной модели.

вождается снижением его эффективности, а также накоплением нежизнеспособных клеток и продуктов обмена; этот период связан с развитием пространственной структуры газона, что ведет к дифференциации биопленки на активно растущую периферическую зону и пассивный центр.

Моделирование колониального роста

Точечная модель роста бактериальной пленки на агаре. В отличие от единичной колонии, где ее край однозначно является зоной роста, в бактериальной биопленке метаболически активные и растущие клетки равномерно распределены по всей прилегающей к агаровому слою поверхности (если рост ограничен доступностью субстрата, диффундирующего из агарового слоя) или на границе раздела аэробной и анаэробной зон в глубине пленки (если рост лимитирован одновременно диффундирукищм снизу субстратом и поступающим сверху кислородом), йце более сложной ожидается пространственная сегрегация и дифференциация клеток внутри биопленки бактерий А1са11вепез зр., которые образуют экстрацеллюляр-ные газовые баллоны, потенциально способные выполнять функцию аэрации внутреннего пространства колонии. Для простоты выделим два типа зон бактериальной пленки: (а) периферическая зона, прилегающая к агаризованной среде и обеспеченная питательными субстратами; (б) зона, где роста нет из-за отсутствия субстратов. На наличие второй зоны в культуре псевдомонад указывает постепенное увеличение содержания мертвых клеток. У ^lícaíígenes эр. эта зона, вероятно, меньше, поскольку доля мертвых клеток невелика. По-видимому, слои клеток внутри колонии подпитываются субстратом и кислородом по сети мембран ных каналов.

Имитационная модель роста бактериального газона на агаризованной поверхности представлена в табл. 3. Настоящая модель учитывает, что в биопленке происходят рост клеток, их дыхание и образование внеклеточных продуктов, а также отмирание тех клеток, которые остаются за пределами активной зоны (х1.пГ-хрг) и где скорость поступле-

Имитационная математическая мол-.; ль роста бактериального газона на повермссти йгаризсвгжз:^ среды

Переменная

Субстрат в биопленке; бактериального

газона

Общая биомасса бактерий Растущая биомасса Некромасса хг} Экзометаболита п С02 р

Субстрат во всем объеме среда

Уравнение

= ^

где

= 9

шаг

Яг

= С^/У'** + УУ'

т =• А<,7!аГз^./ К f / /' Кт + 3^/7^,) йт^ЛК = У^д-т^ - агГог

ciгgr,/dt - если з^/\у>К3, ингн бх^/йг

■ЩЫ = атго{ - от/

сШ/йг

Ог,:Г^

ф/Ш: - (1-7)(аа~т)хрг + мг^

3 [ОТ

(1)

(г)

(3)

(4)

(5) (ь)

сп

ния субстрата становится ниже трат на поддержание.

Экспериментальные данные наилучшим образом описываются данной моделью при значениях параметров, которые приведены в таблице 4.

Таблица 4

Численные значения параметров модели (уравнения 1-7), используемой для имитации развития бактериального газона

Параметр Размерность РзеиОтопаз /1иогезсепз А1са1(§епеа зр.

У г С биом./г С пирувата 0,59 0,55

а ч"1 0,0053 0,0036

К мг с/ч 0,43 0,43

кя мг С/л 0,096 0,39

кп мг С/л 0,175 0,95

** мг С/л 0,276 0,795

Я/ мг С/мг С биом./ч 0,629 0,466

< мг С/мг С биом./ч 0,123 0,104

мг'С/мг С биом./ч 0,149 0,088

¥? л л 4,42*1О-6 2,54*Ю~2 8*Ю-6 2,29*Ю-2

Данная модель предсказывает экспоненциальный и почти недифференцированный рост ~ в течение первых стадий образования газона с последующим переходом к фазе замедленного роста. Замедление вызвано резким снижением концентрации пирувата внутри биопленки в течение первых и вторых суток роста в опыте с Р. /Iиогевсепз и А1-саИвепеа эр. соответственно, после чего внутри колонии появляется периферическая зона и неактивный центр, где бактериальные клетки отмирают. Активно растущие бактерии Р. /Хиогеэсепз характеризуются теми же значениями ростовых параметров (Яа, 03т, |1п), что и в гомогенной культуре (Паников, 1992). Совпали также величины удельной

1 о

1 V

скорости отмирания бактерий в центре колонии и в голодающей гомогенной культуре: 0,0053 и 0,006 ч соответственно {Дорофеев, Лаштког.

л УОх ! .

Различия в значениях параметров настоящей модели для двух культур обусловлена различиями в организации колоний и наследственно закрепленными ростовыми свойствами этих бактерий. Псевдомонада растут и отминают Г5НГ.ТПРР. - ЧОМ Л1 оп1 (пслоа ^ "

Распределенная ыодель роста бактериального газона на агаризо-ванной среде. В отличие от представленной выше модели, которая оперирует усредненными по пространству концентрациями субстрата в бактериальной пленке и в столбике агара, данная модель описывает пространственное распределение пирувата внутри агарового слоя на основе уравнения диффузии: дз(г,1)/д1 = В^а/дг2.

Можно записать уравнения модели в следующем виде:

ШёЛ)- ¡хГ + и

аг аг2

аз^и = Ч1Х/Ут)х + В О^П д1 02 2 '

Зависимость и от 2 задавали в форме уравнения Мопо с учетом трат на

поцдержаше:

^ = Ьпг----тУ'

При численном интегрировании использовали следующие начальные условия:

з(г,0)=з (начальная концентрация субстрата з агаровом слое),

{х- при 0<2<е (инокулят в слое агара высотой е) О при е<г<1 (отсутствие клеток в глубине среды).

При численном интегрировании были использованы следующие граничные условия:

о при г=о, х(г,г)=о при 2=1

при 2=0, -2312*11=0 при 2=1. аг 3%

Равенство производных нулю при 2=0 и г=1 соответственно означает

невозможность перехода субстрата и бактерий в воздушную фазу над

газоном и непроницаемость дна сосуда для субстрата. Равенство нулю

значения биомассы при 2=1 означает отсутствие бактерий в глубине

агарового слоя.

В данной модели мы не учитывали образование продуктов, так как их количество было пренебрежимо мало (особенно на ранних стадиях роста газона). Не была учтена дифференциация клеток на активные и не активные, а также отмирание биомассы, поскольку численное интегрирование соответствующей системы уравнений сопряжено с большими трудностями.

Суть моделируемых процессов сводится к следующему: I) бактерии растут в виде пленки с удельной скоростью роста ц, которая меняется в процессе роста в зависимости от концентрации субстрата з, 2) субстрат поступает в биопленку за счет диффузии и расходуется на рост ] поддержание биомассы. Результаты расчета по этой модели представлен на рис. 9. Согласие с экспериментальными данными наблюдалось при значениях параметров, указанных в таблице 5.

В целом данная модель удовлетворительно описывает экспериментальные данные, но на поздних этапах роста газона заметно отклонение расчетных кривых от экспериментальных точек. Это связано с тем, что модель не учитывает образование экзометаболитов (внеклеточных продуктов обмена), которые в большом количестве выделяются в этот период

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Предпринятые в настоящей работе исследования позволили получит; количественную информацию о динамике колониального роста от микро-до макроколонии и происходящей при этом дифференциации клеток. Впер

Таблица 5

Значение параметров уравнений распределенной модели, описыващей поступление субстрата т эгарового слоя в бзктетэлышй' газ он

Г. /¿иогеясепз и А1сиИ$епе8 эр.

1арамвтр| Биологический смысл Численное значение 1

1 гзеийсипзтыз Аса'11 репез |

1 1 /1иогеасеиз ар. |

\хт 1 максимальная удельная скорость 0,274 Л Т рг/ |

| роста, 1

I - -п чи • I I I ц^ЛЛО илл П VI л .

С ¡¡Ирувяга/ ■ Ч м КГ 0 оисмассы) 0,012 0,013

*8 константа насыщения, мг С/мл 0,15 0,20

выход биомассы на единицу потребленного субстрата, мг С/мг С 0,376 0,359

коэффициент диффузии, см2/ч 0,03 0,03

¡ые получены данные по эффективности колониального роста и динамике :техиометрических параметров.

Выявленные закономерности были сформулированы в виде математических моделей роста бактериального газона на поверхности агаризован-;ой среда. Математическая модель позволяет осуществить синтез змпи-ической информации и получить целостное представление о развитии актериального газона на поверхности среда. Точечная модель рззрзбо-ана кз основе уравнения материального баланса но одному из элемен-ов внесенного субстрата - по углероду. При условии сходимости мате-•иального баланса по углероду можао сделать вывод если не об истин-остп, то о непротиворечивости теоретические положений, объясняющих еханизмы колониального роста. Выявлена регуляция роста фактором реды - концентрацией и диффузией лимитирующего субстрата.

Несмотря на однократную подачу субстрата, рост бактериальной ко-онии (газона) можно считать непрерывным, поскольку субстрат не моет потребляться одновременно во всем объеме сосуда, и происходит остоякная подпитка растущей колонии питательным веществом за счет

градиента диффузии. Рост колонии на поверхности агаризованкой среды растянут во времени в отличие от взрывного роста в гомогенной периодической культуре, где происходит залповая подача субстрата, который в данный момент времени доступен всей популяции. Однако, кинетические параметры, характеризующие периферический рост, оказались теми же, что и в гомогенной культуре: У = 0,5 и 0,49 г С/г С, т = 0,012 и 0,013 мг С пир./(ч * мг С биом.) и = 0,27 и 0,13 ч-1 для Р. /1ио-гезсепз и А\саХ1ёепеа зр. соответственно.

Вместе с тем мы полагаем, что рост бактериального газона в целом близок к росту диализной культуры благодаря непрерывному притоку лимитирующего- субстрата с почти постоянной скоростью без выноса биомассы. Экспоненциальный и недифференцированный рост в течение ранних стадий формирования газона сменяется линейной фазой роста с последующим постепенным замедлением, вызванным уменьшением прироста жизнеспособных клеток в случае Alcaltgeneз зр. и быстрой потерей жизнеспособности в случае Р. ?1иогезоепз. В диализной культуре рост также линеен в течение длительного времени (Дорофеев и др., 1984). Остается неизвестным, почему бактерии, выросшие на агаре, отмирают быстрее по сравнению с выращенными в гомогенной культуре. Объяснить это явление одним лишь ингибиторным действием продуктов нельзя, так как слой агара может служить таким же стоком для продуктов, каким является диализный мешок со свежей средой в периодической диализной системе. Отличие может быть скорее количественным, чем качественным. Переход к замедленному росту и увеличение числа мертвых клеток в колонии связаны с уменьшением количества доступного субстрата на жизнеспособный организм. Выживание голодающих клеток внутри биопленки (колонии), по-видимому, контролируется некоторыми зависящими от плотности популяции киллерными факторами. Выживание успешнее в диализной культуре, где популяционная плотность обычно на несколько порядков ниже (Рап1коу, 1995).

Б процессе наших исследований были выявлена существенные разли-ия в ростовых свойствах двух бактериальна:: культур, отражавдю их риспос^бл-А1ше к различным условиям ЭСИГЗШ1Я. Падение ккзнесио'*обно -та Р. fluoreacena и сохранение высокой жизнеспособности Alcali genes р. указывают на преимущество колониальной организации второй куль-уры ¡ю сравнению с первой. (Это подтверждается и необходимостью ис-ользоеэния сред более сложного состава для гомогенного культивиро-

С™" ЛZ~ZZÍ¿C7lüC UU uudonoxuinj ü rvj¡nt«B»li4KHHUHM ИЯ гглво-ргаплчпт»

rapa). Несмотря на более низкую удельную скорость роста колоний Icaligenes зр., эффективность их роста не ниже, чем культуры псев-омонад. Вероятно, Alcaltgene3 зр. может обеспечить эффективную ра-оту части популяции за счет наличия газовых каналов в колонии, у их менее эффективный энергетический обмен и меньшее сродство тс субтрату, чем у Р. fluoreacens. Указанные различия ростовых характери-тик согласуются со способностью этих микроорганизмов занимать оправленное место в экосистеме. Р. fluorescena - обитатель эфемерных эробных мест (например, ризосферы), характеризующихся регулярными ерепадами в потоках легко доступного органического вещества. Этот рганизм быстро мигрирует и растет па корневых экссудатах, локусы rvrepiix тгостояштс-- шшптя, т.о. ?. Jlturencetin адаптирован к неста-идьккм условиям. Al cal £gen<?s ар. приурочен к гоне донных отлсжениа, арактеризующихся более низким и стабильным содержанием органических еществ и микроаэробными условиями, возможно, днем, когда подержание ислорода выше за счет фотосинтеза, колонии запасают С9 з гаоовыз. аллонах и каналах и используют его в темное время суток. Таким обозом этот организм поддерживает стабильность популяции в нестабильных условиях.

выводы

I. Прослежена динамика роста колонии, начиная от деления единич-гой клетки до макроколонии. Показано, что после попадания бактерии

на поверхность агара наступает стадия колонизации, характеризущаяс экспоненциальным недифференцированным ростом бактериальной популяции. Вследствие диффузионных ограничений затем наступает фаза линей ного роста с последующим постепенным замедлением.

2. Бактерии Р. ?1иогеасепз образуют колонии правильной циркуля рной формы, тогда как часть колоний А1са1^епез эр. проявляет отклс нения от правильной формы, обусловленные появлением областей ускоренного роста и образованием "лопастей" по краям колонии.

3. Скорость роста колоний Р. /Хиогезсепз не зависит от толщине агарового слоя (Н) и составляет 12 и 30 мкм/ч на синтетической и комплексной средах соответственно. Напротив, у А1са11вепез зр. с увеличением Н наблюдалось резкое увеличение радиальной скорости рос та, причем до величин, многократно превышающих таковые у псевдомонад.

4. Показана высокая эффективность колониального роста: выход биомассы по субстрату составил соответственно 0,52 и 0,55 г С биомассы/г С пирувата для ^lZcaZígeлes ар. и Р. /гиогеасепа. Кинетические характеристики роста на стадии колонизации поверхности оказалис близки к показателям роста в гомогенной культуре: удельная скорост! роста была равна 0,13 и 0,27 ч-1 для АХсаИвепеа ар. и Р. Гиогеасепа соответственно.

5. Рост колоний удовлетворительно описывается математической моделью, учитывающей дифференциацию клеток на растущие, поддерживал щиеся и мертвые, диффузионное поступление субстрата в бактериальны! газон из агарового слоя и образование продуктов метаболизма (С02 и зкзометаболитов).

6. Выявлены различия в кинетических и стехиометрических показателях роста двух исследуемых культур. Колонии Alcaligeneз ар. растз быстрее и эффективнее, чем гомогенная суспензионная культура. По срг внению с Р. ^иогезсепз они обнаруживают более высокую кизнеспособ-

зсть, но белее низкую скорость роста. Отмеченные различия соответ-

сшсок публикации

j. Panikov М.8., Rodin V.B., Belova S.S. Xinetics of eoionial ?OWth Of bacteria // Abstr. Book: 7th Tnt. Consr. of Bant, and

ipplement.

2. Белова С.Э., Дорофеев А.Г., Паников Н.С. Кинетика и стехио-зтрия поверхностного роста Pseudomonas fluoreacens и Alcaligenea р. на авизованной с?^/Л!икрсСап2агия.—1ЭЭ5.-:Т.64; 33.-С.347-.

3. Белова С.Э., Дорофеэв А.Г., Лебединский A.B. Стехиометрия

:Еерхностного роста Pseudomonas fluoreacens и Alcaligenea sp. на 'аризованной среде // Прикладная биохимия и микробиология. - 1995. В печати.

Л'веижх у

rva-guti, — uiiLj jrü-oii:

'<]>A