Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфо-функциональные основы этологии некоторых представителей бактерий рода протея

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Морфо-функциональные основы этологии некоторых представителей бактерий рода протея"

ЛШНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ

ИВАНОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИ!! ИНСТИТУТ им. А. С. БУБНОВА

На правах рукописи УДК 576.951.47:576.8.093.031

ПАЛКИН Алексей Леонидович

МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ основы ЭТОЛОГИИ НЕКОТОРЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ БАКТЕРИЙ РОДА ПРОТЕЯ

(03.00.07 — микробиология 14.00.23 — гистология и эмбриология человека)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Иваново — 1992

Работа выполнена в Ивановском государственном медицинском институте им. А. С. Бубнова.

Научные руководители —

доктор медицинских наук, профессор С. Г. Смирнов, доктор медицинских наук, профессор А. А. Миронов.

Официальные оппоненты —

доктор медицинских наук, профессор В. Г. Лиходед, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник В. В. Высоцкий.

Ведущая организация—Институт биохимии и физиологии микроорганизмов г. Пущино-на-Оке.

Защита состоится « . . . » . . . . 1992 г. в «... » час.

на заседании специализированного совета Российского медицинского университета (117437, Москва, ул. Островитянова, 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского медицинского университета.

Автореферат разослан « » 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук, старший преподаватель

Т. Н. КЛУШИЦА

Г С ;< г". • - . ,1 , (-—^

"V- ..........о т.-."л ;

'-.ичи.И'ЛТ г___'__1_J

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМ. От исследователей, работающих в области микробиологии, справедливо вдут конкретных научных выводов, позволяющих клиницистам правильно выбрать и осуществить комплекс мер, направленных на профилактику лнфошиэнных заболевания, разработать эффективные пути борьбы с инфекционными осложнениями различных заболеваний. В последний годы особо важное значение в клинике приобретают заболевания, вызываемые протеем. Протей обладает очень высокой и к тому же постоянно возрастающей устойчивостью к антибак^ териальным препаратам ( Брода ПЛ., 1987), поэтому лечебные мероприятия, проводимые на фоне уже развивающегося процесса, нередко не только мало эффективны, но и при недостаточно рациональном их . проведении зачастую усугубляют этот процесс (Швиденко 0.И.,1988).

Роль протея ё возникновении заболеваний человека постоянно возрастает (Абауси И. с соавт.,1981; Будаева Г.В. с соавт.,1987). Ряд авторов обнаружил наличие у бактерий poflaßoteus факторов агрессивности (Kopp , 1985). Данный возбудитель инициирует ки-.шечные заболевания (Агеева P.A.,1988), остеомиелиты (Гринмаер Т.В., Чер.номордиков А.Д.1981), бронхиты и пневмонии (Антипенко В.П., Красильников А.П., IS82), воспаления мочевыводящего тракта (/¡'mi-

scn'i.^cott А.» 1966). Некоторые штаммы протея, выделенные при * исследовании трупов животных■ являются патогенными для человека (Цвегкова Е.А., I960). Часть штатов протея имеют уреазную и геш-литическую активность (/VcSfy еУ ct. , 1987), высокую степень.инва- . зивности и вирулентности ( ?е.е.т.4гсс msP. ¿cid, 1981), поэтому данный возбудитель способен вызывать тяжелые патологические состояния.

. Таким образом, разработка методов рациональной профилактики и лечения протейной инфекции имеет чрезвычайно важное значение. Между' тем очевидно, что усилия в этом направлении должны базироваться на точном знании биологии возбудителя, на анализе его патогенных свойств в зависимости от состояния окружающей среды. Дейст-

вительно, при бактериологическом исследований часто отмечается апериодичность Еццелзния протея (Калина Г.Н., 1979), хотя следует отметить, что это свойственно и некоторым другим бактерия».! (Бакенов Л.Г,. ..Исхаков Х.К., 1Ш5). Более того, восприимчивость бактерий к антибиотикам зависит от формы, в которой находится клетка, например, меняется при перехода в момент формирования колонки от рояцихся возбудителей и нерощихся (Габидулин З.Г. с соаат., 1У6о). Отмечена неодинаковость реакции на лекарственные средства со стороны отдельно расположенных и образующих колонию шкроорганиа-мов (Шапиро Д.A.., I&68)-.

■ Большое значение в плане предупреждения протейных осложнений различных заболеваний может играть их своевременное прогнозирование с учетом периодически появляющихся особых морфологических форы.--протея, обладающих новыми свойствами по отношению к окружающей среде.

Для клиники очень перспективным, на наш взгляд, является анализ поведенческих реакций протея, провде всего, при его росте на плотных питательных средах, поскольку данный опособ культивирования в большей степени приближен к условиям ¡initio , чем бульонная культура.. Изучение механизмов взаимодействия протея в процессе формирования микроколоний может дать ключ к пониманию причин и ус- . ловий образования новых популяций данного возбудителя инициирующе- . го "вспышку" протейных осложнений в клинике.

Все это позволяет считать проблему анализа поведения протея ' в процессе роста на плотных питательных средах (движения клеток в процессе формирования микро-и гакроколоний, образования новых "суб-полуляции), а также изучения ¡.»рфо-функциональных особенностей данного микроорганизма в зависимости от его свойств, выявляемых при образовании'колонии.и изучения зависимости его поведения от состоя- 2 -

ния некоторых параметров окружающей срзды актуальной.

ЦЕПЬ И ЗАДАЧИ ИССЩОВАНИЯ. Изучение морфо-функциональшх и поведенческих особенностей протея, проявляющихся при формировании микро- я ткроколоний на плотной питательной среде.

Для достижения поставленной цели мы считали необходимым решить следующие задачи:

1. Изучение морфо-функциональных особенностей протея при формировании шкроколокий ка плотной питательной среде.

2. Исследование морфо-функциональных свойств клеток и структурных особенностей ткроколоний лрогея при культивирований на плотной питательной среде. ,

3. Анализ механизмов и условий формирования атипичных какро-. колоний протея. ' • •

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.. Разработан комплексный формо-функциональный методический подход к исследовании поведенческих реакций протея при формировании микро- и ткроколоний на плотной питательной среде-

. Впервые показано, что формирование шкрокопонии протея представляет собой совокупность процессов, реализующих простроение взаимосвязанных структур, которые определяют морфологию макроколоний.

Обнаружена "субпопуляция" клеток протея, отличающаяся "придонным ростом колоний, большим полиморфизмом, образованием своеобраз--ных клеточных "канатов" в роящейся части макроколонии и рядом биологических признаков.

. Феномен образования "субпопуляции" впервые проанализирован за значительный временной период путем непрерывного пересева бактерий, что позволило выявить значимое сходство динамики появления "субпопуляции" протея в эксперименте и повышения высеваемости возбудителя

- 3 -

в бактериологической лаборатории клинической больницы.

Впервые описаны механизмы рост» и дана расшифровка взаимодействия клеток при формировании спиральных колоний протея.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Данныэ о динамике высеваемо ста протея и временные параметры появления "субпопуляции" с образованием спиральных колоний могут быть приняты за основу при дальнейшей разработке математического прогноза и профилактических мероприятий по предупреждению протейной инфекции.

Изучение развития колоний протея, регистрация периодов воз- • •

никновения "субпопуляции", определение моментов перехода от рояния к консолидации с последующим определением восприимчивости протея

х внешним воздействиям на разных стадиях развития популяции и "субпопуляции" должно способствовать формированию более рационального подхода к воздействию на протей различными химически;,¡и веществами с учетом его восприимчивости к ним.

Феномен образованна "субпопулящи" макет стать "индикатором" в отношении неизвестного пока нам экзогенного фактора, влияющего на биологические процессы в клетках протея и их взаимодействие ■ между собой. •

Материалы диссертации доложены и обсуждены на 13 научных совещаниях, что обеспечило их информационное внедрение в практику научных микробиологических исследований. .Материалы диссертации внедрены в учебный процесс в Ивановском государственном университете и Ивановском сельскохозяйственном институте. ОСНОВНЫЕ ЮШЕЯИЯ, ВЫШИНЕ НА ЗАЩИТУ. I.. Формирование кикроколошш протея представляет собой совокупность процессов, реализующих построение взаимосвязанных структур, которые определяют строение макроколонии.

- и -

2. Обнаружены значительная полиморфность метрических показателей и закономерный градиент укладки бактерий в смежных участках макроколонии.

3. Процесс роения бактерий рода протея имеет общие свойства

с автоволновыми колебаниями: наличие сплошного движущегося фронта, переходного процесса, повышение скорости движения с увеличением диффузии,наличие зоны невозбудимости, образование ревербератора.

4. Выявлена "субпопуляция" клеток протея, отличающаяся придонным ростом колонии, большей полиморфностью клеток, числом жгутиков, образованием своеобразных клеточных "канатов" в пределах майроко-лонии и особыми биохимическими свойстваш. При этом вместо кольце-, ведной макроколонии образуются спиральные и другие атипичные формы колоний.

5. Феномен образования "субпопуляции" в пределах значительного временного периода имеет апериодический характер. Обнаружено значительное сходство динамики появления "субпопуляции" протея в эксперименте и повышения высеваешсти возбудителя в бактериологи! ческой лаборатории клинической больницы. Данные о динамике образования "субпопуляций" и "вспышек" протейной инфекции дополняют друг, друга и могут быть объединены в единый экспериментальный массив • для детального изучения этих процессов.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ РАБОТЫ ДОЛОЖШЫ на: Конференции молодых научных работников ИГШ им.А.С.Бубнова г.Иваново, 1984; всесоюзном . совещании "Цитология микроорганизмов", г.Пущино, 1984; конференции молодых ученых ИГШ им.А.С.Бубнова, г.Иваново, 1985; международном семинаре "Магнитобиология и роль межпланетного магнитного поля в биодинамике", Москва, 1985; конференции молодых ученых ИГШ им.А.С.Бубнова-,г.Иваново, 1986; областной Конференции молодых учетных по общественно-политическим и научно-техническим проблемам,

- 5 -

г.Иваново, 196o? 1-й съезде эпидемиологов, инфекционистов и гигиенистов Туркменистана, Ашхабад, 1986; всесоюзном совещании молодых ученых, Тбилиси, IS87; научно-техническом семинаре "Электронная микроскопия для исследования функциональных изменений .структуры клетки при различных возбудителях", г.Иваново, I9S7; научной конференции молодых ученых ИГЬИ, Иванойо, 198?; всесоюзной конферен- " ции по актуальным вопросам клинической микробиологии в неинфекционной клинике, Барнаул, 1987; Ш-ей областной конференции молодых ученых и специалистов по актуальным.общественно-политическим и научно-техническим проблемам, Иваново, 1988; всесоюзной школе-семинаре "Непериодические быстро протекающие явления в окружающей среде, Томск, 1988; научно-практической конференции "Эпидемиология, клиника, диагностика и профилактика инфекционных болезней взрослых-' и детей", Иваново, 1963.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация состоит иэ введения, глав, заключения, выводов, указателя литературы, приложения. Содержит 207 листов машинописи, иллюстрирована 38 таблицами, 29 рисунками. Указатель литературы состоит из 12о источников, 64 отечественных и 62 иностранных.

жгершы и метода исспдадшя

Материалом настоящего исследования послужили НО диких штампов протея (.ИЖсл m¡i&¿>¿'b которые были выделены бактериологи-' ческой лабораторией I городской клинической больницы. Для изучения морфологии бактерий били использованы роящиеся штаммы мирабиль-ного протея, условно обозначенные наш номерами CÍ1-IO, tí 2, 13, 14, 15. Кроме того с использованием штамма СЯ-10 были проведены исследования изменений формы ыакро и микроколоний, в том числе методом цейтраферноД киносъемки; с помоцъю ежедневных пересевов изучены отличия структуры колонии, биохимических и функциональных характерис-

- б -

тик бактерий при обычном росте и при образовании "субпопуляций" Биохимические свойства соответствующих штаммов были изучены с.применением культиватора фирмы ABBOT США, мы приносим глубокую благодарность за помощь в этой работе А.В.Голубеву из ШИ материнства и детства.

Для обнаружения возможных сезонных изменений процесса роения при образовании макроколоний протея да использовали культивированные ' бактерии на плотной питательной среде следующего состава: гид-ролизат кальки -17,9 г, агар-агар -11,2 г (оба производства Догес-танокого НИИ питательных сред, одной партии изготовления),'натрия хлорид -5,9 г, фенол -0,75 г, вода -1000,0 г, рИ - 7,3. Зенол до'-, бавлялся в стериальную питательную среду до начала процесса разлива. Толщина слоя питательной среды была одинаковой во всех,опытах, так как заливка велась дозировано.

Для инокуляции использовали бульонную культуру э возрасте 18 часов. Посев производился уколом иглы, которая проходила через всю толщу агара до дна чашки Петри. Засеянные чашки помещались в ' термостат при темпзра;уре 27;)С.

В течешз пятилетнего периода с 8.08.83 по 7.07.88 года 5 раз в неделю засевалось 10 чашек Петри, что позволяло наблюдать дина-* мкку образования "субпопуляции" протейных бактерий в течение 1184 дней. Всего засеяно II840 чашек Петри. За этот период зарегистрировано 186 дней, в которые наблюдалось 499 случаев формирования . "субпопуляций" протея. '

Кроме того из общего числа штаммов было исследовано 28 с целью определения их способности к образованию ".субпопуляции". Эти группы колоний, соответствуют колониям индикаторного штамма. Каждый из них ивокулировался 5 раз. Всего таким образом проведено . 340 исследований.

Результату ежедневных наблюдений за динамикой образования -субпопуляций" были сопоставлены с данный! бактериологических ис- . следований, проведенных в областной клиничаской о'ольнице г.Иваново, которые были любезно предоставлены нам её заведующей Кузнецовой- Я.В., за что мы'приносим ей глубокую благодарность. Проводился подсчет количества совпадений о-бразования »субпопуляции" и случаев высевания протея в клинике. При этом учитывались совпадения со сдвигом - (5-1) день и совпадения без сдвигов по времени.

Наш проанализирована выборка высеваемости протея в период. . с 8.08.83 по 31.12.88.. ИЗ I?74do исследований, проведенных в лаборатории, протей бьш обнаружен в,1570 случаях. Сопоставлены анализ проведен на материале, полученном с августа 1283 года по апрель I960 года. В этот период зарегистрировано'133 дня, в которые была обнаружена "субпопуляция". Всего выявлено Зо8 случаев форми-■ рования "субпопуляции". В то же время число случаев ввдеяения протея составило 180, а всего положительных результатов зарегистрировано 269.

Кроме этого сравнение этих данных проведено с использованием критерия знаков (И.И.Коньшсва и М.В.Земскова; ИвГУ), которая основана на нулевой гипотезе', предполагающей отсутствие различий между двумя разновидностями объектов. Данные результаты обрабатывались на ЭВМ 3C-I060 в диалоговой системе.

Для изучения влияния различных условий культивирования и мутагенных факторов на формирование манроколоний проведаны экспзри-мантя при проведении которых было засеяно 894 чашзк. Для оценки влияния фенола на рост бактерий использовались концентрации его он 0,01 мг до 0,14 мг на ICO мл мясопоптошого агара. Для оценки 'влияния желчи ("жолчь медицинская") использовались концентрации от

0,01 иг до'4,5 кг на 100 мл 1Ш. Для исследования влияния плотнос-

-8 -

ти среды содержание агара изменялось с 2,2 до. 3,6 г на 100 мл мя~ сопептонного бульона. Показатель рН среды изменялся в пределах от 5,35 до 9,5 (данный параметр контролировался рН-метром марки рН-121). Для исследования влияния температуры на протейные бактерии проанализирован диапазон температур от 20 до 44°С. Культивирование проводилось в термостате марки ТС-80У 42. Облучение ультрафиолетовыми лучами проводилось бактерицидной лампой ОКН-11 с расстояния 30 см при экспозиции 5,10,20,30 мин. Облучение радиоак- ■ ьс

тивным кобальтом Со (доза 88 рад) проводилась кобальтовой пушкой Луч-1 при экспозиции 5,10,20,30,40 мин. Исследования проведаны на базе радиологического отделения онкологического диспансера г.Ива- • ново (выражаем глубокую благодарность асс.В.М.Анисимову).

Для изучения свойств и дифференциальных признаков бактерий, входящих в состав основной колонии и субпопуляции, использовались следующие гесты: I) культивирование с феноловым красным на среде следующего состава: вода-1000,0 г, гидрозилат кильки-0,5 мг, феноловый красный -0,4 г, 45 чашек; 2) исследование изменений цвета тетразолиев в зависимости от возраста культур- 294 чалки. Для проведения последнего теста использовались следующие соли тетраэолия:. тетраэолиевый синий диформазан, тетранитротетразолий синий, синий ' мононитротетразолиевый, синий неотегразолиевый, М-нитратетразолий фиолетовый, Н-нитротетразолий фиолетовый, синий моно-китротётра-золиевый, нитрогетразол' синий (фиртКедАсб - Чехословакия). Ука- ■ занные индикаторы разводились в 0,1 М фосфатном буфере (рН-7,3) в концентрации 2,5 мг в 15 мл. Регистрация изменений цвета проводилась .с использованием спектрофотометра СФ-46 на соответствующей длине волны для каждой соли тетраэолия.

Для исследования поведения одиночных бактерий в процессе •формирования ими микроколоний мы использовали метод цейтрафферной

- 9 -

киносъемки, кульа-ивируемых в специальной шкрокамере, которая была и изготовлена на основе промышленного термостолика. Последний ыодифи- • цлровался путем применения термического регулятора, что обеспечивало повышенную 0,1°С) точность поддержания температуры. При изготовлении микрокамеры использовались покровные стекла толщиной не' более 0,17 мм, размером 24x24 мм. Общая толщина камеры не превышала 1,1-1,2 мм. Её рабочая глубина составляла 0,2-0,3 ш. Всё это позволило использовать для микросъемки иммерсионные объективы. )• Для наблюдения и фотосъемки использовалась микрокиноустановка ШИ-1 ■ '{ЛОМО)., {мы приносим глубокую благодарность асе.О.Ю.Кузнецову за помощь в проведении этрй работы). Нами было обнаружено, что протей не сохраняет способность -к роению при культивировании в микрокамерах, приготовленных обычным способом. Для адаптации ср.едьг к нашим исследованиям ш использовали следуацуи методику посева (рац.предложение ИГ.МИ № 1641 от 22.04.65). Готовились два агаровых пласта, толщина каждого их которых соответствовала толщине пленки, образующейся на бактериологической петле после её изъятия из расплавленного агара. На первый пласт бактерии засевались методом стекаю. щей каплй, после чего он накрывался вторым агаровымушастом.

В ряде случаев мясопе'птонНый агар, предназначенный в качестве питательного субстракта для приготовления шкрокамеры, готовил- ■ ся следующим образом (рад.предложение НГШ'Ю 1901 от 6,10.68). Приготовленная среда расплавлялась над пламенем спиртовки, но не доводилась до кипения. Через полученный расплав при помаци пасте' ровской пипетки, соединенной с резиновым резервуаром, продувался кислород в объеме 100 ска на 2 мл среды. Далее изготавливалась .

. Ш-образная камера Пешкова.

Съемка проводите! с использованием коррегирующего фильтра Н2С-1- на фотопленку "Шкраг-300" с. экспозицией 10 сек и интерва-

- 10 - '

лом между кадрами 10 шн. При исследовании начальных этапов развития шкронолонии изучены 723 бактерии, сделано 1447 измерений. В ходе исследования всех этапов роения было проведено 1055 измерений бактериальных клеток штамма СП-Ю и 1440 измерений штам-

ма Рг.»игаМ\ 2.

Для исследования упаковки клеток и общей структуры макроколоний протея был использован метод препаратов отпечатков. Всего было измерено 418 клеток в 5 разных участках макроколоши (край, область консолидации, зона прилежащая к месту инокуляции и т.д.)'.

■ Пространственная организация роящегося края ткроколоши изучалась с помощью сканирующей электронной микроскопии. Забор проводился таким образом, чтобы на каждом препарате находились клетки только данного участка колонии и отсутствовали микроорганизмы' из соседних зон (рац.предложение КГШ I? 1814 от 02.04.87). Для этих целей из ыакроколонии аккуратно вырезались пластинки мясопоптонно-го агара толщиной 1,5-2,0 мм вместе с находящимися на ней бактериями.

Для освобождения поверхности бактерий от мощного слоя слизи в некоторых случаях мы использовали кактусовые иглы, которыми либо аккуратно очищали поверхность блока, либо игла вкалывалась в агаровый блок и выдвигала на противоположную поверхность образца достаточно большие группы бактерий. Проверка данной методики показа- . ла, что пространственная организация и взаиморасположение микроорганизмов в этих группах изменялась незначительно. Всего исследовано 44 блока, выделенных из различных участков мг.кроколонии. После указанных выше манипуляций или без их использования образцы помещались в 2,5$ раствор гдутарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,3) на 24 часа. Далее препараты обезвоживались в восходящих концентрациях этанола и просматривались в сканирующих элек-

-II-

тронных микроскопах Н,и1С ^-405А и 7г 5 ^ В -300.

Ультраструктура протейных бактерий изучалась с помощью просве- ■ чивающей электронной микроскопии. Для этой цзли колония заливалась 2,55? раствором глутарового альдегида на 0,1 Ы фосфатном буфере (рН 7,3) на 2 часа.Затем из интересующего нас участка аккуратно, сохраняя пространственное взаиморасположение клеток и их агрегатов, вырезался агаровый блок, который после отмывки в буфере постфиксиро-вался в 1% буферном растворе четырехокиси осмия, обезвоживался в восходящих концентрациях этанола и заливался в смесь эпона(с&к.тралой 1КВ-П1 (Швеция), конт {йотировались уранилацетатоы и цитратом свинца и исследовались в просвечивающем электронном микроскопе ЭВМ-100 АК (г.Суш). .Полученные микрофотографии были подвергнуты морфо-метрической и статистической обработке в соответствии со стандарт- •• ной методикой. Всего проведено измерение 1763 клеток.

. РЕЗУЛЬТАТЫ ПРОВЕДЁННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ . При изучении процесса формирования микроколоний протея при росте на плотной питательной среде обнаружено, что исследуемые штаммы образуют типичные для этой формы бактерий концентрические * колонии с характерными неровными кольцами, Исследованы роящиеся колонии двух видой: колонии с. непрерывно двигающим фронтом роения и . колонии, у которых процесс роения-периодически останавливается.

Вместе с тем,, установлено,'что'в областной клинической больнице г.Иваново в последние годы возрастает доля протея среди других возбудителей.

В результате пятилетних, практически непрерывных экспериментах обнаружено, что периодически наряду с концентрическими коло-нияш протея образуются макроколонии с деформированной структурой. Деформация связана с образованием в придонном слое среды особой субпшулпции бактерий, которая бактериостатически воздействует на

- 12 -

основную колонию. При определенных условиях 'субпопуляции" таким' образом влияет нг основную колонию, что последняя принимает форму спирали. Роение имеется как в основной колонии, тан и в .придокно расположенной "субпопуляции".

Появление описываемого феномена носит спорадический характер. Частота' и интенсивность вцделения "субпопуляции" зависит от време-I ни суток. Длительность циклов выделения подобных структур составляет около 5 дней. Проверка диких штамов на способность к образованию "субпопуляции" показала, что более трети их обладают указанной потенцией.

Выявлены дифференциальные признаки, отличающие "субпопуляцию", от основной колонии. Они включают большую, чем у основной колонии, скорость распространения бактерий по дну чашки Пет.ри, указанные выше особенности образования ».акроколонии, увеличенную способность к закислению среды, отсутствием реакции с соляш тетразолиев (последнее не зависело от сохранения жизнеспособности бактериальными клетками) .

Выявленные дифференциальные признаки, в том числе и по размеру бактерий, исчезают чэрез 18 часов после появления описываемой структуры. Поэтому образование этой "субпопуляции" можно отнести к изме-» нению фенотипа, что позволяет для более точного обозначения обнаруженной наш добавочной колонии ввести термин фенотипическая-'субпопу-ляция*.

Изменение условий культивирования и параметров среды, а также воздействие ультрафиолетовым излучением и гамма излучением не при-. вели .к возникновению сходного эффекта.

Проверка предложения об экзогенном характера описываемого явления путем сопоставления со значениями числе Вольфа и геомагнйт-. ним планетарным индексом не позволила установить четно выраженной

- 13 -

и достоверной связи между этими процессами. В то же время показано, что динамика образования "сублолулкции" и динамика выделения протея в клинических условиях имеют сходный характер, что позволяет рассматривать эти процессы как взаимодополняющие и имеющие сходную причину. При учете особенностей клинического выделения протея процент совпадения достигает 84$.

При сопоставлении высеваемости протея в различных отделениях за четырехлетний период установлено, что в некоторых случаях имеется значительная корреляция между рядом отделений (коэффициент, корт-. , реляции от 0,300 до 0,679).

В ходе наблюдения за ростом бактерий протея на поверхности плотной питательной среды обнаружены атипичные макроколонии, форма которых (двойные и удлиненные'колонии) свидетельствует о проявлении полиморфизма и гетерогенности популяции протея.

Анализ начальных стадий роста бактерий роящихся шташов протея на плотной питательной среде и процесса формирования шкроко-лоний показал, что независимо от условий культивирования при образовании шкроколонии происходит закономерная смена поведенческих реакций'бактерий протея. Мы исследовали сладу'щие фазы процесса формирования, микроколоний; - фаза; 2) медленный рост;

фаза; 4) активация движения бактерий; 5) стационарная фаза.'Харак- . черным является определенная зональность распределения бактерий протея различной длины в пределах шкроколонии. На самом краю, как правило, расположены длинные бактерии. Эти нитевидные Ш-форма) микроорганизмы двигаются наиболее интенсивно. Лишь в одном из экспериментов удалось зарегистрировать активное перемещение бактерий, длина которых, на превышала 4 мкм. Движение клеток начинается только поело накопления определенной шесы колонии.

■ Кульги'вирование бактерий роаднхея штаммов протея на плотной

- 14 -

питательной среде, обогащенной кислородом, позволило выявить ряд характерных особенностей процесса формирования шкроколоний в о тих условиях.

Микроколоиия а своем образовании проходит те же фазы развития, что и макроколония, однако переход от одного этапа к другоод значительно ускоряется. При этом увеличивается подвижность бактерий и снижается их адгезивность к плотной питательной среде. Однако это сопровождается и более быстрой остановкой развития колоши (фаза стабилизации достигается скорее). ■ '

В этом случае двигаются на отдельные клетки, а их группы, объединенные в своеобразные плоты. На. данном этапе бактерии в указанных условиях не прикрепляются к поверхности среды. Хотя в дальнейшем скорость движения микроорганизмов постепенно снижается» однако некоторые бактерии в составе плота сохраняют свою активность, способствуя передвижению соседних клеток. Фиксация плота к поверхности среды сопровождается распадом длинных форм.

Рост микроколоний нерояцегося в условиях данного эксперимента штамма (/г. ¡чпл^',//^ 2) характеризуется меньшей длительностью периода адаптации и более быстрым началом деления клеток. Однако и период активного движения в этом случае заканчивается быстрее.

В процессе развития микроколонии обнаруживается отчетливая закономерность в изменении средней длины бактерий. В фазу активации подвижности длина бактерий увеличивается, напротив, в фазу консолидации (резкого снижения двигательной активности) средняя длина клеток уменьшается. Данная закономерность проявляется неза-визимо от условий культивирования (Рис.1, табл.1). Анализ изменений удельной площади поверхности бактерий показал, что при развивши роящихся штаммов этот параметр нарастает вплоть до момента начала стабилизации..' При культивировании нерояцегося штамма этот

-15-

показатель во времени практически не меняется. Следовательно он не служит сигналом к образованию длинных форм бактерий (Рис.2, табл.2).

Изучение структуры макроколоний под световым микроскопом, а такие в сканирующем и просвечивающихся электронных микроскопах показало, что в пределах колонии роящегося штамма протея имеется оп-ределнная зональность в распределении бактерий различной длины. Роящийся край колонии состоит в основном из длинных, часто свыые 50 мкм, бактерий. В зонах, расположенных ближе к центру (в участках консолидации), вначале встречаются как длинные, так и короткие формы клеток. И чем проксииальнее расположен исследуемый участок, тем в большей степени срсди бактерий преобладают короткие. Многие бактерии при этом плохо воспринимают генциан-виолет. И только в центральных участках, там где короткие бактерии составляют подавляющее большинство, тинкториальныз свойства микробных клеток нормализуются и все они прокрашиваются генциан-виолетом. Мсрфомзтричэский анализ показал, что средняя длина бактерий по направлению к центру колонии уменьшается. Доликорфность среди коротких бактерий ближе к переферии увеличивается, а у центра падает.

Оказалось, что роящийся край макроколонии представлен трехмерным сплетением длинных бактерий, ориентация которых в простран--стве довольно хаотична. Среди рыхлой фибриллярной структуры колонии все же встречаются отдельные более плотно упакованные скопления бактерий, имеющих форвд тяжей или пучков. Все бактериальные клетки на краю колонии взаимосвязаны как между сосбой, так и с основной массой колонии. На поверхности длинных бактерий хорошо выражены жгутики, которые тесно переплетены с подобными образованиями смежных бактериальных клеток. &шаметозйое сплетение прикрывает поверхность клеточной стенки ив своих узлах содержит значите-

Таблица I

Статистическая обработка, отра:кающая изменения длины клеток (£ ) происходящее в ходе культивирования

Штамм СД-10. Начальные этапы роения. Среда подготовлена

без продувания кислорода.

Этапы раз- Число Среднее (мкм) вития коло- клеток ний (мин)_

вариация асснм- оксцесс мзг-рия

довери-

тсльн.

интервал

460 31 2,52 ± 0,84

560 ' 303 2,57 ± 0,35

630 371 2,30 ± 0,29

760 410 1,52-0,31

43,89 -1,59 1,31 1,71 51:59 -3,44 15,18 0,69 52,18 -3,74 15,80 0,57

Штамм*и14(<¿'Л СП-Ю. Все этапы роения. Среда подготавливалась с применением продувания кислорода.

10 17 2,34 ±0,14 ' 24,31 -1,51 1,95 0,29

130 . 42 3,48 ±-0,20 22,54 -0,78 -0,23 0,40

200 92 3,49 ± 0,11 3(3,90 -1,15 1,06 0,22

230 62 3,92 ± 0,13 30,35 -0,66 0,95 0,26

• 280 46 7,35 - 0,33 34,29 -0,25 0,29 0,73

640 31 : * 6,98 - 0,75 58,83 -1903 0,45 1,53

Штат Я' *'-' 1} 2. Все этапы роения. Среда приготовлена с при-

менением продувания кислорода.

• 10 31 1,93 ± 0,12 36,64 ' -0,92 0,18 0,24

140 62 2,28 ± 0,05 25,61 -0,81 1,06 0,14

250 83 2,50 ± 0,11 38,42 -0,81 -0,31 0,22

310 85 2,35 ± 0,05 21,31 -0,74 -0,41 0,10

Таблица а

Статистические показатели отражающие изменения отношения площадей клеток к их объемам происходящие г хода культивирования

/}. СП-10. Начальные этапы роения. Среда подготовлена

без продувания кислорода

Этапы развития колоний (мин. культивирования) среднее вариация ассиммет. эксцесс довер. интервал

460 4,67±0,07 е,68 -3,26 ; 12,22 0,14

560 6,68-0,01 3,18 -1,29 ; 4,29 0,02

630 7,0210,01 2,75 1,05 8,96 1,95

Я./н/Ш'^ч СП-Ю менением продувания . Все этапы роения. Среда подготовлена с при-кислорода.

10 4,71^0,04 3,41 0,38 -0,44 0,82

200 3,94±0,08 18,82 -2,02 2,43 0,15

230 3,72-0,03 7,74 -0,96 0,34 0,60

280 4,21^0,02 2,64 -3,04 13,41 0,03

640 5,42±0,08 8,39 1,92 2,42 0,17

/?м.1га//¿"'I р 2. Все этапы роения. Среда подготовлена с применением продувания кислорода

10 4,67± 0,1 11,84 -1,23 3,22 0,2

140 4,0ь±0,05 9,89 -1,25 1,37 0,1

250 4,62±0,05 9,70 0,49 -0,14 .0,1 .

310 4,66±0,03 5,56 2,13 5,70 0,06

льше количества слизи. Содержание слиаи на поверхности клеток увеличивается по направлению к центру. Участок консолидации, расположенный непосредственно у края колонии, отличается незначительным числом слоев бактерий (обычно но более двух). Нитевидные бактерии тесно сомкнуты друг с другом своими боковыми поверхностями и образуют плотную фшаментозчую придонную пластинку. Среди формирующих её бактерий довольно много клеток, изогнуты«в форме дуги или петли. Придонная пластинка образована дискретными совокупностями длинных тесно сомкнутых своими боками бактерий. Эти слои имеют разную ориентацию большей части клеток. Между этими слоями видны участки среды, не покрытые бактериями.

Число слоев клеток увеличивается по направлению к центру. Поверхность клеточных стенок отличается своеобразной гранулярностью и имеет небольшие ямки. Иногда бактерии вместе со слизью образуют своеобразные овоидной формы коконы. Поверхность кокона закрыта фила-ментозной дленной. Большая часть волокон в коконе ориентирована радиально. На ультратонких срезах субмикроскопическая организация бактерий расположенных на соседних участках не имеет особенностей. Для них присущ типичный набор внутриклеточных структур, свойственный бактериям протея. Среди бактерий, локализирующихся ближе к поверхности встречаются осшофильные и "светлые" клетки. Осшофиль-ные клетки обычно входят в состав "плотов". Вокруг бактерий видны срезы жгутиков, ориентированных в самых различных направлениях. ¡Кгутики участвуют в образовании отдельных групп бактерий -плотов путем переплетения со смежными бактериями. В светлых бактериях нуклеоид часто как бы перемешан с осмиофильнын веществом цитоплазмы, в цитоплазматическом матриксе встречаются просветления. Бактерии, принимающие участие в образовании плотов, имеют большее содержание жгутиков на своей поверхности. Кроме данных видов бактс-

. - 19 -

рий встречается определешое число частично лизированных клеток и переходные формы.

' С поверхности колонию покрывает не имеющая перфораций мембрана, образованная внеклеточным веществом. Нам не удалось обнаружить существенной разницы в субмикроскропической органихации бактерий разных штаммов.

Морфометрический анализ показал, что в зонах консолидации у более проксимально расположенных зонах диаметр бактерий увеличивается. Оказалось, что у нероящихся штаммов протея средний диаметр бактерий и выраженность их полиморфизма меньше, чем у роящихся. Кроме того, независимо от участка колонии более поверхностно располагаются бактерии с большим диаметром, чем клетки в более глубоких слоях, что, по-видимому, обусловлено повшенной степенью полиморфизма клеток к этих слоях.

выводы

1. При культивировании роящихся штампов протея в микрокамере на плотной питательной среде, обогащенной кислородом, процессы перехода от одного этапа роста микроколонии к другому ускоряются.

2. Образований микроколоний нероящишся штаммами протея отличается меньшей длительностью периода адаптации и более быстрым началом деления клеток. При этом не отмечается значительных изменений показателя удельной поверхности. Клетки отличаются меньшим полимирфизмом.

3. В толще макроколонии протея имеется выраженная зональность в распределении форм бактерий. Ближе к поверхности локализуется наиболее'гетероморфная совокупность бактерий.

4. Частота и интенсивность ввдоления "субпопуляции" имеет выраженную спорадичность и зависит от времени суток. Длительность циклов выделения подобных структур составляет около 5 суток.

Проявлением полиморфизма и готзроморфности популяции роящихся штаммов Йротея служат атипичные колонии ( двойные и удлиненные).

5. Дифференциальные признаки, отличающие "субпопуляцию" от. основной колонии включают большую скорость роста в придонных слоях плотной питательной среды, большую полиморфноеть бактерий и способность к формированию своеобразных "канатов" в области роящегося края, увеличенную способность к закислению среды, отсутствию реакции с солями тетразолиев, которая не зависит от жизнеспособности бактерий. Дифференциальные признаки исчезают через 18 часов после формирования субпопуляции.

• • б. Динамика образования субпопуляции и динамика выделения протея в клинических условиях имеют сходный характер, что позволяет рассматривать эти процессы как взаимодополняющие и однородно де термини ротайные.

7. Лри сравнении динамики выделения протея в различных отделениях клиники обнаружено, что в 11% случаев наблюдается совпадение по времени усиления активности протея.

8. "роцесс роения бактерий рода протея имеет общие свойства с автоволновыми колебаниями: наличие сплошного движущегося слоя, переходного процесса, повышение скорости движения с увеличением диффузии, наличие зоны невозбудимости, образование ревербератора.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Палкин А..Л. О способности бактерий рода Z-'1"^"-^ к образованию спиральных макроколоний //Тезисы докладов конференции молодых научных работников ИГМ1 им.А.С.Бубнова, Иваново, 2 апреля,I9Q4 г.-с.17-18.

2. Палкин А.Л.. Кольцевые и спиральные структуры в развитии популяции протея на плотных питательных средах //Всесоюзное совещание цитология микроорганизмов: Тесизы докладов АН СССР Научный, центр биологических исследований.-.(ушино, 1984.-с.40-50. 1

3. Палкин АЛ. Особенности формирования шкроколоний протея //Физико-химические исследования патогенных энтеробактерий в процессе культивирования: Сборник научных трудов-Иваноао, 1985.-с.84-87'.

4. Палкин А.Л. О возможности влияния геомагнитных полей на

структуру популяции бактерий рода //Тезисы докладов

научной конференции молодых ученых ИГШ им.А.С.Бубнова 8-7 мая 1985.

Иваново,I9ö5.-с.18-20. о

5. Палкин А.Л. Автоволновые процессы при форми овации макро-) колоний,роящихся форм бактерий рода^ //Тезисы докладов областной конференции молодых ученых ИГШ им.А.С.Бубнова 20 февраля 1986 г.-Иваново,I985.-с.53-58.

6. Палкин А.Л. Динамика изменения морфологической гетероген- . ности бактерий рор,аЛ*/ё<ч в процессе развития микроколонии //Ранняя диагностика клинических инфекций:Сб.научных трудов-г.Иваново, 1986.-с.54-57.

7. Палкин АД. Выживаемость микроорганизмов на таблетках из каолиновой глины в условиях внешней среды //Тезисы докладов областной конференции мродых ученых по общественно-политическим и научно-техническим проблемам 25-28 ноября 1.98бг.-г.Иваново,1986.-е.209.

8.'Панкин А.Л.,Кузнецова Л.В. Диагностика аысеваемости, видо-

- 23 -

вой состав, некоторые биологические особенности бактерий рода протея //Тезисы докладов 1-й съезд эпидемиологов, инфекционистов и гигиенистов Теркменистана.-Ашхабад,1936.-с.47.

9. Лалчин А.Л. Периодически возникающие клеточные изменения //Всесоюзное совещание молодьгь ученых,Сб.тезисов

(

докладов.-Тбилиси,1987.-е.974-975.

10. Панкин А.Л. Особенности строения и клеточного состава роящегося края субпопуляции Рг. /иг'г*/,'^ //Тезисы докладов научной конференции молодых ученых ИГШ им.А.С.Бубнова 21 октября 1987 г.Иваново, 1987.-с. 18-19.

11. Палкин А.Л. Редко встречающиеся формы ткроколоний бактерий рода /«г ^".¿//Всесоюзная конференция "Актуальные вопросы клинической микробиологии в неинфекционной клинике: Сб.тезисов докладов.-Барнаул,1987.-с.47.

12. Палкин А.Л. Структура клеток роящегося штамма,

СП-Ю //Ш-я областная конференция молодых ученых и специалистов по актуальным общественно- политическим и научно-техническим проблемам 22-23 апреля 1988 .¡Тезисы докладов - Иваново,1988.-с.55.

13. Смирнов С.Г., Палкин А.Л, Биологическая ивдикация неиденти-фицированных процессов //Всесоюзная школа-семинар. Непериодические быстро протекающие явления в окружающей среде //Тезисы докладов -Томск,1988.-с.45-50.

14. Палкин А.Л., Земскова Ы.Н. Характер взаимосвязи между активностью протея в условиях клиники и изменением формы маркоколоний' индикаторного штамма Л. СП-Ю //ВНШИ,Д-5785 В-88Д988 г.'

15. Палкин А.Д., Кузнецова Л.В. Высеваемость протея в различных отделениях областной клинической больницы г.Иваново. Д-1409 В-89, 1989.

16. Смирнов С.Г.,Палкин А.Л. Биологическая ивдикация неидентифи-цированных процессов. В1ШИ1И № 7141-В 89, 1989 г.

- ги -

(икм) ф

8 7

6 5

4

3 2 I

(мы)

I

О 8 7

б

5 ' 4 3

3 4

* (мин)

СмкьО 9

8

7

Ь 5

4

3 2 I

2 3 В

(мин1

2 3 В

й (мин)

.Рис.1 Динамика изменения длины'клеток / / тз процессе развития никроколони".Графики.постпоеш на основе статистических данных. А-начальныэ этапы развития колони" (без применения Ъ^Л.тиббз СП-10.) В-все чтапм развитир микроколонии (с применением С1Ы0..)

В-все этапы развитие микро колонии [с применением лни/Ли 5?£ )

- 25* - ■

I

&

4 3 2 Т

8/,

3 2

I

3 2

Рис. 2 Динамика изменения отношения плсцади клеток к их объему в процессе развития колонии.Гистограмм« .построенные на основе статистических данных.

А-началыме ятапы развития колонии (*>ез применена О^.мпщ///'^ СП-10) Б-рге чтапи развития миюоколонии (л применением й^^.Г-чгл¿Л СП-10) В-всв этапы развития микроколонии (с применением О^./п'мЛ^ 12. ^

Б