Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимические и культуральные особенности условно-патогенных энтеробактерий и псевдомонад как основа совершенствования их идентификации

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биохимические и культуральные особенности условно-патогенных энтеробактерий и псевдомонад как основа совершенствования их идентификации"

он

' 1 I1 ^ '1

МИНИСТЕРСТВО ОБОРОНЫ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВОЕННОЙ МЕДИЦИНЫ

На правах рукописи

СИВОЛОДСКИЙ Евгений Петрович

БИОХИМИЧЕСКИЕ И КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ ЭНТЕРОБАКТЕРИИ И ПСЕВДОМОНАД КАК ОСНОВА СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ИХ ИДЕНТИФИКАЦИИ

03.00.07 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1994

Работа выполнена в Военно-медицинской академии.

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАЕН доктор медицинских наук профессор В. В. Тец,

доктор медицинских наук доцент С. И. Дьяков, доктор медицинских наук профессор Г. Е. Афиногенов.

Ведущее учреждение — Санкт-Петербургский государственный санитарно-гигиенический медицинский институт.

Защита диссертации состоится 17 марта 1994 года в 13 часов на заседании специализированного совета Д 106.05.01 в Научно-исследовательском институте военной медицины МО РФ (195043, Санкт-Петербург, ул. Лесопарковая, 4).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан

1994 года.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук профессор

Р. Б. Гольдин <

общая хлрлшриотакл работы

-'ктуадьность исследования. Условно-патогенные зптороботге-рии и псевпомоиапы способны внзнвать широко распространенные заболевания люпей, животных я растений / Беляков В,Д. и пр., 1990; Литвин В.О., 1992/. В мепицинском аспекте они имеют наибольшую значимость как вепушие воэбупители госпитальных инфекций ! Пфаев Р.Х., Зуева. Л.П,, 1989; ш-еппог D.J. , 1992/. По обобщенным ванным госпитальные инфекции возникают у 4,5-16% госпитализированных больных и при различных нозологических формах почт летальность от 3,5 по &3% ) Воробьёв А.А. и пр., 1999/. Более половины клинических изолятов энтеробактерий и нсввпсиокап при госпитальных инфекциях составляет "проблемные" випы: ЕясЬч-ricliia coli, Klabsinlla pnouroouifie pubsp.pneumoniae, i'rotou3 nlrabllio, Pseudomorma anruginnaa / Уагтчг J.J. et al., 1915; Br«nuer D.J., 1992 . Почти вся остальная честь изолятов приставлена небольшой группой (22 випа) энтеробактериП и пссвлсмо-ная; прочие многочисленные пилы составляют около 1% / В<-тс;*г и. al„, -190т, гатачг J ,.Т. et al., 1985/.

Микробиологическая пиагностика госпитальных инфакций и npv-гих заболеваний, вызываемых энтеробагстернями и псевво.чснаггами, основана на культуральном метопе, важнейшим этапом которого является биохимическая ипентификадая выделенных культур. В нншеИ стране еще довольно широко применяется пробирочнпй метоп биохимической идентификации, регламентированный официальными инструкциями. Метоп плителен, трупоёмок и порог. На смену ему пришла микрообъемная технология, которая ужо многие гопы используется за рубежом посредством разнообразных коммерческих тест-систем биохимической ипентификат^и бактерий и автоматизированных микробиологических систем. Отечественное коммерчег.кие тесг-снстечы биохимической идентификации энтеробактериП появились лишь непав-но (ПБДЭ, UMT EI и Е2, М1С-ЮЕ). Однако, нет отечественной системы ускоренной биохимической идентификации энтеробактери}; и автоматизированных микробиологических систем. Недостатком коммерческих тест-систем является высокая стоимость, крат (овремтпк !1 срок годности (I гея) и низкая точность некоторых Из них. Дня ускоренной идентификации "проблемных" видов бактерий ( з.соИ,

Hlabaiella арр. , P. aeruginoaa ) разрЕооТзда уЬанообразниа свлектишю-пифференциалыше питательные среды одноэтшшога выделения и первичной идентификации /*Brovn V.I.et' а2. ,196b; Hf,d-berfc h. , 19Ш; Киселёва Ы.Н. и пр., 1976; Мороз А.Ш. и пр., 1976; Гаэимуратова Л.Д. и пр., 19ТВ; Bagley S.T. et al. ,l9?d; Кшьд n. et аа,,1У?Э; Калина Г.Л., 19иО;тгауеЬа R.Vi.et a]J984; Campbell U.B.at и.Х. , I9bb7. Наиболее важный обшим нецостат-ком i:x является неполная специфичность, Для существенного ускорения, упрощения и повышения точности биохимической идентификации энтеробактерий и псевпомонад необходим научный поиск принципиально новых специфических свойств этих бактерий.

Потребность в отом поиске актуальна также пля систематики псэииомонап и энтеробактерий. Систематика бактерий рола pseudo-шсааа и семейства ЕаЪегоЪасЬе^асеае нахопится па перехопном этапе и подвергается интенсивному пересмотру. Переход к построению естественной классификации, основанной на критериях гено-систаиатики, выявил несоответствие фенотипической систематики многих -вппов панним гетюистематики и отсутствие опорных специфических признаков, коррелируюшихся с генетическими критериям!. Только за несколько последних лет из состава рола РааиЛошопав исключены виды третьей и пятой групп рРНК-гомологии /jfalloro-ni. H.J. > Тенпем^я к сокращению состава рола ^seudo-

гаопав продолжается. Противоположная тенденция наблюпается в систематике энтеробактерий. За послеание 0 лет состав семейства увеличился на 9 родов и десятки видов /Weaner D.J. , 1992Д Систематическое положение некоторых вппов, например t'.iobsioila mobilis i остаётся дискуссионным Уогакоу I., 1984; Grisiout I', efc al. • Ю92/. Ввиду отсутствия специфических признаков, нлк дифференциа^и випов энтеробактерий и псевпомонад используется около 50 таксономических признаков, что услокняет их ипентифн» качни JBrermar D.J. , 1984; paiioi-oni N.J. , 19847. Поис« специфических или уникальных свойств энтеробактерий и псевпсн.о-над, коррелируюшихся с критериями го нос и с тематики, иь.еет валиой научное значение для совершенствования систематики этой группы СакгериЙ.

Таким образом, тема исслепования имеет два аспекта, таксономический и клиника-микробиологический, относящихся к решению

актуальных проблем совершенствования систематики бактерий ро-па Гоеийоиопаа и семейства Еи^огоЬаоЪвз^исв*« » а также совершенствования микробиологической пиагностики госпитальных инфекций и других заболеваний, вызываемых условно-патогенными эн-теробектернями и псевдомонапамн.

Исследование выполнялось в рамках отраслевой программ С-23 "Разработать и внедрить в практику здравоохранения элективные мери бор'-бы и профилактики внутрибольничных инфокфй и сепсиса".

Цель и задачи исследования. Цепь исслеиования состояла п Выявлении таксономическл значимых биохимических и культуральичх особенностей условно-патогенных знтеробакторнй и псевломоняд,' разработке на их основе новых таксономических маркеров и тестов, а также срет^в и способов исследсваний, существенно сосершен-ст^юших идентификации этих бактмрий, в том числе Розбупптедей ГОСПИТВЛЫШХ ИНфеКЦН!..

Для достижения указанной цэли были поставлены следуют«« задачи:

I. Провести поиск специфических свойств условно-латогвщшх энтеробактерий и псевдом1 ""л путём скрининга химических соединений на специфичность хрпмогенных ревнуй и избирательность бактерпостатичеекого действия.

Научно обосновать таксономическую значимость выявленных специфических свойств знтеробактерий и псевиомонап,

3. Изучить биохимические механизмы выявленных таксономи-чески значимых свойств энтеробактерий и псевдомсиаи.

4. Разработать новые таксономические тэ'.'ты для систематики онтерсбектерпй и псевдомонап.

5. Разработать на основе выявленных специфических свойств энтеробактерий и псевдомонап солективно-лифференццальние питательное с репы пля овнозтопного выявления и ияэнтифда^«: "проблемна*" поз^уииталуЛ госп::гальчих инфекций и -роооть их в практике клинико-бшаериологических лабораторий.

6. Выявить и изучить особенности биохимических и культу-ральт-х свойств условио-пвтогенпнх энтеробактерий и ппавпоно-нвв в условиях мшсрообъвмного потопа.

<2 5а >■„

7. Разработать на основе шкр о объемной технологии тести ускоренной биохимической идентификации псевпомонап и систему ускоренной биохимической идентификации энтерооактерий.

Научная новизна и значимость работы. В результате исследований открыты специфические и уникальные свойства псевпомонап и зьтеробмстерий, коррелируюшиесн с ванными х'енисистемати-кч, и научно обоснована их таксономическая значимость.

Впервые обнаружено уникальное свойство псевдомонад первой группы рРНК-гомологии - избирательная чувствительность к бик-териостатическоиу действию ионов бария. Установлено, что этот признак является единствишыи таксономический маркером всех видов исевпомснап первой группы рШК-гомологии (аутентичной роду Peoudonionuc ) и полностью согласуется с изменениями в классификации псевдоионав. Признак имеет высокую научную значимость пли построения естественной классификации исевпомонар.

Бпервие обнаружено уникальное свойство бактерий рода ,..1аъ-iiiella - хромог&нная реакция с 5-аминосалициловоЙ кислотой в питательной среде. Это свойство имеют все виды и подвиды, кроме К. i.'lanfioola и К. terri^ana . Наличие его у К. mobilia , таксономическое положение которого является спорным, подтверждает принадлежность этого вида к роду Kiobeiolla . Признак является единственным таксономическим маркером клебсиелл, что определяет его научную значимость для систематики.

Впервые выявлено специфическое свойство бактерий Uafnia. alvo i - хромогенная реакция с комплексом 5-нптро43-оксихпнолин+ + ионы í' установлена его таксономическая значимость как

маркера бактерий 11. aivei . Признак представляет научный интерес для систематики как единственный биохимический таксонош-чаский маркер H.alvei.

Открыт биохимический механизм хромогенной реакции клебсиелл с 5-ЛСК, выявлен и предварительно идентифицирован неизвестный ранее фермент, осуществляющий реакцию: 5-аминосалицилат-некарбоксилаза из класса ли аз (5-аминосалицилат-карбокси-лиа-ва).

Впервые установлена избирательная резистентность бактерий P.aoruginoea и P.putida к антимикробному действию лекарственного препарата "окпафенамид" (пара-оксифенилсолицилашд) ,что

определило возможность разработки селективной срепч для выделения и идентификации этих бактерий.

Выявлены особенности биохимических и культуральных свойств псевпомонвд и энтеробактерий в условиях шкрообьемного метопа, позволившие впервые разработать пероксидвояороп( ый метоп ускоренного определения окислительного метаболизма углеводов у этих бактерий.

Указанные результаты исследований имеют существенную научную значимость для совершенствования систематики псевпомснад и энтеробактернй и являются основой для разработки новых средств и способов идентификации этих бактерий.

Практическая ценность работы. На основе выявленных особенностей биохимических и культуральных свойств энтеробактернй и псевдомопад разработаны новые средств» и способы их идентификации

1. Таясономнчэсуие тесты идентификации; псевдомонал первой группы рИ Iii-гомологи и (по маркеру барийчувствитолыюстк,, бактерий Klebsiolia app. (по маркеру хромогенной реакции с 5-АСК); бактерий H.alvei,.. (по маркеру хромогенной реакции с комплексом 54ЮК + ионы г eJ+).

2. Селективно-дифференциальные питательные сродм пля оино-этапного выделения и сопряженной идентификации "проблемных" видов энтеробактернй и псевдомонал, отличающиеся высокой специфичностью: среда "Клебсиелла 5-ЛСК" (для Klebsiella о.р.р, )« СР°-па "Псевпомонас ЛШ" (пля Р.аегиеДпова » P.putlda )» средя "Протей ILM" Салд группы Proteus, Prori loncia, fiorganolla среда "Протей llil" (для группы Proteus, Prov3.1encia ).

3. Пероксипвсяоропный микрообъемный метод UF-теста с глюкозой, обеспечивающий экспрессное (I ч) определение окисления и ферментации глюкозы громотрицательныш бактериями.

4. .Микрообьемнна тесты определения окисления углевозов (перо'.сс.ипвовороаннм метопом) и нитратрэпуктазы, пригодные для ускоренной (4-5 ч) идентификации псевпомонал и других пе^ормян-тируяшчх бРНтериЛ.

С. Первая отечественная система ускоренной (5 ч) биохимической идентификации энтеробактернй на основе мпнро£>бьемного метода с жвдкиш средами в ш; нипэтах, отливающиеся доступностью и

- б -

невысокой стоимостью исследований.

• Указании» средства и способы позволяют .ускорить, упростись и поьисить точносл, исследований, что существенно совершенствует идентифшацио условно-патогенных знгиробактерий и псевиомонаи. Эти средства и способы могут использоваться для идентификации бактерий при таксономических исследованиях в области систематики, а также при микробиологичаской диагностике госпитальных инфекциИ и пругих заболеваний, вызываемых условно-патогашими энтеробактерпями и псевдомонацами.

Реализация результатов исслепования. Но представленным результатам исследований получены 6 авторских свидетельств СССР на изобретения; "Способ идентификации бактерий Hofaia alvoi " (Ii II5U577), 'Сродство для селективного повавления роста бактерий poua PeeudowonoE; " (U1 1296577), 'Способ идентификации бактерий рода Klebsiella " ( № I3I3874), 'Способ выделения бактерий семейства Entexobacteriaceaa " ( № I3Ü666Ü), "Питательная среда пля выделения и идентификации бактерий ^¡jauiomoaaü ыеуи-ьяиоаа " ( № 1414671), 'Способ определения окисления и ферментации глюкозы грамотрицательними микроорганизмами" ( № I5IÜ374).

Разработанные нами тести идентификации используются в научно-исследовательской работе для таксономических исследований псевиомонад, клебсиелл, гафний в I11CK им Л .А.Тарасовича (Москва), Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии (Санкт-Летербург), Волгоградской научно-исследовательском противочумном институте, Институте микробиологии и вирусологии им.Д .К.Засолотного АН Украины (Киев), Научно-исслеиовательском институте детских ин^ек^Й МЗ РФ (Санкт-Явтербург). Селективно-лифферонциальные питательные среди для выделения и идентификации "проблемных" бактерий "Псавво-монас АПС", "Клебсиолла 5-/СЦ", "Протей ШШ" и система ускоренной биохимической идентификации энтеробактерий примаияптся в Государственном научном центре пульмонологии МЗ РФ, центральной клинико-диагностической лаборатории ВМецЛ , межрайонной клинико-диагностической лаборатории № Р. (Санкт-Петербург), бактериологических лабораториях Cüü Санкт-Петербурга. Система ускоренной биохимической идентификации ог.т'зробьктерий включена в мето-дичеснио указания ЦВМУ МО СССР ."Диагностика, лечение и профиле.:-

'(ит пизентерйи и других острых кишечных диарейных инфекций в Советской Армии и Военно-Морском Флоте" (М., 1991) и применяется во всех бактериологических лабораториях медицинских частей и учреждений Вооруженных Сил РФ. Эта система применяется также в бактериологических лабораториях гражданского зправоох-ранения.в соответствии с методическими рекомендациями МЗ FC5CP "Диагностика, прогнозирование течения и лечение острых кишечных инфекций условно-патогенной и смешанной этиологии" ( Л.," 1990).

Теоретические положения, новые средства и способы идентификации бактерий, представленные в диссертации, используются в Учебном процессе на кафедрах микробиологии Военно-мепицинской академии, Санкт-Петербургского санитарно-гигиенического медицинского института и Санкт-Петербургского педиатрического медицинского института.

Апробация работу. Материалы диссертации доложены на симпозиуме 'Современная госпитальная инфекция" ( Ленинград, 1980 ), 1-й Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы нозокомиальных инфекций и лекерственной устойчивости микроорганизмов" ( Минск, Í966), заседаниях Ленинграпского отделения Всероссийского научного обшества эпидемиологов и микробиологов (1987, 1968), Всесоюзной конференции "Лимитирование и ингибирование роста, микроорганизмов" (Пущине, 1909), юбилейной научно-лрактической конференции, посвяшенной 70-летип Института имени Пастера (Сенктг Петербург, 1993).

Основные результаты диссертации отражены в 27 опубликованиях работах, в том числе 15 статьях в центральных журналах и б Изобретениях.

Основные положения, выносимые на п?дмтуг

I. Избирательная чувствительность к бактериостатическому ЙвЙствию ионов бария - уникальное свойство и таксономический Маркер псевяомонад первой группы рРНК-гомологии (аутентичной ро-Peaudotaonao ) .

" 2. Хромогенная реакция с 5-аминосалиц>1.'"ЗОЙ кислотой в 'гагел! юП среде - уникальное свойство и таксономический маркер

*№.ктерий Klobsiella ару.

3. Хромогеннап роокци;. с комплексом 5-нитро-й-оксихинолин+

fcl

- В -

+ пони - специфическое свойство и таксономический маркер бактерий Hafnia alvei.

4, /ромогеннвя реакция клебсиелл с 5-АСК происходит в иве стадии. На первой стадии, протекавшей в аэробных и анаэробных условиях, клебсиеллы декарбоксилируют 5-АСК с образованием ьО^ и пара-аминофанола, который является бесцветным промежуточным продуктом. На второй стадии, протекадщей только в аэробных условиях без участия бактерий, пара-аминофенол окисляется киело-родоы воздуха в полимеры темно-коричневого цвета. Выявлен и предварительно ивентифи^рован неизвестный ранее фермент, осуществляющий реакцию: 5~еуиносалицилатдекарбоксилааа из класса лиаэ, имевший клеточную локализацию.

5, Селективно-пифференциалыше питательные среды для одно-этапного выделения и идентификации "проблемных" бактерий ( Klebsiella epp. , P. aeruginosa И Р» vutida » Группы Proteus »Providencia »Morganella ^• отличающиеся высокой специфичностью.

6, Ми кр о объемные перокскпвоаоросный метод of -теста с глюкозой и система ускоренной биохимической идентификации энтеробактерий, позволяющие существенно ускорить идентификацию бактерий.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 353 страницах машинописного текста, включая 53 таблицы и 25 рисунков; состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов. Список литературы включает 118 отечественных и 223 иностранных источников.

ШВДШЫ И МЕТОД!

В работе использовали 2146 штаммов бактерий 72 видов 26 родов, щ том числе типовые штаммы 23 видов. Музейные культуры поступали из V научных учреждений. Клинические штаммы получали Из центральной юшнико-бактериологичаской лаборатории Военно-мбви1Щцской академии и межрайонной клинико-бактериологической лаборатории № 2 г.Санкт-Петербурга. Все штаммы подвергали кон. тральной идентификации.

, Биохимические свойства энтеробактерий определяли микрообь-емным методом в планшетах ) Сиволодсяий Е.П., Луканоа H.A..

1984} и при необходимости макрообьемным метопом. Псевпомонавн и другие неферментируошив бактерии изучали по методическим рекомендациям МЗ РСвСР (1986) с дополнением ряда тестов ) Borgan т., 1981/. Прочие бактерии изучали унифицированными методами, изложенными в приказе МЗ СССР № 535 от 22.04.1985г. Ив9нтиф1кацнп бактерий осуществляли по руководствам " Sergej'a manual of bjb-tematic bacteriology" (198'0 u " The Procaryotes " ( 1992

Для культивирования бактерий и питательной основы всех разрабатываемых селективно-дифференциальных питательных сред применяли сухой питательный агар из рыбного гидролиэпта производства НПО "Питательные среды" '(г.Махачкала). Для минимальных солевых сред использовали агар-агар " вегта " и "Difco И сравнительных испытаниях применяли среди с цетримидом ( "pjocyanoael " ффмъг "aio-Merieux Франция) и иргазаном ( "ряеисЮтопээ . isolation agar " фирмы "i)ifco Laboratories ' "» США).

Скрининг химических соединений на избирательность бактерио-статического действия и хромогенных peaKipifl пропор ■■•и моголом серийных разведений химических соединений в питательном агаре. Для скрининга использовали коллекцию из 30 видов бактерий, включающую преимущественно типовые штаммы. Исследуемые бульонные нуль-туры засевали радиальным штрихом (посевная поза 1Л0 КОЕ), выращивали при 36 — в течение 18-24 ч. Химические соединения с выявленным неизвестным ранее избирательным бактериостатическим действием или неизвестными хромогенными реакциями подвергали углубленному ил.ученип, используя представленные группы соответствующих видов бактерий (по 30-200 штаммов).

Тесты ускоренной (5 ч) ыикрообъемной биохимической «''тенти-фикацик энтеробактерий и псевдомонап применяли и изучали с использованием фосфатных буферных основ, основ лля сред с аминокислота«! , дифференциальных сред и реактивов по прописям и методике Сивололсксго E.H. и Луканова H.A. (1984, IG05). В работе использовали отечественные полистпроловые планшеты для иммунологических роакций однократного применения ( по 96 лунок объемом 0,25 га). Пригодность гакрообъемвых тестов для ускоренной идгн-тифнкыфи по длительности ферментами субстратов изучали на труп иах бактерий разных видов заведомо положительных по данному тесту (20-40 штаммов) путем ;чета результатов через I» 4, 5, IB,

- 10 -

24 ч. Достоверность микрообъемных тестов определяли путем одновременного параллельного изучения каждой культуры микрообъемным (5 ч) и пробирочным методом (18-24 ч) на группах бактерий каждого вида от 2 до 40 штаммов.

Разработанные селективно-пиффзренциальные питательные среди изучили и оценивали по биологическим показателям руководствуясь методическими рекомендациями Ü3 СССР (1980). Определяли следующие показатели: специфичность, чувствительность (ростовая), ингибиторность, скорость роста бактерий, воспроизводимость / Дополнительно изучали частоту выраженности дифференцирующих свойств среды у бактерий в процентах к числу изученные еггаымое данного вида, Чувствительность среды определяли дополнительно по минимальному количеству КОЕ бактерий, обеспечивающих появление роста колоний на среде.

Апроба^т разработанных селективно-дифференциальных питательных сред "Клебспелла 5-АСК", "Псевдомонаа АПС", "Протей. ГШ',' "Протей ПЛ" проводили в межрайонной клинико-диагностической лаборатории К1 2. Каждую пробу клинического материала засевали параллельно по унифицированной методике, используемой в текущей работе в соответствии с приказом МЗ СССР № 535 - 19Ь5 г., и на сектор изучаемой среды (1/4 чашки Петри). Посевы выращивали при 37°С 24 ч, после чего идентифицировали искомые бактерии непосредственно на испытуемой среде первичного посева. Посевы на • средах унифюлроваиного метода продолжали изучать в соответствии с данным методом. Контрольную идентификацию выделенных культур бактерий проводили ПО " lier^ey« в manual of üji/,tej.atic bacteriology " (1964). Качество испытуемых питательных сред оценивали по показателям: чувствительность (диагностическая), ингибиторность, выраженность дифференцирующих свойств, время ри-веления и идентификации бактерий на среде, специфичность,

Исследование генома клебсизлл методом полимеразной цепной реакции с универсальными праймерами проводили по методика Булат С,А. и лр. (I9Ü9, 1992). Препараты геномной ДНК бактерий (клеточные лиэаты) готовили методом щелочного лизиса по Маниа-тио Т. и пр. (19Б4). Полимеразнуя тдонуи реакцию (ПЦР) проро-яили по Saiki а.et al, (Ке2). 3 ПЦР йспользовали универсальные праЛмеры А-А/2 и 45, разработанные Булат С.А. и пр. (1992),

Гель-электрофорез ДНК пля пслученпг. паттернов гмплИ'|«циповгш-ных в 11ЦР фрагмент он ДНК провопили в агярознпм (1,7%) и пачиач-рилвмиином гелях, которые затем окрашивали бромистым

отиинем и фотографировали в ультрафиолетовом свете. Гибрллнзя-циошшй анализ гшплифишрованной ДНК пля изучении гомологии ПНР-паттернов разных штаммов, получениях с опнич прпйчером, провопили в процедура перекрёстной бл от-гибридизации по Соузер-ну (Маниотис Т. и пр., 19'34). В качестве гибриштвцишшого з'оч-па использовали '^^Р-меченый амплиф'Нкат из всего ПЦР-паттерна. 1,сслеповтше выполнено старшим научмнм со'групникоч Петербургского института ядерной физики им.Б.И.Константинова Г/И! кашм»--патом биологических наук К .Л .Булатом и мяаппии научным сотрудником ВМепЛ ¡1 .В.Михайловым при участии автора.

Стабильность генетических детерминант кой хромо-

генной реакции кяебспелл с 5-смнносалициловой г'слотой (ij-AC.lt) издали метопом инпучировечнсй элиминации штезмип агрицинормч оранкеиш по ШгоЬэ. у. (Т9СО).

Морфологию псовпсмоноп на поверхности питательных ерэл изучали метопо:д скаииругаей электронной микроскопии / Шаяк -.г., 1974./, используя скэнпругаий олектронннй мигроскоп -'"'и - ,'/> о (Япония). Особенности строения псеввомонап п присутствии ионоз берия в питательных средах исслг-попалп метопом по-ч-п-ивного окрешиввшш / Вгоппвг гз., Нота й., 1959/. Паепарат» просматривали при увеличен"«; ¡5000-30000 в просвечивашрм злек-тронном шифсекопе <Ш1 100 С (Япония). Элакгропно-микроскт-пичоскио исследования выполнены в Научно-исслеповатгльс ком институте особо чистых биопрепаратов канпнпаточ биологически*-наук 0,ПЛ-ыбвльченко.

Л*!Ч спрэиеленчя ориентировочной масок веществ, учвптпуг» -ших з микробной трансформации 5-АСК в питательной срече "Клеб-сиелла П-АСК", использовали диализное пленки с известными показателями задержки частиц: а-Ч.чЗ/пхч очс*» Са^п с запер*ко¡1 частиц -"чшее 12000 зчльтон и ьап-

7.оу1г-ав'1 с яаперпчсой частиц более 1200 пвльтон.

''пентификяшп химических соединений, оопиикавдих при уран -^Ьак /г.>£

сформьции 5-AGK и других субстратов кдебсиеллами, проводили по уль;граДмолетовш спектрам поглошения в области 400-250 ни на свухлучевом спектрофотометре Acta МУИ ( Be ci™ ал , США). Продукты реак^и идентифицировали по показателям смешения максимума Уй-спектра поглощений I Гордон А. и др., 197ô; Бренд Д. и др., 1967 ). Спектрофотометрические исследования проведены сотрулникаш Научно-исследовательского института особо чистых биопрепаратов Н.В.Ровновым и кандидатом химических наук Л,Н, Пзтрсвым.

Молекулярную массу конечного темно-коричневого продухста. цветной реакции клебсиелх с 5-AGK определяли методом жидкостной колоночной хроматографии среднего давления на жидкостной хроматограф! чес кой системе фирмы " ррьз - Pharmacia " (Швеция), Хроматогр£ф1ческое исследование выполнено кандидатом биологических наук В.Г.Антоновым.

Для результатов исследований вычисляли средние или относительные производные показатели и их средние ошибки. Статистическая достоверность различий результатов определялась критерием t Стыодента. Нуле вал гипотеза отвсрг'&л&оь при уровнях ввт роятности Р 0,05, При статистической обработке использовали руководства ) АшмарияИ.П. и др., 1962; Каминский Л,С., 1964/,

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛВДОВАШЙ И И'Х ОБСЗДШЕ

I, Скрининг химических соединений по специфичности хромо'генных реакций и избирательности бактерио-статичоского действия на знтеробактерии и псевдо-моналы

Методом скрининга изучены 275 химических соединений, в том числе 60 неорганических и 215 органических веществ. Органические соединения содержали 105 коммерческих препаратов (лекарственных веществ, не имеющих антимикробного предназначения; ароматических соединений, ПАВ, красителей) и 110 вешеств экспе-. риментаяьиого химического синтеза. Большинство изученных соединений не обладали избирательным дойстшем. Неожиданно выяв-i лена неизвестная ранее избирательная чувствительность псевдо-■ ыопал к хлоридам и нитратам бария. Для уточнения спсктра изби-'

- iar -

рательности этих препаратов пополнительно изучена чувствительность к хлоридам и нитратам металлов псевдомонад gcex групп рРНК-гомслогии. Установлено, что только ионы Ва избирательно подавляют рост всех штаммов всех видов псевдомоноа первой группы рРНК-гомологли (ШК - 0,25-2 г/л). К ионам бария высоко устойчивы бактерии всех прочих випов (ШК - 1650 г/л). Иены прочих 24 изученных металлов в составе хлоридов

действием на псеваомонады. Обнаружение специфической чувствительности псевдомонэл первой группы рШК-гомологим к ионам бария представляет большой научный интерес, так как ранее эта группа бактерий не имела специфичэского фенотипичеокогс маркера.

Выявлена неизвестная ранее антимикробная активность отечественных лекарственных препаратов оксафэнамид (пара-с 'сифо-йилсалициламип) и фенасал (5,2-дкхлор-4-нитросэлицплонилил). Сксафенаиип избирательно подавляет рост всех видов бактерий, кроме Р. вегицхпоэа и Р.р^хба • Фен ас; ал на угнетазт роста энтеробактериЙ и избирательно подавляет рост грамположительной микрофлоры с необычайно высокой активностью (0,0002 г/л), <гго Превышает активность бриллиантового зелёного, генциан фиолетового и сульфонала. Впервые выявлены химические соединения, лившиеся субстратом неизвестных ранее специфических хромоген-нах реакп^й онтеробактерий. Бактерии рода кхвЪо1в11а даят специфическую цветню реакцию в питательной среде с 5~ашнсеа~ .Ыциловой кислотой (темно-коричневая окраска среди вокруг газона бактерий). Бактерии На Хш.а а1у<поирззутот в питательной среде спзцифячесяу-о сранжево--нрасиув окраску при взаимодействии с комплексом препарата 5-Н01С и хлорида трёхвалентного железа. Ранее специфические хромогеннаэ реакции у клебсиелл и гафлий не были известны.

2. Изучение таксономической значимости признака бариЯчуествительности псевдомонал и механизма избирательного бакте эдост&тическсго действия, ионов бария

И| Iii , Со +t Си'

, i't ) и нитратов

н*

«

Тикеононическу» значимость признака быриНчувствитолиюсти изучил на ш'гш.ишк IcJ пнпои псевоомонап, .шслячая типовые i;irai.mii 12 ьньоь, и 260 штаммах бактерий прочих 56 випов 27 ponen (тябл.). IlceoaúMOiiaou випов Р. и.alie i. i; Р*г.еиаилиШ1 испытаны к хлорину бария в йолгогравском ШШШ доктором меси--Минских наук Ü.il .Плихшшм. Установлено, что ионы о'ария оказиаи-ui избирательное бактериостатичаское действие на все шшмки псех ышов поеипомонап первой группы рРНК-гомологин:_ШК-0,25-2 г/л (табл.). Дли штаммов Р. леху^пое» и Р. subida хлорида бария и нитрата бария I г/л. Исевцомонады 2-5-41 групп рНПЕ-го;ю;шгл: реуистенп и к попом бария: i.íiK-IC-50 г/л. Избирательная чувствительность псевпомонад 1-й группы рРШС-гомо-лоиш )с нонам бария является не только специфической, но и ушпегльной, так как бактерии всех прочих Изученных 'об видов 27 родов устойчивы к растворимым солям бария: ШК - lt:.~64 г/л (табл.). Признак барийчувстпительности псевдомонад коррелн^ует-ся с генетическим критерием (гомологией рРПН) и поэтому пригоне» для построения естественной классификации псевпомонад. Это пока единственный таксономический маркер псевпомопап 1-Й группы рРНК-гомологии (аутентичной роду Pboudокопам )• Признак согласуется с изменениями в классификации псевдомонап (все исключенные виды являются борийрезпетентными) и представляет интерес для дальнейшего уточнения систематики псевпомонад. Таксономическая значимость признака барийчувствительности как маркера псевдомонап первой группы рРНК-гомологии подтверждена в последующих научных публикациях других авторов /Смирнов Ü.B. и др., 1990; Киприанова Е.А. и др., 1992/. Признак барийчувстви-тельности включен в ключ идентификации псевпомонад / Смирнов В .В. и др., 1590/.

С целью изучения механизма избирательного действия ионов бария проверено электронно-микроскопическое исследование морфологии клеток P.aerugiaoea АТСГ. 27353 при культивировании в присутствии хлорида бария (2 г/л). Выявлены характер»" .м*.■■• ш».« морфологии псевпомонад: бактерии pea ко увеличиваются в ширину И приобрети«!? ОВОЛЫ.'УВ форму вмзето исходной шлпндри-ческой; поп является размнекешке балш..>ства клеток; фазе деления не завершается формированием перетякки; имеются деструк-

Чув-^тсителы'есть к пони.» Сирия псевдомонал п б.'аиирий прутик B'ijo:i

Группs pFHH-

Знд бактерий

Число штам-

ШК, г/'л

гомологии мов BaG " 2«20 a.,(N^g

1 Р 4aeww,inor;a 160 0,25-2

t.jJUti'ifil 50 0,35-2

£ ьС1иогг!асэт 5 0,25-?.

¡с . ааг'з oi' ас iens з 0,5-"1 0,5-1

t

I 0.3

i".n»n':locina 1 ' o;5

■l'.otutiçri i 0,5-2 0,5-2

•1 1 'i

p.psouioRloaligeaas 5 0,5 0,5

,f »viridiilava О 0,5

п P.cspacîft 9 ' 16 1(Î

i' .mrtll^i S 0-16

P.pDc.i'ioanllsi 8 16 •

Ш ï „t'ffît"istoryni 1 16 16

F.aniJovornns 2 16-52 16-32

1У i' .diniriuta 1 У- 32 '

У r .in.TltOjjhilÎH. У> 16-50 16-50

_ Прочие вивы 260 16-64' 15-64-

(66 Ридов 27 poaofi)

тивныб повреждения (сжатие участков цитоплазмы о частичной отслойкой фтоплаяматичеекой мембраны, разрывы наружной Мембраны). Эта морфологические изменения подтверждают бактерисггатииейг.'оэ ( и баитврицияное действие ионов барий на псеппомонад«!

53O.K. ici

Имеются публикации / WilKinaan S.G. , 1У67/ о значительной избирательности бактерицидного действия этилсндпаминтетра-уксусной кислоты (ЭДТА) на псевдомонады и корреляции этого признака с повышенным содержанием фосфора в липополисахаридах их наружной мембраны. Предполагался подобный механизм действия ионов бария / Смирнов В.В. и др., 1990/. Поэтому ми изучили методом серийных разведений ЭДТА в питательном агаре чувствительность к нему 16 видов псевдомонад всех гр^/пп рРНК-гомоло-гип и 24 видов прочих бактерий. Установлено, что ШК ЭДТА 0,1~ С,5 г/л имеют б видов псевдомонад 1-й группы рГШС-гомологии (из II Изученных ВИДОВ ЭТОЙ ГР1Т1ПЫ), ВИДЫ 3-Й ГруППЫ Р. acidovo-rana ) и 4-й группы (P.diniiuita ), виды 5 прочих родов; ШК 1-2 г/'л имеют все остальные виды псевдомонап и виды 17 прочих родов бактерий; ШК более 2 г/л имеют 2 вида прочих бактерий. Эти результаты убедительно свидетельствуют, что ЭДТА не обла-пеет избирательным действием на псеЕдомонапч 1-й группы рРНК-гомспогии и не может быть таксономическим маркером псевдомонад. Различие в спектрах бактвриостатического действия ионов бария и ЭДТА указывает на разные механизмы их действия. В некоторых публикациях / Киприанова Е.А. и др., 1992/ предполагается, что механизм избирательного действия ионов бария на псевзомонады 1-й группы рРНК-гомологии состоит в замещении ионами бария ионов магния и кальция в наружной мембране клогок. Дл^+проьерки этой гипотезы мы изучили действие хлоридов Ca К+ на

баркйчувствительность псевдомонад P.aeru^iiioL-ü A'iCC I0I45, Р.aeruginosa А1СС 27853, Р. put id а АТСС 12633, Р. Stutzer! АТСС 17588 методом двухкратных разведений хлорида бария в питательном агаре (от I до 64 мм) в последовательных сочетаниях с одной из концентраций ряда эквимолярных концентраций (1-64 мМ) изучаемых солей. Установлено, что хлорид кадия не изменяет уровня барийчувствительности псевдомонад. Хлориды магния и кальция в эквимолярных хлориду бария концентрациях в диапазоне 2-16 мМ повышают устойчивость псевдомонад к хлорину бария в 4-8 раз, но максимальная устойчивость псевдомонад к ;сло-риду бария (16 мМ 4 г/л) весьма далека до преодоления промежуточной зоны ШК, отделяющей зоны ШК псевдомонад 1-й группы рРНК-гомологии -м -чт* гпчводяет считать

-р -

-^ттурентные отношения ионов бария с ионами магния и кальция отражением лишь одного из путей многоцелевого действия ионов бария на псевпомонады. Основная мишень, определяющая избирательность действия ионов бария на псевпомонады 1-й группы рРНК-гомология остаётся пока неизвестной.

Разработан таксономический тест идентификации псевдомонад 1-й группы рРНК-гомологии по маркеру барийчувствительности. Предварительно для выбора рабочей концентрации хлорида бария в питательном агаре определяют методом серийных разведений в этой же среде ШК хлориду бария для контрольного штамма Р. аегчц!-поиа (желательно А1СС 27853). Рабочая концентрация хлорида бария равна четырёхкратной ШК (г/л) для контрольного штамма. В последующем рабочую концентрацию хлорида бария определяют только при смене вида питательного агара. При постановке теста р • расплавленный с-ерилышй питательный агар внес я? навеску хлорида бария для получения рабочей концентрации, разливают среду р чашки Петри. Контрольной'средой является тот же'питательный агар без хлорида бариз. Исследуемую культуру бактерий засеваяг радиальным штрихом на сектор среды с хлоридом барин (опь;) и питательного агэра (контроль), инкубируют при 37°С, после чего учитывают результат: отсутствие роста бактерий на сроде с хлоридом бария при наличии роста на контрольной среде указывает на принадлежность бактерий к- псевдомонадам 1-й группы рРНК-гомоло-гии. Тест позволяет ускорить и упростить идентификацию псегдс-монад.

3. Изучение таксономической значимости и биохимического механизма хромогенной реакции бактерий К19аахвИа на питательной среде с

5-*мннзсэлпцздовай кислотой

Специфичность хромогенной реакции с 5-АСН исследовали на, 943 штямадх бактерий 72 видов 2с! родов, в тон числе БЬЗ птам-мах клебсиелл всех видоь. /ромогенную репкцию изучали на разработанной !:ем7. питательной среде "Клебснелла 5-АСК", которая содержит (г/л): сухой питательный агор 52-35; 1,-ррабинозу Ь-12;. 5-р.г.5>,нссилчциловуп кислоту 4,5-5,5; бромтимоловый синий

0,05-0,06; дистиллированную »оду I л} I н. раствор НаОЦ но .установления рК Для приготовления среди в колбу с ¿00

ш расплавленного питательного ггг.ра вносят I г 5-АСК, Z г X, .-ерабинолы} од 1,0% спиртового раствору бромтимолоаого синего, I н. рлауроркьОИ ро зелёной otqiac, разливают в чьи-ьи Лктри, Исследуемые егьроаие культуры беитерий рисовали в виде бляшек диаметром ^ мм на секторы среди в чешках, кнкубиро-вг.л" при 1П-24 ч, Положительным результатом очитили появление вокруг колоний бактерий подьшвияной зона темно-коричневой окраски питательной среди, Гецон Сшртсрий и среп" пол ьг.к такой окраски не имеют, Установлено, что хромогениую регамшо с o-j'tCK ноют вас виды клебеиелл, имеющие иваифпскуй знпчльост).; К ,jjnouJ'ioniwe иаЬор.^-пошнОцХио - ~ О?Wi, ,уц.ошюлаat*

t>uboi.,oaaeatt3 ~ 9*, 7 - i 1ч»ра««ооп1ав KubBA'.vhi.uoucleсо-jaatis - 10U/i; K,nubiliii - c/+,?< - t,,o*ytooa - 90,« -

KTtMMOB. КдйбСИеЛЛЫ ВИДОВ К, i'loiiticoXa и Ki ¡¡erpitupfi не дают хромогенной реакции, Все штаммы бактерий прочих видов и ропов не давали цветной реак'^ш иди не рсоди на среде. Следовательно, терсмог-бниая реакция р 5-АСК ярляетси не только специфической влч кдебеиелд, но и уницалРной ввиду отсутствия у всех прочих бактерий, Особое внимание обращает наличие этого свойства у бактерий вида К, одШ« , таксономическое положение которого является спорным. Этот факт доказывает природ-пшюсть вида К. мЬШе к роду иД&ЪцХеЗХа . Отсутствие хромогенной реакции у бактерий ВИДОВ K.terri^eaa и K.iAftn--tiaoXa , обитающих в почве к растениях, позволяет различать пае экологических группм клебоиедл. Следует особенно отметить,' что хрой'огашая реакций с 5-ACJi является пока единственным специфическим свойством адобскедл. с'тот таксономический маркер клебоиелд имеет существенную научную и прикладную значимость,

Механизм хремогерной реагсции клебоиелл с fi-ACJC изучали на мош!ф1Циромшио1| среде "Кнео'сиелла дЛСХ", содержа,дай дошмальт ний солевой apap с .'З-^СК без индикатора н Д-машшт »мест-" т ьрайииог-u. Испольаояеди ятаед Кч'кецыоахаб uubsv. ¡>ae>iw©-nia« ШХС . 9127, K.^nevunoaiae sub ар» иагэоие АТСС IJ2SHV, К» »ofciJis 'I0S, K.ox/toc.a I'43V;. Научение состава

среди показало? что 0-AGK не угдлиаирув'гся ь качества единственного источника углерода зля роста клебсиелд, но подвергается ими химической трансформации, дромогенная реакция происходит при выращивании клебсиег.л в аэробных условиях на поверхности ^ллофовоеой плтчш, покрывающей среду и пропускающей только частицы менее 1200 пальтсн, что истаючвег участие в реакции ркзоферм^птов. После 24 ч выращивания посева ю'еб-сиелл ив поверхности целлофановой плёнки на среде в анаэробных условиях не наблюдается цветной реакции сразу после извлечения чашек из анаэростата, однако, после снятия плёнки с газоном клэбсиелл и поглеяувибй экспозиции чашек со средой в аэробных условиях в течение 2-4 ч появляется интенсивная темно-коричневая окраски среди на участках соответствдоимх зоне поя газоном и вокруг него. Зто явление указывает на двухст&пкйность реакции. Бесцветный промежуточный продукт в аэробных условиях сохраняется пои газоном бактерий. Спактрофотометрип УФ-спе.к-тров поглощения образцов питательной среды ( исходной и бесцветного участка пол газоном бактерий) установила смешение максимума У$-спбйтра поглощения на 2В нм при трансформации- 5-AUK и с бесцветного промежуточного продукта, что указывает при сопоставлении декрементов заместителей бензольного кольца на исчезновение карбоксильного заместителя. Следовательно, клей-сизлли трансформируют 5-АСЖ путем декирбоксияировпния с образованием GOg и пара-амчнофонола, который является бесцветным промежуточным проаукто«. Исследование вместо 5-АСК близких по структуре производных бензола с карбоксильной группой натриевых солей 4~амьносалицидоэой атлеты, салициловой кислоты, ор-то-аминобензойной кислоты показали стабильность УФ-сгшктров поглощения этих субстратов, что поитверкпнет строгую субстре-v ■ ">«ш$ичнорть аекарбоксилирования 5-АСК клебсиеллаш и ферыентмтненую природу реакция. В соответствии с типом химической реакции предполагаемый фермент является 5~а ьяш осели ци-лвтпйкарбоксьлазоМ из класса лиап. Ьторая стадия хромогенной реакции, протекавшая без участия бактерий в аэробных условиях, обусловлена извосгним химическим свойством пара-акмнофенслй окисляться кислородом с образованием цштдоров тзмно-иори'шв» тюро цвета. Показатели смещения максимумов i'ü-cudKvoe. йогпопе-

>!ин оорадиов из зоны '¿емно-коричневой окраски срепы в сравнении с исходной средой выявили процесс полимеризации. Изме-реЕ!ие молекулярной мессы итого продукта выявило смесь соединений от 60000 цс 200000 зельтон.

Б итоге исследования впервые открыт биохимический механизм хроыогенной реакции клебсиелл с 5-АСК и гревварительно идентифицирован неиовестннГ, ранее фермент, который осуществляет эту реакцию. Рескция происходит в лве стадии. На первой стадии, протекающей в знробнкх и анаэробных условиях, клеб-

С -- Ш

Ч/

-а: _ со2

фермент клебсиелл

Н2К V

-Ш

воздуха

5-ЛСК

пара-Емпнофенол ( бесцветный )

Схема бпохимического механизма хромогенной реакция клебсиелл с 5-АСК

ПОЛИМЕР

конечный продукт ( темно-коричневый)

сиеллы пекарбоксилнрумт 5-АСК с образованием С0-, и иера-ашно-феноле, который является бесцветным промежуточным пропуктом. На второй стадии, протекающей только в аэробных условиях без участия бактерий, иоро-аминофенол окисляется кислородом во.э-вуха в г.олш.еры темно-коричневого цвети. Фактором, определяющим хромогеннуп реакцию с 5-АСК, является неизвестный ранее сгермч;!? 5-амкнос£злифлатвекарбоксилоэг« из класса лие.г. (5-ами-носолицилат-карбокск-ли&оа), нневаий у клебсиелл клеточную локализацию.

Исследование возможности индуцированной акридиновым оранжевым элиминации генетических детерминант хромогенной реакции с 5-АСК в популяциях клебсиелл не выявило их утраты, что исключает плазмидную прирезу этих детерминант. Сравнение ПЦР-пат-тзрыов ДНК, амилифицкрованной методом полимеразной цепной реакции с универсальными праймерами, из штаммов клебсиелл положительных по хромогенной реакции с 5-АСК и штаммов без хромо-генной реакции но выявило фрагментов ГДК коррелкруюшихся с этим признаком. Установлено наличие блот-гибридир,ации ГШ?-паттернов клебсиелл всех изученных видов и подвидов с ^Р-меченой ДНК из ПЦР-пкгтерна К. mobilis , что подтверждает принадлежность вида К. mobilis к роду K-lebsialla.

4. Разработка таксономического теста иденти^нации бактерий Hafnia alvei основе хромогенной

реакции с комплексом 5-НОК + ионы в питатель-

ной среде

В опытах применяли 690 штаммов бактерий 72 видов 28 род|>л( в том числе 140 штаммов Н. alvei . Хромсгенную реакцию с комплексом 5-НОК + ионы изучали на разработанной нами дифференциальной питательной среде, следующего состава (г/л): cyxof Питательный агар - 35; 5-ннтро-8-оксихмнолин (препарат "5-НОК"). 0,08-0,1; FeGi3-6H20 - 0,7-1; рН-7,2-7,4. Для приготовления среды в колбу с расплавленным питательным агаром (200 мл) добавляют 1,6 мл раствора 5-НОК в пиметилсульфоксиде с концентрацией 10 мг/мл и 1,4 мл 10% водного раствора хлорного железа, перемешивают, разливают в чашки Петри. При постановке теста агавовую культуру бактерий засевают газоном на сектор среды (1/6 часть чашки), инкубируют в аэробных условиях при 37°С в течение 18-24 ч, после чего учитывают результат. Появление оранжево-красной окраски среды поп газоном и вокруг газона выросших бактерий указывает на принадлежность их к Н.alvei.

Установлено, что хромогенную реакцию с комплексом 5-НОК 4-+ иона Fe"+ лают 130 штаммов н.alvei (g2,8 - 2,2^), в той Чйс^ типовой штамм АТСС 13337. Остальные Í0 штаммов B;alvei росли на среде. Бактерии прочих зерймоген-

hoÍí реакции или не росли на срепе. Специфичность свойства и его высокая частота у штаммов гефниЙ определяют пригодность этого признака как таксономического маркера II.;: iva i . Это пока епинстгашый биохимический такесномичзскпй маркер вида

Н. alvo i.

Хромогенная реакция гафний происходит только в вэроСных условиях. В анаэробных условиях на пифференфрльной срепе таста гафнии не растут, хотя растут на питательном агпре. Предполагается участие в хромохчзнной реакции сидерсфорив, котсрУе у гафшй По данным iintssbrofe Н. ot al. Л.9В8/ относятся только К гиярокса.матному типу, кроме аоробактима. Биохимический механизм хромогенной реакции Пока не известен. Таксономический тест позволяет существенно упростить и повысить точность идентификации И .stive! . Имеются публикаи^и /Лузина Е.И. и ¡тр., 1990/ об успешном применении теста для идентификации бактерий музея культур ШСК и«,,.Л.А.Тарасовича.

б. Разработка к апробация селективно-яиффереифтлыед питательных сред для опноатапнего выделения и Идентификации "проблемных" знторобактерий и псеваомоиад

На основе выявленный селект'ивннх свойств отечественного препарата оксафанамия разработана питательная среза "Псездомо-Нйс АШ" для выделения и идентификация бактерий P.aerueiaosa F.putiSa . Состав среды (г/л): сухой питательней агар ~ 35-36} оксафенаша (пара-оксифенилсадицилашя)-1,0-1,2, растворенный в I0--I2 мл диметнлоульфоксипа; вода дистиллированная до I л; рН-7,2-7,4. В колбу вносят 200 мл расплавленного горячего питательного' агара, -добавляют 2,2 мл 10$ раствора оксафенаыида в диметилсульфодоиде, разливают среду в чаши: Петри. Исследуемый материал засевают на сектор среды (1/4 чашки), инкубируют при 37^ и (или) 42°С (при посеве на второй чашке) в течение 16-24 ц. Наличие колоний бактерий, выросших при 42°С, указывает на принадлежность их к P.asruRinoaa , Колонии, выросшие при 37°С, принадлежат вилам P.aeruginosa 1Ш P.yutida . Их можно различить ускорении (3 ч) мнкрооОъемши тестом на кит-

ратрепуктаоу. Специфичность среди, изученная ьа '¿СО штаммах Р. аег-а .с* , 60 штаммах Р. .дияЛа 14 видах других псез-помонад и 66 ыюях прочих бат'ирнй, высокая: при 4241 растут ТОЛЬКО Р. нчги^ипоеа , при 3?°С -■ Р. оехи^аоьа И Р. дт Ы 1а . На питательных срепах ЦПХ-агар, ацетамиппий агар, средз с цет-римицом (" руосу>шм>г г "), среде с мргаззнои (п?евш1оп>оиая 1ао1аЫсщ а*г>г ") ОТМечеН' рост, кроне Р. аеги^1г»ова

бактерий прочих видев соответственно: 3; 2; 3; 12 видов. Чувствительность среды (ростовйя). идя Р. аош^1г.ояа при 42°С

2-Т2 КОЕ, для Р. А>»ы.1а при 37^1 1-ЗП ШЗ. При одновременном мстюании чувствительности сред "Псеидомопас АШ% ЦПХ-агьр, вцеташпнии агар, " ¿>/осуши..4<а "Ре'яИо'допав х-зоЯ^з-оп адаг " получены показатели ишишсльнмх КОЕ, обеспечивающих рост штамма Р. аига^оза А ЮГ. 10145 - 4; 8-Ю4; 1-М3; 6-Ю3;

3-Ю1" соответственно; в отношении штамма Р. иеги^хпоба АТСС 27053 - 8; З-к/5; МО3; 3-Ю3; 3-Ю4 соответственно. Следовательно, срола "Псевдомонас А!)й" превосходит по чувствительности и специфичности известит отечественные и зарубежные среды подобного назначения. При апробации изучалась диагностическая чувствительность среды в сравнении с унифицированным метопом прямого посева на среду Эппо и кровяной агар. Из 1285 клинических проб выделены двумя метопами в 163 пробах штаммы

Р. аехмс^юаа и Р.риЪЫа . При этом чувствительность унифицированного метопа составила 60,1 - среды "Псевдомонас А1С" - 96,9 ± 1,1%, что достоверна выше ( Р< 0,01). При 42°С синегнойная палочка идентифицировалась одноэтапко сопряженно с выделением через 16-24 ч после посева материала. Бактерии Р.ри-1;1с1а идентифицировались на среде первичного посева при 37°С . с дополнительный тестом на нитратредуктаэу. Контрольная идентификация показала. 100$ специфичность среды. Среда позволяет существенно ускорить и повысить эффективность этиологической диагностики госпитальных инфекций, вызываемых Р.аагийхпоаа И Р.риЬЫа.

Питательная среда "Киебсиелла 5-АСК" мокат попользоваться для ттксо1!1)1.!пчсс;(л'о теста и одноэтапного вивеления и иденти-ф!катпи клебонолл. Состав, приготовление и хорак^еристикй спе-Ч>)ф»1ЧНостп прквевенм в радиоле 3. Среда п^еут высокую

чувствительность о ля всех видов клебсиелл поь), кроме поп-висов К. pneumoniae subЕр. osaenae И К. pneumoniae1 оиЪцр. rhinoGoleromatis ( 1-10^ - I-10^ КОЕ), что определяет ею пригодность в качестве срелы первичного посева пля всех випов, кроме указанных попвипов. На среде ингибируется рост грамполо-жктельных и иефермеитируюших бактерий. Диагностическая чувствительность среды изучалась посевом клинического материала на сектор среды (1/4 чашки) в сравнении с унифицированным методом посева на среды Эндо и кровяной агар. Из 680 проб мочи выделена- пзумя методами клебсиелла в 103 пробах. Чувствительность унифицированного метопа составила 58,£ - 4,9^, чувствительность среды "Клебсиелла 5-АСК" - 92,2 - 2,7%, что достоверно выше ( Р<0,01). Специфичность среды по контрольной идентификации всех культур с положительной хромогенной реакцией составила 100$, Среди клебсиелл с отрицательной хромогенной реакцией с 5-АСК выявлены -1 штамма К. plonticolb. (3,8$ от всех выделенных культур клебсиелл). Это первое сообщение в России о выделении К. planticola из клинического материала. Изучение IB0 штаммов клебсиелл, выделенных из фекалий, с применением среды "(клебсиелла 5-АСК", тестов утилизации гистамина и ферментации Д-меле-цитозы выявило 5 штаммов К. planticola (2,8%). Бактерии K.ter-ribena в кл'/ническок материале не обнаружены. Таким образом, среда "Клебсиелла 5-АСК" позволяет выделить и ускоренно (через 20-24 ч после посева) едноэтапно идентифицировать родовую принадлежность 92,2 - 2,7% клинических штаммов клебсиелл. Среди клебсиелл с отрицательной хромогенной реакцией с 5-АСК целесообразно проводить ПОИСК К.planticola и K.tarrigaua.

Питательная среда "Протей ППМ" разработана нами на основе известной хромогенной реакции на триптофандезаминаэу, которой облоцамг бактерии группы родов протея, прсвиденция, морганел-ла. Состав среды (г/л):- сухой питательный агар - 35-35; ъ -триптофан - I; хлорное железо (^eCig-ftlgO) - 0,6; сульфонол -1,6; вида дистиллированная по I л; рН-6,£-7»2. Модификацией сроды является среда "Протей ГШ", содержащая дополнительно фу-раэолипон 0,025 г/л. Для приготовления срезы в колбу с 200 мг стерильного расплавленного питательного агара вносят 0,2 г !• -триптофана, кипятят до его растворения, добавляют 0,9 мл

раствора сульфонола и 1,6 мл 10% раствора хлорного железа,разливают в чашки Петри. После инкубации посевов при 3?°С в течение 16-24 ч идентифицируют бактерии группы протея, провидепция, морганелла по темно-коричневой окраске среды вокруг колоний. Изучение 470 штаммов бактерий , 1тот71<1впс1а ,

1'юг§вае11а и 220 штаммов прочих 66 видов выявило 100;? специфичность хромогеннойреавдн. Среда обладает высокой чувствительность (2-10 КОЕ) и угт.етает полностью рост 28 видов прочих бактерий (грамположительнчх, неферментируюших). При апробащи среды "Протей ППМ" в сравнении с унифицированном методом посева с накоплением и пересевом на среды Эг.до и кровяной агар из 953 проб мочи и раневого отделяемого выделены двумя метопами бактерии протей, провидеиция, морганедла в 104 пробах. Чувствительность унифицированного метода составила 82,3 1 3,6$, чувствительность среды "Протей ППМ" - 92,1 - 2,5$, что достоверно Еыше (Р <0,05). Специфичность среды 100%. На среде "Протей ППМ" дополнительно были выделены прозиденции Р.в-Ыдаг-Ы! , Р.аз.са-Игасгепз . Ьремя выделения и идентификации бактерий до группы составило 16-24 ч. Испытание среды "Протей ПН" показало, что она обладает равной чувствительностью с унифицированным методом, но превосходит среду "Протей ППМ" по ингибирооанию прочей, микрофлоры .

Таким образом, разработанные питательные среды "Псевдомонад АГ£,!, "Клебсиелла 5-АСК", "Протей ППМ" позволяют ускоренно (сопряженно с выделением) идентифицировать ¡'проблемные" возбудители госпитальных инфекций и повысить уровень этиологической диагностики этих заболеваний.

6. Разработка тестов ускоренной микрообъемной биохимической идентификации бактерий и системы ускоренной биохимической идентификации энтеробактерий

Исследованиями в условиях микрообъемного метода обнаружены некоторые особенности биохимических и культуральных свойств энтеробактерий и псевдомонад. Выявлена устойчивость

грамотрицательннх бактерий к иероксилу водорода а диапазоне

в нреволэх которого возможно сознание о дробных условий среды католазой этих :ке бактерий, что явилось основой рг-проботки иерокспцвояоровного микрообъемного метода выявления окислительного метаболизма углеводов у бактерий. Обнаружена необычайно высокая активность уреолы у Ы,тог£-т11 (завершение ре.чкцин уо 1-2 шн) и б;' - зрий рода Хог.-тЦа (завершение решали за 2-ЕР мин), что в сочетании с тестом на трип-тофаипезаминаз.у сбеспочивает их экспрессную предварительную идентификации. Установлено, что в условиях микрообъемного метода только экспозиция I ч достоверно характеризует истинную ферментации глюкозы бактериями с броцильны' метаболизмом. В более поздние сроки возможны ложсоположителыше результаты у нефе рмпт 1Т1111 у ¡о ии х: бактерий с окислительным метаболизмом, что является ¡(рич'нюй ошибок ипептификации в коммерческих отечественных и - ирубржных микрообъемиык системах биохимической идентификации бактерий, учитывающих все тесты через 4-24 ч. Выявлены сроки и достоверность ферментации различных'субстратов для диагностических тестов, иго позволило отобрать тесты пригодные для ускоренной (4-5 ч) биохимической идентификации эн-торобактерий и исевдомонал.

Впервые разработан перокеидвг.лородний микрообьешый метод теста пля экспрессного определения окисления и ферментации глюкозы грамеч'рицателышми бактериями. Известные ранее методы цместа с глюкозой и а среде Хыо-Лейфсона длительны (.14 суток), микрообъемг.ш метопы недостаточно точны и длительны (4-24 ч). Црпнцпн метода состоит в использовании для создания аэробных условий пероксила водорода в иебектериципиоН концентрации в составе сгрепи для окисления глюкозы и каталазы исследуемых бактерий, вносимых п среду. Каталаэа бактерий бистро расщеы.чЛ':т перокслш эопорода с образованием вопи и кислорода, который пссыгааот сролу и создаёт аэробные условия для ускоренного окисления глюкозы бактериями. В среде с глюкозой без пер-о.тсвда вонороло остппгся анаэробные условия и происходит фор-понтитая глюкозы. Среда для ферментации глвког.ы содержит фос-<1«тнз-» буф<зрнуи основу (рН 7,6) с индикатором фонологии красит.: н I;? елчколы. Орел- ял« окисления глижооы состоит из среды

для ферментами глюкозы, в которую волнительно вносят пергидроль по конечной концентрации 0,5% пероксида водорода. , ся? -тест ставят путем посева по одной петле агаровой культуры исследуемых бактерий в две лунки планшета, содержащие по 0,1 мл указанных сред. Результат учитывают через I и инкубации при 37 С, Изучение достоверности теста сопряженно с постановкой ог -теста ив среде Хью-Лейфсона на 500 штаммах 21 рода бактерий выявило Ъ.щное совпадение результатов, кроме вида ХагЛЬотопаа та1-

, для которого микрообъемлый метод был более точный. Ла])р«сидводородный метод вводит и!-1-тест с глюкозой в прогрессивную микрообъемную технологию и превращает его в экспрессный способ скрининга групп бактерий по типу метаболизма глюкозы, ориентирующий на рациональный Выбор систем дальнейшей идентификации.

На основе пероксидводородного микрообъемного метопа впервые разработаны тесты ускоренного определения (4 "ч) окисления уг-Л^родов (^актозы, сахарозы, мальтозы, манноэы, ксилозы) псевдо-Мандлами и доказана их достоверность при сравнении со средой )фЮ-Лейфсона. На 21 виде неферментиругаших бактерий доказана высокая информативность и достоверность ускоренного (4 ч) микрообъемного метода определения китратредуктазы с использованием нетоксичного реактива на нитриты (0-,2$ водного раствора риванола и 12£ раствора соляной кислоты).

Впервые разработана отечественная система ускоренной биохимической идентификации энтеробактерий на основе микрообъем-цого метода с жидкиш дифференциальными средами в планшетах. Система включает 12 биохимических тестов: уреаза, триптофанпе-^аминаза, лизиндекарбоксилаза; образование индола, сероводорода, ацетоина; ферментация лактозы, сахарозы, маннита, сорбита, лрабиноэь), адонита. При необходимости для видовой идентификации иерсиний используется экспрессный (15 мин) тест на бета-дактамазу. Все культуры предварительно экспрессно изучаются на. цитохромоксидазу, грамотрицательность, тип метаболизма глюкозы по еда-тесту. Среды тест-системы применяются в объеме 0,1 мл в лунках отечественных полис те родовых планшетов для иммунологических реакций ( на 96 лунок),. Система позволяет идентифицировать в. течение 5 ч энтеробактерии 13 родов: по вида - 19, во

- 2ü -

pona - 3 (_ Klebsiella o vitoca, К .pneumonias eubEí .pneumoniae, K.mebilis; üorratia marceecens, Hafnia alvoi, Providencia stu-artii, ï.alcalifacienp, P.rottgari; Pi'oteus mirabilis, Г.vulgaris; Ilarganella norganiis Yersinia enfcerocolitica, Y.pseudotuberculosis s Edwarlsiolla tardai Cifcrobacbftr freundii, G.diver-mis, a.amalonaticus; Salmonella typhi, Escherichia coli и роды Eiiterobaotor, Shigella, Salmonella ), gT0 обеспечивает идентификацию 99 t 0,6$ изолятов энтеробактерий при госпитальных инфекциях. Специфичность идентификации энтеробактерий системой 97,6 Í 0,7^. Испытания установили, что буферные основы сред и среды системы пригодны к длительному хранению (5 лет). Система отличается невысокой стоимостью исследований, возможностью обеспечить большой объем анализов, доступностью приготовления и применения в любой лаборатории. Она пригодна для использования в полевых условиях и чрезвычайных ситуациях. Система применяется в бактериологических лабораториях меди*?!нских частей и учреждений МО РФ и лабораториях МЗ РФ на основании официальных методических указаний и рекомендаций.

ВЫВОДЫ

1. Впервые обнаружено уникальное свойство псевдомонад первой группы рРНК-гомологии - избирательная чувствительность к бактериос-татическому действию ионов бария. Установлено, что этот признак 1вляется единственным специфическим таксономическим маркером всех видов псевдомонад первой группы рРНК-гомологии (аутентичной роду Reudomonaa ) и полностью согласуется с изменениями в классификации псевдомонад. Признак представляет интерес для построения естественной классификации псевдоиоиад.

2. Для идентификации бактерий рода Psou'iomonas (первой группы рРНК-гомологии) впервые разработан таксономический тэст определения барийчувствителыюсти бактерий. Тест позволяет ускорить, .•простить и повысить точность идентификации псевдомонад.

3. Установлено многоцелевое действие ионов бария на клетки псевдомонад. Электпопно-микроскопическое исследование клеток синогнойной палочки впятило приобретение ими оваг.июй формы,

подавление завершающий фазы деления и р;умножения, деструктивные изменения (сжатие цитоплазмы). Подтверждены конкурентные отношения ионов бария с ионами магния и кальция, которые представляют, по нашим данным, лишь один из путей действия ионов бария. Основная мипшь, определяющая структурно и функционально избирательность бактериостатического действия ионов бария, остаётся ещё неизвестной.

4. Впервые обнаружено уникальное свойство бактерий рода Klebsiella - хромогенная реакция с 5-ашносалициловой кислотой в питательной среде. Это свойство имеют 9В,3 * 0,7% штаммов К. pneumoniae r-ubsp.pneumoniae; 9'+,? - 3,^/2 К.pneumoniae ßubop.ozaenae; 100^ К.pneumoniae subsp.rbinosoleromatisi 90,8 -

K.oxytoca; 94,5 ± 3,15* К

„mobilia и Hg имеют бактерии видов K.planticola « K.terrigena. Наличие его у K.uobilis , систематическое положение которого является спорным, подтверждает принадлежность этого вида к роду Klebsiella . Признак зсромогениой реакции с 5-АСК является единственным специфическим таксономическим маркером клебсиелл, что определяет его высокую научную значимость для систематики. .

5. Открыт биохимикекий механизм хромогенной реакции клебсиелл с 5-АСК, выявлен и предварительно идентифицирован неизвестный ранее фермент, осуществляющий реакцию - 5-аминосалицилат-декарбоксилаза из класса лиаз (5-ашносадицилат-карбокси-лиа-па), который имеет клеточную локализацию. Реакция происходит в две стадии. На первой стадии, протекающей в аэробных и анаэробных условиях, клебсиеллы декарбоксилируит 5-АСК с образованием COg и пара-аминофенола, который является бесцветным промежуточным продуктом. На второй стадии, протекающей только в аэробных условиях без участия бактерий, пара-аминофенол окисляется кислородом воздуха в крупномолекулярные полимеры темно-коричневого цвета. i

6. Впервые выявлено специфическое свойство бактерий Baf-aia alvei - хромогенная реакций с комплексом 5-нитро-8-окси-хинолин + коны ре установлена его таксономическая значимость как маркера бактерий Н. alvei , разработан таксономический тест на основе этого признака. Предполагается, что хромогенная реакция гафний с комплексом 5-Н0К + ионы Я в опосре-

пована участием сидерофоров гидроксаматного тшв \кроме аэро-бактина), однако, биохимический механизм реакции не известен.

7. На основе хромогенной реакции с 5-АСК впервые разработана селективно-дифференциальная питательная среда "Клебси-елла 5-АСК" для -постановки такс он омичес кого теста, одноэтап-ного выделения и идентификации клебеиелл. Среда облапает высокой диагностической чувствительность© (92,2 - 2,7%) и специфичностью {100%), пригодна для количественных исследований.

Й. На основе выявленного свойства избирательной резистентности Р. asruginosa и Р.futida к антибактериальному действию лекарственного препарата "оксафенамид" (пар.а-оксифенил-салициламид) впервые разработана селективная питательная среда "Пеевиомонас АПС" для одноэтапного выделения и идентификации бактерий Р.aoruginosa и P.putida . Среда обладает высокой диагностической чувствительностью (96,9 í 1,1$) и специфичностью (100%), превосходит по специфичности и ростовой чувствительности отечественные среды и зарубежные коммерческие среды подобного назначения. Среда позволяет выделять и окончательно идентифицировать синегнойную палочку через 16-24 ч после посева материала (при 42°С). Среда пригодна для количественных и экологических исследований.

9. На основе хромогенной реакции на триптофандезаминазу разработаны селективно-дифференциальные среды для одноэтапного выделения и идентификации бактерий группы í'rotous , Рго~ videncia , Morgaño11а (среда "Протей 1ШМ") и Proteus , Providencia (среда "Протей ГШ"). Среди обладают высокой специфичностью (100$). Срепа "Протей ППМ" превосходит по диагностической чувствительности (92,1 - 2,6$) среды унифицированного метода даже при использовании их с предварительным обогащением материала; среда "Протей 1Ш" при равной диагностической чувствительности превосходит среды унифицированного-метода по. селективности.

10. Впервые разработан пероксидводородный минрообъемный метод озг-теста, обеспечивающий окспрессное (I ч) ■ определение окисления и ферментации'глюкозы грамотрицателышми бактериями, Ыотод вводит QF-тест с глюкозой в микрообъемную технологию, позволяет провопить экспрессный скрининг групп бактерий по тиг

л

пу метаболизма глюкозы, ориентирующий на рациональный выбор систем дальнейшей идентификации,

П. Разработаны ммкрообьемниа тестц определения окисления углеводов (пероксидвгдородным метолом) и нпуратревуктази, пригодные для ускоренной (4-5 ч) идентификации псепдомонап и других иеферментируюших бактерий.

12. Впервые разработана отечественная система ускоренной биохимической идентификации знтеробшг.'ерий на основе микрообъемного метопа с жидкими дифференциальными средами в планшетах. Система включает 12 биохимических тестов и дополнительный тест на бета-локтамазу. Система позволяет вдентифинировать ь течение 5 ч 19 видов и 3 рода энтеробактерий, принадлежащих к 13 родам, что обеспечивает идентификацию 99 - 0,6% изолятов эн-теробактерий при госпитальных инфекциях. Специфичность системы 97,6 Î 0,1%. Среды системы пригодны к длительному хранению (б нет). Система отличается невысокой стоимостью исследований и доступностью.

СШСОК РАБОТ, ОПУБШКОБАЩЦХ ПО ТШ ДИССКРТАЦИ

1. Сиволодскнй Е.П. Метод определения бактериальной ?риптофандезаминазы (оксндазы Ь -аминокислот) }) Лаб.дело. -1901. - № 3. - c.iao-ioi.

2. Сиволодский Е.П. Модификация способа определения грпптоф&ндез&миназы и фенилаланиняезшлшазы бактерий /У Лаб, дело. - 1962. - № 3. - С.38-40.

3. Сиволодский Е.П., Королюк А.М., Ремезов А.П. Действие хлорьна натрия на Tersinia p3qudotrubercul.O0-iQ И Yersi~ nia Ytiteracnliti Са 1 ! JiiypH .микробиологии, эпидемиологии Yî иммунобиологии. - 1983, - № 10. - С.35-38.

4, Сиволодский Е.П., Луканов Н.А. Система ускоренной биохимической идентификации энтеробактерий )) Воен.-мед.журн.-1984. - № 9. - С.37-40.

5, Сивололский Е.П, Метод ускоренной ицег'нфмкации Ето-teaa morganil /У Лай .цело. - IS84. - № II. - С .674-070.

6, А.о. 115857? СССР МШ4 G 12 П/20. Способ ипенти^шса-

цпи бактерий II aínia al»©! / Е.П.Слволодский. - №3655072/2813; Заяв.19 .10.03 ; Опубл .30.05.85, Бил. f Z0 - C.I05. t

7. Сивонопскяй ЕЛ., Луканов Н.А. Ускоренная биохимическая идентификация эитеробактерий в планшетах // Лаб.дело. -1985. - ?? 5. - С.306-306.

8. Сиполоиский Е.П. Тест идентификации бактерий Hafnia alvo i по цветной реакции с комплексом 5чштро-8-оксихинолин +

+ ионы железа II Лао.дело. - 1986. - }f 7. - С.445-447.

9. Сиволоаский Е.П. Питательная срепа. для выведения и идентификации бактерий poflaProt^us // 1-я Всесоюз. конф. Актуальнее проблемы нозокомиальных инфекций и лекарственной устойчивости шкрооргашэмсв: Тез.докл. - Минск, 1936.'- С.234-235.

10. Л.с. 1296577 СССР Ш514 № К 1/20. Средство для селективного подавления роста бактерий рода Vsaudomonas / Е.П.Си-эолопский. - Р 3900215/28-13 ; Заяв.21.05.85 ; Опубл.15.03.07, Бил. » 10 - С.114.

11. А.с. 131874 СССР Ш14 CI2 Q. 1/04. Способ идентификации бактерий рода Klebsiqlla / Е.П.Спволоаский. - Í? 3853284/ 23-13; йояв.25.02.85 ; Опубл.30.05.Ь7, Еюл. №20 - СЛ06.

12. Сиполодский E.1I, Ускоренное определение нитратредук-тазы эитеробактерий II Лаб.дело. - 1907. - № 4. - С.294-296.

13. А.с. 1386650 СССР Ш4 CI2 Q 1/04. Способ выделения бактерий семейства Entorobacteriaceae 1 Е.П.Сивололский,-JP 3999СШ7/29-13; Заяв.24.12.05; 0публ.07.04.С8, Бюл. ),» 13 -

С.124.

Л. с.

для выделения и идентификации бактерий íeoudomonas aorusi-nona / Е.И.СиволопскчЙ. - № 4048217/28-13; Заяв .01.04.86 ; Опубл.07.08.88 , Бил. №29 - С.112.

Сивслодский Е.П. Тест идентификации бактерий рода PüeuJvwa.-'B II Ягб.пело. - 1960. - № П. - С.64-66.

16. Сиенлодский Е.П. Специфическое свойство бактерий' рода iilobí-'iolla - цветная реакция с б-амипосяллцюювой кислотой р питательной среде II Журн.микробиологии, эпидемиологии 11 ыупобиолопш. -1988. - № 12. - С,26-29.

14. А.с. I4I487I СССР МШ4 CI2 Q. 1/04. Питательная среда

17. A.c. 1518374 СССР MIHI4 CI2 QT/04. Способ определения окисления и ферментации глюкозы грамотрицатедъпыми микроорганизмами / ЕЛ.Сиволодский. - № 4361153/40-13; Заяв.22.02.88; Опубл.30.10.09, Еил. U 40 -C.I30.

16. Сиволодский Е.П., Королюк А..М. Ускоренная культураль-ная к биохимическая идентификация антеробактерий - возбудителей госпитальных инфекций 1) Актуальнее проблемы клинической микробиологии. -М., D69. - С.81-83.

19. Сиволодский E.II. Избирательнее подавленна роста бактерий рода РеейгХэтоаав нонами Ва2+ /У Всесоиэ. копф>. Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов: Тез. иокл. -Пущино, №9. - С.79.

20. Сиволодский Е.П. питательная среда " Pseudomonas дра" для выделения и идентификации бактерий iJseudoaonas aeruginosa И Pseudomonaa putida // Лаб.дело. - 1990. - № 8. С.65-67.

21. Зеленин К.II., Хорсеева J1.A., Сиволодский Е.П. и др. Синтез и протпвомшсробная активность комплексов на основе три-аентатннх гаобензоилгипразснов 1/ & ил.-фар мац. журн. - I9S0, -Т.24, !f 12. - С.40-43.

22. Сиволодский Е.П. Ускоренное определение нитратре-пукталы неферментируюших грамотрицательных бактерий /} Лаб.цело. - 199I. - № I. - С.61-63.

23. Сиволодский Е.П. Пероксидводородный шкрообьемный метоп сш'-теста; экспрессное определение окисления и ферментации глюкозы грамотрицательнш.ш бактериями 1) Кури, микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1991. - №7. - С.14-17,

24. Сиволодский К.11, Уникальный признак псевдоыонад первой группы рРНК-гомолопш - Избирательная чувствительность к бактериостатическому действию ионов бария )) кури.микробиологии, епидешологни и иммунобиологии. - 1992. - № 9/10. - 0.1013.

25. Сиволодский Е.П., Герасименко Л.М., Копейка A.A. Питательная среда " proteus-PI'H " для однозтапного выделения и идентификации бактерий Proteus ,Providencia , ik.rgaitóUa // Клинич,лаб .диагностика. - - )f 1710. - С.59-61.

26. Сиволопский Е.П. Идентификация клебсиелл специфическим хромогенным тестом на питательной среве "К1еЬ81е11а С.;-А.ск" )} Актуальные проблемы инфекционной патологии. - СПб,, 1993.4.1: Кишечные и респираторные инфекции. - С.74.

27. Сиволопский Е.П., Обухов Ю.И. Выявление Mebsia.Ua р1ап!;!со1ц при исслепованиях на писбактериоэ кишечника )/ Актуальные проблемы инфекционной патологии. - СПб., 1993, -а Уг Кишечные и респираторные инфекции. - С.75.